MAKALAH KIMIA ANALITIK

PBL 3

Kromatografi

UNIVERSITAS INDONESIA

Kelompok 10

Adinda Sofura Azhariyah 1306370505 I Gede Eka Perdana Putra 1306370676 Imas Mega Pratiwi 1306370524 Pangiastika Putri Wulandari 1306370493 Rayhan Hafidz Ibrahim 1306409362 Zainah 1306405742

Teknik Kimia S1 Reguler

Departemen Teknik Kimia

Fakultas Teknik

Universitas Indonesia

Depok, Desember 2014

Daftar Isi

Kata Pengantar ............................................................................ 1

BAB I (Pendahuluan) .................................................................. 2

BAB II (Isi) ................................................................................... 4

Tugas 1 ................................................................................ 4

Tugas 2 ................................................................................ 5

Tugas 3 ................................................................................ 16

BAB III (Kesimpulan) ................................................................ 23

Daftar Pustaka ............................................................................. 24

Kromatografi | 1

Kata Pengantar

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan yang Maha Esa atas

kehendak-Nya laporan yang berjudul Kromatografi ini dapat terselesaikan tepat

pada waktunya. Penulisan laporan ini bertujuan untuk pembuatan tugas penulisan

laporan pemicu 3 mata kuliah Kimia Analitik Instrumental. Selain itu, tujuan

penulis dalam penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui konsep metode

penentuan kandungan zat beserta aplikasinya dalam kehidupan sehari-hari.

Dalam penyelesaian laporan ini, penulis banyak mengalami kesulitan,

terutama disebabkan oleh kurangnya ilmu pengetahuan. Namun, berkat bimbingan

dari berbagai pihak, laporan ini dapat terselesaikan walaupun masih banyak

kekurangannya. Karena itu, sepantasnya jika penulis mengucapkan terima kasih

kepada Ibu Dianursanti yang telah memberikan kepercayaan dan kesempatan

untuk membuat laporan, juga memberikan pengarahan dan bimbingannya kepada

penulis, dan kepada semua pihak yang telah membantu, baik secara langsung

maupun tidak langsung, yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Sebagai mahasiswa yang pengetahuannya belum seberapa dan masih perlu

banyak belajar dalam penulisan laporan, penulis menyadari bahwa makalah ini

masih banyak terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan

adanya kritik dan saran yang positif agar laporan ini dapat menjadi lebih baik dan

berdaya guna di masa yang akan datang. Penulis berharap laporan yang sederhana

ini dapat menambah pengetahuan pembaca mengenai metode dalam menentukan

kandungan zat beserta penerapannya dalam kehidupan sehari-hari, serta

bermanfaat bagi rekan mahasiswa dan semua kalangan masyarakat.

Depok, Desember 2014

Tim Penulis

Kromatografi | 2

BAB I

Pendahuluan

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantaranya dua fase, yaitu

fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat

padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam

kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat

berupa zat padat atau zat cair.

Banyaknya macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah

kromatografi gas, yang merupaka metode kromatografi pertama yang

dikembangkan pada zaman instrumen dan elektronika. Kromatografi gas dapat

dipakai untuk setiap campuran dimana semua komponennya mempunyai tekanan

uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai untuk proses pemisahan.

Tekanan uap memungkinkan komponen menguap dan bergerak bersama-sama

dengan fase gerak yang berupa gas.

Salah satu aplikasi dari kromatografi gas adalah penggunaannya dalam

bidang tokskologi dan forensik. Metode kromatografi gas ini sangat akurat dan

sensitif dan merupakan prosedur standar untuk analisis alkohol dan senyawa-

senyawa volatil dalam bidang toksikologi forensik. Dengan analisi menggunakan

metode ini, alkohol dalam darah dapat diketahui jumlahnya, walaupun dalam

konsentrasi kecil. Selain untuk menganalisis kandungan alkohol, teknik analisis

ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi kandungan obat-obatan terlarang

dalam tubuh.

Narkoba merupakan singkatan dari Narkotika, Psikotropika dan Bahan

Adiktif berbahaya lainnya, yaitu bahan atau zat yang jika dimasukkan dalam

tubuh manusia, baik secara diminum, dihirup maupun disuntikkan dapat

mengubah pikiran, perasaan dan juga perilaku seseorang dan lebih jauh lagi

narkoba akan dapat menimbulkan ketergantungan fisik dan psikologis. Narkotika

dalam senyawa metabolit akan terdeteksi dalam urine setelah 24 jam setelah

penggunaan oleh pengguna, darah selama 3 x 24 jam setelah pemakaian. Secara

Kromatografi | 3

umum metode kromatografi dengan menggunakan kromatografi gas

spektroskopi massa (GC-MS) dan kromatografi cair dapat digunakan untuk

mendeteksi adanya kandungan narkotika dalam tubuh.

Sebanyak 98% etanol di dalam tubuh akan teroksidasi menjadi

asetaldehid dan asetat, sedangkan 2% dieksresi melewati ginjal dan dikeluarkan

melalui urin. Kadar etanol dalam darah bervariasi tergantung pada oksidasi

jaringan, sedangkan pemeriksaan kadar etanol dalam urin lebih akurat karena

kadar etanol dalam urin lebih stabil (Nisak, 2008).

Kromatografi | 4

BAB II

Isi

Tugas 1

Susunlah pertanyaan penting atau variabel penting untuk merancang suatu

penelitian analisis alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah sebanyak

tujuh pertanyaan.

1. Apa yang dimaksud dengan alkohol?

Alkohol adalah senyawa organik yang mengandung gugus fungsi hidroksil

(-OH). Alkohol bisa berasal dari alkana, alkena, maupun alkuna dengan adanya

pergantian gugus alkil dengan gugus hidroksi pada atom karbon jenuh.

2. Apa yang dimaksud dengan obat-obatan terlarang?

Narkoba merupakan singkatan dari Narkotika, Psikotropika dan Bahan

Adiktif berbahaya lainnya, yaitu bahan atau zat yang jika dimasukkan dalam

tubuh manusia, baik secara diminum, dihirup maupun disuntikkan dapat

mengubah pikiran, perasaan dan juga perilaku seseorang dan lebih jauh lagi

narkoba akan dapat menimbulkan ketergantungan fisik dan psikologis.

3. Berapa ambang batas alkohol dalam darah?

Kadar alkohol dalam darah ditentukan oleh jumlah dan kecepatan

konsumsi Etanol serta laju metabolisme. Katika kadar alkohol dalam darah

mencapai 0,05%, efek depresan dari alkohol mulai bekerja. Pada kadar 0,1%,

syaraf-syaraf motorik mulai terpengaruh. Pada kadar 0,2% dalam darah, syaraf

motorik seorang mengalami kelumpuhan dan keadaan emosi yang terganggu,

sedangkan dalam kadar 0,3% dapat menyebakan kolaps. Kemudian dengan kadar

0.4%-0,5% dalam darah, orang akan berada dalam keadaan koma, serta beberapa

bagian otak yang mengatur detak jantung dan pernafasan akan terganggu sehingga

dapat menimbulkan kematian.

Kromatografi | 5

4. Apa yang mempengaruhi kandungan alkohol dalam darah?

5. Berapa lama waktu untuk alkohol masuk ke dalam darah?

Ketika alkohol dikonsumsi, konsentrasi alkohol darah akan meningkat

pesat. Dalam waktu lima menit dari konsumsi, ada cukup alkohol dalam darah

yang dapat terukur. alkohol dalam darah ditentukan oleh seberapa cepat alkohol

diserap, didistribusikan, dimetabolisme, dan diekskresikan.

6. Berapa lama waktu untuk obat-obatan terlarang masuk ke dalam darah?

7. Berapa lama waktu metabolisme alkohol dalam tubuh?

Konsumsi satu minuman standar akan menghasilkan puncaknya pada

kandungan alkohol dalam darah dalam waktu 35 sampai 45 menit. Seseorang

150-pon dengan fungsi hati normal memetabolisme sekitar 7 sampai 14 gram

alkohol per jam, yang kira-kira 100 sampai 200 mg / kg berat badan per jam. Hal

ini sebanding dengan 8 sampai 12 ons bir atau setengah dari minuman beralkohol.

Mengontrol tingkat konsumsi akan memberikan waktu hati untuk memetabolisme

alkohol dan membatasi kandungan alkohol dalam darah kita. Setelah berhenti

minum, tingkat alkohol darah dalam tubuh akan menurun sekitar 0,01% per jam.

8. Metode apa yang akan digunakan untuk menganalisis alkohol dan obat-

obatan terlarang?

9. Seberapa banyak sampel darah yang digunakan?

10. Intrumen apa saja yang akan digunakan dalam analisis ini?

Tugas II

Dalam percobaan ini, sampel darah akan dianalisis dengan metode analisis

GC/MS, yang akan menetapkan apakah terdapat alcohol di dalam darah.

Berikut ini adalah sekilas gambar besar tentang GC/MS sebagai teknik

yang handal untuk memisihkan komponen dalam campuran. Sampel disuntikan

pada GC. GC kemudian memisahkan semua protein, metabolit, obat, dsb yang ada

dalam sampel menjadi komponen individu. Komponen individu kemudian

dilewatkan ke spectrometer Masssa (bagian MS) untuk mengidentifikasi

komponen campuran.

Kromatografi | 6

Bila anda hendak menggunakan GC/MS dalam analisis darah

1. Parameter apa saja yang harus anda ketahui?

Jawab:

Efisiensi pelarut dan koefisien partisi

Efisiensi pelarut ( cairan fase diam pada GC ) sebagai hasil dari

interaksi bahan terlarut dan pelarut menentukan posisi relatif pita-pita

bahan terlarut (analitik) pada kromatogram. Efisiensi pelarut atau retensi

relatif dinyatakan sebagai rasio dari retensi waktu yang diukur pada

puncak maksimum masing-masing komponen. Hal ini ditentukan oleh

koefisien partisi masing-masing (distribusi) K dari bahan terlarut (analitik)

dalam pelarut (fase diam) pada temperatur tersebut.

Koefisien partisi K didefinisikan sebagai berikut:

K = jumlahbahanterlarutanalitperunitvolumefasediamcairjumlahbahanterlarutanalitperunitvolumefasegerakgas

K =CcairC gas , Kadalahrasiokonsentrasi 1

Rasio Partisi ( Rasio Kapasitas)

Rasio kapasitas/rasio partisi (k) digunakan untuk mengekspresikan

kondisi kesetimbangan dalam kolom, dan dinyatakan dalam rumus sebagai

berikut :

k$ = beratbahanterlarutanalitdalamfasediamberatbahanterlarutanalitdalamfasegerak

k$ = KV&V' 2

di mana VL adalah volume fase diam dan VG adalah volume fase gas atau

volume celah kolom. Koefisien partisi adalah jumlah kekuatan interaksi

diantara bahan terlarut dan pelarut. Keuntungan utama GC atas destilasi

adalah jenis pelarut yang bisa digunakan.

Retensi Relatif dan Efisiensi pelarut

Kromatografi | 7

Efisiensi pelarut diukur dengan a , retensi relatif. Hal ini adalah

rasio dari retensi waktu yang disesuaikan atau koefisien partisi. Keduanya,

a dan k adalah tergantung pada temperatur. Rasio partisi K menurun

terhadap waktu. Efisiensi pelarut dirumuskan sebagai berikut :

= t+,t+- =k,k- =

K,K- 3

Pada banyak kasus tR1 sering digunakan sebagai acuan distribusi puncak-

puncak lainnya, yang penting dalam analisis kuantitatif.

Waktu Retensi

Waktu (tM) setelah injeksi sampel sampai dengan munulnya puncak

ini seringkali dinamakan waktu mati (dead time). Waktu mati memberikan

pengukuran dari laju migrasi rata-rata dari fasa bergerak dan merupakan

suatu parameter yang penting dalam mengidentifiasi puncak analit.

Seringkali suatu sampel akan mengandung spesies yang tidak ditahan, jika

mereka tidak memiliki spesies yang tidak ditahan maka penambahan

spesies dengan sifat seperti ini dapat dilakukan untuk membantu

identifikasi puncak.

Puncak lebih besar yang terdapat di bagian kanan lampiran gambar

1 merupakan puncak dari spesies analit. Waktu yang diperlukan puncak ini

untuk mencapai detektor atau waktu yang diperlukan spesies analit untuk

keluar dari kolom dan mencapai detektor dinamakan waktu retensi (tR).

Laju linear rata-rata dari migrasi zat terlarut (v) dan kecepatan linear rata-

rata dari spesies dalam fasa bergerak (u) diberikan pada persamaan

dibawah ini

/ = 012 (4) 3 = 014 (5) Dimana L = panjang dari kolom

Kromatografi | 8

Nilai dari v juga dapat dinyatakan dalam u dan rasio partisi (K)

dengan cara mengekspresikan nilai laju v sebagai fraksi dari kecepatan

pada fasa bergerak. Penurunannya adalah sebagai berikut:

/ = 3 6789:;8==?7@873=A8@8B68:8C?7D?789 / = 3 E3B@8BG@>8==?7@873=A8@8B68:8C?7D?789E3B@8BG@=G=8@

/ = 3 HIJIHIJI + HLJL = 3 1

1 +HLJL HIJI

/ = 3 --NOPQ P4 (6) Dimana Vs = volume dari fasa diam dan VM = volume dari fasa

bergerak.

Faktor kapasitas

Faktor kapasitas merupakan parameter eksperimental yang

menyatakan perbandingan mol komponen analit dalam fasa diam terhadap

mol komponen dalam fasa gerak, yang nilainya tergantung pada

temperatur. Faktor ini banyak digunakan untuk mendeskrispsikan laju

migrasi zat terlarut dalam kolom. Untuk spesies A nilai faktor

kapasitasnya adalah sebagai berikut. (dengan KA adalah nilai rasio partisi

untuk spesies A)

9R = OSPQP4 (7) Persamaan 5 dapat disubstitusi ke persamaan (4).

/ = 3 --NT$S (8) Agar nilai kA dapat dicari dalam kromatogram maka persamaan (2)

dan (3) dapat disubstitusi ke persamaan (6)

012 =

014

--NT$S (9)

9R = 12U1414 (10) Besarnya faktor kapasitas menentukan laju elusi komponen. Jika k

> 1 maka elusi akan berlangsung dengan cepat dan jika k > 20-30 maka

waktu elusi akan berlangsung sangat panjang.

Kromatografi | 9

Jumlah dan Tinggi Plat Rata-Rata

Plat teoritik adalah istilah yang berasal dari teori destilasi yang

kemudian diadaptasi ke dalam kromatografi. Plat ini menandakan suatu

titik dalam kolom dimana terdapat kesetimbangan antara fasa cair dan gas

(platnya hanya imaginer). Jumlah plat teoritik (n) dapat diukur dengan

menggunakan rumus di bawah ini.

V = 16 X 12YZ[, (11)

Dimana tR = waktu retensi dan Wb = lebar puncak pada pita elusi

hasil kromatografi. Ilustrasi yang dapat memperjelas nilai Wb dapat dilihat

pada lampiran gambar 3. Walaupun tR didefinisikan sebagai waktu, tetapi

sebenarnya kita dapat mengukur jarak pada kertas daftar perekam dalam

cm atau mm, perlu diingat bahwa tR dan Wb harus diukur dalam satuan

yang sama.

Tinggi plat teoritik disebut juga HETP (Height Equivalent

Theoritical Plate). HETP berfungsi untuk merepresentasikan efisiensi dari

kolom. Nilai HETP secara sederhana dapat dicari dengan menggunakan

rumus dibawah ini.

\]^_ = \ = 0` (12) Dimana L = panjang kolom, dan n = jumlah plat teoritik. Semakin

besar nilai N maka semakin kecil nilai HETP dan semakin besar efisiensi

kolom.

Efisiensi Kolom

Efisiensi kolom berkaitan dengan pelebaran puncak dari pita awal

ketika melewati kolom. Melebarnya hasil dari disain kolom dan kondisi

operasi, secara kuantitatif dapat dijelaskan oleh tinggi ekivalen plat teoritis

(HETP). Konsep plat pada kromatografi sama dengan konsep plat pada

destilasi, dimana kolom efisiensi pertamaterdiri dari plat yang terpisah.

Pada G.C. plat terpisah adalah suatu konsep tiruan yang digunakan untuk

membandingkan kolom sejenis pada kondisi spesifik antara lain:

1. Tipe pelarut dan pemuatan.

Kromatografi | 10

2. Bahan terlarut / solut

3. Kecepatan aliran

4. Temperatur

5. Ukuran sampel

Effisiensi kolom diukur dengan angka plat teoritis n yang

ditentukan dari kromatogram sebagai berikut:

V = 16 a =bcde,= 5,54 a =bche

, 13

Jumlah plat berhubungan dengan tinggi ekivalen plat teoritis

(HETP) yang merupakan ukuran langsung dari effsiensi kolom, bisa

dikatakan perbandingan antara kolom diberikan dari :

h = HETP L nn 14 dengan L = panjang kolom, biasanya dalam cm. Rata-rata linear gas

mengalir pada kolom diberikan oleh: p = Lt 15

di mana tm adalah waktu gas tertahan.

Resolusi Kolom

Resolusi kolom (Rs) dapat mengukur kemampuan kolom untuk

memisahkan dua analit secara kuantiitatif. Untuk lebih jelasnya dapat

dituliskan dalam persamaan berikut:

( ) ( )[ ]BA

ARBR

BAS WW

tt

WW

ZR

+

=+=

22 (16)

di mana Z merupakan jarak puncak analit A dan B yang terbaca pada

kromatogram.

Resolusi kolom dapat dipengaruhi oleh faktor selektivitas,

kapasitas sepasang zat terlarut pada kolom yang dapat dilihat pada

persamaan berikut:

+

=B

BS k

kNR

'1

'1

4

(17)

Kromatografi | 11

Dimana adalah faktor selektivitas. Dari persamaan di atas dapat digunakan juga untuk mencara jumlah piringan yang dibutuhkan untuk

mencapai resolusi kolom dengan nilai tertentu.

222

'

'1

116

+

=

B

BS k

kRN

(18)

Selain itu resolusi kolom dapat mempengaruhi retention time (tR),

dan kita dapat melihat hubungan keduanya sebagai berikut:

( ) ( )( )2322

'

'1

1

16

B

BSBR

k

k

u

HRt

+

=

(19)

2. Mengapa metode GC/MS sering digunakan untuk penentuan kandungan

alcohol dan obat-obat terlarang dalam darah?

Jawab:

Alkohol yang masuk ke dalam saluran pencernaan akan diabsorbsi

melalui mukosa mulut dan epitel gastrointestinal dan sebagian besar

diabsorbsi di usus halus, sisanya diabsorbsi di kolon. Setelah alkohol dalam

perut dapat diserap di sana dan pergi langsung ke dalam aliran darah. Alkohol

mudah berdifusi dan distribusinya dalam jaringan sesuai dengan kadar air

jaringan tersebut. Jadi alcohol dapat berdifusi ke dalam darah dan didistribusi

ke otak dan jaringan lainnya. Maka dari itu, untuk menentukan kandungan

alcohol dalam tubuh, dapat diambil dari sampel darahnya.

Biasanya untuk menguji kandungan alcohol dalam darah dapat

digunakan metode GC/MS.Metode analisa GC/MS lebih efektif dan memiliki

banyak keuntungan dibandingkan dengan metode analisa lainnya karena:

Metode analisa GC/MS sangat akurat, spesifik dan sensitif dan

merupakan prosedur standar untuk analisis alkohol dan senyawa-senyawa

volatil dalam bidang toksikologi forensik. Akurat dan spesifik karena

teknik ini menghasilkan molekular fingerpint atau spektrum massa yang

unik. Spektrum ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi ada/tidaknya

alkohol dalam sampel. Sensitif karena alkohol dalam darah dapat

diketahui jumlahnya, walaupun dalam kuantitas kecil.

Kromatografi | 12

Metode analisa GC/MS sangat tepat digunakan dalam menganalisa

kandungan alkohol dalam darah, karena metode ini hanya bisa digunakan

untuk menganalisa komponen yang bersifat volatil. Alkohol yang terdapat

dalam darah merupakan senyawa hidrokarbon yang bersifat volatil/mudah

menguap sehingga sangat tepat menggunakan metoda GC/MS.

Metode GC/MS tidak hanya memisahkan komponen tertentu saja,

melainkan dapat memisahkan semua komponen yang ada dalam sampel

dengan baik. Sehingga, kita dapat mengetahui semua kandungan yang

terdapat dalam sampel darah dengan lengkap. Karena obat-obatan

terlarang yang dikonsumsi oleh seseorang juga beraneka ragam sehingga

metode ini sangat tepat karena dapat memisahkan seluruh komponennyan

dan dapat mengetahui jenis obat-obatan terlarang apa saja yang

dikonsumsi oleh seseorang.

Waktu yang diperlukan cepat (penentuan alkohol dapat dilakukan dalam

6-8 menit) bila alat-alatnya dihangatkan secara teratur. Selain cepat,

ketajaman dan keakuratan dalam proses pemisahan juga cukup tinggi,

sehingga metode ini sangat efektis dan efisien.

3. Dalam analisis komponen, dikenal juga metode HPLC. Apa yang anda

ketahui tentang alat tersebut?

Jawab:

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau biasa juga

disebut dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah metode

pemisahan yang didasarkan pada perbedaan kesetimbangan distribusi

komponen sampel antara dua fasa yaitu diam (kolom) dan gerak (system

pelarut yang mengalir). HPLC juga merupakan alat untuk menganalisa

kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif

(Julia K, 1996).

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam

sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa

konsentrasi utama dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Dua

point yang sangat krusial dalam HPLC yaitu proses separasi/pemisahan dan

Kromatografi | 13

yang kedua adalah proses identifikasi. Teknik ini sangat berguna untuk

memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mwmpunyai

afinitas selektif antara fasa diam dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan

detector serta integrator, akan didapatkan kromatogram. Kromatogram

memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

HPLC biasanya digunakan untuk senyawa yang memiliki berat

molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakkin baik jika

molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahanpun juga akan

semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasi secara

kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen

tersebut secara koantitatif.

HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam

dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC

sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal

dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun

demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diam.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi

secara kimiawi.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation

atau anion dengan suatu fase gerak. Yang paling luas penggunaannya

adalah polistiren resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-

masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup

dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi

Digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat

molekul > 2000 dalton.

Kromatografi | 14

6. Kromatografi Afinitas

Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat

spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat

menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan

dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai contohnya interaksi antara

antigen dan antibodi.

Rangkaian alat yang digunakan dalam metode HPLC yaitu:

Gambar 1. Rangkaian peralatan HPLC

(Sumber: http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-

kinerja-tinggi.html)

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut

kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase

gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2

liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut

yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi

dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen

sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase

Kromatografi | 15

gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase

gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan

komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan

mengacaukan analisis. Fase gerak yang sering digunakan untuk pemisahan

dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau

campuran air dengan asetonitril. Sedangkan dengan fase normal, yang

sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan

pelarut jenis alkohol.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas,

baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya

mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan

fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif,

pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan

kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem

penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase

gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari

gangguan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam

untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kromatografi | 16

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat

spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan

detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang

hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor

UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor

harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil.

c. Stabil dalam pengopersiannya.

d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut

pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Tugas III

Percobaan ini menggunakan gas chromatography dengan thermal conductivity

(TC) detector. Instrument tidak mampu untuk mendeteksi konsentrasi suatu

senyawa yang terlalu rendah, yang akan terdeteksi dalam bentuk gas. Sampel

Anda akan terdiri dari campuran dua alcohol, etanol dan n-propanol. Propanol

akan berfungsi sebagai senyawa pembanding (standar dalam), sedangkan etanol

adalah senyawa yang akan ditentukan. Campuran diinjeksikan ke dalam GC,

teruapkan pada blok injeksi yang panas, dan akan melewati kolom. Komponen

dalam campuran akan dipisahkan oleh material yang mengisi kolom dan diubah

menjadi sinyal listrik yang diterima oleh suatu recorder. Sinyal tersebut dicetak

pada kertas grafik yang berputar. Tinggi puncak akan digunakan sebagai kuantitas

senyawa yang terdeteksi, yang juga terdapat pada sampel.

Kromatografi | 17

Contoh sistem GC berikut ini digunakan untuk menganalisis sampel darah.

Laju alir: 60 L/min; menggunakan gas pembawa helium atau nitrogen,

Arus filament: 180 mA

Suhu kolom: 90oC

Kolom isian: 10% DC-200 pada kromosorb P

Ukuran kolom: 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 mm ketebalan film

Atenuasi: 4

Ukuran sampel: 5 mikroliter

Suggested column: DC-200, 10% or Carbowax 20M, 10% on 60-80 mesh

Chromosorb P

Reagents

Absolute etanol

n-Propanol

Hasil yang diperoleh:

Dari 5 qL larutan standar etanol dan n propanol masing-masing menunjukkan puncak pada 2,4 dan 7,2 menit

Sebanyak 5 qL dari campuran sampel standar menghasilkan data sebagai berikut:

Tabel 1.Data Analisis Alkohol dengan GC-MS

No Etanol (mL) n-Propanol (mL) Tinggi Puncak Etanol(mm)

1 0,1 1,9 3,75

2 0,2 1,8 7,50

3 0,3 1,7 11,25

4 0,4 1,6 15

5 0,5 1,5 18,75

Kromatografi | 18

Dari hasil injeksi 5 qL sampel darah diperoleh puncak pada 2,4 menit dengan tinggi senilai 12,5 mm

Pada salah satu campuran standar etanol dan n-propanol yang digunakan

menunjukkan data sbb: lebar dasar puncak pada etanol dan n-propanolberturut-

turut adalah 1,45 menit dan 3,65 menit

Bagaimana anda menentukan:

a. Konsentrasi senyawa etanol dalam sampel darah

b. Resolusi kolom (Rs) [tanpa satuan]

c. Jumlah piringan rata-rata (N rata-rata)

d. Tinggi piringan (H) dalam meter

e. Panjang kolom bila resoliusi kolom menjadi 1.5

f. Waktu elusi senyawa etanol dalam kolom yang telah diperpanjang

Jawab:

a. Konsentrasi senyawa etanol dalam sampel darah

Dari data-data yang didapat bisa diketahui konsentrasi etanol untuk

masing masing sampel, yaitu :

Tabel 2. Data Analisis Alkohol dengan GC-MS

No Etanol

(mL) n-Propanol

(mL)

Volume (ml/ml)

Etanol dalam Sampel

Standar

Tinggi Puncak

Etanol (mm)

1 0,1 1,9 5% 3,75

2 0,2 1,8 10% 7,50

3 0,3 1,7 15% 11,25

4 0,4 1,6 20% 15

5 0,5 1,5 25% 18,75

Kromatografi | 19

Grafik 1. Kurva Kalibrasi Standar

Dari grafik, didapatkan nilai persamaan garisnya yaitu:

r = Bs + H r = 75s 20

Dengan diketahuinya tinggi puncak etanol= 12,5 mm maka dapat diketahui volume etanol dalam sampel standar yaitu:

r = 75s 12,5 = 75s s = 0,16

Nilai x merupakan nilai %volume, oleh karena itu kandungan senyawa etanol dalam sampel adalah:

v8VA3VD8VA8@8B:8Bw?@ = 0,16s5px = 0,83px

= z, {|}~U{ b. Resolusi Kolom (Rs) [Tanpa satuan]

Data-data yang diketahui adalah sebagai berikut:

( )ARt = waktu retensi etanol = 2,4 menit ( )BRt = waktu retensi n-propanol = 7,2 menit WA = lebar dasar puncak etanol = 1,45 menit

y = 75x

R = 1

0

5

10

15

20

0% 10% 20% 30%

Tin

gg

i P

un

cak

Eta

no

l (m

m)

Volume Etanol (%)

Kurva Kalibrasi Standar

Tinggi puncak Etanol(mm)

Linear (Tinggi puncak

Etanol(mm))

Kromatografi | 20

WB = lebar dasar puncak n-propanol = 3,65 menit

Persamaan yang digunakan untuk mencari nilai Rs adalah sebagai berikut:

( ) ( )[ ]BA

ARBR

BAS WW

tt

WW

ZR

+

=+=

22

(21)

[ ]menitmenit

menitmenitRS 65,345,1

4,22,72

+=

88,11,5

6,9 ==menit

menitRS

Jadi, nilai resolusi kolom (Rs) = 1,88

c. Jumlah piringan rata-rata (N rata-rata)

( )BRt = waktu retensi n-propanol = 7,2 menit ( )ARt = waktu retensi etanol = 2,4 menit WA = lebar dasar puncak etanol = 1,45 menit

WB = lebar dasar puncak n-propanol = 3,65 menit

Persamaan yang digunakan untuk mencari nilai jumlah piringan rata-rata (N

rata-rata) adalah sebagai berikut:

2

16

=W

tN R

(22)

Perhitungan jumlah piringan untuk etanol:

2

16

=W

tN R

833,43menit45,1

menit 2,416

2

=

=N

Perhitungan jumlah piringan untuk n-propanol:

2

16

=W

tN R

Kromatografi | 21

258,62menit65,3

menit 7,216

2

=

=N

Perhitungan jumlah piringan rata-rata:

78=8 78=8 = ?=8VG@ + V w7Gw8VG@2

78=8 78=8 = 43,833 + 62,2582 = 53,045

Jadi, jumlah piringan rata-rata (N rata-rata) = 53,045

d. Tinggi piringan (H) dalam meter

Misal :

Panjang kolom (L) yang digunakan adalah sepanjang 75 cm

Maka, tinggi piringan (H):

cmcm

N

LH 414,1

045,53

75 ===

e. Panjang kolom bila resolusi kolom menjadi 1,5

Panjang kolom bila resolusi kolom menjadi 1,5 (Rs)2

Dari persamaan:

22

2

'

'1

116

+

=

B

BS k

kRN

(23)

diketahui bahwa dan kB konstan (tidak berubah) dengan berubahnya N dan

L, sehingga diperoleh persamaan seperti berikut :

(24)

Subtitusi (Rs)1 = 1,88 ; (Rs)2 = 1,5 ; dan N1 = 53,045 ke dalam persamaan di

atas, sehingga didapat jumlah piringan (N2) bila resolusi diharapkan menjadi

1,5:

( )( )

2

1

2

1

N

N

R

R

S

S =

Kromatografi | 22

33

77,33

88,1

5,1045,53

045,53

5,1

88,1

2

2

2

2

2

=

=

=

N

N

N

N

Jumlah piringan dibulatkan menjadi 33 karena tidak bisa dibulatkan ke atas

menjadi 34 sehingga dibulatkan ke bawah.

Jadi, panjang kolom bila resolusi kolom diharapkan menjadi 1,5:

cmcmcmL

xHNL

47662,46414,133 ===

f. Waktu elusi senyawa etanol dalam kolom yang telah diperpanjang

Diketahui persamaan waktu (tR)B yang dibutuhkan untuk mengelusi 2

senyawa tersebut dengan resolusi Rs adalah:

( ) ( )( )

+

=

2

322

'

'1

1

16

B

BSBR

k

k

u

HRt

(25)

dari persamaan di atas, diketahui bahwa tR ~ RS 2, sehingga diperoleh

persamaan:

2

2

21

2

1

)(

)(

Rs

Rs

t

t

AR

AR = (26)

Jadi, waktu elusi etanol pada kolom yang telah diperpanjang tsb:

( )( )

( ) detik68,91menit528,15,1

88,1

)(

4,2

2

2

2

2

==

=

RA

RA

t

t

Kromatografi | 23

BAB III

Kesimpulan

Alkohol mudah berdifusi ke dalam darah. Maka untuk menentukan kandungan

alcohol dalam tubuh, dapat diambil dari sampel darahnya.

Biasanya untuk menguji kandungan alcohol dalam darah dapat digunakan

metode GC/MS karena lebih efektif dan memiliki banyak keuntungan

dibandingkan dengan metode analisa lainnya karena beberapa sebab.

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah metode pemisahan

yang didasarkan pada perbedaan kesetimbangan distribusi komponen sampel

antara dua fasa yaitu diam (kolom) dan gerak (system pelarut yang mengalir).

Kandungan etanol dalam darah dapat diketahui konsentrasinya dengan

menggunakan GC/MS melalu perhitungan menggunakan kurva kalibrasi

standar.

Parameter yang dianalisis pada GC dan MS yaitu panjang kolom, tinggi

piringan, jumlah piringan yang efektif, waktu retensi, dan resolusi kolom.

Kandungan etanol dalam darah dapat diketahui konsentrasinya dengan

menggunakan GC/MS melalu perhitungan menggunakan kurva kalibrasi

standar.

Parameter yang dianalisis pada GC dan MS yaitu panjang kolom, tinggi

piringan, jumlah piringan yang efektif, waktu retensi, dan resolusi kolom.

Kromatografi | 24

Daftar Pustaka

Adam Wiryawan.2011. Parameter Pemisahan pada Kolom Kromatografi.

(Online) http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/

kromatografi1/parameter-pemisahan-pada-kolom-kromatografi/ Diakses

pada 29 November 2014

Adnamazida, Rizqi. 2013. 9 Efek Samping Mengonsumsi Alkohol. (Online)

http://www.merdeka.com/sehat/9-efek-samping-mengonsumsi-

alkohol.html. Diakses: 30 November 2014 pukul 10:30 WIB.

Anonim, Analysis of Blood Plasma for Ethanol by Gas Chromatography

http://www.oberlin.edu/chem/ForChemLab/Alcohol/AlcoholPStudents.pdf

(29 November 2014)

Anonim. Makalah Chromatography Gas (GC). (Online)

http://www.chayoy.com/2012/06/makalah -cromatography-gas-gc.html

(Diakses pada 29 November 2014)

Anonymous. (2010). Definition of High-performance liquid chromatography

(HPLC). [Online], dari : http://www.chemicool.com/definition/high_

performance_liquid_chromatography_hplc.html [diakses pada 22

November 2014] Anonymous. 2013. Fakta Tentang Alkohol. (Online) http://gosehat.com/fakta-

tentang-alkohol. Diakses: 30 November 2014 pukul 11:23 WIB.

Anonymous. 2013. 8 Efek Negatif Mengonsumsi Minuman Beralkohol Secara

Berlebihan. (Online) http://www.jawaban.com/read/article/id/2013/10/

9/65/131009161727/8-Efek-Negatif-Mengonsumsi-Minuman-Beralkohol-

Secara-Berlebihan.html. Diakses: 30 November 2014 pukul 10:43 WIB.

Clark, Jim. 2007. Kegunaan Alkohol. (Online) http://www.chem-is-

try.org/materi_kimia/sifat_senyawa_organik/alkohol1/kegunaan_ alkohol/.

Diakses: 30 November 2014 pukul 09:48 WIB.

Day, R.A. dan Underwood,A.L. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif (terjemahan).

Edisi kelima. Jakarta: Erlangga.

Kromatografi | 25

Dwina Ramadiani. 2014. HPLC. [Online] Dari:

http://www.academia.edu/5267709/HPLC_LENGKAP_HPLC_ADALAH

_HPLC_High_Performance_Liquid_Chromatography.

Hendayana, Sumar.1995. Kimia Analitik Instrumen. Semarang: IKIP Semarang

Press.

Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed.,

John Wiley & Sons, New York.

Nisak, Nashirotu, 2008, Penentuan Kadar Alkohol dalam Urin dengan

Kromatografi Gas, Skripsi, Jurusan Kimia-FMIPA, Universitas Udayana,

Bukit Jimbaran

Skoog, D.A., et.al., Fundamentals of Analytical Chemistry Sixth Edition.

Saunders College Publishing: London.

Winarto, Dwi. 2013. Golongan Alkohol. (Online)

http://www.ilmukimia.org/2013/03/golongan-alkohol.html. Diakses: 30

November 2014 pukul 10:10 WIB.