Malattie da espansione di repeats instabili

• fenomeno scoperto nel 1991 (FraX, SBMA)

• inizialmente noto come “espansione di triplette”

• poi tetra- penta-nucleotidi: “repeats instabili”

Caratteristica comune:

fenomeno dell’anticipazione

Effetto biologico:

1. perdita di funzione della proteina

2. guadagno di funzione (CAG)

3. effetto tossico dell’mRNA

Malattie da espansione di repeats instabili:perdita della proteina

Sindrome dell’X fragile E: CCGs del 5’UTR con iper-metilazionee silenziamento del gene. Proteina ricca in serine e proline,possibile fattore trascrizionale

Atassia di Friedreich: GAAs nel primo introne con ridotta espressionee inibizione dell’elongazione. Proteina “fratassina” possibile trasportodel Ferro nei mitocondri con riduzione delle ferro-proteine.

Sindrome dell’ X fragileripetizioni CGG nel 5’UTR

> 200

5 - 44 CGG con AGG ogni 9-10 triplette

da 54 – 58 fino a 200 - 230

38 kb in Xq27.3

Sindrome dell’X fragile

Caratteristiche clinicheritardo mentale- moderato nei maschi- lieve nelle femminealtri segni- macrocefalia, faccia allungata- oriecchie sborgenti e basse- lassità articolare- macro-orchidismoBiologia molecolare99% dei casi: CGG >2001% dei casi: delezioni, mut puntiformiPrevalenza16-25 su 100.000 maschi

Sindrome dell’ X fragile

Sindrome dell’ X fragile

• Maschi e femmine possono trasmettere la pre-mutazione

• Durante la meiosi materna la pre-mutazione può espandersi a “mutazione”

08/05/2006

94/25 96/25 85/25 90

> 500

111/31

31

85 118 83

16/05/2005

13ritardo mentale

45POF 36

74tremori intensi

60 Sede ignota tremori intensi

90 CGG

28-86 CGG

26-600 CGG

Sindrome dell’ X fragile:portatori di pre-mutazione (1:300)

Sindrome FXTAS (maschi)- progressiva atassia cerebellare e tremore intenzionale- perdita della memoria a breve termine, declino cognitivo- parkinsonismo, neuropatia periferica- disfunzione autonomica- debolezza muscolare dei cingoli (arti inf.)Penetranza: 17% a 60 aa 38% a 70 aa

47% a 80 aa 75% oltre gli 80 aa2.2% delle atassie dell’età adulta4.4% delle atassie ad esordio > 50 aa

POF (femmine)- menopausa < 40aa nel 21% circa delle portatrici

Mutazioni dominanti

effetto “tossico” dell’RNA messaggero

Gene FMR1CGG: 54-200- POF- FXTAS

CGG > 200- FMR

Sindrome dell’ X fragile:Analisi in PCR

Amplificazione della regione 5’UTR del gene FMR1

Sindrome dell’ X fragile:Analisi in PCR

Maschio normale29 CGGs

Femmina normale22-28 CGGs

Femmina pre-M29-68 CGGs

Femmina pre-M29-58 CGGs

Femmina affetta28 CGGs In caso di full-mutation, l’allele

espanso NON è amplificabile

Sindrome dell’ X fragile:Analisi in Southern blotting

EcoRI EcoRIEagI

2.8 kb X attiva5.2 kb X inattiva

EcoRIEagI

Allele pre-mutato> 2.8 kb X attiva> 5.2 kb X inattiva

EcoRI

Allele mutato>> 5.2 kb

EcoRIEagIEcoRI

Endonucleasi di restrizioneEnzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici

Blunt Ends = estremità prive di estensione

L’ ibridazione del DNA

DNA a doppia elica

denaturazione(soluzioni saline e/o calore)

DNA a singolo filamento

Singolofilamentocomplementare

marcaturaradioattiva o fluorescente

SONDA

Southern Blotting (DNA)

Trasferimento di acidi nucleicisu filtro , ibridizzazione e auto-radiografia.

Diagnosi mediante Southern blottingdi delezioni genomiche

• digestione del DNA genomico• separazione in gel di agarosio • trasferimento su nitrocellulosa• ibridazione con sonda di cDNA • analisi dei frammenti riconosciuti

dalla sonda

Conclusione: • il gene testato (X linked) è assente

nel figlio maschio• la madre ha solo una copia del

gene (l’intensità delle bande èsimile a quella della padre).

Diagnosi mediante Southern blottingdi delezioni genomiche.

Perdita di un sito di restrizione -> banda di giunzione

sond

a

(eterozigote)

mut

WTmut

Sindrome dell’ X fragile:Analisi in Southern blotting

RITARDO MENTALE• Ritardo mentale di varia entità colpisce il 3% della

popolazione (si definiscono con R.M. pazienti con Q.I. inferiore a 70)

• le cause eziologiche sono identificate in meno del 50% dei casi

• cause esogene sono responsabili dal 18,6% al 44% dei casi di R.M.

• cause genetiche sono responsabili dal 17% al 47,1% dei casi di R.M.– FRAX-A, FRX-E, anomalie cromosomiche

• queste variazioni nelle percentuali possono essere dovute:– al grado di R.M.– al criterio di selezione dei pazienti esaminati– alla definizione delle diagnosi

Delezioni sub-telomeriche

Inclusioni citoplasmatiche , nucleari o entrambe .

Malattie da espansione di repeats instabili:guadagno di funzione

Corea di Huntington

• difetti di coordinazione motoria• movimenti involontari coreici (arti, faccia, tronco)• difficoltà nella programmazione delle attività• depressione, irritabilità e demenza• difficoltà nei movimenti volontari• disartria e disfagia• bradicinesia, rigidità e distonia• tentativi di suicidio (28%)• infezioni polmonari e urinarie, insufficienza cardiaca• atrofia del caudato e putamen alla TC o RMN• Esordio : 35-44 anni (raramente infantile-senile)

• Decorso : 10-20 anni (progressivo)

Gene HD 4p16.3

67 esoni – mRNA di 13654 basi – 3141 aa (350kD)

5’ UTR

Esone 121 CAG (10-26)

Esone 2

Esone 3…..

Trascritto gene HD

L’età di insorgenza correla con l’entità dell’espansione

Le triplette CAG si espandono preferibilmente alla meiosi paternaRange Normale: 10-26 Intermedio: 27-35 Patologico: > 36

Proteina “Huntingtina”

• proteina espressa nei neuroni di diverse aree del SNC (citoplasmatica e nucleare)

• perdita di funzione della proteina mutata ? • tossicità della proteina mutata ?

– proteolisi– rilascio di un frammento N-term con poli-Glu– formazione di aggregati citoplasmatici e nucleari– sequestro di altre proteine e fattori di trascrizione

• prococe difetto del trasporto assonale• segnale pro-apoptotico e morte cellulare

Malattie da espansione di repeats instabili:alterata funzione dell’RNA

….ed effetto biologico sconosciuto !

(1:8.000-10.000)

Il fenomeno dell’anticipazionenella distrofia miotonica

Da una generazione all’altra l’età di insorgenza diminuisce e la gravità della malattia aumenta

Distrofia Miotonica:correlazione tra fenotipo e lunghezza

del CTG repeat

3’UTR introne 1