Upload
lydiep
View
238
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Title: Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji gleb skażonych związkami ropopochodnymi
Author: Małgorzata Pawlik
Citation style: Pawlik, Małgorzata. (2018). Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji gleb skażonych związkami ropopochodnymi. Praca doktorska. Katowice : Uniwersytet Śląski
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska
Uniwersytet Śląski w Katowicach
MAŁGORZATA PAWLIK
PRACA DOKTORSKA
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji gleb skażonych
związkami ropopochodnymi
Praca doktorska wykonana
w Katedrze Mikrobiologii
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
Promotor:
Prof. dr hab. Zofia Piotrowska-Seget
Katowice 2018
Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki w ramach grantu PRELUDIUM
2013/09/N/NZ9/01606
Pracę wykonywano przy wsparciu stypendialnym w ramach projektu UPGOW – Uniwersytet
Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzy oraz DoktoRIS – Programu stypendialnego na
rzecz innowacyjnego Śląska współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
Serdeczne podziękowania składam:
Pani prof. dr hab. Zofii Piotrowskiej-Seget, Promotorowi niniejszej pracy
za zainteresowanie przedmiotem badań, przekazaną wiedzę, motywację
do pracy, wyrozumiałość i cierpliwość.
Panu prof. dr Jaco Vangronsveld za możliwość odbycia stażu w Hasselt
University, Centre for Environmental Sciences (CMK).
Dr Sofie Thijs za wyjaśnienie wielu kwestii związanych z bakteriami
endofitycznymi oraz wprowadzenie w tajniki pirosekwencjonowania.
Dr Ariadnie Sánchez-López oraz Dr Evdokii Syranidou za pomoc
w laboratorium, dyskusje naukowe oraz inspirującą atmosferę pracy.
Dr Magdalenie Pacwie-Płociniczak za dyskusje nie tylko naukowe, wsparcie,
dzięki któremu łapałam oddech i precyzowałam cele badawcze, inspirację,
pomoc w analizach, oraz wiarę w realizację zadań, która stawiała na nogi.
Dr Tomaszowi Płociniczak za pomoc w analizie chromatograficznej
oraz dzielenie się swoim doświadczeniem, przede wszystkim za życzliwość,
bezinteresowne wsparcie i możliwość polegania w każdej sytuacji.
Dr Magdalenie Noszczyńskiej oraz Dr Kindze Bondarczuk za ciepłe słowo,
niezliczone rozmowy i życzliwość, która motywowała mnie do pracy.
Dr Sławomirowi Sułowiczowi za pomoc w analizie statystycznej.
Pracownikom i Doktorantom Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Śląskiego
za wspaniałą atmosferę w pracy.
Rodzinie i Mężowi Mateuszowi za każdy dzień zrozumienia, wsparcia,
mobilizację do pracy i wiarę w to, że dzięki pracy mogę osiągnąć zamierzony cel.
Pracę dedykuję mojej Rodzinie
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Spis treści 5
Spis treści
Wykaz skrótów ................................................................................................................................. 8
I. PRZEGLĄD LITERATURY ...................................................................................................... 10
1.1. Związki ropopochodne ............................................................................................................ 10
1.2. Bioremediacja .......................................................................................................................... 13
1.3. Fitoremediacja ......................................................................................................................... 15
1.4. Bakterie endofityczne .............................................................................................................. 18
1.4.1. Charakterystyka bakterii endofitycznych ......................................................................... 20
1.4.2. Cechy warunkujące kolonizację gospodarza .................................................................... 22
1.4.3. Proces kolonizacji ............................................................................................................. 26
1.5. Endofity promujące wzrost roślin ........................................................................................... 29
1.6. Fitoremediacja wspomagana przez bakterie endofityczne ...................................................... 32
II. CEL PRACY ............................................................................................................................. 36
III. MATERIAŁY I METODY ...................................................................................................... 37
3.1. Materiały ................................................................................................................................. 37
3.1.1. Materiał roślinny ............................................................................................................... 37
3.1.2. Podłoża i odczynniki chemiczne ...................................................................................... 38
3.2. Metody ..................................................................................................................................... 39
3.2.1. Izolacja bakterii endofitycznych zdolnych do rozkładu surowej ropy naftowej .............. 39
3.2.2. Wykorzystanie węglowodorów jako jedynego źródła węgla i energii ............................. 39
3.2.3. Charakterystyka genotypowych cech bakterii endofitycznych ........................................ 40
3.2.3.1. Określenie przynależności gatunkowej wyizolowanych szczepów ........................... 40
3.2.3.2. Detekcja genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów ...... 41
3.2.3.3. Detekcja genu acdS .................................................................................................... 42
3.2.3.4. Analiza elektroforetyczna .......................................................................................... 43
3.2.4. Biochemiczna charakterystyka bakterii endofitycznych .................................................. 43
3.2.4.1. Rozpuszczanie fosforanów ........................................................................................ 43
3.2.4.2. Wytwarzanie kwasu indolilo-3-octowego (IAA)....................................................... 43
3.2.4.3. Wytwarzanie cyjanowodoru (HCN) .......................................................................... 44
3.2.4.4. Produkcja sideroforów ............................................................................................... 44
3.2.4.5. Hamowanie wzrostu fitopatogennych grzybów......................................................... 44
3.2.4.6. Produkcja enzymów celulolitycznych ....................................................................... 45
3.2.4.7. Zdolność do ruchu ..................................................................................................... 45
3.2.4.8. Biosynteza biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów ..................................................... 45
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Spis treści 6
3.2.5. Pirosekwencjonowanie 454 .............................................................................................. 46
3.2.5.1. Izolacja DNA z roślin ................................................................................................ 46
3.2.5.2. PCR ............................................................................................................................ 46
3.2.5.3. Analiza wyników pirosekwencjonowania 454 .......................................................... 47
3.2.6. Doświadczenie fitoremediacyjne ...................................................................................... 48
3.2.6.1. Gleba .......................................................................................................................... 48
3.2.6.2. Szczepy bakterii endofitycznych ............................................................................... 49
3.2.6.3. Inokulum .................................................................................................................... 49
3.2.6.4. Doświadczenie fitoremediacyjne ............................................................................... 50
3.2.6.5. Oznaczenie zawartości TPH w glebie........................................................................ 51
3.2.6.6. Ocena przeżywalności wprowadzonych bakterii endofitycznych ............................. 51
3.2.6.7. Badanie wpływu introdukowanych szczepów bakterii na przyrost biomasy roślin .. 52
3.2.6.8. Określenie wpływu wprowadzonych szczepów na ogólną liczebność i liczebność
bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych w glebie .................................. 52
3.2.7. Analiza statystyczna ......................................................................................................... 53
IV. WYNIKI ................................................................................................................................... 54
4.1. Izolacja bakterii endofitycznych zdolnych do wykorzystania surowej ropy naftowej ............ 54
4.2. Określenie przynależności gatunkowej izolatów .................................................................... 55
4.3. Ocena wykorzystania węglowodorów jako jedynego źródła węgla i energii przez bakterie
endofityczne ................................................................................................................................... 59
4.4. Detekcja genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów ................... 60
4.5. Detekcja genu acdS ................................................................................................................. 61
4.6. Biochemiczna charakterystyka bakterii endofitycznych ......................................................... 62
4.6.1. Mechanizmy promujące wzrost roślin .............................................................................. 62
4.6.2. Produkcja enzymów celulolitycznych .............................................................................. 66
4.6.3. Zdolność do ruchu ............................................................................................................ 67
4.6.4. Hamowanie wzrostu fitopatogennych grzybów ............................................................... 67
4.6.5. Biosynteza biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów ............................................................ 68
4.7. Bioróżnorodność zespołów bakterii endofitycznych ............................................................... 69
4.8. Doświadczenie fitoremediacyjne............................................................................................. 82
4.8.1. Oznaczenie zawartości TPH w glebie .............................................................................. 82
4.8.2. Ocena przeżywalności wprowadzonych bakterii endofitycznych .................................... 83
4.8.3. Wpływ introdukowanych szczepów bakterii na biomasę roślin ....................................... 85
4.8.4. Określenie wpływu wprowadzonych szczepów na ogólną liczebność i liczebność bakterii
zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych w glebie ................................................... 86
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Spis treści 7
V. DYSKUSJA ............................................................................................................................... 89
5.1. Bioróżnorodność zespołów bakterii endofitycznych frakcji hodowalnej i niehodowalnej roślin
narażonych na wysokie stężenie związków ropopochodnych w glebie ......................................... 89
5.2. Wykorzystanie węglowodorów przez bakterie endofityczne i obecność genów kodujących
enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów u badanych izolatów ...................................... 94
5.3. Charakterystyka wyizolowanych bakterii endofitycznych ...................................................... 95
5.4. Wpływ bakterii endofitycznych na efektywność usuwania TPH z gleby oraz wzrost roślin w
procesie fitoremediacji ................................................................................................................... 98
5.5. Przeżywalność bakterii endofitycznych wprowadzanych do gleby i ich zdolność do
kolonizacji tkanek roślinnych ....................................................................................................... 100
5.6. Wpływ introdukowanych szczepów bakterii endofitycznych na bakterie autochtoniczne gleby
...................................................................................................................................................... 101
VI. WNIOSKI .............................................................................................................................. 102
VII. STRESZCZENIE .................................................................................................................. 103
VIII. SUMMARY ........................................................................................................................ 105
IX. LITERATURA ....................................................................................................................... 107
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wykaz skrótów 8
Wykaz skrótów
ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylate acid, kwas 1-aminocyklopropano-1-
karboksylowy
AHL N-acylated L-homoserine lactone, lakton N-acylo-L-homoseryny
ANOVA analysis of variance, analiza wariancji
ARDRA amplified ribosomal DNA restriction analysis, analiza restrykcyjna
zamplifikowanych fragmentów rybosomalnego DNA
BLAST basic local alignment search tool, algorytm służący do porównywania
sekwencji aminokwasów białek lub nukleotydów DNA z tymi zawartymi w
bazach danych
BTEX benzene, toluene, ethylbenzene, xylene, benzen, toluen, etylobenzen, ksylen
CAS Chrome Azurol S, barwnik
CK cytokininy
CMC carboxymethylcellulose agar, podłoże z karboksymetylocelulozą
C-TAB hexadecyltrimethylammonium bromie, bromek
haksadecylotrimetyloamoniowy
CWDE cell wall degrading enzymes, enzymy degradujące ścianę komórkową
D indeks Simpsona
DDT dichlorodifenylotrichloroetan
DNA deoxyribonucleic acid, kwas deoksyrybonukleinowy
dNTP trifosforany deoksyrybonukleotydów
EPA Environmental Protection Agency, Amerykańska Agencja Ochrony
Środowiska
EPS egzopolisacharyd
GA gibereliny
H’ indeks Shanonna
HCN cyjanowodór
IAA kwas indolilo-3-octowy, auksyna
IAM indole-3-acetamide, indolilo-3-acetamid
IPyA indole-3-pyruvate, kwas indolilo-3-pirogronowy
ISR induced systemic resistance, indukowana odporność systemiczna
j.t.k. jednostki tworzące kolonie
LB Luria Bertani, podłoże Luria Bertani
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wykaz skrótów 9
log Kow logarytm współczynnika podziału n–oktanol/woda
LPS lipopolisacharyd
LZO lotne związki organiczne
MID sekwencja identyfikująca
MOMP major outer membrane protein, główne białko zewnątrzbłonowe
MW metabolity wtórne
NCBI national center for biotechnology information database, bioinformatyczna
baza danych
Nod nodulation factors, czynniki wpływające na powstawanie brodawek
korzeniowych
NRE non-rhizobial endophytes, nierizobiowe bakterie endofityczne
OD optical density, gęstość optyczna
OTU operational taxonomic units, operacyjne jednostki taksonomiczne
PCoA principal coordinate analysis, analiza głównych współrzędnych
PCR polymerase chain reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy
PDA Potato Dextrose Agar, podłoże
PGPE plant growth-promoting endophytes, endofity promujące wzrost roślin
pz par zasad
QIIME quantitative insights into microbial ecology
qPCR quantitative polymerase chain reaction, reakcja polimerazy w czasie
rzeczywistym (real-time PCR)
QS Quorum Sensing
ROS reactive oxygen species, reaktywne formy tlenu
s.m. sucha masa
ś.m. świeża masa
SAR systemic acquired resistance, nabyta odporność systemiczna
SD standard deviation, odchylenie standardowe
sid siderofory
TISS-TVISS six different secretion systems I-VI, bakteryjne systemy sekrecji I-VI
TPH total petroleum hydrocarbons, indeks oleju mineralnego
TR regulatory transkrypcji
TSA Tryptic Soy Agar, podłoże
VBNC viable but non-culturable, żywe lecz niehodowalne mikroorganizmy
WWA wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 10
I. Przegląd literatury
1.1. Związki ropopochodne
Ropa naftowa jest złożoną mieszaniną wielu związków chemicznych powstałych
w przebiegu skomplikowanych reakcji biochemicznych, chemicznych oraz geochemicznych
(Saleem, 2016; Logeshwaran i wsp., 2018). Wśród tych składowych, wyróżniamy nasycone
lub nienasycone węglowodory alifatyczne, jedno- i wielopierścieniowe węglowodory
aromatyczne, związki heterocykliczne zawierające jeden lub kilka atomów tlenu, azotu
lub siarki (tiofeny, pirydyna, pirole, benzofurany, fenole) oraz śladowe ilości jonów metali
ciężkich, takich jak: ołów, cyna, arsen, rtęć, german, antymon, tal, wanad, żelazo (Rys. 1)
(Thapa i wsp., 2012; Logeshwaran i wsp., 2018).
Rys. 1. Przykładowe substancje ropopochodne występujące w surowej ropie naftowej
(https://energy.usgs.gov/GeochemistryGeophysics/Geochemistry Research/Organic
Originsof Petroleum.aspx).
Węglowodory alifatyczne, zawierające od trzech do jedenastu atomów węgla
w cząsteczce, są najbardziej reaktywne, a w wysokich stężeniach mają działanie toksyczne
(Nyyssonen, 2009; Logeshwaran i wsp., 2018). Związki lotne lub szybko parujące jak np.
benzen, toluen, etylobenzen, ksylen i ich alkilowe pochodne (BTEX, ang. benzene, toluene,
ethylbenzene, xylene), ulatniają się do atmosfery. BTEX oraz wielopierścieniowe
Ropa naftowa
Atom węgla
Atom wodoru
Atom siarki
Metan
Asfalt
Frakcja
gazowa
Substancje
smoliste
Atom tlenu
Atom azotu
Wiązanie chemiczne
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 11
węglowodory aromatyczne (WWA) to najbardziej uciążliwe i zarazem niebezpieczne
dla środowiska i organizmów żywych składniki produktów naftowych (Chambers i wsp.,
2018). Wynika to między innymi z ich oporności na degradację oraz akumulację
w ekosystemach lądowych i wodnych (Maliszewska-Kordybach i wsp., 2008).
W wyniku wydobywania, transportu, składowania i przeróbki ropy naftowej,
dochodzi do skażenia wielu terenów, a zanieczyszczenie gruntów i wód związkami
ropopochodnymi stanowi poważny ogólnoświatowy problem (Khan i wsp., 2013, 2017; Farag
i wsp., 2018; Logeshwaran i wsp., 2018). Znaczący wzrost zużycia ropy naftowej nastąpił
po zakończeniu II Wojny Światowej w krajach szybko rozwijających się. W Polsce w ciągu
ostatnich 50 lat zmniejszyło się zużycie węgla kamiennego na rzecz szerokiego
wykorzystania ropy naftowej i gazu ziemnego (Bocheński i Bocheńska, 2008). Badania
Maliszewskiej-Kordybach i wsp. (2008) wykazały, że w Polsce występują miejsca, gdzie
poziom skażenia węglowodorami, zwłaszcza WWA, jest wysoki i przekracza dopuszczalne
stężenia tych związków zawarte w Rozporządzeniu Ministra Środowiska z dnia 9 września
2002 r. w sprawie standardów jakości gleby oraz standardów jakości ziemi (Dziennik Ustaw
nr 165, poz. 1359).
Obecność związków ropopochodnych w środowisku niesie ze sobą realne zagrożenie
dla wszystkich organizmów żywych (Saleem, 2016; Logeshwaran i wsp., 2018). Związki
te mogą dostawać się do organizmu wraz z wdychanym powietrzem, gdyż często występują
w stanie gazowym lub adsorbują się na cząstkach aerozolu (Chambers i wsp., 2018).
Ze względu na dobrą rozpuszczalność węglowodorów w lipidach, ulegają one łatwej
akumulacji w żywych organizmach, co skutkuje biomagnifikacją tych substancji na kolejnych
poziomach łańcucha troficznego (Mueller i Shann, 2006; Zhang i wsp., 2010). Dlatego też,
największa ilość związków ropopochodnych dostaje się do organizmu ludzi i zwierząt wraz
z pożywieniem (Kubiak, 2013). Podczas wielu procesów biotransformacji węglowodorów
(np. w wątrobie), powstają reaktywne metabolity mające silne powinowactwo do białek,
aminokwasów oraz kwasów nukleinowych (Franco i wsp., 2008). Metabolity te już
w niewielkich stężeniach wykazują działanie toksyczne, mutagenne i kancerogenne
(Maliszewska-Kordybach i wsp., 2008; Nyyssonen, 2009).
Substancje ropopochodne trafiając do środowiska wywołują w nim liczne zmiany
natury fizycznej, chemicznej i biologicznej (Nyyssonen, 2009; Khan i wsp., 2017;
Logeshwaran i wsp., 2018). Zdecydowana większość tych substancji pochodzi ze źródeł
antropogenicznych, a około 90% z nich ostatecznie akumuluje się w glebie (Gocht i wsp.,
2007; Lang i wsp., 2016). Szczególnie wysokie stężenia węglowodory osiągają
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 12
w powierzchniowych warstwach gleby, co związane jest z ich niską rozpuszczalnością
w wodzie oraz dużym powinowactwem do materii organicznej (Maliszewska-Kordybach
i wsp., 2008; Logeshwaran i wsp., 2018). W wyniku sorpcji/desorpcji czy sekwestracji
dochodzi do gromadzenia się związków ropopochodnych na granicy niemieszających się faz:
ciekłej (roztwór glebowy), stałej (materia organiczna) i gazowej (powietrze glebowe).
Węglowodory mogą być adsorbowane na mineralnych lub organicznych cząstkach gleby,
w efekcie czego powstają kompleksy o różnej sile i trwałości wiązania. W konsekwencji,
ich biodostępność zostaje znacząco ograniczona, a rozkład staje się utrudniony i spowolniony
(Kołwzan, 2008; Ukalska-Jaruga i wsp., 2015). Zatykanie porów glebowych przez związki
ropopochodne powoduje zmniejszenie pojemności wodnej gleby, a także zakłóca wymianę
powietrza. Wraz z akumulacją węglowodorów, zmienia się pH gleby, powstaje deficyt
dostępnych form azotu i fosforu, zwiększa się zawartość węgla organicznego w środowisku
(Kołwzan, 2008; Lang i wsp., 2016). Zanieczyszczenia te mogą być wymywane w głąb
profilu gleby i/lub pod wpływem sił grawitacji przedostawać się do wód gruntowych.
W rezultacie tych wszystkich zmian równowaga biologiczna w środowisku narażonym
na węglowodory zostaje zakłócona (Logeshwaran i wsp., 2018).
Zanieczyszczenie gleby przez substancje ropopochodne powoduje daleko idące
zmiany widoczne także u roślin (Rusin i wsp., 2015). Problem ten wydaje się być szczególnie
ważny w sytuacji stałego narażenia roślin na kontakt z tymi związkami. Wyniki analiz
materiału roślinnego wskazują, że przeważająca część WWA obecnych w tkankach roślin
pochodzi z zanieczyszczeń antropogenicznych (Kubiak, 2013; Lang i wsp., 2016).
Ze względu na ograniczony lub zahamowany przez węglowodory dostęp wody, soli
mineralnych i powietrza do korzeni, rośliny stopniowo obumierają. Bardzo często dochodzi
również do zmian zawartości makro- i mikroelementów w organach roślinnych (Ziółkowska
i Wyszkowski, 2010; Rusin i wsp., 2015), a także niedoboru jonów metali, będących
ważnymi składnikami enzymów roślinnych katalizujących wiele przemian (Ujowundu i wsp.,
2011; Rusin i wsp., 2015). Ponadto, u wielu roślin występujących na skażonych terenach,
obserwowano deformację korzeni oraz liści i/lub kwiatów. Rośliny te charakteryzowała także
zaburzona organogeneza i zmniejszona zawartość chlorofilu (Paskova i wsp., 2006; Rusin
i wsp., 2015). W roślinnych częściach nadziemnych może dochodzić do zwiększonej
akumulacji związków ropopochodnych z powietrza, ze względu na ich powinowactwo
do lipidów, które między innymi występują w kutykuli liści i igieł (Balasubramaniyam,
2015). Zanieczyszczenia te przenikają do głębszych warstw tkanek roślinnych, zakłócając
przewodzenie wody w naczyniach i przyczyniając się do obumierania różnych organów
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 13
roślinnych (Balasubramaniyam, 2015). Co więcej, rośliny w celu związania węglowodorów, a
tym samym oddzielenia ich od komórek i tkanek, mogą wytwarzać wiele metabolitów
wtórnych (związki cyjanogenne, fenolowe, siarkowe i saponiny), które mogą być toksyczne
dla zwierząt i ludzi (Rakowska i wsp., 2012; Kubiak, 2013).
Związki ropopochodne obecne w glebie mogą w sposób bezpośredni oddziaływać
również na mikroorganizmy, co wynika z wysokiego ich powinowactwa do błony
komórkowej bakterii, jak i błony zewnętrznej u bakterii Gram-ujemnych (Sikkema i wsp.,
1995; Certik i wsp., 2003; Murinowa i Dercova, 2014). Węglowodory zmieniają funkcjonalne
i strukturalne właściwości tych membran. Nagromadzenie ich cząsteczek w błonie
komórkowej prowadzi do utraty jej integralności oraz wzrostu przepuszczalności dla jonów.
Konsekwencją tych zmian jest zaburzenie homeostazy, ciśnienia osmotycznego i pH
wewnątrz komórki bakteryjnej. Oprócz zmian w warstwie lipidowej, węglowodory
bezpośrednio wpływają na białka komórkowe zakotwiczone w błonie. W konsekwencji
dochodzi do zmiany konformacji białek błonowych, inhibicji aktywności białek
enzymatycznych związanych z błonami oraz pomp protonowych (Sikkema i wsp., 1995;
Certik i wsp., 2003; Murinowa i Dercova, 2014).
Mikroorganizmy narażone na węglowodory wykształciły różnorodne mechanizmy
oporności na te substancje. Są one związane między innymi z modyfikacją składu lipidowego
błony komórkowej, polegającą na zwiększaniu ilości nasyconych kwasów tłuszczowych
w błonie i konwersji nienasyconych kwasów z konformacji cis do trans. Ponadto, wzrasta
stopień usieciowania ściany komórkowej oraz hydrofilowość warstwy S i lipopolisacharydu
(LPS), a węglowodory mogą być aktywnie transportowane przez pompy poza komórkę
bakterii (Sikkema i wsp., 1995; Murinowa i Dercova, 2014).
1.2. Bioremediacja
Ze względu na nieodzowną konieczność oczyszczania środowiska z toksycznych
substancji, a także potrzebę przywracania równowagi biologicznej, opracowano wiele metod
remediacji skażonych terenów (Vangronsveld i wsp., 2009; Thapa i wsp., 2012; Khan i wsp.,
2013, 2017). W celu usunięcia związków ropopochodnych stosuje się metody fizyczne,
chemiczne i/lub biologiczne (Rakowska i wsp., 2012; Saleem, 2016). Każda z tych technik
może zostać przeprowadzona in situ, czyli w miejscu występowania skażenia, bądź ex situ,
w której gleba wymaga przetransportowania do punktu jej oczyszczania (Rakowska i wsp.,
2012; Thapa i wsp., 2012). Metody fizykochemiczne są kosztowne, mogą prowadzić
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 14
do zmiany struktury gleby, wymagają użycia specjalistycznego sprzętu i/lub substancji
chemicznych, często dodatkowo zanieczyszczających glebę (Pawlik i wsp., 2015;
Logeshwaran i wsp., 2018). Obiecującą alternatywą tych technologii są biologiczne metody
oczyszczania środowiska. Są one znacznie tańsze niż metody fizykochemczne, nie niszczą
struktury gleby, przywracają bioróżnorodność gatunkową, mogą być stosowane na dużym
obszarze i są powszechnie akceptowane przez społeczeństwo (Mrozik i wsp., 2003, 2005;
Vangronsveld i wsp., 2009).
Techniki bioremediacyjne wykorzystują naturalny potencjał mikroorganizmów
do degradacji zanieczyszczeń organicznych. Mikroorganizmy posiadają wykształconą
w drodze ewolucji zdolność do rozkładu niemal wszystkich naturalnych związków
organicznych występujących w przyrodzie oraz ich syntetycznych pochodnych (Mrozik
i wsp., 2003, 2005). Szczepy bakterii i grzybów, zdolne do rozkładu węglowodorów, można
wyizolować ze środowisk skażonych i nieskażonych. Jednak w tych ostatnich, udział takich
szczepów w całej populacji mikroorganizmów glebowych jest niewielki i stanowi 0,01-1%
(Łyszcz i Gałązka, 2016). Pojawienie się związków ropopochodnych, szczególnie w bardzo
dużym stężeniu, silnie oddziałuje na strukturę zespołów mikroorganizmów, powodując
usuwanie mikroorganizmów wrażliwych, a promując wzrost komórek wykazujących
oporność i/lub zdolność rozkładu węglowodorów. Związki te, pomimo swojej toksyczności,
są dodatkowym źródłem węgla, co prowadzi do wzrostu liczebności szczepów zdolnych do
ich degradacji (Siciliano i wsp., 2001; Tardif i wsp., 2016).
Mikroorganizmy mogą wykorzystywać związki ropopochodne jako jedyne źródło
węgla i energii lub rozkładać je na drodze kometabolizmu (Mrozik i wsp., 2003, 2005; Guzik
i wsp., 2010; Thapa i wsp., 2012). Jednak, nie wszystkie węglowodory ropopochodne
są w takim samym stopniu podatne na biodegradację, która wzrasta w następującej kolejności:
alkany cykliczne<małocząsteczkowe węglowodory aromatyczne<alkany rozgałęzione<n-
alkany (Lang i wsp., 2016). Szczególnie oporne na rozkład mikrobiologiczny są WWA
zbudowane z czterech i większej liczby pierścieni (Gałązka, 2015; Logeshwaran i wsp.,
2018).
Istotnymi czynnikami wpływającymi na efektywność procesu biodegradacji
związków ropopochodnych są: pH gleby, temperatura, której zakres powinien się mieścić
w granicach 15-45°C, dostępność pierwiastków biogennych, niezbędnych do wzrostu
i rozwoju mikroorganizmów oraz odpowiednia wilgotność związana z rozpuszczalnością
substancji ropopochodnych (Weyens i wsp., 2009c; Saleem, 2016). Kolejnym czynnikiem
determinującym biodegradację tych substancji jest tlen, gdyż rozkład węglowodorów
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 15
zachodzi głównie w warunkach tlenowych. Natomiast stężenie związków ropopochodnych
w środowisku, które ma zostać oczyszczone, nie powinno przekraczać biologicznej tolerancji
mikroorganizmów na te substancje (Thapa i wsp., 2012; Gałązka, 2015). Do rozkładu
związków ropopochodnych zdolne są bakterie zaliczane do rodzajów Achromobacter,
Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium,
Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Sarcina, Serratia,
Sphingomonas, Vibrio oraz Xanthomonas (Seo i wsp., 2009; Stolz, 2009; Khan i wsp., 2013;
Lang i wsp., 2016). Szczepy te mogą degradować węglowodory ropopochodne
wieloetapowymi, nieraz bardzo skomplikowanymi szlakami metabolicznymi. Przykładowo,
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 przekształca piren do intermediatów cyklu Krebsa
w ponad dwudziestu etapach katalizowanych przez różne enzymy (Kim i wsp., 2007).
Biodegradacja węglowodorów wymaga aktywności, oprócz oksygenaz, także dehydrogenaz
i hydrolaz (Guzik i wsp., 2010). Enzymy uczestniczące w metabolizmie węglowodorów
zwykle charakteryzuje specyficzność względem grupy podobnych strukturalnie substratów.
Przykładowo, dioksygenaza naftalenowa katalizuje rozkład wielu małocząsteczkowych
WWA, a monooksygenaza alkanowa bierze udział w biodegradacji różnych węglowodorów
alifatycznych (Nyyssonen, 2009; Guzik i wsp., 2010).
1.3. Fitoremediacja
Jedną z biologicznych metod, która skupia na sobie coraz większą uwagę, jest
fitoremediacja (Pawlik i wsp., 2015; Ijaz i wsp., 2016; Eskandary i wsp., 2017). Termin
fitoremediacja pochodzi od greckiego słowa phyton–roślina i łacińskiego remediare–
oczyszczać. Polega ona na wykorzystaniu naturalnych zdolności roślin i towarzyszących
im mikroorganizmów do degradacji szkodliwych substancji występujących na skażonych
terenach (Weyens i wsp., 2009a,b,c,d; Ijaz i wsp., 2016; Eskandary i wsp., 2017). Technika
ta jest stosowana do usuwania wielu rodzajów zanieczyszczeń, w tym związków
ropopochodnych (Khan i wsp., 2013; Pawlik i wsp., 2015). Ze względu na złożoność
procesów towarzyszących fitoremediacji, szczególnie sposobu pobierania i eliminacji
toksycznych związków przez roślinę (akumulacji, sekwestracji, degradacji, transpiracji),
wyróżniono kilka rodzajów fitoremediacji. Zalicza się do nich fitoekstrakcję, fitostabilizację,
fitodegradację, fitowolatylizację i ryzodegradację (Rys. 2) (Ijaz i wsp., 2016).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 16
Rys. 2. Rodzaje fitoremediacji.
Szacuje się, że fitoremediacja jest dziesięciokrotnie tańsza od fizykochemicznych
metod remediacji gleby, gdyż napędza ją energia słoneczna. Zastąpienie tradycyjnych technik
fizykochemicznych, daje oszczędności w wysokości nawet 50-80% (van Epps, 2006).
Obliczono, że koszt oczyszczania terenu ze związków ropopochodnych, przy zastosowaniu
fitoremediacji, to około 17-100 USD za m3 gleby, natomiast przy wykorzystaniu technik
fizykochemicznych sięga on 10-10 000 USD za m3 gleby (Frick i wsp., 1999; Dudai i wsp.,
2018). Ze względu na fakt, że oczyszczanie gleby za pomocą fitoremediacji wymaga długiego
czasu, kilku lub nawet kilkunastu lat, analizując koszty przeprowadzenia tego procesu, należy
wziąć pod uwagę perspektywę co najmniej pięciu lat. Wtedy, szczegółowe wyliczenia
pokazują, że koszt fitoremediacji danego obszaru to 250 000 USD, podczas gdy zastosowanie
metod fizykochemicznych wymaga nakładów około 660 000 USD (Kamath i wsp., 2004;
Doty, 2008). Zaletami fitoremediacji są nie tylko niskie koszty, ale także fakt, że rośliny
ograniczają rozprzestrzenianie się zanieczyszczeń poza skażony teren, a metoda ta, jako
„zielona” alternatywa dla tradycyjnych technik oczyszczania środowiska, cieszy się dużym
poparciem społecznym (Eskandary i wsp., 2017).
Fitowolatylizacja
Fitostabilizacja
Ryzodegradacja
Fitoekstrakcja
Fitodegradacja
Zanieczyszczenie
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 17
Niektóre rośliny wykazują ewolucyjnie nabytą zdolność do wzrostu na glebach
skażonych związkami ropopochodnymi i tolerują bardzo wysokie stężenia tych związków.
Nazywa się je naftofitami. Należy do nich między innymi turzyca (Carex sp.), wiechlina
łąkowa (Poa pratensis), życica trwała (Lolium perenne), babka zwyczajna (Plantago major),
pokrzywa zwyczajna (Urtica dioica), które odpowiednio tolerują zanieczyszczenia
ropopochodne występujące w glebie w zakresie 204-504 g kg-1, 112-320 g kg-1, 132-166 g
kg-1, do 470 g kg-1, do 506 g kg-1 (Małachowska-Jutsz i wsp., 2012). Naftofity mają zdolność
do absorpcji, akumulowania i/lub degradacji związków ropopochodnych. Zanieczyszczenia
organiczne są pobierane przez rośliny przede wszystkim na zasadzie dyfuzji prostej
wraz z wodą. Jednak wiele składników ropy naftowej to związki hydrofobowe,
charakteryzujące się wysoką lipofilnością, co uniemożliwia ich swobodne wnikanie do roślin.
Dyfuzja tych lipofilowych substancji jest dodatnio skorelowana z zawartością lipidów
w epidermie korzeni. Dodatkowo, rośliny mogą wydzielać związki powierzchniowo czynne,
takie jak małocząsteczkowe kwasy organiczne lub polipeptydy, które obniżają napięcie
powierzchniowe i emulgują substancje hydrofobowe zwiększając tym samym
ich biodostępność (Wang i wsp., 2016a).
Poza tolerancją na wysokie stężenie związków ropopochodnych w glebie, rośliny
stosowane w procesie fitoremediacji, powinny charakteryzować się szybkim wzrostem,
rozbudowanym i głęboko sięgającym systemem korzeniowym oraz osiąganiem stosunkowo
dużej biomasy. Dlatego ocenia się, że drzewa (topole, wierzby) to jedne z bardziej
przydatnych roślin stosowanych w fitoremediacji (Porteous-Moore i wsp., 2006; Doty, 2008).
Niemniej jednak, w zależności od typu zanieczyszczenia i rodzaju terenu, z powodzeniem
wykorzystuje się także rośliny zielne np. trawy i rośliny strączkowe (Khan i wsp., 2013).
Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA, ang. Environmental Protection Agency)
poleca stosować przede wszystkim natywne gatunki roślin, czyli takie, które naturalnie
występują na obszarze, który chce się poddać fitoremediacji. Taka praktyka zapobiega
wprowadzaniu i potencjalnemu rozprzestrzenianiu się obcych gatunków roślin. W Polsce
kwestię tę reguluje Ustawa o Ochronie Przyrody z dnia 16 kwietnia 2004 r. (art. 120, ust. 1).
Gatunki roślin, które z powodzeniem wykorzystano w fitoremediacji związków
ropopochodnych to m.in.: dziwaczek peruwiański (Mirabilis jalapa), lucerna siewna
(Medicago sativa), życica (Lolium perenne, Lolium multiflorum), komonica zwyczajna (Lotus
corniculatus), sorgo dwubarwne (Sorghum bicolor), kukurydza zwyczajna (Zea mays), trawa
bermuszka (Cynodon dactylon), uczep zwisły (Bidens cernua), gailardia oścista (Gaillardia
aristata), jeżówka purpurowa (Echinacea purpurea), kostrzewa trzcinowa (Festuca
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 18
arundinacea) (Kaimi i wsp., 2006; Shirdam i wsp., 2008; Peng i wsp., 2009; Tang i wsp.,
2010; Yousaf i wsp., 2010b; Hall i wsp., 2011; Liu i wsp., 2012).
1.4. Bakterie endofityczne
Termin „endofit” (gr. endon–w, wewnątrz; phyton–roślina) obejmuje zarówno
bakterie, jak i grzyby, kolonizujące zdrowe i żywe tkanki i/lub przestrzenie
międzykomórkowe roślin, nie powodując przy tym żadnych objawów chorobowych u swoich
gospodarzy (Hardoim i wsp., 2008; Weyens i wsp., 2009b,c,d; Reinhold-Hurek i Hurek,
2011). Jest to unikalna grupa mikroorganizmów, które towarzyszą roślinom i wchodzą z nimi
w bardzo ścisłe interakcje. W praktyce termin ten odnosi się do mikroorganizmów
wyizolowanych z powierzchniowo wysterylizowanych organów roślinnych. Jednak definicja
obejmuje także te bakterie, których hodowla w warunkach laboratoryjnych jest ograniczona
bądź niemożliwa, a ich obecność w roślinie wykrywana jest za pomocą metod molekularnych
(Gaiero i wsp., 2013; Beckers i wsp., 2017).
Większość scharakteryzowanych do tej pory bakterii endofitycznych to gatunki
hodowane na standardowych podłożach mikrobiologicznych i opisane w oparciu o analizę
cech fenotypowych (Hung i wsp., 2007; Kukla i wsp., 2014b; Pawlik i Piotrowska-Seget,
2015; Pawlik i wsp., 2017). Ze względu na specyficzność zajmowanej niszy ekologicznej,
prowadzenie hodowli endofitów w warunkach laboratoryjnych jest bardzo trudne. Powoduje
to, że wiedza na temat ilościowego i jakościowego składu zespołów bakterii endofitycznych
roślin jest nadal niepełna. Trudność w ocenie rzeczywistej bioróżnorodności endofitów
wynika, w dużej mierze, z niemożliwości izolacji i hodowli większości z tych
mikroorganizmów klasycznymi metodami hodowlanymi. Bakterie endofityczne mogą
występować jako niehodowalne, ale aktywne metabolicznie formy VBNC (viable but non-
culturable) (Hurek i wsp., 2002; Gamalero i wsp., 2004, 2005; Compant i wsp., 2010).
Przełomem w badaniach nad bioróżnorodnością zespołów mikroorganizmów endofitycznych
było zastosowanie technik biologii molekularnej, takich jak: PCR, real-time PCR,
elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego, sekwencjonowania
oraz zaawansowanych analiz bioinformatycznych. Metody te pozwoliły na poznanie
w znaczenie większym zakresie hodowalnej i niehodowalnej frakcji tej grupy
mikroorganizmów (Kuklinsky-Sobral i wsp., 2004; Souza i wsp., 2013; Romero i wsp., 2014;
Beckers i wsp., 2017).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 19
Większość znanych i opisanych bakterii endofitycznych zaliczanych jest do grup
Alpha-, Beta- oraz Gammaproteobacteria, rodzin Pseudomonaceae, Burkholderiaceae
i Enterobacteriaceae. Jednak to właśnie Gammaproteobacteria jest grupą najbardziej
zróżnicowaną i dominującą (Kuklinsky-Sobral i wsp., 2004; Aleklett i wsp., 2015; Truyens
i wsp., 2016; Sanchez-Lopez i wsp., 2017). Najczęściej bakterie endofityczne identyfikowane
są jako gatunki z rodzajów Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Microbacterium,
Micrococcus, Pantoea, Pseudomonas oraz Stenotrophomonas (Seghers i wsp., 2004; Sun
i wsp., 2008; Kukla i wsp., 2014b; Thijs i wsp., 2014). Ostatnie badania obejmujące
bioróżnorodność mikrobiomu roślinnego koncentrują się nad poznaniem niehodowalnej
frakcji bakterii endofitycznych (Souza i wsp., 2013; Romero i wsp., 2014; Shi i wsp., 2014;
Beckers i wsp., 2017). Szczegółowa analiza metagenomiczna DNA izolowanego z tkanek
ryżu pozwoliła na opisanie bioróżnorodności mikrobiomu tej rośliny. Badania te potwierdziły
dominację szczepów należących do Gammaproteobacteria i rodzaju Enterobacter
oraz Alphaproteobacteria wraz z rodzajem Rhizobium (Sessitsch i wsp., 2012), a także
występowanie rzadkich gatunków bakterii należących do Delta- oraz Epsilonproteobacteria
(Sun i wsp., 2008). Analizy metagenomiczne przeprowadzone przez Tsurumaru i wsp. (2015)
wykazały, że mikrobiom buraka cukrowego (Beta vulgaris) zdominowany jest przez gatunki
endofitów należące do Alpha-, Betaproteobacteria i Actinobacteria. Z kolei inne analizy
metagenomiczne wykazały, że mikrobiom korzenia i łodygi sorgo (Sorghum sp.) znacząco
różni się od siebie. Jednak w obu organach dominują bakterie należące do rodzajów takich
jak: Microbacterium, Agrobacterium, Sphingobacterium, Herbaspirillum, Erwinia,
Pseudomonas oraz Stenotrophomonas (Maropola i wsp., 2015).
Analizy sekwencji prokariotycznego DNA wyizolowanego z roślin potwierdziły,
że także archeony stanowią istotną składową mikrobiomu niektórych roślin. Organizmy
należące do Archaea zostały odnalezione w endosferze trzciny pospolitej (Phragmites
australis), drzewa kawowego (Coffea arabica), drzewa oliwnego (Olea europaea)
oraz buraka cukrowego (Beta vulgaris) (Ma i wsp., 2013; Oliveira i wsp., 2013; Muller
i wsp., 2015; Shi i wsp., 2015). Wśród endofitów danego gospodarza, archeony mogą
stanowić niemałą cześć całego mikrobiomu, co sugeruje ich znaczącą funkcję
w oddziaływaniu z rośliną. W przypadku endosfery drzew oliwnych organizmy należące
do Archaea (Thaumarchaeota, Crenarchaeota oraz Euryarchaeota) stanowiły, aż 35,8%
wszystkich zidentyfikowanych grup mikroorganizmów (Muller i wsp., 2015). Archeony
z grupy Thaumarchaeota mają zdolność do utleniania amoniaku, a tym samym wpływają
na obniżenie pH wewnątrz tkanki roślinnej, co może chronić gospodarza przed
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 20
fitopatogenami. Jednak dokładna rola tych organizmów podczas kolonizacji roślin nie została
opisana. Z kolei, analizy metagenomiczne mikrobiomu ryżu, nie wykazały obecności żadnej
z grup archeonów w endosferze tych roślin (Sessitsch i wsp., 2012).
1.4.1. Charakterystyka bakterii endofitycznych
Wyróżniamy bakterie endofityczne obligatoryjne, fakultatywne i oportunistyczne
(okazjonalne) (Hardoim i wsp., 2008; Reinhold-Hurek i Hurek, 2011). Podział ten związany
jest z długością cyklu życiowego bakterii, podczas którego zasiedlają wnętrze roślin (Pisarska
i Pietr, 2014). Endofity obligatoryjne to mikroorganizmy ściśle i trwale związane ze swoim
gospodarzem. Wykazano, że endofity te utraciły wiele cech umożliwiających im przeżycie
poza rośliną (Hardoim i wsp., 2008; Weyens i wsp., 2009c,d; Truyens i wsp., 2015). Bytują
one w tkankach roślin przez cały swój cykl życiowy, tworząc podstawowy mikrobiom
gospodarza kształtowany już na etapie zawiązywania nasion. Endofity przekazywane
są kolejnym pokoleniom za pośrednictwem nasion i/lub wegetatywnego materiału
rozmnożeniowego (Pisarska i Pietr, 2014; Truyens i wsp., 2015). Druga grupa, endofity
fakultatywne, obejmuje bakterie, które mogą występować i rozwijać się zarówno w roślinie,
jak i poza nią, a wnikają do roślinnego gospodarza z otaczającego środowiska. Z kolei
endofity okazjonalne to bakterie, które tylko w określonych warunkach występują we wnętrzu
tkanek i wykorzystują substancje organiczne pochodzenia roślinnego. Ponadto, chronią się
we wnętrzu roślin, gdzie w porównaniu do środowiska glebowego, konkurencja między
mikroorganizmami jest mniejsza (Compant i wsp., 2005; Hardoim i wsp., 2008; Weyens
i wsp., 2009c,d; Pisarska i Pietr, 2014).
Bakterie endofityczne mogą kolonizować wszystkie organy roślinne: korzenie,
łodygi, liście, kwiaty, owoce, nasiona i brodawki korzeniowe. Liczebność oraz różnorodność
gatunkowa bakterii endofitycznych jest zmienna wzdłuż osi rośliny (Bulgarelli i wsp., 2012;
Gaiero i wsp., 2013). Najbardziej ilościowo i jakościowo zróżnicowany mikrobiom roślin
obserwuje się w korzeniach, co wynika z bezpośredniego ich kontaktu z glebą, będącą
głównym rezerwuarem endofitów (Thijs i wsp., 2014; Santoyo i wsp., 2016). Wraz
ze wzrostem odległości od miejsca kolonizacji, a także mniejszą ilością składników
mineralnych dostarczanych przez ksylem, zmniejsza się liczebność i różnorodność bakterii
endofitycznych (Gaiero i wsp., 2013; Beckers i wsp., 2017). Organy generatywne zazwyczaj
są ich pozbawione.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 21
Liczebność bakterii endofitycznych w korzeniu wynosi średnio 105-107 j.t.k.
(jednostek tworzących kolonie) g-1 ś.m. (świeżej masy) korzenia, podczas gdy w łodygach
wartości te wahają się w granicach 103-104 j.t.k. g-1 ś.m. łodyg, a w liściach 102-103 j.t.k. g-1
ś.m. liści (Rosenblueth i Martinez-Romero, 2006; Weyens i wsp., 2009d; Compant i wsp.,
2010; Mercado-Blanco i Lugtenberg, 2014). Największe różnice w liczebności bakterii
endofitycznych obserwuje się w nasionach, w których waha się ona od 55 j.t.k. g-1 u fasoli
(Rosenblueth i wsp., 2010), przez 103-105 j.t.k. g-1 u ryżu (Hardoim i wsp., 2012), do nawet
107 j.t.k. g-1 u rzepaku (Graner i wsp., 2003). Liczebność bakterii endofitycznych zmienia się
wraz ze wzrostem, rozwojem i wiekiem rośliny (Wagner i wsp., 2016). W młodych siewkach
jest najmniejsza i wzrasta w trakcie rozwoju, aby w roślinach dojrzałych zwiększyć się prawie
dwukrotnie (Stępniewska i Kuźniar, 2013).
Wspólnie z bakteriami symbiotycznymi (rizobiami), bakterie endofityczne mogą
występować w brodawkach korzeniowych. Nazywane są wtedy nierizobiowymi bakteriami
endofitycznymi (NRE, ang. non-rhizobial endophytes) i mogą stanowić nawet do 24%
wszystkich mikroorganizmów występujących w brodawkach (De Meyer i wsp., 2015). NRE
nie indukują u roślin powstawania brodawek korzeniowych oraz nie posiadają genów nod
(Palaniappan i wsp., 2010). Są to kluczowe cechy NRE, umożliwiające ich identyfikację
i odróżnienie od rizobiów. Wykazano, że wspólna inokulacja NRE i rizobiów zwiększa
efektywność tworzenia brodawek korzeniowych oraz promuje wzrost roślin (Rajendran
i wsp., 2008; Pandya i wsp., 2015). Ponadto, obecność bakterii endofitycznych NRE
w brodawkach korzeniowych ułatwia wiązanie azotu atmosferycznego i przyswajanie
go przez roślinę (Subramanian i wsp., 2015).
Proces kolonizacji brodawek korzeniowych przez bakterie endofityczne Rhizobium
sp. KAW12 zachodzić może tylko w obecności bakterii symbiotycznych Mesorhizobium loti,
które indukują tworzenie nici infekcyjnych poprzez wydzielanie czynników Nod (ang.
nodulation factors). Co więcej, proces ten jest regulowany i kontrolowany przez roślinę
poprzez transkrypcję odpowiednich genów (Cyclops, Cerberus, Nap1, ArpC1, Npl1, Alb1)
we wczesnej fazie zawiązywania symbiozy. Aktywność u roślin innych genów, takich jak:
Crinkle oraz Sst1, jest niezbędna podczas infekcji i symbiozy bakterii symbiotycznych M. loti,
natomiast podczas kolonizacji przez bakterie endofityczne, ich aktywności nie wykazano.
Sugeruje to, występowanie u roślin specyficznych mechanizmów będących odpowiedzią
na obecność bakterii endofitycznych (Zgadzaj i wsp., 2015).
Przypuszcza się, że każda z blisko 300 000 obecnie znanych roślin jest zasiedlana
przez jeden lub wiele gatunków bakteryjnych endofitów (Ryan i wsp., 2008). Różnorodność
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 22
endofitów nie jest stała i zależy w dużej mierze od gatunku i wieku rośliny, rodzaju tkanki,
sezonu wegetacyjnego, warunków środowiska, typu, rodzaju i właściwości
fizykochemicznych gleby (Bulgarelli i wsp., 2012, 2013; Gaiero i wsp., 2013). Nie bez
znaczenia pozostają także wszelkie zabiegi rolnicze (nawożenie, stosowanie pestycydów)
(Seghers i wsp., 2004) oraz obecność zanieczyszczeń (metale ciężkie, związki ropopochodne)
(Khan i wsp., 2013; Ma i wsp., 2016).
Wielu autorów jest zgodnych w kwestii, że to roślina „decyduje” o tym, które
mikroorganizmy tworzyć będą jej mikrobiom (Bulgarelli i wsp., 2013; Beckers i wsp., 2017).
Niezwykle interesującym jest fakt, że rośliny z terenów zanieczyszczonych posiadają
zdolność do przyciągania bakterii endofitycznych degradujących toksyczne związki. Siciliano
i wsp. (2001) wykazali, że w korzeniach kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea)
liczebność bakterii endofitycznych posiadających geny alkB oraz ndoB, związanych
z rozkładem związków ropopochodnych była odpowiednio dwa i cztery razy większa niż
w glebie pozakorzeniowej. W badaniach Lemanceau i wsp. (1995) wykazano, że len
zwyczajny (Linum usitatissimum) oraz pomidor (Lycopersicon esculentum) przyciągały
specyficzne szczepy z rodzaju Pseudomonas. Natomiast, Arabidopsis thaliana wytwarzała
atraktanty dla szczepów Bacillus spp., które produkowały związki hamujące wzrost
fitopatogenów (Kloepper i wsp., 2004). Wprowadzenie na powierzchnię liści A. thaliana
fitopatogennych bakterii Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 indukowało wydzielanie
przez korzenie kwasu jabłkowego, co z kolei wzmagało chemotaksję, tworzenie biofilmu
i kolonizację tkanek korzenia przez endofity B. subtilis FB17. Zjawisko to nie występowało,
gdy A. thaliana inokulowano niepatogennymi szczepami Pseudomonas syringae NPS3121
(Rudrappa i wsp., 2008). Wyniki tych badań potwierdzają istotny udział roślin w selekcji
bakterii endofitycznych, wykazujących pożądane cechy.
1.4.2. Cechy warunkujące kolonizację gospodarza
Proces kolonizacji tkanek roślinnych jest wieloetapowy oraz uwarunkowany
rozpoznaniem roślina-endofit na poziomie molekularnym (Piński i Hupert-Kocurek, 2016).
Bakterie endofityczne posiadają szereg cech, które warunkują ich zdolność do efektywnej
kolonizacji rośliny, a także umożliwiają funkcjonowanie w tkankach gospodarza (Rys. 3).
Analiza funkcjonalnych bakteryjnych mutantów delecyjnych, pozwoliła wyróżnić
te właściwości endofitów, które pełnią istotną rolę w procesie wnikania, rozprzestrzeniania
i oddziaływania z roślinnym gospodarzem. Za najważniejsze uważa się te cechy, które
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 23
determinują: zdolność do chemotaksji, aktywnego ruchu, adhezji, tworzenia biofilmu,
Quorum Sensing (QS), produkcji enzymów degradujących ścianę komórkową (CWDE, ang.
cell wall degrading enzymes), oporność na stres oksydacyjny i osmotyczny, sekrecję
i translokację białek efektorowych (TISS-TVISS, ang. secretion systems I-VI), syntezę LPS
i egzopolisacharydu (EPS) (Piński i Hupert-Kocurek, 2016). U bakterii endofitycznych cechy
te nie zawsze występują jednocześnie (Santoyo i wsp., 2016).
Oprócz ruchu chemotaktycznego niezwykle ważna u bakterii jest zdolność
do aktywnego poruszania się za pomocą rzęsek i/lub fimbrii typu IV. Ruch odgrywa istotną
rolę podczas wnikania bakterii do nasion, korzeni i zajmowania kolejnych organów i tkanek.
Ruch drgający, uwarunkowany obecnością fimbrii typu IV, zapewnia efektywną kolonizację
tkanek ryżu bakteriom Azoarcus sp. BH72. Dzięki tym fimbriom, bakterie ściśle przylegają
do epidermy korzeni i tworzą mikrokolonie. Mutanty tych szczepów, mające zmiany w genie
pilT, wytwarzały fimbrie niezdolne do ruchu, co w sposób znaczący pozbawiło Azoarcus sp.
BH72 możliwości inwazji i kolonizacji roślin (Bohm i wsp., 2007). Zdolność do aktywnego
ruchu, to cecha wyróżniająca bakterie endofityczne, co potwierdzono w badaniach
nad mikrobiomem pszenicy, w którym liczba bakterii aktywnie poruszających się była
wewnątrz korzeni pięć razy większa, niż w przyległej do nich ryzosferze (Hung i wsp., 2007).
W innych badaniach wykazano, że większość bakterii endofitycznych wyizolowanych
z nasion ryżu było zdolnych do ruchu, co pozwalało tym szczepom na migrację w kierunku
nasion podczas ich zawiązywania (Ebeltagy i wsp., 2000; Okunishi i wsp., 2005).
Szczepy bakterii endofitycznych posiadają wiele struktur odpowiedzialnych za ścisłe
przyleganie i związanie się z epidermą korzenia. Adhezja komórek bakterii do powierzchni
korzenia uwarunkowana jest występowaniem u bakterii polimerów zewnątrzkomórkowych,
LPS-u i białek ściany komórkowej, a także struktur zewnątrzkomórkowych (rzęsek, fimbrii).
Analiza genomu endofitycznego szczepu Enterobacter sp. 638, potwierdziła obecność
kilkunastu genów kodujących białka biorące udział w adhezji do powierzchni korzeni takich
jak: hemaglutyniny, fimbrie typu I i IV, amyloidowe fimbrie spiralne (ang. curry fibers),
a także otoczkowe polisacharydy. Wiele z tych genów obecnych jest na wyspach genowych
i/lub plazmidach, co sugeruje, że zostały nabyte na drodze horyzontalnego transferu genów
(Taghavi i wsp., 2010). U szczepu Azospirillum brasilense Cd rolę adhezyny pełni główne
białko zewnątrzbłonowe (MOMP, ang. major outer membrane protein), zapewniające
agregację komórek bakteryjnych na powierzchni korzenia, a dodatkowo, zaangażowane
w rozpoznanie właściwego gospodarza (Burdman i wsp., 2001).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 24
Rys. 3. Cechy bakterii endofitycznych warunkujące kolonizację i oddziaływanie z rośliną.
Auksyna (IAA), gibereliny (GA), cytokininy (CK), lotne związki organiczne (LZO),
metabolity wtórne (MW) przenoszone są do komórek gospodarza wpływając m.in.
na wzrost rośliny (fioletowy). Struktury komórki bakteryjnej (fimbrie, pilusy), białka
efektorowe wydzielane przez systemy sekrecji i translokacji (np. TIVSS), LPS,
autoinduktory, antybiotyki aktywują indukowaną odporność systemiczną u roślin
(czerwony). ACC (ang. 1-aminocyclopropane-1-carboxylate acid, kwas 1-
aminocyklopropano-1-karboksylowy), bezpośredni prekursor etylenu, rozkładany
przez bakteryjny enzym deaminazę ACC (ACCD) (jasnozielony). Grupa enzymów
detoksykujących reaktywne formy tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS detoks)
(pomarańczowy). Wiązanie azotu atmosferycznego (N2) i aktywny transport NH4+
i NO3- do gospodarza (ciemnozielony). Wytwarzanie sideroforów (Sid)
i wychwytywanie żelaza (Fe) (brązowy). Substraty transportowane przez kanały
błonowe (żółty). Regulatory transkrypcji (TR) (pomarańczowy) (Hardoim i wsp.,
2015, zmienione).
Mechanizm QS pozwala bakteriom na komunikowanie się i regulację wielu
procesów, w tym także tworzenie biofilmu, adhezję do powierzchni korzenia i kolonizację
tkanek rośliny. Bakterie wydzielają autoinduktory, czyli cząsteczki sygnałowe, regulujące
ekspresję określonych genów w populacji bakterii zasiedlających wspólną niszę ekologiczną
(Dourado i wsp., 2014). U bakterii Gram-ujemnych autoinduktorami są acylowe pochodne
Komórka roślinna Komórka bakteryjna
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 25
laktonu homoseryny (AHL, ang. N-acylated L-homoserine lactone). U Methylobacterium spp.
cząsteczki AHL wpływają na zwiększenie ekspresji genów związanych z oddziaływaniem
bakteria-gospodarz. Z drugiej jednak strony, rośliny mogą regulować bakteryjny mechanizm
QS poprzez produkcję związków reagujących z receptorami AHL. W wyniku
tych oddziaływań sygnał przekazywany przez te receptory może być wzmacniany, wyciszany
lub hamowany (Gao i Teplitski, 2003).
Mikrobiologiczny rozkład polimerów wchodzących w skład ściany komórkowej jest
złożony, a w jego degradacji uczestniczy kilka grup enzymów hydrolitycznych CWDE, takich
jak: celulazy, glukanazy, celobiazy, chitynazy, ksylanazy, pektynazy i poligalakturonazy.
Kompleksy enzymów CWDE są produkowane przez bakterie endofityczne we wczesnej fazie
wnikania do tkanek roślinnych (Hardoim i wsp., 2008). Ich aktywność wydaje się być ważna
dla bakterii endofitycznych, ponieważ 50-62% izolatów posiada zdolność do produkcji
endoglukanazy czy innych enzymów celulolitycznych (Elbeltagy i wsp., 2001; Castro i wsp.,
2014; Kukla i wsp., 2014b). Ponadto, u szczepów z nieaktywnymi genami kodującymi
syntezę endoglukanazy czy endopoligalakturonazy, nie obserwowano wydajnej kolonizacji
epidermy korzenia. Endofity te nie miały również możliwości systemicznego
rozprzestrzeniania się w pozostałych organach rośliny (Compant i wsp., 2005; Reinhold-
Hurek i wsp., 2006). W odróżnieniu od fitopatogenów, bakterie endofityczne wytwarzają
CWDE w znacznie mniejszym stężeniu (Elbeltagy i wsp., 2001).
Bakterie endofityczne wykształciły mechanizmy oporności na obecne w tkankach
roślinnych reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), a także związki
mające działanie antybiotyczne (Fouts i wsp., 2008; Rasche i wsp., 2009). W genomach
bakterii endofitycznych zidentyfikowano geny kodujące enzymy zaangażowane
w detoksykację ROS takie jak: S-transferaza glutationowa, reduktaza glutationowa,
dysmutaza nadtlenkowa, peroksyreduktaza, chloroperoksydaza i katalaza (Fouts i wsp., 2008;
Taghavi i wsp., 2010; Wu i wsp., 2010; Sessitsch i wsp., 2012; Alqueres i wsp., 2013;
Hardoim i wsp. 2015). Mnogość i różnorodność tych enzymów wskazuje na istotność tego
mechanizmu dla prawidłowego funkcjonowania endofitów. Ponadto, u bakterii
endofitycznych zidentyfikowano kompleksy białkowe odpowiedzialne za usuwanie
fitoaleksyn. Są to związki produkowane przez rośliny w celu obrony przed fitopatogenami,
których Stężenie fitoaleksyn wzrasta w wyniku infekcji lub działania czynników
abiotycznych na tkanki roślin (Fouts i wsp., 2008; Rasche i wsp., 2009).
Ważną cząsteczką sygnałową u roślin jest kwas salicylowy, biorący udział
w regulacji nabytej odporności systemicznej (SAR, ang. systemic acquired resistance).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 26
W genomie bakterii endofitycznych Pseudomonas fluorescens PICF7 zidentyfikowano geny
kodujące enzym rozkładający kwas salicylowy (hydroksylaza salicylowa). W ten sposób
endofity mogą zakłócać, wyciszać lub hamować SAR indukowaną podczas kolonizacji tkanek
roślinnych przez fitopatogeny (Martinez-Garcia i wsp., 2015).
Systemy sekrecji pełnią kluczową rolę w infekcji, wirulencji czy patogenezie oraz
warunkują występowanie interakcji między bakteriami endofitycznymi a roślinami (Reinhold-
Hurek i Hurek, 2011; Hardoim i wsp., 2015). U bakterii Gram-ujemnych opisano sześć
systemów sekrecji (TISS-TVISS). Typ I, II, V oraz VI zidentyfikowano u endofitycznych
szczepów, typ III i IV występuje głównie u bakterii patogennych (Ali i wsp., 2014). Pomimo,
iż aktywacja TIIISS oraz TIVSS jest uwarunkowana bezpośrednim kontaktem komórki
bakteryjnej i gospodarza, systemy te rzadko identyfikowane są wśród szczepów bakterii
endofitycznych. Świadczyć to może o odmiennym mechanizmie oddziaływania endofitów
z komórkami roślinnymi, niż inaktywacja systemu odpornościowego gospodarza
czy zniszczenie zainfekowanej tkanki, a to charakteryzuje szczepy patogenne. Najczęściej
u bakterii kolonizujących tkanki roślinne występują systemy sekrecji typu V oraz VI. Są one
ważne dla prawidłowego przebiegu procesów adhezji, tworzenia biofilmu, koniugacji, QS
oraz wirulencji (Boyer i wsp., 2008). Szczególną rolę w optymalizacji oddziaływań bakterie
endofityczne-roślina upatruje się w TVISS, ponieważ zdecydowana większość endofitów
posiada geny hcp, kodujące kluczowe białka tworzące kanał błonowy tego systemu (Sessitsch
i wsp., 2012). Badania Bernal i wsp. (2017) wskazują na dotąd nieznaną funkcję TVISS.
U bakterii endofitycznych Pseudomonas putida KT2440 system ten transportuje
zewnątrzkomórkowo specyficzne białka efektorowe o silnym działaniu antybakteryjnym.
W ten sposób endofity P. putida KT2440 mogą chronić swojego gospodarza przed atakiem
fitopatogenów, takich jak Xanthomonas campestris.
1.4.3. Proces kolonizacji
Proces kolonizacji tkanek roślinnych jest niezbędnym etapem zapewniającym
zawiązanie ścisłych zależności między bakteriami a rośliną. Głównymi drogami wejścia
endofitów do rośliny są miejsca powstawania korzeni bocznych (nasada korzeni bocznych),
wierzchołek wzrostu korzenia głównego, włośniki oraz tak zwane „hot spots” czyli miejsca,
w których epiderma korzenia uległa uszkodzeniu w wyniku działania czynników
abiotycznych i/lub biotycznych (np. działanie fitopatogenów). Proces wnikania bakterii
endofitycznych do rośliny może odbywać się także przez brodawki korzeniowe, przetchlinki,
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 27
otwarte aparaty szparkowe oraz uszkodzoną epidermę części nadziemnych rośliny (Rys. 4).
Drogi te mają jednak niewielkie znaczenie, w porównaniu z kolonizacją tkanek w strefie
wzrostu korzenia. Dlatego, źródłem bakterii endofitycznych najczęściej jest ryzosfera
(Hardoim i wsp., 2008; Weyens i wsp., 2009c,d; Khan i wsp., 2013; Hardoim i wsp., 2015;
Pawlik i wsp., 2015).
Badania wykorzystujące techniki obrazowania struktury materiału biologicznego
(np. mikroskopia elektronowa, znakowanie białkiem zielonej fluorescencji) pokazują,
że mikroorganizmy endofityczne mogą pozostawać w miejscu wniknięcia do rośliny
i/lub migrować przez apoplast i/lub system wiązek przewodzących (Hardoim i wsp., 2008,
2015; Reinhold-Hurek i Hurek, 2011). Dzięki temu, bakterie endofityczne kolonizują
przestrzenie międzykomórkowe, ksylem oraz tkanki określonych organów (korzenie, łodygi,
liście, owoce, nasiona). Migrację bakterii z rodzaju Pseudomonas obserwowali w swoich
badaniach Garbeva i wsp. (2001). Po miesiącu od inokulacji siewek ziemniaka (Solanum
tuberosum), szczepy Pseudomonas sp. zostały zidentyfikowane nie tylko w korzeniach,
ale także w łodygach tych roślin. Ponadto, badania Wagner i wsp. (2016) wykazały,
że znaczna część mikrobiomu korzeni i liści jest podobna, co wskazuje na drogę kolonizacji
bakterii endofitycznych z gleby przez korzenie do liści.
Proces kolonizacji zwykle rozpoczyna się od rozpoznania przez bakterie związków
obecnych w wydzielinach korzeniowych, będących mieszaniną wielu złożonych, często
gatunkowo specyficznych substancji, które selektywnie przyciągają wybrane szczepy bakterii
(Bais i wsp., 2006; Rudrappa i wsp., 2008). Wydzieliny korzeniowe mogą zawierać
węglowodany, aminokwasy, kwasy organiczne, związki fenolowe i/lub flawonoidy (Bacilio-
Jimenez i wsp., 2003; Bais i wsp., 2006; Rosenblueth i Martinez-Romero, 2006), a bakterie
endofityczne są zdolne do ich rozpoznawania, jak i wykorzystania, jako źródło węgla.
W badaniach Yuan i wsp. (2015) stwierdzono, że kwasy organiczne (szczawiowy, jabłkowy,
fumarowy), będące główną składową wydzielin korzeniowych banana (Musa acuminata,
grupa AAA, podgrupa Cavendish), indukują chemotaksję i tworzenie biofilmu u Bacillus
amyloliquefaciens NJN-6. Obserwowano również, że pod wpływem flawonoidów,
w komórkach bakterii dochodzi do aktywacji genów kodujących białka zaangażowane
w proces kolonizacji tkanek roślinnych (Bais i wsp., 2004). Bakterie Serratia spp.
zdecydowanie efektywniej kolonizowały sadzonki ryżu, jeżeli w środowisku obecne były
flawonoidy (Balachandar i wsp., 2006).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 28
Rys. 4. Miejsca kolonizacji i wnikania bakterii endofitycznych do rośliny (czerwone strzałki).
Oznaczenia: 1-wierzchołek wzrostu; 2-„hot spots” (uszkodzenia epidermy); 3-
włośniki; 4-miejsca powstawania korzeni bocznych (Reinhold-Hurek i Hurek, 1998,
zmienione).
Kolejnym etapem wnikania bakterii do gospodarza, jest adhezja komórek bakterii
na powierzchni korzenia. W procesie przylegania można zaobserwować dwa główne etapy:
adhezję wstępną oraz adhezję nieodwracalną. Pierwszy etap, ma charakter odwracalny
i uwarunkowany jest przez oddziaływania fizyczne oraz słabe oddziaływania
międzycząsteczkowe typu van der Waalsa, które pozwalają bakteriom na zbliżenie się
do powierzchni korzeni. Adhezja odwracalna jest na tyle nietrwała, że komórki bakteryjne
można usunąć za pomocą środków fizycznych, bądź chemicznych. Etap drugi-nieodwracalna
adhezja, warunkowana jest przez adhezyny powierzchni komórek bakterii, polimery
polisacharydowe, rzęski i/lub fimbrie. Zapewniają one zakotwiczenie bakterii na powierzchni
korzeni. Warunkiem tworzenia mikrokolonii i biofilmu jest osiągniecie przez bakterie etapu
adhezji nieodwracalnej (Taghavi i wsp., 2010; Kołwzan, 2011).
Ściana komórkowa roślin, w miejscu przylegania bakterii, ulega uszkodzeniu dzięki
działaniu enzymów CWDE. Część bakterii endofitycznych pozbawionych jest zdolności
do produkcji tej grupy enzymów i wnika do wnętrza rośliny w miejscach przerwania ciągłości
Strefa korzeni
bocznych
Strefa
włośnikowa
(różnicowania
się komórek)
Strefa
wydłużania
(elongacyjna)
Czapeczka
korzeniowa
4
3
2
1
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 29
epidermy korzenia. Natomiast, systemiczne rozprzestrzenianie się bakterii endofitycznych
w roślinie jest związane z produkcją enzymów z grupy CWDE (Hardoim i wsp., 2008).
Dzięki aktywności pektynaz, endofity mogą degradować blaszkę środkową, znajdującą się
pomiędzy ścianami komórek roślinnych i w ten sposób rozprzestrzeniać się w całej roślinie
(Sessitsch i wsp., 2012).
1.5. Endofity promujące wzrost roślin
Wiele bakterii endofitycznych wywiera korzystny wpływ na swojego gospodarza,
stymulując jego wzrost i rozwój. Wyniki ostatnich badań wskazują, że endofity poprawiają
kondycję i zwiększają zdolności adaptacyjne roślin do niekorzystnych warunków środowiska
takich jak: nadmierne zasolenie gleby (Sgroy i wsp., 2009), brak wody, zanieczyszczenie
pestycydami (Becerra-Castro i wsp., 2011), metalami ciężkimi (Ma i wsp., 2016)
czy węglowodorami (Khan i wsp., 2013). Uważa się, że bakterie endofityczne są
„rozbrojonymi” patogenami, ze względu na obecność genów homologicznych w ich
genomach, powstałych w wyniku specjacji (ortologi), które występują także u bakterii
patogennych (Ali i wsp., 2014).
Wśród bakterii endofitycznych od kilku lat szczególnym zainteresowaniem cieszą się
tzw. endofity promujące wzrost roślin (PGPE, ang. plant growth-promoting endophytes),
które posiadają szereg mechanizmów potencjalnie odpowiedzialnych za stymulację wzrostu
i rozwoju roślin, przyrost biomasy i poprawę żywotności swojego gospodarza. PGPE mogą
oddziaływać na rośliny w sposób bezpośredni i/lub pośredni (Rys. 5) (Gaiero i wsp., 2013;
Khan i wsp., 2013; Afzal i wsp., 2014; Santoyo i wsp., 2016). Mogą one wspomagać wzrost
roślin poprzez wiązanie i/lub mobilizację trudno dostępnych składników mineralnych (azot,
fosfor, żelazo) lub syntezę związków regulujących wzrost i rozwój roślin (fitohormony,
amoniak), a także konkurując z fitopatogenami o miejsce i składniki pokarmowe (Weyens
i wsp., 2009a,b,c,d; Hardoim i wsp., 2015; Pawlik i wsp., 2015; Santoyo i wsp., 2016).
Do bezpośrednich mechanizmów promujących wzrost roślin zalicza się wiązanie
azotu atmosferycznego, produkcję fitohormonów (auksyn, giberelin, cytokinin, kwasu
abscysynowego i jasmonowego), syntezę deaminazy kwasu 1-aminocyklopropano-1-
karboksylowego (ACC, ang. 1-aminocyclopropane-1-carboxylate acid), wydzielanie
sideroforów, uwalnianie amoniaku oraz fosforu z jego nierozpuszczalnych soli. Mechanizmy
pośrednie związane są z konkurowaniem o składniki pokarmowe, kontrolą wzrostu
fitopatogenów poprzez produkcję antybiotyków, cyjanowodoru (HCN), indukowaniem
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 30
odporności systemicznej (ISR, ang. induced systemic resistance), syntezą enzymów
rozkładających ścianę fitopatogenów, degradacją toksyn wydzielanych przez fitopatogeny,
a także usuwaniem substancji hamujących wzrost roślin np. przez rozkład zanieczyszczeń
organicznych (Glick, 2012; Khan i wsp., 2013; Kukla i wsp., 2014a; Pawlik i wsp., 2015).
Rys. 5. Mechanizmy promujące wzrost roślin występujące u szczepów PGPE.
Azot, fosfor i żelazo są pierwiastkami najczęściej limitującymi wzrost roślin,
ponieważ ich ilość i dostępność w glebie często jest niewystarczająca. Udowodniono,
że bakterie endofityczne wiążące azot atmosferyczny (diazotrofy) Acetobacter diazotrophicus
PAl5 wyraźnie stymulowały wzrost trzciny cukrowej (Saccharum officinarum) w warunkach
niedoboru azotu w glebie. Poziom związanego azotu w roślinnych tkankach inokulowanych
bakteriami wiążącymi N2 może wzrosnąć nawet o 60%, w porównaniu z roślinami
nieinokulowanymi (Boddey i wsp., 1995). Ilość związanego i dostarczanego przez bakterie
endofityczne azotu swoim roślinnym gospodarzom może się znacznie różnić. Na przykład,
w tkankach dzikiego ryżu (Oryza officinalis) inokulowanego Herbaspirillum sp. B501
PGPE
Wpływ na
poziom
hormonów
Pobieranie
składników
mineralnych
Pośrednie mechanizmy Bezpośrednie mechanizmy
Wiązanie N2
Solubilizacja
fosforanów
Wiązanie
żelaza
(siderofory)
Uwalnianie
amoniaku Etylen
(Deaminaza
ACC)
Kwas
abscysynowy
i jasmonowy
Gibereliny
Cytokininy
IAA
EPS
ISR
Wytwarzanie
HCN
Produkcja
sideroforów
Wydzielanie
enzymów
hydrolitycznych
Produkcja
antybiotyków
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 31
zawartość związanego izotopu 15N zwiększyła się, aż o 381% w stosunku do kontroli, która
nie była traktowana bakteriami (Elbeltagy i wsp., 2001). Natomiast, kolonizacja tkanek ryżu
przez Burholderia sp. spowodowała zwiększenie zawartości azotu w tkankach tej rośliny
o 31% (Baldani i wsp., 2000). Uważa się, że zaobserwowane różnice są związane z odmianą
i stadium rozwojowym rośliny, a zależą od szczepu bakterii endofitycznej, metody inokulacji
i warunków, w których były prowadzone doświadczenia.
Wiele bakterii endofitycznych, poprzez wydzielanie małocząsteczkowych kwasów
organicznych i fosfataz, ułatwia rozpuszczanie fosforanów, a tym samym dostarcza fosfor
roślinom. Podobnie bakterie ułatwiają roślinom pobieranie żelaza. Wiele bakterii
endofitycznych wytwarza małocząsteczkowe związki organiczne zwane sideroforami,
tworzące kompleksy z żelazem (Fe3+), które mogą być pobierane przez rośliny (Compant
i wsp., 2010; Santoyo i wsp., 2016). Szczególne zainteresowanie skupiają na sobie bakterie
produkujące fitohormony i deaminazę ACC (Glick i wsp., 2007; Glick, 2014). Jednym
z najczęściej opisywanych fitohormonów produkowanych przez endofity jest kwas indolilo–
3–octowy (IAA), który należy do grupy auksyn. IAA wpływa na wzrost wydłużeniowy
korzeni, indukuje podziały komórkowe i wzrost korzeni bocznych, ale również reguluje
odpowiedź systemu odpornościowego rośliny. Co ciekawe, IAA może pełnić funkcję
cząsteczki sygnalnej w procesie QS u bakterii uczestniczących w tworzeniu biofilmu
(Spaepen i Vanderleyden, 2011). Fitopatogeny wytwarzają IAA z indolilo-3-acetamidu (szlak
IAM, ang. indole-3-acetamide), w odróżnieniu od bakterii symbiotycznych, u których IAA
powstaje przez kwas indolilo-3-pirogronowy (szlak IPyA, ang. indole-3-pyruvate) (Spaepen
i Vanderleyden, 2011). Przykładowo, bakterie endofityczne zdolne do uwalniania auksyny
w wysokich stężeniach powodowały szybszy wzrost roślin, zwiększały ich biomasę, liczbę
liści, a także indukowały szybsze ukorzenianie się sadzonek (Sessitsch i wsp., 2005; Compant
i wsp., 2008; Shi i wsp., 2009).
Ważnym mechanizmem bezpośredniej promocji wzrostu roślin przez bakterie
endofityczne jest wytwarzanie enzymu deaminazy ACC. Enzym ten katalizuje hydrolizę
kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego (prekursor biosyntezy etylenu), do amoniaku
i kwasu α-ketomasłowego (Glick i wsp., 2007; Glick, 2012, 2014). Dzięki temu dochodzi
do zmniejszenia poziomu etylenu w tkankach roślinnych. Etylen jest tzw. hormonem stresu,
„starzenia się” i odpowiada między innymi za dojrzewanie owoców czy hamowanie wzrostu
wydłużeniowego korzeni. Aktywność bakteryjnej deaminazy ACC wpływa pozytywnie
na wydłużenie łodyg i korzeni, zwiększenie biomasy, znacznie redukując negatywny wpływ
etylenu na rozwój rośliny (Belimov i wsp., 2009; Sadrnia i wsp., 2011). Potwierdzają
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 32
to badania Mayak i wsp. (2004), którzy analizowali wpływ endofitów Achromobacter
piechaudii ARV8, zdolnych do produkcji deaminazy ACC, na przyrost biomasy siewek
pomidora. Wyniki ich badań wykazały, że sadzonki inokulowane A. piechaudii ARV8
wytwarzały czterokrotnie większą biomasę, w porównaniu do nieinokulowanej kontroli,
co było spowodowane obniżeniem poziomu etylenu w tkankach pomidora o około 75%
w porównaniu do roślin nieinokulowanych.
Liczne bakterie endofityczne znane są z antagonistycznego działania wobec
patogennych bakterii i grzybów. Mikroorganizmy te konkurują o niszę ekologiczną
oraz mikro- i makroelementy. Ardanov i wsp. (2011) zastosowali dwa gatunki bakterii
endofitycznych: Pseudomonas sp. oraz Methylobacterium sp., jako czynniki kontroli
biologicznej w uprawie ziemniaków. Inokulacja roślin zawiesiną tych bakterii skutecznie
chroniła plony przed patogenem Pectobacterium atrosepticum (Erwinia carotovora supp.
atroseptica), który wywołuje chorobę zwaną czarną nóżką. Oba szczepy endofitów nie tylko
indukowały odporność roślin, ale także promowały wzrost ich pędów. Z kolei, odporność
przeciw grzybowym patogenom Verticillium sp. oraz Botrytis cinerea uzyskiwały pomidory
oraz winorośl inokulowane bakteriami endofitycznymi Bacillus phytofirmans PsJN (Compant
i wsp., 2008; Bordiec i wsp., 2011). Podobnie, ochronny wpływ bakterii endofitycznych
Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1, Paenibacillus polymyxa YUPP-8 oraz Bacillus subtilis
YUPP-2, na uprawy bawełny (Gossypium L.), obserwowali Yang i wsp. (2013). Wyniki
doświadczeń polowych wykazały, że porażenie pleśniami było widoczne tylko u 5,2% roślin
inokulowanych endofitami, podczas gdy u roślin nieinokulowanych, poziom ten wynosił
33,5%.
1.6. Fitoremediacja wspomagana przez bakterie endofityczne
Bakterie endofityczne wykorzystywane mogą być również do wspomagania
procesów fitoremediacji terenów skażonych wieloma związkami organicznymi, na przykład:
związkami ropopochodnymi, pestycydami, chloroformem, nitrobenzenem,
dichlorodifenylotrichloroetanem (DDT), polichlorowanymi bifenylami lub nitrylami (Barac
i wsp., 2004; McGuinness i Dowling, 2009; Khan i wsp., 2013; Thijs i wsp., 2014; Saleem,
2016).
Głównym czynnikiem warunkującym skuteczność fitoremediacji jest dostępność
zanieczyszczeń organicznych. Losy tych związków w środowisku, zdolność do absorpcji
na cząsteczkach gleby bądź powierzchni korzeni, możliwość ich pobierania przez roślinę
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 33
i mikroorganizmy, aktywność biologiczną, powinowactwo do fazy lipidowej/wodnej, opisuje
logarytm współczynnika podziału n–oktanol/woda (log Kow) (Weyens i wsp., 2009c,d; Khan
i wsp., 2013; Afzal i wsp., 2014). Związki ropopochodne, dla których log Kow<1,
są hydrofilowe, bardzo dobrze rozpuszczają się w wodzie, ulegają akumulacji i adsorpcji
przez korzenie, jednak nie są pobierane przez włośniki (Dzantor, 2007). W przypadku
zanieczyszczeń, gdzie log Kow>3,5, obserwuje się wysokie powinowactwo związków
organicznych do powierzchni korzeni i ich silną akumulację, a także zatrzymywanie
we frakcji lipidowej epidermy korzenia, przez co nie są one transportowane do łodyg i liści.
Umiarkowanie hydrofilowe związki ropopochodne, których log Kow mieści się w przedziale
0,5-3,5, przenikają przez błony komórkowe, co powoduje, że są najłatwiej pobierane przez
korzenie i transportowane do pozostałych organów (Marecik i wsp., 2006; Weyens i wsp.,
2009c,d; Afzal i wsp., 2014).
Rośliny, które są fotoautotrofami, nie wykorzystują pobranych egzogennych
zanieczyszczeń organicznych jako źródła węgla i energii, ponieważ węgiel asymilują
na drodze fotosyntezy. Drogi przemian tych związków organicznych w komórkach roślinnych
zostały opisane przez tzw. model zielonej wątroby (green liver concept), ze względu
na podobieństwo do systemu ich detoksykacji w wątrobie ssaków (Sanderman, 1992; Weyens
i wsp., 2009c,d; Saleem, 2016) (Rys. 6). Obecne w tkankach roślin toksyczne związki
organiczne podlegają szeregowi reakcji, które obniżają czas ich półtrwania oraz ograniczają
ich kontakt z tkankami roślin. Według modelu zielonej wątroby związki te ulegają
przekształceniu w trzech etapach: (1) bioaktywacji, czyli enzymatycznej modyfikacji
związku, obniżającej jego toksyczność i/lub liofilowość; (2) koniugacji z glutationem,
cukrami lub aminokwasami w celu wytworzenia związku hydrofilowego;
(3) sekwestracji/kompartmentacji, polegającej na odkładaniu zmodyfikowanego związku
w wakuoli i/lub ścianie komórkowej (Sanderman, 1992; Weyens i wsp., 2009b,c,d; Saleem,
2016) (Rys. 6).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 34
Rys. 6. Oddziaływania rośliny-bakterie endofityczne w fitoremediacji oraz model zielonej
wątroby opisujący drogi przemian ksenobiotyków w komórkach roślinnych.
U roślin model zielonej wątroby opisuje włączenie toksycznych związków
organicznych w cykle przemian z wykorzystaniem szlaków podstawowego metabolizmu.
W pierwszej fazie, ksenobiotyki są przekształcane, w reakcjach utleniania, hydrolizy
i redukcji, w związki o mniejszej toksyczności. Kluczową rolę odgrywają reakcje utleniania
z udziałem cytochromów P450, które obejmują rodzinę enzymów roślinnych o szerokiej
specyficzności substratowej. W drugiej fazie, do powstałych związków, przyłączane są
endogenne substraty roślinne o małej aktywności biologicznej (aminokwasy, peptydy,
węglowodany, kwasy karboksylowe). Reakcje te katalizują glikozylotransferazy,
a kluczowym substratem biorącym udział w reakcjach sprzęgania jest glutation. Reakcja
pomiędzy glutatnionem, a aktywowanymi ksenobiotykami może zachodzić spontanicznie
bądź być katalizowana przez S-transferazę glutationową. Tak koniugowane związki mogą
ulegać dalszym przemianom. Bardzo rzadko dochodzi jednak do całkowitej mineralizacji tych
zanieczyszczeń, ponieważ powstałe pochodne często hamują aktywność kolejnych enzymów
detoksykacyjnych (Dua i wsp., 2002; Soleimani i wsp., 2010; Taghavi i wsp., 2010).
Bakterie endofityczne • Degradacja zanieczyszczeń
• Redukcja fitotoksyczności
• Promowanie wzrostu i
rozwoju roślin
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Przegląd literatury 35
W konsekwencji, w trzeciej fazie, otrzymane intermediaty zostają z cytoplazmy usunięte oraz
zmagazynowane w wakuoli i/lub ścianie komórkowej, w postaci mniej toksycznych form tych
związków, na ogół jako kompleksy z innymi substancjami (Sanderman, 1992). Jednak, aby
zanieczyszczenia mogły być w pełni rozłożone do dwutlenku węgla i wody, konieczna jest
obecność mikroorganizmów. Szczególne znaczenie odgrywają tu endofity, zdolne
do degradacji toksycznych związków organicznych (Rys. 6).
Endofity uważane są za ważne narzędzia zwiększające efektywność fitoremediacji
toksycznych związków organicznych. Wykorzystanie tych bakterii w procesach
fitoremediacji wydaje się być szczególnie obiecujące, ponieważ wchodzą one w ścisłe
interakcje ze swoim gospodarzem (Saleem, 2016; Santoyo i wsp., 2016). Szereg właściwości
bakterii endofitycznych powoduje, że w kooperacji z roślinami mogą istotnie zwiększać
tempo usuwania toksycznych substancji ze środowiska (Porteous-Moore i wsp., 2006; Yousaf
i wsp., 2011; Khan i wsp., 2013). Zdolność endofitów do rozkładu tych związków może
wynikać z ich ewolucyjnego przystosowania do rozkładu metabolitów roślinnych, z których
wiele ma strukturę pierścieniową (van Beilen i wsp., 2006; van Bogaert i wsp., 2011).
Korzystny wpływ roślin i mikroorganizmów na procesy rozkładu substancji
ropopochodnych obserwowali Ying i wsp. (2011). Wykazali oni, że stężenie TPH (ang. total
petroleum hydrocarbons, indeks oleju mineralnego) w ryzosferze trzech różnych gatunków
roślin, po przeprowadzonym doświadczeniu bioremediacyjnym obniżyło się tak, że nie
przekraczało dopuszczalnego poziomu. Badania Ho i wsp. (2012) pokazały, jak ważne
są bakterie endofityczne, zdolne do rozkładu fenolu, związku silnie hamującego wzrost roślin.
Inokulacja rośliny A. thaliana zawiesiną bakterii endofitycznej Achromobacter xylosoxidans
F3B umożliwiła wzrost A. thaliana w obecności wzrastającego stężenia związków
aromatycznych. Natomiast, zaszczepienie roślin endofitem Burkholderia cepacia FX2, poza
przyrostem biomasy, bezpośrednio prowadziło także do obniżenia poziomu transpiracji
toluenu, co było wynikiem biodegradacji tego związku przez endofity (Wang i wsp., 2010).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Cel pracy 36
II. Cel pracy
Celem badań było: (1) charakterystyka zespołów bakterii endofitycznych roślin
porastających gleby długotrwale skażone związkami ropopochodnymi oraz (2) zastosowanie
wybranych szczepów bakterii endofitycznych w procesie fitoremediacji wspomaganej.
Badania zostały podzielone na trzy etapy, odpowiadające kolejnym celom niniejszej
pracy:
1. Izolacja i utworzenie kolekcji szczepów bakterii endofitycznych zdolnych
do rozkładu surowej ropy naftowej oraz charakterystyka wybranych cech
genotypowych i fenotypowych izolatów.
2. Charakterystyka zespołów bakterii endofitycznych roślin porastających gleby
długotrwale skażone związkami ropopochodnymi.
3. Fitoremediacja gleby skażonej związkami ropopochodnymi
z wykorzystaniem życicy trwałej (Lolium perenne) i wyselekcjonowanych
szczepów bakterii endofitycznych: Rhodococcus erythropolis 5WK
oraz Rhizobium sp. 10WK, przeprowadzona w warunkach laboratoryjnych.
.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 37
III. Materiały i metody
3.1. Materiały
3.1.1. Materiał roślinny
Do badań bioróżnorodności zespołów bakterii endofitycznych wybrano rośliny
narażone na toksyczne działanie wysokich stężeń związków ropopochodnych, rosnące przy
Rafinerii „Czechowice” S.A. w Czechowicach-Dziedzicach.
Obszar rafinerii jest silnie skażony związkami ropopochodnymi od 1971 roku, kiedy
doszło do wybuchu zbiornika, w którym zmagazynowano 8850 ton ropy oraz zapalenia się
rozlanej ropy w jego obwałowaniu. Ponadto, na terenie rafinerii od lat trzydziestych XX
wieku składowane są niebezpieczne odpady w postaci kwaśnych smół porafinacyjnych w tak
zwanych „dołach kwasowych” (Rys. 7).
Do badań wykorzystano rośliny takie jak: komonica zwyczajna (Lotus corniculatus),
wiesiołek dwuletni (Oenothera biennis) oraz jastrzębiec wysoki (Hieracium piloselloides)
zebrane wokół „dołów kwasowych” (49°54’49.0”N, 19°01’01.9”E).
Rys. 7. Teren przy Rafinerii „Czechowice” S.A. w Czechowicach-Dziedzicach. Miejsce
zebrania roślin; „doły kwasowe”, (https://maps.google.com; zdjęcia własne).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 38
3.1.2. Podłoża i odczynniki chemiczne
Podłoże TSA (Tryptic Soy Agar): pepton K 15 g; pepton SK 5 g; NaCl 5 g; agar 15 g;
woda demineralizowana 1000 ml.
Podłoże minimalne M9: KH2PO4 3 g; Na2HPO4 6 g; NaCl 0,5 g; NH4Cl 1 g;
MgSO4×7H2O 0,24 g; CaCl2 0,01 g; woda demineralizowana 1000 ml.
Do podłoża M9 po sterylizacji dodawano substancje ropopochodne (surowa ropa naftowa,
olej diesla lub n-heksadekan) oraz roztwory MgSO4×7H2O i CaCl2 uprzednio
wysterylizowane przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
Podłoże Pikovskaya: glukoza 5 g; Ca3(PO4)2 5 g; (NH4)2SO4 0,5 g; NaCl 0,2 g;
MgSO4×7H2O 0,1 g; KCl 0,2 g; ekstrakt drożdżowy 0,5 g; MnSO4×H2O 0,002 g;
FeSO4×7H2O 0,002 g; agar 15 g; woda demineralizowana 1000 ml.
Podłoże CAS (Chrome Azurol S): Roztwór 1: 1 mM FeCl3×6H2O w 10 mM HCl 5 ml;
wodny roztwór barwnika CAS (1,21 mg ml-1) 25 ml; wodny roztwór HDTMA (1,82 mg
ml-1) 20 ml. Roztwór 2: PIPES 15,12 g; K2PO4 0,15 g; NaCl 0,25 g; NH4Cl 0,5 g; agar
10 g; woda demineralizowana 400 ml. Roztwór 3: glukoza 1 g; mannitol 1 g;
MgSO4×7H2O 246,5 mg; CaCl2 5,5 mg; MnSO4×2H2O 0,508 mg; H3BO3 0,7 mg;
CuSO4×5H2O 0,02 mg; ZnSO4×7H2O 0,6 mg; Na2MoO4×7H2O 0,5 mg; woda
demineralizowana 35 ml. Roztwór 4: hydrolizat kazeiny 1,5 g; woda demineralizowana
15 ml.
Roztwór 1 przygotowano z wykorzystaniem wcześniej wysterylizowanej wody
demineralizowanej. Roztwór 2 i 3 sterylizowano w autoklawie w temp. 121°C przez
20 min. Po ich ochłodzeniu do temp. ok. 50-60°C roztwory mieszano i dodawano roztwór
4 uprzednio wysterylizowany przez filtr strzykawkowy 0,22 µm.
Podłoże LB (Luria Bertani): pepton kazeinowy (trypton) 10 g; ekstrakt drożdżowy 5 g;
NaCl 10 g; woda demineralizowana 1000 ml.
Podłoże bulion odżywczy z glicyną: ekstrakt mięsny 3 g; pepton 5 g; glicyna 4,4 g; woda
demineralizowana 1000 ml.
Podłoże PDA (Potato Dextrose Agar): ziemniaczanka 200 g; dekstroza 20 g; agar 15 g;
woda demineralizowana 1000 ml.
Podłoże z karboksymetylocelulozą (CMC, ang. carboxymethylcellulose agar):
karboksymetyloceluloza 10 g; FeCl3 0,004 g; (NH4)2SO4 1 g; NaCl 0,6 g; K2HPO4 0,5 g;
MgSO4×7H2O 0,5 g; KH2PO4 0,5 g; CaCl2×2H2O 0,002 g; ekstrakt drożdżowy 0,1 g; agar
15 g; woda demineralizowana 1000 ml.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 39
Odczynnik Salkowskiego: 150 ml stężonego kwasu siarkowego (VI) (H2SO4); 250 ml
wody destylowanej; 7,5 ml 0,5 M FeCl3×6H2O.
Bufor ekstrakcyjny: C-TAB 2 g; Tris HCl pH=8,1 1 M 10 ml; EDTA 0,5 M 4 ml; NaCl
5 M 28 ml; -merkaptoetanol 1 ml.
3.2. Metody
3.2.1. Izolacja bakterii endofitycznych zdolnych do rozkładu surowej ropy naftowej
Bakterie endofityczne izolowano z korzeni, łodyg i liści komonicy zwyczajnej,
wiesiołka dwuletniego oraz jastrzębca wysokiego. Korzenie oczyszczano z przyległej gleby,
cięto na fragmenty o długości 1-2 cm, następnie wytrząsano przez 15 min w 1% roztworze
Tween 80. Powierzchniową sterylizację korzeni przeprowadzano zanurzając fragmenty tkanki
na 2 min kolejno w 0,01% roztworze podchlorynu sodu, 10% H2O2 i 70% etanolu, a następnie
trzykrotnie płukano w sterylnej wodzie destylowanej. Łodygi i liście sterylizowano przez 1-
2 min w 10% H2O2 i 70% etanolu, a następnie trzykrotnie płukano w sterylnej wodzie
destylowanej. Każdy proces powierzchniowej sterylizacji był kontrolowany przez posiew
200 μl wody z ostatniego płukania na płytki z podłożem TSA, które inkubowano w temp.
28°C przez 7 dni. Brak kolonii bakterii i grzybów na podłożu świadczył o poprawnym
przeprowadzeniu procesu powierzchniowej sterylizacji. Tak przygotowany materiał roślinny
wykorzystano w kolejnych etapach doświadczenia.
Wysterylizowaną tkankę roślinną rozcierano w sterylnym moździerzu zawierającym
9 ml sterylnej soli fizjologicznej. Otrzymany homogenat przenoszono na podłoże minimalne
M9 zawierające surową ropę naftową stanowiącą jedyne źródło węgla i energii, której
końcowe stężenie wynosiło 1% lub 2%. Po 7 dniach inkubacji w temp. 28°C, różniące się
morfologicznie kolonie bakterii, przesiewano metodą posiewu redukcyjnego na podłoże M9
z surową ropą naftową w stężeniu 1%. Uzyskane czyste kultury bakterii przechowywano
w stanie zamrożenia z dodatkiem 15% glicerolu w temp. -20°C.
3.2.2. Wykorzystanie węglowodorów jako jedynego źródła węgla i energii
Ocenę zdolności izolatów do wzrostu w obecności oleju diesla, n-heksadekanu lub p-
ksylenu i ich potencjalnego rozkładu przeprowadzono na podłożu M9, w którym
węglowodory (końcowe stężenie 1%), stanowiły jedyne źródło węgla. Hodowle szczepów,
w trzech powtórzeniach, prowadzono przez 7 dni w temp. 28°C z wytrząsaniem
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 40
(120 obr min-1). O zdolności do wzrostu w obecności węglowodoru i wykorzystania go jako
źródła węgla świadczył przyrost gęstości optycznej (OD, ang. optical density) hodowli
w podłożu M9. Pomiary OD prowadzono na spektrofotometrze GENESYSTM 20 (Thermo
Scientific).
3.2.3. Charakterystyka genotypowych cech bakterii endofitycznych
3.2.3.1. Określenie przynależności gatunkowej wyizolowanych szczepów
Analiza restrykcyjna zamplifikowanych fragmentów rybosomalnego DNA (ARDRA,
ang. amplified ribosomal DNA restriction analysis) pozwoliła na wyodrębnienie
reprezentatywnych szczepów bakterii spośród wszystkich izolatów. Następnie, wybrane
szczepy oznaczano do gatunku poprzez sekwencjonowanie fragmentu genu 16S rRNA.
Izolację genomowego DNA bakterii endofitycznych przeprowadzano zgodnie
z instrukcją producenta wykorzystując zestaw DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen).
Na matrycy bakteryjnego DNA amplifikowano fragment genu 16S rRNA z wykorzystaniem
uniwersalnych starterów: 27F (5’ GAG TTT GAT CCT GGC TCA G 3’) oraz 1492R
(5’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’). Mieszanina reakcyjna PCR o objętości 50 µl
składała się z: 1 µl matrycowego DNA, 5 µl 10×stężonego buforu High Fidelity PCR
(Invitrogen), 2 µl 50 mM MgSO4, 1 µl 10 mM dNTP mix, po 1 µl 10 µM starterów 27F
i 1492R, 0,2 µl polimerazy Platinum Taq High Fidelity (5 U) (Invitrogen), 38,8 µl sterylnej
wody demineralizowanej. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze C1000 TouchTM
Thermal Cycler (BioRad) według następującego profilu temperaturowego: (1) wstępna
denaturacja 5 min 95°C, (2) 35 cykli: denaturacji 1 min 94°C, przyłączania starterów 30 s
52°C, elongacji 3 min 72°C, (3) końcowa elongacja 10 min 72°C. Analizę elektroforetyczną
otrzymanych produktów PCR przeprowadzano w 2% żelach agarozowych (60 min, 100 V),
które wybarwiano Gel Red (VWR, Leuven, Belgia).
Następnie, stosowano metodę ARDRA z wykorzystaniem rzadko tnącego enzymu
restrykcyjnego HpYCH4IV, rozpoznającego czteronukleotydową sekwencję (5’ A/CGT 3’).
Mieszanina restrykcyjna zawierała: 2,9 µl 10×stężonego buforu CutSmart (New England
Biolabs), 0,3 µl enzymu HpyCH4IV (New England Biolabs), 1,1 µl RNazy, 4,3 µl sterylnej
wody demineralizowanej, 20 µl produktu amplifikacji genu 16S rRNA. Całość inkubowano
2 godz. w temp. 37°C. Inaktywację enzymu restrykcyjnego przeprowadzano w temp. 65°C
przez 20 min. Uzyskane po trawieniu restrykcyjnym fragmenty DNA, o różnej długości,
rozdzielano za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym (130 min, 110 V) barwionym
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 41
Gel Red. Charakterystyczne układy prążków otrzymane dla każdego z badanych amplikonów,
analizowano, porównywano i klasyfikowano w grupy ARDRA o tym samym wzorze. W ten
sposób wybrano 26 produktów PCR reprezentatywnych dla różnych klas ARDRA, które
wysłano do sekwencjonowania firmie Macrogen (Amsterdam, Holandia). Uzyskane
sekwencje fragmentu genu 16S rRNA analizowano i porównywano metodą Clustal W
względem szczepów referencyjnych dostępnych w bazie danych National Center for
Biotechnology Information Database (NCBI), wykorzystując Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST). Drzewo filogenetycznego pokrewieństwa skonstruowano przy użyciu metody
najbliższego sąsiedztwa (Neighbour-Joining) korzystając z programu MEGA 7.0 Wartości
bootstrap wyliczono dla 1000 powtórzeń. Sekwencje fragmentu genu 16S rRNA wybranych
szczepów zostały umieszczone w bazie NCBI GenBank pod numerami od KU726257
do KU726272 oraz MF765329 do MF765338.
3.2.3.2. Detekcja genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów
U wyizolowanych szczepów bakterii endofitycznych metodą PCR sprawdzano
obecność genów kodujących monooksygenazę alkanową (alkB), hydroksylazę alkanową
(alkH), grupę enzymów spokrewnionych z cytochromem P450 (rodzina CYP153) (P450),
dioksygenazę-2,3-katecholu (C23O) oraz podjednostkę alfa dioksygenaz hydroksylujących
wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (pah).
Izolację genomowego DNA bakterii przeprowadzano zgodnie z protokołem zestawu
GeneMatrix Bacterial&Yeast Genomic DNA Purification Kit (EURx DNA Gdańsk).
Amplifikację fragmentów genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład
węglowodorów alifatycznych i aromatycznych przeprowadzano wykorzystując startery
wymienione w Tabeli 1. Mieszanina reakcyjna (25 µl) zawierała: 1 µl matrycowego DNA,
2,5 µl 10×stężonego buforu Dream Taq (Thermo Scientific), 1 µl każdego ze starterów danej
pary w stężeniu 10 mM, 0,2 µl polimerazy Dream Taq DNA (5 U) (Thermo Scientific),
19,3 µl sterylnej wody demineralizowanej. Warunki reakcji PCR były następujące: (1)
wstępna denaturacja 5 min 95°C, (2) 30 cykli: denaturacji 1 min 95°C, przyłączania starterów
w temp. jak w Tabeli 1, elongacji 1 min 72°C, (3) końcowa elongacja 5 min 72°C. Produkty
reakcji rozdzielano w 2% żelu agarozowym (60 min, 100 V).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 42
3.2.3.3. Detekcja genu acdS
Potencjalną zdolność bakterii endofitycznych do syntezy enzymu deaminazy ACC
oceniano na podstawie wyników reakcji PCR. W tym celu stosowano pary zdegenerowanych
starterów specyficznych dla sekwencji nukleotydowej kodującej enzym deaminazę ACC
(acdS) (Tabela 1).
Izolację genomowego DNA bakterii, reakcję PCR i weryfikację specyficzności
produktów PCR przeprowadzano według tych samych procedur, które stosowano
w badaniach genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów
alifatycznych i aromatycznych przedstawionych w rozdziale 3.2.3.2. Sekwencje starterów
i temperaturę ich przyłączania podano w Tabeli 1.
Tabela 1. Startery wykorzystane w reakcjach amplifikacji fragmentów genów kodujących
enzymy uczestniczące w rozkładzie węglowodorów alifatycznych
i aromatycznych (alkH, alkB, C23O, P450, pah) oraz genu kodującego enzym
deaminazę ACC (acdS).
Nazwa genu Sekwencje starterów (5’3’)
Długość
produktu
PCR (pz)
Temperatura
przyłączania
starterów
(°C)
Źródło
alkH
alk-H1-F
alk-H3-R
CIG IIC ACG AII TIG GIC ACA
AGA AGG
IGC ITG ITG ATC III GTG ICG
CTG IAG
549 60
Phillips
i wsp.,
2008
alkB
alkB-F
alkB-R
AAC TAC MTC GAR CAY TAC
GG
TGA MGA TGT GGT YRC TGT
TCC
100
49
Powell
i wsp.,
2006
C23O
C23O-F
C23O-R
AGG TGC TCG GTT TCT ACC
TGG CCG A
ACG GTC ATG AAT CGT TCG
TTG AG
406
65
Phillips
i wsp.,
2008
P450
P450fw1
P450rv3
GTS GGC GGC AAC GAC ACS
AC
GCA SCG GTG GAT GCC GAA
GCC RA
339
58
Yousaf
i wsp.,
2010a,b
pah
PAH-RHDα GP F
CGG CGC CGA CAA YTT YGT
NGG
292
54
Cebron
i wsp.,
2008
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 43
PAH-RHDα GP R
GGG GAA CAC GGT GCC RTG
DAT RAA
acdS
F1936 F
F1938 R
F1939 R
GHG AMG ACT GCA AYW SYG
GC
ATC ATV CCV TGC ATB GAY
TT
GAR GCR TCG AYV CCR ATC
AC
F1936/
F1938-792
F1936/
F1939-558
50
Blaha
i wsp.,
2006
3.2.3.4. Analiza elektroforetyczna
Produkty reakcji PCR rozdzielano w żelach agarozowych o różnym stężeniu agarozy
dostosowanym względem spodziewanej wielkości produktu amplifikacji. Próbki DNA
nakładano do studzienek po uprzednim obciążeniu barwnikiem firmy Thermo Scientific.
Wykorzystywano następujące markery wielkości: GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder,
GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder oraz GeneRulerTM Express DNA Ladder. Rozdział
elektroforetyczny DNA przeprowadzano w aparatach Mini-Sub® Cell GT Cell, Wide Mini-
Sub Cell GT Cell, Sub-Cell® GT Cell (Bio-Rad). DNA wizualizowano w transilluminatorze
Gel DocTM XR+ (Bio-Rad), a wyniki dokumentowano za pomocą programu Image Lab.
3.2.4. Biochemiczna charakterystyka bakterii endofitycznych
3.2.4.1. Rozpuszczanie fosforanów
Zdolność wyizolowanych bakterii endofitycznych do rozpuszczania fosforanów
sprawdzano w trzech powtórzeniach na podłożu Pikovskaya. Na pożywce wykonywano
posiew punktowy bakterii za pomocą sterylnej igły bakteriologicznej. Po 14 dniach inkubacji
w temp. 28°C mierzono średnicę kolonii bakterii oraz stref przejaśnień, które powstały
w wyniku uwolnienia fosforu z jego nierozpuszczalnej soli Ca3(PO4)2 (Pikovskaya, 1948).
3.2.4.2. Wytwarzanie kwasu indolilo-3-octowego (IAA)
Ilość wytwarzanego IAA przez bakterie endofityczne oznaczano za pomocą metody
spektrofotometrycznej. W tym celu bakterie hodowano na podłożu płynnym LB
zawierającym tryptofan w stężeniu 500 µg ml-1. Po 4 dniach inkubacji w temp. 28°C 2 ml
hodowli odwirowywano (10 000 obr min-1, 10 min), a otrzymany supernatant mieszano
ze 100 µl 10 mM kwasu ortofosforowego oraz 4 ml odczynnika Salkowskiego.
Tak przygotowane próby inkubowano w ciemności przez 25 min w temperaturze pokojowej.
Metodą spektrofotometryczną mierzono absorbancję mieszanin przy długości fali 530 nm.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 44
Stężenie powstałego IAA, o czym świadczyło pojawianie się różowego zabarwienia,
wyliczano z krzywej wzorcowej sporządzonej w zakresie 1-100 µg ml-1 tego związku
(Gordon i Weber, 1951).
3.2.4.3. Wytwarzanie cyjanowodoru (HCN)
W celu zbadania zdolności bakterii endofitycznych do wytwarzania HCN izolaty
te hodowano przez 4 dni w temp. 28°C z wytrząsaniem (120 obr min-1) na podłożu bulion
odżywczy z glicyną, której końcowe stężenie wynosiło 4,4 mg l-1. Po tym czasie, hodowlę
bakterii wysiewano na to samo podłoże zestalone agarem. Kwadraty (o boku 2 cm) sterylnej
bibuły, nasączone roztworem 2% Na2CO3 w 0,5% roztworze kwasu pikrynowego, nanoszono
na środek każdej płytki Petriego, którą uszczelniano parafilmem i inkubowano 4 dni w temp.
28°C (Lorck, 1948). Zmiana zabarwienia bibuły z żółtej na pomarańczową i/lub brązową,
świadczyła o zdolności bakterii do wytwarzania HCN.
3.2.4.4. Produkcja sideroforów
Ocenę zdolności bakterii endofitycznych do produkcji sideroforów przeprowadzano
wykorzystując zmodyfikowaną metodę Schwyn i Neilands (1987). Na podłożu CAS,
zawierającym barwnik Chrome Azurol S, wykonywano posiew redukcyjny szczepów, a płytki
inkubowano przez 4 dni w temp. 28°C. Pod wpływem wydzielanych przez bakterie
sideroforów katecholowych, podłoże CAS zmieniło barwę na fioletową, a w przypadku
wydzielania sideroforów hydroksamowych, stawało się żółtopomarańczowe.
3.2.4.5. Hamowanie wzrostu fitopatogennych grzybów
Ocena zdolności bakterii endofitycznych do hamowania wzrostu fitopatogennych
grzybów została przeprowadzona na podłożu PDA (ang. Potato Dextrose Agar). Jako szczepy
referencyjne zastosowano Cladosporium sphaerospermum KKP741, Fusarium avenaceum
KKP756, Fusarium graminearum KKP1771, pozyskane z kolekcji Instytutu Immunologii
i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu.
Grzyby mikroskopowe hodowano na podłożu PDA przez 7 dni w temp. 23°C.
Następnie, wycinano kwadrat podłoża wraz z grzybnią o boku 1-2 cm, który przenoszono na
środek nowej płytki Petriego z podłożem PDA. W odległości około 3-4 cm od grzybni
wykonywano posiew rysowy 24 godzinnej hodowli bakterii. Płytki kontrolne
przygotowywano w ten sam sposób, bez wykonywania posiewów badanych szczepów
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 45
bakterii. Całość inkubowano przez 7-14 dni w temp. 23°C do momentu uzyskania na płytkach
kontrolnych odpowiedniego wzrostu grzybni (przekroczenie promienia 3-4 cm). Widoczne
strefy zahamowania wzrostu grzybni potwierdzały właściwości przeciwgrzybowe bakterii
endofitycznych.
3.2.4.6. Produkcja enzymów celulolitycznych
Zdolność do produkcji enzymów celulolitycznych przez bakterie endofityczne
sprawdzano na podłożu z karboksymetylocelulozą (CMC, ang. carboxymethylcellulose agar).
Metodą punktową posiewano każdy szczep bakterii na jednej płytce Petriego z podłożem
CMC w trzech powtórzeniach. Po 14 dniach inkubacji w temp. 28°C powierzchnię podłoża
zalewano płynem Lugola na 15 min. Następnie płyn zlewano, a średnice powstałych
przejaśnień wokół kolonii mierzono (Pointing, 1999).
3.2.4.7. Zdolność do ruchu
Zdolność bakterii endofitycznych do ruchu sprawdzano na podłożu bulion odżywczy
zestalonym agarem, którego końcowe stężenie wynosiło 0,2%. Posiewy bakterii wykonywano
metodą punktową na środku płytki Petriego z podłożem. Po 24-48 godz. inkubacji w temp.
28°C oceniano stopień rozprzestrzeniania się bakterii na powierzchni podłoża. Wzrost
bakterii na całej lub w przeważającej części pożywki wskazywał na zdolności izolatów
do ruchu.
3.2.4.8. Biosynteza biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów
Ocenę zdolności izolatów do biosyntezy biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów,
przeprowadzano wyznaczając indeks emulsyfikacji (E24). Bakterie hodowano na płynnych
podłożach LB, M9 z surową ropą naftową w stężeniu 1% oraz M9 z n-heksadekanem
w stężeniu 1%, przez 7 dni w temp. 28°C z wytrząsaniem (120 obr min-1). Po tym czasie
odwirowywano 2 ml hodowli, a otrzymany supernatant worteksowano przez 2 min z 3 ml
oleju diesla, n-heksadekanu lub p-ksylenu. Tak przygotowane próby inkubowano
w temperaturze pokojowej przez 24 godz., a następnie mierzono całkowitą wysokość
roztworów w probówce oraz wysokość powstałej warstwy emulsji (Pacwa-Płociniczak i wsp.,
2014). Indeks emulsyfikacji (E24) obliczano ze wzoru:
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 46
%10024 b
aE
gdzie: a–wysokość warstwy emulsji [mm]; b–całkowita wysokość roztworu [mm]
3.2.5. Pirosekwencjonowanie 454
Bioróżnorodność bakterii endofitycznych w tkankach komonicy zwyczajnej
oraz jastrzębica wysokiego analizowano wykorzystując pirosekwencjonowanie 454. W sumie
analizie poddano 5 prób (w czterech powtórzeniach) oznaczonych odpowiednio: KK
(Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL
(Jastrzębiec liść).
3.2.5.1. Izolacja DNA z roślin
Izolację DNA z tkanek roślin przeprowadzano według zmodyfikowanej metody
mikro C-TAB. Świeżo zebrane rośliny oczyszczano i sterylizowano tak, jak opisano
w rozdziale 3.2.1. Do dalszych etapów izolacji DNA wykorzystywano tylko sterylny materiał
roślinny.
Materiał roślinny (0,03-0,15 g) rozcierano w moździerzu z solą fizjologiczną.
Dodawano 1 ml podgrzanego do temp. 60°C buforu ekstrakcyjnego, a następnie w tej samej
temperaturze inkubowano próby delikatnie je mieszając. Po 30 min do prób dodawano 800 l
roztworu chloroform-alkohol izoamylowy (24:1), całość odwirowywano (10 000 obr min-
1, 4C, 20 min), uzyskaną fazę wodną (górną) przenoszono do nowej probówki i ponownie
dodawano 600 l roztworu chloroform-izoamylowy alkohol. Po ponownym wirowaniu
(10 000 obr min-1, 4C, 10 min), fazę wodną (górną) przenoszono do nowej probówki
i dodawano 1 ml 96% etanolu, w celu wytrącenia kwasów nukleinowych. Po kolejnym
wirowaniu (10 000 obr min-1, 4C, 30 min) osad przemywano 1 ml 70% etanolu i wirowano
(10 000 obr min-1, 4C, 5 min). Po wysuszeniu osadu w temperaturze pokojowej zawieszano
go w 100 l buforu TE. W celu usunięcia RNA, do prób dodawano 1 l RNAzy (10 mg ml-1)
i inkubowano w łaźni wodnej w temp. 37C przez 45 min. W ten sposób uzyskany z tkanek
roślinnych DNA przechowywano w temp. -20C.
3.2.5.2. PCR
W celu przygotowania prób do pirosekwencjonowania 454 przeprowadzono dwie
reakcje PCR. Wyizolowany z tkanek roślinnych i oczyszczony DNA był matrycą w pierwszej
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 47
z nich, gdzie zastosowano startery 799F (5’ AAC MGG ATT AGA TAC CCK G 3’) i 1193R
(5’ ACG TCA TCC CCA CCT TCC 3’) flankujące region hiperzmienny V5-V7 genu 16S
rRNA (Beckers i wsp., 2017). Startery te wybrano aby uniknąć namnażania produktu
na matrycy mitochondrialnego bądź chloroplastowego DNA. Uzyskany produkt amplifikacji
wielkości 394 pz wycinano z 1,5% żelu agarozowego i oczyszczono za pomocą zestawu
do ekstrakcji z żelu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). W drugiej reakcji PCR
zastosowano zmodyfikowane startery 799F/1193R przedłużone o specyficzną dla każdej
próby sekwencję nukleotydów (MID) o długości 10 pz mającą na celu identyfikację danej
próby podczas pirosekwencjonowania. Matrycą był produkt amplifikacji pierwszej reakcji
PCR. Mieszanina reakcyjna obu reakcji składała się z 1-6 µl matrycowego DNA
(w zależności od stężenia DNA w badanej próbie), 5 µl buforu 10×High Fidelity (Invitrogen),
2 µl 50 mM MgSO4, 1 µl 10 mM dNTP mix, 1 µl starterów 799F i 1193R w stężeniu 10 µM,
0,2 µl polimerazy Platinum Taq High Fidelity (5 U) (Invitrogen), 33,8-38,8 µl sterylnej wody
demineralizowanej. Warunki przeprowadzonej reakcji PCR uwzględniały: (1) początkową
denaturację 95°C 5 min, następnie (2) 35 cykli obejmujących 94°C 1 min, 53°C 40 s i 72°C
40 s, (3) końcową elongację 7 min 72°C (TechneTC 5000 PCR Thermal Cycler). Otrzymane
produkty drugiej reakcji PCR, czyli amplikony znakowane MID, oczyszczano za pomocą
zestawu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Stężenie DNA w każdej próbie określano
fluorymetrycznie w obecności barwnika PicoGreen dsDNA Quantitation assay (Life
Technologies) przy użyciu czytnika płytek Fluostar Omega (BMG Labtech). Równomolowe
stężenia amplikonów, znakowanych odpowiednimi adaptorami MID, łączono ze sobą
i wysłano do Macrogen (Amsterdam, Holandia), gdzie przeprowadzano
pirosekwencjonowanie na aparacie 454 Genom Sequencer FLX Titanium.
3.2.5.3. Analiza wyników pirosekwencjonowania 454
Surowe sekwencje, tzw. raw data, analizowano z wykorzystaniem programu QIIME
1.9.1 (ang. quantitative insights into microbial ecology) (Caporaso i wsp., 2010a). Następnie,
sekwencje złej jakości usuwano stosując AmpliconNoise (Quince i wsp., 2009). Otrzymane
biblioteki rozdzielano według sekwencji MID, które następnie usuwano, tak jak sekwencje
starterów, homopolimerów dłuższych niż 6 pz i sekwencji krótszych niż 200 pz. Powstałe
chimery identyfikowano i usuwano przy wykorzystaniu UCHIME 4.2.40 (Edgar i wsp., 2011)
zgodnie z algorytmem USEARCH61 (Edgar, 2010). Tak wyselekcjonowane sekwencje
uporządkowano zgodnie ze strategią ‘open reference’. Z uzyskanych sekwencji usuwano
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 48
również te należące do genomów mitochondrialnych, chloroplastowych i Archaea. W ten
sposób zanalizowane sekwencje ostatecznie przetwarzano przez PyNast 0.1 (Caporaso i wsp.,
2010b). Grupowanie OTU (ang. operational taxonomic unit, operacyjna jednostka
taksonomiczna) przeprowadzano na poziomie 97% podobieństwa sekwencji DNA, następnie
wszystkie OTU przydzielano do odpowiednich jednostek taksonomicznych w oparciu o bazę
GreenGenes (DeSantis i wsp., 2006).
Krzywe rarefakcji (rozrzedzenia) wykreślano dla każdej z analizowanych prób.
Do oceny zmienności i bioróżnorodności zespołów bakterii endofitycznych badanych roślin
wykorzystano: liczbę obserwowanych gatunków, różnorodność filogenetyczną, indeks
Shannona (H’) (wskaźnik ogólnej bioróżnorodności), wskaźnik różnorodności Simpsona
(1/D) (wskaźnik bogactwa gatunkowego, charakteryzujący różnorodność gatunkową),
estymator asymptotycznego bogactwa gatunkowego Chao1 oraz indeks Gooda (Good’s
coverage) (metoda szacowania, jaki procent wszystkich gatunków jest reprezentowany
w badanej próbie).
Analizę głównych współrzędnych PCoA (ang. principal coordinate analysis)
przeprowadzono wykorzystując metrykę UniFrac (Unweighted i Weighted) opierającej się
na informacji filogenetycznej (Lozupone i Knight, 2007). Pozwala ona na odrzucenie
czynników najmniej istotnych i wyróżnienie czynników kluczowych. W analizie
bioróżnorodności bakterii endofitycznych badanych roślin, metodę PCoA wykorzystano
do wyznaczania korelacji pomiędzy próbami, a także określania wzorców zmienności.
3.2.6. Doświadczenie fitoremediacyjne
3.2.6.1. Gleba
W doświadczeniu fitoremediacyjnym wykorzystano glebę pobraną w pobliżu „dołów
kwasowych” przy rafinerii w Czechowicach-Dziedzicach. Glebę pobierano
z powierzchniowej warstwy o głębokości 0-20 cm, a następnie przechowywano w chłodni
w temp. 4°C. Przed rozpoczęciem doświadczenia przesiewano ją przez sita, z których ostatnie
miały oczka o średnicy 2 mm.
W doświadczeniu fitoremediacyjnym stosowano szczepy bakterii oporne
na rifampicynę. Dlatego, konieczne było sprawdzenie czy wśród mikroorganizmów
autochtonicznych gleby wykorzystanej w doświadczeniu fitoremedicyjnym nie występują
szczepy oporne na ten antybiotyk. W tym celu wykonywano posiewy gleby na podłoże LB
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 49
z rifampicyną w stężeniu 20-150 µg ml-1 oraz nystatyną w stężeniu 50 µg ml-1. Testy te były
ujemne, nie notowano wzrostu kolonii bakterii.
3.2.6.2. Szczepy bakterii endofitycznych
Na podstawie przeprowadzonych analiz genetycznych i biochemicznych,
do doświadczenia fitoremediacyjnego, wybrano dwa szczepy bakterii endofitycznych:
Rhodococcus erythropolis 5WK oraz Rhizobium sp. 10WK. W celu monitorowania
ich przeżywalności w glebie i tkankach życicy trwałej (Lolium perenne) podczas
doświadczenia, wyselekcjonowano dzikie mutanty tych szczepów oporne na rifampicynę:
R. erythropolis 5WKrif oraz Rhizobium sp. 10WKrif.
Selekcję spontanicznych mutantów obu endofitów przeprowadzano wykonując
posiew redukcyjny szczepów na podłożu LB zawierającym rifampicynę w stężeniu 5 µg ml-1.
Następnie, wyrosłe kolonie kolejno przenoszono na podłoże LB ze wzrastającym stężeniem
rifampicyny od 20-150 µg ml-1. Uzyskane w ten sposób R. erythropolis 5WKrif
oraz Rhizobium sp. 10WKrif, oporne na najwyższe stężenie antybiotyku, wielokrotnie
hodowano na podłożu LB bez rifampicyny, a następnie posiewano ponownie na podłoże LB
z rifampicyną w stężeniu 150 µg ml-1. Dzięki temu, potwierdzono trwałość uzyskanej
wcześniej oporności. Dzikie mutanty oporne na rifampicynę 5WKrif oraz 10WKrif, tak jak
szczepy rodzicielskie, posiadały te same mechanizmy promujące wzrost roślin oraz potencjał
degradacji węglowodorów, co potwierdzano wykonując odpowiednie testy opisane
w rozdziałach 3.2.2., 3.2.3., 3.2.4.
3.2.6.3. Inokulum
Inokulum bakteryjne przygotowywano wykorzystując rifampicynooporne szczepy:
R. erythropolis 5WKrif oraz Rhizobium sp. 10WKrif. Bakterie hodowano na podłożu LB
z rifampicyną w stężeniu 150 µg ml-1 w temp. 28°C, z wytrząsaniem (120 obr min-1) przez
14-16 godz., aż do uzyskania właściwej absorbancji (OD600nm=1,5-2,0). Uzyskane hodowle
odwirowywano (5000 obr min-1, 20°C, 15 min), otrzymany osad przemywano trzy razy
sterylnym roztworem 0,9% NaCl, a następnie zawieszano w sterylnym roztworze 0,9% NaCl.
Za pomocą pomiarów gęstości optycznej i posiewów płytkowych oceniano liczebność
bakterii w 1 ml hodowli, jednocześnie dobierając jej objętość tak, aby liczba wprowadzonych
bakterii do gleby wynosiła 108 j.t.k. g-1 suchej masy gleby (s.m. gleby). Bakterie endofityczne
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 50
wprowadzano do gleby w postaci inokulum, które składało się z pojedynczych szczepów
5WKrif lub 10WKrif lub konsorcjum obu szczepów.
3.2.6.4. Doświadczenie fitoremediacyjne
Do doświadczenia fitoremediacyjnego wybrano życicę trwałą ze względu
na udokumentowane w literaturze przedmiotu jej zdolności do wzrostu w glebie skażonej
substancjami ropopochodnymi.
Doświadczenie fitoremediacyjne prowadzono w następujących układach
doświadczalnych:
(1) zanieczyszczona gleba (S)
(2) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy (R)
(3) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy inokulowana szczepem 5WKrif
(SI+5WK)
(4) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy inokulowana szczepem 10WKrif
(SI+10WK)
(5) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy inokulowana konsorcjum
szczepów 5WKrif i 10WKrf (SI+5WK+10WK)
(6) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy pre-inokulowanymi szczepem
5WKrif, a następnie inokulowana gleba szczepem 5WKrif (PI+5WK)
(7) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy pre-inokulowanymi szczepem
10WKrif, a następnie inokulowana gleba szczepem 10WKrif (PI+10 WK)
(8) zanieczyszczona gleba z wysianymi nasionami życicy pre-inokulowanymi
konsorcjum szczepów 5WKrif i 10WKrif, a następnie inokulowana gleba konsorcjum
szczepów 5WKrif i 10WKrif (PI+5WK+10WK)
W doniczkach (550 ml) umieszczano przygotowaną wcześniej glebę (450 g),
do której wysiewano nasiona życicy (0,40±0,1 g). W trakcie doświadczenia wilgotność gleby
utrzymywano na stałym poziomie (20%), poprzez podlewanie jej co 2-3 dni odpowiednią
ilością wody wodociągowej. Doniczki umieszczono w pokoju hodowlanym w warunkach
14 godz. dnia o temp. 23°C i 10 godz. nocy z temp. 18°C.
W przeprowadzonym doświadczeniu fitoremediacyjnym stosowano dwie metody
inokulacji: (1) inokulację gleby (SI); (2) pre-inokulację nasion z inokulacją gleby (PI).
W pierwszej metodzie (SI), po wysianiu nasion (0,40±0,1 g) do gleby, równomiernie na całą
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 51
powierzchnię, wprowadzano 40 ml inokulum zawierającego pojedyncze szczepy (5WKrif
lub 10WKrif) lub konsorcjum obu szczepów. W drugiej metodzie (PI), zastosowano najpierw
wstępną bakteryjną inokulację nasion życicy tzw. pre-inokulację. Przed pre-inokulacją,
nasiona powierzchniowo sterylizowano, płucząc je przez 5 min kolejno w: 70% etanolu,
0,01% roztworze podchlorynu sodu i trzy razy w sterylnej wodzie. Skuteczność procesu
sterylizacji weryfikowano przez posiew wody z ostatniego płukania na podłoże LB. Brak
wzrostu kolonii bakterii świadczył o sterylnej powierzchni nasion. Tak przygotowane nasiona
inkubowano w ciemności, bez wytrząsania w temp. 28°C z 14 ml zawiesiny bakteryjnej (108
komórek ml-1 podłoża), zawierającej szczep 5WKrif, 10WKrif lub konsorcjum obu szczepów
zmieszanych w stosunku 1:1. Po 24 godz. nasiona przemywano trzy razy sterylną wodą
i wysiewano je do doniczek. Następnie, w okolice nasion wprowadzano 40 ml świeżego,
bakteryjnego inokulum zawierającego pojedyncze szczepy (5WKrif lub 10WKrif)
lub konsorcjum obu szczepów.
W 14, 31 i 75 dniu prowadzenia doświadczenia określano świeżą masę roślin
i pobierano próbki gleby. Do czasu przeprowadzenia analiz przechowywano je w temp. -
20°C.
3.2.6.5. Oznaczenie zawartości TPH w glebie
W celu oceny zawartości TPH w glebie przed rozpoczęciem doświadczenia, w 14, 31
i 75 dniu fitoremediacji, oznaczano zawartość węglowodorów zawierających od dziesięciu
do czterdziestu atomów węgla w cząsteczce (C10-C40), metodą chromatografii gazowej
według normy PN-EN ISO 16703.
3.2.6.6. Ocena przeżywalności wprowadzonych bakterii endofitycznych
W celu oceny przeżywalności bakterii endofitycznych w glebie odważano 10 g
gleby, którą zawieszano w 90 ml 0,9% NaCl z 1% Tween 80 i wytrząsano (120 obr min-1,
28°C, 30 min). Z wybranych rozcieńczeń wykonywano posiew na stałe podłoże LB
z rifampicyną w stężeniu 150 µg ml-1 oraz nystatyną w stężeniu 50 μg ml-1 (LB+rif+nyst).
Płytki inkubowano przez 7 dni w temp. 28°C.
Zdolność szczepów bakterii endofitycznych do kolonizacji tkanek roślinnych i ich
migracji do części nadziemnych oceniano poprzez ich izolację z tkanek życicy. Sterylizację
korzeni i części nadziemnych przeprowadzano w sposób opisany w rozdziale 3.2.1. Wybrane
rozcieńczenia zawiesiny roślinnej posiewano na stałe podłoże LB+rif+nyst, a płytki
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 52
inkubowano w temp. 28°C przez 7 dni. Liczebność 5WKrif, 10WKrif lub konsorcjum obu
szczepów zdolnych do kolonizacji tkanek roślinnych wyrażano w j.t.k. g-1 ś.m. korzeni
lub części nadziemnych życicy trwałej.
3.2.6.7. Badanie wpływu introdukowanych szczepów bakterii na przyrost biomasy roślin
W 14, 31 i 75 dniu doświadczenia fitoremediacyjnego rośliny usuwano z doniczek,
oczyszczano z gleby i ważono. Po zakończeniu eksperymentu obliczano współczynnik
wzrostu roślin (%) korzystając ze wzoru:
((M1-M0) / M0) * 100%
gdzie: M1-całkowita biomasa roślin w 75 dniu doświadczenia dla
danego układu doświadczalnego; M0-całkowita biomasa roślin w 14
dniu doświadczenia dla danego układu doświadczalnego
3.2.6.8. Określenie wpływu wprowadzonych szczepów na ogólną liczebność i liczebność
bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych w glebie
Na podstawie liczby kopii genu 16S rRNA w glebie, oznaczonej metodą
łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR, qPCR), oceniano
wpływ introdukowanych szczepów na ogólną liczebność mikroorganizmów autochtonicznych
w badanej glebie. Ponadto, tą samą metodą oznaczano liczbę kopii genu hydroksylazy
alkanowej (alkH) w celu określenia wpływu introdukowanych szczepów na liczebność
mikroorganizmów zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych.
Izolację DNA z gleby przeprowadzano za pomocą kitu Power Soil DNA (Mo Bio)
zgodnie z załączonym protokołem. Na matrycy uzyskanego DNA przeprowadzano
oznaczenie liczby kopii genów 16S rRNA oraz alkH metodą qPCR na aparacie LightCycler96
(Roche). Do amplifikacji stosowano startery specyficzne dla genu 16S rRNA pE (5’ AAA
CTC AAA GGA ATT GAC GG 3’) i pF (5’ ACG AGC TGA CGA CAG CCA TG 3’)
(Edwards i wsp., 1989) oraz dla genu alkH alk-H1-F (5’ CIG IIC ACG AII TIG GIC ACA
AGA AGG 3’) i alk-H3-R (5’ IGC ITG ITG ATC III GTG ICG CTG IAG 3’) (Philips i wsp.,
2008). Mieszanina reakcyjna o objętości 20 μl zawierała: 10 µl 2×stężonego FastStart
Essential DNA Green Master (Roche), 1 µl każdego ze starterów w stężeniu 10 µM, 2 µl
matrycowego DNA oraz 6 µl wody. Reakcję qPCR dla genu 16S rRNA przeprowadzano
zgodnie z profilem temperatury: 95°C 10 min, 28 cykli obejmujących 95°C 10 s, 57°C 20 s,
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Materiały i metody 53
72°C 30 s. Natomiast, dla genu alkH warunki qPCR były następujące: 10 min 95°C, 30 cykli
95°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 1 min. Detekcję emisji fluorescencji przeprowadzano
wykorzystując fluorochrom SYBR Green I, który łączy się z dwuniciowym DNA, w tym
również z niespecyficznymi produktami PCR, takimi jak struktury „primer-dimer”. Dlatego,
aby zapobiec detekcji tych struktur, na końcu każdego etapu wydłużania, fluorescencję
mierzono w temp. 81°C. Krzywe topnienia produktów PCR analizowano w zakresie temp.
od 65°C do 95°C. Liczbę kopii obu genów wyznaczano na podstawie krzywych wzorcowych
przygotowanych z seryjnych rozcieńczeń standardu. Standard przygotowano zgodnie
z protokołem zestawu InsTAclone PCR (Thermo Scientific), według którego do wektora
pTZ57R/T (Thermo Scientific) wklonowano produkt PCR odpowiadający analizowanym
genom. Czystość i koncentrację DNA standardu oznaczono spektrofotometrycznie
(NanoDrop, Thermo Scientific).
3.2.7. Analiza statystyczna
Obliczenia oraz wykresy wykonywano z zastosowaniem arkuszy kalkulacyjnych
Microsoft®Excel 2010. Przedstawione wyniki są średnimi z trzech powtórzeń ± odchylenie
standardowe. W przypadku pirosekwencjonowania 454, wyniki są średnimi z czterech
powtórzeń ± odchylenie standardowe.
Do porównania ubytku TPH w glebie wykorzystano jedno- oraz dwuczynnikową
analizę wariancji. Istotność różnic w liczbie kopii genu 16S rRNA jak i alkH (qPCR) w glebie
w badanych układach doświadczalnych oraz przyroście biomasy życicy trwałej podczas
doświadczenia fitoremediacyjnego określano za pomocą analizy wariancji jedno-
i trójczynnikowej. Natomiast, porównując liczebność szczepów 5WK i 10WK w glebie
i tkankach życicy trwałej oraz indeksy bioróżnorodności wyznaczonych na podstawie
wyników pirosekwencjonowania 454 zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji.
W celu określenia stopnia podobieństwa zespołów bakterii endofitycznych komonicy
zwyczajenej i jastrzębca wysokiego, przeprowadzano analizę głównych współrzędnych
(PCoA) zgodnie z metrykami Unweighted (analiza jakościowa) oraz Weighted (analiza
ilościowa) UniFrac.
Istotne statystyczne różnice (p<0,05) między poszczególnymi średnimi oceniano
w oparciu o test post-hoc, test Tukeya, z zastosowaniem programu STATISTICA® 13.1 PL.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 54
IV. Wyniki
4.1. Izolacja bakterii endofitycznych zdolnych do wykorzystania surowej ropy
naftowej
Rośliny wykorzystane do badań zostały zebrane z terenu, w którym stężenie oleju
mineralnego w glebie przekraczało ponad czterokrotnie normy dopuszczalne w Polsce.
Poziom TPH wynosił 12853,34±322,62 mg kg-1 s.m. gleby. W celu selekcji bakterii zdolnych
do rozkładu związków ropopochodnych, endofity izolowano na pożywce M9, w której
stężenie surowej ropy naftowej wynosiło 1%. Łącznie wyselekcjonowano 44 różniące się
mofrologicznie szczepy bakterii endofitycznych z korzeni, łodyg i liści komonicy zwyczajnej
(12 szczepów), wiesiołka dwuletniego (14 szczepów) oraz jastrzębca wysokiego (18
szczepów) (Tabela 2).
Tabela. 2. Szczepy bakterii endofitycznych wyizolowane z komonicy zwyczajnej, wiesiołka
dwuletniego i jastrzębca wysokiego.
Szczepy bakterii endofitycznych
Komonica zwyczajna Wiesiołek dwuletni Jastrzębiec wysoki
Korzeń
2WK
3WK
4WK
5WK
6WK
6.1WK
7WK
8WK
8.1WK
10WK
10.1WK
1FWK
1.1FWK
1CJK
2CJK
2CJKA
4FJK
2RJK
2RJKA
3RJK
3RJKA
6RJK
Łodyga
1XS
1.1XS
2.1XS
4XS
5XS
5.1XS
6.1XS
2FXS
5FXS
6FXS
3.1FWS
6RJS1
6RJS2
7RJS
7RJS1
7RJSS
10RJS
Liść 1XL
5XL
3RJL
3RJLA
5RJL
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 55
4.2. Określenie przynależności gatunkowej izolatów
Metodą ARDRA przeprowadzono analizę różnorodności genetycznej izolatów.
Analiza restrykcyjna fragmentu genu 16S rRNA pozwoliła na wyróżnienie 26 profili
ARDRA, przedstawiających różne wzory prążków (Tabela 3). Na podstawie sekwencji
fragmentu genu 16S rRNA i porównania z sekwencjami nuleotydów w bazie NCBI, przy
wykorzystaniu algorytmu BLAST, określono przynależność gatunkową bakterii
endofitycznych. Podobieństwo filogenetyczne izolatów do najbliższych im wzorcowych
szczepów przedstawiono na Rys. 9. Otrzymane drzewo filogenetyczne składa się z 42
węzłów, z których tylko dwa zostały zweryfikowane wartościami bootrstrap, mniejszymi niż
50%. W przypadku izolatów z rodzaju Pseudomonas szczepy, 2RJK, 3RJK i 5RJL,
są w dużym stopniu filogenetycznie do siebie podobne. Podobnie, szczepy z rodziny
Enterobacteriaceae: 2RJKS, 4FJK, 7RJSS wykazują duże podobieństwo względem siebie.
Tabela 3. Profile ARDRA uzyskane przez cięcie fragmentu genu 16S rRNA enzymem
restrykcyjnym HpyCH4IV. Przynależność gatunkowa wyizolowanych endofitów.
Profil ARDRA
Gatunek o najbliższym
stopniu pokrewieństwa
(% podobieństwa)
numer
ACC
Szc
zep w
ysł
any d
o
sekw
encj
onow
ania
Szc
zepy o
tym
sam
ym
pro
filu
AR
DR
A
Burkholderia ambifaria
(99%)
MF765329 1CJK
Enterobacter ludwigii (100%)
Pseudomonas rhodesiae
(99%)
Enterobacter ludwigii (100%)
Pseudomonas grimontii
(99%)
MF765330
MF765331
MF765332
MF765333
4FJK
2RJK
2RJKA
3RJK
Microbacterium natoriense
(99%)
MF765334
3RJKA 2CJK
Pseudomonas mandeli
(100%)
MF765335
6RJK 6RJS1
6RJS2
7RJS
7RJS1
3RJL
3RJLA
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 56
Pantoea agglomerans (100%)
Rhodococcus fascians
(100%)
MF765336
MF765337
7RJSS
10RJS
2CJKA
Pseudomonas rhodesiae
(100%)
MF765338
5RJL
Xanthomonas albilineans
(99%)
KU726266 2WK 3.1FWS
Stenotrophomonas
maltophilia (98%)
KU726268
KU726258
6WK
5XS
3WK
1.1XS
Rhodococcus erythropolis
(98%)
KU726267
KU726269
KU726270
5WK
6.1WK
7WK
4WK
Rhizobium nepotum (99%) KU726271 8WK 10WK
10.1WK
1.1FWK
1XS
4XS
Pseudomonas umsongensis
(99%)
KU726272 8.1WK 1FWK
Serratia plymuthica (99%) KU726257 2.1XS
Pseudomonas kilonensis
(99%)
Pseudomonas mandelii (99%)
KU726259
KU726263
5.1XS
6FXS
Pseudomonas poae (99%) KU726261 2FXS
Delftia lacustris (99%) KU726260
KU726262
6.1XS
5FXS
Tsukamurella tyrosinosolvens
(99%)
Tsukamurella pulmonis
(99%)
KU726264
KU726265
1XL
5XL
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 57
Rys. 9. Drzewo filogenetyczne 26 izolatów komonicy zwyczajnej, wiesiołka dwuletniego
i jastrzębca wysokiego, których przynależność gatunkową oznaczono na podstawie
sekwencjonowania fragmentu genu 16S rRNA (Neighbor-Joining, bootstrap n=1000,
program MEGA 7.0).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 58
Wyizolowane bakterie endofityczne zaklasyfikowano do 12 rodzajów zgrupowanych
w klasach Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria oraz Actinobacteria. Bakterie zaliczane
do wszystkich wymienionych klas stwierdzono jedynie u komonicy, natomiast wśród
endofitów wiesiołka nie odnaleziono bakterii hodowalnych należących
do Betaproteobacteria. Z kolei, wśród izolatów jastrzębca nie zidentyfikowano bakterii
zalicznaych do Alphaproteobacteria (Rys. 10). Większość wyizolowanych szczepów
ze wszystkich badanych gatunków roślin zaklasyfikowano do Gammaproteobacteria, a wśród
szczepów jastrzębca, aż 78% izolatów należało do tej klasy (Rys. 10).
Gatunki bakterii zaliczne do Delftia sp., Serratia sp., Tsukamurella sp. występowały
tylko w tkankach komonicy (Rys. 11). Dla mikrobiomu wiesiołka charakterystyczne były
bakterie należące do rodzaju Xanthomonas, natomist bakterie Burkholderia sp.,
16%
17%
50%
17%
Komonica zwyczajna
28%
43%
29%
Wiesiołek dwuletni
5%
78%
17%
Jastrzębiec wysoki
Rys. 10. Przynależność taksonomiczna wyizolowanych szczepów bakterii endofitycznych
komonicy zwyczajnej, wiesiołka dwuletniego oraz jastrzębca wysokiego.
Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Actinobacteria.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 59
Enterobacter sp., Microbacterium sp. oraz Pantoea sp. występowały tylko wśród izolatów
z jastrzębca. Endofity zaliczane do rodzajów Rhizobium i Rhodococcus najliczniej
występowały w tkankach wiesiołka. U pozostałych gatunków roślin dominowały bakterie
z rodzaju Pseudomonas. Odpowiednio, wśród bakterii komonicy stanowiły one 25%,
natomiast u jastrzębca, aż 55,5% wszystkich izolatów.
Rys. 11. Bakterie endofityczne występujące w tkankach komonicy zwyczajnej, wiesiołka
dwuletniego i jastrzębca wysokiego.
4.3. Ocena wykorzystania węglowodorów jako jedynego źródła węgla i energii
przez bakterie endofityczne
Izolaty testowano pod kątem ich zdolności do wzrostu w obecności oleju diesla, n-
heksadekanu i p-ksylenu oraz potencjalnego wykorzystania tych węglowodorów jako
jedynego źródła węgla i energii (Tabela 4). Ponad 90% wszystkich badanych endofitów,
izolowanych z komonicy oraz wiesiołka, było zdolnych do wzrostu w obecności oleju diesla.
Natomiast, wśród endofitów jastrzębca 77,8% bakterii posiadało tę cechę. Możliwość
wykorzystania n-heksadekanu jako źródło węgla zaobserwowano u 16,7%, 28,6% i 44,4%
bakterii wyizolowanych odpowiednio z tkanek komonicy, wiesiołka i jastrzębca. Żaden
z badanych szczepów nie wykorzystywał p-ksylenu jako jedynego źródła węgla. Zdolność do
Rhizobium sp.
Stenotrophomonas sp.
Delftia sp.
Serratia sp.
Tsukamurella sp.
Komonica zwyczajna Wiesiołek dwuletni
Xanthomonas sp.
Jastrzębiec wysoki
Rhodococcus sp.
Burkholderia sp.
Enterobacter sp.
Microbacterium sp.
Pantoea sp.
Pseudomonas sp.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 60
wzrostu w obecności wybranych węglowodorów wśród izolatów wszystkich roślin kształtuje
się według schematu: surowa ropa naftowa>olej diesla>n-heksadekan.
4.4. Detekcja genów kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów
Detekcję genów kodujących enzymy zaangażowane w degradację węglowodorów,
u wyizolowanych bakterii endofitycznych, przeprowadzono za pomocą reakcji PCR (Tabela
4). Spośród 44 badanych szczepów u sześciu: Burkholderia ambifaria 1CJK, Pseudomonas
mandelii 6FXS i Rhodococcus sp. (4WK, 5WK, 6.1WK, 7WK) stwierdzono obecność genu
alkB kodującego monooksygenazę alkanową (Rys. 12). Pozytywny wynik amplifikacji genu
alkH obserwowano u 7 szczepów, należących do rodzajów Tsukamurella i Rhodococcus. Gen
P450, kodujący enzymy spokrewnione z cytochromem P450 (rodzina CYP153), wykryto
u 41,7%, 42,9% i 38,9% endofitów wyizolowanych odpowiednio z komonicy, wiesiołka
i jastrzębca (Rys. 12). Ponadto, tylko wśród izolatów jastrzębca występowały szczepy,
u których stwierdzono obecność genów kodujących dioksygenazę-2,3-katecholu (C23O)
(61,1% wszystkich izolatów) i podjednostkę alfa dioksygenaz hydroksylujących
wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (pah) (88,9% wszystkich izolatów).
500 pz
400 pz
300 pz
200 pz
100 pz
1000 pz
750 pz
500 pz
250 pz
A) alkB 100 pz B) alkH 549 pz C) P450 339 pz
500 pz
300 pz
100 pz
100
bp
5W
K
7W
K
1C
JK
1 k
b
4W
K
5W
K
6.1
WK
7W
K
Exp
2C
JK
6R
JK
7R
JS
7R
JSS
3R
JLA
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 61
`
Rys. 12. Przykładowe elektroforogramy rozdziału produktów reakcji PCR dla genów (A)
alkB, (B) alkH, (C) P450, (D) pah, (E) C23O. Oznaczenia: nad liniami
umieszczono nazwę szczepu lub nazwę markera wielkości: 100 bp, 1 kb, Exp-
Express DNA Ladder.
4.5. Detekcja genu acdS
Wyniki przeprowadzonych reakcji PCR z wykorzystaniem zdegenerowanych
starterów pozwoliły na detekcję u bakterii endofitycznych genu acdS kodującego deaminazę
ACC (Rys. 13). Wśród izolatów komonicy, wiesiołka i jastrzębca odpowiednio 41,7%,
42,8%, 77,8% bakterii posiadało gen acdS. Nie wykryto tego genu u badanych szczepów
należących do rodzaju Rhodococcus.
500 pz
300 pz
100 pz
500 pz
300 pz
100 pz
D) pah 292 pz E) C23O 406 pz
Exp
1C
JK
2C
JK
2C
JKA
4F
JK
2R
JK
2R
JKA
3R
JK
Exp
2C
JKA
4F
JK
2R
JK
2R
JKA
3R
JK
3R
JKA
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 62
Rys. 13. Przykładowe elektroforogramy rozdziału produktów reakcji PCR dla genu acdS
z wykorzystaniem odpowiednich par starterów: (A) F1936/F1939, (B) F1936/F1938.
Oznaczenia: nad liniami umieszczono nazwę szczepu lub nazwę markera wielkości:
Exp-Express DNA Ladder i 100 bp.
4.6. Biochemiczna charakterystyka bakterii endofitycznych
4.6.1. Mechanizmy promujące wzrost roślin
U wszystkich wyizolowanych endofitów oceniano obecność mechanizmów
potencjalnie odpowiedzialnych za promowanie wzrostu roślin. Uzyskane wyniki zebrano
w Tabeli 4.
750 pz
500 pz
300 pz
100 pz
1000 pz
900 pz
800 pz
700 pz
600 pz
500 pz
A) Para starterów F1936/F1939 558 pz B) Para starterów F1936/F1938 792 pz
Exp
4X
S
8W
K
10
WK
1
0.1
WK
1
FW
K
1X
L
5X
L
5.1
XS
100
bp
5X
S
5.1
XS
8W
K
1F
WK
3W
K
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki
63
Tabela 4. Charakterystyka bakterii endofitycznych wyizolowanych z tkanek komonicy zwyczajnej, wiesiołka dwuletniego i jastrzębca
wysokiego.
Sekwencjonowanie genu
16S rRNA Właściwości bakterii endofitycznych Genyf
Potencjał
degradacyjny
Rośl
ina
Tkan
ka
Szczep Gatunek o najbliższym
stopniu pokrewieństwa PSa IAAb HCNc SIDd CMCe Ruch acdS alkB alkH P450 C23O pah
Suro
wa
ropa
Ole
j die
sla
n-h
eksa
dek
an
Ko
mo
nic
a z
wycz
ajn
a
Łodyga
1XS Rhizobium sp. 1,0±0,0 35,9±3,7 - - - + - - - - - - + + -
1.1XS Stenotrophomonas sp. - 24,3±0,9 +++ ng - + - - - - - - + - -
2.1XS Serratia plymuthica 1,8±0,5 5,8±0,1 ++ + 6,3±1,2 + - - - - - - + + -
4XS Rhizobium sp. - 18,8±0,6 ++ - - + + - - - - - + + -
5XS Stenotrophomonas
maltophilia - 22,1±1,5 +++ ng - + + - - + - - + + -
5.1XS Pseudomonas kilonensis 7,3±0,6 12,0±0,3 + - 4,7±0,6 + + - - + - - + + -
6.1XS Delftia lacustris - 59,9±4,0 - + - + - - - + - - + + -
2FXS Pseudomonas poae 10,3±1,5 7,9±0,3 +++ + - + - - - - - - + + -
5FXS Delftia lacustris - 62,6±5,2 + - - + - - - - - - + + -
6FXS Pseudomonas mandelii 2,3±0,6 16,5±0,8 ++ + 7,7±1,5 + - + - - - - + + -
Liś
ć 1XL Tsukamurella
tyrosinosolvens 5,3±0,6 2,0±0,3 + + 15,3±2,1 - + - + + - - + + +
5XL Tsukamurella pulmonis 5,67±0,6 1,9±0,2 ++ + 14,7±0,6 - + - + + - - + + +
Udział
procentowy
(%)
58,3 100 83,3 50 41,7 83,3 41,7 8,3 16,7 41,7 0 0 100 91,7 16,7
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki
64
Sekwencjonowanie genu 16S
rRNA Właściwości bakterii endofitycznych Genyf
Potencjał
degradacyjny
Rośl
ina
Tkan
ka
Szczep Gatunek o najbliższym stopniu
pokrewieństwa PSa IAAb HCNc SIDd CMCe Ruch acdS alkB alkH P450 C23O pah
Suro
wa
ropa
Ole
j die
sla
n-h
eksa
dek
an
Wie
siołe
k d
wu
letn
i
Korz
eń
2WK Xanthomonas albilineans - 17,2±1,1 - - - + - - - - - - + + -
3WK Stenotrophomonas sp. - 23,4±2,0 +++ ng - + + - - - - - + + -
4WK Rhodococcus sp. - 1,8±0,1 + ng 2,3±0,6 - - + + + - - + + +
5WK Rhodococcus erythropolis - 1,4±0,1 - ng 2,0±0,0 - - + + + - - + + +
6WK Stenotrophomonas maltophilia - 18,6±2,8 +++ ng - + - - - - - - + + -
6.1WK Rhodococcus erythropolis - 2,0±0,2 +++ ng 2,7±0,6 - - + + + - - + + +
7WK Rhodococcus erythropolis - 1,3±0,0 +++ ng 1,7±0,6 - - + + + - - + + +
8WK Rhizobium nepotum 3,0±0,0 15,3±1,8 - - 1,7±0,6 + + - - - - - + - -
8.1WK Pseudomonas umsongensis 4,0±0,6 7,9±1,2 +++ + - + - - - + - - + + -
10WK Rhizobium sp. - 27,5±1,0 - - 1,7±0,6 + + - - - - - + + -
10.1WK Rhizobium sp. - 29,6±1,0 ++ - 2,0±0,0 + + - - - - - + + -
1FWK Pseudomonas sp. 3,0±0,0 7,5±0,2 - + 2,0±0,0 + + - - + - - + + -
1.1FWK Rhizobium sp. 1,3±0,6 22,5±1,5 +++ - 3,0±1,0 + + - - - - - + + -
Ło
dy
ga
3.1FWS Xanthomonas sp. - 16,3±1,0 +++ - - + - - - - - - + + -
Udział
procentowy (%) 28,6 100 64,3 14,3 64,3 71,4 42,86 28,6 28,6 42,9 0 0 100 92,9 28,6
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki
65
Oznaczenia: a-PS-rozpuszczanie fosforanów, średnica strefy przejaśnienia [mm]; b-IAA-produkcja kwasu indolilo-3-octowego [µg IAA ml-1 podłoża]; c-HCN-produkcja
cyjanowodoru, - brak; + niska; ++ średnia; +++ wysoka; d-SID-produkcja sideroforów, - brak; + obecne; ng brak wzrostu szczepu na podłożu CAS; e-CMC-produkcja
enzymów celulolitycznych, średnica strefy przejaśnienia [mm]; f-Identyfikacja genów kodujących: enzym deaminazę ACC acdS, monooksygenazę alkanową alkB,
hydroksylazę alkanową alkH, enzymy spokrewnione z cytochromem P450 P450, dioksygenazę-2,3-katecholu C23O, podjednostkę alfa dioksygenaz hydroksylujących
wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne pah; ± odchylenie standardowe z trzech powtórzeń.
Sekwencjonowanie genu 16S
rRNA Właściwości bakterii endofitycznych Genyf
Potencjał
degradacyjny R
ośl
ina
Tkan
ka
Szczep Gatunek o najbliższym stopniu
pokrewieństwa PSa IAAb HCNc SIDd CMCe Ruch acdS alkB alkH P450 C23O pah
Suro
wa
ropa
Ole
j die
sla
n-h
eksa
dek
an
Jast
rzęb
iec
wyso
ki K
orz
eń
1CJK Burkholderia ambifaria - 2,6±0,2 - + - + - + - - - + + + +
2CJK Microbacterium sp. - 2,6±0,1 - ng 17,3±2,1 + - - - + - + + + +
2CJKA Pantoea sp. - 52,2±8,0 ++ - - + + - - - + + + + -
4FJK Enterobacter ludwigii - 68,8±6,2 + - - + + - - - + + + + -
2RJK Pseudomonas rhodesiae - 2,0±0,3 - - - + + - - - + + + + -
2RJKA Enterobacter ludwigii - 76,4±3,1 +++ - - + + - - - + + + + -
3RJK Pseudomonas grimontii - 2,7±0,3 - - - + + - - - + + + + -
3RJKA Microbacterium natoriense - 4,6±0,4 - ng 14,3±1,1 - + - - + + + + + +
6RJK Pseudomonas mandelii - 5,6±1,5 +++ - 5,3±0,3 + - - - + + + + + +
Ło
dyga
6RJS1 Pseudomonas sp. - 2,1±0,4 - - - + + - - - - - + - -
6RJS2 Pseudomonas sp. - 1,8±0,1 - + - + + - - - + + + + -
7RJS Pseudomonas sp. 3,7±0,5 3,9±2,4 - - - + + - - + + + + + +
7RJS1 Pseudomonas sp. 8,0±1,0 2,7±0,3 - - - + + - - - + + + + -
7RJSS Pantoea agglomerans 9,3±1,3 2,5±0,3 - - - + + - - + - + + - +
10RJS Rhodococcus fascians - 2,5±0,4 ++ ng - - - - + + - - + - +
Liś
ć 3RJL Pseudomonas sp. - 2,9±0,6 + - - + + - - - + + + + -
3RJLA Pseudomonas sp. - 2,1±0,5 - - - + + - - + - + + - +
5RJL Pseudomonas rhodesiae - 2,0±0,5 - + - + + - - - - + + + -
Udział
procentowy (%) 16,7 100 33,3 16,7 16,7 88,9 77,8 5,6 5,6 38,9 61,1 88,9 100 77,8 44,4
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 66
Przeprowadzone badania wykazały, że 58,3% izolatów komonicy tworzyło
przejaśnienia na pożywce Pikovskaya, co świadczy o zdolności tych bakterii
do rozpuszczania fosforanów i uwalniania fosforu z jego nierozpuszczalnej soli. Największe
strefy przejaśnień (>10 mm) obserwowano u szczepu Pseudomonas sp. 2FXS. Prawie 30%
endofitycznych szczepów wiesiołka wykazywało zdolność do rozpuszczania fosforanów,
ale ich aktywność była niska, a strefy przejaśnień mieściły się w granicach od 1,3±0,6
do 3,0±0,0 mm. Wśród endofitów jastrzębca zaobserwowano, że tylko trzy szczepy były
zdolne do solubilizacji fosforanów: Pseudomonas sp. 7RJS (3,7±0,5 mm), Pseudomonas sp.
7RJS1 (8,0±1,0 mm) i Pantoea agglomerans 7RJSS (9,3±1,3 mm).
Wszystkie badane szczepy były zdolne do uwalniania IAA podczas hodowli
na podłożu z dodatkiem tryptofanu. Koncentracja IAA w przeliczeniu na ml podłoża
po hodowli szczepów wahała się w granicach od 1,8±0,1 do 76,4±3,1 μg IAA ml-1 podłoża.
Najwyższe stężenie IAA obserwowano w pohodowlanym supernatancie szczepów
izolowanych z korzeni jastrzębca: Enterobacter ludwigii 2RJKA (76,4±3,1 μg IAA ml-1
podłoża), Enterobacter ludwigii 4FJK (68,8±6,2 μg IAA ml-1 podłoża) oraz szczepów
izolowanych z łodyg komonicy: Delftia lacustris 5FXS, Delftia lacustris 6.1XS i Rhizobium
sp. 1XS, które wytworzyły odpowiednio 62,6±5,2; 59,9±4,0 i 35,9±3,7 μg IAA ml-1 podłoża.
Szczepy wytwarzające HCN stanowiły 83,3%, 64,3% i 33,3% wszystkich bakterii
endofitycznych izolowanych odpowiednio z komonicy, wiesiołka i jastrzębca. Zdecydowana
większość z nich charakteryzowała się wydzielaniem dużych ilości HCN, na co wskazywało
ciemnobrązowe zabarwienie bibuły w przeprowadzonym teście.
Produkcję sideroforów zaobserwowano u połowy (50%) wyizolowanych szczepów
endofitycznych z komonicy. Wśród izolatów jastrzębca tylko 16,7% wykazywało zdolność
do syntezy sideroforów. Z kolei, wśród bakterii endofitycznych wiesiołka ten odsetek był
jeszcze niższy i wynosił 14,3% wszystkich izolatów. Kilkanaście szczepów, pomimo wielu
prób, nie było zdolnych do wzrostu na podłożu CAS.
4.6.2. Produkcja enzymów celulolitycznych
Zdolność do produkcji enzymów celulolitycznych to cecha często warunkująca
możliwość kolonizacji korzeni przez bakterie. Ocenę tej zdolności bakterii przeprowadzono
na podłożu z karboksymetylocelulozą. Odsetek potencjalnych producentów celulaz wśród
szczepów komonicy i wiesiołka wynosił odpowiednio 47,7% i 64,3% wszystkich izolatów
(Tabela 4). Średnice powstałych stref przejaśnień dla bakterii endofitycznych izolowanych
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 67
z tkanek komonicy były nawet 5 razy większe niż te powstałe podczas hodowli izolatów
wiesiołka. Tylko trzy szczepy bakterii endofitycznych jastrzębca były zdolne do wzrostu
i rozkładu karboksymetylocelulozy.
4.6.3. Zdolność do ruchu
Aktywny ruch bakterii endofitycznych jest jedną z cech ułatwiającą im efektywną
kolonizację swojego gospodarza. W testach płytkowych duża liczba szczepów wykazywała
zdolność do poruszania się. Wśród endofitów komonicy, wiesiołka i jastrzębca bakterie
te stanowiły odpowiednio 83,3%, 71,4% i 88,9% wszystkich izolatów.
4.6.4. Hamowanie wzrostu fitopatogennych grzybów
Bakterie endofityczne często posiadają zdolność do produkowania i wydzielania
związków, które hamują wzrost i rozwój fitopatogenów np. grzybów mikroskopowych. Jest
to jeden z pośrednich mechanizmów, związany z promowaniem wzrostu roślin.
W przeprowadzonych badaniach widoczne strefy zahamowania wzrostu grzybni
C. sphaerospermum KKP741, F. avenaceum KKP756 oraz F. graminearum KKP1771
potwierdzały właściwości przeciwgrzybowe wyizolowanych bakterii endofitycznych.
Wśród szczepów izolowanych z tkanek komonicy obserwowano zróżnicowaną
zdolność do hamowania wzrostu grzybni trzech badanych gatunków grzybów
mikroskopowych. Spośród badanych endofitów tylko 6 wyizolowanych z łodyg komonicy
(szczepy 1.1XS, 2.1XS, 5XS, 6.1XS, 2FXS, 5FXS) ograniczało wzrost grzybni
C. sphaerospermum KKP741. Aż 58,3% izolatów komonicy hamowało wzrost grzybni
F. avenaceum KKP756. Natomiast, tylko jeden szczep, Serratia plymuthica 2.1XS, ograniczał
wzrost grzybni F. graminearum KKP1771. Co więcej, ten szczep, jako jedyny wśród
wszystkich badanych bakterii endofitycznych, wykazywał właściwości przeciwgrzybowe
wobec trzech testowanych gatunków grzybów mikroskopowych.
Spośród izolatów wiesiołka 57,1% szczepów hamowało wzrost grzybni
F. avenaceum KKP756. Tylko jeden szczep, Xanthomonas sp. 3.1FWS, ograniczał wzrost
C. sphaerospermum KKP741.
Szczep Burkholderia ambifaria 1CJK, jako jedyny spośród endofitów
wyizolowanych z tkanek jastrzębca działał hamująco na wzrost grzybni C. sphaerospermum
KKP741 i F. avenaceum KKP756.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 68
4.6.5. Biosynteza biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów
Hydrofobowa natura węglowodorów ropopochodnych utrudnia ich biodegradację.
Dlatego oceniano zdolność szczepów do produkcji biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów
powodujących emulgację tych zanieczyszczeń, a tym samym zwiększenie ich biodostępności
dla mikroorganizmów i roślin.
Przyjmuje się, że jeżeli wartość indeksu emulsyfikacji (E24) jest wyższa niż 40%
to biosurfaktanty efektywnie emulgują związki ropopochodne. W przeprowadzonych
badaniach spośród wszystkich szczepów tylko 6: S. plymuthica 2.1XS, D. lacustris 6.1XS,
Rhodococcus sp. 4WK, R. erytropolis 6.1WK, R. nepotum 8WK i P. umsongensis 8.1WK,
spełniało to kryterium (Tabela 5).
Tabela 5. Indeksy emulsyfikacji wyznaczone dla biosurfaktantów/bioemulsyfikatorów
produkowanych przez bakterie endofityczne, dla których wartość E24 była
wyższa niż 40%.
Indeks emulsyfikacji (E24) [%]
M9+surowa ropa naftowa M9+n-heksadekan
Szczep D* H* X* D H X
Serratia plymuthica 2.1XS - - 41,7±0,8 - - -
Delftia lacustris 6.1XS - - 41,7±0,4 - - -
Rhodococcus sp. 4WK 52,8±0,5 52,8±1,4 58,3±0,6 47,2±0,4 47,2±0,4 52,8±0,9
Rhodococcus erythropolis
6.1WK - - - 50,0±0,5 - 50,0±0,5
Rhizobium nepotum 8WK - - 47,2±0,5 - - -
Pseudomonas
umsongensis 8.1WK - - 47,2±0,3 - - -
* D-olej diesla, H-n-heksadekan; X-p-ksylen; E24±odchylenie standardowe z trzech powtórzeń
Biosurfaktanty/bioemulsyfikatory produkowane przez szczep Rhodococcus sp. 4WK
wykazywały najwyższą zdolność do emulgowania oleju diesla, n-heksadekanu i p-ksylenu,
na co wskazuje wartość E24, która wynosiła 52,8% w przypadku pierwszych dwóch
związków i 58,3% dla p-ksylenu. Biosurfaktanty produkowane przez bakterie podczas ich
hodowli na podłożu M9 z surową ropą naftową powodowały głównie emulsyfikację p-
ksylenu. Natomiast biosurfaktanty syntetyzowane przez szczep 6.1WK, podczas jego wzrostu
na podłożu M9 z n-heksadekanem, prowadziły do emulsyfikacji oleju diesla oraz p-ksylenu,
ale nie n-heksadekanu.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 69
4.7. Bioróżnorodność zespołów bakterii endofitycznych
Bioróżnorodność zespołów bakterii endofitycznych komonicy zwyczajnej
oraz jastrzębca wysokiego analizowano przy pomocy metody pirosekwencjonowania 454.
W wyniku pirosekwencjonowania na aparacie 454 Genom Sequencer FLX Titanium
otrzymano łącznie 148 799 sekwencji, z których 138 684 (93%) posiadało odpowiednie MID
i zostało wykorzystane w analizie. Średnia długość uzyskanego odczytu wynosiła 340,95 pz.
Po przetworzeniu danych przez QIIME, zgodnie ze strategią ‘open reference’, usunięciu
sekwencji niskiej jakości, odcięciu adaptorów, MID oraz starterów uzyskano 87 331
sekwencji wysokiej jakości. Następnie, usunięto chimery oraz sekwencje odpowiadające
DNA chloroplastowemu, eukariotycznemu oraz Archaea. W ten sposób otrzymano 64 833
bakteryjnych sekwencji wysokiej jakości, które ostatecznie poddano dalszej analizie.
Krzywe rarefakcji dla badanych prób zostały wykreślone na podstawie liczby
otrzymanych OTU oraz różnorodności filogenetycznej (Rys. 14). Wynika z nich,
że najwyższą liczbę obserwowanych gatunków zanotowano dla korzeni jastrzębca,
najmniejszą dla korzeni komonicy, natomiast próby KŁ, KL i JL zawierały podobną liczbę
OTU.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Lic
zba
ob
serw
ow
anych
gat
unków
Liczba sekwencji
JKKŁKLJL
A)
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 70
Rys. 14. Krzywe rarefakcji wykreślone na podstawie (A) całkowitej liczby OTU oraz (B)
różnorodności filogenetycznej. Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ
(Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec
liść).
Liczba zidentyfikowanych OTU była najwyższa dla mikrobiomu JK i wynosiła
573,18±10,13. W pozostałych próbach, wartości te były zdecydowanie niższe i wynosiły
332,48±34,1; 255,8± 23,6; 237,0±68,72 i 62,8±3,4, odpowiednio dla mikrobiomu KŁ, KL, JL
i KK. Podobnie, skrajne wartości różnorodności filogenetycznej, stwierdzono dla JK oraz KK,
które wynosiły odpowiednio 42,78±0,28 oraz 6,8±1,77.
Rozproszenie wartości OTU i różnorodności filogenetycznej dla badanych prób
przedstawiono na wykresach pudełkowych (Rys. 15). Największe rozproszenie wartości OTU
uzyskano dla próby JL, a najmniejsze dla KK. Wyniki uzyskane dla różnorodności
filogenetycznej dla JL i JK przyjmują odpowiednio najbardziej i najmniej różniące się
wartości.
Indeks podobieństwa Gooda w badanych próbach był wyższy od 97%, co wskazuje
na bardzo wysoki poziom reprezentatywności badanych prób, odzwierciedlający znaczną
różnorodność gatunków bakterii obserwowaną w badanych próbach. Na podstawie
wyznaczonych indeksów bioróżnorodności (Tabela 6), mikrobiom korzeni jastrzębca
charakteryzuje się najwyższą, a mikrobiom korzeni komonicy najniższą bioróżnorodnością
bakterii endofitycznych. Najwyższą różnorodnością gatunkową charakteryzuje się mikrobiom
korzeni jastrzęba, najniższą mikrobiomy JL i KK, a średnią KŁ i KL.
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Różn
oro
dność
fil
ogen
etycz
na
Liczba sekwencji
JK
KŁKL
JL
B)
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 71
Rys. 15. Rozproszenie wartości uzyskanych dla (A) liczby obserwowanych gatunków oraz
(B) różnorodności filogenetycznej. Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ
(Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec
liść).
Tabela 6. Indeksy bioróżnorodności wyznaczone dla KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica
łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
Wartości indeksów bioróżnorodności
Próby Chao1 Indeks Gooda Indeks
Shannona
Wskaźnik
różnorodności
Simpsona
1/D
KK 16,5±1,7d 99,7±0,6a 0,3±0,0d 1,1±0,0c
KŁ 71,7±4,1b 98,7±0,2c 3,3±0,0b 4,8±0,1b
KL 37,2±10,9c 99,6±0,3ab 3,0±0,2b 4,4±0,9b
JK 123,5±6,7a 97,7±0,3d 5,0±0,1a 15,5±2,6a
JL 40,8±3,9c 99,1±0,1b 1,2±0,5c 1,5±0,4c
Wartości porównywano kolumnami, a te oznaczone różnymi literami wykazują istotne statystycznie
różnice (jednoczynnikowa ANOVA, test Tukeya, p<0,05).
Podczas przeprowadzonych analiz w sumie zidentyfikowano 129 różnych OTU,
wśród których 74 zaklasyfikowano do rodzaju, a 55 do rodziny lub klasy (Tabela 7, 8, 9).
Ze względu na różny procentowy udział jednostek taksonomicznych w badanych próbach,
wybrano 28 OTU odpowiadających rodzinie lub klasie, które stanowiły ≥1% przynajmniej
B) A)
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 72
w jednej badanej próbie (Tabela 7). Wśród mikrobiomu komonicy zwyczajnej
zidentyfikowano 11 (korzeń), 56 (łodyga), 35 (liść) różnych OTU. Natomiast u jastrzębca
wysokiego 106 (korzeń) oraz 38 (liść) różnych OTU.
Analiza otrzymanych sekwencji i ich klasyfikacja do odpowiednich jednostek
taksonomicznych pozwoliła na wyróżnienie 11 typów (Tabela 8). Największy udział
procentowy w badanych próbach miały Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,
Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Delta-, Gamma-), TM7 i Tenericutes (Rys. 16). Proteobacteria
stanowiły, w zależności od tkanki, 42,9-99,9% wszystkich OTU zindentyfikowanych
w mikrobiomie komonicy, natomiast dla jastrzębca udział tej klasy, w zalezności od tkanki,
mieścił się w granicach 11,9-39,6% wszystkich OTU. Kolejno, wyróżniono 10 rodzin, które
występowały we wszystkich badanych próbach, a ich udział stanowił >1% przynajmniej
w jednej z nich. Niezwykle wysoki udział rodzaju Mesorizobium (>98%) obserwowano wśród
mikrobiomu korzeni komonicy, natomiast ponad 80% OTU uzyskanych z liści jastrzębca nie
udało się zidentyfikować do właściwej jednostki taksonomicznej (Rys. 17).
Mikrobiomy badanych róślin różnią się dominującymi typami/klasami (Tabela 9).
W mikrobiomie korzeni komonicy, aż 98,8% otrzymanych sekwencji została zaklasyfikowana
do Alphaproteobacteria. W mikrobiomie łodyg komonicy wykazano przewagę sekwencji
reprezentujących Alphaproteobacteria (48,2%), natomiast w liściach komonicy dominowały
OTU należące do Firmicutes (44,4%). Analiza rang taksonomicznych wykazała, że wśród
bakterii tworzących mikrobiom korzeni jastrzębca najwyższy udział stanowiły szczepy
zaliczane do Actinobacteria, których odsetek wynosił 44% wszystkich OTU. W przypadku
liści tej rośliny tylko 7,8% OTU zostało przyporządkowane do Gammaproteobacteria,
aż 83,6% OTU charakterystycznych dla liści jastrzębca nie zostało rozpoznanych
i przypisanych do właściwej jednostki taksonomicznej.
Skład mikrobiomu badanych roślin różni się także na poziomie rodzaju. W tkankach
komonicy niezwykle wysoki odsetek OTU został przyporządkowany do rodzaju
Mesorhizobium, który stanowił odpowiednio w korzeniach 98,3%, a w łodygach tej rośliny
43,2% wszystkich oznaczonych OTU. Duży procentowy udział stanowiły także OTU
klasyfikowane do rodzajów Pseudomonas, których udział w łodygach i liściach wynosił
odpowiednio 20,5% oraz 21,4%. Ponadto, w liściach komonicy zidentyfikowano 37,4% OTU
należących do rodzaju Bacillus.
Inaczej przedstawiała się analiza składu mikrobiomu jastrzębca wysokiego.
W korzeniach OTU zaklasyfikowano do rodzaju Streptomyces, rzędu Micromonosporaceae,
rodzaju Pseudomonas, odpowiednio 23,8%, 12,6%, 7,4% zidentyfikowanych OTU.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 73
W liściach tej rośliny najwięcej OTU (83,6%) nie zostało przypisanych do żadnej jednostki
taksonomicznej. Są to sekwencje niemające odpowiednika w bazie danych, którym
nie przypisano żadnej rangi taksonomicznej. Pozostałe OTU przypisane do odpowiednich
rodzajów Pseudomonas, Acinetobacter, rodziny Micromonosporaceae, stanowiły
odpowiednio 4,3%, 2,8% i 2,2% wszystkich OTU.
Niektóre z jednostek taksonomicznych zostały zidentyfikowane tylko wśród
mikrobiomu jednej rośliny. Jedynie w łodygach komonicy zidentyfikowano rodzaj Buchnera.
Natomiast charakterystyczne tylko dla mikrobiomu korzeni jastrzębca wysokiego są rodzaje
Rhizobium, Burkholderia, Rhodanobacter, Asteroleplasma oraz klasa TM7-3. Oprócz tego 6
rodzajów to jest: Propionibacterium, Delftia, Bacillus, Staphylococcus, Methylobacterium,
Microbacterium występowało w 4 badanych próbach KL, KŁ, JK, JL. Natomiast
we wszystkich badanych próbach zidentyfikowano rodzaje: Mesorhizobium, Morganella,
Pseudomonas, Stenotrophomonas i rodzinę Oxalobacteraceae.
Tabela 7. Udział procentowy wybranych OTU, które stanowiły ≥1% wśród mikrobiomu
roślin komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca wysokiego. Kolorem czerwonym
zaznaczono OTU mające najwyższy procentowy udział wśród badanych prób.
Rodzaj podkreślony podwójną linią, występuje tylko u komonicy, rodzaj/rodzina
podkreślony pojedynczą linią, występuje tylko u jastrzębca.
Typ lub klasa
*-klasa
**-rząd
***-rodzina
Próby
KK KŁ KL JK JL
OTU %
Nieprzypisane - 0,00 0,00 0,10 1,45 83,6
Actinobacteria Microbacterium 0,00 7,15 9,65 2,73 2,18
Micromonosporaceae*** 0,00 0,03 0,00 12,60 0,00
Propionibacterium 0,00 0,85 1,68 0,20 0,45
Streptomyces 0,00 0,15 0,00 23,78 0,05
Bacteroidetes Chryseobacterium 0,00 0,08 0,00 4,73 0,00
Firmicutes Bacillus 0,00 0,13 37,38 0,90 0,98
Staphylococcus 0,00 0,35 5,50 0,10 0,10
Alphaproteobacteria Caulobacter 0,00 0,20 0,00 1,13 0,03
Rhizobiales** 0,00 0,03 1,88 0,03 0,00
Methylobacterium 0,00 1,90 4,35 0,20 0,78
Mesorhizobium 98,33 43,20 0,23 0,55 0,15
Agrobacterium 0,10 0,80 0,00 1,18 0,03
Rhizobium 0,00 0,00 0,00 1,43 0,00
Betaproteobacteria Burkholderia 0,00 0,00 0,00 3,95 0,05
Delftia 0,00 12,33 6,68 2,03 1,70
Leptothrix 0,00 0,10 0,00 1,08 0,00
Rubrivivax 0,00 0,65 0,00 2,80 0,05
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 74
Oxalobacteraceae*** 0,05 0,40 0,58 1,00 0,53
Janthinobacterium 0,03 0,10 0,00 2,38 0,08
Gammaproteobacteria Buchnera 0,00 1,68 0,00 0,00 0,00
Morganella 0,25 1,13 0,03 0,38 0,03
Acinetobacter 0,00 0,00 5,18 2,68 2,85
Pseudomonas 0,35 20,48 21,35 7,40 4,28
Rhodanobacter 0,00 0,00 0,00 4,35 0,00
Stenotrophomonas 0,38 1,30 0,85 0,58 0,58
TM7 TM7-3* 0,00 0,00 0,00 1,35 0,00
TM7 EW055** 0,00 0,15 0,00 1,63 0,00
Tenericutes Asteroleplasma 0,00 0,00 0,00 2,88 0,00
Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec
korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
Tabela 8. Udział procentowy wybranych OTU, które stanowiły <1% wśród mikrobiomu
roślin komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca wysokiego. Kolorem czerwonym
zaznaczono OTU mające najwyższy procentowy udział wśród badanych prób.
Rodzaj podkreślony podwójną linią, występuje tylko u komonicy, rodzaj
podkreślony pojedynczą linią, występuje tylko u jastrzębca.
Typ lub klasa *-klasa
**-rząd
***-rodzina
Próby
KK KŁ KL JK JL
OTU %
Acidobacteria Terriglobus 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Actinobacteria Acidimicrobiales** 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Actinomycetales** 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00
Lentzea 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Actinotalea 0,00 0,10 0,00 0,00 0,03
Corynebacterium 0,00 0,00 0,43 0,00 0,03
Frankia 0,00 0,00 0,00 0,40 0,00
Geodermatophilaceae*** 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00
Glycomyces 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00
Arsenicicoccus 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Janibacter 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
Kineosporiaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,85 0,00
Kineococcus 0,00 0,10 0,03 0,03 0,18
Microbacteriaceae*** 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00
Microbacteriaceae*** 0,00 0,13 0,00 0,45 0,08
Cryocola 0,00 0,00 0,00 0,08 0,00
Curtobacterium 0,00 0,00 0,05 0,08 0,05
Herbiconiux 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00
Salinibacterium 0,00 0,00 0,13 0,58 0,05
Micrococcaceae*** 0,00 0,20 0,00 0,00 0,15
Rothia 0,00 0,00 0,18 0,00 0,00
Micromonosporaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00
Couchioplanes 0,00 0,00 0,00 0,73 0,00
Mycobacterium 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 75
Nocardiaceae*** 0,00 0,03 0,05 0,03 0,03
Nocardioidaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,05 0,03
Aeromicrobium 0,00 0,00 0,00 0,45 0,00
Kribbella 0,00 0,03 0,00 0,15 0,00
Pseudonocardiaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00
Amycolatopsis 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00
Streptomycetaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,08 0,00
Gaiellales** 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Bacteroidetes Cytophagaceae*** 0,00 0,43 0,00 0,15 0,00
Hymenobacter 0,00 0,03 0,00 0,00 0,13
Flavobacteriaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00
Flavobacterium 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00
Sphingobacteriaceae*** 0,00 0,05 0,00 0,05 0,00
VC2_1_Bac22* 0,00 0,00 0,00 0,28 0,00
Chitinophagaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,70 0,00
Chitinophagaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Chitinophaga 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00
Niabella 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05
Chlamydiae Criblamydiaceae*** 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
Parachlamydiaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Protochlamydia 0,00 0,03 0,00 0,03 0,00
Chloroflexi Chloroflexi* 0,00 0,00 0,00 0,40 0,00
Dolo*** 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00
Firmicutes Bacilli* 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00
Bacillales** 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00
Thermicanus 0,00 0,08 0,00 0,00 0,05
Aerococcus 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00
Vagococcus 0,00 0,00 0,38 0,00 0,00
Lactococcus 0,00 0,00 0,08 0,03 0,00
Streptococcus 0,00 0,00 0,75 0,10 0,00
Anaerococcus 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00
Fusobacteria Fusobacteriaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Planctomycetes DH61** 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Proteobacteria - 0,00 0,15 0,00 0,03 0,00
Proteobacteria Alphaproteobacteria* 0,00 0,03 0,03 0,20 0,15
BD7-3** 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00
Aurantimonadaceae*** 0,00 0,25 0,00 0,03 0,00
Bradyrhizobium 0,00 0,23 0,00 0,60 0,03
Ochrobactrum 0,00 0,00 0,30 0,03 0,00
Hyphomicrobium 0,00 0,00 0,00 0,08 0,00
Rhodoplanes 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Methylobacteriaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,00 0,08
Phyllobacteriaceae*** 0,38 0,20 0,00 0,00 0,00
Rhizobiaceae*** 0,03 0,18 0,00 0,13 0,00
Rickettsia 0,00 0,05 0,00 0,03 0,00
Erythrobacteraceae*** 0,00 0,05 0,00 0,03 0,00
Sphingomonadaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00
Sphingomonas 0,00 0,98 0,00 0,43 0,43
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 76
Betaproteobacteria Burkholderiales** 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Alcaligenaceae*** 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00
Glomeribacter 0,00 0,00 0,00 0,33 0,00
Comamonadaceae*** 0,00 0,53 0,53 0,33 0,00
Methylibium 0,00 0,05 0,00 0,35 0,00
Schlegelella 0,00 0,05 0,13 0,08 0,03
Oxalobacteraceae*** 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00
Paucimonas 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Ralstonia 0,00 0,00 0,23 0,05 0,00
Ellin6067** 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00
Dechloromonas 0,00 0,30 0,00 0,05 0,13
SC-I-84** 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00
Deltaproteobacteria Bdellovibrio 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Myxococcales** 0,00 0,00 0,00 0,73 0,00
Cystobacterineae*** 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00
Haliangiaceae*** 0,00 0,38 0,00 0,03 0,00
Gammaproteobacteria Enterobacteriaceae*** 0,00 0,93 0,60 0,03 0,05
Pantoea 0,00 0,08 0,00 0,13 0,00
Serratia 0,00 0,00 0,00 0,08 0,00
Azomonas 0,00 0,00 0,03 0,08 0,00
Sinobacteraceae*** 0,00 0,00 0,00 0,45 0,00
Steroidobacter 0,03 0,18 0,00 0,75 0,00
Dokdonella 0,00 0,00 0,00 0,35 0,00
Fulvimonas 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Pseudoxanthomonas 0,05 0,18 0,05 0,38 0,03
Thermomonas 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
TM7 - 0,00 0,20 0,00 0,03 0,00
TM7 I025** 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00
Tenericutes Mollicutes* 0,00 0,00 0,00 0,68 0,00
Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec
korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 77
Tabela 9. Udział procentowy wszystkich typów/klas zidentyfikowanych dla badanych
zespołów bakterii endofitycznych roślin komonicy i jastrzębca. Kolorem
czerwonym zaznaczono OTU mające najwyższy procentowy udział wśród
badanych prób.
Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL (Komonica liść), JK (Jastrzębiec
korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
Typ/Klasa Próby
KK KŁ KL JK JL
OTU %
Nieprzypisane 0,00 0,00 0,10 1,45 83,60
Acidobacteria 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
Actinobacteria 0,00 8,93 12,45 44,03 3,20
Bacteroidetes 0,00 0,60 0,00 6,73 0,15
Chlamydiae 0,00 0,05 0,10 0,08 0,00
Chloroflexi 0,00 0,05 0,00 0,40 0,00
Firmicutes 0,00 0,58 44,43 1,10 1,13
Fusobacteria 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Planctomycetes 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
Proteobacteria 99,98 89,33 42,93 39,65 11,93
TM7 0,00 0,45 0,00 2,98 0,00
Tenericutes 0,00 0,00 0,00 3,53 0,00
Alphaproteobacteria 98,83 48,15 6,78 6,30 1,58
Betaproteobacteria 0,05 14,60 8,10 14,83 2,50
Deltaproteobacteria 0,00 0,40 0,00 0,95 0,00
Gammaproteobacteria 1,08 26,03 28,05 17,58 7,83
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 78
Rys. 16. Udział procentowy dominujących typów/klas zidentyfikowanych wśród mikrobiomu
komonicy zwyczajnej i jastrzębca wysokiego. Typ Proteobacteria został
przedstawiony jako klasy Alpha-, Beta-, Gamma- oraz Deltaproteobacteria.
Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL (Komonica liść),
JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Alphaproteobacteria Nieprzypisane Gammaproteobacteria Actinobacteria
Firmicutes Betaproteobacteria Bacteroidetes Tenericutes
TM7 Deltaproteobacteria
KK KŁ KL JK JL
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 79
Rys. 17. Udział procentowy dominujących rodzin zidentyfikowanych wśród mikrobiomu
komonicy zwyczajnej i jastrzębca wysokiego. Wykresy kołowe dotyczą struktury
mikrobiomu dla prób KK oraz JK i przedstawiają dominujące OTU przypisane do
rodzaju. Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL
(Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec liść).
98%
2%
Mesorhizobium Pozostałe
84%
16%
Nieprzypisane Pozostałe
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Phyllobacteriaceae Nieprzypisane Pseudomonadaceae Bacillaceae
Comamonadaceae Microbacteriaceae Xanthomonadaceae Methylobacteriaceae
Staphylococcaceae Enterobacteriaceae Propionibacteriaceae
KK KŁ KL JK JL
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 80
W celu okreslenia stopnia podobieństwa badanych prób przeprowadzono analizę
głównych współrzędnych PCoA zgodnie z metrykami Unweighted (analiza jakościowa)
oraz Weighted (analiza ilościowa) UniFrac. Metoda PCoA (Unweighted UniFrac) została
wykorzystana do wyznaczenia wzorców zmienności oraz różnic między badanymi próbami
wynikającymi z obecności lub braku danej grupy taksonomicznej (Rys. 18).
Rys. 18. PCoA (Unweighted UniFrac) dla mikrobiomu komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca
wysokiego. Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL
(Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec liść). Analizę wykonano w
oparciu o n=4 (niewidoczność niektórych znaczników spowodowana jest ich
zachodzeniem na siebie).
Wykonana analiza PCoA wyjaśnia 69,47% występującej zmienności między
zespołami bakterii endofitycznych komonicy zwyczajnej i jastrzębca wysokiego ocenionej
pod względem grup taksonomicznych reprezentowanych przez OTU. Pierwsza główna
składowa (czynnik PC1) wyjaśnia 37,58% zmienności i różnicuje profile według
różnorodności zidentyfikowanych OTU. Metoda PCoA wskazała na podobieństwo zespołów
bakterii endofitycznych liści komonicy (KL) i jastrzębca (JL) (Rys. 18). Uzyskane grupy
taksonomiczne tworzyły jeden klaster, który różnicował się od pozostałych zarówno
względem czynnika PC1, jak i PC2. Najbardziej różnią się od siebie, pod względem
bioróżnorodności grup taksonomicznych, zespoły bakterii endofitycznych występujące
w korzeniach komonicy (KK) oraz jastrzębca (JK). Profile te są zróżnicowane względem
KL
JL
JK
KŁ
KK
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 81
czynnika PC1. Wartości czynnika PC1 dla mikrobiomu korzeni jastrzębca przyjmują wartości
ujemne, a dla mikrobiomu korzeni komonicy wartości dodatnie.
Metoda PCoA (Weighted UniFrac) uwzględnia różnice w liczebności każdej grupy
taksonomicznej w badanych próbach (analiza ilościowa) (Rys. 19). PCoA (Weighted
UniFrac) wykazała różnice między liczebnością grup taksonomicznych występujących wśród
mikrobiomu komonicy zwyczajnej i jastrzębca wysokiego. Analiza PCoA wyjaśnia 86,05%
zmienności obserwanej między profilami badanych prób. Pierwsza główna składowa-czynnik
PC1 wyjaśnia 56,75% zmienności i różnicuje próby ze względu na liczbę OTU
zidentyfikowanych dla danej próby. Najbardziej różnią się od siebie zespoły bakterii
endofitycznych występujące w korzeniach komonicy (KK) oraz jastrzębca (JK). Profile
te zróżnicowane są względem czynnika PC1. Wartości czynnika PC1 dla prób JK przyjmują
wartości ujemne, a dodatnie dla próby KK. Z kolei PC2 różnicuje otrzymane profile
ze względu na części rośliny, z których je uzyskano. Próby grupują się w klastry ze względu
na rodzaj tkanki z której izolowano endofity (Rys. 19).
Rys. 19. PCoA (Weighted UniFrac) dla mikrobiomu komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca
wysokiego. Oznaczenia: KK (Komonica korzeń), KŁ (Komonica łodyga), KL
(Komonica liść), JK (Jastrzębiec korzeń), JL (Jastrzębiec liść). Analizę wykonano
w oparciu o n=4 (niewidoczność niektórych znaczników spowodowana jest ich
zachodzeniem na siebie).
JK KK
KŁ
KL
JL
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 82
4.8. Doświadczenie fitoremediacyjne
4.8.1. Oznaczenie zawartości TPH w glebie
Początkowe stężenie TPH w glebie wykorzystanej w doświadczeniu doniczkowym
było wysokie i wynosiło 12853,34±322,62 mg kg-1 s.m. gleby. Analiza stężeń TPH w glebie
po 75 dniach doświadczenia wykazała, że inokulacja gleby i nasion wybranymi szczepami
bakterii endofitycznych zwiększa efektywność fitoremediacji. Jakkolwiek, obserwowany
wynik w sposób istotny zależał od sposobu wprowadzenia szczepów, to jest od metody
ich inokulacji: inokulacji gleby (SI) lub pre-inokulacji nasion z inokulacją gleby (PI).
W układach, w których zastosowano metodę PI, obserwowano istotne statystycznie obniżenie
stężenia TPH w glebie dla wszystkich badanych układów (PI+5WK; PI+10WK;
PI+5WK+10WK) (Tabela 10). Najwyższy spadek stężenia TPH w glebie, o 19,1%
w porównaniu do początkowej zawartości oleju mineralnego w glebie, zaobserwowano
w przypadku zastosowania pre-inokulacji nasion z inokulacją gleby (PI), przez konsorcjum
szczepów (PI+5WK+10WK) (Tabela 10).
W układzie doświadczalnym, w którym zastosowano tylko inokulację gleby przez
konsorcjum szczepów (SI+5WK+10WK), zanotowano nieistotny statystycznie spadek
stężenia TPH o 2,1%. Podobnie, ubytek TPH w glebie, do której nie wprowadzano inokulum
bakteryjnego, w układach (S) i (R), wynosił odpowiednio 1,7% oraz 4,7% i był nieistotny
statystycznie w odniesieniu do początkowej zawartości oleju mineralnego. Obecność roślin
nie wpływała istotnie na obniżenie stężenia węglowodorów w glebie.
W celu określenia wpływu metody inokulacji (SI, PI) i szczepu/konsorcjum bakterii
(5WK, 10WK, 5WK+10WK), na ubytek TPH, wykonano dwuczynnikową analizę wariancji.
Analiza ta wykazała, że zastosowana metoda inokulacji bakterii miała istotny statystycznie
wpływ na obserwowany spadek stężenia TPH w glebie (p<0,001). Metoda introdukcji
szczepów (inokulacja gleby (SI) lub pre-inokulacja nasion z inokulacją gleby (PI)) wyjaśnia
72,5% obserwowanych zmian zawartości TPH w glebie w badanych układach
doświadczalnych. Także wariant zastosowanego szczepu/konsorcjum bakterii jest istotnym
czynnikiem (p<0,001), który wyjaśnia 16% obserwowanych różnic w koncentracji TPH
w glebie. Natomiast, interakcje występujące między metodą, a zastosowanym
szczepem/konsorcjum, wyjaśniają tylko 7,3% obserwowanych różnic w procentowym ubytku
TPH w glebie (p=0,002).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 83
Tabela 10. Ubytek zawartości (%) TPH w glebie po przeprowadzonej fitoremediacji (75 dzień
doświadczenia).
Zawartość TPH w badanej glebie
Układy doświadczalne Ubytek TPH (%)
SI +5WK 0
SI +10WK 0
SI +5WK+10WK 2,1±1,8
PI+5WK 8,9±2,6*
PI+10WK 9,7±1,3*
PI+5WK+10WK 19,1±2,5*
S 1,7±0,5
R 4,7±1,4
Średnia procentowa wartość ubytku TPH±odchylenie standardowe z trzech powtórzeń
[*] istotny statystycznie ubytek w odniesieniu do początkowej koncentracji TPH w badanej glebie
(jednoczynnikowa ANOVA; test Tukeya p<0,05).
4.8.2. Ocena przeżywalności wprowadzonych bakterii endofitycznych
W celu oceny zdolności badanych szczepów do przeżywania w glebie i życicy
trwałej, przeprowadzono izolację inokulantów z gleby i tkanek roślin (korzeni i części
nadziemnych) na podłożu LB z dodatkiem rifampicyny.
Oba szczepy bakterii endofitycznych, Rhodococcus erythropolis 5WKrf
oraz Rhizobium sp. 10WKrf, były zdolne do przeżywania w glebie i tkankach życicy. Podczas
inokulacji gleby szczepem 5WKrif (SI+5WK) jego liczebność w korzeniach życicy była o rząd
wielkości wyższa niż w częściach nadziemnych (Tabela 11). Natomiast, w glebie nie wykryto
komórek szczepu 5WKrif. W przypadku szczepu 10WKrif (SI+10WK), wysoką liczbę
komórek tej bakterii stwierdzono w glebie, przy jednoczesnym braku komórek tego szczepu
w tkankach życicy. Po wprowadzeniu konsorcjum szczepów (SI+5WK+10WK) liczebność
obu szczepów endofitycznych była o dwa rzędy wielkości wyższa w korzeniach niż w glebie
(Tabela 11).
Przy pre-inokulacji nasion z inokulacją gleby szczepem 5WKrif (PI+5WK) jego
komórki wyizolowano jedynie z korzeni życicy trwałej. Natomiast, liczebność bakterii
10WKrif (PI+10WK) w korzeniach i częściach nadziemnych życicy była porównywalna
i wynosiła około 6,04×104 j.t.k. g-1 ś.m. tkanki życicy. Niemniej jednak, liczba komórek tego
szczepu w korzeniach była istotnie statystycznie (p<0,05) niższa niż endofitów 5WKrif.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 84
Po wprowadzeniu konsorcjum szczepów (PI+5WK+10WK), komórki obu bakterii opornych
na rifampicynę wyizolowano z gleby i korzeni, przy czym w korzeniach ich liczebność była
istotnie statystycznie (p<0,05) niższa niż w glebie (Tabela 11).
Przy bezpośrednim wprowadzeniu szczepu 5WKrif do gleby (SI+5WK) jego
obecność stwierdzono w korzeniach i częściach nadziemnych, ale nie w glebie. Obecność
szczepu 10WKrif zaobserwowano jedynie w glebie (SI+10WK). Natomiast, podczas
zastosowania pre-inokulacji (PI+5WK), obecność 5WKrif stwierdzono tylko wewnątrz
korzeni. Szczep 10WKrif wykazywał zdolność do kolonizacji korzeni i części nadziemnych
życicy (PI+10WK). Po wprowadzeniu szczepów w postaci konsorcjum (SI+5WK+10WK;
PI+5WK+10WK), ich komórki wykryto w glebie i korzeniach życicy.
W celu określenia różnic między liczebnością szczepów w glebie, korzeniach
i częściach nadziemnych życicy trwałej przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji
(Tabela 11). Analiza post-hoc (test Tukeya, p<0,05) wykazała, że w przypadku porównania
liczebności bakterii w glebie, uzyskane wartości istotnie różnią się od siebie. W przypadku
korzeni, liczebność komórek bakterii wprowadzonych w postaci konsorcjum
(SI+5WK+10WK; PI+5WK+10WK) istotnie statystycznie różniła się od siebie. Analiza post-
hoc (test Tukeya, p<0,05) nie wykazała istotnych statystycznie różnic w liczebności komórek
bakterii w częściach nadziemnych.
Tabela 11. Liczebność bakterii endofitycznych w glebie oraz tkankach życicy trwałej w 75
dniu doświadczenia.
Liczebność bakterii endofitycznych
Układy
doświadczalne
Gleba (log j.t.k. g-1
s.m. gleby)
Korzeń (log j.t.k. g-1
ś.m. korzeni)
Części nadziemne (log j.t.k.
g-1 ś.m. części nadziemnych)
SI+5WK 0 5,84±0,08bc 4,84±0,18cde
SI+10WK 8,34±0,12a 0 0
SI+5WK+10WK 4,56±0,28e 6,55±0,07b 0
PI+5WK 0 5,94±0,52b 0
PI+10WK 0 4,72±0,12de 4,8±0,17de
PI+5WK+10WK 5,7±0,05bcd 4,48±0,21e 0
Liczebność bakterii endofitycznych±odchylenie standardowe z trzech powtórzeń; Wartości oznaczone
różnymi literami wykazują istotne statystycznie różnice (jednoczynnikowa ANOVA, test Tukeya,
p<0,05).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 85
4.8.3. Wpływ introdukowanych szczepów bakterii na biomasę roślin
Metoda inokulacji szczepów, to jest inokulacja gleby (SI) lub pre-inokulacja nasion
z inokulacją gleby (PI), w znaczący sposób wpływała na uzyskaną biomasę roślin podczas
fitoremediacji (trójczynnikowa ANOVA, p<0,001). Podczas inokulacji gleby (SI)
zaobserwowano przyrost biomasy życicy jedynie w przypadku wprowadzenia szczepu 5WK,
gdzie współczynnik wzrostu wyniósł 13,3% (SI+5WK). Przy zastosowaniu metody pre-
inokulacji nasion z inokulacją gleby (PI) obserwowano przyrost biomasy roślin dla układów
doświadczalnych, w których przeprowadzono inokulację pojedynczymi szczepami 5WK
(PI+5WK), 10WK (PI+10WK) (Rys. 20). Współczynnik wzrostu roślin obliczony dla tych
układów wynosił odpowiednio 106,1% (PI+5WK) oraz 28% (PI+10WK).
W celu określenia wpływu czasu, metody inokulacji bakterii (SI, PI)
i szczepu/konsorcjum bakterii (5WK, 10WK, 5WK+10WK), na przyrost biomasy życicy
trwałej, wykonano trójczynnikową analizę wariancji. Analiza ta wykazała, że zastosowana
metoda inokulacji bakterii endofitycznych (inokulacja gleby (SI) lub pre-inokulacja nasion
z inokulacją gleby (PI)) miała istotny statystycznie wpływ na obserwowany wzrost biomasy
życicy w badanych układach doświadczalnych (p<0,001). Metoda introdukcji szczepów
wyjaśnia 64% obserwowanych zmian. Również, wariant zastosowanego szczepu/konsorcjum
bakterii jest istotnym czynnikiem (p<0,001), który wyjaśnia 10,6% obserwowanych różnic
w biomasie roślin.
Rys. 20. Biomasa życicy trwałej inokulowanej bakteriami endofitycznymi w 14 i 75 dniu
fitoremediacji. Różnymi literami oznaczono istotne statystycznie różnice biomasy
roślin (jednoczynnikowa ANOVA, test Tukeya, p<0,05).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
SI+5WK SI+10WK SI+5WK+10WK PI+5WK PI+10WK PI+5WK+10WK
Bio
mas
a [g
]
14 dzień
75 dzieńa a ab ab
cd
e
cde cd
bc
de de
ab
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 86
4.8.4. Określenie wpływu wprowadzonych szczepów na ogólną liczebność i liczebność
bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych w glebie
W celu określenia wpływu introdukowanych szczepów endofitycznych na ogólną
liczebność autochtonicznych bakterii i liczebność bakterii rozkładających alkany w glebie
w 14, 31 i 75 dniu eksperymentu, zastosowano metodę real-time PCR, przy pomocy której
przeprowadzono amplifikację fragmentów genów 16S rRNA i alkH.
Na podstawie zmian liczby kopii genu 16S rRNA w glebie poddanej fitoremediacji
określano wpływ introdukowanych szczepów na zespół mikroorganizmów autochtonicznych
obecnych w glebie. W celu określenia różnic w liczbie kopii genu 16S rRNA w glebie między
badanymi układami w danym dniu przeprowadzenia odczytu wykonano jednoczynnikową
analizę wariancji oraz test Tukeya, p<0,05. Wyniki analizy post-hoc przedstawiono na Rys.
21. Analiza ta wykazała, że w 14, 31 i 75 dniu doświadczenia nie występują istotne
statystycznie różnice w średniej liczbie kopii genu 16S rRNA w glebach nieinokulowanych
bakteriami (R oraz S). Wynika z tego, że zarówno obecność rośliny (R), jak i zachodzenie
procesu naturalnej attenuacji (S), nie wpływało na zmianę liczby kopii genu 16S rRNA
w żadnym z punktów pomiarowych. Ponadto w każdym dniu przeprowadzenia odczytu
wykazano istotne statystycznie różnice w liczbie kopii genu 16S rRNA między glebą,
w której rosły rośliny nieiokulowane bakteriami (R), a glebą w której rosły rośliny
i wprowadzono konsorcjum szczepów (SI+5WK+10WK; PI+5WK+10WK) (Rys.21).
Przeprowadzona na podstawie liczby kopii genu 16S rRNA w badanej glebie
trójczynnikowa ANOVA (czas, metoda inokulacji (SI, PI), szczep/konsorcjum bakterii jako
czynniki) nie wykazała istotnej interakcji między tymi trzema czynnikami (p=0,326). Za 30%,
26,9%, 2,7% obserwowanych różnic w liczbie kopii genu 16S rRNA odpowiadają
odpowiednio czas (p<0,001), szczep/konsorcjum bakterii (p<0,001) oraz metoda inokulacji
szczepów (p<0,05). Analiza ta wykazała także istnienie interakcji między czasem a metodą
wprowadzania szczepów do gleby (p<0,001) oraz metodą introdukcji bakterii
a szczepem/konsorcjum bakterii (p=0,037), które wyjaśniają odpowiednio 14% oraz 3,8%
występujących zmienności w liczbie kopii genu 16S rRNA w glebie w badanych układach
doświadczalnych.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 87
Rys. 21. Liczba kopii genu 16S rRNA w glebie w 14, 31 i 75 dniu doświadczenia. Wartości
oznaczone różnymi literami są istotnie statystycznie różne względem badanych
układów w danym dniu przeprowadzenia odczytu (jednoczynnikowa ANOVA dla
poszczególnych dni, test Tukeya, p<0,05).
Na podstawie zmian liczby kopii genu alkH w glebie poddanej fitoremediacji
określano wpływ introdukowanych szczepów na liczebność mikroorganizmów
autochtonicznych zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych. W celu określenia
różnic w liczbie kopii genu alkH w glebie, między badanymi układami, w danym dniu
doświadczenia, wykonano jednoczynnikową analizę wariancji oraz test Tukeya (p<0,05).
Wyniki analizy post-hoc przedstawiono na Rys. 22. Analiza ta wykazała, że w 14 i 75 dniu
doświadczenia nie występują istotne statystycznie różnice w średniej liczbie kopii genu alkH
między glebą, w której rosły rośliny (R) oraz glebą bez posianych roślin (S) (Rys.22).
Natomiast w 75 dniu doświadczenia fitoremediacyjnego nie zaobserwowano istotnych różnic
w liczbie kopii genu alkH w glebie pomiędzy układami doświadczalnymi.
W celu określenia wpływu czasu, metody inokulacji bakterii i szczepu/konsorcjum
bakterii na zmiany liczby kopii genu alkH w badanej glebie, przeprowadzono trójczynnikową
analizę wariancji. Nie wykazano istotnej interakcji tych trzech czynników (p=0,069).
Największy wpływ na zmiany liczby kopii genu alkH miał czas (p<0,001), który wyjaśniał
48,4% obserwowanej zmienności, następnie zastosowany szczep/konsorcjum bakterii
8,8
9
9,2
9,4
9,6
9,8
10
14 dzień 31 dzień 75 dzień
SI+5WK SI+10WK SI+5WK+10WK PI+5WK PI+10WK PI+5WK+10WK S R
log
lic
zba
ko
pii
gen
u 1
6S
rR
NA
g-1
s.m
. g
leb
y
a
ab
a
bc ab
a
bc
a
ab ab
b
c
bc
cd
d d
a
abc ab
bc
bc c
bc
c
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wyniki 88
(p<0,001) wyjaśniający 11,9% występujących różnic w liczbie kopii genu alkH. Analiza
ta wykazała także istnienie interakcji między czasem, a szczepem/konsorcjum bakterii
(p<0,001), która wyjaśnia 27,5% występujących zmienności w liczbie kopii genu alkH
w glebie w badanych układach doświadczenia.
Rys. 22. Liczba kopii genu alkH w glebie w 14, 31 i 75 dniu doświadczenia. Wartości
oznaczone różnymi literami są istotnie statystycznie różne względem badanych
układów w danym dniu przeprowadzenia odczytu (jednoczynnikowa ANOVA dla
poszczególnych dni, test Tukeya, p<0,05).
7,2
7,4
7,6
7,8
8
8,2
8,4
8,6
8,8
9
9,2
14 dzień 31 dzień 75 dzień
SI+5WK SI+10WK SI+5WK+10WK PI+5WK PI+10WK PI+5WK+10WK S R
log
lic
zba
ko
pii
gen
u
alk
H g
-1 s
.m.
gle
by
a
ab ab abc abc
abc
c
bc
bc ab
a
a a
a a
a b
c abc
c
abc
abc bc bc
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 89
V. Dyskusja
5.1. Bioróżnorodność zespołów bakterii endofitycznych frakcji hodowalnej i
niehodowalnej roślin narażonych na wysokie stężenie związków ropopochodnych
w glebie
Bakterie endofityczne występują wewnątrz komórek roślinnych
i/lub w przestrzeniach międzykomórkowych każdej z blisko 300 000 obecnie znanych roślin
(Ryan i wsp., 2008). Dotychczasowe badania wskazują na wręcz konieczną ich obecność
(endofity obligatoryjne) oraz ważną rolę tych mikroorganizmów dla życia swoich gospodarzy
(Compant i wsp., 2005, 2010; Santoyo i wsp., 2016). Wzajemne zależności i interakcje
między bakteriami endofitycznymi i roślinami naturalnie występującymi na obszarach
skażonych związkami ropopochodnymi nie zostały dokładnie opisane, a wiedza na ten temat
jest fragmentaryczna. Zatem, celem przeprowadzonych badań było poznanie różnorodności
zespołów bakterii endofitycznych związanych z roślinami spontanicznie kolonizującymi
tereny przez wiele lat skażone związkami ropopochodnymi. W ramach przeprowadzonych
badań identyfikowano bakterie frakcji hodowalnej i niehodowalnej, a także określono
wybrane właściwości biochemiczne mikroorganizmów występujących w tkankach komonicy
zwyczajnej (L. corniculatus), wiesiołka dwuletniego (O. biennis) i jastrzębca wysokiego
(H. piloselloides).
Analiza wyników pirosekwencjonowania genu 16S rRNA uzyskanych w niniejszej
pracy wykazała, że wśród zespołów bakterii endofitycznych badanych roślin (komonicy i
jastrzębca), zdecydowanie przeważają przedstawiciele Proteobacteria. Typ ten stanowił
77,4% oraz 25,8% badanej populacji bakterii, odpowiednio u komonicy oraz jastrzębca.
Natomiast, kolejnymi typami bakterii, mającymi znaczny udział w mikrobiomie badanych
gatunków roślin są Firmicutes u komonicy (14,9%), a Actinobacteria u jastrzębca (23,6%).
Wysoki udział endofitów zaliczanych do Proteobacteria, Actinobacteria i Firmicutes u
różnych gatunków roślin (Dactylis glomerata, Festuca rubra, Lolium perenne, Populus
tremula×Populus alba, Arabidopsis thaliana, Hieracium aurantiacum) potwierdzają wyniki
innych badań metagenomicznych (Gottel i wsp., 2011; Bodenhausen i wsp., 2013; Aleklet i
wsp., 2015; Beckers i wsp., 2017; Wemheuer i wsp., 2017). To, że u różnych gatunków
roślin, najwyższy odsetek bakterii endofitycznych zaliczany jest do tych samych rang
taksonomicznych może świadczyć o tym, że pewne szczepy bakterii posiadają tzw.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 90
kompetencje endofityczne związane z kolonizacją gospodarza, pokonaniem bariery korzeni
czy możliwością przeżycia w zajmowanych tkankach.
Badania dotyczące mikrobiomu roślin występujących na terenach skażonych
związakami ropopochodnymi pokazują, że wraz ze wzrostem poziomu zanieczyszczenia
dominacja poszczególnych rang taksonomicznych zmieniała się na korzyść Proteobacteria,
szczególnie Alpha- i Gammaproteobacteria oraz Actinobacteria. W przeprowadzonych
badaniach, w korzeniach jak i częściach nadziemnych komonicy oraz jastrzębca,
zidentyfikowano OTU należące głównie do dwóch klas: Alpha- oraz Gammaproteobacteria.
Może to wskazywać na istotną rolę tych endofitów w rozwoju roślin występujących
na zanieczyszczonych obszarach. Tym bardziej, że bakterie endofityczne obu tych klas
dominują wśród endofitów obecnych w momencie zawiązywania nasion u roślin Crotalaria
pumila i A. thaliana (Truyens i wsp., 2015, 2016; Sanchez-Lopez i wsp., 2017).
Analiza frakcji hodowalnej endofitów zdolnych do rozkładu surowej ropy naftowej,
izolowanych z komonicy, wiesiołka i jastrzębca również wskazała na dominację szczepów
bakterii zaliczanych do Gammaproteobacteria oraz Actinobacteria. Z tkanek komonicy
i wiesiołka wyizolowano endofity należące do Alphaproteobacteria, natomiast szczepy
reprezentujące Betaproteobacteria odnaleziono u komonicy i jastrzębca. Jednak zdecydowana
większość izolatów została zaklasyfikowana do Gammaproteobacteria, a wśród bakterii
endofitycznych jastrzębca stanowiły one, aż 78% wszystkich wyizolowanych szczepów.
Wyniki badań Peng i wsp. (2013) także wskazują na znaczny udział Proteobacteria wśród
bakterii endofitycznych wyizolowanych z tkanek wyczyńca czerwonożółtego (Alopecurus
aequalis) i szczawika rożkowatego (Oxalis corniculata), rosnących w glebie
zanieczyszczonej substancjami ropopochodnymi, zwłaszcza WWA. Podobnie, wśród bakterii
endofitycznych życicy trwałej, występującej na terenach zanieczyszczonych związkami
ropopochodnymi, dominują izolaty należące do Proteobacteria oraz Actinobacteria (Kukla
i wsp., 2014a,b). Przewaga tych samych jednostek taksonomicznych, zidentyfikowana
poprzez pirosekwencjonowanie, jak i stosowanie metod hodowalnych, jasno wskazuje
na istotną rolę tych bakterii endofitycznych. Może to oznaczać, że szczepy należące
do wymienionych klas i rodzajów tworzą tzw. rdzeń zespołu bakterii endofitycznych,
szczególnie tych roślin, które rosną na terenach zanieczyszczonych związkami
ropopochodnymi.
Wielowymiarowe analizy statystyczne wskazują na istotność poziomu
zanieczyszczenia, jako jednego z czynników wpływających na strukturę zespołów bakterii
endofitycznych roślin rosnących w skażonych glebach (Tardif i wsp., 2016; Blain i wsp.,
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 91
2017). Peng i wsp. (2013) wykazali, że wraz ze wzrostem stężenia związków
ropopochodnych statystycznie istotnie spadała ogólna liczebność bakterii endofitycznych.
Wykazano również, że obecność węglowodorów w bezpośrednim otoczeniu roślin, wpływa
na zwiększenie liczebności endofitów zdolnych do rozkładu tych związków
oraz posiadających potencjalne mechanizmy promujące wzrost roślin (Siciliano i wsp., 2001;
Tardif i wsp., 2016). W tkankach spartiny (Spartina alternifora), występującej na obszarach
zanieczyszczonych WWA, wykryto obecność bakterii degradujących węglowodory,
należących do rodzajów Pseudomonas, Penibacillus i Flavobacterium (Su i wsp., 2016).
Natomiast, wśród zespołów bakterii endofitycznych wierzby, rosnącej w glebie skażonej
związkami ropopochodnymi, zanotowano wzrost udziału OTU, zaklasyfikowanych
do rodzajów: Pseudomonas, Steroidobacter, Sinorhizobium, Sphingobium i Rhizobium (Tardif
i wsp., 2016). Z kolei, w niniejszej pracy, w mikrobiomie komonicy i jastrzębca, najwięcej
zidentyfikowanych OTU przyporządkowano do rodzajów: Mezorhizobium, Pseudomonas,
Bacillus Streptomyces, Delftia i Microbacterium. Co ważne, przedstawicieli Mesorhizobium
sp., Pseudomonas sp., Morganella sp. i Stenotrophomonas sp. odnaleziono zarówno
w korzeniach jak i częściach nadziemnych komonicy i jastrzębca. Z jednej strony, może
to wskazywać na systemiczną kolonizację rośliny przez endofity, które dostają się do rośliny
głównie z ryzosfery, kolonizują początkowo korzenie, a później kolejne organy roślinne.
Podobne wyniki uzyskali Wagner i wsp. (2016), którzy wykazali, że większość
zidentyfikowanych OTU w liściach pokrywa się z OTU występującymi w korzeniach.
Z drugiej strony, wiele bakterii wyżej wymienionych rodzajów, to ważne mikroorganizmy
degradujące różne zanieczyszczenia, w tym węglowodory, wywierające korzystny wpływ
na wzrost i rozwój roślin, szczególnie ważny w środowisku zdegradowanym (Porteous-Moore
i wsp., 2006; Kukla i wsp., 2014; Zampolli i wsp., 2014; Pawlik i Piotrowska-Seget, 2015).
Na przykład bakterie z rodzaju Streptomyces wytwarzają siderofory, umożliwiając pobieranie
żelaza roślinom, a także produkują związki ograniczające wzrost fitopatogenów (Verma
i wsp., 2011). Na uwagę zasługują także bakterie z rodzaju Bacillus. Szczepy te oprócz
hamowania wzrostu Fusarium sp., solubilizacji fosforanów, często posiadają zdolność do
wytwarzania biosurfaktantów i degradowania ropy naftowej (Khan i wsp., 2013; Souza
i wsp., 2015). Przykładowo, dzięki introdukcji B. subtilis A1 do zanieczyszczonej gleby,
stężenie węglowodorów zawierających od dziesieciu do dwudziestu dziewięciu atomów
węgla w cząsteczce (C10-C29), w ciągu 7 dni obniżyło się o 87% (Parthipan i wsp., 2017). Z
kolei, bakterie Mesorhizobium sp. posiadają liczne mechanizmy promujące wzrost roślin takie
jak: wiązanie azotu atmosferycznego czy synteza deaminazy ACC (Laranjo i wsp., 2014).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 92
Przedstawiciele rodzaju Pseudomonas są bardzo często izolowane z organów różnych roślin.
Zostały one wyizolowane między innymi z tkanek życicy trwałej, wyczyńca
czerwonożółtego, szczawika rożkowatego, topoli oraz bluszczu (Porteous-Moore i wsp.,
2006; Peng i wsp., 2013; Kukla i wsp., 2014b; Tran i wsp., 2015). Występowanie bakterii
z rodzaju Pseudomonas wśród endofitów, niewątpliwie związane jest ze specyficznymi
i unikalnymi cechami tych mikroorganizmów. Przykładowo, szczepy Pseudomonas sp.
zasiedlające tkanki bluszczu (Toxicodendron radicans), degradują toksyczny dla bakterii
i wierząt olejek „urushiol” wytwarzanany przez tę roślinę. Zdolność ta pozwala
więc bakteriom na kolonizację tkanek tej trującej rośliny (Tran i wsp., 2015). Obok zdolności
do promowania wzrostu roślin, wiele bakterii z rodzaju Pseudomonas posiada enzymy
zaangażowane w rozkład alifatycznych i aromatycznych węglowodorów (Weyens i wsp.,
2009c,d; Khan i wsp., 2013; Pawlik i wsp., 2015, 2017). Z tego względu, szczepy
te stosowane są jako bioszczepionki, które w fitoremediacji wspomaganej, zwiększają
efektywność rozkładu zanieczyszczeń ropopochodnych (Preston, 2004; Compant i wsp.,
2005; Khan i wsp., 2013; Sessitsch i wsp., 2013; Sun i wsp., 2014).
Peng i wsp. (2013) wykazali, że u różnych gatunków roślin, występujących na tym
samym skażonym obszarze, dominowały odmienne grupy bakterii endofitycznych. Podobne
zależności zaobserwowano w prezentowanych badaniach. Bakterie zdolne do rozkładu
surowej ropy naftowej z rodzaju Pseudomonas dominowały wewnątrz tkanek komonicy
i jastrzębca, podczas gdy przedstawiciele rodzaju Rhizobium, stanowiły większość
hodowalnych endofitów wiesiołka. Z kolei, Delftia sp., Serratia sp. i Tsukamurella sp. zostały
wyizolowane tylko z tkanek komonicy, Xanthomonas sp. tylko z tkanek wiesiołka,
a Burkholderia sp., Enterobacter sp., Microbacterium sp., Pantoea sp. tylko z tkanek
jastrzębca. Wyniki sekwencjonowania również ujawniły dominację odmiennych grup
endofitów. Bakterie z rodzaju Buchnera, odnaleziono jedynie w łodygach komonicy.
Natomiast dla mikrobiomu korzenia jastrzębca wysokiego charakterystyczne były bakterie
z rodzaju Rhizobium, Burkholderia, Rhodanobacter i Asteroleplasma. Badania Phillips i wsp.
(2008) wykazały obecność specyficznych gatunków bakterii endofitycznych dla lucerny
siewnej (Medicago sativa), życicy trwałej (Lolium perenne), Elymus angustus i perzu
(Agropyron sp.) zebranych z tego samego terenu skażonego węglowodorami. Podobnie,
mikrobiomy krwawnika pospolitego (Achillea millefolium), nawłoci kanadyjskiej (Solidago
canadensis), koniczyny złocistożółtej (Trifolium aureum) i kupkówki pospolitej (Dactylis
glomerata) charakteryzowały się specyficznym gatunkowo składem zespołów bakterii
endofitycznych (Lumactud i wsp., 2016). Wyniki te potwierdzają obserwacje innych autorów,
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 93
którzy uważają, że kluczowym czynnikiem decydującym o składzie mikrobiomu jest gatunek
rośliny (Phillips i wsp., 2008; Aleklett i wsp., 2015; Lumactud i wsp., 2016) oraz stadium jej
rozwoju (van Overbeek i van Elsas, 2008; Shi i wsp., 2014). Nadrzędną rolę roślin
w kształtowaniu swoistego mikrobiomu pokazują wyniki Gottel i wsp. (2011). Przedstawili
oni analizę wyników pirosekwencjonowania, która wykazała dominację odmiennych typów
bakterii i różny udział poszczególnych jednostek taksonomicznych w ryzosferze i endosferze
topoli. Natomiast, w tkankach wierzby zidentyfikowano OTU występujące również
w ryzosferze, jednakże analizy metagonomiczne pozwoliły na wskazanie OTU,
charakterystycznych i unikalnych tylko dla tej rośliny (Tardif i wsp., 2016). Ponadto,
zaobserwowano, że w ryzosferze liczba OTU była 10-krotnie wyższa niż w tkankach rośliny
(Gottel i wsp., 2011; Wang i wsp., 2016b). Podobnie, Beckers i wsp. (2017) zwrócili uwagę
na bardzo duży spadek różnorodności gatunkowej bakterii obecnych w tkankach topoli,
w porównaniu do mikrobiomu ryzosfery. Mając to na uwadze, znaczące obniżenie liczby
zidentyfikowanych gatunków bakterii w korzeniach roślin oraz wspólne OTU
zidentyfikowane w tkankach roślin i ryzosferze, można przypuszczać, że rośliny mogą być
swoistym rodzajem „filtra”, decydującym o tym, które bakterie będą kolonizować jej tkanki
(Wang i wsp., 2016b).
W niniejszej pracy w mikrobiomie korzeni jastrzębca i łodyg komonicy
zidentyfikowano typ bakerii opisany w literaturze jako TM7, którego udział był niewielki.
Badania Beckers i wsp. (2017) pokazują jednak, że typ ten może być dominującą grupą
w endosferze innych roślin np. topoli.
Na podstawie wyznaczonych indeksów Gooda, Chao1, Shannona i Simpsona
możliwe było porównanie bioróżnorodności zespołów bakterii endofitycznych badanych
roślin. Wysoka wartość indeksu Gooda pozwala przypuszczać, że uzyskane wyniki odnoszą
się do znaczącej części populacji endofitów danego gospodarza i odzwierciedlają znaczną
różnorodność gatunkową bakterii, obserwowaną w badanych próbach. Najbardziej skrajne
wartości wszystkich wskaźników bioróżnorodności wyznaczono dla korzeni jastrzębca, gdzie
były one najwyższe i korzeni komonicy, gdzie były najniższe. Niska bioróżnorodność
(zgodna z indeksem H’) i różnorodność gatunkowa (indeks Chao1 i Simpsona) wyznaczone
dla korzeni komonicy niewątpliwie są związane z występowaniem jednego dominującego
typu Alphaproteobacteria. Za dominację Alphaproteobacteria odpowiadają przedstawiciele
Mezorhizobium stanowiący odpowiednio 98,3% oraz 43,2% wśród zespołów bakterii
endofitycznych korzeni oraz łodygi komonicy. Natomiast, wysoka bioróżnorodność
obserwowana dla korzeni jastrzębca jest wynikiem wysokiej różnorodności gatunkowej, co
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 94
potwierdza indeks Simpsona. Inni autorzy również zwracali uwagę na znaczną przewagę
jednego lub kilku rodzajów bakterii determinujących dominację danego typu (Bodenhausen
i wsp., 2013; Sanchez-Lopez i wsp., 2017). Przykładowo, wyniki sekwencjonowania
mikrobiomu nasion C. pumila wskazują na dominację Alphaproteobacteria, jako rezultat
wysokiego udziału Methylobacterium sp. w badanym zespole bakterii endofitycznych
(Sanchez-Lopez i wsp., 2017). Na uwagę zasługuje również fakt, że w przypadku endofitów
liści jastrzębca, ponad 80% OTU nie zostało przypisanych do żadnej jednostki
taksonomicznej. Odzwierciedlają to wyznaczone metryki gdzie obserwowano niską
bioróżnorodność i różnorodność gatunkową. Co więcej, w niniejszej pracy z liści jastrzębca
wyizolowano jedynie szczepy należące do rodzaju Tsukamurella, zdolne do rozkładu surowej
ropy naftowej. Mikrobiom jastrzębca wysokiego nie został jak dotąd opisany w literaturze.
Jedyne doniesienia odnoszące się do roślin należących do Oenothera spp. są związane z ich
wykorzystaniem w doświadczeniach fitoekstrakcji i fitostabilizacji miedzi (Gonzalez i wsp.,
2011; Guo i wsp., 2014).
5.2. Wykorzystanie węglowodorów przez bakterie endofityczne i obecność genów
kodujących enzymy zaangażowane w rozkład węglowodorów u badanych
izolatów
Wiele bakterii endofitycznych jest potencjalnie zdolnych do usuwania
zanieczyszczeń organicznych, gdyż posiadają enzymy i szlaki metaboliczne niezbędne w tym
procesie (Barac i wsp., 2004; Germaine i wsp., 2009). Przeprowadzone badania potwierdziły,
że szczepy bakterii endofitycznych wykazują potencjał do rozkładu ropy naftowej, oleju
napędowego i/lub n-heksadekanu. Ponad 90% izolatów komonicy i wiesiołka, a 77,8%
endofitów jastrzębca było zdolnych do wykorzystania oleju diesla jako jedynego źródła węgla
i energii. Najwięcej szczepów zdolnych do wykorzystania n-heksadekanu wyizolowano
z tkanek jastrzębca, stanowiły one 44,4% wszystkich izolatów, zdolnych do rozkładu surowej
ropy naftowej. Udział bakterii endofitycznych w rozkładzie węglowodorów alifatycznych
i/lub aromatycznych takich jak: BTEX, fenantren, fluoren, naftalen, trinitrotoluen i WWA
został potwierdzony także przez innych autorów (Phillips i wsp., 2008; Taghavi i wsp., 2009;
Yousaf i wsp., 2010a, 2010b; Andreolli i wsp., 2013; Oliveira i wsp., 2014; Thijs i wsp.,
2014).
Wyniki wykonanych w niniejszej pracy PCR pokazały, że znaczący odsetek
szczepów bakterii endofitycznych rozkładających surową ropę naftową posiada geny
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 95
związane z degradacją węglowodorów alifatycznych i aromatycznych. Wśród izolatów
jastrzębca, aż 88,9% posiadało gen pah, a 61,1% gen C23O, które kodują odpowiednio
podjednostkę alfa dioksygenaz hydroksylujących wielopierścieniowe węglowodory
aromatyczne oraz dioksygenazę-2,3-katecholu. Dioksygenazy te, to jedne z enzymów
szlaków rozkładu węglowodorów aromatycznych. Uważa się, że obecność u bakterii
endofitycznych genów kodujących enzymy biorące udział w rozkładzie różnych związków
ropopochodnych, wynika z ich ewolucyjnego przystosowania do wykorzystania roślinnych
metabolitów jako źródła węgla. Metabolity roślinne często swoją budową i strukturą
przypominają węglowodory, przez co potencjał degradacyjny endofitów wykazywany
w stosunku do związków ropopochodnych łączy się z ich zdolnościami do kolonizowania
i życia w tkankach roślinnych (van Beilen i wsp., 2006; van Bogaert i wsp., 2011).
Spośród badanych szczepów w niniejszej pracy ok. 40% izolatów posiadało gen
P450, kodujący grupę enzymów zaangażowanych w degradację n-alkanów, o krótkiej
i średniej długości łańcucha oraz kwasów tłuszczowych (van Beilen i wsp., 2006). Zdolność
bakterii do degradacji pobranych przez rośliny węglowodorów, wykazali Wang i wsp. (2010).
Z drugiej strony, bakterie posiadające geny kodujące enzymy degradujące alkany zostały
odnalezione w środowiskach niezanieczyszczonych węglowodorami, co sugeruje również
inne funkcje genów alkB i/lub P450 (rodzina CYP153) u tych bakterii (Brooijmans i wsp.,
2009). Uważa się, że u endofitów pełnią one ważną rolę w pokonywaniu epidermy, pierwszej
bariery w procesie kolonizacji tkanek roślinnych. Epiderma często pokryta jest woskami,
w których składzie występują alkany o długich łańcuchach, w których degradację mogą być
zaangażowane enzymy kodowane przez geny alkB i/lub P450 (rodzina CYP153) (van Bogaert
i wsp., 2011; Nie i wsp., 2014).
5.3. Charakterystyka wyizolowanych bakterii endofitycznych
Szczególne znaczenie dla roślin zasiedlających zanieczyszczone tereny mają
endofity promujace wzrost roślin (PGPE). Jest to grupa bakterii, która poprzez szereg
pośrednich i bezpośrednich mechanizmów wspomaga rozwój roślin narażonych
na zanieczyszczenia. Synteza przez PGPE takich związków jak auksyna, enzymy np.
deaminaza ACC, czy zdolność tych bakterii do solubilizacji fosforanów, produkcji
biosurfaktantów i sideroforów, często skorelowana jest z ograniczeniem negatywnego
wpływu toksycznych związków organicznych na rośliny (Glick i wsp., 2012; Khan i wsp.,
2013).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 96
Niektóre bakterie wytwarzają związki powierzchniowo czynne, zwane
biosurfaktantami, które odpowiedzialne są za zwiększanie biodostępności hydrofobowych
cząsteczek węglowodorów i możliwość ich dalszej biodegradacji (Pacwa-Płociniczak i wsp.,
2011). W przeprowadzonych badaniach endofity syntetyzujące
biosurfaktanty/bioemulsyfikatory wyizolowano z tkanek komonicy i wiesiołka. Należą one do
rodzaju Serratia, Delftia, Rhodococcus, Rhizobium oraz Pseudomonas. Biosurfaktanty, ze
względu na zróżnicowaną budowę chemiczną, mogą spełniać różne funkcje. Wykazano, że
hamują wzrost patogenów, wspomagają kolonizację tkanek roślinnych, poprawiają
ruchliwość komórek bakteryjnych i/lub ułatwiają dostęp enzymów zaangażowanych w
rozkład ściany komórkowej do powierzchni tkanek rośliny (Andersen i wsp., 2003;
Raaijmakers i wsp., 2006; Velho i wsp., 2011).
Kluczowymi czynnikami wpływającymi na sprawną kolonizację tkanek roślinnych
i dalsze rozprzestrzenianie się mikroorganizmów endofitycznych wewnątrz roślin są:
wydzielanie enzymów celulolitycznych i zdolność do ruchu. Wiele szczepów
w prezentowanej pracy wytwarzało enzymy celulolityczne. Stanowiły one odpowiednio
wśród bakterii endofitycznych komonicy i wiesiołka 41,7% i 64,3% wszystkich izolatów.
Cecha ta wydaje się mieć decydujące znaczenie w zawiązywaniu ścisłych interakcji między
roślinami a bakteriami (Verma i wsp., 2001; Pereira i wsp., 2016). Potwierdzają to badania
Germaine i wsp. (2009), którzy wykazali, że tylko szczepy zdolne do jednoczesnego ruchu,
zasiedlania korzeni i rozkładu naftalenu chroniły rośliny przed toksycznym wpływem
węglowodorów. Z kolei, bakterie Burkholderia fungorum DBT1, które efektywnie
kolonizowały korzenie i rozkładały węglowodory, zwiększały efektywność fitoremediacji
(Andreolli i wsp., 2013).
Za najważniejszy mechanizm promujący wzrost roślin uważa się zdolność bakterii
endofitycznych do produkcji IAA (Weyens i wsp., 2009c,d; Glick i wsp., 2012). Wszystkie
wyizolowane szczepy bakterii endofitycznych zdolne do rozkładu surowej ropy naftowej,
syntetyzowały kwas indoilo-3-octowy i uwalniały IAA do pożywki w różnej koncentracji.
Wysoki odsetek bakterii produkujących IAA wyizolowano także z innych roślin narażonych
na zanieczyszczenia (Etesami i wsp., 2014; Kukla i wsp., 2014; Pawlik i Piotrowska-Seget,
2015; Pereira i wsp., 2016; Xu i wsp., 2016). Szczepy syntetyzujące IAA stymulują wzrost
komórek korzeni i ich wydłużanie, co jest istotne podczas kiełkowania i rozwoju wielu roślin
(Garbeva i wsp., 2001; Seghers i wsp., 2004; Ikeda i wsp., 2010). Przykładowo, sadzonki
A. thaliana inokulowane bakteriami endofitycznymi wytwarzającymi IAA, posiadały
zdecydowanie więcej korzeni włośnikowych, w porównaniu do nieinokulowanej kontroli
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 97
(Abbamondi i wsp., 2016). Ponadto, szczepy wytwarzające IAA, wydają się efektywniej
kolonizować korzenie roślin niż bakterie pozbawione zdolności do syntezy tego fitohormonu.
Etesami i wsp. (2014) wykazali silną korelację pomiędzy produkcją IAA przez bakterie i ich
zdolnością do kolonizacji rośliny. Bakterie uwalniają IAA w szerokim zakresie stężeń, przez
co wywierają zróżnicowany efekt na rośliny (Zúñiga i wsp., 2013). Rośliny inokulowane
zawiesiną szczepu Pantoea sp. FF34 produkującym IAA w stężeniu 95,3±2,1 µg IAA ml-1
podłoża, osiągały mniejszą biomasę korzeni, w porównaniu do roślin podlewanych zawiesiną
szczepów produkujących IAA w niskich stężeniach w zakresie od 7,5±1,0 do 12,3±1,0 µg
IAA ml-1 podłoża (Naveed i wsp., 2014). Ponieważ, aż 56,8% bakterii endofitycznych
wyizolowanych z badanych gatunków roślin produkowało IAA w stężeniu niższym niż 10 µg
IAA ml-1 podłoża, wydaje się, że jest to stężenie wystarczające do wspomagania wzrostu
roślin.
Szczepy wykazujące aktywność deaminazy ACC wzbudzają duże zainteresowanie ze
względu na swoistą funkcję tego enzymu (Glick, 2014). Enzym ten rozkłada kwas 1-
aminocyklopropano-1-karboksylowy, będący prekursorem etylenu. Rozkład tego kwasu
powoduje zmniejszenie syntezy tego fitohormonu w roślinach i ogranicza jego hamujący
wpływ na wzrost roślin (Glick i wsp., 2007; Hardoim i wsp., 2008). Szczepy wytwarzające
deaminazę ACC odgrywają szczególnie istotną rolę w środowisku, w którym roślina narażona
jest na stresy abiotyczne związane z występowaniem zanieczyszczeń. W przeprowadzonych
badaniach prawie połowa izolatów komonicy i wiesiołka wykazywała potencjalną zdolność
do syntezy dezaminazy ACC. Wśród endofitów jastrzębca udział tych bakterii był jeszcze
wyższy i wynosił aż 77,8% wszystkich izolatów zdolnych do rozkładu surowej ropy naftowej.
Bakterie produkujące deaminazę ACC, stymulując wzrost i rozwój systemu korzeniowego,
umożliwiają roślinom zwiększone pobieranie zanieczyszczeń i ich dalsze przekształcenie
(Arshad i wsp., 2007; Glick i wsp., 2007; Qin i wsp., 2015). Zdolność do promowania
wzrostu roślin oraz zwiększania wydajności fitoremediacji wykazywał syntetyzujący
deaminazę ACC szczep Pantoea sp. BTRH79 (Arslan i wsp., 2014). Z kolei, u Burkholderia
phytofirmans PsJN usunięcie fragmentu genu acdS skutkowało syntezą nieaktywnego enzymu
i utratą zdolności do promowania wzrostu korzeni rzepaku (Sun i wsp., 2009).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 98
5.4. Wpływ bakterii endofitycznych na efektywność usuwania TPH z gleby oraz
wzrost roślin w procesie fitoremediacji
Postępująca degradacja środowiska naturalnego związana z niekontrolowanym
uwalnianiem związków ropopochodnych do gleby, których toksyczne i mutagenne
właściwości wpływają negatywnie na organizmy żywe, zmusza do poszukiwania
alternatywnych metod remediacji środowiska. Pomimo pewnych ograniczeń, obiecującą
techniką oczyszczania środowiska naturalnego jest fitoremediacja wspomagana
wyselekcjonowanymi szczepami bakterii (Vangronsveld i wsp., 2009). Szczególne miejsce
w tym procesie zajmują bakterie endofityczne, które wchodzą w bardzo ścisłe interakcje
ze swoim gospodarzem (Weyens i wsp., 2009a,b,c; Khan i wsp., 2013; Santoyo i wsp., 2016).
Bardzo często, rozwój roślin i przyrost ich biomasy na terenach skażonych jest powolny,
co stanowi poważne ograniczenie procesów fitoremediacji, dlatego niezwykle ważne jest
wykorzystanie bakterii endofitycznych do promowania wzrostu roslin.
Wykorzystanie w fitoremediacji odpowiednich gatunków roślin, wykazujących
naturalne przystosowania do wzrostu w skażonych glebach, znacznie przyspiesza proces
usuwania związków ropopochodnych z gleby. W praktyce, najczęściej stosowane są rośliny
posiadające dobrze rozwinięty, głęboko sięgający system korzeniowy oraz takie, które
osiągają wysoki przyrost biomasy. Wyniki wielu badań pokazują, że w fitoremediacji
środowisk zanieczyszczonych związkami organicznymi szczególnie przydatne są trawy
z gatunku życic (Lolium sp.) (Kirk i wsp., 2005; Tang i wsp., 2010; Escaray i wsp., 2012).
Wybrana do badań życica trwała okazała się rośliną oporną na wysokie stężenia związków
ropopochodnych (12853,34±322,62 mg TPH kg-1 s.m. gleby).
Bakterie endofityczne wykorzystane w przeprowadzonym doświadczeniu
fitoremediacyjnym zostały wyizolowane z tkanek wiesiołka dwuletniego. Ze względu
na zdolność tych bakterii do kolonizacji tkanek życicy, która nie jest macierzystym
gospodarzem badanych endofitów, można wnioskować, że są to endofity fakultatywne.
Co prawda, wiele bakterii endofitycznych ma zdolność do kolonizowania odmiennych
gatunków roślin, jednak niektóre z nich mogą być patogenne dla roślin innych
niż rodzicielskie (Hardoim i wsp., 2008). Z uwagi na fakt, iż wyselekcjonowane bakterie,
5WK oraz 10WK, nie wywierały szkodliwego wpływu na życicę, mogłyby być potencjalnie
wykorzystywane w fitoremediacji wspomaganej.
Zastosowane w niniejszej pracy bakterie endofityczne istotnie wpływały
na obniżenie stężenia TPH w badanej glebie. Pre-inokulacja nasion życicy i inokulacja gleby
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 99
wyselekcjonowanymi bakteriami w postaci konsorcjum (PI+5WK+10WK) prowadziła
do najwyższego ubytku (19,1%) TPH ze skażonej gleby. Podobnie, badania Fatima i wsp.
(2016) wykazały, że wykorzystanie roślin i konsorcjum bakterii endofitycznych prowadzi
do znacznego obniżenia stężenia węglowodorów w glebie, nawet o 78%. Z kolei, Chuluun
i wsp. (2014) obserwowali pozytywny wpływ wprowadzonego konsorcjum bakterii
na wydajność fitoremediacji wspomaganej. Średni ubytek TPH w glebie inokulowanej
konsorcjum bakteryjnym był o 7,3% wyższy, niż w fitoremediacji bez inokulacji bakteriami,
a o 5,3% wyższy niż w glebie poddanej bioaugmentacji (Chuluun i wsp., 2014). Co więcej,
inokulacja roślin bakteriami endofitycznymi powoduje także szybszy wzrost korzeni
i przyrost biomasy roślin, co w konsekwencji prowadzi do efektywniejszego usuwania TPH
z gleby (Wang i wsp., 2010). Wyniki badań Wang i wsp. (2010) oraz Afzal i wsp. (2013)
wykazały, że wykorzystanie w fitoremediacji wspomaganej specyficznych szczepów
endofitów degradujących węglowodory, zmniejszało fitotoksyczność tych związków.
Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykazała, że metoda inokulacji bakterii
endofitycznych (inokulacja gleby (SI) lub pre-inolulacja nasion z inokulacją gleby (PI)) miała
istotny wpływ na obserwowany spadek stężenia TPH. Afzal i wsp. (2011) wykazali,
że zastosowanie życicy wielokwiatowej (Lolium multiflorum) może przyczynić się do spadku
stężenia węglowodorów w zakresie od 12% do 20%, w zależności od typu gleby.
W przeprowadzonych badaniach, w nieinokulowanych glebach (S) i (R), ubytek TPH wynosił
odpowiednio 1,7% i 4,7% stężenia wyjściowego. Tak niski spadek stężenia TPH w procesie
bioremediacji podstawowej najprawdopodobniej wynika z bardzo wysokiego początkowego
stężenia TPH w badanej glebie, które hamowało aktywność mikroorganizmów i rozwój
roślin. Uważa się, że metody biologiczne są najbardziej skuteczne podczas oczyszczania
środowisk, w których stężenie związków ropopochodnych mieści się w graniach 5-10% s.m.
gleby. Natomiast, dla większości bakterii i grzybów mikroskopowych stężenie związków
ropopochodnych mieszczące się w zakresie od 1 do 100 µg ml-1 wody lub 1 do 100 µg g-1
s.m. gleby jest nietoksyczne (Steliga, 2014). Ponadto, pierwsze zabiegi bioremediacyjne
powinno się podejmować dopiero po obniżeniu wysokiej zawartości zanieczyszczeń
ropopochodnych (70 000-200 000 mg TPH kg-1 s.m. gleby) o 50-75%, stosując wstępną
remediację i metody fizykochemiczne (Steliga, 2014). Przyjmuje się, że skuteczność
usuwania węglowodorów ropopochodnych z gleby w wyniku zastosowania metod
biologicznych jest zgodna ze schematem, w którym wydajność maleje w kolejności:
fitoremediacja z inokulacją szczepów>bioaugmentacja≈fitoremediacja niewspomagana przez
bakterie (Xu i wsp., 2014).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 100
Inokulacja gleby szczepami 5WK, 10WK prowadziła do przyrostu biomasy życicy
w czasie doświadczenia. Współczynnik wzrostu roślin był najwyższy podczas pre-inokulacji
nasion z inokulacją gleby szczepem 5WK (PI+5WK+10WK) i wynosił 106,1%. Analiza
statystyczna wykazała, że metoda inokulacji szczepów bakterii endofitycznych istotnie
wpływała na uzyskaną biomasę życicy w czasie trwania doświadczenia fitoremediacyjnego.
Co ważne, porównując biomasę życicy uzyskaną podczas zastosowania metody inokulacji
gleby (SI), z biomasą życicy otrzymaną po pre-inokulacji nasion z inokulacją gleby (PI),
okazało się, że w tym drugim przypadku odnotowano słaby przyrost biomasy życicy. Mogło
to być związane z przeprowadzoną sterylizacją nasion, podczas której zastosowane środki
chemiczne obniżyły siłę ich kiełkowania, zwłaszcza na początku eksperymentu (Sen i wsp.,
2013; Barampuram i wsp., 2014).
5.5. Przeżywalność bakterii endofitycznych wprowadzanych do gleby i ich
zdolność do kolonizacji tkanek roślinnych
Warunkiem skutecznego działania szczepów w procesie fitoremediacji wspomaganej
jest ich zdolność do przeżywania w zanieczyszczonej glebie, do której zostały wprowadzone
(Germaine i wsp., 2009; Afzal i wsp., 2013). Jest to bowiem jeden z niezbędnych czynników,
który determinuje wytworzenie interakcji między roślinami a bakteriami.
Ocena przeżywalności bakterii endofitycznych, oparta na hodowli
rifamipicynoopornych szczepów 5WK i 10WK, wykazała, że różniły się one zdolnością
do kolonizacji tkanek roślinnych życicy oraz przeżywalnością w glebie. Szczepy bakteryjne
wykorzystane jako inokulum efektywniej kolonizowały tkanki roślinne niż glebę, co może
być związane z tym, że są to bakterie endofityczne, których naturalnym środowiskiem życia
jest wnętrze roślin. Yousaf i wsp. (2011) wykazali, że bakterie endofityczne, wykorzystane
jako inokulum do wspomagania fitoremediacji, zdecydowane efektywniej kolonizowały
właśnie te części roślin, z których pierwotnie zostały wyizolowane. Generalnie, obserwuje się,
że bakterie endofityczne są najlepszymi kolonizatorami powierzchni roślin. Wydaje się,
że jest to powiązane z cyklem życiowym endofitycznych bakterii i ich specyficznymi cechami
(Rosenblueth i Martinez-Romero, 2006; Andria i wsp., 2009; Yousaf i wsp., 2011; Pisarska
i Pietr, 2014). Badania innych autorów wykazały, że kolonizacja tkanek roślin przez bakterie
zależna jest także od warunków środowiska. W warunkach stresu środowiskowego
(zanieczyszczenie, niska zawartość azotu, susza) proces ten zachodzi szybciej (Siciliano
i wsp., 2001; Oliveira i wsp., 2003; Vargas i wsp., 2014).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Dyskusja 101
W prezentowanych badaniach obserwowano, że metoda inokulacji bakterii, pre-
inokulacja nasion z inokulacją gleby (PI), ma wpływ na zaobserwowane różnice w zdolności
do przeżywania w glebie i tkankach roślinnych obu szczepów bakterii. Wydaje się, że pre-
inokulacja pozwala na zapoczątkowanie korzystnych oddziaływań między bakteriami
a roślinami, kolonizację powierzchni nasion, a następnie korzeni i części nadziemnych
rośliny.
5.6. Wpływ introdukowanych szczepów bakterii endofitycznych na bakterie
autochtoniczne gleby
W skład zespołu mikroorganizmów autochtonicznych gleby wchodzi wiele
gatunków, dlatego ich wpływ na przeżywalność inokulowanych bakterii może być bardzo
istotny. Z drugiej strony, wprowadzone do gleby bakterie mogą zmieniać strukturę zespołów
mikroorganizmów autochtonicznych gleby.
Analiza wyników real-time PCR wykazała, że największy wpływ na zmianę liczby
kopii genów 16S rRNA i alkH miał czas i zastosowany szczep/konsorcjum bakterii.
Wprowadzenie konsorcjum szczepów (SI+5WK+10WK; PI+5WK+10WK) istotnie wpływało
na zmianę ogólnej liczebności bakterii autochtonicznych w badanej glebie. Natomiast nie
miało ono wpływu na zmianę liczebności bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów
alifatycznych. Występowanie istotnych różnic w obserwowanej liczbie kopii genu 16S rRNA
podczas fitoremediacji prawdopodobnie jest związane z rozwojem roślin i zwiększoną
produkcją wydzielin korzeniowych, dostarczających składników odżywczych bakteriom
i stymulujących ich wzrost. Po zakończeniu procesu fitoremediacji, liczba kopii genu 16S
rRNA i alkH była niska i porównywalna we wszystkich układach doświadczalnych.
Obserwowana dynamika zmiany liczby kopii obu genów może być wynikiem interakcji
bakterii z rośliną i reakcją wprowadzonych szczepów na rozwój rośliny. Nie i wsp. (2011)
stwierdzili, że w czasie wzrostu wegetatywnego rośliny, liczba kopii genu alkB w glebie była
wyższa, niż podczas kiełkowania i kwitnienia. Tym samym, potencjał degradacyjny zespołów
mikroorganizmów glebowych był wyższy właśnie w tej fazie rozwoju rośliny. Wyniki innych
badań sugerują, że wysoka liczbia kopii genów związanych z rozkładem związków
ropopochodnych w ryzosferze, jest wynikiem dostarczanych przez korzenie, wraz
z wydzielinami, wielu związków, w tym kometabolitów. Ponadto, dostępność dodatkowych
składników odżywczych może promować wzrost i podział bakterii oraz mineralizację
węglowodorów przez mikroorganizmy (Andria i wsp., 2009; Arslan i wsp., 2014).
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Wnioski 102
VI. Wnioski
1. W tkankach komonicy zwyczajnej, wiesiołka dwuletniego oraz jastrzębca wysokiego
występowały szczepy bakterii endofitycznych promujących wzrost roślin (PGPE).
Wyizolowane bakterie endofityczne posiadały geny kodujące enzymy zaangażowane
w degradację węglowodorów alifatycznych i/lub aromatycznych oraz szereg
mechanizmów odpowiedzialnych za wspomaganie wzrostu roślin.
2. Wyizolowane bakterie endofityczne zdolne do rozkładu surowej ropy naftowej
należały głównie do Gammaproteobacteria, wśród których dominował rodzaj
Pseudomonas.
3. Analiza metagenomiczna wykazała, że przedstawiciele Proteobacteria, Actinobacteria
i Firmicutes dominowały w mikrobiomie komonicy zwyczajnej i jastrzębca
wysokiego. Najwyższą bioróżnorodność bakterii obserwowano wewnątrz korzeni
jastrzębca, a najniższą wewnątrz korzeni komonicy.
4. Zastosowana metoda inokulacji bakterii endofitycznych, podczas doświadczenia
fitoremediacyjnego, istotnie wpływała na obniżenie stężenia oleju mineralnego
w glebie. Największą efektywność fitoremediacji wspomaganej uzyskano przy pre-
inokulacji nasion z inokulacją gleby konsorcjum szczepów Rhodococcus erythropolis
5WK i Rhizobium sp. 10WK (PI+5WK+10WK).
5. Wprowadzone do gleby szczepy Rhodococcus erythropolis 5WK oraz Rhizobium sp.
10WK nie powodowały trwałych zmian w strukturze zespołów mikroorganizmów
autochtonicznych gleby.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Streszczenie 103
VII. Streszczenie
Bakterie endofityczne to grupa mikroorganizmów, na którą w ostatnich latach
zwraca się szczególną uwagę. Udokumentowano, że bakterie endofityczne z powodzeniem
mogą być wykorzystane do zwiększenia efektywności fitoremediacji gleb skażonych
związkami ropopochodnymi. Największym zainteresowaniem cieszą się endofity zdolne
jednocześnie do promowania wzrostu roślin i rozkładu toksycznych związków organicznych.
Celem badań była charakterystyka hodowalnej frakcji bakterii endofitycznych
występujących w tkankach komonicy zwyczajnej (Lotus corniculatus), wiesiołka dwuletniego
(Oenothera biennis) i jastrzębca wysokiego (Hieracium piloselloides) zdolnych do rozkładu
surowej ropy naftowej. Bioróżnorodność mikrobiomu komonicy i jastrzębca oznaczona
została poprzez pirosekwencjonowanie 454. Rośliny wykorzystane w badaniach zebrano
z terenu rafinerii w Czechowicach-Dziedzicach, silnie zanieczyszczonego związkami
ropopochodnymi. Wyizolowane szczepy bakterii charakteryzowano pod kątem ich potencjału
do promowania wzrotu roślin i degradacji węglowodorów. Wybrane szczepy endofitów
wchodziły w skład inokulum wykorzystanego podczas fitoremediacji.
Przeprowadzona izolacja bakterii endofitycznych pozwoliła na wyselekcjonowanie
44 szczepów zdolnych do wykorzystania surowej ropy naftowej, oleju diesla i/lub n-
heksadekanu. Endofity te, oprócz genów kodujących enzymy, zaangażowane w rozkład
węglowodorów, posiadały liczne mechanizmy wspomagające wzrost roślin, co pozwoliło je
zaliczyć do grupy bakterii endofitycznych promujących wzrost roślin (PGPE). Wszystkie
izolaty syntetyzowały kwas indolilo-3-octowy (IAA), a większość z nich posiadało zdolność
do produkcji enzymów celulolitycznych (>40%) i ruchu (>80%). Na podstawie sekwencji
fragmentu genu 16S rRNA określono przynależność gatunkową wyizolowanych endofitów,
które zaklasyfikowano głównie do Gammaproteobacteria. Bakterie z rodzaju Rhizobium
i Rhodococcus najliczniej występowały w tkankach wiesiołka, natomiast u komonicy
i jastrzębca dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas.
Analiza metagenomiczna wykazała najwyższy udział przedstawicieli Proteobacteria,
Actinobacteria i Firmicutes u komonicy zwyczajnej oraz jastrzębca wysokiego. Najwyższą
bioróżnorodność i różnorodność zespołów bakterii endofitycznych obserwowano
w korzeniach jastrzębca, natomiast najniższą w korzeniach komonicy, co niewątpliwie było
wynikiem wyraźnej dominacji w badanej populacji bakterii przedstawicieli
Alphaproteobacteria.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Streszczenie 104
W fitoremediacji wspomaganej w okolice nasion życicy trwałej (Lolium perenne)
wprowadzano inokulum bakteryjne składające się z pojedynczych szczepów Rhodococcus sp.
5WK lub Rhizobium sp. 10WK lub konsorcjum obu z nich. Zastosowano dwie metody
introdukcji przygotowanego inokulum: (1) inokulację gleby (SI) oraz (2) pre-inokulcję nasion
z inokulacją gleby (PI). Po 75 dniach fitoremediacji najwyższy spadek zawartości TPH
zaobserwowano w glebie, gdzie zastosowano konsorcjum szczepów i metodę pre-inokulacji
nasion z inokulacją gleby (PI+5WK+10WK). Ubytek TPH wynosił 19,1% początkowej
zawartości oleju mineralnego w badanej glebie. Wielowymiarowa analiza statystyczna
wykazała, że metoda wprowadzania szczepów do gleby istotnie wpływała nie tylko
na obserwowany spadek stężenia TPH, ale także na przyrost biomasy roślin w czasie
eksperymentu. Oba szczepy były zdolne do kolonizowania gleby i tkanek roślin, zarówno
korzeni, jak i części nadziemnych, a ich introdukcja do gleby powodowała jedynie
krótkotrwałe zmiany w ogólnej liczebności i liczebności zdolnych do rozkładu
węglowodorów alifatycznych zespołów bakterii autochtonicznych gleby.
Przedstawione wyniki mają duże znaczenie poznawcze, naukowe i potencjalnie
praktyczne. Scharakteryzowane bakterie endofityczne mogą być przydatne w dalszych
badaniach o charakterze zarówno podstawowym, jak i praktycznym, nad bioremediacją
i fitoremediacją gleb skażonych związkami ropopochodnymi. Ponadto, otrzymane wyniki
pozwoliły na uzupełnienie wiedzy na temat bioróżnorodności mikrobiomu roślin
zasiedlających gleby silnie zanieczyszczone związkami ropopochodnymi. Istotnym wydaje
się fakt poznania frakcji hodowalnej i niehodowalnej zespołów bakterii endofitycznych roślin
naturalnie występujących na obszarach skażonych, ze szczególnym uwzględnieniem
endofitów zdolnych do rozkładu związków ropopochodnych.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Summary 105
VIII. Summary
Recent attention has been paid to the endophytic bacteria which live inside plant
tissues without causing any apparent symptoms of diseases. These bacteria display a broad
range of symbiotic interactions with their host. Several studies demonstrated that endophytes
may significantly increase effectiveness of phytoremediation of soils polluted by petroleum
hydrocarbons. The highest potential have hydrocarbon-degrading endophytic bacteria with
multiple plant growth-promoting mechanisms and ability to survive in contaminated soil and
to colonize plant tissues.
The aims of this study were to isolate and characterise crude oil-degrading
endophytic bacteria from different tissues of the birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus),
evening primrose (Oenothera biennis) and tall hawkweed (Hieracium piloselloides). These
plants were collected in the highly-polluted area around the refinery in Czechowice-
Dziedzice. The diversity and richness of microbiome of birdsfoot trefoil and tall hawkweed
were assessed by 454 pyrosequencing. Furthermore, the biochemical traits considered as plant
growth-promoting mechanisms of endophytes and their ability to grow on media containing
crude oil, diesel oil, n-hexadecane, as sole carbon sources were evaluated. The selected strains
were used as inoculum in the phytoremediation experiment.
Based on morphological characteristics, in total 44 crude oil-degrading endophytic
bacteria were isolated from the interior tissues of three plants. The isolates possessed
numerous mechanisms supporting plant growth, which allowed them to be included in the
group of plant growth promoting endophytes (PGPE). All selected endophytes synthetized
indole-3-acetic acid (IAA) at varying levels, and most of them had the ability to produce
cellulolytic enzymes (> 40%). More than 80% of endophytes were found to be motile. PCR
analyses revealed that catabolic genes that are associated with hydrocarbon degradation
pathways were widespread in the tested strains. The isolates were identified based on
sequencing of their 16S rDNA genes. Gammaproteobacteria comprised the majority of the
isolated strains and were the predominant group in the investigated plant species. Bacterial
isolates belonging to the genus Rhizobium and Rhodococcus were the most abundant in the
tissues of O. biennis. Pseudomonas sp. was the most often isolated from L. corniculatus and
H. piloselloides.
The metagenomics analysis showed that Proteobacteria, Actinobacteria and
Firmicutes were the most abundant phyla in all samples. The highest bacterial diversity was
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Summary 106
revealed in roots of H. piloselloides, while the lowest diversity was observed in roots of L.
corniculatus. The predominance of Alphaproteobacteria was driven by the high abundance of
mentioned phyla.
The impact of endophytic bacteria Rhodococcus erythropolis 5WK and Rhizobium
sp. 10WK on petroleum hydrocarbons removal efficiency during phytoremediation with
Lolium perenne was evaluated. In the phytoremediation experiment, two inoculation
techniques: (1) soil inoculation (SI); (2) seeds pre-inoculation followed by soil inoculation
(PI), were used. After 75 days of phytoremediation, the highest TPH removal (19.1%). was
observed in the soil, where a consortium of strains and seed pre-inoculation method with soil
inoculation (PI+5WK+10WK) were used. Multivariate statistical analysis showed that the
method of strains inoculation significantly affected TPH removal and biomass production.
Both strains were able to colonize the soil and interior plant tissues (roots and shoots), and
their introduction into the soil caused only short-term changes in the total number and
abundance of aliphatic hydrocarbon-degrading autochthonous microbial community in soil.
Presented results have a high cognitive, scientific and potentially practical
significance. Characterised endophytic bacteria may be useful in further research of both a
basic and practical nature, on bioremediation and phytoremediation of soils contaminated
with petroleum hydrocarbons. In addition, results obtained in this project allowed to
complement the knowledge about the abundance and biodiversity of the endophytic bacteria
associated with plants growing spontaneously on heavily polluted environments.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 107
IX. Literatura
1. Abbamondi G.R., Tommonaro G., Weyens N., Thijs S., Sillen W., Gkorezis P., Iodice
C., Rangel W.M., Nicolaus B., Vangronsveld J. 2016. Plant growth-promoting effects
of rhizospheric and endophytic bacteria associated with different tomato cultivars and
new tomato hybrids. Chem. Biol. Technol. Agric. 3.
2. Afzal M., Khan Q.M., Sessitsch A. 2014. Endophytic bacteria: prospects and
applications for the phytoremediation of organic pollutants. Chemosphere 117, 232-
242.
3. Afzal M., Khan S., Iqbal S., Mirza M.S., Khan Q.M. 2013. Inoculation method affects
colonization and activity of Burkholderia phytofirmans PsJN during phytoremediation
of diesel-contaminated soil. Int. Biodeter. Biodegr. 85, 331-336.
4. Afzal M., Yousafa S., Reichenauer T.G., Kuffner M., Sessitsch A. 2011. Soil type
affects plant colonization, activity and catabolic gene expression of inoculated
bacterial strains during phytoremediation of diesel. J. Hazard. Mater. 186, 1568–1575.
5. Aleklett K., Leff J.W., Fierer N., Hart M. 2015. Wild plant species growing closely
connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities.
PeerJ 3, e804, doi 10.7717/peerj.804.
6. Ali S., Duan J., Charles T.C., Glick B.R. 2014. A bioinformatics approach to the
determination of genes involved in endophytic behavior in Burkholderia spp. J. Theor.
Biol. 21, 193-198.
7. Alqueres S., Meneses C., Rouws L., Rothballer M., Baldani I., Schmid M., Hartmann
A. 2013. The bacterial superoxide dismutase and glutathione reductase are crucial for
endophytic colonization of rice roots by Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5.
Mol. Plant Microbe. Interact. 23, 937–945.
8. Andersen J.B., Koch B., Nielsen T.H., Sørensen D., Hansen M., Nybroe O.,
Christophersen C., Sørensen J., Molin S., Givskov M. 2003. Surface motility in
Pseudomonas sp. DSS73 is required for efficient biological containment of the root-
pathogenic microfungi Rhizoctonia solani and Pythium ultimum. Microbiology 149,
37-46.
9. Andreolli M., Lampis S., Poli M., Gullner G., Biró B., Vallini G. 2013. Endophytic
Burkholderia fungorum DBT1 can improve phytoremediation efficiency of polycyclic
aromatic hydrocarbons. Chemosphere 92, 688–694.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 108
10. Andria V., Reichenauer T.G., Sessitsch A. 2009. Expression of alkane
monooxygenase (alkB) genes by plant-associated bacteria in the rhizosphere and
endosphere of Italian ryegrass (Lolium multiflorum L.) grown in diesel contaminated
soil. Environ. Pollut. 157, 3347-3350.
11. Ardanov P., Ovcharenko L., Zaets I., Kozyrovska N., Pirttila A.M. 2011. Endophytic
bacteria enhancing growth and disease resistance of potato (Solanum tuberosum L.).
Biol. Control. 56, 43–49.
12. Arshad M., Saleem M., Hussain S. 2007. Perspectives of bacterial ACC deaminase in
phytoremediation. Trends Biotechnol. 25, 356–362.
13. Arslan M., Afzal M., Amin I., Iqbal S., Khan Q.M. 2014. Nutrients can enhance the
abundance and expression of alkane hydroxylase CYP153 gene in the rhizosphere of
ryegrass planted in hydrocarbon-polluted soil. PLoS ONE 9, e111208.
14. Bacilio-Jiménez M., Aguilar-Flores S., Ventura-Zapata E., Pérez-Campos E.,
Bouquelet S., Zenteno E. 2003. Chemical characterization of root exudates from rice
(Oryza sativa) and their effects on the chemotactic response of endophytic bacteria.
Plant Soil 249, 271-277.
15. Bais H.P., Weir T.L., Perry L.G., Gilroy S., Vivanco J.M. 2006. The role of root
exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Ann. Rev. Plant
Biol. 57, 233–266.
16. Bais H.P., Fall R., Vivanco J.M. 2004. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection
of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and
surfactin production. Plant Physiol. 134, 307–319.
17. Balachandar D., Sandhiya G.S., Sugitha T.C.K., Kumar K. 2006. Flavonoids and
growth hormones infl uence endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by
a diazotrophic Serratia sp. in rice. World J. Microbiol. Biotechnol. 22, 707–712.
18. Balasubramaniyam A. 2015. The influence of plants in the remediation of petroleum
hydrocarbon contaminated sites. Pharm. Anal. Chem. 1, 1000105.
19. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. 2000. Inoculation of rice plants with the
endophytic diazotrophs Herbaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. Biol. Fert.
Soils 30, 485–491.
20. Barac T., Taghavi S., Borremans B., Provoost A., Oeyen A, Colpaert J.V.,
Vangronsveld J., van der Lelie D. 2004. Engineered endophytic bacteria improve
phytoremediation of water–soluble, volatile, organic pollutants. Natur. Biotechnol. 22,
583–588.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 109
21. Barampuram S., Allen G., Krasnyanski S. 2014. Effect of various sterilization
procedures on the in vitro germination of cotton seeds. Plant Cell, Tissue Organ. Cult.
118, 179–185.
22. Becerra-Castro C., Kidd P.S., Prieto-Fernández Á., Weyens N., Acea M.J.,
Vangronsveld J. 2011. Endophytic and rhizoplane bacteria associated with Cytisus
striatus growing on hexachlorocyclohexane-contaminated soil: isolation and
characterization. Plant Soil 340, 413–433.
23. Beckers B., Beeck M.O., Weyens N., Boerjan W., Vangronsveld J. 2017. Structural
variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial
microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome 5, 25.
24. Belimov A.A., Dodd I.C., Hontzeas N., Theobald J.C., Safronova V.I., Daves W.J.
2009. Rizosphere bacteria containing 1–aminocyclopropane–1–carboxylate deaminase
increase yield of plants grown in dry soil via both local systemic hormone signaling.
New Phytolog. 181, 413–423.
25. Bernal P., Allsopp L.P., Filloux A., Llamas M.A. 2017. The Pseudomonas
putida T6SS is a plant warden against phytopathogens. ISME J. 11, 972–987.
26. Blaha D., Prigent-Combaret C., Mirza M.S., Moenne-Loccoz Y. 2006. Phylogeny of
the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase-encoding gene acdS in
phytobeneficial and pathogenic Proteobacteria and relation with strain biogeography.
FEMS Microbiol. Ecol. 56, 455–470.
27. Blain N.P., Helgason B.L., Germida J.J. 2017. Endophytic root bacteria associated
with the natural vegetation growing at the hydrocarbon-contaminated Bitumount
Provincial Historic site. Can. J. Microbiol. 63, 502-515.
28. Bocheński C., Bocheńska A. 2008. Ocena zasobów ropy naftowej i perspektywy jej
substytucji biopaliwami. Motrol 10, 23-30.
29. Boddey R.M., Oliveira O.C.D., Urquiaga S., Reis V.M., Olivares F.L.D., Baldani
V.L.D., Döbereiner J. 1995. Biological nitrogen fixation associated with sugarcane
and rice: contributions and prospects for improvement. Plant Soil 174, 195–209.
30. Bodenhausen N., Horton M.W., Bergelson J. 2013. Bacterial communities associated
with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLOS ONE 8, e56329.
31. Bohm M., Hurek T., Reinhold-Hurek B. 2007. Twitching motility is essential for
endophytic rice colonization by the N2-fixing endophyte Azoarcus sp. strain BH72.
Mol. Plant Microbe. Interact. 20, 526-33.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 110
32. Bordiec S., Paquis S., Lacroix H., Dhondt S., AitBarka E., Kauffmann S., Jeandet P.,
Mazeyrat-Gourbeyre F., Clement Ch., Baillieul F., Dorey S. 2011. Comparative
analysis of defence responses induced by the endophytic plant growth-promoting
rhizobacterium Burkholderia phytofirmans strain PsJN and the non-host bacterium
Pseudomonas syringae pv. pisi in grapevine cell suspensions. J. Exp. Bot. 62, 595–
603.
33. Boyer M., Bally R., Perrotto S., Chaintreuil C., Wisniewski-Dyé F. 2008. A quorum-
quenching approach to identify quorum-sensing-regulated functions in Azospirillum
lipoferum. Res. Microbiol. 159, 699–708.
34. Brooijmans R.J., Pastink M.I., Siezen R.J. 2009. Hydrocarbon-degrading bacteria: the
oil-spill clean-up crew. Microb. Biotechnol. 2, 6, 587-594.
35. Bulgarelli D., Rott M., Schlaeppi K., Ver Loren van Themaat E., Ahmadinejad
N., Assenza F., Rauf P., Huettel B., Reinhardt R., Schmelzer E., Peplies J., Gloeckner
F.O., Amann R., Eickhorst T., Schulze-Lefert P. 2012. Revealing structure and
assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota. Nature 2, 91-95.
36. Bulgarelli D., Schlaeppi K., Spaepen S., Themaat E.L., Schulze-Lefert P. 2013.
Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annu. Rev. Plant Biol.
64, 807–838.
37. Burdman S., Dulguerova G., Okon Y., Jurkevitch E. 2001. Purification of the major
outer membrane protein of Azospirillum brasilense, its affinity to plant roots, and its
involvement in cell aggregation. Mol. Plant Microbe Interact. 14, 555-561.
38. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J., Bittinger K., Bushman F.D., Costello
E.K., Fierer N., Gonzalez Peña A., Goodrich J.K., Gordon J.I., Huttley G.A., Kelley
S.T., Knights D., Koenig J.E., Ley R.E., Lozupone C.A., McDonald D., Muegge B.D.,
Pirrung M., Reeder J., Sevinsky J.R., Turnbaugh P.J., Walters W.A., Widmann J.,
Yatsunenko T., Zaneveld J., Knight R. 2010a. QIIME allows analysis of
highthroughput community sequencing data. Nat. Methods 7, 335–336.
39. Caporaso J.G., Bittinger K., Bushman F.D., DeSantis T.Z., Andersen G.L., Knight R.
2010b. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.
Bioinformatics 26, 266–267.
40. Castro R.A., Quecine M.C., Lacava P.T., Batista B.D., Luvizotto D.M., Marcon
J., Ferreira A., Melo I.S., Azevedo J.L. 2014. Isolation and enzyme bioprospection of
endophytic bacteria associated with plants of Brazilian mangrove ecosystem.
Springerplus 28, 382.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 111
41. Cebron A., Norini M.P., Beguiristain T., Leyval C. 2008. Real-time PCR
quantification of PAH-ring hydroxylatingdioxygenase (PAH-RHDα) genes from
Gram positive and Gram negative bacteria in soil and sediment samples. J. Microbiol.
Meth. 73,148-159.
42. Certik M., Dercova K., Sejakova Z., Findova M., Jakubik T. 2003. Effect of
polyaromatic hydrocarbons (PAHs) on the membrane lipids of bacterial cell. Biologia
Bratislava 58, 1115-1121.
43. Chambers D.M., Reese C.M., Thornburg L.G., Sanchez E., Rafson J.P., Blount B.C.,
Ruhl J.R.E., De Jesus V.R. 2018. Distinguishing petroleum (crude oil and fuel) from
smoke exposure within populations based on the relative blood levels of benzene,
toluene, ethylbenzene, and xylenes (BTEX), styrene and 2,5-dimethylfuran by pattern
recognition using artificial neural networks. Environ. Sci. Technol. 52, 308-316.
44. Chuluun B., Shah S.H., Rhee J.S. 2014. Bio-augmented phytoremediation: A strategy
for reclamation of diesel oil-contaminated soils. Int. J. Agric. Biol. 16, 624–628.
45. Compant S., Clement C., Sessitach A. 2010. Plant growth–promoting bacteria in the
rhizo–and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and
prospects for utilization. Soil Biol. Biochem. 42, 669–678.
46. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement C., Barka E.A. 2005. Use of plant growth–
promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action,
and future prospects. Appl. Environ. Microbiol. 9, 4951–4959.
47. Compant S., Kaplan H., Sessitsch A., Nowak J., AitBarka E., Clement C. 2008.
Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Burkholderia phytofirmans strain
PsJN: from the rhizosphere to inflorescence tissues. FEMS Microbiol. Ecol. 63, 84–
93.
48. De Meyer S.E., De Beuf K., Vekeman B., Willems A. 2015. A large diversity of non-
rhizobial endophytes found in legume root nodules in Flanders (Belgium). Soil Biol.
Biochem 83, 1-11.
49. Doty S.L. 2008. Enhancing phytoremediation through the use of transgenics and
endophytes. New Phytol. 179, 318–333
50. Dourado M.N., Bogas A.C., Pomini A.M., Andreote F.D.,Quecine M.C., Marsaioli
A.J., Araujo W.L. 2014. Methylobacterium-plant interaction genes regulated by plant
exudates and quorum sensing molecules. Braz. J. Microbiol. 10, 1331-1339.
51. Dua M., Singh A., Sethunathan N., Johri A.K. 2002. Biotechnology and
bioremediation: successes and limitations. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2-3, 143.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 112
52. Dudai N., Tision I., Shamir S.Z., Nitzan N., Chaimovitsh D., Shachter A., Haim A.
2018. Agronomic and economic evaluation of Vetiver grass (Vetiveria zizanioides L.)
as means for phytoremediation of diesel polluted soils in Israel. J. Environ. Manage.
2011, 247-255.
53. Dzantor E. 2007. Perspectie Phytoremediation: the state of rhizosphere ‘engineering’
for accelerated rhizodegradation of xenobiotic contaminants. J. Chem. Technol. Biot.
82, 228-232.
54. Ebeltagy A., Nishioka K., Suzuki H., Sato T., Sato Y., Morisaki H., Mitsui H.,
Minamisawa K. 2000. Isolation and characterization of endophytic bacteria from wild
and traditionally cultivated rice varieties. Soil Sci. Plant Nutr. 46, 617–629.
55. Edgar R.C. 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.
Bioinformatics 26, 2460-2461.
56. Edgar R.C., Haas B.J., Clemente J.C., Quince C., Knight R. 2011. UCHIME improves
sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27, 2194–2200.
57. Edwards U., Rogall T., Blöcker H., Emde M., Böttger E.C. 1989. Isolation and direct
complete nucleotide determination of entire genes: characterization of a gene coding
for 16S ribosomal RNA. Nucl. Acids Res. 17, 7843–7853.
58. Elbeltagy A.K., Sato N.T., Suzuki H., Ye B., Hamada T., Isawa T., Mitsui H.,
Minamisawa K. 2001. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a
Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Appl. Environ. Microbiol. 67,
5285–5293.
59. Eskandary S., Tahmourespour A., Hoodaji M., Abdollahi A. 2017. The synergistic use
of plant and isolated bacteria to clean up polycyclic aromatic hydrocarbons from
contaminated soil. J. Environ. Health Sci. Eng. 15, doi 10.1186/s40201-017-0274-2.
60. Etesami H., Hosseini M., Alikhani H.A. 2014. In planta selection of plant growth
promoting endophytic bacteria for rice (Oryza sativa L.). J. Soil Sci. Plant Nutr. 14, 2,
491-503.
61. Farag S., Soliman N.A., Abdel-Fattah Y.R. 2018. Statistical optimization of crude oil
bio-degradation by a local marine bacterium isolate Pseudomonas sp. sp48. J. Genet.
Eng. Biotechnol. doi 10.1016/j.jgeb.2018.01.001.
62. Fatima K., Imran A., Amin I., Khan Q.M., Afzal M. 2016. Plant species affect
colonization patterns and metabolic activity of associated endophytes during
phytoremediation of crude oil-contaminated soil. Environ. Sci. Pollut. Res. 23, 6188–
6196.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 113
63. Fouts D.E., Tyler H.L., DeBoy R.T., Daugherty S., Ren Q., Badger J.H., Durkin A.S.,
Huot H., Shrivastava S., Kothari S., Dodson R.J., Mohamoud Y., Khouri H., Roesch
L.F.W., Krogfelt K.A., Struve C., Triplett E.W., Methé B.A. 2008. Complete genome
sequence of the N2 -fixing broad host range endophyte Klebsiella pneumoniae 342
and virulence predictions verified in mice. PLoS Genet. 4, e1000141 doi
10.1371/journal.pgen.1000141.
64. Franco S.S., Nardocci A.C., Günther W.M.R. 2008. PAH biomarkers for human
health risk assessment: a review of the state-of-the-art Cad. Saúde Pública, Rio de
Janeiro, 24, 569–580.
65. Frick C.M., Farrell R.E., Germida J.J. 1999. Assessment of phytoremediation as an in-
situ technique for cleaning oil-contaminated sites petroleum technology alliance of
Canada (PTAC), Calgary.
66. Gaiero J.R., Mccall C.A., Thompson K.A., Day N.J., Best A.S., Dunfield K.E. 2013.
Inside the root microbiome: bacterial root endophytes and plant growth promotion.
Am. J. Bot. 100, 1738-1750.
67. Gałązka A. 2015. Zanieczyszczenia gleb substancjami ropopochodnymi z
uwzględnieniem biologicznych metod ich oczyszczenia. Kosmos 1, 145-164.
68. Gamalero E., Lingua G., Caprì F.G., Fusconi A., Berta G., Lemanceau P. 2004.
Colonization pattern of primary tomato roots by Pseudomonas fluorescens A6RI
characterized by dilution plating, flow cytometry, fluorescence, confocal and scanning
electron microscopy. FEMS Microbiol. Ecol. 48, 79e87.
69. Gamalero E., Lingua G., Tombolini R., Avidano L., Pivato B., Berta G. 2005.
Colonization of tomato root seedling by Pseudomonas fluorescens 92rkG5: spatio-
temporal dynamics localization, organization, viability and culturability. Microb. Ecol.
50, 289e297.
70. Gao M., Teplitski M. 2003. Production of substances by Medicago truncatula that
affect bacterial quorum sensing. Mol. Plant Microbe Interact.16, 827–834.
71. Garbeva P., Overbeek L.S., Vuurde J.W.L, Elsas J.D. 2001. Analysis of endophytic
bacterial communities of potato by plating and denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE) of 16S rDNA based PCR fragments. Microb. Ecol. 41, 369–383.
72. Germaine K.J., Keogh E., Ryan D., Dowling D.N. 2009. Bacterial endophyte-
mediated naphthalene phytoprotection and phytoremediation. FEMS Microbiol. Lett.
296, 226–234.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 114
73. Glick B.R. 2012. Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications.
Hindawi Publishing Corporation Scientifica ID 963401.
74. Glick B.R. 2014. Bacteria with ACC deaminase can promote plant growth and help to
feed the world. Microbiol. Res. 169, 30-39.
75. Glick B.R., Todorovic B., Czarny J., Cheng Z., Duan J., McConkey B. 2007.
Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase. Crit. Rev. Plant Sci. 26, 227–
242.
76. Gocht T., Ligouis B., Hindere M., Grathwohl P. 2007. Accumulation of polycyclic
aromatic hydrocarbons in rural soils based on mass balances at the catchment scale.
Environ. Toxicol. Chem. 26, 591–600.
77. Gonzalez I., Cortes A., Neaman A., Rubio P. 2011. Biodegradable chelate enhances
the phytoextraction of copper by Oenothera picensis grown in copper-contaminated
acid soils. Chemosphere 84, 490–496.
78. Gordon A.S., Weber R.P. 1951. Colourimetric estimation of indole acetic acid. Plant
Physiol. 26, 192–195.
79. Gottel N.R., Castro H.F., Kerley M., Yang Z., Pelletier D.A., Podar M., Karpinets T.,
Uberbacher E., Tuskan G.A., Vilgalys R., Doktycz M.J., Schadt C.W. 2011. Distinct
microbial communities within the endosphere and rhizosphere of Populus deltoides
roots across contrasting soil types. Appl. Environ. Microbiol. 77, 5934–5944.
80. Graner G., Persson P., Meijer J., Alstrom S. 2003. A study on microbial diversity in
different cultivars of Brassica napus inrelation to its wilt pathogen, Verticillium
longisporum. FEMS Microbiol. Lett. 29, 269–276.
81. Guo P., Wang T., Liu Y., Xia Y., Wang G., Shen Z., Chen Y. 2014. Phytostabilization
potential of evening primrose (Oenothera glazioviana) for copper-contaminated sites.
Environ. Sci. Pollut. Res. 21, 631–640.
82. Guzik U., Wojcieszyńska D., Krysiak M., Kaczorek E. 2010. Mikrobiologiczny
rozkład alkanów ropopochodnych. Nafta-Gaz 11, 1019-1027.
83. Hall J., Soole K., Bentham R. 2011. Hydrocarbon phytoremediation in the family
Fabacea–a review. Int. J. Phytorem. 13, 317–332.
84. Hardoim P.R, Hardoim C.C.P., van Overbeek L.S., van Elsas J.D. 2012. Dynamics of
seed-borne rice endophytes on early plant growth stages. PLoS ONE 7, e30438.
85. Hardoim P.R., Overbeek L.S., Berg G., Pirttilä A.M., Compant S., Campisano A.,
Döring M., Sessitsch A. 2015. The hidden world within plants: ecological and
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 115
evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 79, 3293-320
86. Hardoim P.R., van Overbeek L.S., van Elsas J.D. 2008. Properties of bacterial
endophytes and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol. 10, 463-471.
87. Ho Y.N., Mathew D.C., Hsiao S.C., Shih C.H., Chien M.F., Chiang H.M., Huang C.C.
2012. Selection and application of endophytic bacterium Achromobacter xylosoxidans
strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants. J. Hazard. Mater.
219– 220, 43–49.
88. https://energy.usgs.gov/GeochemistryGeophysics/GeochemistryResearch/Organic
Originsof Petroleum.aspx
89. https://maps.google.com
90. Hung P.Q., Kumar S.M., Govindsamy V., Annapurna K. 2007. Isolation and
characterization of endophytic bacteria from wild and cultivated soybean varieties.
Biol. Fertil. Soils 44, 155–162.
91. Hurek T., Handley L.L., Reinhold-Hurek B., Piché Y. 2002. Azoarcus grass
endophytes contribute fixed nitrogen to the plant in an unculturable state. Mol. Plant
Microbe Interact. 15, 233e242.
92. Ijaz A., Imran A., Anwar ul Haq M., Khan Q.M., Afzal M. 2016. Phytoremediation:
recent advances in plant-endophytic synergistic interactions. Plant Soil 105, 179-195.
93. Ikeda S., Okubo T., Anda M., Nakashita H., Yasuda M., Sato S., Kaneko T., Tabata
S., Eda S., Momiyama A., Terasawa K., Mitsui H., Minamisawa K. 2010. Community
and genome-based views of plant-associated bacteria: plant–bacterial interactions in
soybean and rice. Plant Cell Physiol. 51, 1398–1410.
94. Kaimi E., Mukaidani T., Miyoshi S., Tamaki M. 2006. Ryegrass enhancement of
biodegradation in diesel-contaminated soil. Environ. Exp. Bot. 55, 110–119.
95. Kamath R., Rentz J.A., Schnoor J.L., Alvarez P.J.J. 2004. Petroleum biotechnology.
Developments and perspectives studies in surface science and catalysis, Elsevier
Science, Oxford.
96. Khan A.H.A., Ayaz M., Arshad M., Yousaf S., Khan M.A., Anees M., Sultan A.,
Nawaz I., Iqbal M. 2017. Biogeochemical cycle, occurrence and biological treatments
of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Iran J. Sci. Technol. Trans. Sci. doi
10.1007/s40995-017-0393-8.
97. Khan S., Afzal M., Iqbal S., Khan Q.M. 2013. Plant-bacteria partnerships for the
remediation of hydrocarbon contaminated soils. Chemosphere 4, 1317–1332.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 116
98. Kim S.J., Kweon O., Jones R.C., Freeman J.P., Edmondson R.D., Cerniglia C.E.
2007. Complete and integrated pyrene degradation pathway in Mycobacterium
vanbaalenii PYR-1 based on systems biology. J. Bacteriol. 189, 464–472.
99. Kirk J.L., Klironomos J.N., Lee H., Trevors J.T. 2005. The effects of perennial
ryegrass and alfalfa on microbial abundance and diversity in petroleum contaminated
soil. Environ. Pollut. 133, 455–465.
100. Kloepper J.W., Ryu C.M., Zhang S. 2004. Induced systemic resistance and
promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology 94, 1259–1266.
101. Kołwzan B. 2008. Ocena przydatności inokulantów do bioremediacji gleby
zanieczyszczonej produktami naftowymi. Ochrona Środowiska 30, 3-14.
102. Kołwzan B. 2011. Analiza zjawiska biofilmu–warunki jego powstawania
i funkcjonowania. Ochrona Środowiska 33, 3-14.
103. Kubiak M.S. 2013. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA)–ich
występowanie w środowisku i w żywności. Probl. Hig. Epidemiol. 94, 31-36.
104. Kukla M., Cania B., Płociniczak T., Piotrowska-Seget Z. 2014a. Fitoremediacja
terenów skażonych związkami ropopochodnymi z wykorzystaniem bakterii
endofitycznych. Przemysł Chemiczny 93, 355-359
105. Kukla M., Płociniczak T., Piotrowska-Seget Z. 2014b. Diversity of endophytic
bacteria in Lolium perenne and their potential to degrade petroleum hydrocarbons and
promote plant growth. Chemosphere 117, 40-46.
106. Kuklinsky-Sobral J., Araújo W.L., Mendes R., Geraldi I.O., Pizzirani-Kleiner A.A.,
Azevedo J.L. 2004. Isolation and characterization of soybean-associated bacteria and
their potential for plant growth promotion. Environ. Microbiol. 6, 1244–1251.
107. Lang F.S., Destain J., Delvigne F., Druart P., Ongena M., Thonart P. 2016.
Characterization and evaluation of the potential of a diesel-degrading bacterial
consortium isolated from fresh mangrove sediment. Water Air Soil Pollut. 227, doi
10.1007/s11270-016-2749-7.
108. Laranjo M., Alexandre A., Oliveira A. 2014. Legume growth-promoting rhizobia:
An overview on the Mesorhizobium genus. Microbiol. Res. 169, 2-17.
109. Lemanceau P., Corberand T., Gardan L., Latour X., Laguerre G., Boeufgras
J., Alabouvette C. 1995. Effect of 2 plant-species, flax (Linum usitatissinum L) and
tomato (Lycopersicon esculentum Mill), on the diversity of soilborne populations of
fluorescent pseudomonads. Appl. Environ. Microbiol. 61, 1004-1012.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 117
110. Liu R., Jadeja R.N., Zhou Q., Liu Z. 2012. Treatment and remediation of petroleum-
contaminated soils using selective ornamental plants. Environ. Eng. Sci. 29, 494–501.
111. Logeshwaran P., Megharaj M., Chadalavada S., Bowman M., Naidu R. 2018.
Petroleum hydrocarbons (PH) in groundwater aquifers: An overview of environmental
fate, toxicity, microbial degradation and risk-based remediation approaches. Environ.
Technol. Innovation doi 10.1016/j.eti.2018.02.001.
112. Lorck H. 1948. Production of hydrocyanic acid by bacteria. Physiol. Plantarum 1,
142–146.
113. Lozupone C.A., Knight R. 2007. Global patterns in bacterial diversity. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 104, 11436–11440.
114. Lumactud R., Shen S.Y., Lau M., Fulthorpe R. 2016. Bacterial endophytes isolated
from plants in natural oil seep soils with chronic hydrocarbon contamination. Front.
Microbiol. 7, 755.
115. Łyszcz M., Gałązka A. 2016. Wybrane metody molekularne wykorzystywane w
ocenie bioróżnorodności mikroorganizmów glebowych. Post. Mikrobiol. 55, 309-319.
116. Ma B., Lv X., Warren A., Gong J. 2013. Shifts in diversity and community structure
of endophytic bacteria and archaea across root, stem and leaf tissues in the common
reed, Phragmites australis, along a salinity gradient in a marine tidal wetland of
northern China. Antonie Van Leeuwenhoek 104, 759–768.
117. Ma Y., Oliveira R.S., Freitas H., Zhang C. 2016. Biochemical and molecular
mechanisms of plant-microbe-metal interactions: relevance for phytoremediation.
Front. Plant Sci. 7, 918.
118. Małachowska-Jutsz A., Janosz W., Rudek J. 2012. Toksyczność gleby
zanieczyszczonej olejem silnikowym poddanej samooczyszczaniu oraz fitoremediacj.
Ochrona Środowiska 34, 15-20.
119. Maliszewska-Kordybach B., Smreczak B., Klimkowicz-Pawlas A., Terelak H. 2008.
Monitoring of the total content of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in arable
soils in Poland. Chemosphere 73, 1284–1291.
120. Marecik R., Króliczak P., Cyplik P. 2006. Fitoremediacja—alternatywa dla
tradycyjnych metod oczyszczania środowiska. Biotechnologia 3, 88—97.
121. Maropola M.K., Ramond J.B., Trindade M. 2015. Impact of metagenomic DNA
extraction procedures on the identifiable endophytic bacterial diversity in Sorghum
bicolor (L. Moench). J. Microbiol. Methods 112, 104–117.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 118
122. Martinez-Garcia P.M., Ruano-Rosa D., Schilirò E., Prieto P., Ramos C., Rodríguez-
Palenzuela P., Mercado-Blanco J. 2015. Complete genome sequence of Pseudomonas
fluorescens strain PICF7, an indigenous root endophyte from olive (Olea europaea L.)
and effective biocontrol agent against Verticillium dahlia. Stand. Genomic Sci. 10, 10.
123. Mayak S., Tirosh T., Glick B.R. 2004. Plant growth–promoting bacteria that confer
resistance to water stress in tomato and pepper. Plant Sci. 166, 525–530.
124. McGuinness M., Dowling D. 2009. Plant-associated bacterial degradation of toxic
organic compounds in soil. Int. J. Env. Res. Publ. Hlth. 6, 2226–2247.
125. Mercado-Blanco J., Lugtenberg B.J.J. 2014. Biotechnological applications of
bacterial endophytes. Curr. Biotechnol. 3, 60-75.
126. Mrozik A., Piotrowska-Seget Z., Łabużek S. 2003. Bacterial degradation and
bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Pol. J. Environ. Stud. 12, 15–25.
127. Mrozik A., Piotrowska-Seget Z., Łabużek S. 2005. Bacteria in bioremediation of
hydrocarbon-contaminated environments. Post. Mikrobiol. 44, 227–238.
128. Mueller K.E., Shann J.R. 2006. PAH dissipation in spiked soil: impacts of
bioavailability, microbial activity, and trees. Chemosphere 64, 1006–1014.
129. Muller H., Berg C., Landa B.B., Auerbach A., Moissl-Eichinger C., Berg G. 2015.
Plant genotype-specific archaeal and bacterial endophytes but similar Bacillus
antagonists colonize Mediterranean olive trees. Front.Microbiol. 6, 138.
130. Murinowa S., Dercova K. 2014. Response mechanisms of bacterial degraders to
environmental contaminants on the level of cell walls and cytoplasmic membrane. Int.
J. Microbiol. 873081, doi 10.1155/2014/873081.
131. Naveed M., Mitter B., Yousaf S., Pastar M., Afzal M., Sessitsch A. 2014. The
endophyte Enterobacter sp. FD17: a maize growth enhancer selected based on
rigorous testing of plant beneficial traits and colonization characteristics. Biol. Fertil.
Soils 50, 249–262.
132. Nie Y., Chi Ch.Q., Fang H., Liang J.L., Lu S.L., Lai G.L., Tang Y.Q., Wu X.L.
2014. Diverse alkane hydroxylase genes in microorganisms and environments. Sci.
Rep. 4, 4968.
133. Nyyssonen M. 2009. Functional genes and gene array analysis as tools for
monitoring hydrocarbon biodegradation. VTT Publications 711.
134. Okunishi S., Sako K., Mano H., Imamura A., Morisaki H. 2005. Bacterial flora of
endophytes in the maturing seed of cultivated rice (Oryza sativa). Microbes Environ.
20, 168–177.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 119
135. Oliveira A.L.M., de Lima Canuto E., Reis V.M., Baldani J.I. 2003. Response of
micropropagated sugarcane varieties to inoculation with endophytic diazotrophic
bacteria. Braz. J. Microbiol. 34, 59–61.
136. Oliveira M.N., Santos T.M., Vale H.M., Delvaux J.C., Cordero A.P., Ferreira A.B.,
Miguel P.S., Tótola M.R., Costa M.D., Moraes C.A., Borges A.C. 2013. Endophytic
microbial diversity in coffee cherries of Coffea arabica from southeastern Brazil. Can.
J. Microbiol. 59, 221–230.
137. Oliveira V., Gomes N.C.M., Almeida A., Silva A.M.S., Simões M.M.Q., Smalla K.,
Cunha Â. 2014. Hydrocarbon contamination and plant species determine the
phylogenetic and functional diversity of endophytic degrading bacteria. Mol. Ecol. 23,
1392–1404.
138. Pacwa-Płociniczak M., Płaza G.A., Piotrowska-Seget Z., Cameotra S.S. 2011.
Environmental applications of biosurfactants: recent advances. Int. J. Mol. Sci. 18,
633-654.
139. Pacwa-Płociniczak M., Płaza G.A., Poliwoda A., Piotrowska-Seget Z. 2014.
Characterization of hydrocarbon-degrading and biosurfactant-producing Pseudomonas
sp. P-1 strain as a potential tool for bioremediation of petroleum-contaminated soil.
Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 21, 9385-9395.
140. Palaniappan P., Chauhan P.S., Saravanan V.S., Anandham R., Sa T. 2010. Isolation
and characterization of plant growth promoting endophytic bacterial isolates from root
nodule of Lespedeza sp. Biol. Fertil. Soils 46, 807–816.
141. Pandya M., Rajput M., Rajkumar S. 2015. Exploring plant growth promoting
potential of non rhizobial root nodules endophytes of Vigna radiate. Microbiology 84,
80–89.
142. Parthipan P., Preetham E., Machuca L.L., Rahman P.K.S.M., Murugan K., Rajasekar
A. 2017. Biosurfactant and degradative enzymes mediated crude oil degradation by
bacterium Bacillus subtilis A1. Front. Microbiol. 8, doi 10.3389/fmicb.2017.00193.
143. Paskova V., Hilscherová K., Feldmannová M., Bláha L. 2006. Toxic effects and
oxidative stress in higher plants exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons and
their N-heterocyclic derivatives. Environ. Toxicol. Chem. 25, 3238-3245.
144. Pawlik M., Cania B., Thijs S., Vangronsveld J. 2017. Hydrocarbon degradation
potential and plant growth-promoting activity of culturable endophytic bacteria of
Lotus corniculatus and Oenothera biennis from a long-term polluted site. Environ.
Sci. Pollut. Res. 24, 19640-19652.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 120
145. Pawlik M., Piotrowska-Seget Z. 2015. Endophytic bacteria associated with
Hieracium piloselloides: their potential for hydrocarbon-utilizing and plant growth-
promotion. J. Toxicol. Env. Heal. A 78, 860-870.
146. Pawlik M., Płociniczak T., Piotrowska-Seget Z. 2015. Bakterie endofityczne i ich
znaczenie w mikrobiologii środowiskowej, medycynie i przemyśle. Post. Mikrobiol.
54, 115–122.
147. Peng A., Liu J., Gao Y., Chen Z. 2013. Distribution of endophytic bacteria in
Alopecurus aequalis Sobol and Oxalis corniculata L. from soils contaminated by
polycyclic aromatic hydrocarbons. PLoS ONE 8, 12.
148. Peng S., Zhou Q., Cai Z., Zhang Z. 2009. Phytoremediation of petroleum
contaminated soils by Mirabilis Jalapa L. in a greenhouse plot experiment. J. Hazard.
Mater. 168, 1490-1496.
149. Pereira S.I.A., Monteiro C., Vega A.L., Castro P.M.L. 2016. Endophytic culturable
bacteria colonizing Lavandula dentata L. plants: Isolation, characterization and
evaluation of their plant growth-promoting activities. Ecol. Eng. 87, 91–97.
150. Phillips L.A., Germida J.J., Farrell R.E., Greer C.W. 2008. Hydrocarbon degradation
potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants. Soil Biol.
Biochem. 12, 3054-3064.
151. Pikovskaya R.I. 1948. Mobilization of phosphorus in soil connection with vital
capacity of source microbial species. Microbiologiya 17, 362-370.
152. Piński A., Hupert-Kocurek K. 2016. Genetyczne podłoże oddziaływań bakterii
endofitycznych z roślinami. Post. Mikrobiol. 55, 404-412.
153. Pisarska K., Pietr S.J. 2014. Bakterie endofityczne–ich pochodzenie i interakcje
z roślinami. Post. Mikrobiol. 53, 141-151.
154. PN-EN ISO 16703. Jakość gleby-Oznaczanie zawartości węglowodorów w zakresie
od C10 do C40 metodą chromatografii gazowej.
155. Pointing S.B. 1999. Qualitative methods for the determination of lignocellulolytic
enzyme production by tropical fungi. Fungal Divers. 2, 17–33.
156. Porteous-Moore F.P., Barac T., Borremans B., Oeyen L., Vangronsveld J., van der
Lelie D., Campbell C.D., Moore E.R. 2006. Endophytic bacterial diversity in poplar
trees growing on a BTEX-contaminated site: the characterisation of isolates with
potential to enhance phytoremediation. Syst. Appl. Microbiol. 7, 539-556.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 121
157. Powell S.M., Ferguson S.H., Bowman J.P., Snape I. 2006. Using real-time PCR to
assess changes in the hydrocarbon-degrading microbial community in Antarctic soil
during bioremediation. Microbiol. Ecol. 52 , 523–532.
158. Preston G.M. 2004. Plant perceptions of plant growth-promoting Pseudomonas.
Phil.Trans. R. Soc. Lond. B. 359, 907–918.
159. Qin S., Miao Q., Feng W.W., Wang Y., Zhu X., Xing K., Jiang J.H. 2015.
Biodiversity and plant growth promoting traits of culturable endophytic actinobacteria
associated with Jatropha curcas L. growing in Panxi dry-hot valley soil. Appl. Soil
Ecol. 93, 47–55.
160. Quince C., Lanzén A., Curtis T.P., Davenport R.J., Hall N., Head I.M., Read L.F.,
Sloan W.T. 2009. Accurate determination of microbial diversity from 454
pyrosequencing data. Nat. Methods 6, 639–641.
161. Raaijmakers J.M., de Bruijn I., de Kock M.J.D. 2006. Cyclic lipopeptide production
by plant-associated Pseudomonas spp.: diversity, activity, biosynthesis, and
regulation. Mol. Plant-Microbe Interact. 19, 699–710.
162. Rajendran G., Sing F., Desai A.J., Archana G. 2008. Enhanced growth and
nodulation of pigeon pea by co-inoculation of Bacillus strains with Rhizobium spp.
Bioresour. Technol. 99, 4544–4550.
163. Rakowska J., Radwan K., Ślosorz Z., Pietraszek E., Łudzik M., Suchorab P. 2012.
Usuwanie substancji ropopochodnych z dróg i gruntów. Centrum naukowo-badawcze
ochrony przeciwpożarowej im. Józefa Tuliszkowskiego. Państwowy Instytut
Badawczy, Józefów.
164. Rasche F., Lueders T., Schloter M., Schaefer S., Buegger F., Gattinger A., Hood-
Nowotny R.C., Sessitsch A. 2009. DNA-based stable isotope probing enables the
identification of active bacterial endophytes in potatoes. New Phytologist. 181,
802e807.
165. Reinhold-Hurek B., Hurek T. 2011. Living inside plants: bacterial endophytes. Curr.
Opin. Plant Biol.14, 435–443.
166. Reinhold-Hurek B., Hurek T. 1998. Interactions of gramineous plants with Azoarcus
spp. and other diazotrophs: identification, localization, and perspectives to study their
function. Crit. Rev. Plant Sci. 17, 29–54.
167. Reinhold-Hurek B., Maes T., Gemmer S., van Montagu M., Hurek T. 2006. An
endoglucanase is involved in infection of rice roots by the not-cellulose-metabolizing
endophyte Azoarcus sp. strain BH72. Mol. Plant Microbe Interact. 19, 181–188.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 122
168. Romero F.M., Marina M., Pieckenstain F.L. 2014. The communities of tomato
(Solanum lycopersicum L.) leaf endophytic bacteria, analyzed by 16S-ribosomal RNA
gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Lett. 351, 187-94.
169. Rosenblueth M., López-López A., Martínez J., Rogel M.A., Toledo I., Martínez-
Romero I. 2010. Seed bacterialendophytes: common genera, seed-to-seed variability
andtheir possible role in plants. Acta Hort 938, 39–48.
170. Rosenblueth M., Martinez–Romero E. 2006: Bacterial endophytes and their
interaction with host. Mol. Plant-Microbe Inter. 19, 827–837.
171. Rudrappa T., Czymmek K.J., Pare P.W., Bais H.P. 2008. Root-secreted malic acid
recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148, 1547–1556.
172. Rusin M., Gospodarek J., Nadgórska-Socha A. 2015. The effect of petroleum-
derived substances on the growth and chemical composition of Vicia faba L. Pol. J.
Environ. Stud. 24, 2157-2166.
173. Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N. 2008. Bacterial
endophytes: Recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett. 278, 1-9.
174. Sadrnia M., Maksimava N., Khromsova E., Stanislavitch S., Owlia P.,
Marjomandzadegan M. 2011. Study the effect of bacterial 1–aminocyclopropane–1–
carboxylate deaminase (ACC deaminase) on resistance to salt stress in tomato plant.
Fascicula Biologie 2, 120–123.
175. Saleem H. 2016. Plant-bacteria partnership: phytoremediation of hydrocarbons
contaminated soil and expression of catabolic genes. Bulletin of Environmental
Studies 1, 18-28.
176. Sanchez-Lopez A.S., Thijs S., Beckers B., González-Chávez M.C., Weyens N.,
Carrillo-González R., Vangronsveld J. 2017. Community structure and diversity of
endophytic bacteria in seeds of three consecutive generations of Crotalaria pumila
growing on metal mine residues. Plant Soil, doi 10.1007/s11104-017-3176-2.
177. Sanderman H. 1992. Plant metabolism of xenobiotics. TIBS 17, 82–84.
178. Santoyo G., Moreno-Hagelsieb G., Orozco-Mosqueda M.O., Glick B.R. 2016. Plant
growth-promoting bacterial endophytes. Microbiol. Res. 183, 92–99.
179. Schwyn B., Neilands J.B. 1987. Universal chemical assay for the detection and
determination of siderophores. Anal. Biochem. 160, 47-56.
180. Seghers D., Wittebolle L., Top E.M., Verstraete W., Siciliano S.D. 2004. Impact of
agricultural practices on the Zea mays L. endophytic community. Appl. Environ.
Microbiol. 70, 1475–1482.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 123
181. Sen M.K., Jamal M.A.H.M., Nasrin S. 2013. Sterilization factors affect seed
germination and proliferation of Achyranthes aspera cultured in vitro. Environ. Exper.
Biol. 11, 119–123.
182. Seo J.S., Keum Y.S., Li Q.X. 2009. Bacterial degradation of aromatic compounds.
Int. J. Environ. Res. Public Health. 6, 278-309.
183. Sessitsch A., Coenye T., Sturz A.V., Vandamme P., AitBarka E., Salles J.F., van
Elsas J.D., Faure D., Reiter B., Glick B.R., Wang-Pruski G., Nowak J. 2005.
Burkholderia phytofirmans sp. nov., a novel plant-associated bacterium with plant-
beneficial properties. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1187–1192.
184. Sessitsch A., Hardoim P., Döring J., Weilharter A., Krause A., Woyke T., Mitter
B., Hauberg-Lotte L., Friedrich F., Rahalkar M., Hurek T., Sarkar A., Bodrossy
L., van Overbeek L., Brar D., van Elsas J.D., Reinhold-Hurek B. 2012. Functional
characteristics of an endophyte community colonizing rice roots as revealed by
metagenomic analysis. Mol. Plant Microbe Interact. 25, 28-36.
185. Sessitsch A., Kuffner M., Kidd P., Vangronsveld J., Wenzel W., Fallmann K.,
Puschenreiter M. 2013. The role of plant-associated bacteria in the mobilization and
phytoextraction of trace elements in contaminated soils. Soil Biol. Biochem. 60, 182-
194.
186. Sgroy V., Cassán F., Masciarelli O., Florencia M., Papa D., Lagares A., Luna V.
2009. Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting (PGPB) or
stress homeostasis-regulating (PSHB) bacteria associated to the halophyte Prosopis
strombulifera. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 371–381.
187. Shi Y., Lou K., Li Ch. 2009. Promotion of plant growth by phytohormone-producing
endophytic microbes of sugar beet. Biol. Fertil. Soils 45, 645–653.
188. Shi Y., Yang H., Zhang T., Sun J., Lou K. 2014. Illumina-based analysis of
endophytic bacterial diversity and space-time dynamics in sugar beet on the north
slope of Tianshan mountain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 6375-6385.
189. Shi Y., TaPa M., Li C., Yang H., Zhang T., Gao Y., Sun J., Zeng J., Lin Q., Cao
Z., OuTi K., Li Y., Lou K. 2015. Diversity and space-time dynamics of endophytic
archaea from sugar beet in the north slope of Tianshan Mountain revealed by 454
pyrosequencing and T-RFLP. World J. Microbiol. Biotechnol. 31, 1031-1039.
190. Shirdam R., Zand A., Bidhendi G., Mehrdadi N. 2008. Phytoremediation of
hydrocarbon-contaminated soils with emphasis on the effect of petroleum
hydrocarbons on the growth of plant species. Phytoprotection 89, 21–29.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 124
191. Siciliano S.D., Fortin N., Mihoc A., Wisse G., Labelle S., Beaumier D., Ouellette D.,
Roy R., Whyte L.G., Banks M.K., Schwab P., Lee K., Greer C.W. 2001. Selection of
specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination.
Appl. Environ. Microbiol. 6, 2469-2475.
192. Sikkema J., de Bont J.A., Poolman B. 1995. Mechanisms of membrane toxicity of
hydrocarbons. Microbiol Rev. 59, 201-222.
193. Soleimani M., Afyuni M., Hajabbasi A.M., Nourbakhsh F., Sabzalian M.R.,
Christensen J.H. 2010. Phytoremediation of aged petroleum contaminated soil using
endophyte infected and non–infected grasses. Chemosphere 81, 1084–1090.
194. Souza R., Ambrosini A., Passaglia L.M.P. 2015. Plant growth-promoting bacteria as
inoculants in agricultural soils. Genet. Mol. Biol. 38, 401-419.
195. Souza S.A., Xavier A.A., Costa M.R., Cardoso A.M., Pereira M.C., Nietsche S.
2013. Endophytic bacterial diversity in banana 'Prata Anã' (Musa spp.) roots. Genet.
Mol. Biol. 36, 252-64.
196. Spaepen S., Vanderleyden J. 2011. Auxin and plant-microbe interactions. Cold
Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a001438.
197. Steliga T. 2014. Ocena efektywności biodegradacji węglowodorów ropopochodnych
w zastarzałym odpadzie z dołu urobkowego Graby-59 w warunkach przemysłowych
metodą in-situ. Nafta-Gaz 6, 351-364.
198. Stępniewska Z., Kuźniar A. 2013. Endophytic microorganisms—promising
applications in bioremediation of greenhouse gases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97,
9589–9596.
199. Stolz A. 2009. Molecular characteristics of xenobiotic-degrading sphingomonads.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 793–811.
200. Su J., Ouyang W., Hong Y., Liao D., Khan S., Li H. 2016. Responses of endophytic
and rhizospheric bacterial communities of salt marsh plant (Spartina alterniflora) to
polycyclic aromatic hydrocarbons contamination. J. Soils Sediments 16, 707-715.
201. Subramanian P., Kim K., Krishnamoorthy R., Sundaram S., Sa T. 2015. Endophytic
bacteria improve nodule function and plant nitrogen in soybean on co-inoculation
with Bradyrhizobium japonicum MN110. Plant Growth Regul. 76, 327-332.
202. Sun K., Liu J., Jin L., Gao Y. 2014. Utilizing pyrene-degrading endophytic bacteria
to reduce the risk of plant pyrene contamination. Plant Soil 374, 251-262.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 125
203. Sun L., Qiu F., Zhang X., Dai X., Dong X., Song W. 2008. Endophytic bacterial
diversity in rice (Oryza sativa L.) roots estimated by 16S rDNA sequence analysis.
Microb. Ecol. 55, 415–424.
204. Sun Y., Cheng Z., Glick B.R. 2009. The presence of a 1-aminocyclopropane-1-
carboxylate (ACC) deaminase deletion mutational ters the physiology of the
endophytic plant growth-promoting bacterium Burkholderia phytofirmans PsJN.
FEMS Microbiol. Lett. 296, 131-136.
205. Taghavi S., Garafola C., Monchy S., Newman L., Hoffman A., Weyens N., Barac T.,
Vangronsveld J., van der Lelie D. 2009. Genome survey and characterization of
endophytic bacteria exhibiting a beneficial effect on growth and development of
poplar trees. Appl. Environ. Microbiol. 75, 748-757.
206. Taghavi S., van der Lelie D., Hoffman A., Zhang Y.B., Walla M.D., Vangronsveld
J., Newman L., Monchy S. 2010. Genome sequence of the plant growth promoting
endophytic bacterium Enterobacter sp. 638. Plos Genetics 6, e1000943.
207. Tang J., Wang R., Niu X., Zhou Q. 2010. Enhancement of soil petroleum
remediation by using a combination of ryegrass (Lolium perenne) and different
microorganisms. Soil Till. Res. 110, 87–93.
208. Tardif S., Yergeau É., Tremblay J., Legendre P., Whyte L.G., Greer C.W. 2016. The
willow microbiome is influenced by soil petroleumhydrocarbon concentration with
plant compartment-specific effects. Front. Microbiol. 7, 1363.
209. Thapa B., Kumar A.K.C., Ghimire A. 2012. A review on bioremediation of
petroleum hydrocarbon contaminants in soil. Kathmandu University Journal Of
Science, Engineering And Technology 8, 164-170.
210. Thijs S., van Dillewijn P., Sillen W., Truyens S., Holtappels M., D´Haen J., Carleer
R., Weyens N., Ameloot M., Ramos J.L., Vangronsveld J. 2014. Exploring the
rhizospheric and endophytic bacterial communities of Acer pseudoplatanus growing
on a TNT-contaminated soil: towards the development of a rhizocompetent TNT-
detoxifying plant growth promoting consortium. Plant Soil 385, 15–36.
211. Tran P.N., Tan N.E.H., Lee Y.P., Gan H.M., Polter S.J., Dailey L.K., Hudson A.O.,
Savka M.A. 2015. Whole-genome sequence and classification of 11 endophytic
bacteria from poison ivy (Toxicodendron radicans). Genome Announc. 3, e01319-15.
212. Truyens S., Beckers B., Thijs S., Weyens N., Cuypers A., Vangronsveld J. 2016.
Cadmium-induced and transgenerational changes in the cultivable and total seed
endophytic community of Arabidopsis thaliana. Plant Biol. 18, 376-381.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 126
213. Truyens S., Weyens N., Cuypers A., Vangronsveld J. 2015. Bacterial seed
endophytes: genera, vertical transmission and interaction with plants. Environ.
Microbiol. Rep. 7, 40-50.
214. Tsurumaru H., Okubo T., Okazaki K., Hashimoto M., Kakizaki K., Hanzawa E.,
Takahashi H., Asanome N., Tanaka F., Sekiyama Y., Ikeda S., Minamisawa K. 2015.
Metagenomic analysis of the bacterial community associated with the taproot of sugar
beet. Microbes Environ. 30, 63–69.
215. Ujowundu C.O., Kalu F.N., Nwaoguikpe R.N., Kalu O.I., Ihejirika C.E.,
Nwosunjoku E.C., Okechukwu R.I. 2011. Biochemical and physical characterization
of diesel petroleum contaminated soil in southeastern Nigeria. Res. J. Chem. Sci. 1,
57-62.
216. Ukalska-Jaruga A., Smreczak B., Klimkowicz-Pawlas A., Maliszewska-Kordybach
B. 2015. Rola materii organicznej w procesach akumulacji trwałych zanieczyszczeń
organicznych (TZO) w glebach. Polish Journal of Agronomy 20, 15–23.
217. van Beilen J.B., Funhoff E.G., van Loon A., Just A., Kaysser L., Bouza M.,
Holtackers R., Rothlisberger M., Li Z., Witholt B. 2006. Cytochrome P450 alkane
hydroxylases of the CYP153 family are common in alkane-degrading eubacteria
lacking integral membrane alkane hydroxylases. Appl. Environ. Microbiol. 72, 59–65.
218. van Bogaert I.N.A., Groeneboer S., Saerens K., Soetaert W. 2011. The role of
cytochrome P450 monooxygenases in microbial fatty acid metabolism. FEBS J. 278,
206–221.
219. van Epps A. 2006. Environmental protection agency office of solid waste and
emergency response office of superfund remediation and technology innovation.
Washington.
220. van Overbeek L., van Elsas J.D. 2008. Effects of plant genotype and growth stage on
the structure of bacterial communities associatedwith potato (Solanum tuberosum L.).
FEMS Microbiol. Ecol. 64, 283-296.
221. Vangronsveld J., Herzig R., Weyens N., Boulet J., Adriaensen K., Ruttens A.,
Thewys T., Vassilev A., Meers E., Nehnevajova E., van der Lelie D., Mench M. 2009.
Phytoremediation of contaminated soils and groundwater: lessons from the field.
Environ. Sci. Pollut. Res. 16, 765–794.
222. Vargas L., Santa Brígida A.B., Mota Filho J.P., de Carvalho T.G., Rojas C.A.,
Vaneechoutte D., van Bel M., Farrinelli L., Ferreira P.C.G., Vandepoele K., Hermely
A.S. 2014. Drought tolerance conferred to sugarcane by association with
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 127
Gluconacetobacter diazotrophicus: a transcriptomic view of hormone pathways. PLoS
ONE 9, e114744.
223. Velho R.V., Medina L.F.C., Segalin J., Brandelli A. 2011. Production of lipopeptides
among Bacillus strains showing growth inhibition of phytopathogenic fungi. Folia
Microbiol. 56, 297–303.
224. Verma S.C., Ladha J.K., Tripathi A.K. 2001. Evaluation of plant growth promoting
and colonization ability of endophytic diazotrophs from deep water rice. J. Biotechnol.
91, 127–141.
225. Verma V.C., Singh S.K., Prakash S. 2011. Bio-controland plant growth promotion
potential of siderophore producing endophytic Streptomyces from Azadira chtaindica
A. Juss. J.Basic Microbiol. 51,550–556.
226. Wagner M.R., Lundberg D.S., Rio T.G., Tringe S.G., Dangl J.L., Olds T.M. 2016.
Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.
Nat. Commun. 7, 12151.
227. Wang D., Xie Y., Jaisi D.P., Jin Y. 2016a. Effects of low-molecular-weight organic
acids on the dissolution of hydroxyapatite nanoparticles. Environ. Sci. Nano. 3, 768-
779.
228. Wang M., Yang P., Falcão Salles J. 2016b. Distribution of root-associated bacterial
communities along a salt-marsh primary succession. Front. Plant Sci. 6, 1188.
229. Wang Y., Li H., Zhao W., He X., Chen J., Geng X., Xiao M. 2010. Induction of
toluene degradation and growth promotion in corn and wheat by horizontal gene
transfer within endophytic bacteria. Soil Biol. Biochem 42, 1051–1057.
230. Wemheuer F., Kaiser K., Karlovsky P., Daniel R., Vidal S., Wemheuer B. 2017.
Bacterial endophyte communities of three agricultural important grass species differ in
their response towards management regimes. Sci. Rep. 7, 40914.
231. Weyens N., Taghavi S., Barac T., van der Lelie D., Boulet J., Artois T., Carleer R.,
Vangronsveld J. 2009a. Bacteria associated with Oak and Ash on a TCE-contaminated
site: characterization of isolates with potential to avoid evapotranspiration. Environ.
Sci. Pollut. Res. 16, 830–843.
232. Weyens N., van der Lelie D., Artois T., Smeets K., Taghavi S., Newman L., Carleer
R., Vangronsveld J. 2009b. Bioaugmentation with engineered endophytic bacteria
improves phytoremediation. Environ. Sci. Technol. 43, 9413-9418.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 128
233. Weyens N., van der Lelie D., Taghavi S., Newman L., Vangronsveld J. 2009c.
Exploiting plant–microbe partnerships for improving biomass production and
remediation. Trends Biotechnol. 27, 591-598.
234. Weyens N., van der Lelie D., Taghavi S., Vangronsveld J. 2009d. Phytoremediation:
plant-endophyte partnerships take the challenge. Curr. Opin. Biotechnol. 2, 248-254.
235. Wu X., Monchy S., Taghavi S., Zhu W., Ramos J., van der Lelie D. 2010.
Comparative genomics and functional analysis of niche-specific adaptation in
Pseudomonas putida. FEMS Microbiol. Rev. 35, 299–323.
236. Xu J.Y., Han Y.H., Chen Y., Zhu L.J., Ma L.Q. 2016. Arsenic transformation and
plant growth promotion characteristics of As-resistant endophytic bacteria from As-
hyperaccumulator Pteris vittata. Chemosphere 144, 1233-1240.
237. Xu Y., Sun G.D., Jin J.H., Liu Y., Luo M., Zhong Z.P., Liu Z.P. 2014. Successful
bioremediation of an aged and heavily contaminated soil using a microbial/plant
combination strategy. J. Hazard. Mater. 264, 430-438.
238. Yang P., Sun Z., Liu S., Lu H., Zhou Y., Sun M. 2013. Combining antagonistic
endophytic bacteria in different growth stages of cotton for control of Verticillium
wilt. Crop Prot. 47, 17–23.
239. Ying X., Dongmei G., Judong L., Zhenyu W. 2011. Plant-microbe interactions to
improve crude oil degradation. Energy Procedia 5, 844–848.
240. Yousaf S., Afzal M., Reichenauer T.G., Brady C.L., Sessitsch A. 2011. Hydrocarbon
degradation, plant colonization and gene expression of alkane degradation genes by
endophytic Enterobacter ludwigii strains. Environ. Pollut. 10, 2675-2683.
241. Yousaf S., Andria V., Reichenauer T.G, Smalla K., Sessitsch A. 2010a. Phylogenetic
and functional diversity of alkane degrading bacteria associated with Italian ryegrass
(Lolium multiflorum) and Birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus) in a petroleum oil-
contaminated environment. J. Hazard. Mater. 1-3, 523-532.
242. Yousaf S., Ripka K., Reichenauer T.G., Andria V., Afzal M., Sessitsch A. 2010b.
Hydrocarbon degradation and plant colonization by selected bacterial strains isolated
from Italian ryegrass and birdsfoot trefoil. J. Appl. Microbiol. 4, 1389-1401.
243. Yuan J., Zhang N., Huang Q., Raza W., Li R., Vivanco J.M., Shen Q. 2015. Organic
acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus
amyloliquefaciens NJN-6. Sci. Rep. 5, 13438.
Rola bakterii endofitycznych w fitoremediacji … Małgorzata Pawlik
Literatura 129
244. Zampolli J., Collina E., Lasagni M., Gennaro P. 2014. Biodegradation of variable-
chain-length n-alkanes in Rhodococcus opacus R7 and the involvement of an alkane
hydroxylase system in the metabolism. AMB Express 4, 1-9.
245. Zgadzaj R., James E.K., Kelly S., Kawaharada Y., de Jonge N., Jensen D.B., Madsen
L.H., Radutoiu S. 2015. A legume genetic framework controls infection of nodules by
symbiotic and endophytic bacteria. PLoS Genet 11, e1005280.
246. Zhang Z.B., Deng H., Wang H., Yin R., Hallett P.D., Griffiths B.S., Daniell T.J.
2010. Does microbial habitat or community structure drive the functional stability of
microbes to stresses following re-vegetation of a severely degraded soil? Soil Biol.
Biochem. 42, 850–859.
247. Ziółkowska A., Wyszkowski M. 2010. Toxicity of petroleum substances to
microorganisms and plants. Ecol. Chem. Eng. S 17, 73-82.
248. Zúñiga A., Poupin M.J., Donoso R., Ledger T., Guiliani N., Gutiérrez R.A.,
González B. 2013. Quorum sensing and indole-3-acetic acid degradation play a role in
colonization and plant growth promotion of Arabidopsis thaliana by Burkholderia
phytofirmans PsJN. Mol. Plant Microbe Interact. 26, 546–553.