Mapas de Restricción

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Mapas de Restricción. Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé , PhD. Objetivos. Al completar este ejercicio los estudiantes 1. Habrán usado enzimas para digerir un plásmido 2 . Analizaran los resultados con una electroforesis de agarosa . - PowerPoint PPT Presentation

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Mapas de Restriccin

Mapas de RestriccinBiol 3030 Lab DesarrolloJA Card, PhD

ObjetivosAl completar este ejercicio los estudiantes1. Habrn usado enzimas para digerir un plsmido2. Analizaran los resultados con una electroforesis de agarosa. 3. Calcularn las distancias entre los puntos de corte de las enzimas usadas3. Determinarn las posiciones relativas entre estos cortesAnlisis

Plasmido de 5000bpEnzimas ABCCualquiera sola 5000bpDouble DigestAC 3000, 2000AB 4500, 500BC 3,500, 1500Plasmido de 5000bpEnzimas ABC 3000, 2500, 500 La localizacion de lugares de restriccion es importante en:Analisis Mapas y CloningDe moleculas de DNASu3Interpretacion de mapas

4Digestiones parciales y Configuraciones

Supercoiled migran ++++Lineal +++Nicked ++

Dimeros +Trimeros .+5Marcadores

En este expto determinaras las localizaciones de sitios de restriccion en el plasmido. Se usaran fragmentos para el tamanoReactivos

Las enzimas con HindIII y Bgl 1Asume a Bgl1 en 0Calcula las distancias entre los puntos de corte y determina las orientaciones relativas.Instrucciones GeneralesAnadir enzimas, mezclas de reaccion al DNAMezclar con fingertiop vortexIncubar a 45 o 37 en bao de MaraAadir loading buffer para detener la reaccin.

Instrucciones de ReaccionesRotular 4 tubos (del 1-4) para cuatro reacciones de enzimas de restriccinGolpear los tubos contra el bench para recoger el contenido en el fondoServir 30l de buffer de Rxn en cada tuboAadir DNA, agua y enzima a los tubos de reaccin segn resumido en la tabla.Tapar el tubo y mezclar cuidadosamente. Vigile la fase del glicerol que no se acumuleSpin para bajar todo el contenido al fondoIncubar 15 o 60 min a 45 o 37 grados respectivamenteAador X ul de loading buffer a los tubos de reaccion, mezle y esta lista para servir.

Reacciones

Incubacin

Instrucciones de GelPreparar gel al 0.8% de 6 carriles con pozos de 40ls.Pueden ser 2 geles de 15 carrilesServir 1 marcador2 Plasmido sin cortar3.Corte con HindIII4.Corte con Bgl5 Corte con HindIII y Bgl I

Grafica: Determinacin de Tamao de los fragmentos

-Medir y registrar distancia migrada por cada banda del marcador (excpto el de 23,130, que no caer en la linea)Mida y anote en cmRotule papel semilog con Distancia en X en cmRotula Log base pair en Y. Escoja la escala de manera que los puntos queden bien distribuidosCiclos de 100 1000, de 1000-10000Ubique cada punto en la grafica con Distancia y su tamano en YDibuja la mejor linea que pase por todos los puntos (Igual numero a cada lado de la linea)Mida la distancia de cada banda desconocidaExtrapola en la linea recta los valores de los desconocidosUsar este papel para analizar la gel

Preparacin del mapaPrepare un mapa circular del plasmido de 4340. Marque la posicion para cortes de HindIII de acuerdo a los tamanos de la gelDibuje un segundo circulo de 4340. Marque la posicion del corte para BglI en la parte superior lo que serian las 12.Para dibujar el mapa compuesto coloque uno de los circulos sobre el otro.Mantenga el de BglI a las 12 y rote el otro dibujo hasta que la distanca relativa entre los sitios de restriccion aproximen los tamanos relativos a los fragmentos de la digestionCompare los tamanos de los fragmentos de las digestiones simples con los de las dobles.