Mar´ıa Piedad Fernandez-P´ erez´ - Universidad de … · de transporte que ocurre a nivel de sus dendritas. ... los mecanismos de senescencia celular. ... en nuestro laboratorio

INVESTIGACION CONTRA EL CANCER

COMO CONVERTIR LA RESISTENCIA EN EL TALON DE AQUILES DELMELANOMAMarıa Piedad Fernandez-Perez1, Luıs Sanchez-del-Campo2, Magalı Saez-Ayala 1, Marıa F.Montenegro 1, Soledad Chazarra1 y Jose Neptuno Rodrıguez-Lopez11. Departamento de Bioquımica y Biologıa Molecular-A, Universidad de Murcia.2. Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research, University of OxfordE-mail: [email protected]

Melanocitos y melanoma

Los melanocitos son las celulas responsables dela sıntesis de melaninas, que son los pigmentos queproporcionan el color a la piel, el pelo y los ojos y losprotegen de la luz ultravioleta (UV). Estos pigmentosson sintetizados y almacenados por los melanocitosen unos organulos especiales denominados melanoso-mas que derivan de endosomas tempranos que sufrenuna maduracion especıfica de este tipo celular duran-te la cual incorporan una serie de proteınas estructu-rales y enzimas implicadas en la sıntesis de melanina(Raposo y Marks, 2007).

En la piel, los melanocitos se distribuyen en lamembrana basal, situada entre la epidermis y la der-mis, desde donde transfieren los melanosomas a losqueratinocitos circundantes mediante un mecanismode transporte que ocurre a nivel de sus dendritas.Los queratinocitos captan los melanosomas y los dis-ponen alrededor de su nucleo para proteger al ADNdel dano ocasionado por la luz UV. A su vez, los que-ratinocitos epidermicos secretan una serie de factoresque regulan la homeostasis de los melanocitos (Slo-minski et al., 2004) (Figura 1).

El melanoma cutaneo es un tipo de cancer de pielque se origina por transformacion maligna de los me-lanocitos epidermicos o de sus celulas madre, princi-palmente por el dano al ADN inducido por la radia-cion UV (Goding, 2007). Se piensa que esta neoplasia

se desarrolla segun un modelo de progresion secuen-cial. Segun este modelo, en primer lugar se producirıauna proliferacion aberrante de los melanocitos debidoa alguna alteracion genetica, presumiblemente cau-sada por la radiacion UV, que les permitirıa escapara la estrecha regulacion por los queratinocitos dan-do lugar a los nevus o lunares. Se trata de lesioneshiperplasicas benignas consistentes en una pobla-cion clonal de melanocitos que no progresan gracias alos mecanismos de senescencia celular. Si continuanacumulandose alteraciones geneticas, los nevus so-brepasan los mecanismos de senescencia celular, sevuelven displasicos y pueden progresar a una fase decrecimiento radial (RGP) en la que se produce unaextension superficial de los melanocitos confinada ala epidermis y con bajo potencial invasivo. Finalmen-te, la sucesiva acumulacion de alteraciones geneticashace que las celulas pasen a una fase de crecimientovertical (VGP) en la que adquieren la capacidad de in-vadir la dermis y alcanzar vasos sanguıneos o linfati-cos para metastatizar (preferentemente en hıgado,pulmon y cerebro). Sin embargo, hay que tener encuenta que no todos los melanomas se originan a par-tir de nevus pre-existentes, sino que tambien puedenoriginarse a partir de melanocitos aislados, ni tampo-co todos los melanomas pasan por todas estas fases(Zaidi et al., 2008) (Figura 2).

La deteccion y la extirpacion quirurgica del mela-noma en las fases tempranas de su evolucion biologi-ca son determinantes para la supervivencia de los

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pacientes. La mayorıa de las lesiones tempranas y al-gunos melanomas en estadios mas avanzados puedenser identificados empleando la regla ABCDE. Seguneste criterio, los melanomas son Asimetricos (no pue-den dividirse en dos mitades iguales), tienen Bordesirregulares, muestran un Color no homogeneo, suDiametro suele ser superior a 6 mm y su Evolucioncambia con el tiempo (Friedman et al., 1985; Abbasiet al., 2004) (Figura 3).

Cuando un mecanismo defensivo se convier-te en ofensivo

El melanoma cutaneo es el cancer que mayor in-cremento ha sufrido en cuanto a incidencia y mortali-dad en las ultimas decadas en la poblacion caucasicay se trata del tipo de cancer de piel mas agresivo(Giblin y Thomas, 2007). Los pacientes con enferme-dad avanzada que presentan afectacion de ganglioslinfaticos o metastasis distantes tienen unas tasas desupervivencia media a 5 anos del 50 % y del 10-20 %,respectivamente (Grossman y Altieri, 2001). El uni-co tratamiento efectivo es la escision quirurgica delas lesiones tempranas, ya que el melanoma malignomuestra una gran resistencia frente a todas las tera-pias anti-cancerıgenas disponibles en la actualidad.

Durante decadas, los clınicos y los cientıficos basi-cos han estado desconcertados por la gran capacidadque presentan las celulas de melanoma para escapara los mecanismos de vigilancia del sistema inmune,para resistir a la inmunoterapia y a la radioterapia,ası como para evadir la accion de una gran diversidadde agentes quimioterapeuticos (agentes que causan

dano al DNA, inhibidores de microtubulos, inhibido-res de topoisomerasas, etc.). Tanto es ası que, despuesdel tratamiento con quimioterapia, raramente expe-rimentan beneficios mas de un 20 % de los pacientesy el termino “remision” es practicamente inexistenteen melanoma. Por tanto, se postula que la gran resis-tencia a las distintas terapias probablemente no seaconsecuencia de la adquisicion de alteraciones geneti-cas durante o despues del tratamiento, sino que masbien la resistencia serıa una capacidad inherente alas celulas de melanoma ya presente en el momen-to del diagnostico. Diversos estudios postulan que lascelulas de melanoma “nacen para sobrevivir” y que sucomportamiento agresivo provendrıa de caracterısti-cas intrınsecas de supervivencia de sus progenitores,los melanocitos, que se verıan incrementadas por al-teraciones adicionales adquiridas durante la progre-sion del tumor. (Soengas y Lowe, 2003)

Los antifolatos fueron los primeros antimetaboli-tos en incorporarse a la clınica a finales de la decadade 1940. Estos agentes, entre los que destaca el meto-trexato (MTX), actuan como inhibidores competitivosde la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que esla enzima clave en el metabolismo del acido folico. Sudescubrimiento se produjo a raız de la observacion deque la administracion de suplementos de acido folicoa los pacientes con leucemia linfoblastica aguda em-peoraba su evolucion, mientras que una dieta pobreen acido folico producıa una notable mejorıa (Meyeret al., 1950). En las siguientes decadas, la efectividaddemostrada frente a diversos tipos de cancer popu-larizo el uso de MTX e hizo que este se incorporaraa los distintos regımenes anti-cancerıgenos (Bertino,2000). Sin embargo, no tardaron en aparecer estudiosen los que se describıa la ausencia de efectividad delMTX en el tratamiento del melanoma debido a unaresistencia que parecıa ser natural o intrınseca (Kufeet al., 1980).

Desde su descubrimiento hasta la actualidad, losmecanismos generales de resistencia al MTX han sidoampliamente estudiados (Assaraf, 2007). Sin embar-go, hasta hace unos anos poco se sabıa acerca de losmecanismos especıficos de resistencia a esta drogaen las celulas de melanoma. Experimentos realizadosen nuestro laboratorio y otros han proporcionado evi-dencias de la existencia de un nuevo mecanismo deresistencia, especıfico del melanoma frente a diversasdrogas citotoxicas, que consistirıa en su secuestro enlos melanosomas y su posterior exportacion al exte-rior celular (Chen et al., 2006; Sanchez del Campo etal., 2009a). Concretamente, nuestro laboratorio pusode manifiesto que el transporte de MTX por endo-citosis mediada por el FRα (folate receptor alpha)conducıa, de alguna manera, al secuestro del MTX enel interior de los melanosomas y a su exportacion alexterior celular, lo cual reducıa la acumulacion intra-celular de la droga y hacıa que esta solo fuera capazde detener el crecimiento de las celulas de melanomapero no de inducir su muerte (Sanchez del Campo etal., 2009a) (Figura 4).

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En melanocitos normales la sıntesis de melaninay la biogenesis y transporte de melanosomas se activatras la exposicion solar y tiene como objetivo aumen-tar la pigmentacion de la piel para proteger al orga-nismo de la radiacion UV (Lin y Fisher, 2007). Sinembargo, este mecanismo “defensivo” frente a la ra-diacion solar en los melanocitos normales, se tornarıaen un arma “ofensiva” de las celulas de melanoma alpermitirles expulsar drogas citotoxicas como el MTX.

Nuestros resultados sugerıan que el MTX podıaestar activando la maquinaria responsable de labiogenesis y el transporte de los melanosomas favore-ciendo ası su propia eliminacion del interior celular.Pero el mecanismo molecular por el cual el MTX con-trolaba estos procesos celulares era desconocido.

Dadas las limitadas opciones terapeuticas exis-tentes para los pacientes con melanoma metastasico,en nuestro laboratorio decidimos centrar nuestrosesfuerzos en descifrar las bases moleculares que sub-yacen a este particular mecanismo de resistencia alMTX con el objetivo de identificar nuevas dianas te-rapeuticas para el diseno de terapias combinadasencaminadas a evadir dicha resistencia.

¿Como es capaz el MTX de orquestar su pro-pia expulsion celular?

Diversos autores han puesto de manifiesto la gransimilitud existente entre el desarrollo de un tumory ciertos procesos que ocurren durante el desarrolloembrionario (Ma et al., 2010). El ejemplo mas claroy mejor estudiado lo encontramos en el proceso detransicion epitelio-mesenquima (EMT) que duranteel desarrollo embrionario permite que las celulas pro-genitoras migren hacia aquellas localizaciones dondese diferenciaran para formar tejidos y organos. Puesbien, la reactivacion en las celulas tumorales del pro-grama de transicion epitelio-mesenquima permitea las celulas ya diferenciadas restituir propiedadesembrionarias tales como la capacidad migratoria e

invasiva que facilita la diseminacion de las celulasdel tumor primario a otros tejidos (Micalizzi y Ford,2009). Por esta razon algunos autores se han aventu-rado a postular que el desarrollo de un tumor serıacomo “un intento de formar un organo pero en un lu-gar y en un momento equivocados”.

Como hemos dicho anteriormente, las dos prin-cipales caracterısticas indicadoras de diferenciacionen melanocitos son: a) la morfologıa dendrıtica, ne-cesaria para la correcta distribucion de melanina enla piel, y b) la capacidad de sintetizar y almacenarmelanina en los melanosomas, ası como de exportar-los hacia los queratinocitos circundantes (Ibrahim yHaluska, 2009). Pues bien, el tratamiento con MTXparecıa estar induciendo diferenciacion en las celu-las de melanoma puesto que, no solo parecıa activarla sıntesis de melanina y la biogenesis y exporta-cion de melanosomas, sino que ademas producıa unllamativo cambio morfologico induciendo una fuertedendricidad en estas celulas (Figura 7B). Ante estoshallazgos nos planteamos adentrarnos en el estudiodel origen de los melanocitos durante el desarrolloembrionario, con la esperanza de encontrar simili-tudes con los procesos desencadenados por el trata-miento con MTX.

Los melanocitos se originan a partir de celulasprecursoras no pigmentadas derivadas de la crestaneural denominadas melanoblastos que, durante eldesarrollo embrionario, migran hacia determinadaslocalizaciones en el ojo, el oıdo interno, la epider-mis y los folıculos pilosos, donde se diferencian haciamelanocitos maduros (Ernfors, 2010). Estos se ca-racterizan principalmente por su aspecto dendrıticoy su capacidad de sintetizar y almacenar melaninaen los melanosomas, ası como de exportarlos hacialos queratinocitos circundantes (Ibrahim y Haluska,2009). El punto crıtico que compromete a estos pre-cursores pluripotentes para su diferenciacion haciael linaje melanocıtico es la activacion de la expresiondel factor de transcripcion MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) (Goding, 2000). Dehecho, diversos estudios han demostrado que la ex-presion de MITF en celulas madre embrionarias essuficiente para inducir su diferenciacion hacia mela-nocitos (Bejar, 2003). Se trata de uno de los princi-pales marcadores especıficos del linaje melanocıtico(Goding, 2007) que, ademas de regular el proceso dediferenciacion, actua como un modulador clave de lasupervivencia y la proliferacion de los melanocitos(Widlund y Fisher, 2003).



Dado que MITF parecıa ser un punto clave en ladiferenciacion melanocıtica, nos planteamos averi-guar si este factor de transcripcion podrıa estar im-plicado en el mecanismo de resistencia del melanomaal MTX descrito por nuestro grupo de investigacion.Estudios realizados en nuestro laboratorio pusieronde manifiesto que el tratamiento con MTX inducıafuertemente la expresion del factor de transcripcionMITF en celulas de melanoma, el cual iniciaba elprograma de diferenciacion melanocıtica gracias a laactivacion de la expresion de genes que codifican:

a) proteınas estructurales de los melanosomas(como PMEL-17 y MART-1), a los que irıa a pa-rar el MTX tras ser endocitado.

b) enzimas implicadas en la sıntesis de melani-nas (como TYR y TYRP-1), que interaccionarıancon el MTX secuestrandolo en el interior delMTX.

c) proteınas implicadas en el transporte de me-lanosomas al exterior celular (como RAB-27a),que conducirıan a la expulsion del MTX incluidoen el interior de los melanosomas.

Por tanto, la induccion de dicho factor de trans-cripcion por el MTX era responsable de la puesta enmarcha de la biogenesis y exportacion de melanoso-mas y, por ende, del mecanismo de resistencia des-crito anteriormente por el que el MTX es secuestradoen los melanosomas y exportado al exterior celular(Saez-Ayala et al., 2013) (Figura 5).

Como en el caso de otros tumores, en el interiorde un melanoma coexisten distintas sub-poblacionesde celulas cancerıgenas que muestran distintas pro-piedades biologicas y distinto grado de diferenciacion.Algunas de estas celulas podrıan exhibir rasgos de di-ferenciacion, otras podrıan mostrar mayor capacidad

proliferativa y solo unos pocos clones de celulas masindiferenciadas presentarıan propiedades similares alas de las celulas madre (Visvader y Lindeman, 2008).Estas ultimas son las denominadas “cancer stem ce-lls (CSC)” o “celulas madre del cancer” que tendrıancapacidad tanto de auto-renovacion para mantenerel pool de celulas madre del cancer, como de diferen-ciacion para dar lugar a toda una progenie de celulastumorales. Los ultimos estudios apuntan a que serıanestas las responsables de la iniciacion y el manteni-miento del tumor, ası como de las metastasis y lasrecaıdas tras remisiones logradas con la quimiotera-pia (Menaa, 2009) (Figura 6).

En melanoma, la identidad de las distintas sub-poblaciones de celulas tumorales viene determinadapor los niveles de expresion de MITF (Carreira et al.,2006; Cheli et al., 2011). De esta manera, aquellascelulas con baja expresion de MITF muestran pro-piedades de celula madre, tienen gran capacidad deiniciar tumores y son altamente invasivas (Carreiraet al., 2006; Cheli et al., 2011). Por el contrario, aque-llas celulas con elevada expresion de MITF presentanun bajo potencial invasivo y expresan genes de dife-renciacion que conducen a la produccion de melaninay a la biogenesis y transporte de melanosomas (Cheliet al., 2010). Entre ambas estarıan aquellas celulascon niveles de expresion intermedios que serıan lasque tendrıan capacidad proliferativa. Puesto que losmelanomas suponen una mezcla de celulas con dis-tintos niveles de expresion de MITF, la induccion dela expresion de este factor de transcripcion por eltratamiento con MTX conseguirıa reducir la hetero-geneidad celular existente en el tumor y, con ella,la probabilidad de que existan en el tumor celulascapaces de eludir terapias dirigidas contra dianasmoleculares concretas. Ademas, esta terapia elimi-narıa aquellas celulas que expresan bajos niveles deMITF y muestran un fenotipo de celulas madre queson altamente invasivas (Saez-Ayala et al., 2013) (Fi-gura 7).



Por un lado, el descubrimiento de las bases mole-culares de este mecanismo de resistencia ha abierto elcamino al desarrollo de nuevas estrategias terapeuti-cas dirigidas contra dianas moleculares implicadasen el proceso, tales como proteınas implicadas en eltransporte de los melanosomas o enzimas implicadasen la sıntesis de melanina. Pero lo mas importan-te de este descubrimiento es que el tratamiento conMTX, al inducir la diferenciacion de las celulas demelanoma, supone una herramienta para reducir laheterogeneidad existente en el tumor al conducir atodas las celulas tumorales a un fenotipo comun, sen-sible a otras terapias dirigidas especıficamente contracelulas mas diferenciadas.

Cuando los arboles no dejan ver el bosque. . .

En las ultimas decadas, los avances en el cono-cimiento de la genetica y la biologıa molecular delcancer han permitido identificar un gran numero dedianas terapeuticas, es decir, moleculas que desem-penan una funcion esencial en los procesos patologi-cos que dan lugar al desarrollo del cancer y, por lotanto, son el objetivo para el desarrollo de farmacosanti-cancerıgenos. Con esta finalidad se han segui-do fundamentalmente dos estrategias. Por un lado, el“diseno racional” consistente en el diseno de farmacosbasado en el conocimiento de la estructura molecularde la diana terapeutica (van Montfort y Workman,2009). Y, por otro lado, el screening a gran escala degrandes bibliotecas de compuestos quımicos sinteti-cos o naturales en busca de aquellos capaces de blo-quear o estimular una diana terapeutica, o bien dedestruir celulas neoplasicas en cultivo (Shoemakeret al., 2002). Pero ambas estrategias pasan por altoaquellos compuestos que no presentan la actividaddeseada o aquellos frente a los cuales las celulas can-cerıgenas muestran resistencia.

Dada la gran resistencia del melanoma frente atodas las terapias clasicamente utilizadas y la escasaefectividad de las nuevas terapias dirigidas frente a

dianas moleculares especıficas, en nuestro laborato-rio decidimos emplear un enfoque diferente. En lugarde descartar una droga como el MTX para la que sesabıa desde hacıa decadas que el melanoma es resis-tente, intentamos descifrar las bases moleculares delmecanismo de resistencia para identificar dianas te-rapeuticas a las que disparar con un segundo farmacopara intentar evadir dicha resistencia. Con este nue-vo enfoque, nuestro grupo de investigacion ha logradodesarrollar varias estrategias terapeuticas distintascon excelentes resultados pre-clınicos que resultanesperanzadores para el tratamiento del melanoma enestadios avanzados para el que, a dıa de hoy, siguesin haber una terapia efectiva.

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