Maria RussoDipartimento di Patologia Molecolare e Terapie InnovativeUniversità Politecnica delle Marchem.russo@univpm.it

I MICRORGANISMI

Batteri

Funghi

Cianobatteri

Protozoi

Alghe Virus

DIMENSIONI DEI MICRORGANISMI

AGENTI FISICI E CHIMICI NEL CONTROLLO DEI MICRORGANISMI

Calore secco

AGENTI FISICI

Sterilizzazione diretta alla fiamma

Stufa a secco (160-180 °C per 2 ore: vetreria, strumenti di metallo, polveri, olii e cere, materiali impermeabili e danneggiabili dal vapore)

Calore umido

Ebollizione

Pasteurizzazione (latte, vino e altre bevande)

Autoclave (vapore sotto pressione: soluzioni stabilial calore e attrezzature varie)

Sterilizzazione frazionata (tyndalizzazione)

Filtrazione

(liquidi sensibili al calore, aria)

Radiazioni

Ionizzanti (raggi γ e raggi X: materiale plastico sensibileal calore, prodotti farmaceutici, derrate alimentari)

Ultraviolette (aria e superfici)

AGENTI CHIMICI

Elevata attività microbicida

Ossido di etilene

Glutaraldeide

Formaldeide

Media attività microbicidaIodio + alcoolCloroAlcool etilicoFenolici

IodoforiAmmonio quaternarioMercurialiCloroexidina

Bassa attività microbicida

CONTENIMENTO RISCHIO BIOLOGICO

Riduzione o eliminazione dell’esposizione a potenziali agenti infettanti

• formazione di aerosol• lavoro con grandi volumi e/o concentrazioni di

microrganismi• eccessivo affollamento di persone o attrezzature

nel laboratorio• infestazioni da roditori e insetti• accesso a persone non autorizzate

Tipo di attività

Applicazione combinata di misure di protezione di vario grado

Livelli di sicurezza biologica

Titolo VIII del D.Lgs. 626/94: protezione da agenti biologici (attuazione della direttiva 90/679/CEE del 26/11/90 successivamente modificata dalla direttiva 93/88/CEE del 12/10/93).

• Buone pratiche microbiologiche:

Definizione di un manuale operativo con procedure per minimizzare rischio infettivo

• Barriere primarie: equipaggiamenti e apparecchi di sicurezza

Protezione del personale e dell’ambiente confinato del laboratorio

Vaccinoprofilassi (se disponibile)

Norme comportamentali tecniche (tecniche ed attrezzature in grado di ridurre la produzione di aerosol, uso corretto della cappe biologiche, uso sistemico di DPI)

Norme comportamentali igieniche

• Barriere secondarie:

Protezione ambiente esterno al laboratorio (aria in uscita, rifiuti liquidi e solidi)

Misure costruttive e procedurali:

separazione area di lavoro da accesso al pubblico

filtrazione dell’aria

strumenti per decontaminazione

mezzi per lavaggio delle mani

VIE DI TRASMISSIONE IN LABORATORIO DEGLI AGENTI BIOLOGICI

• INGESTIONE

• INALAZIONE

• INOCULAZIONE

• CONTAMINAZIONE DI CUTE E MUCOSE

(schizzi, spargimenti, contatto con superfici, oggetti)

• Laboratorio di base - livello di biosicurezza 1

per microrganismi classe 1

• Laboratorio di base - livello di biosicurezza 2

per microrganismi classe 2

• Laboratorio di sicurezza - livello di biosicurezza 3

per microrganismi classe 3

• Laboratorio di massima sicurezza - livello di biosicurezza 4

per microrganismi classe 4

L’elenco degli agenti biologici classificati che possono provocare malattie infettive in soggetti umani è in Allegato XI - D.Lgs. 626/94

Agenti che non comportano rischi per il personale e la comunità (classe 1)

Buona pratica di laboratorio

• uso di sistemi meccanici di pipettamento• lavaggio delle mani• limitato accesso durante il lavoro• divieto di mangiare, bere o fumare• evitare formazione di aerosol• decontaminazione superfici almeno una volta al giorno • decontaminazione rifiuti • controllo roditori e insetti

Agenti a moderato rischio per il personale e la comunità (classe 2)

• uso di sistemi meccanici di pipettamento• lavaggio delle mani• limitato accesso durante il lavoro• divieto di mangiare, bere o fumare• evitare formazione di aerosol• decontaminazione superfici almeno una volta al giorno • decontaminazione rifiuti • controllo roditori e insetti • arredi e finiture facili da pulire • cappa biologica di sicurezza per qualsiasi manipolazione che

comporti rischio di aerosol

Agenti ad elevato rischio per il personale e basso rischio per la comunità (classe 3)

• uso di sistemi meccanici di pipettamento• lavaggio delle mani• limitato accesso durante il lavoro• divieto di mangiare, bere o fumare• evitare formazione di aerosol• decontaminazione superfici almeno una volta al giorno • decontaminazione rifiuti • controllo roditori e insetti • arredi e finiture facili da pulire • cappa biologica di sicurezza per qualsiasi manipolazione che

comporti rischio di aerosol• sistema di ventilazione per creare pressione negativa rispetto alle

aree circostanti

Agenti ad elevato rischio per il personale e la comunità (classe 4)

• unità funzionale completamente isolata • pressione negativa rispetto alle aree circostanti • aria filtrata (HEPA) in uscita prima e in entrata• sistema di trattamento autonomo di sterilizzazione per tutti i liquidi di

scarto prima dello scarico finale• cappe di biosicurezza di classe III o, in alternativa, di classe II (tute

ventilate a pressione negativa

CAPPE DI SICUREZZA BIOLOGICA

Produzione di aerosol• centrifugazione• frantumazione• miscelazione • agitazione vigorosa • sonicazione • apertura di contenitori di materiale infetto con pressione interna

diversa da quella dell’ambiente circostante • inoculazione intranasale di animali• raccolta di tessuti infetti da animali e uova• manipolazione di forti concentrazioni o grandi volumi di materiali

infetti

CLASSE I

Cappa ventilata aperta frontalmente

Protezione dell’operatore: flusso di aria in ingresso non rimandato in circolo

Protezione dell’ambiente: filtro HEPA nel sistema di scarico

Nessuna protezione del prodotto (aria in ingresso non filtrata)

A: ingresso ariaB: pannello frontaleC: filtro HEPAD: camera posteriore

FILTRI HEPA

Fogli sottili di fibra di vetro finemente pieghettatiTrattengono 99.97% di particelle con diametro = / > 3μManutenzione periodica

CLASSE II

Protezione dell’operatore

Protezione dell’ambiente

Protezione del prodotto

Tipo A:

70% dell’aria ricircolata

30% dell’aria eliminata

Classe B:

B1 30% dell’aria ricircolata

70% dell’aria eliminata

B2 100% espulsa

CLASSE III

Cappa ventilata, totalmente chiusa,

a tenuta d’aria e pressione negativa

Aria filtrata in ingresso e in uscita

Lavoro svolto con guanti a manica

in gomma attaccati alla cappa

Barriera totale tra operatore e lavoro

Utilizzo della cappa in sicurezza

• Il corretto uso della cappa deve essere spiegato a tutti gli utenti• Non utilizzare la cappa se non perfettamente funzionante• Non aprire il pannello di chiusura in vetro della cappa durante l’uso• Attrezzatura e materiali all’interno devono essere ridotti al minimo e

posti sul fondo della cappa• Evitare di introdurre nuovo materiale sotto cappa dopo aver iniziato il

lavoro• Non usare Bunsen (può danneggiare i filtri e causare scompensi nel

flusso d’aria). Usare microinceneritori o se possibile anse monouso• Eseguire tutte le operazioni nel mezzo o in fondo al piano di lavoro, in

modo che siano visibili dal pannello di vetro• Ridurre al minimo il passaggio di persone alle spalle dell’operatore• Spegnere sempre la lampada UV in presenza dell’operatore • Rimuovere immediatamente dal piano di lavoro fuoriuscite o versamenti

di materiale biologico

• Non disturbare il flusso dell’aria della cappa introducendo e togliendo le braccia ripetutamente

• Lasciare libere le grate di ingresso dell’aria sia sul piano che sulle pareti della cappa

• Far funzionare il monoventilatore della cappa almeno 10’ prima di iniziare a lavorare, in modo da far stabilizzare il flusso laminare

• Prima di spegnere la cappa, lasciare in azione 25-30’ dopo la disinfezione, per assicurare il trattamento attraverso il filtro di tutta l’aria

• Il materiale potenzialmente infetto o contaminato deve essere estratto dalla cappa in contenitori chiusi ed a tenuta, perfettamente puliti ed etichettati con il segnale di rischio biologico.

Le apparecchiature prima di essere rimosse dalla cappa devono essere disinfettate