Masna spektrometrija

stabilnih izotopov za

določanje izotopske

sestave lahkih elementov

(praktični primeri)

Doris Potočnik, Nives Ogrinc

MERITVE - IRMS

• IRMS instrumenti so zasnovani tako, da določamo razmerja stabilnih

izotopov lahkih elementov (2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S).

• Pred analizo z IRMS se mora vzorce pretvoriti v plinasto fazo (H2,

CO2, N2, SO2 CO; odvisno od željene meritve). Meri se razmerje

ionov v plinu.

– Primer na CO2; masni spektrometer zazna ione z razmerjem

masa:naboj (𝑚

𝑧) 44, 45, 46 (to ustreza molekulam 12C, 13C, 16O,

17O, 18O v različnih kombinacijah).

EA-IRMS (Elementni analizator za merjenje stabilnih izotopov lahkih elementov)

• Poznamo 2 tipa elementarnega analizatorja:

- Za C, N, S analize (sežig); vzorec se sežge v kisikovi atmosferi

(prisotnost oksidacijske in redukcijske kolone)

- Za O, H analize (piroliza); vzorec gre skozi visoko temperaturno

pretvorbo

IsoPrime100 - Vario PYRO Cube (OH/CNS

Pyrolyser/Elemental Analyser

Masni spektrometer za stabilne izotope

Europa 20-20 z ANCA-SL modulom

Sočasno merjenje izotopskega razmerja

C, N, S v vzorcu

Posamično merjenje izotopskega razmerja

C, N, S* v vzorcu

Določanje izotopskega razmerja O in H v

trdnih in tekočih vzorcih (piroliza)-

Vpeljava referenčnega plina preko

vmesnika

Referenčni plin je sekundarni referenčni

standard

MASNI SPEKTROMETER

RAZREDČEVALNIK

DOVOD ZA REFERENČNI

PLIN

VZORČEVALNIK ZA TEKOČE VZORCE

VZORČEVALNIK ZA TRDNE IN TEKOČE

VZORCE

VZORČEVALNIK ZA TRDNE VZORCE

Izotopsko razmerje R (2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S) se izraža

z vrednostjo (v ‰) in predstavlja relativno razliko izotopske sestave

raziskovanega vzorca (vz) glede na standard (st), ki je definiran z 0‰

(V-SMOW, V-PDB, AIR, V-CDT).

TERMINOLOGIJA

X = 2H, 13C, 15N,18O, 34S𝛿𝑋(‰) = [(𝑅𝑣𝑧/𝑅𝑠𝑡 ) − 1] 𝑥 1000

KLASIFIKACIJA REFERENČNIH STANDARDOV

• Primarni / kalibracijski materiali, (prejme le 1x na tri leta)

• Sekundarni / certificirani referenčni materiali

• Terciarni / delovni / laboratorijski standardi

Primarni

referenčni

material

Opis Izotopsko

razmerje (‰) Skala

VSMOW2 Voda

2H/1H18O/16O17O/16O

0.00 ± 0.3

0.00 ± 0.02

0.00 ± 0.03

VSMOW

VSMOW

VSMOW

NBS-19Kalcijev

karbonat

13C/12C18O/16O

+1.95

-2.20

VPDB

VPDB

SEKUNDARNI (CERTIFICIRANI) REFERENČNI MATERIALI

• Naravne ali sintetične spojine, umerjene na primarne

standarde• vrednosti sprejete na mednarodni ravni, vsebujejo merilno

negotovost

Sekundarni referenčni materiali za 15N meritve

Referenčni material Opis 15NAIR (‰)

USGS 25 Amonijev sulfat -30.4 ± 0.4

USGS 26 Amonijev sulfat +53.7 ± 0.4

USGS 32 Kalijev nitrat +180 ± 1

IAEA-N-1 Amonijev sulfat +0.4 ± 0.2

IAEA-N-2 Amonijev sulfat +20.3 ± 0.2

IAEA-NO-3 Kalijev nitrat +4.7 ± 0.2

USGS-35 Natrijev nitrat +2.7 ± 0.2

USGS-34 Kalijev nitrat -1.8 ± 0.2

Referenčni material Opis 13CV-PDB (‰)

IAEA-CH-3 Celuloza -24.724 ± 0.041

IAEA-CH-6 Sukroza -10.449 ± 0.033

IAEA-CH-7 Polietilen -32.151 ± 0.050

USGS-40L-glutaminska

kislina -26.389 ± 0.042

USGS-41L-glutaminska

kislina +37.626 ± 0.049

NBS-22 olje -30.031 ± 0.043

USGS-24 Grafit -16.049 ± 0.035

BCR-656 Etanol v vinu -26.91 ± 0.07

Sekundarni referenčni materiali za 13C meritve

Referenčni material Opis 34SV-CDT (‰)

IAEA-S-1 Srebrov sulfid -0.30

IAEA-S-2 Srebrov sulfid +22.7 ± 0.2

IAEA-S-3 Srebrov sulfid -32.3 ± 0.2

IAEA-S-4 Žveplo +16.9 ± 0.2

IAEA-SO-5 Barijev sulfat +0.5 ± 0.2

IAEA-SO-6 Barijev sulfat -34.1 ± 0.2

NBS-127 Barijev sulfat +20.3 ± 0.4

Sekundarni referenčni materiali za 34S meritve

Referenčni material Opis 2HVSMOW (‰) 18OVSMOW (‰)

NBS-18 Kalcit -23.2 ± 0.1*

NBS-22 Olje -120 ± 1

IAEA-601 Benzojska kislina +23.3 ± 0.3

IAEA-602 Benzojska kislina +71.4 ± 0.5

IAEA-CH-7 Polietilen -100.3 ± 2

USGS-43Človeški lasje

(Indija)-50.3 ± 2.8 +14.11 ± 0.1

USGS-42Človeški lasje

(Tibet)-78.5 ± 2.3 +8.56 ± 0.1

LSVEC Litijev karbonat -26.7 ± 0.2*

Sekundarni referenčni materiali za 2H in 18O meritve

* Ta vrednost je podana glede na VPDB skalo

TERCIARNI / DELOVNI STANDARDI

• Izotopsko homogeni in konstantni

• Kemijsko podobni vzorcu (ista matrica)

• vrednost se mora določiti glede na primarni ali sekundarni RM,

posledično ima nekoliko večjo merilno negotovost

• Potrebno spremljati kontrolno karto

- stabilnost standarda

- homogenost

- čistost

Laboratorijski

standard

13CV-PDB

(‰)

15NAIR

(‰)

34SV-CDT

(‰)

RUM

(destilat ruma)-13.75 ± 0.08 - -

ETANOL

(absolutni

etanol)

-27.4 ± 0.13 - -

Kazein (CRP) -20.34 ± 0.09 5.62 ± 0.19 +4.18 ± 0.74

IZVAJANJE MERITEV

• EA-IRMS in TC/EA-IRMS – določanje celokupnega „bulk“ izotopskega

razmerja

• Homogeniziran vzorec – (natančno podajanje vrednosti)

• Popolnoma posušen vzorec (določanje 2H in 18O)

• Predpriprava vzorca;

- izolacija kazeina iz mleka,

- Izolacija kazeina iz sira

- izolacija proteinov iz medu,

- izolacija sladkorja iz sokov,

- izolacija pulpe v sokovih,

- destilacija sokov/vin (etanol v vinu)

(Uredba EGS št. 2676/90 (KIS)

1. PRIPRAVA VZORCA

Ne smemo povzročiti

FRAKCIONACIJE!

• Pred pričetkom meritev je potrebno preveriti:

- stanje oksidacijske in redukcijske kolone (CNS)

oziroma kolone za pirolizo (OH in H, O)

- stanje pasti za vodo

2. NASTAVITEV/ PRIPRAVA INSTRUMENTA ZA PRAVILNO

IZVAJANJE MERITEV

- stabilnost (≤ 0.03 ‰)

- linearnost instrumenta (≤ 0.03 ‰)

- „tuning“ oz. centriranje pika

3. MERJENJE VZORCEV

• preveč vzorca – bolj pozitivne vrednosti

• premalo vzorca – bolj negativne vrednosti

Optimalna velikost pika:

13C = 5x10-8 – 7x10-7

15N, 34S = manjši razpon (10-7)

• na začetku seta meritev damo „dummy“,

• vzorec merimo vsaj v 3 ponovitvah,

• referenčni materiali morajo biti postavljeni na začetku in na koncu

sekvence

• delovni standardi so postavljeni periodično po sekvenci in služijo kot

kontrolni material

KAKO VEMO KOLIKO VZORCA MORAMO ZATEHTATI?

KAKO POMEMBNA JE IZBIRA

REFERENČNEGA

MATERIALA?

1 mg – 10 mg

OBDELAVA PODATKOV/IZRAČUNI

• IRMS programska oprema samodejno izračuna razmerje v vzorcu glede

na izbrani delovni standard (zato je pomembno kateri RM vzamemo)

• če je na volj samo en RM, popravki na eno točko

𝛿𝑑𝑜𝑙𝑜č𝑒𝑛𝑎 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐 (‰) =𝛿𝑖𝑧𝑚𝑒𝑟𝑗𝑒𝑛𝑎(𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐) + 1000 𝛿𝑑𝑜𝑙𝑜č𝑒𝑛𝑎(𝑠𝑡𝑑) + 1000

𝛿𝑖𝑧𝑚𝑒𝑟𝑗𝑒𝑛𝑎(𝑠𝑡𝑑) + 1000

• če je na voljo več referenčnih materialov, popravki na dve točki - kalibracijsko premico

RM z različnima vrednostima (IAEA-CH-7 13C = -32.15 ± 0.05 ‰, IAEA-CH-6

13C = -10.45 ± 0.03‰

13Cdoločena = x113Cizmerjena + b0

MERILNA NEGOTOVOST IN PRISPEVKI K MERILNI NEGOTOVOSTI

• Merilna negotovost karakterizira razpršeno vrednost, ki se jo pripiše k merjencu

(Chen in sod. 2013).

• Sestavljena je iz:

- ponovljivosti instrumenta oz. meritev (vzorec),

- referenčnega standarda,

- kalibracijske premice,

- obnovljivosti meritev (različni dnevi meritev, različni izvajalci meritev),

- vpliva laboratorija (bias).

Primer: določitev celokupnega 13C v medu

• OCENA NEGOTOTOVOSTI IZ KALIBRACIJSKE PREMICE

(QUAM, Eurachem/CITAC, 2012)

kalibracijska premica je linearna premica a = xib1 + b0

negotovost se izračuna po enačbi:

𝑢 𝑘𝑎𝑙 =𝑆

𝑏1

1

𝑝+

1

𝑛+

𝑥0− ҧ𝑥 2

𝑆𝑥𝑥, 𝑆 =

𝐽=1

𝑛𝑎 𝑗− 𝑏0+𝑏𝑗𝑋𝑗

2

𝑛−2,

𝑆𝑥𝑥 = σ𝑗=1𝑛 𝑋𝑗 − ത𝑋

2

𝑢𝑟𝑒𝑙(𝑘𝑎𝑙) =𝑢𝑘𝑎𝑙𝑥0

p = št. meritev za določitev x0

n = št. meritev za kalibracijo

x0 = določena 13C vrednost vzorca

ҧ𝑥 = srednja vrednost kalibracijskih standardov

• OCENA NEGOTOVOSTI IZ REFERENČNEGA STANDARDA

standardni odklon (s) in 13CRM sta določena s strani proizvajalca

𝑢(RM) =)𝑠(RM

𝑛𝑢𝑟𝑒𝑙 RM =

𝑢 RM

𝛿13𝐶𝑅𝑀=

)𝑠(RM

𝑛𝛿13𝐶𝑅𝑀

• OCENA NEGOTOVOSTI IZ PONOVLJIVOSTI

izvedba 6 meritev v enem dnevu

izračuna povprečno vrednost (AVE) in standardni odklon (s)

𝑢(𝑝𝑜𝑛) =𝑠

𝑛 n = število izvedenih meritev𝑢𝑟𝑒𝑙 𝑝𝑜𝑛 =𝑢 𝑝𝑜𝑛

𝛿13𝐶𝐴𝑉𝐸=

𝑠

𝑛𝛿13𝐶𝐴𝑉𝐸

• OCENA NEGOTOVOSTI IZ OBNOVLJIVOSTI (Rw)

standardni odklon kontrolnega materiala, pridobljenega iz

kontrolnih kart

• OCENA NEGOTOVOSTI IZ VPLIVA LABORATORIJA

izračuna na osnovi podatkov pridobljenih iz udeležb v medlaboratorijskih

primerjavah

vsaj 6 udeležb v medlaboratorijskih primerjavah v določenih časovnih intervalih

𝑢 𝑅𝑤 𝑄𝐶 =𝑠𝑅𝑤𝑄𝐶

𝑛

sRw QC = standardni odklon referenčnih materialov v daljšem

časovnem obdobju,

n =število izvedenih meritev v istem obdobju

𝑢𝑟𝑒𝑙 𝑅𝑊 𝑄𝐶 =𝑢 𝑅𝑊 𝑄𝐶

𝛿13𝐶𝐴𝑉𝐸=

𝑠𝑅𝑊𝑛𝛿13𝐶𝐴𝑉𝐸

𝑢(𝑏𝑖𝑎𝑠) = ൯𝑅𝑀𝑆𝑏𝑖𝑎𝑠2 + 𝑢2(𝐶𝑟𝑒𝑓

𝑅𝑀𝑆𝑏𝑖𝑎𝑠 =൯(𝑏𝑖𝑎𝑠2

𝑛𝑃𝑇

nPT = število opravljenih medlaboratorijskih primerjav

bias = lab. vrednost – robustna sredna vrednost

sR = srednja vrednosti v medlaboratorijskih primerjavah

𝑢(𝐶𝑟𝑒𝑓) =𝑠𝑅𝑛𝑙𝑎𝑏

• KOMBINIRANA MERILNA NEGOTOVOST

relativna standardna negotovost vzorca se določi z združenjem

prispevkov posameznih negotovosti

𝑢𝑐,𝑟𝑒𝑙(𝛿13𝐶) = )𝑢𝑟𝑒𝑙

2 𝑝𝑜𝑛 + 𝑢𝑟𝑒𝑙2 RM1 + 𝑢𝑟𝑒𝑙

2 RM2 + 𝑢𝑟𝑒𝑙2 (𝑘𝑎𝑙 +𝑢𝑟𝑒𝑙

2 𝑅𝑤, 𝑄𝐶 + )𝑢(𝑏𝑖𝑎𝑠 2

𝑢𝑐 (𝛿13)𝐶 = 𝑢𝑐,𝑟𝑒𝑙(𝛿

13𝐶)𝛿13𝐶𝐴𝑉𝐸

razširjena merilna negotovost

kombinirana merilna negotovost

𝑈𝛿 = 2𝑢𝑐 (𝛿13𝐶)

faktor pokritja k = 2,

predstavlja 95% stopnjo zaupanja

HVALA ZA VAŠO POZORNOST!!