Massenspektrometrische Analytik von Proteinmodi kationen ... · Massenspektrometrische Analytik von Proteinmodi kationen in thermisch behandelter Milch Den Naturwissenschaftlichen

Massenspektrometrische Analytik

von Proteinmodi�kationen

in thermisch behandelter Milch

Den Naturwissenschaftlichen Fakult�aten

der Friedrich-Alexander-Universit�at Erlangen-N�urnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Jasmin Meltretter

aus Hammelburg

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakult�aten der

Universit�at Erlangen-N�urnberg

Tag der m�undlichen Pr�ufung: 26.10.2007

Vorsitzender

der Pr�ufungskommission: Prof. Dr. E. B�ansch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. M. Pischetsrieder

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. C.-M. Becker

Danksagung

Danksagung

Allen voran m�ochte ich meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Monika Pischetsrieder f�ur

die mir gew�ahrte freie Gestaltung meines Themas, die harmonische Zusammenarbeit

und ihre freundliche Unterst�utzung in jeglicher Hinsicht danken. Mein Dank gilt ferner

Frau Dr. In�es Birlouez-Aragon vom Institut National de la Recherche Agronomique

in Paris, die meinen dortigen Forschungsaufenthalt mit ihren kreativen Ideen und der

herzlichen Atmosph�are im Labor entscheidend mitgestaltet hat.

Meinen Dank m�ochte ich au�erdem Herrn Prof. Dr. C.-M. Becker f�ur die �Ubernahme

des Koreferates und Herrn Prof. Dr. R. Trosch�utz f�ur den Pr�ufungsvorsitz aussprechen.

Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn PD Dr. Andreas Humeny f�ur die Pr�ufung im

Nebenfach Biochemie, insbesondere aber auch f�ur die anf�angliche Hilfe bei meiner Ar-

beit, die zahlreichen Stunden, die er mit der Vermessung meiner Proben vebracht hat,

und die unterhaltsame und lehrreiche Zeit, die ich in der Biochemie mit ihm verbringen

durfte.

Gedankt sei auch Herrn Dr. Alexander Schmidt von der Eidgen�ossischen Technischen

Hochschule in Z�urich f�ur die Vermessung meiner Proben, Frau Dr. Katrin Sparbier

von Bruker Daltonics in Leipzig f�ur die Hilfe bei den Messungen, sowie den Domspitz

Milchwerken in Regensburg f�ur die freundliche Bereitstellung von Milchproben.

Mein besonderer Dank richtet sich an J�org sowie an meine Familie, insbesondere meine

Gro�mutter, meine Tante und meinen Vater, f�ur ihre stetige Unterst�utzung in allen

Lebenslagen.

Teile dieser Arbeit wurden bereits ver�o�entlicht in:

� Meltretter, J., Seeber, S., Humeny, A., Becker, C.-M., Pischetsrieder, M. Site-

speci�c formation of Maillard, oxidation, and condensation products from whey

proteins during reaction with lactose. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6096-6103

� Meltretter, J., Pischetsrieder, M. Application of mass spectrometry for the de-

tection of glycation and oxidation products in milk proteins. (akzeptiert zur Pu-

blikation in den Ann. N. Y. Acad. Sci.)

� Meltretter, J., Schmidt, A., Humeny, A., Becker, C.-M., Pischetsrieder, M. Ana-

lysis of the peptide pro�le of milk and its changes during thermal treatment and

storage. (eingereicht zur Publikation im J. Agric. Food Chem.)

� Meltretter, J., Pischetsrieder, M. Monitoring of whey protein modi�cations in

milk models during thermal treatment. Proceedings of the Euro Food Chem XIV

2007 in Paris: Food quality, an issue of molecule based science. Vol. 1, p. 68-71

� Meltretter, J., Pischetsrieder, M. Massenspektrometrische Untersuchung von Mol-

kenproteinmodi�kationen in erhitzten Milchmodellen. Kurzreferate des 36. Deut-

schen Lebensmittelchemikertages 2007 in Erlangen, S. 30

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Glossar vi

1 Einleitung 1

1.1 Die Milchproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Die Hitzebehandlung von Milch und Milchprodukten . . . . . . . . . . 5

1.2.1 Technologien zur Hitzebehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2.2 Chemische Reaktionen w�ahrend der Hitzebehandlung von Milch 5

1.2.3 Auswirkungen der Hitzebehandlung auf die Milchproteine . . . . 13

1.3 Methoden zur Beurteilung einer Hitzebehandlung von Milch . . . . . . 15

1.3.1 Klassische Hitzeindikatoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.2 Massenspektrometrische Analytik der Proteinver�anderungen . . 17

1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2 Analyse von Molkenproteinmodi�kationen in Milchmodellen 22

2.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin nach Erhitzen im Milch-

modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.1 Analyse der Modi�kationen am intakten �-Lactalbumin . . . . . 23

2.2.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin nach partieller

enzymatischer Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.3 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin nach Erhitzen imMilch-

modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3.1 Analyse der Modi�kationen am intakten �-Lactoglobulin . . . . 31

2.3.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin nach partieller

enzymatischer Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

i

Inhaltsverzeichnis

3 Analyse der Proteinmodi�kationen in Milchprodukten 47

3.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.2 Untersuchung der Modi�kationen an intakten Molkenproteinen aus Milch-

produkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.2.1 Direkte Vermessung mittels MALDI-TOF-MS . . . . . . . . . . 48

3.2.2 Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nach metalla�nit�atschro-

matographischer Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.3 Methoden zur Proteinisolierung f�ur einen anschlie�enden enzymatischen

Verdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.3.1 Proteinisolierung mittels Immunoa�nit�atschromatographie . . . 52

3.3.2 Auftrennung von Proteinen mittels Gelelektrophorese . . . . . . 54

3.4 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin aus Milchprodukten . 58

3.4.1 Analyse der mit Lactose inkubierten Modellproteine . . . . . . . 60

3.4.2 Analyse von erhitzter Rohmilch . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.4.3 Analyse von Handelsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.5 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4 Untersuchung der niedermolekularen Proteinfraktion der Milch 72

4.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.2 Analyse der niedermolekularen Proteinfraktion von Rohmilch . . . . . . 73

4.3 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Erhitzung 75

4.3.1 Analyse von erhitzter Rohmilch . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.3.2 Analyse von erhitzter Molke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.3.3 Analyse der erhitzten Caseinfraktion . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.4 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Lagerung . 78

4.4.1 Lagerversuche mit ESL-Milch bei K�uhlschranktemperatur . . . 79

4.4.2 Lagerversuche mit UHT-Milch bei Raumtemperatur . . . . . . . 80

4.4.3 Lagerversuche mit Sterilmilch bei Raumtemperatur . . . . . . . 80

4.5 Untersuchung von Handelsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4.6 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5 Vergleich verschiedener Erhitzungsindikatoren von Milch 90

5.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

5.2 Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Protein nach Lowry . 91

ii

Inhaltsverzeichnis

5.3 Quanti�zierung des bei pH 4,6 l�oslichen �-Lactalbumins und �-Lacto-

globulins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.4 Bestimmung des FAST-Indexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

5.5 Relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin . . . 96

5.6 Korrelationen zwischen den analysierten Hitzeindikatoren . . . . . . . . 98

5.6.1 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem Protein . . . . . . 99

5.6.2 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin . . 101

5.6.3 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactoglobulin . 102

5.6.4 Amadoriprodukt von �-Lactalbumin { Gehalt an bei pH 4,6 l�osli-

chem Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102


chem �-Lactalbumin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103


chem �-Lactoglobulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

5.6.7 Amadoriprodukt von �-Lactalbumin { FAST-Index . . . . . . . 104

5.7 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6 Material und Methoden 111

6.1 Ger�ate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.2 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.3 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

6.4 Kommerziell erh�altliche Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

6.5 Herstellung von L�osungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

6.6 Methoden zur Analyse von Proteinmodi�kationen in Milchmodellen . . 117

6.6.1 Vorversuche zur Optimierung der experimentellen Parameter . . 117

6.6.2 Erhitzen der Molkenproteine im Milchmodell . . . . . . . . . . . 120

6.6.3 Oxidation der Molkenproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.6.4 Partielle enzymatische Proteinhydrolyse mit den Endoprotein-

asen AspN und Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.6.5 Vermessung der Proben mittels MALDI-TOF-MS . . . . . . . . 121

6.6.6 Proteindatenbanksuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

6.7 Methoden zur Analyse der Proteinmodi�kationen in Milchprodukten . . 122

6.7.1 Untersuchung von Modi�kationen an intakten Molkenproteinen

in Milch und Milchprodukten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

iii

Inhaltsverzeichnis

6.7.1.1 Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.7.1.2 Entfetten der Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.7.1.3 Direkte Vermessung mittels MALDI-TOF-MS . . . . . 122

6.7.1.4 Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nach metalla�-

nit�atschromatographischer Aufreinigung . . . . . . . . 123

6.7.2 Methoden zur Proteinisolierung f�ur den anschlie�enden partiellen

enzymatischen Verdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

6.7.2.1 Isolierung von Proteinen mittels Immunoa�nit�atschro-

matographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

6.7.2.2 Auftrennung von Proteinen mittels eindimensionaler

SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

6.7.2.3 Auftrennung von Proteinen mittels zweidimensionaler

SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

6.7.3 Analyse der Modi�kationen an �-Lactoglobulin in Milch und

Milchprodukten nach gelelektrophoretischer Auftrennung und par-

tieller enzymatischer Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

6.7.3.1 Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

6.7.3.2 Erhitzen der Rohmilch . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

6.7.3.3 Auftrennung der Milchproteine mittels SDS-PAGE . . 126

6.7.3.4 Partielle enzymatische Hydrolyse der Proteine im Gel

mit AspN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

6.7.3.5 Elution der Peptide aus dem Gel . . . . . . . . . . . . 128

6.7.3.6 Aufreinigung der eluierten Peptide f�ur die Messung . . 129

6.7.3.7 MALDI-TOF-MS-Messung der Peptide . . . . . . . . . 130

6.7.3.8 Proteindatenbanksuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

6.7.3.9 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

6.8 Methoden zur Analyse der niedermolekularen Proteinfraktion in Milch . 131

6.8.1 Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

6.8.2 Entfetten der Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

6.8.3 Isolierung von Casein- und Molkenfraktion der Rohmilch . . . . 131

6.8.4 Erhitzen der Rohmilch, der Casein- und der Molkenfraktion . . 132

6.8.5 Lagerversuche mit hocherhitzter, ultrahocherhitzter und sterili-

sierter Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

iv

Inhaltsverzeichnis

6.8.6 Aufreinigung der Milchproteine mittels immobilisierter Metallaf-

�nit�atschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

6.8.7 MALDI-TOF-MS-Analyse der Peptide . . . . . . . . . . . . . . 132

6.8.8 MALDI-TOF/TOF-MS-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

6.8.9 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

6.9 Methoden zum Vergleich verschiedener Erhitzungsindikatoren von Milch 133

6.9.1 Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

6.9.2 Entfetten der Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

6.9.3 Erhitzen der Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

6.9.4 Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molkenproteine 134

6.9.5 Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Protein nach

Lowry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

6.9.6 Quanti�zierung von �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin mittels

HPLC/Fluoreszenzdetektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

6.9.7 Bestimmung des FAST-Indexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

6.9.8 Relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin

mittels MALDI-TOF-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

6.9.9 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

7 Zusammenfassung 138

8 Summary 144

Literaturverzeichnis 149

Lebenslauf 165

v

Glossar

Glossar

AP Amadoriprodukt, Seite 61

AS Aminos�aure, Seite 28

Cca �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure, Seite 113

Cca/Dhb �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure/2,5-Dihydroxybenzoes�aure, Seite 48

Cml N�-Carboxymethyllysin, Seite 10

Da Dalton, Seite 3

d Tag(e), Seite 6

Dhap 2,5-Dihydroxyacetophenon, Seite 48

Dhb 2,5-Dihydroxybenzoes�aure, Seite 113

Dtt Dithiothreitol, Seite 114

Esi Elektrospray-Ionisierungs-, Seite 17

Esl Extended shelf life, verl�angerte Haltbarkeit, Seite 48

exp. exponentiell, Seite 100

h Stunde(n), Seite 6

Hmf 5-Hydroxymethylfurfural, Seite 7

Hplc Hochleistungs �ussigchromatographie, Seite 16

vi

Iac Immunoa�nit�atschromatographie, Seite 52

Imac Immobilisierte Metalla�nit�atschromatographie, Seite 51

Konz. Konzentration, Seite 3

KS K�uhlschranktemperatur, Seite 6

lin. linear, Seite 100

Maldi-Tof-Ms Matrixunterst�utzte Laserdesorptions-/Ionisierungs-Flugzeit-

Massenspektrometrie, Seite 17

Metox Methioninsulfoxid, Seite 61

min Minute(n), Seite 6

m Monat(e), Seite 6

Ms/Ms Tandemmassenspektrometrie, Seite 51

Ms Massenspektrometrie, Seite 17

m/z Masse pro Ladung, Seite 29

pI Isoelektrischer Punkt, Seite 56

pot. potentiell, Seite 100

p Signi�kanzniveau, Seite 77

r Korrelationskoe�zient, Seite 100

RT Raumtemperatur, Seite 6

Sds Sodiumdodecylsulfat, Seite 54

Sds-Page Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese, Seite 24

s Sekunde(n), Seite 6

Uht Ultrahocherhitzt, Seite 48

w Woche(n), Seite 6

vii

Abbildungsverzeichnis


1.1 Schematische Darstellung einer Caseinmicelle . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Zuckerabbau in erhitzter Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3 Die fr�uhe Phase der Maillard-Reaktion in Milch . . . . . . . . . . . . . 9

1.4 Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion in erhitzter

Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.5 Abbau des Amadoriprodukts zu Cml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.6 Einige Quervernetzungsprodukte in Milch . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.7 Strukturen aus der Oxidation der Aminos�auren Tryptophan, Methionin

und Cystein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.8 Schematischer Aufbau eines Maldi-Tof-Massenspektrometers . . . . . 19

2.1 Sds-Page des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins . . . . . . . . . 24

2.2 Methodenprinzip zur Identi�zierung von Modi�kationen am intakten

Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins 26

2.4 Schematische Darstellung des"Peptide mappings\ . . . . . . . . . . . . 27

2.5 Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins

nach Hydrolyse mit AspN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.6 Reaktion einer N-terminalen Glutamins�aure zum Pyrrolidon . . . . . . 30

2.7 Maldi-Tof-Ms-Spektren des oxidierten �-Lactalbumins nach Hydro-

lyse mit Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.8 Sds-Page des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins . . . . . . . . 33

2.9 Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins 34

2.10 Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins

nach Hydrolyse mit AspN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

viii


2.11 Maldi-Tof-Ms-Spektren des oxidierten �-Lactoglobulins nach Hydro-

lyse mit AspN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.12 Postulierte Modi�kationsstellen in der Sequenz von �-Lactalbumin . . . 39

2.13 Postulierte Modi�kationsstellen in der Sequenz von �-Lactoglobulin . . 40

2.14 �Uberblick �uber einige relevante Oxidationsreaktionen von Aminos�auren 43

2.15 Mechanismus der Oxidation von Lysin zum Lysinaldehyd . . . . . . . . 44

3.1 Maldi-Tof-Ms-Spektren von �-Lactalbumin aus Handelsproben . . . 49

3.2 Maldi-Tof-Ms-Spektren von �-Lactoglobulin aus Handelsproben . . 50

3.3 Methodenprinzip zur Aufreinigung von Milch mittels Imac-Cu-Kit . . . 51

3.4 Methodenprinzip zur Aufreinigung von Milch mittels Iac-Kit . . . . . . 52

3.5 Maldi-Tof-Ms-Spektren von Milch vor und nach Immunoa�nit�atschro-

matographie mit einem Antik�orper gegen �-Lactalbumin . . . . . . . . 53

3.6 Maldi-Tof-Ms-Spektren von Milch vor und nach Immunoa�nit�atschro-

matographie mit einem Antik�orper gegen �-Lactoglobulin . . . . . . . . 54

3.7 Eindimensionale Sds-Page von Rohmilch . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.8 Zweidimensionale Sds-Page von Rohmilch . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.9 Zweidimensionale Sds-Page glykierter Modellproteine . . . . . . . . . 57

3.10 Zweidimensionale Sds-Page von Sterilmilch . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.11 Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins

nach partieller enzymatischer Hydrolyse im Gel . . . . . . . . . . . . . 61

3.12 Maldi-Tof-Ms-Spektren des �-Lactoglobulins aus erhitzter Rohmilch

nach partieller enzymatischer Hydrolyse im Gel . . . . . . . . . . . . . 63

3.13 Relative Quanti�zierung der Amadoriprodukte von �-Lactoglobulin in

Handelsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.14 Relative Quanti�zierung der Methioninsulfoxide von �-Lactoglobulin in

Handelsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.1 H�ohermolekularer Massenbereich von Milch nach der Aufreinigung mit-

tels Imac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2 Peptidspektren vor und nach der Aufreinigung mittels Imac-Cu-Kit . . 75

4.3 Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Rohmilch . . . . . . 76

4.4 Relative Quanti�zierung der bei der Erhitzung entstehenden Peptide . 77

4.5 Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Molke . . . . . . . . 78

ix


4.6 Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Caseine . . . . . . . 79

4.7 Maldi-Tof-Ms-Spektren der gelagerten Uht-Milch . . . . . . . . . . 80

4.8 Relative Quanti�zierung des bei der Lagerung von Uht-Milch anstei-

genden Peptids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

4.9 Maldi-Tof-Ms-Spektren der gelagerten Sterilmilch . . . . . . . . . . 81

4.10 Maldi-Tof-Ms-Spektren einiger Handelsproben . . . . . . . . . . . . 83

4.11 Mechanismen der radikalischen Fragmentierung des Proteinr�uckgrats . 87

5.1 Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem Protein nach Lowry in Abh�angigkeit von

Erhitzungsdauer und -temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.2 Hplc-Chromatogramme der bei 100 °C erhitzten Milch . . . . . . . . . 94

5.3 Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin in Abh�angigkeit

von Erhitzungsdauer und -temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.4 Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactoglobulin in Abh�angigkeit

von Erhitzungsdauer und -temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.5 Fast-Index in Abh�angigkeit von Erhitzungsdauer und -temperatur . . 96

5.6 Maldi-Tof-Ms-Spektren von Rohmilch in verschiedenen Matrices . . 97

5.7 Maldi-Tof-Ms-Spektren von bei 80 °C erhitzter Milch . . . . . . . . 98

5.8 Relativer Gehalt des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin in Abh�angig-

keit von Erhitzungsdauer und -temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.9 Korrelation zwischen Fast-Index und l�oslichem Protein . . . . . . . . . 101

5.10 Korrelation zwischen Fast-Index und l�oslichem �-Lactalbumin . . . . . 101

5.11 Korrelation zwischen Fast-Index und l�oslichem �-Lactoglobulin . . . . 102

5.12 Korrelation zwischen Amadoriprodukt und l�oslichem Protein . . . . . . 103

5.13 Korrelation zwischen Amadoriprodukt und l�oslichem �-Lactalbumin . . 104

5.14 Korrelation zwischen Amadoriprodukt und l�oslichem �-Lactoglobulin . 105

5.15 Korrelation zwischen Amadoriprodukt und FAST-Index . . . . . . . . . 106

x

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

1.1 Zusammensetzung von Kuhmilch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Charakteristische Daten der Milchproteine . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.3 Technologien zur Hitzebehandlung von Milchprodukten . . . . . . . . . 6

1.4 Vitaminverluste w�ahrend der Erhitzung von Milch . . . . . . . . . . . . 13

2.1 Detektierte Modi�kationen in �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin nach

Reaktion mit Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2 Detektierte Modi�kationen in oxidiertem �-Lactalbumin und �-Lacto-

globulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.1 Detektierte Modi�kationen von �-Lactoglobulin in erhitzter Milch und

Milchprodukten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.1 Detektierte Peptide in verschiedenen Milchproben . . . . . . . . . . . . 84

5.1 Korrelationskoe�zienten der untersuchten Hitzeindikatoren . . . . . . . 100

6.1 Optimierung der eingesetzten Molarit�aten an Molkenprotein bzw. Milch-

zucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

6.2 Verd�unnung der Milchproben f�ur die eindimensionale Sds-Page . . . . 127

6.3 Hplc-Parameter f�ur die Quanti�zierung der Molkenproteine . . . . . . 136

xi

Tabellenverzeichnis

xii

1 Einleitung

Milch stellt das erste Lebensmittel dar, das dem Menschen nach der Geburt begegnet.

Sie bietet ihm in den ersten Wochen und Monaten die ideale Quelle aller N�ahrsto�e

f�ur ein gesundes Wachstum. Auch im Laufe seines Lebens verliert die Milch nicht

ihre zentrale Rolle in der Ern�ahrung des Menschen. So deckt der durchschnittliche

Verbraucher in Deutschland 16 % seines Energiebedarfs durch Milch und Milchprodukte

[1]. Die weltweite landwirtschaftliche Milchproduktion liegt bei 60 Millionen Tonnen im

Jahr, wobei Kuhmilch mit 85 % den gr�o�ten Anteil liefert, w�ahrend Milch von anderen

Tierarten wie Schafen, Ziegen oder B�u�eln von wesentlich geringerer Bedeutung ist [1].

Milch enth�alt alle wesentlichen Bestandteile, die das Neugeborene zum Aufbau von

Knochen und K�orpermasse ben�otigt. Mengenm�a�ig dominierend ist mit Abstand Was-

ser, gefolgt von Lactose als vorherrschendem Kohlenhydrat, Fetten und, als besonders

wertgebendem Inhaltssto�, den Milchproteinen. Zudem sind Mineralsto�e und in Spu-

ren Vitamine, Enzyme und weitere Minorbestandteile zu �nden. Bei der Milch handelt

es sich um ein komplexes biologisches System, das Eigenschaften einer echten L�osung,

einer Emulsion und zugleich einer kolloidalen Suspension aufweist: Die Zucker, Salze

und ein Teil der Proteine liegen gel�ost vor, die Lipide emulgiert, w�ahrend der Gro�-

teil des Eiwei�es kolloidal in der Milchmatrix suspendiert ist [2]. Die Synthese der

Milchinhaltssto�e �ndet teils in der Brustdr�use selbst statt (Lactose, Fette, Caseine,

�-Lactoglobulin, �-Lactalbumin), teils gelangen sie nach Passage durch die Zellmem-

branen aus dem Blut direkt in die Milch (Immunoglobuline, Serumalbumin, Vitamine,

Mineralsto�e) [2].

Die genaue Zusammensetzung von Kuhmilch ist stark abh�angig von Rasse, Alter, Ge-

sundheitszustand, Laktationszeit und Futter der Tiere. In Tab. 1.1 werden die Hauptin-

haltssto�e von Kuhmilch und ihre durchschnittlichen Konzentrationen aufgelistet.

1

1 Einleitung

Tab. 1.1: Zusammensetzung von Kuhmilch (nach [3]).

Inhaltssto� mittlerer Anteil Schwankungsbreite

in % (m/m) in % (m/m)

Wasser 87,3 85,5 - 88,7

Fett 3,9 2,4 - 5,5

Proteine 3,3 2,3 - 4,4

Lactose 4,6 3,8 - 5,3

Mineralsto�e 0,7 0,5 - 0,8

Andere * 0,2 0,1 - 0,3

* Enzyme, Vitamine u. a.

1.1 Die Milchproteine

Die Proteine der Kuhmilch geh�oren zu den am besten untersuchten und charakterisier-

ten Proteinen, was auf ihren hohen Stellenwert in der menschlichen Ern�ahrung zur�uck-

zuf�uhren ist. So deckt bereits ein Liter Milch 40 % des t�aglichen Proteinbedarfs eines

gesunden Erwachsenen [1]. Die gro�e physiologische Bedeutung der Milchproteine l�asst

sich durch ihre gute Verdaubarkeit sowie ihre Aminos�aurezusammensetzung erkl�aren,

die dem f�ur den Aufbau von menschlichem K�orperprotein ben�otigten Verh�altnis sehr

nahe kommt und damit eine hohe biologische Wertigkeit bietet [4].

Tabelle 1.2 gibt einen �Uberblick �uber die wichtigsten Kuhmilchproteine, ihre Konzen-

trationen in Milch und einige ihrer charakteristischen Eigenschaften. Man unterscheidet

zwei Hauptgruppen von Milchproteinen, namentlich die Caseine und die Molkenpro-

teine. Etwa 80 % des Eiwei�es machen die Caseine aus, die beim Ans�auern der Milch

auf pH 4,6, ihrem isoelektrischen Punkt, ausfallen und sich in �s1-Casein, �s2-Casein,

�-Casein, die -Caseine und �-Casein einteilen lassen. Es handelt sich hierbei um eine

Gruppe von meist relativ stark phosphorylierten Proteinen, die trotzdem �uberwiegend

hydrophobe Eigenschaften besitzen und �uber Komplexe, die sogenannten Micellen, in

L�osung gehalten werden. Submicellen aus ca. zehn Caseinmolek�ulen lagern sich zu

im Durchmesser bis zu 180 nm starken Micellen zusammen. Diese werden �uber Cal-

ciumphosphatbr�ucken zusammengehalten und mit Hilfe von Kohlenhydratresten der

�-Caseine, die sich an der Au�enseite der Micelle anlagern, in der w�assrigen Milchma-

trix stabilisiert (siehe Abb. 1.1) [2].

2

1.1 Die Milchproteine

Tab. 1.2: Durchschnittliche Konzentrationen und charakteristische Daten der wichtigstenMilchproteine (nach [5{7]).

Protein Konz. Molekular- Disul�d- Phospho- Glyko-

in g/l gewicht in Da br�ucken protein protein

Caseine

�s1-Casein B 12 - 15 22974 nein ja nein

�s2-Casein A 3 - 4 24348 ja ja nein

�-Casein A1 23583 nein ja nein

�-Casein A2 9 - 11 23623 nein ja nein

�-Casein B 23692 nein ja nein

�-Casein A 2 - 4 18974 ja ja ja

�-Casein B 18942 ja ja ja

1-Casein 20442 nein ja nein

2-Casein 0,8 11823 nein nein nein

3-Casein 11558 nein nein nein

Molkenproteine

�-Lactalbumin 0,6 - 1,7 14185 ja nein nein

�-Lactoglobulin A 2-4 18366 ja nein nein

�-Lactoglobulin B 18280 ja nein nein

Serumalbumin 0,4 66433 ja nein nein

Immunoglobuline G 0,3 - 0,6 ca. 150000 ja nein ja

Proteoso Peptone 0,8 3000-28000 nein ja ja (PP3)

Bei Absinken des pH-Werts auf 4,6 wird die Ausbildung der Calciumphosphatbr�ucken

unterbunden und es kommt zur Pr�azipitation der Caseine. Ein vergleichbares Resultat

erh�alt man, wenn z. B. bei der K�aseherstellung durch Enzymzugabe die Kohlenhydrat-

reste der �-Caseine abgespalten werden und so die Micellen ihre Stabilit�at verlieren.

Die heterogene Gruppe der -Caseine wird durch partielle Proteolyse des �-Caseins

durch die milcheigene alkalische Proteinase Plasmin gebildet [8]. Dieser Vorgang �ndet

schon im Euter statt, so dass bereits in der Rohmilch -Caseine enthalten sind.

3

1 Einleitung

Submicelle

Calciumphosphat

Kohlenhydratrest

Abb. 1.1: Schematische Darstellung einer Caseinmicelle.

Die Molkenproteine stellen ungef�ahr 20 % des Milchproteins dar und bleiben bei

pH 4,6 in L�osung. Hauptbestandteil der Molke ist �-Lactoglobulin, zudem �nden sich

�-Lactalbumin, Serumalbumin, die Immunoglobuline und die sogenannten Proteoso

Peptone. Letztere de�nieren sich dadurch, dass sie ihre L�oslichkeit nach Erhitzen auf

95 °C f�ur 20-30 Minuten bei pH 4,6 beibehalten, und bestehen aus Proteolysefrag-

menten des �-Caseins sowie Membranproteinen [2]. Die Molkenproteine unterscheiden

sich von den Caseinen durch einen erh�ohten Gehalt an essentiellen Aminos�auren wie

Lysin, Tryptophan und Methionin, was sie zu einem Nahrungsprotein mit einer sehr

hohen biologischen Wertigkeit macht. Auch aufgrund ihrer technologischen Eigenschaf-

ten �nden sie daher zahlreichen Einsatz in der Lebensmittelindustrie, wie z. B. in

Kindern�ahrmitteln, Sportlernahrung oder Getr�anken [9]. Zudem weisen die Molken-

proteine eine kompaktere Struktur als die Caseine auf, was sie resistenter gegen den

Angri� von Proteinasen macht [2]. Ein weiteres Merkmal dieser Proteingruppe ist ihre

erh�ohte Emp�ndlichkeit gegen�uber Hitze: Ab Temperaturen von ca. 60 °C setzt der

Prozess der Denaturierung ein, bei dem sich die Proteine aufgrund der thermischen

Energie entfalten, teils sehr komplexe Aggregate bilden und folglich unl�oslich werden

[10]. Ausgenommen davon sind lediglich, wie bereits angemerkt, die �au�erst hitzesta-

bilen Proteoso Peptone.

4

1.2 Die Hitzebehandlung von Milch und Milchprodukten

Einen weiteren, wenn auch anteilsm�a�ig geringeren Bestandteil der Eiwei�fraktion

stellen die Enzyme der Milch dar, die entweder nativ in der Milch vorkommen oder von

au�en, z. B. durch Bakterien, eingetragen werden. Es konnten bislang ca. 60 Enzyme

in der Milch identi�ziert werden. Sie weisen teils technologische und organoleptische

(Lipasen, Proteasen) und teils antibakterielle Bedeutung (Lysozym, Lactoperoxidase)

auf oder k�onnen zum Nachweis von mangelnder Hygiene (Enzyme somatischer Zellen)

bzw. thermischer Behandlung (Phosphatase, Peroxidase) herangezogen werden [2].

1.2 Die Hitzebehandlung von Milch und Milchpro-

dukten

1.2.1 Technologien zur Hitzebehandlung

Ohne ausreichenden Schutz verliert Milch bei der Lagerung sehr schnell ihre urspr�ung-

lichen Eigenschaften. Dies ist vor allem auf das Einwirken verschiedenster, in der Milch

nat�urlich vorkommender Bakterien oder durch das Eintragen von Keimen von au�en

zur�uckzuf�uhren. Milch und Milchprodukte werden daher in der Regel einer Hitzebe-

handlung unterzogen, die die mikrobielle Stabilit�at des Produkts und den Erhalt der

nat�urlichen Eigenschaften der Milch zum Ziel hat. Zudem stellen verschiedene techno-

logische Schritte w�ahrend der Produktherstellung eine thermische Belastung dar, z. B.

die Hydrolyse bei der Herstellung hypoallergener Lebensmittel oder die Spr�uhtrock-

nung zur Produktion von Milchpulvern. In Tabelle 1.3 werden typische Technologien

zur Hitzebehandlung kurz erl�autert.

1.2.2 Chemische Reaktionen w�ahrend der Hitzebehandlung von

Milch

Parallel zur Inaktivierung von Mikroorganismen l�auft eine Vielzahl von weiteren Re-

aktionen w�ahrend der thermischen Behandlung von Milchprodukten ab, die die tech-

nologischen, bioaktiven und ern�ahrungsphysiologischen Eigenschaften der Milch { im

positiven Sinne wie im negativen { ver�andern k�onnen und im Folgenden vorgestellt

werden.

5

1 Einleitung

Tab.1.3:TechnologienzurHitzebehandlungvonMilchprodukten,deren

Ausw

irkungenaufKeimgehaltundHaltbarkeit

undtypischeAnwendungen.

Hitzebehandlung

Tem

peratur

Dauer

Ausw

irkungaufKeime

Haltbarkeit

Anwendung

Pasteurisation

72-75

°C15

-30

spathogeneabget �otet

7d(K

S)

Trinkmilch,Milch

f �urK�aseherstellung

Hocherhitzung

85-95

°C4s

pathogeneabget �otet

3w(K

S)

Trinkmilch,

Rahm

Ultrahocherhitzung

135-150°C

2-20

svollst�andigabget �otet

3-6m

(RT)

Trinkmilch,

Molke

Sterilisation

109-120°C

20-40

min

Keime,Sporen

abget �otet

6-12

m(RT)

Kondensm

ilch,

S�auglingsnahrung

Trocknung

90-95

°C,

3-5min,

pathogeneabget �otet

6-12

m(RT)

Milchpulver,

150-300°C

weniges

S�auglingsnahrung

KS:Lagerungim

K�uhlschrank.

RT:LagerungbeiRaumtemperatur.

s:Sekunden.min:Minuten.h:Stunden.d:Tage.w:Wochen.m:Monate.

6


Denaturierung der Proteine

Die Erhitzung von Milch f�uhrt zu einer Konformations�anderung der Proteine, was vor

allem an den Molkenproteinen deutlich wird. W�ahrend sich die Micellstrukturen der

Caseine bei Temperaturen bis 130 - 140 °C relativ stabil verhalten, kommt es in den

Molkenproteinen schon ab Temperaturen von 60 °C zur Aufhebung der labilen Kr�afte

(z. B. Wassersto�br�ucken oder hydrophobe Wechselwirkungen). Als Folge davon ent-

falten sich die Proteine, hydrophobe Reste sowie Thiolgruppen werden freigelegt und

es kommt zur Herabsetzung der L�oslichkeit und zur Aggregatbildung durch Disul-

�dbr�ucken zwischen den verschiedenen Milchproteinen [10].

Zuckerabbau ohne Reaktionspartner

Ab Temperaturen von 90 - 95 °C wird Lactose im Sauren zu Galactose und Glucose

hydrolysiert. Diese Reaktion ist jedoch in den meisten Milchprodukten nur von gerin-

gerer Bedeutung [10]. Mehr ins Gewicht f�allt hingegen die Isomerisierung von Lactose

zu Lactulose, wenn in Folge der Hitzeeinwirkung der Glucoseanteil im Milchzucker in

der sogenannten Lobry-de-Bruyn-Alberda-van-Ekenstein-Umlagerung zu Fructose iso-

merisiert [11]. Des Weiteren wird Lactose bei thermischer Belastung einem je nach

Reaktionsbedingungen stark variierenden Abbau, der Karamelisierung, unterworfen.

Dieser beschr�ankt sich in Milch haupts�achlich auf den 3-Desoxy- und den 1-Desoxyweg,

w�ahrend der f�ur Disaccharide ebenfalls beschriebene 4-Desoxyweg vor allem bei alkali-

schem pH-Wert abl�auft [12] und daher in Milch nur eine untergeordnete Rolle einnimmt.

Abbildung 1.2 zeigt die wesentlichen Reaktionen, die beim Zuckerabbau w�ahrend der

Erhitzung von Milch ablaufen.

Bei den intermedi�ar gebildeten Verbindungen 1-Desoxyoson und 3-Desoxyoson han-

delt es sich um reaktive Substanzen, die nur schwer nachweisbar sind und sehr schnell

zu stabilen Produkten abreagieren. Im 3-Desoxyweg wird unter sauren Bedingungen

u. a. 5-Hydroxymethylfurfural (Hmf) gebildet; da in Milch jedoch nur leicht saure

Bedingungen vorliegen (pH ca. 6,8), �ndet man diese Komponente in sehr geringen

Konzentrationen [11]. Zudem entsteht durch Fragmentierung des Zuckerger�usts Amei-

sens�aure, die haupts�achlich f�ur den pH-Abfall veantwortlich ist, den man beim Erhitzen

von Milch beobachten kann [11]. Parallel entsteht eine C5-Komponente sowie Galactose,

die selbst wiederum zu ihrem Isomer Tagatose weitereagieren kann und ebenfalls Amei-

sens�aure freisetzt [11]. Im nahezu neutralen Milieu der Milch l�auft jedoch haupts�achlich

7

1 Einleitung

3-D

esox

yweg

C CH

HC C

H2O

H

HC

HC

OH

OH

HO

Gal

OH

C CH

HC C

H2O

H

HCC

OH

H

OH

HO

Gal

OH

C CH

HC C

H2O

H

HCC

OH

OH

Gal

OH

C CH

2

HC C

H2O

H

HCC

OH

OH

Gal

O

OC

CH

2OH

O H

HC

OO

H

CH

HC C

H2O

H

HCC

OH

HO

Gal

O

H2C

OH

C

HC C

H2O

H

HCC

OH

HO

Gal

OH

H2C

OH

C

HC C

H2O

H

HCC

OH

O

Gal

OH

H2C

C

HC C

H2O

H

HCC

OH

O Gal

O

H3C

OO

Gal

OH

CH

3O

OG

al

CH

3

O

O CH

3

OH

OH

OG

al

O

H2O

H2O

C5-

Kom

pone

nte

Gal

Lac

tose

Gal

= G

alac

tose

Cyc

lope

nten

on

1,2-

End

iol

3-D

esox

yoso

n

Am

eise

nsäu

re

Hyd

roxy

met

hylfu

rfur

al

Lac

tulo

se2,

3-E

ndio

l1-

Des

oxyo

son

β-Py

rano

n

1-D

esox

yweg

++

Gal

acto

se

Gal

acto

sylis

omal

tol

Abb. 1.2: Reaktionsgleichungen zum Abbau der Lactose in erhitzter Milch.

8


der 1-Desoxyweg ab, der zur Bildung von �-Pyranon und 3-Furanon f�uhrt, die auf-

grund ihrer mangelnden Stabilit�at weiterreagieren. So wird z. B. aus �-Pyranon und

dessen Isomer Cyclopentenon Galactosylisomaltol gebildet [12]. In Konkurrenz zu die-

sem Zuckerabbau steht die im Folgenden beschriebene Maillard-Reaktion, wobei bei

Temperaturen von 110 - 150 °C die Isomerisierungs- und Abbaureaktionen des Zuckers

deutlich �uberwiegen [11].

Die Maillard-Reaktion: Reaktion von Lactose mit Aminen

Eine besondere Stellung w�ahrend der Erhitzung von Milch nimmt die sogenannte

Maillard-Reaktion, die auch unter den Begri�en nicht-enzymatische Br�aunung oder

nicht-enzymatische Glykierung bekannt ist, ein. Dabei reagiert in der fr�uhen Phase der

reduzierende Milchzucker Lactose mit der Aminogruppe, in der Regel von proteingebun-

denem Lysin, zur Schi�schen Base, die zu Lactulosyllysin (dem"Amadori-Produkt\)

umgelagert wird (s. Abb.1.3) [13]. Letzteres ist in Milch relativ stabil, sofern nicht allzu

drastische Temperaturbedingungen vorliegen.

Lysin

C

CH

HC

CH2OH

HC

HC

OH

OH

HO

Gal

OH

NH2

C

CH

HC

CH2OH

HC

HC

H

OH

HO

Gal

OH

Prot

N ProtH2C

CH

HC

CH2OH

HC

C

OH

HO

Gal

O

NH ProtH2O

Lactulosyllysin(Amadoriprodukt)

LactoseGal = Galactose

SchiffscheBase

Amadori-Umlagerung

Abb. 1.3: Die fr�uhe Phase der Maillard-Reaktion in Milch.

In der fortgeschrittenen Phase wird Lactulosyllysin �uber Enolformen einem je nach

Reaktionsbedingungen stark variierenden Abbau unterworfen, der dem Zuckerabbau

�ahnelt. Infolgedessen werden Produkte des Zuckerabbaus auch in der Maillard-Reaktion

gebildet. Bei letzterer laufen jedoch die Reaktionen wesentlich schneller ab, was auf

9

1 Einleitung

CCH2OHO

H

O Gal

CH3

O

NH2

CH2 4

COOHCH

O

CH3N

OH

NH2

CH2 4

COOHCH

N

CH2 4

NH2 COOHCH

N

Lysylpyrralin Acetylpyrrol Maltosin

Abb. 1.4: Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion in erhitzter Milch.

die Katalysatorwirkung der Amine zur�uckzuf�uhren ist. Zudem entstehen durch Ein-

bau von Aminkomponenten zus�atzlich zahlreiche sticksto�haltige Verbindungen (siehe

Abb. 1.4).

So bildet sich z. B. im 3-Desoxyweg in geringen Konzentrationen Lysylpyrralin als

Sticksto�analoges zum Hydroxymethylfurfural [14]. Die im 1-Desoxyweg entstehenden

Verbindungen �-Pyranon, Cyclopentenon und Galactosylisomaltol k�onnen in Anwe-

senheit von Aminen z. B. weiter zu Acetylpyrrol reagieren [12]. Weitere Produkte der

fortgeschrittenen Maillard-Reaktion stellen Maltol und sein Sticksto�analoges Maltosin

dar, die jedoch �uber den 4-Desoxyweg gebildet werden und daher in nur sehr geringen

Mengen vorkommen [13].

Unter oxidativen Bedingungen kann aus dem Amadoriprodukt au�erdem durch Frag-

mentierung des Zuckerger�usts N�-Carboxymethyllysin (Cml) entstehen [15]; gleichzei-

tig werden dabei Erythrons�aure und Galactose freigesetzt (siehe Abb. 1.5). Mittler-

Amadoriprodukt Nε-Carboxymethyllysin Erythronsäure Galactose

+ +

C O

H2C NH

OH

CH2 4

NHR

COR

CHC

HC

CH2OH

HC

OH

OH

O

OH

O Gal

H2C

CH

HC

CH2OH

HC

C

OH

HO

Gal

O

NH Prot

Abb. 1.5: Abbau des Amadoriprodukts zu Cml.

10


Pentosidin Histidinomethylalanin

+N

N

N

RNH

CH2 4

CORCH

NH CH2 3CH

COR

NHR

HC

RCO

RNH

CH2 4 NH C

O

CH2 CH

COR

NHR

HC

ROC

RHN

CH2 S CH2 CH

COR

NHR

HC

RCO

RNH

CH2 NH CH2 4CH

COR

NHR

NN

CH2

RNH CH COR

CHH3C

RNH CH COR

H

LysinoalaninLanthionin Isopeptidbindung(Asparaginsäure + Lysin)

Abb. 1.6: Einige Quervernetzungsprodukte in Milch.

weile wurden in der Literatur weitere Mechanismen zur Bildung vonCml vorgeschlagen

[16, 17].

Im Zuge der intermedi�aren Phase kommt es zus�atzlich zu den beschriebenen Ab-

baureaktionen auch zu zahlreichen Quervernetzungen zwischen Aminos�aureresten, die

unabh�angig von der Anwesenheit von Zuckern sind. Als in der Milch beschriebene Pro-

dukte sind hierbei z. B. Pentosidin, Lysinoalanin und Isopeptidbindungen zu nennen,

die jedoch allesamt in nur sehr geringen Konzentrationen vorzu�nden sind [18{20]. In

Abb. 1.6 werden einige der in erhitzter Milch detektierten Quervernetzungsprodukte

gezeigt.

In der sp�aten Phase der Maillard-Reaktion bilden sich schlie�lich �uber Kondensie-

rungen die sogenannten Melanoidine, eine hochmolekulare, heterogene Gruppe stick-

sto�haltiger Substanzen, die zur Braunf�arbung des Lebensmittels f�uhren, deren genaue

Strukturen jedoch bis heute nur wenig charakterisiert werden konnten.

11

1 Einleitung

HC

C

HN

R

O

R

CH2 S OHHC

C

HN

R

O

R

CH2 S CH3CH2

O

NH2

CH2 CHNH2

COOHC

O

Kynurenin Methioninsulfoxid Cysteinsulfensäure

Abb. 1.7: Strukturen aus der Oxidation der Aminos�auren Tryptophan, Methionin und Cy-stein.

Oxidativer Abbau von Aminos�auren

W�ahrend der Maillard-Reaktion kommt es �uber �-Hydroxycarbonylverbindungen (z. B.

aus Zuckern) [21], Partialstrukturen quervernetzter Proteine [22] oder die Amadori-

produkte [23] zur Bildung des Superoxidradikalanions, welches zu Wassersto�peroxid

weiterreagiert. Dieses bildet unter Einwirkung von Metallionen, die im Lebensmittel

stets in Spuren vorkommen oder z. B. in Form von Mineralsto�en zugesetzt werden,

das Hydroxylradikal. Bei letzterem handelt es sich um eine hochreaktive Verbindung,

die Aminos�aurereste oder das Proteinr�uckgrat anzugreifen vermag und damit zu gro�en

strukturellen Ver�anderungen in den Proteinen f�uhren kann [24]. In Milch werden ins-

besondere Methionin, Cystein und Tryptophan leicht oxidiert [10]. Resultierende Oxi-

dationsprodukte werden in Abb. 1.7 gezeigt.

Oxidativer Abbau von Vitaminen

Die Milch enth�alt eine Vielzahl von Vitaminen, wovon vor allem die Vitamine A, B2

und B12 hervorzuheben sind, deren t�aglicher Bedarf des Menschen durch Milch zu ca. 8,

19 bzw. 26 % gedeckt wird [25]. Vitamine sind aufgrund ihrer Struktur anf�allig f�ur ver-

schiedene Reaktionen, die durch Licht, Sauersto� oder Hitze bedingt sind. Neben einem

daraus resultierenden teils gravierenden Abbau w�ahrend der Lagerung f�uhrt bereits

die thermische Behandlung von Milch teilweise zu bemerkenswerten Vitaminverlusten.

W�ahrend fettl�osliche Vitamine keine Beeintr�achtigung durch den Erhitzungsprozess er-

fahren, wurden bei den Vitaminen C, B1, B6, B12 und Fols�aure Abnahmen um 10 bis

100 % gemessen (s. Tab. 1.4) [25].

12


Tab. 1.4: Vitaminverluste w�ahrend der Erhitzung von Milch (nach [25]).

Vitamin Pasteurisation Uht-Behandlung Sterilisation

Fettl�osliche Vitamine

Vitamin A - - -

Vitamin D - - -

Vitamin E - -

Vitamin K - -

Wasserl�osliche Vitamine

Vitamin C 10 % <20 % 50 %

Vitamin B1 10 % 20-50 %

Vitamin B2 - - -

Niacin - - -

Vitamin B6 <20 % 50 %

Fols�aure 10-20 % 40 % 50 %

Vitamin B12 <10 % 20 % 90-100 %

Pantothens�aure - - -

Biotin -

1.2.3 Auswirkungen der Hitzebehandlung auf die Milchproteine

Die Abl�aufe w�ahrend der Hitzebehandlung von Milch haben vielf�altige Auswirkungen

auf das Produkt. Zum Teil weisen diese Folgen durchaus positiven Charakter auf, jedoch

fallen die negativen E�ekte der thermischen Behandlung nicht unerheblich ins Gewicht.

Ver�anderung der Allergenizit�at von Milcheiwei�

Zwei bis drei Prozent der S�auglinge sind von einer Kuhmilchallergie betro�en [26], die

sich in Symptomen wie Haut-, Gastrointestinal- oder systemischen Reaktionen bis hin

zum anaphylaktischen Schock �au�ert [27]. An der Allergenizit�at der Milch sind prak-

tisch alle Milchproteine beteiligt, wobei die Caseine und �-Lactoglobulin die gr�o�te

Wirkung aufzeigen [27]. Bisher durchgef�uhrte Studien belegen nicht eindeutig, ob ei-

ne Hitzebehandlung der Milchprodukte eine Zu- oder Abnahme der Allergenizit�at der

Milchproteine nach sich zieht. Durch die Denaturierung und die daraus resultierende

Entfaltung der Proteine wird einerseits der im nativen Protein teils schwierige Angri�

13

1 Einleitung

durch die Proteinasen w�ahrend der Verdaung erleichtert [28]. Dadurch wird die Gefahr

einer allergischen Reaktion im Verdauungstrakt durch unvollst�andig verdaute Proteine

verringert. Zudem k�onnen Epitope, die durch die r�aumliche Anordnung der Proteine

bedingt waren, aufgehoben werden und somit zu einer Verminderung der allergenen

Wirkung f�uhren. Andererseits k�onnen bei der Entfaltung auch bisher verborgene Epi-

tope freigelegt werden. Zus�atzlich f�uhrt die Proteinaggregatbildung bei der Erhitzung

zu einem erh�ohten allergenen E�ekt von Milchprodukten [27].

Entwicklung von Aromasto�en

Die Entstehung von Aromasto�en im Zuge der Maillard-Reaktion ist in vielen Lebens-

mitteln erw�unscht, wie z. B. im Ka�ee, dessen charakteristisches Aroma sich durch

die nicht-enzymatische Br�aunung beim R�ostvorgang entwickelt. In Milchprodukten ist

jedoch der typische Kochgeschmack, der beim Erhitzen von Milch durch Schwefelver-

bindungen entsteht, oder das Karamelaroma aus der Maillard-Reaktion in der Regel

beim Verbraucher unerw�unscht [29].

Braunf�arbung der Milchprodukte

Durch die in der sp�aten Phase der Maillard-Reaktion entstehenden Melanoidine ist bei

der thermischen Behandlung von Milch mit der Zeit eine deutliche Braunf�arbung zu

beobachten. Dies tritt vor allem bei sterilisierten Produkten wie Kondensmilch oder

Kindern�ahrmitteln auf; eine leichte �Anderung der Farbe ist jedoch auch bereits bei

ultrahocherhitzter Milch zu verzeichnen. Auch diese Folge des Erhitzens von Milchpro-

dukten ist in der Regel nicht erw�unscht und bedarf daher einer sorgf�altigen Kontrolle.

Verminderung der biologischen Wertigkeit der Milchproteine

Ein weiterer bedeutsamer E�ekt der Hitzebehandlung auf die Milchprodukte ist die

Herabsetzung der biologischen Wertigkeit der Milchproteine. Diese l�asst sich auf ver-

schiedene Faktoren zur�uckf�uhren. Die Blockierung des Lysins im Zuge der Lactosead-

dition kann zur einer drastischen Verminderung der Bioverf�ugbarkeit dieser essentiellen

Aminos�aure f�uhren. So wurde in Kondensmilch eine Abnahme des verf�ugbaren Lysins

um 36,2 % gemessen [30]. Einige Maillard-Produkte k�onnen verschiedene Enzyme des

Verdauungstrakts, wie z. B. die Aminopeptidase oder die Carboxypeptidase, inhibie-

ren, so dass die Proteolyse unterbrochen und somit die Verwertbarkeit der Proteine

14

1.3 Methoden zur Beurteilung einer Hitzebehandlung von Milch

generell herabgesetzt wird [31]. Dies wird weiterhin durch die in der fortgeschritte-

nen Phase der Maillard-Reaktion gebildeten Quervernetzungen und die entstehenden

Proteinaggregate verst�arkt, die einen enzymatischen Angri� aufgrund der komplexeren

Struktur erschweren [32]. Schlie�lich verursacht auch der oxidative Abbau essentieller

Aminos�auren wie Lysin oder Tryptophan eine Verminderung der biologischen Wertig-

keit.

1.3 Methoden zur Beurteilung einer Hitzebehandlung

von Milch und Milchprodukten

Eine sorgf�altige Kontrolle der beschriebenen Reaktionen w�ahrend der industriellen Ver-

arbeitung von Milchprodukten ist von gro�em Interesse, um ein wertvolles, gesundes

Produkt zu gew�ahrleisten, dessen urspr�ungliche ern�ahrungsphysiologischen Eigenschaf-

ten so wenig wie m�oglich verloren gegangen sind. Daf�ur sind Hitzeindikatoren gefragt,

die eine m�oglichst umfassende Aussage �uber die Hitzebehandlung und die Konsequen-

zen f�ur das Produkt erlauben. Erschwerend bei dieser Beurteilung ist die Tatsache,

dass es beim Erhitzungsprozess zu einer Vielfalt von Reaktionen kommt, so dass das

Produktspektrum sehr komplex ist. Daher m�ussen Bedingungen, die einen Hitzemarker

beein ussen k�onnen (wie z. B. pH-Wert, Temperatur oder Lagerung) gegebenenfalls bei

der Beurteilung des Messergebnisses ber�ucksichtigt werden. Zur Beurteilung einer Hit-

zebehandlung von Milch und Milchprodukten weist man die in Kapitel 1.2.2 beschrie-

benen Vorg�ange w�ahrend des Erhitzens mit geeigneten Markern nach. Im Folgenden

werden einige �ubliche Indikatoren f�ur eine thermische Behandlung kurz erl�autert.

1.3.1 Klassische Hitzeindikatoren

Messung von Enzymaktivit�aten

Die einfachste Methode zum Nachweis einer Hitzebehandlung stellt wohl die Bestim-

mung der Phosphatase- bzw. Peroxidaseaktivit�at dar. Grundlage daf�ur ist die Protein-

denaturierung beim Erhitzen, die bei den beiden Enzymen den Verlust ihrer Aktivit�at

zur Folge hat [33]. Dieser Nachweis wird z B. zur Kontrolle einer ausreichenden Pasteu-

risierung (keine Phosphataseaktivit�at) bzw. Hocherhitzung (keine Peroxidaseaktivit�at)

herangezogen. Eine weitere Di�erenzierung der Hitzebehandlung ist jedoch mit Hilfe

dieser Parameter nicht m�oglich.

15

1 Einleitung

Bestimmung der Proteindenaturierung

Ebenfalls auf der Proteindenaturierung basieren verschiedene Methoden, die die Be-

stimmung der bei pH 4,6 l�oslichen Proteine zum Ziel haben. Wie bereits erkl�art wurde,

verlieren die Molkenproteine aufgrund ihrer Entfaltung bei Erreichen ihrer Denaturie-

rungstemperatur einen Gro�teil ihrer L�oslichkeit bei pH 4,6. Der Gehalt an bei pH 4,6

l�oslichen Proteinen kann daher als Ma� f�ur die Hitzebehandlung dienen. Er ist z. B.

durch kolorimetrische (Proteinbestimmung nach Lowry [34]) oder chromatographische

(Bestimmung der Konzentration an �-Lactalbumin oder �-Lactoglobulin mittels Hoch-

leistungs �ussigchromatographie (Hplc) [35]) Methoden zu ermitteln.

Nachweis von Zuckerabbauprodukten

Als Ma� f�ur die fr�uhe Phase des Zuckerabbaus wird der quantitative Nachweis von

Lactulose genutzt. Dieser erfolgt z. B. enzymatisch [36] oder chromatographisch mittels

Hplc [11]. Auch die Konzentrationen an Galactose und Ameisens�aure sind von der

Erhitzungsdauer abh�angig und k�onnen �uber Hplc bestimmt werden [11], ebenso wie

Hmf [37].

Nachweis von Produkten der fr�uhen Phase der Maillard-Reaktion

Einen klassischen Nachweis f�ur die Maillard-Reaktion stellt die Bestimmung des Ama-

doriprodukts dar. Dies geschieht meist nicht direkt, sondern indirekt nach Umwand-

lung von Lactulosyllysin in stabile Produkte. Standardmethode ist hier die sogenannte

Furosinmethode, die die Umwandlung des Amadoriprodukts in Furosin durch saure

Hydrolyse vorsieht. Furosin kann anschlie�end mittels Hplc [38] oder Ionenaustausch-

chromatographie [39] quanti�ziert werden. Alternativ kann das Amadoriprodukt indi-

rekt durch Bestimmung des nicht blockierten Lysinanteils bestimmt werden, da dieser

in der fr�uhen Phase der Maillard-Reaktion mit der Bildung des Amadoriprodukts kor-

reliert [11]. Zu beachten ist aber, dass auch w�ahrend der Lagerung von Milchprodukten

die Maillard-Reaktion in geringem Ma�e abl�auft und es so zu einem Anstieg der Kon-

zentration des Amadoriprodukts kommt [40].

16


Nachweis von Produkten der intermedi�aren Phase der Maillard-Reaktion

F�ur den Nachweis der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion bietet sich Cml

an, das nach Reduktion und saurer Hydrolyse �ussigchromatographisch bestimmt wer-

den kann [41]. M�oglich ist aber auch ein immunochemischer Nachweis von proteinge-

bundenem Cml in Milch mit Hilfe eines Cml-spezi�schen Antik�orpers [42]. Als weiterer

Hitzeindikator wurde Lysylpyrralin vorgeschlagen, dessen Konzentration in Milch sich

jedoch nur im �mol/l-Bereich bewegt [14]. Zudem wurde Pentosidin in Milch quanti-

�ziert, jedoch ist auch dessen Gehalt so gering, dass es keinen optimalen Marker f�ur

eine Hitzebehandlung darstellt [18].

Bestimmung von Braunf�arbung und Fluoreszenz

Eine weniger spezi�sche Beurteilung der thermischen Behandlung erlaubt die Bestim-

mung der Braunf�arbung in erhitzter Milch [43]. Alternativ kann die Bildung uoreszie-

render Verbindungen im Laufe der Maillard-Reaktion ebenfalls als schnelle Methode

dazu genutzt werden, das Ausma� der Maillard-Reaktion zu bestimmen [44].

1.3.2 Massenspektrometrische Analytik der Proteinver�anderungen

In den letzten Jahren hat sich die Massenspektrometrie (Ms) immer mehr als �au�erst

wertvolle und e�ziente Technik zur Untersuchung von strukturellen Proteinver�ande-

rungen, die auf die Hitzebehandlung der Milch zur�uckzuf�uhren sind, durchgesetzt [5].

Die Elektrospray-Ionisierungs- (Esi-) oder Matrixunterst�utzte Laserdesorptions-/Ioni-

sierungs-Flugzeit-Massenspektrometrie (Maldi-Tof-Ms) erlauben es, die Bildung des

Amadoriprodukts in der fr�uhen Phase der Maillard-Reaktion nachzuweisen [45{47].

Verbindet man diese Analytik mit einem vorangestellten partiellen enzymatischen Ver-

dau, lassen sich zus�atzlich die Modi�kationsstellen im Protein identi�zieren [48{50].

Bislang wurde mit Hilfe dieser Methodik in Milch vornehmlich die Bildung des Ama-

doriprodukts analysiert, w�ahrend weitere Glykierungs-, Glykoxidations- und Oxidati-

onsprodukte �uber konventionelle Methoden erfasst wurden [18, 42, 51]. Au�erdem wur-

de die Massenspektrometrie f�ur Milchproteine haupts�achlich als qualitative Analytik

eingesetzt; die M�oglichkeit einer relativen Quanti�zierung von Proteinmodi�zierungen

wurde jedoch f�ur andere Proteine aufgezeigt [52]. Im folgenden Abschnitt wird kurz die

Funktionsweise der Maldi-Tof-Ms erl�autert.

17

1 Einleitung

MALDI-TOF-MS

Die Technik derMaldi-Tof-Ms wurde im Jahre 1988 von Karas und Hillenkamp vor-

gestellt [53] und seitdem immer weiter entwickelt. Abb. 1.8 A zeigt den schematischen

Aufbau eines Maldi-Tof-Massenspektrometers.

F�ur die Messung wird die Probe zusammen mit einer Matrix auf einem metallischen

Tr�ager, z. B. aus Stahl, kokristallisiert. Dieses Kristallgitter wird im Hochvakuum der

Ionenquelle Laserimpulsen einer Dauer von wenigen Nanosekunden ausgesetzt. Der

darauf folgende Prozess der Desorption und Ionisierung ist bis heute nicht ins Detail

gekl�art. Es wird davon ausgegangen, dass die Matrix die Energie des Laserstrahls ab-

sorbiert und an die Probenmolek�ule weiterleitet. Dabei gehen Matrix- und Probenmo-

lek�ule in die Gasphase �uber, in der ein Protonentransfer statt�ndet (siehe Abb. 1.8 B)

[54]. Die protonierten Probenmolek�ule werden im Folgenden in einem elektrischen Feld

beschleunigt, bevor sie in eine feldfreie Zone, die sogenannte Driftzone, eintreten. An

diesem Punkt weisen sie idealerweise dieselbe kinetische Energie auf, die sich wie folgt

berechnen l�asst:

Ekin =12mv2

Ekin = kinetische Energie des Ions

m = Masse des Ions

v = Geschwindigkeit des Ions nach der Beschleunigungsstrecke

Aus dieser Formel ergibt sich, dass die Ionen die feldfreie Zone in Abh�angigkeit ihrer

Masse unterschiedlich schnell durchlaufen und nach einer bestimmten Zeit den Detektor

erreichen. Die Flugdauer kann dann zur Ermittlung der Masse genutzt werden.

Da jedoch nicht alle Ionen gleicher Masse wirklich gleichzeitig und vom gleichen Ort

desorbiert und ionisiert werden, kommt es zu Unterschieden in ihrer kinetischen Ener-

gie, so dass sie den Detektor zu geringf�ugig unterschiedlichen Zeiten erreichen. Dies

f�uhrt zu einer Verbreiterung des Signals, was eine Reduzierung der Au �osung nach

sich zieht. Diese Unsch�arfen gleicht das Re ektor ugrohr aus (siehe Abb. 1.8 C): Darin

durchlaufen die Ionen w�ahrend der Driftphase keine lineare Strecke, sie werden viel-

mehr in einem elektrischen Gegenfeld"re ektiert\. Dabei dringen Ionen mit h�oherer

kinetischer Energie tiefer in das Feld ein als Ionen der gleichen Masse, deren Energie

geringer ist. Durch diese Wegverl�angerung wird die h�ohere Geschwindigkeit kompen-

18


Laser

Matrix

Probe

Träger

Regulierbare Spannung

Reflektor

Detektor

Träger

m1 = m2

Energie (m1 ) < Energie (m2)

1

1

2

2

Laser Spiegel

TrägerBeschleunigungs-

elektrode Detektor

[M1+H]+ [M2+H]+ [M3+H]+

Matrix mit Probe

A

Beschleunigungs-strecke

Feldfreie Driftzone

B

C

Abb. 1.8: Funktionsweise eines Maldi-Tof-Massenspektrometers. A: Aufbau eines Maldi-Tof-Massenspektrometers. B: Matrixunterst�utzte Desorption und Ionisation der Probe.C: Aufbau eines Re ektor ugrohrs.

19

1 Einleitung

siert, so dass Ionen gleicher Masse mit unterschiedlicher kinetischer Energie letztlich

zur gleichen Zeit am Detektor ankommen.

Der Vorteil der Maldi-Tof-Ms besteht darin, dass es sich um eine sehr schonen-

de Ionisierungsmethode handelt, die prim�ar kaum zur Fragmentierung oder Artefakt-

bildung der Proteine f�uhrt. An dieser Stelle sei nur kurz darauf hingewiesen, dass

dennoch in und nach der Quelle die Ionen teilweise zerfallen, was allerdings zur Struk-

turaufkl�arung genutzt werden kann. Zudem entstehen in der Regel nur einfach gelade-

ne Ionen, so dass das Spektrum �ubersichtlicher als z. B. nach Elektrospray-Ionisation

bleibt und somit auch die Analyse komplexer Proteingemische m�oglich ist. Desweite-

ren werden auch relativ hohe Konzentration an Salzen und anderen Kontaminanten

toleriert, da sich bei der Kokristallisation"Inseln\ aus Matrix- und Probenmolek�ulen

im Mikroma�stab bilden, von denen St�orsubstanzen weitgehend ausgeschlossen wer-

den. Voraussetzung ist allerdings, dass letztere den eigentlichen Kristallisationsprozess

nicht behindern [55, 56].

1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit

Die bisherigen Studien haben bewiesen, dass es sich bei der Massenspektrometrie um

eine Technik handelt, deren gro�es Potential in Hinblick auf die Milchanalytik bisher

bei Weitem nicht ausgesch�opft wurde. Zielsetzung dieser Arbeit war die systematische

Untersuchung von Proteinver�anderungen nach thermischer Behandlung von Milch und

Milchprodukten mittels Maldi-Tof-Ms. Im ersten Abschnitt konzentriert sich die

Analytik auf den qualitativen Nachweis von Modi�kationen, die beim Erhitzen von

Molkenproteinen in Milchmodellen entstehen, wobei auch neue, bisher in Milch nicht

beschriebene Strukturen erfasst werden sollten. Zus�atzlich sollte eine partielle enzy-

matische Proteolyse der Modellproteine die Identi�zierung der Modi�kationsstellen in

der Aminos�auresequenz erlauben. Im folgenden Kapitel wurden verschiedene Techniken

zur Proteinisolierung getestet, um anschlie�end Modi�kationen an �-Lactalbumin und

�-Lactoglobulin in kommerziellen Milchproben untersuchen zu k�onnen. Hierbei sollte

die relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts als Kontrollm�oglichkeit der Hitzebe-

handlung von Handelsproben Einsatz �nden. Ein weiteres Projekt dieser Arbeit befasst

sich mit der Charakterisierung der bisher wenig erforschten niedermolekularen Protein-

fraktion der Milch und deren Ver�anderungen w�ahrend der thermischen Belastung und

20

1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit

Lagerung. Schlie�lich wird eine massenspektrometrische Methode zur Beurteilung der

W�armebehandlung mit klassischen Hitzeindikatoren verglichen.

21

2 Analyse von Molkenproteinmodi�kationen in Milchmodellen

2 Massenspektrometrische Unter-

suchung von Molkenproteinmodi�-

kationen in erhitzten Milchmodellen

2.1 Einleitung

Wegen ihres hohen Anteils an essentiellen Aminos�auren geh�oren die Molkenproteine mit

zu den wertvollsten Proteinquellen f�ur die menschliche Ern�ahrung. Aus diesem Grund

werden Molkenproteine h�au�g zu Lebensmitteln wie Sportlernahrung oder Kindern�ahr-

mitteln zugesetzt; zudem �nden sie auch dank ihrer technologischen Eigenschaften Ver-

wendung in der Lebensmittelindustrie, z. B. bei der Herstellung von Eiscreme, Joghurt

oder Frischk�ase [9].

Den gr�o�ten Anteil an der Molkenproteinfraktion haben �-Lactoglobulin und �-

Lactalbumin (siehe Tab. 1.2). �-Lactoglobulin macht ca. 50 % der Molkenproteine aus.

Dabei handelt es sich um ein globul�ares Protein aus 162 Aminos�auren mit einem Mo-

lekulargewicht von ca. 18 kDa. Es weist zwei Disul�dbr�ucken auf (zwischen Cystein 66

und Cystein 160 und zwischen Cystein 106 und Cystein 119) [6]. Die verbleibende freie

Thiolgruppe von Cystein 121 f�uhrt dazu, dass �-Lactoglobulin im Neutralen als Dimer

vorliegt und erst bei pH-Werten unter 3 monomerisiert [57]. �-Lactoglobulin geh�ort

zu den Proteinen der Lipocalinfamile und �ubernimmt lipidbindende Funktionen im

K�orper [58]. In Kuhmilch sind verschiedene genetische Varianten des �-Lactoglobulins

bekannt, wobei die Varianten A und B am h�au�gsten vorkommen [6]. Diese unterschei-

den sich in den Aminos�auren an Position 64 (Variante B: Asparagins�aure ! Glycin)

und Position 118 (Valin ! Alanin).

22

2.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin nach Erhitzen im Milchmodell

�-Lactalbumin ist ein globul�ares Protein aus 123 Aminos�auren mit einem Moleku-

largewicht von ca. 14 kDa, das im Gegensatz zu �-Lactoglobulin auch bei neutralem

pH-Wert als Monomer vorliegt. In der Struktur von �-Lactalbumin sind vier Disul-

�dbr�ucken (zwischen Cystein 6 und Cystein 120, Cystein 28 und Cystein 111, Cys-

tein 61 und Cystein 77, Cystein 73 und Cystein 91) vorhanden [59]. �-Lactalbumin

weist eine hohe A�nit�at zu Calciumionen auf, was sich stabilisierend auf seine Se-

kund�arstruktur auswirkt [60]. Seine physiologische Funktion ist die Interaktion mit

der �-1,4-Galactosyltransferase; der dabei entstehende Komplex ist f�ur die Lactose-

Synthese verantwortlich [6].

Dieses Kapitel besch�aftigt sich mit den Modi�kationen von Molkenproteinen, die

beim Erhitzen von Milchmodellen entstehen. Daf�ur wurden L�osungen von �-Lact-

albumin und �-Lactoglobulin mit Lactose erhitzt und auftretende Strukturver�ande-

rungen mittels Maldi-Tof-Ms analysiert. Eine zus�atzliche partielle Proteinhydro-

lyse sollte die Identi�zierung der Modi�kationsstellen in der Aminos�auresequenz er-

lauben. Von �ahnlichen Studien mit Modellsystemen oder Milchproben wurde berich-

tet [49, 50, 61, 62], jedoch wurden dabei nur Produkte der fr�uhen Maillard-Reaktion

beschrieben, w�ahrend weitere Glykierungs-, Glykoxidations- oder Oxidationsprodukte

und deren Positionen im Protein bislang nicht erfasst wurden. Deshalb war es das Ziel

dieses Projekts, mit Hilfe der Maldi-Tof-Ms-Technik weitere Erkenntnisse zu den

Molkenproteinver�anderungen w�ahrend der thermischen Behandlung zu erhalten.

2.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin

nach Erhitzen mit Lactose im Milchmodell

2.2.1 Analyse der Modi�kationen am intakten �-Lactalbumin

Zur Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin wurden in einem Modellsystem

L�osungen aus �-Lactalbumin und Lactose erhitzt. F�ur die Inkubation wurden milchsi-

mulierende Bedingungen gew�ahlt (92 �M �-Lactalbumin und 144 mM Lactose, gel�ost

in Natriumphosphatpu�er mit Natriumchlorid). Um eine thermische Denaturierung

des Proteins zu vermeiden, erfolgte die Inkubation bei einer Temperatur von 60 °C.

Nach 3, 7 und 14 Tagen wurden Proben gezogen, in Eis abgek�uhlt und zur Entfernung

des Zuckers gegen bidestilliertes Wasser dialysiert. Die lyophyllisierten, glykierten Pro-

23


teine wurden anschlie�end zur Untersuchung von Strukturver�anderungen mittels ein-

dimensionaler Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (Sds-Page) sowie

Maldi-Tof-Ms analysiert.

SDS-PAGE

Zun�achst wurde eine Sds-Page mit Coomassie-Anf�arbung durchgef�uhrt, um einen

�Uberblick �uber die Ver�anderungen des Molekulargewichts infolge der Proteininkubation

zu erhalten. Als Kontrolle dienten der kommerzielle Standard (Standard) sowie ein

Proteinstandard, der ohne den Zusatz von Lactose 14 d bei 60 °C erhitzt wurde (erhitzte

Kontrolle).

Abb. 2.1 zeigt, dass die Erhitzung von �-Lactalbumin mit Lactose eine Verbreite-

rung der �-Lactalbumin-Bande in Richtung h�oherer Massen bewirkte. Eine deutliche

Abtrennung der Modi�kationen vom nativen Protein war jedoch mittels Sds-Page

nicht m�oglich; auch waren keine genaueren Einblicke in die Strukturver�anderungen

gegeben.

A B C D E F

66 kDa

14 kDa

20 kDa

24 kDa29 kDa36 kDa45 kDa

Abb. 2.1: Eindimensionale Sds-Page des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins. 92 �M �-Lactalbumin wurde in einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactosebei einer Temperatur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte inDoppelbestimmung. Der kommerziell erh�altliche Standard und das ohne Lactose erhitzteProtein dienten als Kontrolle. A: Marker. B: Standard. C: erhitzte Kontrolle. D: 3 d 60 °C.E: 7 d 60 °C. F: 14 d 60 °C.

24


∆ Inkubation mit LactoseModifizierung der ProteineLactose

rel.

Int. Vermessen der Proteine mittels MALDI-TOF-MS,

Vergleich der gemessenen Massen der erhitzten und nicht erhitzten Proteine

∆m

∆m

∆m m/z

Rückschluss über die Massenveränderungauf die Modifikation

Abb. 2.2: Schematische Darstellung des Methodenprinzips zur Identi�zierung von Modi�ka-tionen am intakten Protein mittels Maldi-Tof-Ms

MALDI-TOF-MS

Aus diesem Grund wurden im Weiteren die mit Lactose inkubierten Proteine mit-

tels Maldi-Tof-Ms vermessen. Mit Hilfe der Massendi�erenz zwischen dem nativen

Protein und den w�ahrend der Inkubation neu entstehenden Signalen sollten zus�atz-

liche Informationen �uber die auftretenden Proteinmodi�zierungen gewonnen werden.

Abb. 2.2 zeigt schematisch das Prinzip der Methode auf.

Aus dem Spektrum des �-Lactalbumin-Standards (siehe Abb. 2.3) ist ersichtlich,

dass es sich bei der kommerziell erh�altlichen Substanz um keine Reinsubstanz handelt,

da zus�atzlich zum Massenpeak von �-Lactalbumin bei 14186 Da ein zweites Signal mit

einer Massendi�erenz von -113 Da vorhanden ist. Es ist zu vermuten, dass es sich bei

diesem um �-Lactalbumin handelt, bei dem die endst�andige Aminos�aure Leucin am

C-Terminus { m�oglicherweise w�ahrend des Aufreinigungsprozesses { abgespalten wur-

de. Diese Verunreinigung beeintr�achtigte jedoch die weiteren Messungen nicht. Nach

dreit�agiger Inkubation mit Lactose waren drei neue Signale deutlich zu erkennen. Ein

Massenunterschied von jeweils 324 Da entspricht einer Modi�zierung des nativen Pro-

teins mit drei Lactose-Molek�ulen. In der erhitzten Kontrolle waren diese Signale nicht

vorhanden. Nach weiterer Erhitzung bis 7 Tage nahm der relative Anteil der Amadori-

25


α-Lactalbumin

14000 15000 16000 m/z

rel.

Int.

Standard

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Abb. 2.3: Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins. 92 �M �-Lactalbumin wurde in einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactose beieiner Temperatur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppel-bestimmung. Die Spektren des kommerziell erh�altlichen Standards und des ohne Lactoseerhitzten Proteins dienten als Kontrolle. Amadoriprodukte (mit einer Massendi�erenz von324 Da) sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.

produkte weiter zu; zudem wurde bei Verg�o�erung des Spektrums ein viertes Lactose-

Addukt schwach sichtbar (Daten nicht gezeigt). Zus�atzliche Massen, die im Spektrum

zu sehen sind, sind auf die lactosylierte Formen des Artefakts des kommerziellen Stan-

dards zur�uckzuf�uhren. Die Inkubation der Modelll�osungen f�ur 14 Tage f�uhrte zu einem

breiten Signal �uber ca. 14000-16000 Da, bei dem eine Au �osung in einzelne Signale

nicht m�oglich war.

2.2.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin nach

partieller enzymatischer Hydrolyse

Analyse der Modi�kationen von �-Lactalbumin nach Erhitzen im Milchmodell

Um einen weiteren Einblick in die Struktur der Proteinmodi�kationen und ihre Positio-

nen in der Aminos�auresequenz zu gewinnen, wurde vor der massenspektrometrischen

Vermessung eine partielle enzymatische Proteinhydrolyse durchgef�uhrt. Bei dieser auch

"Peptide Mapping\ genannten Methode wird das Protein mit einem oder mehreren En-

zymen versetzt, die spezi�sche Schnittstellen in der Proteinsequenz erkennen. Die ent-

26


∆ Inkubation mit LactoseModifizierung der ProteineLactose

partielle enzymatische Hydrolyse mit der Endo-proteinase AspN

Vermessen der Peptide mittels MALDI-TOF-MS,Vergleich der gemessenen Massen der erhitzten und nicht erhitzten Proteine

m/z

rel.

Int.

∆m

∆m

∆m Rückschluss über die Massenveränderungauf die Modifikation und deren Bindungsstelle

Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Methodenprinzips zur Identi�zierung von Modi�ka-tionen am partiell enzymatisch hydrolysierten Protein (

"Peptide mapping\).

stehenden, proteinspezi�schen Peptide dienen z. B. in Proteomics-Studien zur Identi�-

zierung von unbekannten Proteinen [63, 64]. Hier jedoch konnten die Signale aufgrund

des bekannten Ausgangsproteins der entsprechenden Aminos�auresequenz mit Hilfe der

Software"Peptide Mass\ (frei zug�anglich �uber www.expasy.org) [7] zugeordnet werden.

Mittels der Massendi�erenz zwischen den w�ahrend der Inkubation neu entstehenden

und den nativen Peptiden ist es m�oglich, auftretende Modi�kationen zu interpretieren.

Vorteil des Peptide Mappings ist, dass die Peptide im Re ektormodus mit wesentlich

h�oherer Au �osung gemessen werden k�onnen als die Proteine im linearen Modus (siehe

dazu auch Kapitel 1.3.2) und die Massen der Modi�kationen dadurch exakter bestimmt

werden k�onnen. Zus�atzlich erlaubt die Methode, die Bindungsstellen der Modi�katio-

nen in der Proteinsequenz zu lokalisieren. In Abb. 2.4 wird das Prinzip der Methode

schematisch dargestellt.

F�ur die partielle enzymatische Proteinhydrolyse wurde die Endoproteinase AspN

gew�ahlt. Diese schneidet in 25 mM Ammoniumbicarbonatpu�er pH 8,0 spezi�sch N-

terminal zu Aspartams�aure sowie, in wesentlich geringerem Ma�e, N-terminal zu Gluta-

mins�aure. In anderen Studien wurde f�ur die partielle enzymatische Hydrolyse glykierter

27


Proteine h�au�g Trypsin verwendet [47, 65], welches C-terminal zu Lysin und Arginin

schneidet. F�ur das hier vorliegende Experiment erwies sich indessen die Endoproteinase

AspN als geeigneter, da sie durch die Glykierung des Proteins kaum beeintr�achtigt

wurde wie es f�ur Trypsin bekannt ist [48, 65]. Da dieses bei der Hydrolyse glykierte

Lysinreste nicht ber�ucksichtigt und somit Peptide mit relativ gro�er Masse entstehen,

sind die modi�zierten Peptide im Spektrum weit von den nativen entfernt, was die

Zuordnung erschweren kann. Weitere Vorteile von AspN bestanden darin, dass wenig

unspezi�sche Schnittstellen beobachtet wurden und die Proteolyse von �-Lactalbumin

zu einem Spektrum mit �ubersichtlich angeordneten nativen Signalen f�uhrte, was eine

leichte Zuordnung der Peptide zu den entsprechenden Aminos�auresequenzen erlaubte.

Die Sequenzabdeckung mit AspN betrug f�ur �-Lactalbumin 70 %.

Die Messung erfolgte �uber einen Massenbereich von 800-7000 Da, jedoch wurden nur

Signale unter 4000 Da detektiert. Beim Vergleich der in Abb. 2.5 abgebildeten Spektren

des nativen und der inkubierten Proteine werden mehrere Ver�anderungen o�ensichtlich,

die zur Verdeutlichung vergr�o�ert dargestellt sind (A-E).

Abb. 2.5 B zeigt den Bereich zwischen 1600 und 1950 Da, in dem das Signal 1623

dominierte. W�ahrend der Inkubation wurde eine Abnahme dieses Peptids, begleitet von

einer Zunahme eines Peptides mit 1605 Da, beobachtet. Bei dieser Modi�kation handel-

te es sich o�ensichtlich um kein Maillardprodukt, da sie auch in der erhitzten Kontrolle,

also in Abwesenheit von Lactose, gebildet wurde. Signal 1623 konnte den Aminos�auren

(AS) 1-13 zugeordnet werden mit Glutamins�aure am N-Terminus (vgl. Tab. 2.1 auf

S. 41). Die freie Aminogruppe einer am N-Terminus lokalisierten Glutamins�aure kann

leicht mit der S�aurefunktion der Seitenkette reagieren, wobei das cyclische Pyrrolidon

gebildet wird (siehe Abb. 2.6). Diese Reaktion, die zu einem Massenverlust von 18 Da

f�uhrt, l�auft bereits bei milden Temperaturen ab, und tats�achlich wurde auch im un-

erhitzten Standard das Pyrrolidon in geringer Konzentration detektiert. Im Laufe der

Inkubation erreichte das Pyrrolidon die nahezu gleiche Signalintensit�at wie das native

Peptid.

Zudem entstanden zwei neue Signale bei 1947 und 1929 Da, die w�ahrend der ther-

mischen Behandlung deutlich anstiegen. Eine Massenver�anderung von jeweils 342 Da

in Bezug auf das native Peptid 1623 und dessen cyclische Form lassen die Bildung

des Amadoriprodukts vermuten, was sich mit den Beobachtungen am intakten Protein

deckt. Bei andauernder Erhitzung konnten zwei weitere Signale mit einer Massenzunah-

me von je 58 Da detektiert werden. Es ist anzunehmen, dass das Amadoriprodukt, das

28


CA

B

D E

B/CA D E

Standard

Erhitze Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

1000 2000 3000 m/z

rel.

Int.

rel.

Int.

1034

1030 1045 1060 m/z

1050

1615 1625 1635 m/z

rel.

Int.

1623

1622

1681

1947

1663

1623

1605

1929

1600 1700 1800 1900 m/z

rel.

Int.

Standard

Erhitze Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

2188

2204

rel.

Int.

2185 2200 2215 m/z

2517

2533

2515 2530 2545 m/z

rel.

Int.

Erhitze Kontrolle

3 d 60 °C

Standard

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Abb. 2.5: Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactalbumins nach parti-eller enzymatischer Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN. 92 �M �-Lactalbumin wurdein einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactose bei einer Temperaturvon 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppelbestimmung. Nach derInkubation wurden 20 �g des dialysierten und lyophyllisierten Proteins mit 0,2 �g AspNbei 37 °C f�ur 18 h inkubiert. Die markierten Massenbereiche A-E sind zur Verdeutlichungvergr�o�ert dargestellt. m/z-Werte sind angegeben.

29


Glutaminsäure(N-Terminus)

Pyrrolidon∆m = -18 Da

H2N CH R

CH2

CH2

CO OH

CH2

CH RHN

C CH2O

OH2

Abb. 2.6: Reaktion einer N-terminalen Glutamins�aure zum Pyrrolidon

in der fr�uhen Phase der Maillard-Reaktion entstand, weitere Reaktionen einging, die

den Abbau zu N�-Carboxymethyllysin (Cml) implizierten. Exakt dieselben Beobach-

tungen wurden am Peptid 1253 gemacht, einem Fragment von Peptid 1623, bei dem die

Endoproteinase AspN zus�atzlich bei Glutamins�aure an Position 11 geschnitten hatte

(vgl. Tab. 2.1 auf S. 41).

In Abb. 2.5 C wird das Peptid 1623 nochmals vergr�o�ert. W�ahrend der Inkubation

mit Lactose wurde ein neues Signal mit der Masse von 1622 Da gemessen, das weder

im Standard noch in der erhitzten Kontrolle vorhanden war. F�ur eine Massenverschie-

bung um -1 Da schl�agt die Software Peptide Mass zwei m�ogliche Modi�kationen vor.

Erstens f�uhrt eine Amidierung von Carboxylgruppen zu einer Massenver�anderung von

-0,98 Da. Zweitens resultiert die Lysinoxidation zum Lysinaldehyd (Aminoadipins�aure-

semialdehyd; siehe Abb. 2.14 auf S. 43) zu einer Massenabnahme von 1,03 Da. Mit

dem verwendeten Massenspektrometer wurde eine Massengenauigkeit von 50 ppm er-

reicht; eine eindeutige Di�erenzierung dieser beiden Modi�kationen ist allein aufgrund

des Massenunterschieds somit nicht m�oglich. Die Bildung des Lysinaldehyds erscheint

jedoch wahrscheinlicher, da die oxidierte Form auch im mit Lactose inkubierten �-

Lactoglobulin nachgewiesen wurde und bei den beiden Proteinen �ahnliche Reaktionen

erwartet wurden (siehe dazu Kapitel 2.3.2).

Abb. 2.5 A, D und E stellt die nativen Peptide mit den Massen 1034, 2188 und

2517 Da dar (zur Zuordnung der Signale zu den Aminos�auresequenzen siehe Tab. 2.1

auf S. 41). Infolge der Inkubation mit Lactose wurden neue Signale mit jeweils einer

Massenzunahme von 16 Da beobachtet. Eine solche Massendi�erenz l�asst vermuten,

dass infolge von Oxidationsreaktionen Sauersto� in die Proteinstruktur eingef�uhrt wur-

de. Alle Peptide enthalten Cystein und Tryptophan, die beide leicht zu verschiedenen

Produkten oxidiert werden k�onnen (siehe Abb. 2.14 auf S. 43).

30

2.3 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin nach Erhitzen im Milchmodell

Analyse der Modi�kationen von oxidiertem �-Lactalbumin

Um die Hypothese von Oxidationsreaktionen in den Modelll�osungen mit Lactose zu

best�atigen, wurde eine �-Lactalbumin-L�osung bei 120 °C f�ur 10, 20 und 30 min mit

Wassersto�peroxid (H2O2) als oxidierendes Reagens erhitzt. Nach enzymatischem Ver-

dau wurden strukturelle Ver�anderungen mittelsMaldi-Tof-Ms analysiert. Die Spek-

tren des oxidierten �-Lactalbumins nach partieller enzymatischer Hydrolyse mit der

Endoproteinase AspN zeigten keine Unterschiede zum Standard auf (Daten nicht ge-

zeigt). Jedoch betrug die mit AspN erreichte Sequenzabdeckung lediglich 70 %, wo-

bei das Peptid mit dem einzigen Methionin der Sequenz, das als oxidationsanf�alligste

Aminos�aure eingesch�atzt wurde, nicht abgedeckt war. Aus diesem Grund wurde eine

enzymatische Proteolyse mit Trypsin durchgef�uhrt, die die Detektion weiterer Sequenz-

abschnitte erlaubte. Abbildung 2.7 zeigt die erhaltenen Spektren, bei denen das Peptid

1643 zur Verdeutlichung vergr�o�ert wird.

Es f�allt auf, dass dieses Peptid, das an Position 90 Methionin enth�alt (s. Tab. 2.2 auf

S. 45), nur im Standard und der erhitzten Kontrolle detektiert werden konnte. In den

mit H2O2 inkubierten Proben hingegen wurde ein Signal mit einer um 16 Da h�oher-

en Masse gemessen, das vermutlich dem oxidierten Produkt zuzuordnen ist. Weitere

Ver�anderungen wurden nicht beobachtet.

2.3 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin

nach Erhitzen mit Lactose im Milchmodell

2.3.1 Analyse der Modi�kationen am intakten �-Lactoglobulin

Analog zur Inkubation von �-Lactalbumin (s. Kap. 2.2) wurden L�osungen aus 175 �M

�-Lactoglobulin und 144 mM Lactose im Milchmodell erhitzt und aufgearbeitet. Auch

hier wurde zur Untersuchung von Massenver�anderungen am intakten Protein eine Ana-

lyse mittels eindimensionaler Sds-Page und Maldi-Tof-Ms durchgef�uhrt.

SDS-PAGE

Das eindimensionale Sds-Page-Gel der Proben (siehe Abb. 2.8) zeigte ein �ahnliches

Bild wie bei �-Lactalbumin: Im Zuge der Inkubation war eine deutliche Verbreiterung

31


A

A

1643

1659

1640 1650 1660 m/z

rel.

Int.

1000 1500 2000 2500 m/z

rel.

Int.

Standard

Erhitzte Kontrolle

10 min 120 °C

20 min 120 °C

30 min 120 ° C

Standard

Erhitzte Kontrolle

10 min 120 °C

20 min 120 °C

30 min 120 ° C

Abb. 2.7: Maldi-Tof-Ms-Spektren des oxidierten �-Lactalbumins nach partieller enzyma-tischer Hydrolyse mit der Endoproteinase Trypsin. 92 �M �-Lactalbumin wurde in einemmilchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 8,4 mM H2O2 bei einer Temperatur von 120 °Cf�ur 10, 20 und 30 min erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppelbestimmung. Nach der Inku-bation wurden 20 �g des dialysierten und lyophyllisierten Proteins mit 0,2 �g Trypsin bei37 °C f�ur 15 h inkubiert. Der markierte Massenbereich A ist zur Verdeutlichung vergr�o�ertdargestellt. m/z-Werte sind angegeben.

der Banden in Richtung h�oherer Massen zu beobachten, sogar in einem etwas st�arkeren

Ausma� als bei �-Lactalbumin. Zudem wurden Banden auf der H�ohe von ca. 36 kDa

sichtbar, was auf Dimerisierung der �-Lactoglobulin-Molek�ule schlie�en l�asst.

MALDI-TOF-MS

Im n�achsten Schritt wurden die mit Lactose inkubierten Proteine sowie der Standard

und die erhitzte Kontrolle mittels Maldi-Tof-Ms vermessen (siehe Abb. 2.9). Im

Spektrum des Standards waren die beiden Varianten A und B mit einem Massenun-

terschied von 86 Da zu sehen. Die Inkubation der Proteinl�osungen f�ur 3 Tage f�uhrte

zu vier neuen Doppelsignalen mit einer Massenzunahme von je 324 Da, was mit einer

32


14 kDa

20 kDa24 kDa29 kDa36 kDa45 kDa66 kDa

A B C D E F

Abb. 2.8: Eindimensionale Sds-Page des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins. 175 �M�-Lactoglobulin wurde in einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactosebei einer Temperatur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte inDoppelbestimmung. Der kommerziell erh�altliche Standard und das ohne Lactose erhitzteProtein dienten als Kontrolle. A: Marker. B: Standard. C: erhitzte Kontrolle. D: 3 d 60 °C.E: 7 d 60 °C. F: 14 d 60 °C.

mehrfachen Modi�zierung mit Lactose �ubereinstimmt. Erneut waren diese Signale nur

in den L�osungen mit Lactose, jedoch nicht in den beiden Kontrollen zu detektieren, was

best�atigt, dass es sich um Glykierungsprodukte handelt. Bereits nach 7 d Erhitzung

war keine Di�erenzierung von spezi�schen Signalen mehr m�oglich. Daher wurde ein

partieller enzymatischer Verdau mit der Endoproteinase AspN angeschlossen.

2.3.2 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin nach par-

tieller enzymatischer Hydrolyse

Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin nach Erhitzen im Milchmodell

Beim Verdau des glykierten bzw. oxidierten �-Lactoglobulins wurde eine Sequenzab-

deckung von 94 bzw. 100 % erreicht. Die Spektren der verdauten Proteine f�ur den

Massenbereich von 800-5000 Da werden in Abb. 2.10 dargestellt. Abschnitt C zeigt

den Bereich 2150-2550 Da mit Peptid 2199 (AS 33-52, s. Tab. 2.1 auf S. 41) als domi-

nierendes Signal. Infolge der Hitzebehandlung mit Lactose erschienen zwei neue Signale

mit einer Masse von 2523 bzw. 2257 Da. Der Massenunterschied von 324 bzw. 58 Da

f�uhrt zu der Annahme, dass in diesem Peptid ein Lysinrest mit Lactose zum Amado-

33


β-LactoglobulinVar. A Var. B

18000 19000 20000 m/z

rel.

Int.

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Standard

Abb. 2.9: Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins. 175 �M�-Lactoglobulin wurde in einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactosebei einer Temperatur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppel-bestimmung. Die Spektren des kommerziell erh�altlichen Standards und des ohne Lactoseerhitzten Proteins dienten als Kontrolle. Amadoriprodukte (mit einer Massendi�erenz von324 Da) sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.

riprodukt reagierte, welches anschlie�end teilweise zu Cml abgebaut wurde. Dieselben

Beobachtungen wurden am Peptid 3033 (AS 137-162, vgl. Tab. 2.1 auf S.41) gemacht

(siehe Abb. 2.10 D), welches o�ensichtlich ebenfalls in der Maillard-Reaktion Lactulo-

syllysin und Cml bildete. Zudem wurde an diesem Peptid eine Massenzunahme von

16 Da detektiert, was eine Oxidationsreaktion vermuten l�asst. Die weiteren Signale bei

2293 bzw. 2422 Da in Abschnitt C konnten Fragmenten des Peptids 3033 zugeordnet

werden, die durch zus�atzliche Hydrolyse an Glutamins�aureresten durch die Endopro-

teinase AspN zu erkl�aren waren. Ihre Abnahme im Laufe der Inkubation k�onnte auf

Ver�anderungen in der Proteinstruktur zur�uckzuf�uhren sein, die den enzymatischen An-

gri� beein usst haben.

In Abb. 2.10 A ist eine Verg�o�erung des Peptids mit einer Masse von 1104 Da (AS

1-10; vgl. Tab. 2.1 auf S. 41) zu sehen. In den Spektren war mit anhaltender Erhitzungs-

dauer der Anstieg eines Peptids mit einer um 1 Da verringerten Masse festzustellen,

vergleichbar mit den Beobachtungen am glykierten �-Lactalbumin. Da hier die Ami-

dierung einer Carboxylgruppe ausgeschlossen werden kann, weil in diesem Peptid keine

S�aurefunktion enthalten ist, wird eine Oxidation des Lysinrests an Position 8 zum Ly-

34


DA B C

D

A

C

B

Standard

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

3091

2199

2257

2523

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

Standard

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Standard

14 d 60 °C

3357

1812

1828

1844

1810 1830 1850 m/z

rel.

Int.

1104

1120

1103

1119

1100 1130 m/z

rel.

Int.

1115

2200 2300 2400 2500 m/z

rel.

Int.

rel.

Int.

1000 2000 3000 4000 m/z

3033

3049

rel.

Int.

33503050 3200 m/z

Abb. 2.10:Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins nach par-tieller enzymatischer Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN. 175 �M �-Lactoglobulinwurde in einem milchsimulierenden Pu�er bei pH 6,8 mit 144 mM Lactose bei einer Tem-peratur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppelbestimmung.Nach der Inkubation wurden 20 �g des dialysierten und lyophyllisierten Proteins mit 0,1 �gAspN bei 37 °C f�ur 18 h inkubiert. Die markierten Massenbereiche A-D sind zur Verdeut-lichung vergr�o�ert dargestellt. m/z-Werte sind angegeben.

35


sinaldehyd angenommen. Zus�atzlich wurde am Peptid 1104 nach Erhitzung mit Lac-

tose ein neues Signal mit einer um 16 Da h�oheren Masse gemessen. Das Peptid 1812

(AS 11-27; vgl. Tab. 2.1 auf S.41) wies au�erdem zwei neue Signale mit einem Massen-

unterschied von 16 bzw. 32 Da auf, so dass auch an dieser Stelle im Protein von einer

Oxidation ausgegangen wird (siehe Abb. 2.10 B).

Analyse der Modi�kationen von oxidiertem �-Lactoglobulin

Um die Hypothese zu belegen, dass die beobachteten neuen Signale mit Massenzunah-

men von 16 bzw. 32 Da auf Oxidationsreaktionen zur�uckzuf�uhren waren, wurden im

Folgenden L�osungen aus �-Lactoglobulin mit H2O2 bei 120 °C f�ur 10, 20 und 30 min

erhitzt. Die daraus resultierenden Spektren sind in Abb. 2.11 abgebildet. Wie in den

Spektren des mit Lactose inkubierten Proteins waren auch in denen der oxidierten Pro-

teine neue Signale mit einem Massenunterschied von 16 Da an den nativen Peptiden

1104, 1812 und 3033 zu verzeichnen. Alle drei Peptide weisen einen Methioninrest in

ihrer Sequenz auf, zudem sind als weitere oxidationsanf�allige Aminos�auren Tryptophan

und Cystein enthalten. Zus�atzlich bewirkte die Inkubation mit H2O2 die Bildung zweier

Signale, die 16 Da h�oher lagen als die nativen Peptide 3723 und 3751, die o�ensichtlich

auch oxidiert worden waren (vgl. Tab. 2.2 auf S. 41). Auch sie enthalten als m�ogli-

che Modi�kationsstellen Methionin oder Cystein. Bei den Messungen der glykierten

Proteine waren diese beiden Peptide nicht abgedeckt worden.

2.4 Diskussion

Industrielle Hitzebehandlung von Milchprodukten bewirkt eine Vielzahl chemischer Re-

aktionen der Proteine. Darunter nehmen Glykierungen und Oxidationen einen wichti-

gen Stellenwert ein, da sie zum Verlust essentieller Aminos�auren und zur Verminderung

der Verdaubarkeit f�uhren k�onnen und somit den ern�ahrungsphysiologischen Wert der

Proteine herabsetzen [32]. In diesem Kapitel sollten systematisch Strukturver�anderun-

gen, die w�ahrend der Erhitzung von Molkenproteinen im Milchmodell auftreten, und

der Ein uss von der Inkubationsdauer und der Anwesenheit von Milchzucker bzw. die

Abh�angigkeit von oxidativen Bedingungen untersucht werden. Daf�ur wurden L�osun-

gen aus �-Lactalbumin bzw. �-Lactoglobulin mit Lactose in den Konzentrationen, in

denen sie in der Milch auftreten, erhitzt. Die eindimensionale Sds-Page zeigte so-

36

2.4 Diskussion

D

B

DC

A B C

A18

12

1828

1104

1120

Erhitzte Kontrolle

10 min 120 °C

Standard

rel.

Int.

1000 2000 3000 4000 m/z

Standard

Erhitzte Kontrolle

rel.

Int.

10 min 120 °C

20 min 120 °C

30 min 120 ° C

1810 1820 1830 m/z1100 1110 1120 m/z

Erhitzte Kontrolle

10 min 120 °C

Standard

rel.

Int.

20 min 120 °C

30 min 120 ° C

20 min 120 °C

30 min 120 ° C

3723

rel.

Int.

3751

3767

3739

3720 3745 3770 m/z

rel.

Int.

3033

3049

3030 3045 3060 m/z

Abb. 2.11: Maldi-Tof-Ms-Spektren des oxidierten �-Lactoglobulins nach partieller enzy-matischer Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN. 175 �M �-Lactoglobulin wurde ineinem milchsimuliereden Pu�er bei pH 6,8 mit 8,4 mM H2O2 bei einer Temperatur von120 °C f�ur 10, 20 und 30 min erhitzt. Der Ansatz erfolgte in Doppelbestimmung. Nach derInkubation wurden 20 �g des dialysierten und lyophyllisierten Proteins mit 0,1 �g AspNbei 37 °C f�ur 18 h inkubiert. Die markierten Massenbereiche A-D sind zur Verdeutlichungvergr�o�ert dargestellt. m/z-Werte sind angegeben.

37


wohl bei �-Lactalbumin als auch bei �-Lactoglobulin nach der Reaktion mit Lactose in

Richtung gr�o�erer Massen verbreiterte Banden, die auf Modi�zierung der inkubierten

Proteine schlie�en lie�en. Genauere Aussagen �uber strukturelle Ver�anderungen waren

allerdings mittels Sds-Page nicht m�oglich, weswegen anschlie�end die Vermessung

mittels Maldi-Tof-Ms erfolgte.

Die Inkubation mit Lactose hatte sowohl bei �-Lactalbumin als auch bei �-Lacto-

globulin neue Signale im Spektrum zur Folge. Eine Massendi�erenz von jeweils 324 Da

in Bezug auf das native Protein zeigte die Bildung von bis zu je vier Amadoripro-

dukten an, das erste stabile Produkt der Maillard-Reaktion, das aus der Reaktion des

Milchzuckers mit der Aminogruppe eines Lysinrestes resultiert (s. Abb. 1.3 auf S. 9)

[13]. Lactosylierung wurde als die h�au�gste Modi�kation in Milch identi�ziert [48] und

konnte in verschiedenen Milchprodukten nachgewiesen werden [62, 66{68].

Die massenspektrometrische Analyse der intakten Proteine lie� jedoch aufgrund der

unzureichenden Au �osung der Maillardprodukte vom nativen Protein keine Identi-

�zierung weiterer Modi�kationen zu. Infolgedessen wurde vor der Vermessung mit-

tels Maldi-Tof-Ms eine partielle enzymatische Hydrolyse mit der Endoproteinase

AspN durchgef�uhrt, die spezi�sche Schnittstellen im Protein erkennt. Die entstehen-

den Peptide wurden unter Verwendung der Software Peptide Mass (zug�anglich �uber

www.expasy.org) den entsprechenden Aminos�auresequenzen zugeordnet. Aus der Mas-

sendi�erenz zwischen den w�ahrend der Inkubation neu entstehenden und den nati-

ven Peptiden waren Hypothesen �uber die Struktur der Modi�kationen m�oglich. Es sei

jedoch darauf hingewiesen, dass die Massendi�erenz allein keinen eindeutigen Beleg

f�ur die Strukturidenti�zierung darstellt. Zur endg�ultigen strukturellen Aufkl�arung der

Proteinver�anderungen sind weiterf�uhrendeMs-Messungen, wie z. B. kollisioninduzierte

Dissoziation oder Elektronentransferdissoziation, notwendig. Dennoch ist festzuhalten,

dass die Massendi�erenz bereits einen aussagekr�aftigen Hinweis auf die Identit�at der

Modi�kation gibt und die Wahrscheinlichkeit einer richtigen Interpretation als sehr

hoch eingesch�atzt wird.

Mit Hilfe des enzymatischen Verdaus und der dadurch m�oglichen Messung im Re-

ektormodus gelang es, die Au �osung erheblich zu verbessern, wodurch die Masse der

Modi�kationen wesentlich genauer bestimmt werden konnte als im intakten Protein.

Zudem konnten Modi�kationen mit relativ kleiner Masse im Vergleich zu der des Pro-

teins detektiert werden. Dar�uber hinaus lieferte die Analyse des partiell hydrolysierten

Proteins zus�atzlich wertvolle Hinweise auf die Bindungsstelle der Modi�kationen in der

38

2.4 Diskussion

EQLTKCEVFR ELKDLKGYGG VSLPEWVCTT FHTSGYDTQA IVQNNDSTEY GLFQINNKIW

CKDDQNPHSS NICNISCDKF LDDDLTDDIM CVKKILDKVG INYWLAHKAL CSEKLDQWLC EKL

1, 2 3, 4 5

5 5

6

6 67

1 Pyrrolidon2 Amadoriprodukt und Nε-Carboxylmethyllysin a

3 Amadoriprodukt und Nε-Carboxylmethyllysin4 Lysinaldehyd5 Hydroxytryptophan b

6 Cysteinsulfensäure b

7 Methioninsulfoxid

Abb. 2.12: Aminos�auresequenz von �-Lactalbumin. Postulierte Modi�kationsstellen sind miteinem Pfeil gekennzeichnet. Vorgeschlagene Interpretationen sind aufgef�uhrt.a: Modi�zierung an dieser Stelle ist nicht gesichert. b: Unterscheidung ist nicht m�oglich.

Aminos�auresequenz. Die detektierten Modi�kationen sind in Tab. 2.1 und Tab. 2.2

sowie in Abb. 2.12 und Abb. 2.13 zusammengefasst.

In den verdauten Modellproteinen konnten ein neues Peptid von �-Lactalbumin und

zwei neue Peptide von �-Lactoglobulin als Lactoseaddukte mit einem Massenunter-

schied von 324 Da identi�ziert werden. Bei dem betro�enen Peptid in �-Lactalbumin

handelte es sich um den N-Terminus (AS 1-10). Tab. 2.1 zeigt, dass in diesem Peptid

die Bildung des Lactulosyllysins entweder an der freien Aminogruppe des N-Terminus

oder an Lysin 5 m�oglich ist. Die Lactosylierung wurde auch am Peptid AS 1-10, in dem

die N-terminale Glutamins�aure zum Pyrrolidon kondensiert war und somit blockiert

vorlag, detektiert. Daher konnte Lysin 5 als bevorzugte Glykierungsstelle im Protein

identi�ziert werden. Im �-Lactoglobulin wurde das Amadoriproukt an zwei Peptiden

detektiert, n�amlich AS 33-52 und AS 137-162. Ersteres enth�alt lediglich einen Lysinrest

an Position 47, welcher somit eindeutig als Bindungsstelle f�ur Lactose identi�ziert wur-

de. Im zweiten Peptid konnte die Adduktbildung mit Lactose entweder an Lysin 138

oder an Lysin 141 erfolgt sein.

In der Literatur wurde bereits �uber ortsspezi�sche Lactosylierung berichtet. In �-

Lactalbumin wurden die Lysinreste 98 und 114 oder 122 als Reaktionspartner f�ur Lac-

tose identi�ziert [61]. Nach dem Verdau mit der Endoproteinase AspN konnten die

Peptide, die Lysin 98 und Lysin 114 enthalten, nicht mittels Maldi-Tof-Ms detek-

tiert werden, wahrscheinlich aufgrund unzureichender Ionisierungseigenschaften. Das

39


LIVTQTMKGL DIQKVAGTWY SLAMAASDIS LLDAQSAPLR VYVEELKPTP EGDLEILLQK WENGECAQKK

IIAEKTKIPA VFKIDALNEN KVLVLDTDYK KYLLFCMENS AEPEQSLACQ CLVRTPEVDD EALEKFDKAL

KALPMHIRLS FNPTQLEEQC HI 1 6

1 2 3 1, 4

1

5

6

1 Methioninsulfoxid2 Lysinaldehyd3 N-Formylkynurenin a

4 Methioninsulfon a

5 Amadoriprodukt und Nε-Carboxylmethyllysin6 Amadoriprodukt und Nε-Carboxylmethyllysin b

Abb. 2.13: Aminos�auresequenz von �-Lactoglobulin. Postulierte Modi�kationsstellen sindmit einem Pfeil gekennzeichnet. Vorgeschlagene Interpretationen sind aufgef�uhrt.a: Unterscheidung ist nicht m�oglich. b: eindeutige Identi�zierung der Modi�kationsstelleist nicht m�oglich.

Peptid hingegen mit Lysin 122 ergab ein sehr intensives Signal, jedoch wurde kein

entsprechendes Signal mit einem Massenunterschied von 324 Da beobachtet. Es wird

deshalb angenommen, dass unter den vorliegenden Inkubationsbedingungen eine even-

tuelle Lactosylierung nur unterhalb der Nachweisgrenze ablief. Andererseits konnte die

Bildung des Amadoriprodukts an Lysin 5 gezeigt werden, was sich mit den Ergebnissen

einer Studie mit Kindern�ahrmitteln deckt [48]. Desweiteren ist eine Lactoseadduktbil-

dung am N-Terminus m�oglich, die bisher noch nicht beschrieben wurde.

In �-Lactoglobulin wurde Lysin 47 als reaktive Aminogruppe identi�ziert, was mit

den Untersuchungen von L�eonil et al. �ubereinstimmt [47]. Zudem lassen die vorliegen-

den Spektren auf eine Lactosylierung an Lysin 138 oder Lysin 141 schlie�en. Von einer

Reaktion dieser Aminos�auren mit Lactose bei geringer Wasseraktivit�at wurde bereits

berichtet [69]. Dar�uber hinaus wurde von Fogliano et al. die Glykierung von Lysin 100

beschrieben [70]. Diese konnte jedoch in dem hier vorliegenden Experiment aufgrund

unzureichender Sequenzabdeckung nicht best�atigt werden. Man kann aus den Ergeb-

nissen dieser Studien schlie�en, dass die bevorzugten Glykierungsstellen in der Ami-

nos�auresequenz wohl von den Glykierungsbedingungen (in L�osung oder im trockenen

Zustand) und/oder der Probenzusammensetzung (Modelll�osungen oder Milchproben)

abh�angen.

40

2.4 Diskussion

Tab. 2.1: �Uberblick �uber die in �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin detektierten Modi�ka-tionen nach der Reaktion mit Lactose und m�ogliche Interpretationen.

�-Lactalbumin (partiell hydrolysiert mit AspN)

Peptid AS Aminos�auresequenz � m Interpretation

1034 116-123 DQWLCEKL 16 Da Cys/Trp-Oxidation

1253 1-10 EQLTKCEVFR -1 Da Lysinaldehyd

-18 Da Pyrrolidon

58 Da Cml

324 Da Lactulosyllysin

1623 1-13 EQLTKCEVFRELK -1 Da Lysinaldehyd

-18 Da Pyrrolidon

58 Da Cml


2188 97-115 DKVGINYWLAHKALCSEKL 16 Da Cys/Trp-Oxidation

2517 14-36 DLKGYGGVSLPEWVCTTFHTSGY 16 Da Cys/Trp-Oxidation

�-Lactoglobulin (partiell hydrolysiert mit AspN)


1104 1-10 LIVTQTMKGL -1 Da Lysinaldehyd

16 Da Methioninsulfoxid

1812 11-27 DIQKVAGTWYSLAMAAS 16 Da Methioninsulfoxid

32 Da Met/Trp-Oxidation

2199 33-52 DAQSAPLRVYVEELKPTPEG 58 Da Cml


3033 137-162 DKALKALPMHIRLSFNPTQLE 16 Da Methioninsulfoxid

EQCHI 58 Da Cml


Im Gegensatz zu den Spektren der verdauten Proteine, in denen ein bzw. zwei Ama-

doriprodukte detektiert werden konnten, zeigten die Spektren der intakten Proteine je

vier Amadoriprodukte auf. Die Glykierung beein usst kaum die Ionisierungseigenschaf-

ten von Proteinen [71]; in Peptiden scheint sie jedoch die Messung zu beeintr�achtigen,

wie aus diesen Ergebnissen zu erschlie�en ist.

41


Alle Peptide, in denen die Bildung des Amadoriprodukts aufgezeigt wurde, wiesen

nach anhaltender Erhitzung weitere Signale mit einem Massenunterschied von 58 Da

zum nativen Peptid auf. Dies l�asst vermuten, dass das Amadoriprodukt teilweise ab-

gebaut wurde, was zur Bildung von Cml f�uhrte. Cml wurde als geeigneter Indikator

f�ur die Hitzebehandlung von Milch beschrieben [41] und in Milchprodukten mit immu-

nochemischen oder chromatographischen Methoden quanti�ziert [72, 73]. Humeny et

al. verwendeten eine massenspektrometrische Methode zur Identi�zierung von Cml in

glykiertem Lysozym [74], in Milch jedoch wurde bisher noch nicht von ortsspezi�scher

Bildung von Cml berichtet.

Zus�atzlich zu den Glykierungsreaktionen wurden mehrere Massenunterschiede ge-

messen, die oxidative Modi�zierungen w�ahrend der Inkubation der Molkenproteine mit

Lactose annehmen lassen. Abbildung 2.14 zeigt einige relevante Strukturen, die auf

Oxidatonsreaktionen zur�uckzuf�uhren sind.

Zwei neue Signale mit einem Massenunterschied von -1 Da in Bezug auf das jeweilige

native Protein wurden in �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin detektiert und lassen auf

die Oxidation eines Lysins zum Lysinaldehyd schlie�en. Die Bildung des Lysinaldehyds

konnte eindeutig Lysin5 in �-Lactalbumin und Lysin8 in �-Lactoglobulin zugeordnet

werden, w�ahrend andere Peptide mit Lysinresten keine entsprechenden Signale aufwie-

sen. Die Oxidation von Lysin scheint daher sehr selektiv abzulaufen, wie es auch f�ur

die Oxidation von Lysin in humanen Serumalbumin berichtet wurde [75]. Die Inkuba-

tion von �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin mit Wassersto�peroxid bei 120 °C f�uhrte

nicht zu der entsprechenden Reaktion; dies zeigt, dass H2O2 als relativ mildes Oxida-

tionsmittel keine Lysinoxidation bewirkte. Hingegen f�ordern Dicarbonyle, wie sie aus

Zuckern im Laufe der Maillard-Reaktion entstehen, die Bildung von Lysinaldehyd �uber

eine Strecker-Reaktion (siehe Abb. 2.15) [76]. Eine analoge Oxidation von Arginin zu

Glutamins�auresemialdehyd konnte wie auch in Studien mit humanen Serumalbumin

[75] nicht beobachtet werden.

Zus�atzlich wurden in den Spektren des partiell hydrolysierten �-Lactalbumins bzw.

�-Lactoglobulins mehrere Massenunterschiede von 16 Da gemessen, was die Einf�uhrung

von Sauersto� in die Proteinstruktur vermuten l�asst. Hau et al. zeigten bereits in Esi-

Ms-Spektren von Molke Massenzunahmen von 16 Da, jedoch konnten sie diese Modi-

�kationen ohne enzymatischen Verdau keiner spezi�schen Stelle im Protein zuordnen

[67].

42

2.4 Diskussion

HC

C

HN

R

O

R

CH2 S CH3CH2 HC

C

HN

R

O

R

CH2 S CH3CH2

O

HC

C

HN

R

O

R

CH2 S CH3CH2

OO O

O

Methioninsulfoxid∆m = 16 Da

Methioninsulfon∆m = 32 Da

Methionin

HC

C

HN

R

O

R

CH2 SHO

HC

C

HN

R

O

R

CH2 S OHO

HN

CNH2

O

O

HN

C O

Lysinaldehyd∆m = -1 Da

LysinCystein Cysteinsulfensäure∆m = 16 Da

NH CHO NH

OH

NH

CH2 CH

COOH

NH2 O

CH2 CH

COOH

NH2C CH2 CH

COOH

NH2

O

Tryptophan N-Formylkynurenin∆m = 32 Da

Hydroxytryptophan∆m = 16 Da

Abb. 2.14: �Uberblick �uber einige relevante Oxidationsreaktionen von Aminos�auren

In der hier vorliegenden Studie wurde eine Massendi�erenz von 16 Da an den Pepti-

den 1034 (AS 116-123), 2188 (AS 97-115) und 2517 (AS 14-36) detektiert (vgl. Tab. 2.1).

Das einzige Methionin der Sequenz wurde bei dieser Methode nicht abgedeckt. Zur wei-

teren Untersuchung der postulierten Oxidationsreaktionen in den Modellmischungen

mit Lactose wurde die Inkubation mit H2O2 wiederholt. Nach der partiellen enzymati-

schen Hydrolyse mit AspN waren jedoch keine Unterschiede zwischen den Spektren des

nativen und des inkubierten �-Lactalbumins festzustellen. Die Proteolyse wurde darauf-

hin mit Trypsin durchgef�uhrt, woraufhin das Peptid 1643 (AS 80-93) mit Methionin 90,

Cystein 91 und Phenylalanin 80 detektiert wurde (vgl. Tab. 2.2). Die Inkubation mit

H2O2 f�uhrte an diesem Peptid zur einer Signalneubildung mit einer Massendi�erenz von

16 Da. Methionin ist die Aminos�aure, die von H2O2 am leichtesten oxidiert wird [77].

Daher wird angenommen, dass in �-Lactalbumin Methionin die einzige Aminos�aure ist,

43


R

O

OH2N N

R

O

Prot Prot

H

R ProtN

O

OH

OProtR

NH2O

H2O

Me2+

-

Me2+

H2O

-

Me2+

+

α-Dicarbonyl Lysin

Lysinaldehyd

+

-

Abb. 2.15: Mechanismus der Oxidation von Lysin zum Lysinaldehyd �uber eine Strecker-Reaktion (nach [76]).

die im durchgef�uhrten Oxidationsexperiment in solchem Ausma� oxidert wurde, dass

das modi�zierte Peptid detektiert werden konnte.

Als weitere oxidationsanf�allige Aminos�auren sind Cystein und Tryptophan bekannt

[77], es wurden aber auch Modi�zierungen von Phenylalanin, Tyrosin und Histidin

entdeckt, die zu einer Massenzunahme von 16 Da oder Vielfachen davon f�uhren [78].

Im glykierten �-Lactalbumin kann die Massenver�anderung von 16 Da an den Pepti-

den 1034, 2188 und 2517 entweder von einer Oxidation von Cystein oder Tryptophan

stammen. Betro�en sind somit Cys28/Trp26, Cys111/Trp104 und Cys120/Trp118 (vgl.

Tab. 2.1). Cysteinsulfens�aure ist unter gewissen strukturellen Voraussetzungen in Pro-

teinen stabil [79], wurde allerdings bislang in Milch noch nicht nachgewiesen. Oxidative

Abbauprodukte des Tryptophans wurden hingegen bereits in Frauenmilch detektiert

[80].

Auch in �-Lactoglobulin konnten an den Peptiden 1104 (AS 1-10), 1812 (AS 11-27),

and 3033 (AS 137-162) (vgl. Tab. 2.1) Oxidationsprodukte mit einem Massenunter-

schied von 16 Da aufgezeigt werden. Die Inkubation mit Wassersto�peroxid zog diesel-

ben Massenver�anderungen nach sich. Zus�atzlich wurden an den Peptiden 3723 and 3751

(AS 98-129 der Varianten B und A; vgl. Tab. 2.2) neue Signale mit einer um jeweils

44

2.4 Diskussion

Tab. 2.2: �Uberblick �uber die in �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin detektierten Modi�ka-tionen nach Inkubation mit Wassersto�peroxid und m�ogliche Interpretationen.

�-Lactalbumin (partiell hydrolysiert mit Trypsin)


1643 80-93 FLDDDLTDDIMCVK 16 Da Methioninsulfoxid

�-Lactoglobulin (partiell hydrolysiert mit AspN)


1104 1-10 LIVTQTMKGL 16 Da Methioninsulfoxid


3033 137-162 DKALKALPMHIRLSFNPTQLE 16 Da Methioninsulfoxid

EQCHI

3723 98-129 DYKKYLLFCMENSAEPEQSLA 16 Da Methioninsulfoxid

CQCLVRTPEVD

3751 AA 98-129 DYKKYLLFCMENSAEPEQSLV 16 Da Methioninsulfoxid

(Var. A) CQCLVRTPEVD

16 Da h�oheren Masse detektiert. Die betro�enen Peptide waren beide bei der Messung

des verdauten glykierten Proteins nicht abgedeckt worden. Da alle oxidierten Peptide

Methionin enthalten, wird angenommen, dass in den Milchmodellen an Met7, Met24,

Met145 und m�oglicherweise auch an Met107 Methioninsulfoxid gebildet wurde. Aller-

dings kann die Oxidation anderer Aminos�auren nicht ausgeschlossen werden. Zudem

wurde am Peptid 1812 (AS 11-27), das ein Methionin und ein Tryptophan enth�alt,

eine Massenzunahme um 32 Da beobachtet. Dies kann entweder auf eine Oxidation

von Tryptophan zu N-Formylkynurenin, eine Oxidation von Methionin zu Methionin-

sulfon oder auf die parallele Bildung von Methioninsulfoxid und Hydroxytryptophan

zur�uckgef�uhrt werden (siehe Abb. 2.14). Weitere Studien sind daher notwendig, um

die Strukturen der Oxidationsprodukte von �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin im

vorliegenden Milchmodell eindeutig identi�zieren zu k�onnen.

Die beschriebenen Oxidationsprodukte wurden in den L�osungen, die keine Lacto-

se enthielten, nicht nachgewiesen. Die oxidativen Eigenschaften von Zucker-Protein-

L�osungen sind bekannt. Bei deren Erhitzung entstehende �-Hydroxycarbonylverbin-

dungen (z. B. aus Zuckern) [21], Partialstrukturen quervernetzter Proteine [22] oder

45


Amadoriprodukte [23] f�ordern die Bildung des Superoxidradikalanions. Dieses f�uhrt zu

Wassersto�peroxid, das in Anwesenheit von Metallionen, die stets in Spuren vorhanden

sind, schnell zum Hydroxylradikal reagiert. Letzteres zeichnet sich durch eine hohe Re-

aktivit�at aus und greift Aminos�aurereste oder das Proteinr�uckgrat an, was zu massiven

Sch�aden in der Proteinstruktur f�uhren kann [24].

Zus�atzlich zu den Glykierungs- und Oxidationsreaktionen, die durch die Anwesenheit

von Lactose hervorgerufen wurden, wurden Modi�kationen beobachtet, die nur durch

die thermische Behandlung bedingt waren und folglich auch in der erhitzten Kontrolle,

die keine Lactose enthielt, detektiert wurden. Ein Peptid, das um 18 Da leichter als

das N-terminale Peptid 1623 war, l�asst eine Pyrrolidonbildung durch intramolekularen

Angri� der N-terminalen Aminogruppe an der Carboxylseitenkette vermuten (siehe

Abb. 2.6 auf S. 30). Diese Reaktion l�auft bereits bei milden Temperaturen ab [81], was

die geringen Konzentration an Pyrrolidon im Standard erkl�art: Dieses kann entweder im

kommerziellen Produkt w�ahrend der Aufreinigung entstanden sein oder aber w�ahrend

des enzymatischen Verdaus mit AspN.

Bisherige Studien �uber Milchproteine mit Maldi-Tof-Ms konzentrierten sich auf

den Nachweis des Amadoriprodukts, das in der fr�uhen Phase der Maillard-Reaktion

gebildet wird. In der in diesem Kapitel vorgestellten Arbeit konnte das Potential dieser

Methode auf die Detektion weiterer Modi�kationen ausgeweitet werden, was einen de-

taillierteren Einblick in die Prozesse w�ahrend der thermischen Behandlung von Milch-

proteinen erlaubte. Es konnte gezeigt werden, dass Lactulosyllysin das anteilsm�a�ig

wichtigste Glykierungsprodukt darstellte, dass bei anhaltender Erhitzung teilweise zu

Cml abgebaut wurde. Dabei handelte es sich um eine ortsspezi�sche Reaktion, die von

einer Vielfalt von ebenfalls ortsspezi�schen Oxidationen begleitet wurde. Au�erdem

wurde eine glykierungsunabh�angige Reaktion aufgezeigt. Bei Maldi-Tof-Ms handelt

es sich daher um eine leistungsf�ahige Methode, die dazu dienen kann, durch Modi�-

kationen bedingte Ver�anderungen der ern�ahrungsphysiologischen oder technologischen

Proteineigenschaften vorherzusagen.

46

3 Analyse der Proteinmodi�kationen

in Milch und Milchprodukten

3.1 Einleitung

Im vorangegangenen Kapitel wurden Molkenproteinmodi�kationen beim Erhitzen von

Milchmodellen untersucht. Ziel des n�achsten Abschnitts dieser Arbeit war es, Modi-

�zierungen w�ahrend der industriellen Prozessierung von handels�ublichen Milchproben

zu analysieren. Auch hier wurde der Fokus auf die beiden anteilsm�a�ig wichtigsten

Molkenproteine, d. h. �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin, gerichtet.

In der Literatur existieren bereits verschiedene massenspektrometrische Studien, die

sich mit den Proteinmodi�kationen in Milchprodukten besch�aftigen. Dabei wurden die

Milchproteine entweder direkt vermessen [46] oder aber zun�achst gelelektrophoretisch

[66] oder �ussigchromatographisch [45] aufgetrennt. Zur Identi�zierung von Modi�kati-

onsstellen in der Aminos�auresequenz wurden zudem die Proteine vor der massenspek-

trometrischen Analyse mit Enzymen wie Trypsin, GluC oder AspN partiell hydrolysiert

[47{49, 62]. Damit konnten verschiedene spezi�sche Glykierungsstellen in den Proteinen

aufgezeigt werden, w�ahrend Oxidationsprodukte hingegen unerw�ahnt blieben.

In diesem Projekt sollten zun�achst verschiedene Handelsproben direkt mittelsMaldi-

Tof-Ms vermessen werden. Als M�oglichkeit zur Aufreinigung der Proben wurde die

Metalla�nit�atschromatographie getestet, um eine verbesserte Spektrenqualit�at zu er-

halten. Da vor der partiellen enzymatischen Hydrolyse f�ur dieMaldi-Tof-Ms-Analyse

die Proteine isoliert werden m�ussen, sollten im n�achsten Schritt mehrere Proteintrenn-

methoden auf ihre Eignung �uberpr�uft werden. Als in bisherigen Studien noch nicht

angewendete Methode wurde eine immunoa�nit�atschromatographische Aufreinigung

mit der klassischen ein- bzw. zweidimensionalen Sds-Page verglichen. Im Folgenden

47

3 Analyse der Proteinmodi�kationen in Milchprodukten

sollte dann mit der geeignetsten Technik Milch, die im Modellversuch erhitzt worden

war, analysiert werden, um den Verlauf der Entstehung von Glykierungs- oder Oxi-

dationsprodukten beobachten zu k�onnen. Abschlie�end wurden noch Handelsproben

vermessen, um darin die mit dieser Methode detektierbaren Modi�kationen zu charak-

terisieren.

3.2 Untersuchung der Modi�kationen an intakten

Molkenproteinen aus Milchprodukten

Zur Untersuchung der Modi�kationen in Handelsproben wurden hocherhitzte (Esl-

Milch, engl."extended shelf life\ = verl�angerte Haltbarkeit), ultrahocherhitzte (Uht-

Milch), sterilisierte (Steril- bzw. Kondensmilch) Milchproben sowie �ussige bzw. pul-

verf�ormige S�auglingsmilchnahrungen herangezogen. Als Vergleich diente stets Roh-

milch. Im ersten Schritt wurden die Modi�kationen am intakten Protein analysiert.

Daf�ur wurden die Proben einerseits direkt nach Verd�unnung mit Wasser, andererseits

nach metalla�nit�atschromatographischer Aufreinigung mittels Maldi-Tof-Ms ver-

messen.

3.2.1 Direkte Vermessung mittels MALDI-TOF-MS

F�ur die direkte massenspektrometrische Vermessung wurden als Matrices eine �-Cyano-

4-hydroxyzimts�aure/2,5-Dihydroxybenzoes�aure-Mischung (Cca/Dhb-Matrix) sowie ei-

ne 2,5-Dihydroxyacetophenon/Diammoniumhydrogencitratl�osung (Dhap-Matrix) ver-

wendet. Erstere wurde von Fenaille et al. f�ur die direkte Vermessung von Milch mit-

tels Maldi-Tof-Ms beschrieben [46], w�ahrend letztere f�ur Glykoproteine empfohlen

wurde [82]. Die Cca/Dhb-Matrix stellte sich f�ur die Messung von �-Lactalbumin als

geeigneter heraus, da dessen Ionisierung wahrscheinlich beg�unstigt wurde und so ein

intensives Signal erhalten wurde. Bei �-Lactoglobulin hingegen resultierte die Verwen-

dung der Dhap-Matrix in einer optimalen Signalintensit�at, da es damit im Spektrum

der Milchproteine dominierte und so emp�ndlicher als in Cca/Dhb gemessen werden

konnte (siehe Abb. 5.6 auf S. 97.

In den Spektren von �-Lactalbumin konnten in den verschiedenen Proben ein (Esl-

Milch) bis drei (S�auglingsmilchnahrung) Lactoseaddukte mit einem Massenunterschied

48

3.2 Untersuchung der Modi�kationen an intakten Molkenproteinen aus

Milchprodukten

A B

14000 14500 15000 m/z 14000 14500 15000 m/z

rel.

Int.

α-LactalbuminLactose-/Hexoseaddukte

α-LactalbuminLactose-/Hexoseaddukte

rel.

Int.

Rohmilch

ESL-Milch

UHT-Milch 1

UHT-Milch 2

Sterilmilch

Kondensmilch

Säuglingsnahrung 1

Säuglingsnahrung 2

Säuglingsnahrung 3

Säuglingsnahrung 4

Abb. 3.1: Maldi-Tof-Ms-Spektren von �-Lactalbumin aus Handelsproben direkt (A) undnach metalla�nit�atschromatographischer Aufreinigung (B). Lactose- bzw. Hexoseadduktesind mit durchgezogenen bzw. gestrichelten Pfeilen gekennzeichnet.

von 324 Da detektiert werden (siehe Abb. 3.1 A). Zudem waren in den S�auglingsnahrun-

gen schwach Hexoseaddukte (�m= 162 Da) sichtbar. Insbesondere bei den sterilisierten

Proben ergaben sich jedoch Schwierigkeiten in der Messung, da nur sehr schwache Si-

gnale erhalten wurden und ein starkes Rauschen zu verzeichnen war. Auch die Spektren

der S�auglingsnahrungen waren teilweise von mangelhaftem Signal-Rausch-Verh�altnis

gekennzeichnet. Dies war wahrscheinlich in erster Linie darauf zur�uckzuf�uhren, dass

mit steigender Hitzebelastung der Produkte �-Lactalbumin zum Teil denaturierte, mit

anderen Milchproteinen aggregierte [83{85] und somit nicht mehr als Monomer zu de-

tektieren war. Auch Marsilio et al. hatten vom"Verschwinden\ verschiedener Signale

im Spektrum von erhitzter Milch berichtet [86].

49


β-Lactoglobulin Var. A/BLactoseaddukte

18000 18750 19500 m/z

rel.

Int. Rohmilch

ESL-Milch

UHT-Milch 1

UHT-Milch 2

Sterilmilch

Kondensmilch

Säuglingsnahrung 1

Säuglingsnahrung 2

Säuglingsnahrung 3

Säuglingsnahrung 4

Abb. 3.2: Maldi-Tof-Ms-Spektren von �-Lactoglobulin aus Handelsproben nach direkterVermessung. Lactoseaddukte sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Dieses Problem wurde in den Spektren von �-Lactoglobulin noch o�ensichtlicher

(siehe Abb. 3.2): Nur die Rohmilch und die hocherhitzte Milch ergaben ein deutliches

Signal f�ur �-Lactoglobulin, w�ahrend die ultrahocherhitzte Milch und zwei der S�aug-

lingsnahrungen relativ schwache Intensit�aten mit starkem Rauschen aufwiesen. In den

restlichen vier Proben war �-Lactoglobulin sogar �uberhaupt nicht mehr detektierbar.

3.2.2 Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nach metalla�nit�ats-

chromatographischer Aufreinigung

Nachdem von den direkt vermessenen Proben teilweise nur unbefriedigende Spektren

generiert worden waren, wurde im Folgenden eine metalla�nit�atschromatographische

Aufreinigung der Milch mit einem kommerziell erh�altlichen Kit getestet. Dessen Prin-

zip beruht auf der A�nit�at von Proteinen zu Kupferionen, welche auf magnetischen

50

3.3 Methoden zur Proteinisolierung f�ur einen anschlie�enden enzymatischen Verdau

EluierenWaschen

Cu2+

COO_

Magnetischer Partikel

Protein

Begleit-substanzen

COO_

Probe

Cu2+Cu2+ COO_

Abb. 3.3: Schematische Darstellung des Methodenprinzips zur Aufreinigung von Milch mittelsimmobilisierter Metalla�nit�atschromatographie (Imac).

Partikeln immobilisiert sind. Bei der Zugabe von Milch binden die Proteine �uber elek-

trostatische Wechselwirkungen, z. B. von Carboxyl- oder Phosphatgruppen, an die

Kupferionen. Nach einem sich anschlie�enden Waschschritt werden die Peptide und

Proteine mit einer Elutionsl�osung wieder von den magnetischen Partikeln gel�ost [87].

In Abb. 3.3 wird das Prinzip der Methode schematisch dargestellt.

F�ur �-Lactoglobulin konnte durch die Aufreinigung keine bedeutende Verbesserung

der Spektren erzielt werden (Daten nicht gezeigt). In den Spektren von �-Lactalbumin

konnte hingegen das Grundrauschen teilweise erheblich reduziert werden (siehe Abb. 3.1

B). In den beiden sterilisierten Proben (Steril- bzw. Kondensmilch) wurde �-Lactalbu-

min mit deutlich h�oherer Intensit�at als zuvor gemessen; zudem f�uhrte die Aufreinigung

bei den S�auglingsnahrungen 1 und 3 zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verh�altnis.

3.3 Methoden zur Proteinisolierung f�ur einen anschlie-

�enden enzymatischen Verdau

Sollen die Proteine vor der Vermessung mittels Maldi-Tof-Ms enzymatisch hydroly-

siert werden, ist zun�achst eine Proteinisolierung notwendig. Ein Verdau der gesamten

Proteinprobe ist z. B. f�ur Fl�ussigchromatographie mit anschlie�ender Vermesssung mit-

tels Tandemmassenspektrometrie (Ms/Ms) geeignet, w�urde beiMaldi-Tof-Ms aber

51


Antikörper EluierenWaschenProbe

YY YMagnetischer

Partikel

Antikörper

Protein G

Zielprotein

weiteres Protein

Abb. 3.4: Schematische Darstellung des Methodenprinzips zur Proteinisolierung mittelsImmunoa�nit�atschromatographie

zu komplexen Spektren f�uhren, deren Auswertung nahezu unm�oglich w�are. Aus diesem

Grund sollten verschiedene Techniken zur Proteinauftrennung auf ihre Eignung f�ur eine

anschlie�ende partielle enzymatische Hydrolyse gepr�uft werden.

3.3.1 Isolierung von Proteinen mittels Immunoa�nit�atschromato-

graphie

Zun�achst wurde zur Isolierung von Milchproteinen ein kommerziell erh�altlicher Kit

getestet, dessen Prinzip auf der Immunoa�nit�atschromatographie (Iac) beruht. Aus-

gangspunkt der Analytik sind magnetische Partikel, auf denen Protein G immobilisiert

ist. Dieses aus Streptococcus G gewonnene Protein zeichnet sich durch seine Eigen-

schaft aus, an die konstante Region von einer Vielzahl von Antik�orpern zu binden.

Gibt man also einen Antik�orper gegen �-Lactalbumin zu den magnetischen Partikeln,

bindet er an diese. Durch Inkubation des gebildeten Komplexes mit Milch gelingt es

somit, das Zielprotein { in diesem Fall �-Lactalbumin { aus der Probe zu isolieren.

Nach einem Waschschritt, in dem weitere vorhandene Proteine entfernt werden, wird �-

Lactalbumin durch Inkubation mit einer Elutionsl�osung wieder vom Antik�orper gel�ost

[88]. In Abbildung 3.4 wird das Prinzip der Aufreinigung schematisch dargestellt.

Abb. 3.5 zeigt das Potential der Immunoa�nit�atschromatographie auf: W�ahrend in

der Milch Signale von �-Lactalbumin, �-Lactoglobulin sowie weiterer niedermolekula-

rer Proteine zu sehen waren, war nach der Aufreinigung nur noch �-Lactalbumin bei

14186 Da detektierbar. Bei den beiden weiteren Signalen im Spektrum handelte es sich

52


5000 15000 25000 m/z

rel.

Int.

5000 15000 25000 m/z

rel.

Int.

13500 14500 15500 m/zre

l. In

t.

α-Lactalbuminβ-Lactoglobulin

Standard

Rohmilch

Erhitzte Milch300 min 70 °C

α-Lactalbumin

A B C

AP

Abb. 3.5: Maldi-Tof-Ms-Spektren einer �-Lactalbumin-Standardl�osung, einer Rohmilchbzw. einer bei 70 °C f�ur 300 min erhitzten Milch vor (A) und nach (B) Aufreinigungmittels Immunoa�nit�atschromatographie unter Verwendung eines anti-�-Lactalbumin-Antik�orpers. Die Aufreinigung erfolgte in Doppelbestimmung. Bei weiteren Signalen inden Spektren unter B handelt es sich um mehrfach geladene Ionen. Abschnitt C vergr�o�ertden markierten Bereich der mit B gekennzeichneten Spektren. Au�er �-Lactalbumin unddessen Amadoriprodukt ist das Matrixaddukt sowie im Standard dessen Verunreinigungzu sehen. AP: Amadoriprodukt.

um das zwei- bzw. dreifach geladene Ion. Die Vergr�o�erung des Spektrums im Bereich

von 13500 bis 15500 Da zeigte zus�atzlich noch das Matrixaddukt (�m = 154 Da) des

Proteins sowie die Verunreinigung des Standards (�m = -113 Da; siehe Kapitel 2.2.1).

Es wird au�erdem deutlich, dass auch glykiertes �-Lactalbumin an den Antik�orper bin-

det, da im Spektrum einer Milch, die 300 min bei 70 °C erhitzt worden war, das Signal

des Amadoriprodukts mit einer um 324 Da h�oheren Masse zu detektieren war.

Ein enzymatischer Verdau im Anschluss an die vorgestellte Aufreinigung ist m�oglich,

wie Vorversuche gezeigt haben (Daten nicht gezeigt) und wie f�ur andere Proteine nach

Isolierung mittels magnetischer Partikel berichtet wurde [89]. Hierbei muss jedoch be-

achtet werden, dass im Elutionsschritt auch der Antik�orper eluiert wird, der bei der

sp�ateren massenspektrometrischen Analyse st�oren kann. Zur Abhilfe kann der An-

tik�orper mit dem Protein G mit Hilfe von Dimethylpimelimidat quervernetzt werden,

um eine Koelution zu verhindern. Auch �-Lactoglobulin eignet sich f�ur diese Aufreini-

53


A

B

5000 15000 25000 m/z

β-Lactoglobulin

rel.

Int.

Abb. 3.6: Maldi-Tof-Ms-Spektren einer Rohmilch, die 1:150 verd�unnt worden war, vor (A)und nach (B) Aufreinigung mittels Immunoa�nit�atschromatographie unter Verwendungeines anti-�-Lactoglobulin-Antik�orpers. Das Signal des einfach geladenen �-Lactoglobulinsist markiert.

gungstechnik und kann damit noch in sehr geringen Mengen (ca. 20 ppm) in verd�unnter

Rohmilch nachgewiesen werden (s. Abb. 3.6).

3.3.2 Auftrennung von Proteinen mittels Gelelektrophorese

Eine klassische Methode zur Auftrennung von Proteinen stellt die eindimensionale Po-

lyacrylamidgelelektrophorese (Page) dar, bei der die Proteine in einem Gel aus Poly-

acrylamid aufgetrennt werden. Durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (Sds) wird die

terti�are Struktur der Proteine aufgehoben und aufgrund der hohen negativen Ladung

von Sds die Eigenladung der Proteine unterdr�uckt. Infolgedessen werden die Proteine

praktisch ausschlie�lich nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt [90]. Ein Vorteil der

Gelelektrophorese besteht darin, dass im Anschluss ein enzymatischer Verdau der Pro-

teine direkt im Gel durchgef�uhrt werden kann. Nach Elution der Peptide aus dem Gel

kann die Vermessung mittels Maldi-Tof-Ms erfolgen [91, 92].

Eindimensionale SDS-PAGE-Gelelektrophorese

Die eindimensionale Sds-Page besteht aus der eben erkl�arten elektrophoretischen Auf-

trennung der Proteine in einem Polyacrylamidgel, an die sich eine Anf�arbung mit Rea-

54


β-Casein

A B CLactoferrin

BSAImmunoglobulin

α-s2-Caseinα-s1-Casein

κ-Casein

β-Lactoglobulin

α-Lactalbuminγ2/3-Casein

Abb. 3.7: Eindimensionale Sds-Page von Rohmilch. Rohmilch wurde 1:10 mit Probenpuf-fer verd�unnt. Davon wurden 10 (A), 5 (B) und 2,5 �L (C) pro Tasche aufgetragen undim 15 %igen Trenngel aufgetrennt. Die Anf�arbung der Proteine erfolgte mit Coomassie.Zuordnung der Banden nach [6, 95, 96].

genzien wie Coomassie, Silber oder Fluoreszenzfarbsto�en zur Detektion der Proteine

im Gel anschlie�t [93, 94]. Coomassie ist dabei die universellste und einfachste, wenn

auch unemp�ndlichste Methode. Abbildung 3.7 zeigt das Gelelektropherogramm einer

Rohmilch, von der drei unterschiedliche Mengen aufgetragen wurden. In der gew�ahlten

Konzentration an Acrylamid im Gel (15 %) lassen sich die Hauptproteine der Milch gut

auftrennen; eine weitere Trennung der Caseinfraktion w�are durch ein niedriger konzen-

triertes Trenngel m�oglich. Die Banden der Hauptproteine, d. h. �s1-Casein, �s2-Casein,

�-Casein, �-Casein, �-Lactalbumin sowie �-Lactoglobulin sind deutlich angef�arbt. In

den weiteren schw�acheren Banden �nden sich die h�ohermolekularen Proteine (Bsa,

Lactoferrin, Immunoglobuline) bzw. Proteolyseprodukte der Caseinfraktion. Es ist er-

sichtlich, dass die sehr unterschiedlichen Konzentrationen der Proteine in der Milch

eine Schwierigkeit in der Sds-Page von Milch mit sich bringen: Einerseits darf keine

zu hohe Menge an Protein aufgetragen werden, da dann die Caseinfraktion nur unzu-

reichend getrennt wird und das Gel lokal �uberladen ist. Andererseits werden bei einer

zu geringen Menge die niedriger konzentrierten Proteine nicht mehr detektiert. Die auf-

zutragene Proteinmenge muss daher stets an die Zielsetzung der Elektrophorese (z. B.

Darstellung des gesamten Proteoms oder saubere Trennung der Caseine) angepasst

werden.

55


Zweidimensionale SDS-PAGE-Gelelektrophorese

Eine e�zientere M�oglichkeit zur Auftrennung komplexer Proteingemische �ndet man

in der zweidimensionalen Gelelektrophorese [97]. In der ersten Dimension erfolgt dabei

eine Auftrennung der Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI). Die Proteine wan-

dern auf einem Gelstreifen mit immobilisiertem pH-Gradienten bis zu dem pH-Wert, der

ihrem isoelektrischen Punkt entspricht, an dem sie als nach au�en hin neutrales Zwit-

terion vorliegen (isoelektrische Fokussierung). Daran schlie�t sich die soeben erkl�arte

Sds-Page an. Durch die Auftrennung der Proteine nach zwei sehr unterschiedlichen

physikalischen Eigenschaften (isoelektrischer Punkt bzw. Molekulargewicht) wird bei

der zweidimensionalen Sds-Page eine wesentlich bessere Au �osung erzielt: So k�onnnen

bis zu 10000 Proteine in einem einzigen Gel aufgetrennt werden [92].

Abb. 3.8 zeigt ein zweidimensionales Gel von Rohmilch in einem pH-Bereich von

3-6. Es ist zu beachten, dass bei einem solch engen pH-Bereich einige Milchproteine

(z. B. Lactoferrin oder die -Caseine) nicht erfasst wurden. Im Vergleich mit der eindi-

mensionalen Sds-Page �el die wesentlich klarere Trennung der einzelnen Caseine auf.

Vor allem die �-Caseine wurden aufgrund ihres unterschiedlichen Phosphorylierungs-

grads in mehrere Punkte aufgetrennt. Gleichzeitig wird deutlich, dass im Vergleich zu

Systemen wie Gewebe oder Plasma bei einem vergleichsweise einfachen Proteom wie

dem der Milch eine eindimensionale Auftrennung der Proteine f�ur viele Anwendungen

ausreichend ist.

β-Caseinα-s1-Casein

κ-Caseinβ-Lactoglobulin

α-Lactalbumin

pH 3 pH 6

Abb. 3.8: Zweidimensionale Sds-Page von Rohmilch. Rohmilch wurde 1:20 mit Probenpu�erverd�unnt. Davon wurden 10 �L pro Ipg-Streifen (7 cm, pH 3-6) eingesetzt. Die Auftren-nung mittels Sds-Page erfolgte im 15 %igen Trenngel mit anschlie�ender Anf�arbung mitCoomassie in Doppelbestimmung.

56


Zus�atzlich wurden die Modellproteine, die bei der Inkubation von �-Lactalbumin

bzw. �-Lactoglobulin mit Lactose f�ur drei Tage bei 60 °C erhalten worden waren (siehe

Kapitel 2), mittels zweidimensionaler Sds-Page untersucht, um zu testen, ob sich die

modi�zierten von den nativen Proteinen abtrennen lassen (siehe Abb. 3.9).

A B

D

pH 3 pH 6 pH 3 pH 6

pH 3 pH 6 pH 3 pH 6

14 kDa

18 kDa

β-LactoglobulinVar. B Var. A

α-Lactalbumin

C

Abb. 3.9: Zweidimensionale Sds-Page glykierter Modellproteine. L�osungen aus �-Lactalbu-min bzw. �-Lactoglobulin und Lactose wurden 3 d bei 60 °C erhitzt. Der Ansatz erfolgein Doppelbestimmung. Je 5 �g der inkubierten Proteine bzw. der nicht behandelten Stan-dards wurden mittels zweidimensionaler Sds-Page (Ipg-Streifen: 7 cm, pH 3-6; 15 %igesTrenngel) aufgetrennt und mit Coomassie angef�arbt. A: �-Lactalbumin (Standard). B: in-kubiertes �-Lactalbumin. C: �-Lactoglobulin (Standard). D: inkubiertes �-Lactoglobulin.

Tats�achlich wurden bei den inkubierten Proteinen deutlich neue Punkte mit �ahnlicher

Masse sichtbar, die in den sauren pH-Bereich verschoben waren. O�ensichtlich f�uhrten

die Modi�zierungen zu einer detektierbaren pI-Ver�anderung der Molkenproteine. Mit

zweidimensionaler Sds-Page ist es somit m�oglich, modi�ziertes �-Lactalbumin bzw.

57


pH 3 pH 6

β-Caseinα-s1-Casein

κ-Caseinβ-Lactoglobulin

α-Lactalbumin

Abb. 3.10: Zweidimensionale Sds-Page von Sterilmilch. Sterilmilch wurde 1:10 mit Proben-pu�er verd�unnt. Davon wurden 10 �L pro Ipg-Streifen (7 cm, pH 3-6) eingesetzt. Die Auf-trennung mittels Sds-Page erfolgte im 15 %igen Trenngel mit anschlie�ender Anf�arbungmit Coomassie in Doppelbestimmung.

�-Lactoglobulin anzureichern. Allerdings war die Abtrennung der modi�zierten Protei-

ne in Handelsproben deutlich weniger ausgepr�agt; vielmehr bildete der Protein eck auf

dem Gel einen"Schweif\ in Richtung des niedrigeren pH-Wertes (s. Abb. 3.10). Damit

war es schwierig, klare Grenzen beim Ausschneiden des Proteins f�ur die enzymatische

Hydrolyse zu ziehen. Gleichzeitig sollte verhindert werden, zu gro�e St�ucke aus dem Gel

zu schneiden, um Matrixst�ore�ekte beim anschlie�enden In-Gel-Verdau bzw. der Mes-

sung zu minimieren. Aus diesem Grund wurde f�ur die Analyse der Modi�kationen von

�-Lactoglobulin in Handelsproben in Kapitel 3.4 die eindimensionale Gelelektrophorese

vorgezogen. Ein weiterer Vorteil bestand darin, dass pro Gel mehrere Proben gleich-

zeitig aufgetrennt werden konnten und somit der Material- und Zeitaufwand erheblich

reduziert wurde.

3.4 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin

aus Milchprodukten nach SDS-PAGE und partieller

enzymatischer Hydrolyse

F�ur die massenspektrometrische Analyse der Proteinmodi�kationen wurden die bereits

in Kapitel 3.2 beschriebenen Handelsproben mittels eindimensionaler Sds-Page auf-

getrennt. Als Zielprotein wurde in der vorliegenden Studie lediglich �-Lactoglobulin

58

3.4 Analyse der Modi�kationen von �-Lactoglobulin aus Milchprodukten

gew�ahlt; es ist jedoch m�oglich, auch die anderen Milchproteine mit der vorgestellten

Technik zu analysieren. Bei �-Lactalbumin ergab sich allerdings das Problem, dass die

Spektren ausgesprochen schwer reproduzierbar waren. Teilweise glichen die Spektren

nach In-Gel-Verdau exakt denen des Verdaus des Standards in L�osung; es �uberwo-

gen aber diejenigen Versuche, bei denen meistens ein bis zwei Peptide im Spektrum

dominierten, w�ahrend die restlichen nur in geringer Intensit�at detektiert wurden. Eine

Ursache f�ur diese gro�en Schwankungen zwischen den Ans�atzen konnte nicht festgestellt

werden, noch f�uhrte die Ver�anderung verschiedener Parameter des Protokolls zu einer

Verbesserung (siehe Kapitel 6.7.3). Daher schien es nicht m�oglich, die hitzeinduzierten

Modi�kationen, die nur in geringen Anteilen zu erwarten waren, verl�asslich zu detek-

tieren, da insbesondere f�ur eine relative Quanti�zierung eine gute Reproduzierbarkeit

der Ergebnisse notwendig ist.

Im Anschluss an die gelelektrophoretische Auftrennung der Milchproben wurde die

Bande des �-Lactoglobulins in kleine St�ucke geschnitten und mit der Endoproteinase

AspN versetzt. Nach der partiellen enzymatischen Hydrolyse wurden die Peptide aus

dem Gel eluiert und mit Hilfe von C18-Mikros�aulen aufgereinigt, um St�orsubstanzen,

die die Messung beeintr�achtigen k�onnten, zu entfernen.

Die vorgestellte Methode beinhaltet einige problemanf�allige Schritte, die eine sorgf�alti-

ge Kontrolle erfordern. W�ahrend der enzymatischen Proteolyse muss die Enzymau-

tolyse durch geringes Verdauvolumen und ein geeignetes Substrat-Enyzm-Verh�altnis

bestm�oglich unterdr�uckt werden, da sonst die Fragmente von AspN das Spektrum do-

minieren und die Zielpeptide supprimieren. Bei der Elution der Peptide aus dem Gel

muss einerseits darauf geachtet werden, dass diese vollst�andig eluieren, andererseits

darf der Anteil der Gelpartikel, die dabei ebenfalls aus der Matrix herausgel�ost werden,

nicht �uberhand nehmen. Die Aufreinigung der Proben ist schlie�lich der entscheidende

Schritt der Analytik, da Salze und Gelreste im Spektrum derartiges Rauschen verursa-

chen, dass niedrig konzentrierte Modi�kationen nicht mehr detektiert werden k�onnen.

Die Analyse von Proteinmodi�kationen, die in Milch in relativ geringer Konzentration

vorkommen, ist daher wesentlich anspruchsvoller als eine gew�ohnliche Proteomanaly-

tik, bei der lediglich die Identi�zierung des Proteins von Interesse ist, was bereits mit

vergleichbar qualitativ schlechteren Spektren gelingen kann.

59


3.4.1 Analyse der mit Lactose inkubierten Modellproteine

Zun�achst sollte untersucht werden, inwiefern die Aufarbeitung der Proben das Ausse-

hen der Spektren beein usst, z. B. zu einer anderen Intensit�aten-Verteilung der Signale

oder einer Abreicherung von Modi�kationen f�uhrt. Daf�ur wurde das in Kapitel 2 bespro-

chene, im Modellversuch glykierte �-Lactoglobulin mittels eindimensionaler Sds-Page

aufgetrennt (siehe Abb. 2.8 auf S. 33) und anschlie�end wie oben erkl�art aufgearbeitet.

Generell war festzustellen, dass alle Modi�kationen, die nach dem Verdau in L�osung

detektiert worden waren, auch nach der Aufreinigung aus dem Gel noch zu messen

waren. Dies galt sowohl f�ur die Glykierungs-, die Glykoxidations- als auch die Oxi-

dationsprodukte. In Abb. 3.11 werden beispielhaft die Spektren der Peptide mit der

Masse von 1812 bzw. 3033 Da nach In-Gel-Verdau vergr�o�ert denjenigen des Verdaus

in L�osung gegen�ubergestellt. Es war zu beobachten, dass w�ahrend der partiellen enzy-

matischen Hydrolyse der Proteine im Gel die Oxidation des Methionins o�ensichtlich

beg�unstigt wurde, was sich in den deutlich h�oheren Anteilen des Methioninsulfoxids

widerspiegelte. So erreichte dessen Intensit�at am Peptid 1812 in den f�ur 14 Tage inku-

bierten Proben etwa denselben Wert wie die des unmodi�zierten Signals. Tendenziell

gleiche Ergebnisse waren an den weiteren Peptiden mit Methionin zu beobachten (Da-

ten nicht gezeigt). Trotz der arti�ziellen Oxidation durch die Aufarbeitung war jedoch

die Oxidation, die allein durch die Erhitzung bedingt war, noch deutlich zu erkennen.

Nach der Hydrolyse im Gel war im Spektrum ein zus�atzliches Signal zu verzeichnen,

das einen Massenunterschied von 71 Da zum Peptid 3033 aufwies. Dabei handelte es

sich wahrscheinlich um ein Acrylamidaddukt des Peptids. Auch eine Polymerisation

der Gele �uber Nacht oder mehrere Tage konnte diese Artefaktbildung nur verringern,

jedoch nicht komplett unterdr�ucken. Entsprechend nahm die Intensit�at des Signals

des unmodi�zierten Peptids 3033 merklich ab und folglich auch die des zugeh�origen

Amadoriprodukts. Als Folge davon konnte das mit Lactose modi�zierte Peptid deutlich

unemp�ndlicher detektiert werden.

Im Allgemeinen wurde au�erdem eine verringerte Reproduzierbarkeit der Spektren

beobachtet, die meist von einem schlechteren Signal-Rausch-Verh�altnis, insbesondere

im unteren Massenbereich von ca. 1000 - 2000 Da, begleitet wurde. Auch dies beein-

tr�achtigte teilweise die Detektierbarkeit der Modi�zierungen.

60


3050 3200 3350 m/z

Met ox

CMLCML

In Lösung

3033

rel.

Int.

33503050 3200 m/z

1812

rel.

Int.

1810 1825 1840 m/z

Met ox

1812

Met ox AP

Acrylamidaddukt

In Gel

3033

rel.

Int.

AP

1810 1825 1840 m/z

rel.

Int.

Met ox

Standard

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Standard

Erhitzte Kontrolle

3 d 60 °C

7 d 60 °C

14 d 60 °C

Abb. 3.11: Maldi-Tof-Ms-Spektren des mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins nachpartieller enzymatischer Hydrolyse im Gel. 175 �M �-Lactoglobulin wurde bei pH 6,8 mit144 mM Lactose bei einer Temperatur von 60 °C f�ur 3, 7 und 14 Tage erhitzt. Das dialysier-te, lyophyllisierte Protein wurde in Doppelbestimmung mittels eindimensionaler Sds-Pageaufgetrennt und im Gel mit 0,1 �g der Endoproteinase AspN verdaut. Nach der Elution ausder Gelmatrix wurden die Peptide an C18-Material aufgereinigt. Der kommerziell erh�altli-che Standard und das ohne Lactose erhitzte Protein dienten als Kontrolle. m/z-Werte sindangegeben, Modi�zierungen gekennzeichnet. Metox: Methioninsulfoxid. AP: Amadoripro-dukt.

61


Tab. 3.1: �Uberblick �uber die in erhitzter Rohmilch und Handelsprodukten detektierten Mo-di�kationen von �-Lactoglobulin


1104 1-10 LIVTQTMKGL 16 Da Methioninsulfoxid


2199 33-52 DAQSAPLRVYVEELKPTPEG 324 Da Lactulosyllysin

3033 137-162 DKALKALPMHIRLSFNPTQLE 16 Da * Methioninsulfoxid

EQCHI 324 Da Lactulosyllysin

* nur in erhitzter Rohmilch eindeutiger Anstieg detektiert

3.4.2 Analyse von erhitzter Rohmilch

Im n�achsten Experiment wurde Rohmilch im Modellversuch bei 120 °C f�ur bis zu 60 min

erhitzt und wie beschrieben aufgearbeitet, um die Entstehung von Modi�kationen in

Milch im Zeitverlauf beobachten zu k�onnen. Abb. 3.12 zeigt die dabei generierten Spek-

tren; die detektierten Modi�kationen sind in Tab. 3.1 zusammengefasst.

An den Peptiden 1103, 1812 sowie 3033 wurde wie bei den Modellproteinen eine

Massenzunahme von 16 Da beobachtet, die mit der Bildung von Methioninsulfoxid an

Methionin 7, 24, 145 interpretiert werden kann. Zudem wurden die Amadoriprodukte

der Peptide 2199 (Lysin 47) und 3033 (Lysin 138/141) mit einer Massendi�erenz von

324 Da detektiert. Im Unterschied zu den Modellproteinen konnten sowohl Cml als

auch Lysinaldehyd nicht sicher nachgewiesen werden.

3.4.3 Analyse von Handelsproben

Abschlie�end wurden verschiedene Handelsproben analysiert, um deren Modi�zierun-

gen w�ahrend der industriellen Erhitzung zu untersuchen. Als Proben dienten eine hoch-

erhitzte Milch, zwei ultrahocherhitzte Milchproben, Sterilmilch, sterilisierte Kondens-

milch sowie S�auglingsmilchnahrung in Pulver- bzw. �ussiger Form, um eine m�oglichst

gro�e Bandbreite verschiedener W�armebehandlungen und Produkttypen abzudecken.

Die Proben wurden gegebenenfalls in L�osung gebracht und mittels eindimensionaler

Sds-Page aufgetrennt. Die Banden des �-Lactoglobulins wurden anschlie�end mit

AspN partiell hydrolysiert und die eluierten Peptide vor der massenspektrometrischen

Vermessung aufgereinigt.

62


1810 1825 1840 m/z1100 1115 1130 m/z

3050 3250 3450 m/z 3340 3380 3420 m/z

rel.

Int.

rel.

Int.

rel.

Int.

rel.

Int.

20 min 120 °C

40 min 120 °C

60 min 120 °C

Rohmilch

20 min 120 °C

40 min 120 °C

60 min 120 °C

Rohmilch

2490 2530 2570 m/z

rel.

Int.

rel.

Int.

2199

1812

1103

3033

Acrylamidaddukt

AP

AP des Acrylamid-

addukts

Met ox Met ox

AP

2200 2350 2500 m/z

Rohmilch

20 min 120 °C

40 min 120 °C

60 min 120 °C

Abb. 3.12: Maldi-Tof-Ms-Spektren des �-Lactoglobulins aus erhitzter Rohmilch nach par-tieller enzymatischer Hydrolyse im Gel. Rohmilch wurde in Doppelbestimmung 20, 40 und60 min bei 120 °C erhitzt. Anschlie�end wurde die Milch mittels eindimensionaler Sds-Page aufgetrennt und die Bande von �-Lactoglobulin ausgeschnitten und mit 0,1 �g AspNverdaut. Die eluierten Peptide wurden vor der Messung an C18-Material aufgereinigt. AlsKontrolle diente Rohmilch. m/z-Werte sind angegeben, Modi�zierungen gekennzeichnet.Metox: Methioninsulfoxid. AP: Amadoriprodukt.

63


In den Handelsproben wurden dieselben Modi�kationen wie in der erhitzen Rohmilch

detektiert (siehe Tab. 3.1). Dabei trat am deutlichsten das Amadoriprodukt von Lacto-

se an Lysin 138/141 hervor, gefolgt vom Lactulosyllysin an Lysin 47. Amadoriprodukte

von Hexosen konnten nicht detektiert werden, ebensowenig Cml. F�ur eine quantitative

Bewertung der Glykierung wurde der relative Gehalt der Amadoriprodukte berech-

net. Daf�ur wurde die Fl�ache des monoisotopischen Lactulosyllysins auf die Summe der

Fl�achen des monoisotopischen nativen und des modi�zierten Peptids bezogen:

Rel. Gehalt =Fl�ache (Lactulosyllysin)

Summe (Fl�ache natives Peptid + Fl�ache modifizierte Peptide)

Abb. 3.13 gibt die Ergebnisse der relativen Quanti�zierung wieder. Die Gehalte des

Amadoriprodukts an Lysin 47 lagen zwischen 0,9± 0,3 % und 5,7± 1,2 %, w�ahrend

an Lysin 138/141 Werte zwischen 1,7± 0,6 % und 7,2± 0,7 % erreicht wurden. Die

Kondensmilch und die pulverf�ormige S�auglingsmilchnahrung erwiesen sich dabei als

die am st�arksten glykierten Proben.

Auch in den Handelsproben konnte Lysinaldehyd nicht sicher identi�ziert werden,

da o�ensichtlich dessen Gehalt unterhalb der Nachweisgrenze lag. Oxidationsproduk-

te des Methionins konnten hingegen detektiert werden. Bei deren Analyse stellte sich

die Oxidation, die durch die Aufarbeitung bedingt wird, als Problem dar. Bereits in

der Kontrolle (Rohmilch) wurde ein relativer Gehalt des Methioninsulfoxids zwischen

ca. 14 und 27 % ermittelt. Dabei muss zus�atzlich angemerkt werden, dass die durch die

Probenbehandlung bedingte Oxidation stark schwankte. Als Folge davon lie� sich nach

der relativen Quanti�zierung des Methioninsulfoxids kein signi�kanter Unterschied zwi-

schen den Proben feststellen, auch wenn tendenziell bei den Mittelwerten des relativen

Gehalts an Methioninsulfoxid der Peptide 1103 und 1812 ein Anstieg zu verzeichnen

war. So wurde in Rohmilch am Peptid 1103 bzw. 1812 ein mittlerer Anteil von 22 %

bez. 27 % ermittelt, w�ahrend in der �ussigen S�auglingsmilchnahrung Werte von 30 %

bzw. 41 % erhalten wurden (siehe Abb. 3.14).

3.5 Diskussion

In diesem Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollten Molkenproteinver�anderungen in

handels�ublichen Milchproben mittelsMaldi-Tof-Ms analysiert werden.Maldi-Tof-

64

3.5 Diskussion

0

2

4

6

8

Rohmilch

(10)

ESL (2)

UHT 1 (7)

UHT 2 (3)

Sterilm. (4

)

Konde

nsm. (7

)

Säugli

ngsn

. P. (7

)

Säugli

ngsn

. fl. (6

)

Rel

. Geh

alt [

%]

1 1 1

23

6

2

n.n.

A

0

2

4

6

8

10

Rohmilch

(10)

ESL (1)

UHT 1 (7)

UHT 2 (2)

Sterilm. (4

)

Konde

nsm. (7

)

Säugli

ngsn

. P. (7

)

Säugli

ngsn

. fl. (6

)

Rel

. Geh

alt [

%]

n.n.

22

4 4

7

54

B

Abb. 3.13: Relative Quanti�zierung der Amadoriprodukte von �-Lactoglobulin in Handels-proben. Als Bezugswert diente die Summe der Fl�achen des nativen und der modi�ziertenPeptide. Dargestellt sind die Mittelwerte von unabh�angigen Wiederholungen der Aufar-beitung und Messung, deren Anzahl in Klammern angegeben ist. A: Amadoriprodukt anLysin 47. B: Amadoriprodukt an Lysin 138/141. n.n.: nicht nachweisbar.

65


0

15

30

45

60

Rohmilch ESL

UHT 1UHT 2

Sterilm.

Konde

nsm.

Säugli

ngsn

. P.

Säugli

ngsn

. fl.

Rel.

Geh

alt [

%]

0

10

20

30

40

Rohmilch ESL

UHT 1UHT 2

Sterilm.

Konde

nsm.

Säugli

ngsn

. P.

Säugli

ngsn

. fl.

Rel.

Geh

alt [

%] 22

25 2625

30 26 29 30

2730 32

38 3729

3741

0

5

10

15

20

25

Rohmilch ESL

UHT 1UHT 2

Sterilm.

Konde

nsm.

Säugli

ngsn

. P.

Säugli

ngsn

. fl.

Rel.

Geh

alt [

%] 14 13

13 13 1414 16 13

A

B

C

Abb. 3.14: Relative Quanti�zierung der Methioninsulfoxide von �-Lactoglobulin in Handels-proben. Als Bezugswert diente die Summe der Fl�achen des nativen und der modi�zier-ten Peptide. Dargestellt sind die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung derAufarbeitung und Messung. A: Methioninsulfoxid an Peptid 1103. B: Methioninsulfoxid anPeptid 1812. C: Methioninsulfoxid an Peptid 3033.

66

3.5 Diskussion

Ms ist als e�zientes Werkzeug f�ur die Analyse von Proteinmodi�kationen in Milch

etabliert. Dabei ist es m�oglich, die Proteine intakt [46, 66] oder aber nach partieller

enzymatischer Hydrolyse [47, 49] zu vermessen. Die direkte massenspektrometrische

Vermessung der intakten Proteine wurde bereits angewendet, um Amadoriprodukte

von �-Lactalbumin zu detektieren [46]. Es zeigte sich jedoch in der hier durchgef�uhr-

ten Arbeit, dass sich dabei je nach Probe Schwierigkeiten in der Spektrenqualit�at erge-

ben, die wohl u. a. auch auf Matrixst�ore�ekte zur�uckzuf�uhren sind. Mit der Metallaf-

�nit�atschromatographie konnte eine M�oglichkeit aufgezeigt werden, die Milchprodukte

aufzureinigen, um eine verbesserte Spektrenqualit�at zu erzielen. Damit gelang es, �-

Lactalbumin und dessen Modi�zierung mit Amadoriprodukten deutlich emp�ndlicher

nachzuweisen, w�ahrend sich f�ur �-Lactoglobulin vermutlich aufgrund dessen st�arkerer

Denaturierung w�ahrend der industriellen Erhitzung keine Verbesserung der Spektren

erreichen lie�. Insbesondere f�ur komplexere Matrices, wie z. B. S�auglingsmilchnahrung,

bietet sich daher eine Aufreinigung mittels Metalla�nit�atschromatographie vor der

massenspektrometrischen Analyse an.

Die Analyse am intakten Protein ist allerdings nicht f�ur alle Zielsetzungen geeignet.

Sollen z. B. neben dem Amadoriprodukt weitere Modi�zierungen sowie deren Positio-

nen im Protein bestimmt werden, ist eine partielle enzymatische Hydrolyse notwendig,

wie bereits in Kapitel 2 erl�autert wurde. Ein Verdau der unfraktionierten Milch ist

in Verbindung mit Hilfe von strukturaufkl�arenden Techniken wie Ms/Ms denkbar.

Soll jedoch wie hier nur eine einfache eindimensionale massenspektrometrische Analy-

se erfolgen, bedarf es einer vorherigen Proteinisolierung, um die �Ubersichtlichkeit der

Spektren zu bewahren.

Als e�ziente Methode zur Isolierung von �-Lactalbumin erwies sich ein kommerziell

erh�altliches System, welches auf der Immunoa�nit�atschromatographie basiert. Damit

konnte erfolgreich ein Antik�orper gegen bovines �-Lactalbumin an magnetische Par-

tikel gebunden werden. Mit diesem Komplex wurde im Folgenden �-Lactalbumin se-

lektiv aus Rohmilch oder hitzebehandelter Milch abgetrennt, wobei auch lactosyliertes

Protein erfasst wurde. Die Aufreinigung ist f�ur einen anschlie�enden enzymatischen

Verdau des isolierten Proteins geeignet, wie durch Vorversuche aufgezeigt wurde. Auch

�-Lactoglobulin aus Milch konnte mit Hilfe dieser Technik aufgereinigt werden und

emp�ndlich nachgewiesen werden. Es ist zu erwarten, dass andere Milchproteine bzw.

andere Lebensmittel ebenfalls f�ur diese Form der Immunoa�nit�atschromatographie ge-

eignet sind. Vorteil der Methode ist ihre einfache und relativ schnelle Durchf�uhrung.

67


Zudem werden die Proteine sehr selektiv und wesentlich schonender aufgereingt als

z. B. bei der Sds-Page, die f�ur ihre Artefaktbildung bekannt ist [63].

Auch mit der eindimensionalen Sds-Page gelang es, die Mehrzahl der Milchproteine

aufzutrennen. Je nach Zielsetzung des Versuchs k�onnen die elektrophoretischen Bedin-

gungen so gew�ahlt werden, dass in der gew�unschten Proteinfraktion eine ausreichende

Isolierung der Banden m�oglich ist. Insbesondere f�ur die Di�erenzierung der Caseine

erwies sich die zweidimensionale Sds-Page, bei der die Proteine zus�atzlich nach ihrem

isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden, als n�utzlich. Durch den variierenden Phos-

phorylierungsgrad und dem daraus resultierenden Unterschied im isoelektrischen Punkt

konnten sowohl die Proteine selbst als auch deren Varianten mit unterschiedlicher An-

zahl an Phosphatgruppen aufgetrennt werden. Eine Analyse der Molkenproteine, die

mit Lactose bei 60 °C inkubiert worden waren, zeigte eine deutliche Verschiebung der

Banden in den sauren pH-Bereich auf. �Ahnliche Beobachtungen wurden mit glykiertem

�-Lactoglobulin von Fenaille et al. gemacht, die die Ver�anderung des isoelektrischen

Punktes mittels isoelektrischer Fokussierung verfolgt hatten [65]. Sie erkl�arten dieses

Ph�anomen mit der Addition von Zuckermolek�ulen an das Protein, ohne jedoch den

pI-Wert des Amadoriprodukts in Betracht zu ziehen. Vermutlich spielen jedoch vor

allem saure Gruppen, die w�ahrend der fortgeschrittenen Maillard-Reaktion entstehen,

wie z. B. Carboxylfunktionen von Cml oder oxidiertem Cystein, eine Rolle bei der

beobachteten Verschiebung des pI-Wertes in den sauren Bereich. Die zweidimensio-

nale Gelelektrophorese wurde bereits f�ur die Analyse von Milchproteinmodi�kationen

eingesetzt [48, 62]. Da jedoch mit der eindimensionalen Sds-Page eine ausreichende

Trennung der Molkenproteine erreicht wurde und damit ein h�oherer Probendurchsatz

m�oglich war, wurde f�ur die folgenden Versuche auf eine zus�atzliche isoelektrische Fo-

kussierung der Milchproteine verzichtet.

Die Trennung von Proteinen im Gel und ihr anschlie�ender enzymatischer Verdau

stellt eine klassische Methode in der Proteomanalytik dar [91, 92]. Die Anwendung die-

ser Technik f�ur die Analyse von Proteinmodi�kationen, die im Zuge der Erhitzung von

Milch entstehen, erfordert allerdings qualitativ einwandfreie Spektren mit tadellosem

Signal-Rausch-Verh�altnis und intensiven Signalen. W�ahrend bei der Proteinidenti�zie-

rung auch schwache Signale und relativ starkes Grundrauschen zu tolerieren sind, kann

dies bei der Untersuchung von Modi�kationen hinderlich sein, da diese in der Regel

in sehr geringer Konzentration zu erwarten sind und somit die Nachweisgrenze ein

limitierender Schritt der Analytik ist.

68

3.5 Diskussion

Bei der Vermessung des im Modellversuch mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins

zeigte sich nach der Auftrennung im Gel eine Abnahme der Spektrenqualit�at im Ver-

gleich zu den Spektren, die nach partieller enzymatischer Hydrolyse in L�osung erhalten

worden waren. Einerseits war in der Regel ein schlechteres Signal-Rausch-Verh�altnis zu

beobachten. Andererseits wurde die Auswertung der Spektren durch Proteinmodi�zie-

rung infolge der Aufarbeitung erschwert: Auch die Peptide der Kontrolle mit Methionin

in der Sequenz zeigten bereits einen verh�altnism�a�ig gro�en relativen Anteil des Oxi-

dationsprodukts, was eine oxidative Belastung der Proben w�ahrend der Aufarbeitung

beweist. Dieses Ph�anomen ist bekannt und wird vor allem auf Reste von Ammonium-

persulfat im Gel zur�uckgef�uhrt [63]. In der Proteomanalytik wird Methioninsulfoxid bei

der Datenbanksuche meistens ber�ucksichtigt und kann so sogar zur Reduzierung der

Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Proteinidenti�zierung dienen. Bei der Analyse von

Oxidationsreaktionen, wie z. B. hier w�ahrend der Erhitzung von Milch, stellt sich die

Artefaktbildung durch die Aufarbeitung jedoch als hinderlich dar.

Zus�atzlich wurden cysteinhaltige Peptide durch Acrylamidmonomere, die o�ensicht-

lich noch im Gel vorhanden waren, teilweise modi�ziert und ergaben somit zwei Si-

gnale. Folglich nahm die Intensit�at des nativen Peptids ab, was die Emp�ndlichkeit

des Nachweises von dessen Modi�kationen wiederum herabsetzte. Die Addition von

Acrylamidmonomeren an freie Thiolgruppen im Protein w�ahrend der Gelelektrophore-

se ist bekannt [98, 99]. M�oglich w�are eine Reduktion und Alkylierung der Proteine vor

der elektrophoretischen Auftrennung, um die Cysteinmodi�zierung zu vermeiden, je-

doch sollten Schritte, die eine zus�atzliche W�armebelastung der Proteine beinhalten, so

weit wie m�oglich vermieden werden. Trotz der beschriebenen Schwierigkeiten der Ana-

lyse nach dem In-Gel-Verdau konnten in den Modellproteinen noch alle Modi�kationen

detektiert werden.

Im Folgenden wurde Rohmilch bei 120 °C bis zu 60 Minuten erhitzt, um dabei

ablaufende Reaktionen von �-Lactoglobulin anschlie�end nach partieller emzymatischer

Hydrolyse im Gel massenspektrometrisch zu untersuchen. An Modi�kationen von �-

Lactoglobulin konnten dabei Lactulosyllysin an Lysin 47 und Lysin 138 oder 141 sowie

Methioninsulfoxid an Methion 7, 24 und 145 detektiert werden. Cml und Lysinaldehyd,

die im Modell nachgewiesen worden waren, waren o�ensichtlich nur in Konzentrationen

unterhalb der Nachweisgrenze entstanden.

Die Analyse von verschiedenen Milchprodukten aus dem Handel zeigte ebenfalls die

Glykierung von Lysin 47 und 138 oder 141 auf. Dies galt f�ur hocherhitzte Milch ebenso

69


wie f�ur sterilisierte S�auglingsmilchnahrung. Eine relative Quanti�zierung des Lactulo-

syllysins ergab Anteile zwischen 0,9± 0,3 % und 7,2± 0,7 %. Als am st�arksten glykierte

Proben erwiesen sich dabei eine Kondensmilch und eine S�auglingsmilchnahrung in Pul-

verform. Der relative Gehalt des Lactulosyllysins war dabei stets an Lysin 138/141

h�oher als an Lysin 47, nur die pulverf�ormige S�auglingsnahrung zeigte umgekehrte

Verh�altnisse. Eventuell ist dies darauf zur�uckzuf�uhren, dass das Amadoriprodukt an

Lysin 138/141 bereits teilweise weiterreagiert hatte.

Die Glykierung an Lysin 138 oder 141 deckt sich mit den Ergebnissen einer anderen

Studie, die Kindern�ahrmittel mittels Esi-Ms analysiert hat [48]. Darin war jedoch von

keiner Modi�zierung von Lysin 47 berichtet worden, die aber in Modellversuchen mit �-

Lactoglobulin nachgewiesen worden war [47, 50]. Die vorliegende Studie zeigt, dass die

Ergebnisse der Modellexperimente auch auf Milchprodukte zu �ubertragen sind. In der

Literatur wurde die Anwendung der relativen Quanti�zierung f�ur glykiertes Lysozym

beschrieben [52], f�ur Milchproteine aus Modellinkubationen oder realen Proben sind

jedoch bislang keine entsprechenden Daten vorhanden. Die relative Quanti�zierung von

Lactoseaddukten k�onnte beispielsweise bei der Kontrolle einer selektiven Glykierung,

z. B. zum Erlangen bestimmter technologischer Eigenschaften, genutzt werden.

Eine Oxidation von Methionin in Milchproteinen kann infolge der Sterilisation von

Milchcontainern mit Wassersto�peroxid oder w�ahrend der Lipidoxidation ablaufen [5].

In Kapitel 2 wurde jedoch aufgezeigt, dass auch w�ahrend der thermischen Behandlung

von Milchprodukten oxidative Ver�anderungen des Methionins zu erwarten sind. Da die

Analyse von Methioninsulfoxid schwierig ist, wurde es als Marker f�ur oxidativen Scha-

den bislang vernachl�assigt [5]. Mit der hier durchgef�uhrten massenspektrometrischen

Methode konnte ein Anstieg der Mittelwerte des relativen Gehalts von Methioninsulf-

oxid an Methionin 7 und 24 ermittelt werden.

Bei den meisten bislang vorgestellten Methoden zur Bestimmung von Methionin-

sulfoxid besteht die Schwierigkeit in der Wieder�ndung, da es leicht wieder zu Me-

thionin reduziert wird. Im Gegensatz dazu stellte sich bei der in dieser Arbeit vorge-

stellten massenspektrometrischen Technik vielmehr die zus�atzliche Oxidation w�ahrend

der Aufarbeitung der Proben als Problem heraus. O�ensichtlich f�uhrte diese zu ei-

ner erheblichen Modi�zierung, w�ahrend die industrielle Erhitzung selbst schw�achere

Auswirkungen hatte, was eine Absch�atzung der Ergebnisse erschwerte. Dar�uber hin-

aus schwankte die durch die Aufarbeitung bedingte Artefaktbildung stark. Dies l�asst

sich wohl durch unterschiedliche Restkonzentrationen an Ammoniumpersulfat im Gel

70

3.5 Diskussion

erkl�aren. Zudem konnten die einzelnen Schritte des Protokolls nicht immer einheitlich

durchgef�uhrt werden (beispielsweise unterschiedliche Dauer des Entf�arbens des Gels

oder des Lyophyllisierens). So kam es wahrscheinlich zu Unterschieden in der oxidati-

ven Belastung der Proteine w�ahrend der Durchf�uhrung. Als Folge dessen war zwar bei

den Mittelwerten des relativen Gehalts an Methioninsulfoxids eine Zunahme festzustel-

len, die jedoch nicht statistisch belegt werden konnte. Die Analyse von Methioninsulf-

oxid mittels Maldi-Tof-Ms nach gelelektrophoretischer Auftrennung der Proteine

ist deshalb nicht optimal. Vielmehr ist es notwendig, eine weniger oxidativ belastende

Aufreinigungsmethode der massenspektrometrischen Analytik voranzustellen. Mit der

anfangs getesteten immunochemischen Isolierung der Proteine aus der Milch k�onnte

eine geeignete Methode vorhanden sein, da dabei die Proteine nur wenig beansprucht

werden. Es ist daher zu vermuten, dass eine eventuelle Oxidation wesentlich schw�acher

ausgepr�agt ist als w�ahrend einer gelelektrophoretischen Trennung und der darauf fol-

genden Aufreinigung.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass in den Milchprodukten o�ensichtlich �ahnli-

che Glykierungsreaktionen abliefen wie in den Modelll�osungen. In beiden Experimenten

konnte in �-Lactoglobulin die ortsspezi�sche Modi�zierung mit Lactose an den gleichen

Positionen im Protein detektiert werden. Dies zeigt auf, dass in diesem Zusammenhang

das Modell sehr gut die realen Bedingungen simuliert hatte und die unterschiedliche

Umgebung der Proteine keine Variationen im Glykierungsmuster hervorgerufen hatte.

Allerdings wurde auch deutlich, dass in den Milchprodukten an den Molkenproteinen

weniger Oxidationsreaktionen abliefen als in den Modelll�osungen, da weder Methionin-

sulfoxid in so deutlichem Ausma�, noch Lysinaldehyd, noch Cml detektiert werden

konnten. Eine m�ogliche Erkl�arung kann darin liegen, dass der in den Modellen ein-

gesetzte Phosphatpu�er die Glykierung und damit auch die Oxidation verst�arkt hat

[100], w�ahrend Metall- und Phosphationen in Milch in den Caseinmicellen komplexiert

vorliegen und somit wahrscheinlich ihre oxidative Wirksamkeit auf die Molkenproteine

herabgesetzt wurde.

Das in diesem Kapitel vorgestellte Projekt hat die Eignung vonMaldi-Tof-Ms zur

Detektion und Quanti�zierung von Glykierungsprodukten in handels�ublichen Milchpro-

ben best�atigt. F�ur den Nachweis von Oxidationsprodukten ist es erstrebenswert, die

entsprechenden Modi�kationen vor der Analyse anzureichern, wof�ur sich z. B. immuno-

a�nit�atschromatographische Methoden anbieten. In Verbindung mit einer schonenden

Aufreinigung der Proteine sollte es damit auch mittels Maldi-Tof-Ms m�oglich sein,

die selektive Oxidation von Proteinen emp�ndlich nachzuweisen.

71

4 Untersuchung der niedermolekularen Proteinfraktion der Milch

4 Untersuchung der niedermolekularen

Proteinfraktion der Milch

4.1 Einleitung

Das Proteom boviner Milch ist ausgesprochen kompliziert. Obwohl die anteilsm�a�ig

�uberwiegenden Proteine �s1-Casein, �s2-Casein, �-Casein, �-Casein, �-Lactalbumin

und �-Lactoglobulin intensiv erforscht wurden, bleiben noch immer Fragen �uber Ein-

zelheiten der Proteinzusammensetzung o�en. Genetische Varianten, posttranslationale

Modi�kationen und proteolytische Reaktionen f�uhren zu einer gro�en Komplexizit�at

des Milchproteoms, so dass es bis heute nicht vollst�andig aufgekl�art werden konnte

[64].

Insbesondere die Peptidfraktion, die u. a. aus hydrolytischer Aktivit�at verschiedener

Milchproteinasen resultiert, ist bei weitem noch nicht bis ins Detail erforscht. Diese

Proteingruppe ist jedoch in Hinsicht auf ern�ahrungsphysiologische, technologische und

sensorische Eigenschaften der Milch von gro�er Bedeutung. Bioaktive Peptidstruktu-

ren, die in Milchproteinen enthalten sind und durch Proteinasen freigesetzt werden,

wurden ausgiebig auf ihre opoide, immunostimulierende, antithrombotische u. a. Ei-

genschaften untersucht [101] und sind f�ur den Einsatz in neuartigen Lebensmitteln mit

gesundheitsf�ordernder Wirkung in Diskussion [102]. Andererseits ist ein hoher Anteil

von Proteolyseprodukten in der Milchindustrie unerw�unscht, da dieser das Gelierungs-

verhalten z. B. von Uht-Milch negativ beein usst oder die Gerinnung bei der K�aseher-

stellung beeintr�achtigt [103, 104]. Dar�uber hinaus f�uhrt die Proteolyse zu Fehlaroma

und Fehlgeschmack in Milch [105, 106] und sollte deshalb minimiert werden.

Folglich war die Proteolyse in Milch Ziel verschiedener Studien, die z. B. den Nicht-

proteinsticksto�-Anteil in der s�aurel�oslichen Proteinfraktion als Ma� f�ur den Proteinab-

72

4.2 Analyse der niedermolekularen Proteinfraktion von Rohmilch

bau heranzogen [107]. Parallel kann die Caseinhydrolyse mittels gelelektrophoretischer

Methoden verfolgt werden [108]. Jedoch sind diese Techniken nur wenig emp�ndlich.

Ein weiterer Ansatz zur Analyse von Milchpeptiden war die Hochleistungs �ussigchro-

matographie, die die Bildung neuer Peptide w�ahrend der Erhitzung von Milch aufzeigte

[109]. Weitere Informationen �uber die gebildeten Peptide waren hingegen mangels struk-

turaufkl�arender Methoden nicht m�oglich. Hier haben massenspektrometrische Techni-

ken einen klaren Vorteil, da sie die strukturelle Charakterisierung der Peptidfraktion

erlauben. Auf diesem Forschungsgebiet wurden solche Methoden bislang aber kaum ein-

gesetzt. Es �ndet sich z. B. Literatur �uber die massenspektrometrische Untersuchung

von K�ase [110, 111] oder von Milch im Involutionsstadium (Absetzen des Milchentzu-

ges) [112], wohingegen weitere Studien zur Analyse von Laktationsmilch fehlen.

Daher war die Zielsetzung des vorliegenden Projekts, strukturelle Eigenschaften

der niedermolekularen Proteinfraktion der Milch zu untersuchen. Hierf�ur wurde zum

Aufreinigen der Milch die immobilisierte Metalla�nit�atschromatographie mit Kupfer

(Imac-Cu) angewandt, bevor sie mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen wurde. Mit dieser

Methode sollte ein Einblick in das Peptidpro�l der Milch gewonnen werden. Zus�atzlich

sollten die Ver�anderungen w�ahrend der industriellen Hitzebehandlung von Milch sowie

w�ahrend der Lagerung erfasst werden. Eine Studie mit Handelsproben sollte abschlie-

�end kl�aren, ob die in den Erhitzungs- und Lagerversuchen beobachteten Ver�anderun-

gen auch in handels�ublichen Milchprodukten eine Rolle spielen.

4.2 Massenspektrometrische Analyse der niedermole-

kularen Proteinfraktion von Rohmilch

Zur Aufreinigung der Milchpeptide wurde ein kommerziell erh�altlicher Kit verwendet,

dessen Prinzip auf der A�nit�at von Proteinen zu Kupferionen beruht. Zur detaillierten

Beschreibung des Kits sowie der schematischen Darstellung des Methodenprinzips siehe

Kapitel 3.2.2. Bei Verwendung entsprechender Matrices wie Sinapins�aure oder Dihy-

droxyacetophenon ist es m�oglich, die aufgereinigten h�ohermolekularen Proteine mittels

Maldi-Tof-Ms zu vermessen (s. Abb. 4.1). In diesem Projekt wurde der Fokus jedoch

durch den Einsatz von �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure als Matrix auf die niedermoleku-

lare Proteinfraktion (< 6000 Da) gerichtet, wobei die Ionisierung h�ohermolekularer

Proteine supprimiert wird.

73


α-La

ctal

bum

in

7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500 25000 m/z

rel.

Int.

A

B

β-Lactoglobulin

κ-Casein

γ-C

asei

ne

C

09JasmingrossSinapin\0_K11\1\1SLin

09JasmingrossDHAP\0_L5\1\1SLin

09JasmingrossCCA\0_J16\1\1SLin

Abb. 4.1: Maldi-Tof-Ms-Spektren der h�ohermolekularen Proteinfraktion von Milch nachder Aufreinigung mittels Metalla�nit�atschromatographie. A: Messung in Sinapins�aure. B:Messung in Cyanohydroxyzimts�aure. C: Messung in Dihydroxyacetophenon. Bei den nichtbenannten Signalen handelt es sich um mehrfach geladene Ionen oder um nicht identi�zierteProteine.

Abb. 4.2 zeigt das Spektrum von Milch vor und nach der Aufreinigung mit dem

Imac-Cu-Kit im Bereich von 1000-6000 Da. Das Spektrum weist �ubersichtlich ange-

ordnete Signale, haupts�achlich im Bereich von ca. 1900 bis 4500 Da, auf (vgl. Tab. 4.1

auf S. 84). Nach der Aufreinigung wurde eine Ab- oder Anreicherung einiger Signale be-

obachtet, o�ensichtlich aufgrund schw�acher bzw. st�arker ausgepr�agter A�nit�at der ent-

sprechenden Peptide zu Kupfer. Zus�atzlich wird deutlich, dass durch die Aufreinigung

das Signal-Rausch-Verh�altnis bedeutend verbessert wurde. Die Metalla�nit�atschroma-

tographie stellt somit ein e�zientes Mittel f�ur die Maldi-Tof-Ms-Analyse von Milch

dar. Es ist jedoch zu ber�ucksichtigen, dass durch die Aufreinigung auch ein gewisser In-

formationsverlust bedingt ist, da Peptide ohne A�nit�at zu Kupfer nicht erfasst werden.

Soll die Analyse auf diese Peptide ausgeweitet werden, so ist auf andere, z. B. auf hy-

drophobe oder kationische Wechselwirkungen beruhende Techniken mit magnetischen

Partikeln, die ebenfalls im Handel erh�altlich sind, zur�uckzugreifen.

MittelsMaldi-Tof/Tof-Ms wurde von Dr. Alexander Schmidt von der Eidgen�ossi-

schen Technischen Hochschule in Z�urich das Signal bei m/z 3984 als die Aminos�aure-

sequenz RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGK bzw. das bei m/z 4340

74

4.3 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Erhitzung

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z

rel.

Int.

A

B

*

**

Abb. 4.2: Maldi-Tof-Ms-Spektren der niedermolekularen Proteinfraktion von Rohmilchvor (A) und nach (B) der Aufreinigung mittels Metalla�nit�atschromatographie. Das mit* gekennzeichnete Signal wurde mittels Maldi-Tof/Tof-Ms dem Fragment AS 1-34 von�s1-Casein zugeordnet, das mit ** gekennzeichnete Signal dem Fragment AS 1-37 von�s1-Casein.

als RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKV identi�ziert. Es handelt

sich dabei um zwei Fragmente von �s1-Casein (AS 1-34 bzw. 1-37), die vermutlich durch

hydrolytische Aktivit�at von milcheigenen Proteinasen gebildet wurden. Weitere mas-

senspektrometrische Analysen zur Identi�zierung anderer Peptide sind erstrebenswert.

4.3 Analyse der Ver�anderungen in der niedermoleku-

laren Proteinfraktion w�ahrend der Erhitzung

4.3.1 Analyse von erhitzter Rohmilch

Wie in der Einleitung dieser Arbeit aufgezeigt wurde, wird Milch in der Regel ver-

schiedenen Hitzebehandlungen unterzogen, bevor sie den Verbraucher erreicht. Um

Ver�anderungen im Peptidpro�l w�ahrend dieser thermischen Belastung zu untersuchen,

wurde als n�achstes Rohmilch bei 72 °C, 85 °C und 120 °C bis zu 30 min erhitzt. Diese

Temperaturen wurden als Modell f�ur typische industrielle Behandlungen (Pasteurisie-

rung, Hocherhitzung, Sterilisierung) gew�ahlt. Die erhitzte Milch wurde mit Hilfe der

Metalla�nit�atschromatographie aufgereinigt und mittels Maldi-Tof-Ms vermessen.

In Abb. 4.3 werden die Spektren der bei 120 °C erhitzten Milch dargestellt. W�ahrend

der Inkubation wurden f�unf neu entstehende Peptide bei 1974,4, 2218,7, 3730,1, 4297,8

75


1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500m/z

rel.

Int.

Rohmilch

10 min 120 °C

20 min 120 °C

30 min 120 °C

Abb. 4.3: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Rohmilch. Entfettete Rohmilchwurde in Dreifachbestimmung 10, 20 und 30 min bei 120 °C erhitzt. Nach Aufreinigungmit einem Imac-Cu-Kit wurde die niedermolekulare Proteinfraktion direkt mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen. Signi�kante Ver�anderungen sind hervorgehoben.

bzw. 4436,8 Da detektiert. Die gleichen Beobachtungen wurden in geringerem Ausma�

in den Spektren der bei 72 °C bzw. 85 °C erhitzten Milch gemacht (Daten nicht gezeigt).

Es ist folglich ersichtlich, dass die Bildung der Peptide sowohl von der Erhitzungsdauer

als auch von der -temperatur abh�angt.

F�ur eine quantitative Bewertung wurden die neu entstehenden Signale relativ quanti-

�ziert. Als Bezugssignal diente das Peptid 3984, dessen Gehalt als konstant angesehen

wurde. Diese Hypothese wurde von der Tatsache gest�utzt, dass sich das Verh�altnis

seiner Intensit�at zu der aller anderen Signale des Spektrums { ausgenommen die f�unf

neu entstehenden Peptide { w�ahrend der Erhitzung nicht signi�kant �anderte. Jedoch

sind leichte Ver�anderungen in der Intensit�at, die innerhalb der Messungenauigkeit der

Methode liegen, nicht ausgeschlossen. In Abb. 4.4 werden die Ergebnisse der relativen

Quanti�zierung dargestellt.

Um die Herkunft der neu entstehenden Peptide zu kl�aren, wurde im Folgenden die

Milch vor der thermischen Behandlung in die Casein- und die Molkenfraktion aufge-

trennt. Die bei pH 4,6 gef�allten Caseine wurden in einem milch�ahnlichen Pu�er resus-

pendiert und ebenso wie die Molkenproteinl�osung bei 120 °C bis zu 30 min erhitzt.

76

4.3 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Erhitzung

D

C

A

0

3

6

9

12

15

0 min 10 min 20 min 30 min

Erhitzungsdauer

rel.

Int.

in %

0

5

10

15

20

25


Erhitzungsdauerre

l. In

t. in

%

0

3

6

9

12

15


Erhitzungsdauer

rel.

Int.

in %

0

8

16

24

32

40


Erhitzungsdauer

rel.

Int.

in %

**

*

27

9

10

0

10

20

30

40

50


Erhitzungsdauer

rel.

Int.

in %

*17

1

5

0

**38

1

9

0

**

**

4

10

0 1

**

B

E

12

3

10

*

Abb. 4.4: Relative Quanti�zierung der w�ahrend der Erhitzung von Rohmilch bei 120 °C neuentstehenden Peptide. Als Bezugspeptid diente Signal 3984. Dargestellt sind die Mittelwer-te einer unabh�angigen Dreifachbestimmung±Standardabweichung. A: Peptid 1974,4. B:Peptid 2218,7. C: Peptid 3730,1. D: Peptid 4297,8. E: Peptid 4436,8. * p < 0.05; ** p < 0.01

77


4.3.2 Analyse von erhitzter Molke

Wie Abb. 4.5 zeigt, wies die Molkenfraktion deutlich weniger Signale als die komplette

Rohmilch auf. Im Laufe der Erhitzung bei 120 °C waren jedoch keine signi�kanten

Unterschiede in den Spektren erkennbar. Leichte Ver�anderungen, die auftraten, waren

nicht signi�kant und waren vermutlich auf verbliebende Reste von Caseinproteinen

zur�uckzuf�uhren.

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z

rel.

Int.

Molke

30 min 120 °C

Abb. 4.5: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Molke. Entfettete Rohmilchwurde bei pH 4,6 in die Casein- und die Molkenfraktion aufgetrennt. Die Molkenprote-inl�osung wurde in Dreifachbestimmung 10, 20 und 30 min bei 120 °C erhitzt. Nach Aufrei-nigung mit einem Imac-Cu-Kit wurde die niedermolekulare Proteinfraktion direkt mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen. Relevante Massenbereiche sind hervorgehoben.

4.3.3 Analyse der erhitzten Caseinfraktion

Im Gegensatz dazu zeigen die erhitzten Caseinsuspensionen genau die Ver�anderungen,

die auch im Spektrum der inkubierten Rohmilch zu beobachten gewesen waren (s.

Abb. 4.6). Es konnte somit nachgewiesen werden, dass die w�ahrend der thermischen

Behandlung von Rohmilch neu entstandenen Peptide aus der Caseinfraktion stammten.

4.4 Analyse der Ver�anderungen in der

niedermolekularen Proteinfraktion w�ahrend der

Lagerung von Milch

Im n�achsten Schritt sollten Ver�anderungen w�ahrend der Lagerung von Milch untersucht

werden. Daf�ur wurde von einem regionalen Milchproduzenten w�armebehandelte Milch

78

4.4 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Lagerung

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z

rel.

Int.

Caseine

10 min 120 °C

20 min 120 °C

30 min 120 °C

Abb. 4.6: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 120 °C erhitzten Caseine. Entfettete Rohmilchwurde bei pH 4,6 in die Casein- und die Molkenfraktion aufgetrennt. Die Caseinsuspensionwurde in Dreifachbestimmung 10, 20 und 30 min bei 120 °C erhitzt. Nach Aufreinigungmit einem Imac-Cu-Kit wurde die niedermolekulare Proteinfraktion direkt mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen. Massenbereiche, in denen in der erhitzten Rohmilch Ver�anderungendetektiert worden waren, sind hervorgehoben.

direkt am Tag der Produktion zur Verf�ugung gestellt. Analysiert wurden zwei Typen

von Milch: zum einen hocherhitzte Milch (sogenannte Esl-Milch, engl."extended shelf

life\ = verl�angerte Haltbarkeit), die im K�uhlschrank gelagert bis zu drei Wochen frisch

bleibt; zum anderen ultrahocherhitzte Milch (Uht-Milch), die bei Raumtemperatur je

nach Herstellungsverfahren in der Regel drei bis sechs Monate haltbar ist.

4.4.1 Lagerversuche mit ESL-Milch bei K�uhlschranktemperatur

Die Lagerung der hocherhitzten Milch bei 4 °C erfolgte bis zum Ende des Mindest-

haltbarkeitsdatums. In regelm�a�igen Abst�anden wurden neue Packungen ge�o�net, die

Milch wurde entfettet und bis zur weiteren Analyse bei -20 °C aufbewahrt. In den ent-

sprechenden Spektren konnten �uber die gesamte Lagerzeit keine signi�kanten Ver�ande-

rungen festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).

79


1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500m/z

rel.

Int.

1 d RT

3 w RT

6 w RT

9 w RT

Abb. 4.7: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei Raumtemperatur gelagerten Uht-Milch. DieLagerung erfolgte in einer Dreifachbestimmung. Nach Aufreinigung mit einem Imac-Cu-Kit wurde die niedermolekulare Proteinfraktion direkt mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen.RT: Raumtemperatur. d: Tag. w: Woche.

4.4.2 Lagerversuche mit UHT-Milch bei Raumtemperatur

Die ultrahocherhitzte Milch wurde ebenfalls bis zum Ablauf der vom Hersteller angege-

benen Haltbarkeit bei Raumtemperatur gelagert. Im Gegensatz zur Esl-Milch wurde

in den dazugeh�origen Spektren ein deutlicher Unterschied beobachtet: Bereits nach

kurzer Lagerzeit stieg die Intensit�at des Peptids mit der Masse von 4340 Da signi�kant

an (siehe Abb. 4.7). W�ahrend es in der frisch produzierten Milch einen relativen Anteil

von ca. 18 % (in Bezug auf die Intensit�at des Peptids 3984) ausmachte, erreichte es bis

zum Ende des Versuches ca. 85 % (siehe Abb. 4.8). Bei dem Peptid handelte es sich um

den N-Terminus des �s1-Caseins (AS 1-37), wie bereits in Kapitel 4.2 erl�autert wurde.

4.4.3 Lagerversuche mit Sterilmilch bei Raumtemperatur

Die Vermutung lag nahe, dass die beobachtete Zunahme des Peptids 4340 auf eine

enzymatische Reaktion zur�uckzuf�uhren war. Um dies zu best�atigen, wurden die La-

gerversuche mit einer Sterilmilch wiederholt. Hierbei wurde davon ausgegangen, dass

80

4.4 Analyse der Ver�anderungen der Peptidfraktion w�ahrend der Lagerung

0

20

40

60

80

100

1 d 3 w 6 w 9 w

Lagerungsdauer

rel.

Int.

in %

**85

**62

**40

18

Abb. 4.8: Relative Quanti�zierung des Peptids 4340, dessen Gehalt bei der Lagerung vonUht-Milch bei Raumtemperatur anstieg. Als Bezugspeptid diente Signal 3984. Darge-stellt sind die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung±Standardabweichung.** p < 0.01. d: Tag. w: Woche.

s�amtliche enzymatische Aktivit�at durch die drastischen Bedingungen beim Sterilisati-

onsprozess unterbunden wurde. Abbildung 4.9 zeigt, dass eine entsprechende Zunahme

in Sterilmilch nicht zu verzeichnen war. Es wird daher angenommen, dass die Ursache

f�ur den Konzentrationsanstieg des Peptids eine Protease war.

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z

rel.

Int.

Sterilmilch

Sterilmilch9 w RT

Abb. 4.9: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei Raumtemperatur gelagerten Sterilmilch. DieLagerung erfolgte in einer Dreifachbestimmung. Nach Aufreinigung mit einem Imac-Cu-Kit wurde die niedermolekulare Proteinfraktion direkt mittelsMaldi-Tof-Ms vermessen.Das relevante Peptid ist hervorgehoben. w: Woche. RT: Raumtemperatur.

81


4.5 Untersuchung von Handelsproben

Abschlie�end sollte untersucht werden, ob die Beobachtungen der Erhitzungs- und La-

gerungsexperimente auch f�ur Proben des Handels relevant sind. Dar�uber hinaus sollten

Unterschiede im Peptidpro�l zwischen den Produkten identi�ziert werden. Daf�ur wur-

den 12 pasteurisierte, 6 hocherhitzte und 16 ultrahocherhitze Milchproben auf dieselbe

Weise aufgereinigt und mittels Maldi-Tof-Ms analysiert. In Abb. 4.10 sind beispiel-

haft die Spektren von sieben Handelsproben dargestellt. In keiner der pasteurisierten

Milchproben konnten die Peptide detektiert werden, die auch bei der Erhitzung von

Rohmilch aufgetreten waren. Im Gegensatz dazu zeigte immerhin eine hocherhitzte

Probe die hitzebedingten Signale. Die ultrahocherhitzten Produkte best�atigten den

Ein uss der Hitzebehandlung auf die Bildung der f�unf Peptide: In allen analysierten

Produkten konnten diese in unterschiedlicher Intensit�at nachgewiesen werden. Zus�atz-

lich zu diesen Beobachtungen konnte festgestellt werden, dass die Produkte weitere,

nicht hitzeabh�angige Unterschiede in der Intensit�at einiger Signale zeigten (siehe mit

Pfeilen markierte Peptide in Abb. 4.10).

4.6 Diskussion

Maldi-Tof-Ms wurde bereits erfolgreich zur Analyse des Proteinpro�ls von Milch

[113, 114] oder von Milchprodukten [115{118] eingesetzt. Der Schwerpunkt dieser Stu-

dien lag jedoch auf der Proteinfraktion, w�ahrend der niedermolekulare Eiwei�anteil ver-

nachl�assigt wurde. Hingegen wurde Maldi-Tof-Ms f�ur die Peptidanalyse von K�ase

nach Extraktion mit Ethanol (Peptidmuster im Laufe des Reifeprozesses) [110] oder

von Milch im Involutionsstadium (Zusammensetzung der Proteine bei Absetzen des

Milchentzuges) [112] vorgeschlagen. F�ur Milch im Laktationsstadium ist allerdings kei-

ne �ahnliche Arbeit bekannt. Daher sollte in diesem Projekt die bislang wenig erforschte

niedermolekulare Proteinfraktion analysiert werden.

Entfettete Rohmilch wurde mit Hilfe der Metalla�nit�atschromatographie aufgerei-

nigt und im Folgenden mittelsMaldi-Tof-Ms analysiert. Diese Aufreinigungsmetho-

de kann auch dazu eingesetzt werden, die Proteine der Milch und z. B. ihre Ver�anderun-

gen w�ahrend der thermischen Behandlung zu untersuchen, jedoch konzentrierte sich die

vorliegende Studie auf Peptide mit einemMolekulargewicht zwischen 1000 und 6000 Da.

Der Vergleich der Spektren mit denen der nicht aufgereinigten Milch zeigte neben der

82

4.6 Diskussion

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500m/z

rel.

Int.

past. Milch 1

past. Milch 2

ESL-Milch

UHT-Milch 1

UHT-Milch 2

UHT-Milch 3

UHT-Milch 4

Abb. 4.10: Maldi-Tof-Ms-Spektren einiger Handelsproben. Nach Entfetten und Aufrei-nigung mit einem Imac-Cu-Kit in einer Doppelbestimmung wurde die niedermolekulareProteinfraktion direkt mittels Maldi-Tof-Ms vermessen.

Ab- bzw. Anreicherung einiger Peptide vor allem eine deutliche Verbesserung des

Signal-Rausch-Verh�altnisses. Dies beweist das Potential der Metalla�nit�atschromato-

graphie zur Aufreinigung von Milch f�ur die massenspektrometrische Vermessung.

Das dominierende Signal bei 3984 Da wurde mittels Maldi-Tof/Tof-Ms als die

Aminos�auresequenz RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGK identi�ziert,

einem Fragment von �-s1-Casein (AS 1-34). Milch enth�alt eine Vielzahl an proteoly-

tisch aktiven Enzymen wie z. B. Plasmin, die bereits im Euter zur Hydrolyse der

Milchproteine f�uhren [119]. Die dominierenden Proteolyseprodukte sind die -Caseine

83


Tab.4.1:WichtigstedetektiertePeptideinden

analysiertenMilchproben

nachAufreinigungmittelsMetalla�nit�atschro-

matographie.Aufgef�uhrteMassen

wurden

imlinearenModusgemessen.Die

Massengenauigkeitliegtbei

150ppm.

Neu

gebildetePeptidesinddurchxxgekennzeichnet,ansteigendePeptidedurchxxx.

Peptid

Rohmilch

Erhitzte

Rohe

Erhitzte

Rohes

Erhitztes

Gelagerte

Gelagerte

Gelagerte

Rohmilch

Molke

Molke

Casein

Casein

Esl-M

ilch

Uht-M

ilch

Sterilmilch

1974,4

xx

xx

xx

1993,2

xx

xx

xx

x

2218,7

xx

xx

xx

2235,8

xx

xx

xx

x

2462,0

xx

xx

xx

x

2618,2

xx

xx

xx

x

2765,4

xx

xx

xx

xx

x

2912,4

xx

xx

xx

xx

x

3730,1

xx

xx

xx

3856,2

xx

xx

xx

x

3984,2

xx

xx

xx

x

4241,3

xx

xx

xx

x

4297,8

xx

xx

4340,4

xx

xx

xxxx

x

4436,8

xx

xx

xx

84

4.6 Diskussion

sowie die Proteoso Peptone, die aus �-Casein durch Plasminaktivit�at resultieren [8,

120]. Zus�atzlich wurde auch von der Anf�alligkeit von �-s1-Casein f�ur die Hydroly-

se durch Plasmin berichtet [121] und die Aminos�auren 34/35 wurden im Modellsys-

tem als eine der bevorzugten Schnittstellen von Plasmin im �-s1-Casein identi�ziert

[122, 123]. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das detektierte Peptid bereits

vor dem Melkprozess im Euter durch die Einwirkung von Plasmin entstanden war. Des

Weiteren wurde das Peptid bei 4340 Da der Aminos�auresequenz RPKHPIKHQGL-

PQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKV (�-s1-Casein AS 1-37) zugeordnet. Auch hier

wird ein Entstehen durch enzymatische Aktivit�at vermutet. Da allerdings Plasmin C-

terminal zu Lyinresten schneidet [124], kann es in diesem Fall an der Schnittstelle AS

37/38 (Valin/Asparagin) als aktives Enzym ausgeschlossen werden, und eine andere

Milchproteinase muss die Ursache sein. Weitere, in dieser Studie nicht identi�zierte

Peptide der Rohmilch sind hoch interessante Ziele f�ur weitere massenspektrometrische

Analysen zur Strukturaufkl�arung.

Milch wird in der Regel, bevor sie in den Handel kommt, zur Sicherstellung der mikro-

biellen Stabilit�at erhitzt. Dabei ablaufende Reaktionen in der Peptidfraktion sind bis-

lang weitgehend unbekannt. Zur Aufkl�arung der Strukturver�anderungen wurde entfet-

tete Rohmilch bei drei Temperaturen erhitzt, die typischerweise auch so in der Milchin-

dustrie angewendet werden: 72 °C (Pasteurisierung), 85 °C (Hocherhitzung) und 120 °C

(Sterilisation). Im Laufe der Erhitzung wurde bei allen drei Temperaturen das Entste-

hen von f�unf neuen Peptiden beobachtet. Deren Anstieg war deutlich abh�angig von

der Erhitzungsdauer und -temperatur. Mit Hilfe der relativen Quanti�zierung wurde

eine quantitative Bewertung der Peptidbildung m�oglich, indem die Intensit�at der neu

gebildeten Peptide auf die Intensit�at des konstanten Hauptsignals 3984 bezogen wurde.

Durch separates Erhitzen der Casein- und der Molkenfraktion konnte gezeigt werden,

dass die neu entstehenden Peptide aus der Caseinfraktion stammen, was sehr gut mit

den Ergebnissen von anderen Arbeiten �ubereinstimmt. In Studien mit isoliertem �-, �-

bzw. �-Casein wurde beim Erhitzen ein Anstieg des Nicht-Protein-Sticksto�s nachge-

wiesen [107]. �Ahnliche Ergebnisse wurden von Hindle und Wheelock erhalten, die die

Freisetzung von Peptiden aus �-Casein w�ahrend der Erhitzung von Kuhmilch beob-

achteten [125]. Ein detallierteres Experiment wurde von Morales et al. durchgef�uhrt,

die mittels Hochleistungs �ussigchromatographie zeigen konnten, dass bei der thermi-

schen Behandlung von Milch zwei neue Peptide entstanden [109]. Da diese Peptide

auch in milchsimulierenden Systemen detektiert wurden, die keine Molken-, sondern

85


nur Caseinproteine und Lactose enthielten, wurde ihr Ursprung auf die Caseinfraktion

zur�uckgef�uhrt. Da jedoch keine strukturaufkl�arenden Methoden angewandt wurden,

waren keine weiteren Informationen �uber die gebildeten Verbindungen m�oglich.

Ein Proteinabbau kann in erster Linie �uber zwei Wege erfolgen: Einerseits �uber Hy-

drolyse der Peptidbindungen, z. B. enymatisch oder s�aurekatalysiert, andererseits �uber

radikalische Fragmentierung des Proteinr�uckgrats. Eine enzymatische Hydrolyse der

Peptidbindung wird ausgeschlossen, weil diese zu einem anderen Peptidpro�l f�uhrt, wie

die Lagerversuche gezeigt haben (siehe unten). Auch eine s�aurekatalysierte Proteolyse

erscheint unter den gegebenen Bedingungen weniger wahrscheinlich. Dabei w�are keine

Selektivit�at zu erwarten, w�ahrend jedoch in den hier durchgef�uhrten Versuche die o�en-

sichtlich spezi�sche Bildung von einzelnen Peptiden beobachtet wurde. Im Gegensatz

dazu ist bekannt, dass Radikale, wie sie beispielsweise w�ahrend der Maillard-Reaktion

entstehen (siehe Kapitel 1.2.2), zu einem selektiven Angri� am Proteinr�uckgrat f�uhren

k�onnen. Abb. 4.11 zeigt die grundlegenden Reaktionen auf, die dabei ablaufen.

Im ersten Schritt wird bei der radikalischen Proteinfragmentierung durch ein Ra-

dikal ein Wassersto�atom am �-C-Atom, an dem die Seitenkette h�angt, abstrahiert

(Gleichung 1). Das entstehende Proteinradikal kann nun mit einem weiteren Radikal

reagieren, eine Reaktion, die jedoch aufgrund der im Allgemeinen geringen Radikalkon-

zentration relativ begrenzt ist. Wahrscheinlicher ist die Bildung eines Peroxidradikals

durch die Anlagerung von Sauersto� (Gleichung 2). Durch Freisetzung von HO2. und

Hydrolyse des entstehenden Imins kommt es letztlich zur Spaltung des Proteinr�uckgrats

(Gleichung 3). Eine andere M�oglichkeit ist, dass von einer anwesenden Verbindung ein

Wassersto�atom an das Peroxidradikal angelagert wird. �Uber ein Alkoxyradikal wird

dann ebenfalls das Proteinr�uckgrat fragmentiert, wobei wohlbemerkt andere Spaltpro-

dukte als bei der Iminhydrolyse entstehen (Gleichung 4). Alternativ zu der anfangs

erw�ahnten direkten Radikalbildung am �-C-Atom kann der radikalische Angri� auch

zun�achst an einer Seitenkette erfolgen, woraufhin das Radikal im Protein an die �-

Position weitergeleitet wird. Eine anf�angliche Seitenkettenoxidation kann somit eben-

falls zur Proteinfragmentierung f�uhren [78]. Die beschriebene oxidative Proteindegra-

dierung weist einen au��allig selektiven Charakter auf. Die Gr�unde hierf�ur sind bislang

nicht eindeutig gekl�art. Es wird vermutet, dass die Selektivit�at durch die Zug�anglich-

keit der attackierten Stellen im Protein, die Stabilit�at der gebildeteten Radikale und

das Vorkommen von Transferreaktionen der Radikale innerhalb eines Molek�uls bedingt

ist. Zus�atzlich k�onnen Metallbindungsstellen im Protein, die die an der Oxidation be-

teiligten Metallionen zur Verf�ugung stellen, eine Rolle spielen [24].

86

4.6 Diskussion

N N

R

RO

O

H H

H

N N

R

RO

O

H

HRadikal

(1) .

N N

R

RO

O

H

H

N

R

RO

O

H

H

N

OO

O2

. .(2)

N

R

RO

O

H

H

N

OO

N

R

RO

O

H

N NH2

R

O

N

R

OO

H

-HO2 +H2O

N

R

RO

O

H

H

N

OO

N

R

RO

O

H

H

N

OOH

N

R

RO

O

H

H

N

O

R

RO

H

N ON

O

H

RH Reduktion

+

+

.

. .

.

.(3)

(4)

Abb. 4.11: Reaktionsmechanismen zum radikalischen Angri� des Proteinr�uckgrats w�ahrendder Proteinoxidation (nach [78]).

Der Ein uss der Lagerung auf die niedermolekulare Proteinfraktion der Milch war

Ziel des n�achsten Experiments, in dem hocherhitzte bzw. ultrahocherhitzte Milch bei

K�uhlschrank- bzw. Raumtemperatur gelagert wurde. Die Lagerung der Esl-Milch bei

4 °C bis zum Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums f�uhrte zu keiner signi�kanten

Ver�anderung des Peptidspektrums. Es ist anzunehmen, dass die proteolytische Ak-

tivit�at, die zur Bildung neuer oder zum Anstieg bereits vorhandener Peptide f�uhren

k�onnte, bei einer so niedrigen Temperatur unterdr�uckt wurde. Diese Hypothese wird

von einer Studie gest�utzt, die von geringerer Bedeutung der Hydrolyse durch Plas-

min bei K�uhlschranktemperatur berichtet [126]. Verbleibende Proteinaseaktivit�at be-

ein usste o�ensichtlich die hier untersuchten Peptide nicht. Im Gegensatz dazu konnte

bei der gelagerten Uht-Milch eine signi�kante (p < 0,01) Zunahme des Peptids 4340

87


gemessen werden. Bei diesem handelte es sich, wie bereits erw�ahnt, um ein Fragment

des �s1-Caseins (AS 1-37). Eine messbare enzymatische Restaktivit�at in Uht-Milch

trotz partieller Denaturierung w�ahrend der industriellen thermischen Behandlung ist

bekannt [104]. Es wurde beschrieben, dass Plasmin au��allig hitzestabil in Milch ist

[127]; so wurde beispielsweise von Alichanidis et al. nach Ultrahocherhitzung eine ver-

bleibende Plasminaktivit�at von 30-40 % ermittelt [128]. Jedoch ist Plasmin nur f�ur seine

Hydrolyse C-terminal zu Lysinresten bekannt, so dass sich die beobachtete Hydrolyse

an AS 37/38 (Valin/Asparagin) wahrscheinlich nicht durch Plasminaktivit�at erkl�aren

l�asst. Deshalb wird angenommen, dass die Zunahme des Peptids 4340 durch den Ein-

uss einer weiteren hitzestabilen Milchproteinase bedingt ist. Auf das Vorhandensein

weiterer Proteinasen wurde geschlossen, da das Proteinmuster von Milch nach Plasmin-

einwirkung Unterschiede im Vergleich zu dem nach Lagerung von Milch aufwies [108];

mittlerweile sind etwa 60 Enzyme in der Milch identi�ziert [2]. Da das ansteigende Pep-

tid bereits in der Rohmilch detektiert wurde, wird vermutet, dass sein Entstehen wohl

eher durch milcheigene Proteinasen verursacht wurde als durch bakterielle Enzyme, die

von au�en in die Milch eingetragen wurden.

Um die enzymatische Ursache f�ur den Peptidanstieg zu belegen, wurden analoge La-

gerversuche mit im Handel erh�altlicher Sterilmilch durchgef�uhrt. Dabei wurde davon

ausgegangen, dass durch die drastischen Bedingungen bei der Herstellung von Steril-

milch keine enzymatische Restaktivit�at verblieben war. Tats�achlich konnte in diesem

Experiment w�ahrend einer Lagerung von bis zu 13 Wochen kein Anstieg des Peptids

4340 beobachtet werden, was die Hypothese einer enzymatischen Proteolyse best�atigt.

Bei der Analyse von mehreren k�au ich erh�altlichen Milchproben konnte gezeigt wer-

den, dass die Ver�anderungen, die beim Erhitzen von Rohmilch beobachtet worden

waren, auch in Produkten des Handels von Bedeutung sind. In keiner der 12 analy-

sierten pasteurisierten Proben konnten die hitzeinduzierten Ver�anderungen beobachtet

werden. Dies l�asst sich wohl damit erkl�aren, dass die Hitzebelastung bei der Pasteu-

risierung nicht ausreichte, um eine messbare �Anderung im Peptidpro�l zu verursa-

chen. Hingegen zeigte eine von sechs hocherhitzten Proben dieselben Ver�anderungen

wie die erhitzte Rohmilch, entsprechend der h�oheren Temperaturen, die w�ahrend der

industriellen W�armebehandlung zum Zuge kamen. Die ultrahocherhitzten Milchproben

best�atigten den Ein uss der thermischen Belastung auf die Bildung der f�unf Peptide: In

jeder der 16 untersuchten Proben konnten die hitzeinduzierten Peptide in variierender

Intensit�at detektiert werden. Unterschiede in der relativen Intensit�at unter den Proben

88

4.6 Diskussion

lassen sich vermutlich mit unterschiedlichen Erhitzungstechnologien (direkte/indirekte

Erhitzung, andere Erhitzungsdauern und -temperaturen) erkl�aren. Zudem zeichneten

sich weitere Unterschiede in den Signalintensit�aten anderer Peptide ab, die w�ahrend

der Erhitzung von Rohmilch keine Ver�anderungen gezeigt hatten. Es ist anzunehmen,

dass diese Fluktuationen z. B. auf unterschiedliche Rinderrassen oder Laktationsstadien

zur�uckzuf�uhren sind, Faktoren, die f�ur ihren Ein uss auf die Proteinzusammensetzung

bekannt sind [103].

Diese Versuche haben gezeigt, dass die Metalla�nit�atschromatographie ein �au�erst

hilfreiches Mittel zur massenspektrometrischen Analyse der niedermolekularen Prote-

infraktion der Milch darstellt. Weitere Untersuchungen sind w�unschenswert, um die-

se bislang unzureichend erforschte Proteingruppe aufzukl�aren. Die klare Abh�angigkeit

der bei thermischer Behandlung neu entstehenden Peptide von Erhitzungsdauer und

-temperatur weist auf die M�oglichkeit hin, diese Peptide als neue, schnelle und einfache

Hitzeindikatoren f�ur Milch einzuf�uhren. Zuvor ist daf�ur jedoch noch eine Validierung

der Methode gefragt. Zudem ist mittels dieser Analytik eine Bewertung der proteoly-

tischen Aktivit�at im Euter oder w�ahrend der Lagerung m�oglich. Dies k�onnte in der

Produktion von K�ase oder anderen Milchprodukten von Interesse sein, um geeignete

technologische Eigenschaften der Milch zu gew�ahrleisten. Dar�uber hinaus ist auch ein

Einsatz in der Prozesskontrolle, z. B. bei der K�asereifung oder der Joghurtfermentation,

denkbar.

89

5 Vergleich verschiedener Erhitzungsindikatoren von Milch

5 Vergleich einer massenspektrometri-

schen Methode zur Untersuchung

der Hitzebehandlung von Milch mit

klassischen Indikatoren

5.1 Einleitung

Zum Abschluss der vorliegenden Arbeit sollte die Eignung der Massenspektrometrie

als Methode zur Beurteilung der thermischen Belastung von Milch bewertet werden.

Der bisherige Einsatz von massenspektrometrischen Techniken in der Milchanalytik

konzentrierte sich auf Strukturaufkl�arung, w�ahrend quantitative Aspekte meist in den

Hintergrund r�uckten. Nur Fenaille et al. haben bisher einen Modellversuch vorgestellt,

in der die Anzahl der an �-Lactoglobulin gebundenen Zuckermolek�ule mittels Esi-Ms

bestimmt und deren Korrelation mit klassischen Indikatoren untersucht wurde [129].

Zur quantitativen Bewertung der Hitzebehandlung von Milch fanden im Allgemeinen

klassische Methoden wie z. B. Kolorimetrie [130], Elektrophorese [131, 132], Fluorime-

trie [133] oder Chromatographie [134, 135] Verwendung.

Als neuer Indikator f�ur die W�armeeinwirkung auf Milch sollte der relative Anteil

des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin mittels Maldi-Tof-Ms bestimmt werden.

Als Vergleich wurden die Proteindenaturierung (quanti�ziert �uber den Gehalt an bei

pH 4,6 l�oslichem Gesamtprotein, �-Lactalbumin bzw. �-Lactoglobulin) und die Bil-

dung uoreszierender Produkte (erfasst �uber den Fast-Index) herangezogen. Daf�ur

wurde eine entfettete pasteurisierte Milch bei 70 °C, 80 °C und 100 °C erhitzt, um

anschlie�end die oben aufgef�uhrten Hitzeparameter zu vermessen. Um einen eventuell

90

5.2 Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Protein nach Lowry

gegebenen Zusammenhang beurteilen zu k�onnen, wurden die Korrelationskoe�zienten

berechnet. Es wird ausdr�ucklich darauf hingewiesen, dass die Inkubationsbedingungen

nicht denen in der Industrie entsprachen. W�ahrend dort die Milch aufgrund entspre-

chender Technologien innerhalb von Sekunden auf die gew�unschte Temperatur erhitzt

wird, dauerte es in dem hier durchgef�uhrten Erhitzungsexperiment bedeutend l�anger,

bis die Proben die Temperatur des Trockenschranks erreicht hatten. Die tats�achliche

thermische Belastung der Milch war damit wesentlich geringer als die Erhitzungsdauer

aussagt.

5.2 Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem

Protein nach Lowry

Wie in Kapitel 1.2.2 erl�autert, kommt es bei der thermischen Behandlung von Milch

zur Denaturierung hitzelabiler Proteine, wobei es sich vor allem um die Proteine der

Molkenfraktion handelt. Bei diesem Prozess werden ins Proteininnnere gerichtete Thiol-

gruppen der Proteine nach au�en gekehrt. Im Folgenden kommt es zur Reaktion mit den

Caseinen und zur Bildung unl�oslicher Aggregate, die im l�oslichen �Uberstand bei pH 4,6

nicht mehr erfasst werden [136]. Der Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichen Molkenproteinen

kann daher als Hitzeindikator dienen [137].

Bei der Methode von Lowry werden zwei Eigenschaften der Proteine genutzt. Zum

einen entsteht bei der Zugabe von Kupfer(II)-Ionen ein farbiger Komplex mit der Pep-

tidbindung. Zus�atzlich wird das hinzugef�ugte Folin-Reagenz von reduzierenden Ami-

nos�auren wie z. B. Tyrosin oder Tryptophan zu einem blauen Farbsto� reduziert, dessen

Absorption bei 630 nm vermessen wird. Durch die Kombination der beiden Reaktionen

ist die Methode nach Lowry wesentlich emp�ndlicher als andere g�angige kolorimetrische

Proteinbestimmungen [34].

Abbildung 5.1 zeigt die erhaltenen Kurven der Proteinbestimmung. In der unerhitz-

ten Milch wurde im Durchschnitt ein Gehalt von 6,2 g/L Molkenprotein ermittelt,

was im �ublichen Schwankungsbereich liegt (vgl. Kapitel 1.1). Nach einer zeitlichen

Verz�ogerung von ca. 30 min wurde bei der Erhitzungsreihe bei 70 °C ein linearer Abfall

(R2 = 0,986; p < 0,001) der Proteinkonzentration im l�oslichen �Uberstand beobachtet.

Hingegen wurde bei den bei 80 °C erhitzten Proben nur im Bereich von 30 bis 60 min

eine lineare Abnahme (R2 = 0,994; p < 0,01) an Protein festgestellt, w�ahrend dann ein

91


0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0

70 °C80 °C100 °C

0

2

4

6

8

0 50 100 150 200 250 300 350

Erhitzungsdauer [min]

Kon

zent

ratio

n [g

/L]

Abb. 5.1: Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem Protein nach Lowry in Abh�angigkeit von Erhit-zungsdauer und -temperatur. Entfettete pasteurisierte Milch wurde bei 70 °C, 80 °C und100 °C erhitzt. Nach Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molkenproteine beipH 4,6 wurde der Gehalt an l�oslichen Proteinen nach Lowry bestimmt. Angegeben sind dieMittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung± Standardabweichung.

Plateau bei ca. 2,2 g/L erreicht wurde, woraufhin nach 240 min ein leichter Anstieg

(p < 0,05) folgte. Eine �ahnliche Kurve wurde nach der Erhitzung bei 100 °C erhalten,

nur lief der lineare Proteinabfall (R2 = 0,983; p < 0,001) bereits zwischen 17 und 30 min

ab und erreichte nach 45 min sein h�ochstes Ausma�. Auch hier stieg bei l�anger anhal-

tender Erhitzung die Konzentration an l�oslichem Protein moderat signi�kant (p < 0,05)

an.

5.3 Quanti�zierung des bei pH 4,6 l�oslichen �-Lact-

albumins und �-Lactoglobulins mittels HPLC

Einen �ahnlichen, jedoch genaueren Ansatz stellt die Bestimmung des Gehalts des bei

pH 4,6 l�oslichen �-Lactalbumins bzw. �-Lactoglobulins dar. Auch hier ist die Grundlage

f�ur die Bewertung der Hitzebehandlung von Milch die Proteindenaturierung, jedoch ist

eine di�erenzierte Betrachtung der Denaturierung einzelner Molkenproteine m�oglich.

Dabei werden erneut die Caseine und die denaturierten Molkenproteine durch Einstel-

len des pH-Wertes auf 4,6 gef�allt und der verbleibende l�osliche Anteil an �-Lactalbumin

bzw. �-Lactoglobulin chromatographisch bestimmt. Die Hochleistungs �ussigchromato-

92

5.4 Bestimmung des FAST-Indexes

graphie ist eine etablierte Methode zur Quanti�zierung von Milchproteinen [35, 138{

140]. In dem hier vorliegenden Experiment wurde eine C8-Umkehrphase als station�are

Phase eingesetzt; die Detektion der Proteine erfolgte uorimetrisch. Abb. 5.2 zeigt

beispielhaft einige der erhaltenen Chromatogramme der bei 100 °C erhitzten Milch.

Bei der Erhitzung bei 70 °C wurde keine signi�kante Ver�anderung der Konzentration

von �-Lactalbumin gemessen (siehe Abb. 5.3). Erst bei 80 °C lie� sich ein Abfall des

Gehaltes beobachten, der bei der Inkubation bei 100 °C noch schneller eintrat. Auch

nach 120 min bei 80 °C bzw. 45 min bei 100 °C war noch ca. 0,1 g/L l�osliches �-

Lactalbumin nachweisbar; st�arker erhitzte Proben konnten aufgrund der resultierenden

Komplexit�at der Chromatogramme nicht mehr ausgewertet werden.

�Ahnliche Beobachtungen wurden bei der Quanti�zierung von �-Lactoglobulin ge-

macht (siehe Abb. 5.4). Im Gegensatz zu �-Lactalbumin wurde hier bereits bei 70 °C

eine lineare (R2 = 0,976; p < 0,001) Abnahme der Proteinkonzentration gemessen, die

jedoch im beobachteten Erhitzungszeitraum nicht ihr Minimum erreichte. Erst bei 80 °C

bzw. 100 °C �el der Gehalt weiter auf 0,1 g/L bzw. 0,2 g/L ab. Auch hier konnten nicht

alle Proben analysiert werden, da die Chromatogramme mit anhaltender thermischer

Behandlung nicht mehr auswertbar wurden.


Der Fast-Index ist ein Ma� f�ur die uoreszierenden Verbindungen, die im Laufe der

Maillard-Reaktion gebildet werden. Daf�ur wird die Fluoreszenz der intermedi�aren Gly-

kierungsprodukte (FAMP) im bei pH 4,6 l�oslichen �Uberstand vermessen. Da jedoch

dessen Proteingehalt mit steigender Erhitzungsdauer abnimmt, muss zus�atzlich die er-

mittelte Fluoreszenz auf die Proteinkonzentration, erfasst �uber die Fluoreszenz von

Tryptophan (FTrp), bezogen werden. Der Fast-Index berechnet sich dann folgender-

ma�en [141]:

Fast =FAMPFTrp

· 100

Bei 70 °C wurde �uber die gesamte Erhitzungsdauer hinweg ein linearer Anstieg des

Fast-Indexes gemessen (R2 = 0,994; p < 0,001) (s. Abb. 5.5). Bei h�oherer Inkubations-

temperatur hingegen bot sich ein anderes Bild: Sowohl bei 80 °C als auch bei 100 °C

stieg der Fast-Index nach einer anfangs nur langsamen Zunahme schnell an, bis er ein

93


0 min

0200000400000600000800000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35

Retentionszeit [min]

Fluo

resz

enz

13 min

0200000400000600000800000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35


Fluo

resz

enzLG

LA

20 min

0200000400000600000800000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35


Fluo

resz

enz

30 min

0200000400000600000800000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35


Fluo

resz

enz

45 min

0200000400000600000800000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35


Fluo

resz

enz

01000020000300004000050000

0 5 10 15 20 25 30 35


Abb. 5.2: Einige Chromatogramme der bei 100 °C erhitzten Milch. Entfettete pasteurisierteMilch wurde in Dreifachbestimmung bei 100 °C erhitzt. Nach Pr�azipitation der Caseineund der denaturierten Molkenproteine bei pH 4,6 wurde die Milch auf einer C8-S�aulechromatographisch aufgetrennt. Die Detektion erfolgte mittels Fluoreszenz der Proteine.LA: �-Lactalbumin LG: �-Lactoglobulin.

94


0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0

70 °C80 °C100 °C

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0 50 100 150 200 250 300 350


Kon

zent

ratio

n [g

/L]

Abb. 5.3: Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin in Abh�angigkeit von Er-hitzungsdauer und -temperatur. Entfettete pasteurisierte Milch wurde bei 70 °C, 80 °Cund 100 °C erhitzt. Nach Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molkenproteinebei pH 4,6 wurde der Gehalt des l�oslichen �-Lactalbumins mittels Hplc mit Fluoreszenz-detektion bestimmt. Angegeben sind die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestim-mung±Standardabweichung.

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0

70 °C80 °C100 °C

0

1

2

3

4

0 50 100 150 200 250 300 350


Kon

zent

ratio

n [g

/L]

Abb. 5.4: Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactoglobulin in Abh�angigkeit von Er-hitzungsdauer und -temperatur. Entfettete pasteurisierte Milch wurde bei 70 °C, 80 °Cund 100 °C erhitzt. Nach Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molkenproteinebei pH 4,6 wurde der Gehalt des l�oslichen �-Lactoglobulins mittels Hplc mit Fluoreszenz-detektion bestimmt. Angegeben sind die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestim-mung±Standardabweichung.

95


0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0

70 °C80 °C100 °C

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200 250 300 350


FAST

-Inde

x

Abb. 5.5: Fast-Index der Milch in Abh�angigkeit von Erhitzungsdauer und -temperatur. Ent-fettete pasteurisierte Milch wurde bei 70 °C, 80 °C und 100 °C erhitzt. Nach Pr�azipitationder Caseine und der denaturierten Molkenproteine bei pH 4,6 wurde der Fast-Index im�Uberstand bestimmt. Angegeben sind die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestim-mung± Standardabweichung.

Maximum erreichte. W�ahrend der Erhitzung bei 80 °C stagnierte der Fast-Index bei

diesem maximalen Wert zun�achst, bis er nach 300 min signi�kant (p< 0,01) absank. Die

erneute Absenkung des Fast-Indexes bei anhaltender thermischer Behandlung wurde

bei der Inkubation bei 100 °C noch deutlicher.

5.5 Relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts von

�-Lactalbumin mittels MALDI-TOF-MS

Wie von Fenaille et al. gezeigt wurde, l�asst sich Milch einfach und schnell direkt

nach Verd�unnung mit Wasser mit einer Cyanohydroxyzimts�aure-Dihydroxybenzoes�au-

re-Matrix mittels Maldi-Tof-Ms vermessen [46]. Dabei wird die Ionisierung von �-

Lactalbumin sichtlich beg�unstigt, was sich in dem wesentlich intensiveren Signal als

im Vergleich zur Messung mit anderen Matrices manifestiert (siehe Abb. 5.6; vgl. dazu

auch Abb. 4.1 auf S. 74). Aus diesem Grund wurde f�ur die relative Quanti�zierung des

Amadoriprodukts �-Lactalbumin als Zielprotein gew�ahlt. Zudem weist �-Lactalbumin

eine h�ohere Stabilit�at gegen�uber Denaturierungsprozessen auf, die die Messung erschwe-

ren (siehe n�achster Absatz). Da die Glykierung von Proteinen deren Ionisierung nicht

messbar beeintr�achtigt [71], kann die Intensit�at des modi�zierten Proteins direkt auf

96

5.5 Relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin

α-La

ctal

bum

in

β-Lactoglobulin

κ-Casein

αγ-C

asei

ne

/β-Casein

7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500 25000m/z

rel.

Int.

A

B

Abb. 5.6: Maldi-Tof-Ms-Spektren von Rohmilch unter Verwendung verschiedener Ma-trices. A: �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure-Dihydroxybenzoes�aure. B: 2,5-Dihydroxyacetophe-non (unter Zusatz von Diammoniumhydrogencitrat).

die Summe der Intensit�aten des nativen und des modi�zierten bezogen werden (zur

Formel siehe S. 137). Ein �ahnlicher Ansatz zur relativen Quanti�zierung von Glykie-

rungsprodukten von Lysozym wurde von Kislinger et al. vorgestellt [52].

In Abb. 5.7 sind beispielhaft einige Spektren der bei 80 °C erhitzten Milch dargestellt.

Mit steigender Erhitzungsdauer wurden die Lactoseaddukte mit einem Massenunter-

schied von je 324 Da detektiert. Zugleich zeigte sich, dass im Laufe der Inkubation das

Signal des nativen Proteins schw�acher wurde, was sich nicht allein auf die Modi�zierung

zur�uckf�uhren lie�. �Ahnliche Beobachtungen wurden von Marsilio et al. gemacht [86].

Es ist zu vermuten, dass die Denaturierung, die mit anhaltender Erhitzung eintritt,

dazu f�uhrte, dass �-Lactalbumin mit anderen Milchproteinen aggregierte [83{85], und

somit �-Lactalbumin nicht mehr als Monomer zu erfassen war. Dies impliziert, dass

es sich bei dem detektierten Signal wohl lediglich um das nicht denaturierte Protein

handelte, was bei der Bewertung der Ergebnisse der relativen Quanti�zierung bedacht

werden muss.

Die Ergebnisse der relativen Quanti�zierung (siehe Abb. 5.8) zeigten einen nahezu

linearen Verlauf (R2 = 0,968; p < 0,001) der Amadoriproduktbildung w�ahrend der Er-

97


α-LactalbuminAmadoriprodukte

14000 14500 15500 m/z

rel.

Int.

0 min 80 °C

60 min 80 °C

120 min 80 °C

180 min 80 °C

240 min 80 °C

300 min 80 °C

Abb. 5.7: Maldi-Tof-Ms-Spektren der bei 80 °C erhitzten Milch. Entfettete pasteurisierteMilch wurde in einer Dreifachbestimmung bis zu 300 min bei 80 °C erhitzt und direktmittels Maldi-Tof-Ms vermessen. Lactosyliertes �-Lactalbumin ist gekennzeichnet.

hitzung bei 70 °C f�ur bis zu 240 min. Bei den beiden h�oheren Temperaturen zeichnete

sich hingegen eine Kurve ab und die Bildung des Lactulosyllysins achte mit anhal-

tender Erhitzung langsam ab. Zus�atzlich lie� sich eine deutliche Abh�angigkeit von der

Inkubationsdauer und -temperatur feststellen: je h�oher die Temperatur und je l�anger

die Dauer, desto h�oher war der Anteil des Amadoriprodukts. So erreichte die Modi�-

zierung von �-Lactalbumin mit Lactose nach 120 min bei 100 °C einen Maximalwert

von ca. 77 %.

5.6 Korrelationen zwischen den analysierten Hitze-

indikatoren

Die Korrelationen verschiedener Hitzeindikatoren f�ur Milch wurden teilweise bereits

untersucht [40, 134, 142]. Im Folgenden wird der Schwerpunkt auf die Korrelationen

98

5.6 Korrelationen zwischen den analysierten Hitzeindikatoren

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0

70 °C80 °C100 °C

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350


Rel

. Geh

alt [

%]

Abb. 5.8: Relativer Gehalt des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin in Abh�angigkeit vonErhitzungsdauer und -temperatur. Entfettete pasteurisierte Milch wurde bei 70 °C, 80 °Cund 100 °C erhitzt und direkt mittels Maldi-Tof-Ms vermessen. Angegeben sind dieMittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung±Standardabweichung.

gelegt, �uber die bisher keine Literaturdaten vorliegen. Tabelle 5.1 gibt einen �Uberblick

�uber die ermittelten Korrelationen.

5.6.1 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem Protein

F�ur die Untersuchung der Korrelation zwischen dem FAST-Index und dem Gehalt an

bei pH 4,6 l�oslichem Protein wurden nur die Werte einbezogen, bei denen mit steigender

Erhitzungsdauer ein Abfall der Proteinkonzentration verzeichnet worden war. F�ur die

darauf folgenden Werte war keine Korrelation zu erwarten, so dass eine Berechnung des

Korrelationskoe�zienten �uber die gesamte Erhitzungsdauer hinweg keinen Sinn h�atte.

Dabei wurde ein potentieller Zusammenhang (r = 0,979) zwischen den beiden Pa-

rametern festgestellt (siehe Abb. 5.9). Es f�allt auf, dass dieser unabh�angig von der

Temperatur war, da die Werte aller drei Erhitzungsreihen auf einer Kurve vereinigt

werden konnten. Erst bei anhaltender Erw�armung korrelierten die beiden Parameter

aufgrund der maximalen Proteindenaturierung und der einsetzenden Proteinhydrolyse

nicht mehr.

99


Tab. 5.1: Korrelationskoe�zienten (r) der untersuchten Hitzeindikatoren, ggf. in Abh�angig-keit von der Erhitzungstemperatur. F�ur die Berechnung wurden jeweils die Mittelwerteeiner unabh�angigen Dreichfachbestimmung der Parameter herangezogen. Der mathemati-sche Zusammenhang zwischen den jeweiligen Parametern ist angegeben: pot.: potentiell.exp.: exponentiell. lin.: linear.Fast: Fast-Index.Protein: bei pH 4,6 l�osliches Protein.�-Lactalbumin: bei pH 4,6 l�osliches �-Lactalbumin.�-Lactoglobulin: bei pH 4,6 l�osliches �-Lactoglobulin.AP: Amadoriprodukt von �-Lactalbumin.

Hitzeparameter r Typ

Fast { Protein 0,979 pot.

Fast { �-Lactalbumin 80 °C 0,997 exp.

100 °C 0,990 exp.

Fast { �-Lactoglobulin 0,981 exp.

AP { Protein 70 °C 0,984 exp.

80 °C 0,978 exp.

100 °C 0,984 exp.

AP { �-Lactalbumin 0,969 exp.

AP { �-Lactoglobulin 70 °C 0,995 exp.

80 °C 0,982 exp.

100 °C 0,983 exp.

AP { Fast 70 °C 0,991 lin.

80 °C 0,992 lin.*

0,995 exp.**

100 °C 0,997 lin.*

0,996 exp.**

* nur im Anfangsbereich linearer Verlauf

** nach linearem Anfangsbereich

100


0

70 °C

80 °C

100 °C

0

2

4

6

8

0 10 20 30 40

FAST-Index

Konz

entra

tion

[g/L

]

Abb. 5.9: Korrelation zwischen dem Fast-Index und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichemProtein. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung.Die potentielle Trendlinie ist gestrichelt eingezeichnet (r = 0,979). Werte, die aufgrundanhaltender Erhitzung nicht mehr korrelieren, sind eingekreist.

5.6.2 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin

Abb. 5.10 zeigt die Gegen�uberstellung der Werte des Fast-Indexes und die des Gehalts

an l�oslichem �-Lactalbumin. Nur f�ur die 80 °C und 100 °C-Werte wurde eine exponen-

tielle Korrelation (r (80 °C) = 0,997; r (100 °C) = 0,990) ermittelt; da sich jedoch

der Gehalt an l�oslichem �-Lactalbumin bei der Erhitzung bei 70 °C nicht signi�kant

ver�andert hatte, war auch keine Korrelation mit dem Fast-Index zu erwarten.

0

70 °C

80 °C

100 °C

0,0

0,5

1,0

1,5

0 10 20 30 40

FAST-Index

Konz

entr

atio

n [g

/L]

Abb. 5.10: Korrelation zwischen dem Fast-Index und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�osli-chem �-Lactalbumin. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte einer unabh�angigen Drei-fachbestimmung. Die jeweiligen exponentiellen Trendlinien f�ur die Werte der 70 °C, 80 °Cbzw. 100 °C-Reihe sind gestrichelt eingezeichnet (r (70 °C) = 0,814; r (80 °C) = 0,997;r (100 °C) = 0,990).

101


5.6.3 FAST-Index { Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lacto-

globulin

In der Gra�k, in der der Fast-Index gegen die Konzentration des bei pH 4,6 l�osli-

chen �-Lactoglobulins aufgetragen wurde (s. Abb. 5.11), lie� sich ein exponentieller

Zusammenhang zwischen den beiden Parametern erkennen. Erneut lagen die Werte

aller Erhitzungsreihen auf einer Kurve (r = 0,981).

0

70 °C 80 °C 100 °C

0

1

2

3

4

0 5 10 15 20

FAST-Index

Konz

entra

tion

[g/L

]

Abb. 5.11: Korrelation zwischen dem Fast-Index und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem�-Lactoglobulin. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbe-stimmung. Die exponentielle Trendlinie ist gestrichelt eingezeichnet (r = 0,981).

5.6.4 Amadoriprodukt von �-Lactalbumin { Gehalt an bei pH 4,6

l�oslichem Protein

In Abb. 5.12 wird die Korrelation zwischen dem relativen Gehalt des Amadoriprodukts

von �-Lactalbumin und der Konzentration an l�oslichem Protein dargestellt. Auch hier

war ein exponentieller Zusammenhang zwischen den beiden Hitzeindikatoren festzu-

stellen, jedoch nur in der Anfangsphase der thermischen Behandlung, solange der Pro-

teingehalt noch nicht wieder angestiegen war. Dabei war die Lage der Kurven abh�angig

von der Temperatur (r (70 °C) = 0,984; r (80 °C) = 0,978; r (100 °C) = 0,984).

102


0

70 °C

80 °C

100 °C

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8

Konzentration [g/L]

Rel.

Geh

alt [

%]

0

70 °C 80 °C 100 °C

B

A

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8

Konzentration [g/L]

Rel.

Geh

alt [

%]

Abb. 5.12: Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an Amadoriprodukt von �-Lactalbumin und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem Protein. Dargestellt sind jeweils dieMittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung. Die jeweiligen exponentiellen Trend-linien f�ur die Werte der 70 °C, 80 °C bzw. 100 °C-Reihe sind gestrichelt eingezeichnet(r (70 °C) = 0,984; r (80 °C) = 0,978; r (100 °C) = 0,984). Werte, die aufgrund anhaltenderErhitzung nicht mehr korrelieren, sind in Abschnitt A eingekreist. In Abschnitt B wird zurVerdeutlichung der Anfangsbereich der Werte vergr�o�ert dargestellt.


l�oslichem �-Lactalbumin

Zwischen dem relativen Gehalt des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin und der Dena-

turierung des letzteren wurde bei der Erhitzung bei 80 °C bzw. 100 °C eine exponentielle

Korrelation (r = 0,969) beobachtet (s. Abb. 5.13). Die Werte der 70 °C-Reihe �elen

erneut aus dem Rahmen, da die Konzentration an l�oslichem �-Lactalbumin nahezu

konstant geblieben war.

103


0

70 °C

80 °C

100 °C

0

10

20

30

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Konzentration [g/L]

Rel.

Geh

alt [

%]

Abb. 5.13: Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an Amadoriprodukt von �-Lactalbu-bumin und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin. Dargestellt sind jeweils dieMittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung. Die exponentielle Trendlinie f�ur dieWerte der 80 °C bzw. 100 °C-Reihe ist gestrichelt eingezeichnet (r = 0,969).


l�oslichem �-Lactoglobulin

Abb. 5.14 zeigt, dass der relative Anteil des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin expo-

nentiell mit dem Gehalt an l�oslichem �-Lactoglobulin korrelierte. Dabei wurden f�ur die

drei Erhitzungsreihen drei Trendlinien ermittelt (r (70 °C) = 0,995; r (80 °C) = 0,982;

r (100 °C) = 0,983).

5.6.7 Amadoriprodukt von �-Lactalbumin { FAST-Index

Bei der Analyse der Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an Amadoriprodukt

von �-Lactalbumin und dem Fast-Index wurde f�ur jede Erhitzungsreihe eine eigene

Kurve erhalten (s. Abb. 5.15). Hierbei wurde ein Unterschied zwischen der Inkubation

bei 70 °C und der bei 80 °C bzw. 100 °C deutlich: W�ahrend der Anteil am Amadori-

produkt bei 70 °C linear mit dem Fast-Index anstieg (r = 0,991), wurde bei h�oherer

Temperatur ein exponentieller Zusammenhang (r (80 °C) = 0,995; r (100 °C) = 0,996)

ermittelt. Bei genauerem Betrachten der Kurve zeigte sich jedoch, dass sowohl bei der

Erhitzung bei 80 °C als auch bei 100 °C anfangs ein linearer Bereich (r (80 °C) = 0,992;

r (100 °C) = 0,997) zu verzeichnen war. Zur Verdeutlichung wird in der Abbildung in

Abschnitt B beispielhaft die Kurve der 100 °C-Proben vergr�o�ert.

104

5.7 Diskussion

0

70 °C

80 °C

100 °C

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4

Konzentration [g/L]

Rel.

Geh

alt [

%]

Abb. 5.14: Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an Amadoriprodukt von �-Lactalbumin und dem Gehalt an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactoglobulin. Dargestellt sindjeweils die Mittelwerte einer unabh�angigen Dreifachbestimmung. Die jeweiligen Trend-linien (exponentiell) f�ur die Werte der 70 °C, 80 °C bzw. 100 °C-Reihe sind gestrichelteingezeichnet (r (70 °C) = 0,995; r (80 °C) = 0,982; r (100 °C) = 0,983).

5.7 Diskussion

Die thermische Behandlung von Milch und Milchprodukten f�uhrt zu einer Vielzahl von

chemischen Reaktionen, die u. A. eine Verminderung der biologischen Wertigkeit der

Proteine bewirken (siehe Kapitel 1). Daher ist es notwendig, die industrielle Erhit-

zung der Produkte sorgf�altig zu kontrollieren, wof�ur aussagekr�aftige Hitzeindikatoren

gefragt sind. In dem hier vorgestellten Projekt wurden mehrere klassische Parameter in

erhitzter Milch bestimmt; zudem wurde als neuer Ansatz eine massenspektrometrische

Methode getestet.

Zun�achst wurde die Proteindenaturierung, erfasst �uber den Proteingehalt im bei

pH 4,6 l�oslichen �Uberstand der Milch, als Ma� f�ur die Hitzebehandlung [137] unter-

sucht. Die Kurven spiegelten den Verlauf der Denaturierung wider: Zun�achst blieb die

Konzentration der bei pH 4,6 l�oslichen Proteine nahezu konstant, �ubereinstimmend mit

den Beobachtungen von Dalgleish [143]. Die Denaturierungstemperaturen der Molken-

proteine liegen zwischen 62 und 64 °C [144]. Erst bei deren Erreichen sank der Pro-

teingehalt abh�angig von der Inkubationstemperatur und -dauer durch den Verlust an

L�oslichkeit der entfalteten und koaggregierten Milchproteine ab, bis diese maximal de-

naturiert waren. Bei den in L�osung verbliebenen Proteinen handelte es sich wohl um

105


0

70 °C 80 °C 100 °C

0

20

40

60

80

0 10 20 30 40

FAST-Index

Rel.

Geh

alt [

%]

0

5

10

4 6 8 10

FAST-Index

Rel.

Geh

alt [

%]

B

A

Abb. 5.15: Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an Amadoriprodukt von �-Lactalbubu-min und dem FAST-Index (A). Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte einer unabh�angigenDreifachbestimmung. Die jeweiligen Trendlinien sind gestrichelt eingezeichnet (r (70 °C;linear)= 0,991; r (80 °C; exponentiell)= 0,995; r (100 °C; exponentiell)= 0,996). Werte,die aufgrund anhaltender Erhitzung nicht mehr korrelieren, sind eingekreist. In B wirdder Anfangsbereich der Werte der 100 °C-Proben vergr�o�ert. Die lineare Trendlinie istzus�atzlich gestrichelt eingezeichnet (r (100 °C; linear)= 0,997).

die per De�nition hitzestabilen Proteoso Peptone sowie in geringen Mengen um l�osliche

Proteinaggregate. Die bei andauernder thermischer Behandlung gemessene Zunahme

des Proteingehalts l�asst sich vermutlich auf den bereits in Kapitel 4 ausgef�uhrten Pro-

teinabbau zur�uckf�uhren.

Die �ussigkeitschromatographische Gehaltsermittlung von �-Lactalbumin bzw. �-

Lactoglobulin lieferte �ahnliche Ergebnisse. Zwar ist die Konzentration der Proteine

abh�angig von der Erhitzungsdauer bzw. -temperatur und kann somit als guter Erhit-

zungsindikator herangezogen werden [131], jedoch stie� die Methode schnell an ihre

Grenzen, als das Chromatogramm aufgrund zunehmender Proteinmodi�zierung bzw.

-hydrolyse zu komplex f�ur eine aussagekr�aftige Auswertung wurde.

106

5.7 Diskussion

In den letzten Jahren hat die Messung der Fluoreszenz als Marker f�ur thermisch be-

handelte Lebensmittel zunehmend an Bedeutung gewonnen [133, 145, 146]. In diesem

Zusammenhang wurde der Fast-Index als schnelle Methode zur Beurteilung von hitze-

behandelter Milch vorgestellt [141, 147]. Untersucht worden war in diesen Studien aller-

dings nur die Entwicklung des Fast-Indexes bei moderater thermischer Belastung. Bei

andauernder Inkubation der Milch wurde bei den in dieser Arbeit erhaltenen Daten ein

Maximum des Fast-Indexes beobachtet, dem allm�ahlich eine erneute Abnahme folgte.

Eine Erkl�arung f�ur dieses Ph�anomen k�onnte die fortgeschrittene bzw. sp�ate Phase der

Maillard-Reaktion sein, in der die uoreszierenden Verbindungen zu nicht uoreszenten

Strukturen weiterreagiert waren. Tats�achlich war in den stark erhitzten Proben bereits

eine leichte Braunf�arbung der Milch zu verzeichnen gewesen, ein Anzeichen f�ur die Bil-

dung von Melanoidinen. Zwar war in den pr�azipitierten Proben keine Braunf�arbung

mehr sichtbar, da wohl der Gro�teil der farbgebenden Strukturen in die Caseinfraktion

�uberging, jedoch k�onnen dennoch verbliebende Reste davon im vermessenen �Uberstand

zus�atzlich dazu beigetragen haben, die Fluoreszenz der Maillardprodukte zu vermin-

dern ("Quenching\). Zudem f�uhrte die Erhitzung wahrscheinlich zum Einsetzen des

Proteinabbaus (vgl. Kapitel 4), was durch den gr�o�eren Nenner in der Formel zur

Berechnung des Fast-Indexes ebenfalls eine Verringerung des Wertes bewirkt. Es ist

dar�uber hinaus auch m�oglich, dass aufgrund der durch die Maillard-Reaktion hervor-

gerufenen pH-Verringerung in der Milch auf ca. 6,6 die Bildung der uoreszierenden

Verbindungen reduziert wurde, da diese abh�angig vom pH-Wert ist [148].

Die analysierten klassischen Hitzeparameter wurden auf Korrelationen untereinan-

der untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Fast-Index mit der Konzentration an bei

pH 4,6 l�oslichem Protein in potentiellem Zusammenhang stand, wobei die Erhitzungs-

temperatur keinen Ein uss hatte. Erst bei anhaltender Inkubation der Milch lagen die

Werte au�erhalb der Kurve. Dies war jedoch zu erwarten, da zu diesem Zeitpunkt beim

Fast-Index eine Abnahme bzw. beim Proteingehalt eine erneute Zunahme gemessen

worden war, da wahrscheinlich weitere Faktoren wie die Proteinhydrolyse die Hitzepa-

rameter beein ussten. Eine �ahnliche Kurve wurde von Birlouez-Aragon et al. erhalten

[141], die unterschiedlich erhitzte Milchproben analysierten. Auch sie berichteten von

einer Abh�angigkeit des Fast-Indexes vom Proteingehalt, der �uber die Tryptophan uo-

reszenz erfasst wurde. Zwar wurde erw�ahnt, dass autoklavierte Proben au�erhalb der

Regressionskurve lagen, eine Erkl�arung daf�ur wurde hingegen nicht gegeben.

Zwischen dem Fast-Index und �-Lactalbumin bzw. �-Lactoglobulin wurde jeweils ei-

ne exponentielle Korrelation berechnet. Dabei war f�ur die Kurve von �-Lactalbumin ei-

107


ne deutliche Temperaturabh�angigkeit zu erkennen. Vermutlich wird der Fast-Index we-

sentlich st�arker durch �-Lactoglobulin beein usst als durch �-Lactalbumin, was durch

den h�oheren prozentualen Anteil von �-Lactoglobulin am Molkenprotein zu erkl�aren

ist. Zudem k�onnte die Denaturierung von �-Lactalbumin von weiteren Faktoren wie

z. B. der Glykierung abh�angen, was die Abh�angigkeit von der Temperatur erkl�arte.

Zusammenfassend l�asst sich �uber die untersuchten klassischen Hitzeparameter fest-

stellen, dass diese schnell an ihre Grenzen gelangen und an Aussagekraft verlieren, z. B.

bei stark erhitzten Milchprodukten oder bei Produkten mit Molkenproteinzusatz. F�ur

eine Beurteilung einer moderaten thermischen Belastung wie z. B. von pasteurisierter

oder ultrahocherhitzter Milch sind sie zweifelsohne gut geeignet, wie hinreichend gezeigt

wurde [35, 141, 147]; ihr Einsatz f�ur sterilisierte Proben oder S�auglingsmilchnahrung

erscheint jedoch fraglich.

Als neue Methode zur Analyse der thermischen Behandlung von Milch wurde der

relative Gehalt des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin mittels Maldi-Tof-Ms be-

stimmt. Hierbei wurde bei moderater Temperatureinwirkung ein linearer Zusammen-

hang zwischen der Erhitzungsdauer und dem relativen Gehalt an Lactulosyllysin ermit-

telt. Erst bei anhaltender Erhitzung der Milch achte die Kurve wieder leicht ab. Diese

Beobachtungen stimmen mit anderweitig ermittelten Daten zur Amadoriproduktbil-

dung �uberein [130]. Im Gegensatz zu den zuvor angewendeten klassischen Methoden

war �uber den gesamten Erhitzungszeitraum hinweg eine Beurteilung der Hitzebehand-

lung der Milch mittelsMaldi-Tof-Ms m�oglich, was diese Technik klar gegen�uber den

anderen Methoden hervorhebt.

Zur Zeit ist f�ur das Amadoriprodukt und somit f�ur die fr�uhe Phase der Maillard-

Reaktion Furosin der spezi�schste und wichtigste Indikator [149]. Daf�ur wird die Probe

mit 8 N Salzs�aure hydrolysiert, wobei Furosin in vom Zucker abh�angigen Anteilen

aus dem Amadoriprodukt entsteht [150]. Es kann dann �ussigkeitschromatographisch

[38, 151, 152] oder mittels Kapillarzonenelektrophorese [153] bestimmt werden. Nachteil

der Furosin-Methode ist jedoch, dass bei der Anwesenheit von verschiedenen Zuckern,

z. B. in Kindern�ahrmitteln, eine pr�azise Umrechnung aufgrund des zuckerabh�angigen

Faktors schwierig wird. Dar�uber hinaus ist die Bildungsrate von Furosin auch von den

individuellen Reaktionsbedingungen abh�angig, so dass der exakte Umrechnungsfaktor

stets empirisch bestimmt werden muss. Zudem ist die Analyse durch die erforderliche

S�aurehydrolyse relativ zeitaufw�andig.

Die vorgestellte massenspektrometrische Methode ist im Gegensatz dazu ausgespro-

chen schnell, da eine Probe lediglich verd�unnt, auf den Stahltr�ager gegeben und vermes-

108

5.7 Diskussion

sen werden muss, was nur wenige Minuten in Anspruch nimmt. Zus�atzlich k�onnen auch

andere Milchprodukte, wie z. B. S�auglingsnahrung, vermessen werden (siehe Kapitel

3.2.1). Die Analytik erschien daher f�ur die Bewertung der fr�uhen Maillard-Reaktion

sehr gut geeignet.

Um die Eignung der Methode zu best�atigen, wurde auf Korrelationen mit den klas-

sischen Hitzeindikatoren gepr�uft. Zwischen dem relativen Gehalt des Amadoriprodukts

und der Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem Protein wurde anfangs ein expo-

nentieller Zusammenhang beobachtet. Dieser war abh�angig von der Temperatur, da

o�ensichtlich diese die Proteindenaturierung st�arker beein usste als die Bildung des

Amadoriprodukts.

Im Gegensatz dazu war zwischen der Reaktion zum Amadoriprodukt und der De-

naturierung von �-Lactalbumin eine exponentielle Korrelation zu verzeichnen, die un-

abh�angig von der Temperatur war. Indessen zeigten die Korrelationskurven zwischen

Lactulosyllysin und l�oslichem �-Lactoglobulin erneut eine klare Temperaturabh�angig-

keit. Dies erkl�art, warum auch die Korrelation zwischen dem relativen Gehalt an

Amadoriprodukt und bei pH 4,6 l�oslichem Protein temperaturabh�angig war: Da �-

Lactoglobulin ca. 50 % des Molkenproteins ausmacht, war zu erwarten, dass das Ver-

halten von �-Lactoglobulin ma�geblich die Kurve des Gesamtproteins beein usst. �-

Lactoglobulin ist im Vergleich zu �-Lactalbumin temperaturemp�ndlicher und schneller

denaturierbar, was einen schnelleren Proteinabfall bei h�oherer Erhitzungstemperatur

nach sich zieht.

Interessante Ergebnisse wurden bei der Untersuchung der Korrelation zwischen der

Amadoriproduktbildung von �-Lactalbumin und dem Fast-Index erhalten: W�ahrend

bei 70 °C eine lineare Beziehung ermittelt wurde, zeichnete sich bei den 80 °C und

100 °C-Proben eine exponentielle Kurve ab. Bei genauerer Analyse der Kurven zeigte

sich allerdings, dass im Anfangsbereich der Inkubation auch hier ein linearer Anstieg

des Fast-Indexes zu beobachten war. O�ensichtlich reagierte das Amadoriprodukt erst

nach einer anf�anglichen Verz�ogerung vermehrt zu uoreszierenden Verbindungen wei-

ter. Nicht zu vernachl�assigen ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass bei der

Erhitzung der Milch unter den gegebenen Bedingungen nur ein allm�ahlicher Tempera-

turanstieg in den Proben m�oglich war, was die lineare Phase beg�unstigt haben k�onnte.

Die erhaltenen Ergebnisse lassen annehmen, dass die getestete Maldi-Tof-Ms-

Methode eine sehr gute Alternative zu bisher genutzten Techniken zur Beurteilung der

Hitzebehandlung von Milch ist. Allerdings ist zu ber�ucksichtigen, dass in diesem Projekt

nur das Amadoriprodukt von �-Lactalbumin bestimmt wurde. Da jedoch die Milchpro-

109


teine unterschiedlich stark glykiert werden [49, 154], ist keine absolute Aussage �uber

die gesamte Lysinblockierung m�oglich. Eine ausf�uhrliche Validierung der massenspek-

trometrischen Analytik, insbesondere eine eventuelle Korrelation mit der etablierten

Furosin-Methode, ist daher gefragt.

110

6 Material und Methoden

6.1 Ger�ate

Analysenwaagen Sartorius, Mettler Toledo

Analytische Hplc Jasco AS-1555 Intelligent Sampler,

Jasco PU-1580 Intelligent Hplc Pump,

Jasco LG-1580-02 Ternary Gradient Unit,

Jasco DG-1580-53 3-Line-Degasser,

Jasco FP-920 Intelligent Fluorescence Detector

Fluorimeter Kontron Spectro uorometer SFM 23,

Power Supply SFM 23, Igniter System SFM 23

Eindimensionale Gelelektrophorese BioRad Mini Protean III,

BioRad PowerPac Basic 300

Kolbenhubpipetten, diverse Gr�o�en Brand

Lyophylle Savant Novalyphe NL 150,

Varian DS 602 Pumpe

Maldi-Tof-Ms Bruker Auto ex

Microplate Reader BioRad

Magnetic Bead Separator Bruker

Magnetr�uhrer IKAMAG RET/RCT

111


Mikrotitersch�uttler IKA-Sch�uttler MTS4

Oberschalenwaage Mettler PM 400

pH-Meter Metrohm 654

Sch�uttelwasserb�ader Julabo SW 20

Julabo SW 22

Sch�uttler Stuart Gyro-Rocker SSL3

Thermometer B�uchi Laboratories

Thermomixer Eppendorf comfort

Trockenschr�anke Binder WTC

6 Ehret VTS 70

Ultraschallbad Bandelin Sonorex Super RK 255 H

Ultratiefk�uhlger�at New Brunswick Scienti�c, Modell U101

UV/VIS-Spectrometer Perkin Elmer Lamda 2

Vortexer Heidolph

Wasseraufbereitung Millipore, Synergy 185

Zentrifuge Hettich, Universal 16/32

Zweidimensionale Gelelektrophorese BioRad Protean IEF Cell,

BioRad Mini Protean III

6.2 Verbrauchsmaterialien

Dialyseschl�auche Roth Zellutrans 6,0, Mwco 8000-10000 Da

Einmalhandschuhe Roth rotiprotect Nitril

Falten�lter MN 615 1/4 Macherey Nagel

Membran�lter, Nylon, 0,8 �m Schleicher & Sch�ull

96-Mikrotiterplatten Nunc

112

6.3 Chemikalien

Pipettenspitzen Eppendorf

PCR-Streifen Biozym

Ready Strip Ipg-Streifen, pH 3-6, 7 cm BioRad

Reaktionsgef�a�e mit Schraubverschluss Roth

SafeLock Reaktionsgef�a�e Eppendorf

Spritzen�lter, steril, PVDF, 0,45 �m Roth

Zentrifugenr�ohrchen, steril Bio-Greiner

ZipTips C18 Millipore

6.3 Chemikalien

Acetonitril, for Hplc Prolabo

Acrylamid/Bis, 30 %, 37,5:1 (2,6 % C) BioRad

Ammoniumbicarbonat Sigma

Ammoniumdihydrogenphopshat, 99,9 % Acros

Ammoniumpersulfat BioRad

Anti-�-Lactalbumin Immunology Consultant Laboratories

Anti-�-Lactoglobulin Immunology Consultant Laboratories

BioSafe Coomassie BioRad

Bromcyan Fluka

Bsa-Standardl�osung 2 mg/mL PerBio

�-Cyano-4-hydroxyzimts�aure, purriss. p. a. (Cca) Fluka

Diammoniumhydrogencitrat, Ultra >99,0 % Fluka

2,5-Dihydroxyacetophenon (Dhap) Bruker

2,5-Dihydroxybenzoes�aure, puriss. (Dhb) Fluka

Dinatriumhydrogenphosphat Fluka

113


Dithiothreitol (Dtt) Fluka

Essigs�aure, 99 % BASF

Glycerin, 99,5 % Acros

Glycin, min. 99 % Sigma

Harnsto� Fluka

�-Lactalbumin, Type I, >85 % PAGE Sigma

�-Lactoglobulin, appr. 90 % PAGE Sigma

D-(+)-Lactose Monohydrat Fluka

Methanol, for Hplc Prolabo

Natriumacetat wasserfrei Fluka

Natriumdihydrogenphosphat Fluka

Natriumdodecylsulfat (Sds) Fluka

Peptid-Standardmischung Bruker

Salzs�aure konz. BASF

Tetramethylethylendiamin BioRad

Thioharnsto� Acros

Tri uoressigs�aure, 99 % Aldrich

Tris, 99,85 % Acros

Wassersto�peroxid, 30 % Degussa

6.4 Kommerziell erh�altliche Kits

BioRad DC Protein Assay BioRad

Magnetic Beads Iac Protein G Bruker

Magnetic Beads Imac-Cu Bruker

114

6.5 Herstellung von L�osungen

6.5 Herstellung von L�osungen

Ammoniumbicarbonatpu�er, 25 mM, pH 8,0

Zur Herstellung des 25 mM Ammoniumbicarbonatpu�ers pH 8,0 wurden 0,9875 g Am-

moniumbicarbonat in Reinstwasser gel�ost, mit 1 % Ammoniakl�osung auf pH 8,0 einge-

stellt und auf 50 mL aufgef�ullt.

Natriumacetatpu�er, 0,4 M, pH 4,6

17,015 g Natriumacetat wurden in Reinstwasser gel�ost, mit 17,58 g konzentrierter Es-

sigs�aure auf pH 4,6 eingestellt und auf 1 L aufgef�ullt.

Natriumacetatpu�er, 0,5 M, pH 4,0

6,198 g Natriumacetat wurden in Reinstwasser gel�ost, mit 25,49 g konzentrierter Es-

sigs�aure versetzt und auf 1 L aufgef�ullt. Der resultierende pH-Wert lag bei 4,0.

Phosphatpu�er, 10 mM, mit 8 mM NaCl, pH 6,8

Zur Herstellung des das Milchsystem simulierenden Pu�ers ("Milchpu�er\) wurden

137,3 g Natriumdihydrogenphopshat sowie 21,8 g Dinatriumhydrogenphosphat und

49,5 g NaCl in bidestilliertem Wasser gel�ost, mit verd�unnter Ameisens�aure auf pH 6,8

eingestellt und auf 100 mL aufgef�ullt.

Trispu�er, 1,5 M, pH 8,8 (Trenngelpu�er)

Es wurden 18,171 g Tris in bidestilliertem Wasser gel�ost, mit konzentrierter Salzs�aure

auf pH 8,8 eingestellt und auf 100 mL aufgef�ullt.

Trispu�er, 1 M, pH 6,8 (Sammelgelpu�er)

6,057 g Tris wurden in bidestilliertem Wasser gel�ost, mit konzentrierter Salzs�aure auf

pH 6,8 eingestellt und auf 50 mL aufgef�ullt.

115


Probenpu�er nach L�ammli f�ur die eindimensionale SDS-PAGE

F�ur die Herstellung Probenpu�ers nach L�ammli wurden 2,5 mL eines 0,5 M Trispu�ers

(pH 8,5) mit 2,0 mL Glycerin, 0,31 g Dtt, 0,4 g Sds und einer kleinen Spatelspitze

Bromphenolblau versetzt. Anschlie�end wurde mit bidestilliertem Wasser auf 10 mL

aufgef�ullt.

Probenpu�er nach G�org f�ur die zweidimensionale SDS-PAGE

F�ur die Herstellung des Probenpu�ers nach G�org wurden 8,4 g Harnsto�, 3,04 g Thio-

harnsto�, 0,2 g Dtt, 0,4 g Chaps und 0,4 mL 40 % Bio-Lyte pH 3-10 mit Reinstwasser

auf 20 mL aufgef�ullt.

Rehydratisierungsl�osung

24 g Harnsto�, 154 mgDtt, 500 mg Chaps und 313 �L 40 % Bio-Lyte pH 3-10 wurden

mit Reinstwasser auf 50 mL aufgef�ullt.

Reduzierende �Aquilibrierl�osung

72 g Harnsto�, 60 g Glycerin, 4 g Sds, 100 mg Dtt und eine kleine Spatelspitze

Bromphenolblau wurden mit 0,05 M Trispu�er pH 8,8 auf 10 mL aufgef�ullt.

116

6.6 Methoden zur Analyse von Proteinmodi�kationen in Milchmodellen

6.6 Methoden zur Analyse von Molkenproteinmodi-

�kationen in Milchmodellen

6.6.1 Vorversuche zur Optimierung der experimentellen Parameter

Optimierung der Erhitzung der Molkenproteine mit Lactose

Zur Optimierung der Erhitzungsreihen wurden zwei verschiedene Temperaturen mit

unterschiedlichen Inkubationsdauern getestet (1 - 27 Tage bei 60 °C bzw. 30 - 90 min bei

120 °C). Beide f�uhrten zu deutlich detektierbarer Modi�zierung der Molkenproteine. Die

Wahl �el letztlich auf eine Temperatur von 60 °C, um die Denaturierung der Proteine

zu vermeiden. Um die Proteine nicht �uberm�a�ig und damit unrealistisch thermisch

zu belasten, beschr�ankte sich die Inkubation auf eine maximale Dauer von 14 Tagen.

Tabelle 6.1 gibt einen �Uberblick �uber den Bereich der Molarit�aten an Protein bzw.

Milchzucker, die f�ur die Inkubation getestet wurden.

Tab. 6.1: Optimierung der eingesetzten Molarit�aten an Molkenprotein bzw. Milchzucker f�urdie Inkubationsversuche

Molarit�at molares Verh�altnis

Protein : Lactose

�-Lactalbumin 44 - 529 �M 1:355 - 1:2956

�-Lactoglobulin 175 - 410 �M 1:458 - 1:1220

Lactose 130 - 500 mM

Alle aufgef�uhrten Ans�atze f�uhrten zu deutlich nachweisbarer Modi�zierung der Pro-

teine in unterschiedlichem Ausma�. F�ur die endg�ultigen Versuche wurden die Konzen-

trationen gew�ahlt, die dem System Milch am �ahnlichsten sind: 92 �M �-Lactalbumin,

175 �M �-Lactoglobulin und 144 mM Lactose.

Optimierung der Oxidation der Molkenproteine mit Wassersto�peroxid

F�ur die Erhitzungsversuche wurden die Konzentrationen der Molkenproteine in Milch

eingesetzt. Wassersto�peroxid wurde zu einer Endkonzentration in den L�osungen von

8,4 mM und 16,7 mM zugegeben. Die Inkubation erfolgte bei 120 °C f�ur 10 - 90 min, wo-

bei nach 30 min eine ausgesprochen starke Oxidation beobachtet wurde, die nicht mehr

117


realistisch f�ur Milchprodukte erschien. F�ur die endg�ultigen Versuche wurden daher die

Molkenproteinl�osungen mit 8,4 mM Wassersto�peroxid f�ur 10 - 30 min erhitzt.

Optimierung der Proteinspaltung

Zun�achst wurde eine chemische Spaltung der Proteine mit Bromcyan getestet. Daf�ur

wurden 7 mg Protein in 1 ml 70 %iger Tri uoressigs�aure in einem 50 ml Reaktionsgef�a�

gel�ost. Zu der L�osung wurden wenige Kristalle Bromcyan zugegeben und der Ansatz

wurde mit Sticksto� �uberschichtet. Die Reaktion erfolgte im Dunkeln �uber Nacht bei

Raumtemperatur. Nach Zugabe von 25 ml Wasser wurde die L�osung gefriergetrocknet.

Der R�uckstand wurde in 1 ml Wasser gel�ost, wovon 10 �L in einem Reaktionsgef�a� mit

1 �L 100 mM Dtt versetzt wurden. Nach 30 min erfolgte die massenspektrometrische

Vermessung (siehe unten).

�-Lactalbumin wurde unter diesen Bedingungen nicht gespalten. Auch eine Denatu-

rierung des Proteins vor der chemischen Spaltung lie� keine optimalen Spektren erwar-

ten, da aufgrund eines einzigen Methionins in der Sequenz zu gro�e Peptide entst�unden,

als dass eine ausreichende Au �osung der Signale erreicht werden k�onnte.

�-Lactoglobulin wurde an allen vier enthaltenen Methioninresten gespalten, wobei

die entsprechenden Fragmente detektiert werden konnten. Diese Methode zur Prote-

infragmentierung erschien jedoch ebenfalls nicht optimal, da die stark sauren Bedin-

gungen wohl den Nachweis von labilen Modi�kationen beeintr�achtigen k�onnten und die

entstandenen Signale �uberwiegend sehr hohe Massen aufwiesen, was erneut die Mess-

genauigkeit minimiert.

Als Alternative wurde eine partielle enzymatische Hydrolyse mit der Endoproteinase

GluC durchgef�uhrt, die spezi�sch C-terminal an Glutaminsresten und, mit geringerer

A�nit�at, an Asparagins�aure schneidet. Daf�ur wurden 4 mg Protein in 1 ml 25 mM

Phosphatpu�er pH 7,8 gel�ost. Davon wurden 5 �L mit 2 �L Wasser und 3 �L Enzym

(entsprechend 3 ug) versetzt und bis zu 15 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie-

�end wurde 1 �L einer 100 mM Dtt-L�osung zugesetzt und nach 30 min das Protein

massenspektrometrisch vermessen (siehe unten). Als Resultat wurden sehr gute Spek-

tren mit intensiven Signalen und gutem Signal-Rausch-Verh�altnis erhalten, nur waren

stets Natriumaddukte der Proteine detektierbar.

Alternativ wurde der Verdau auch in 25 mM Ammoniumbicarbonatpu�er pH 8,0

durchgef�uhrt, der Schritt zur Reduktion unterlassen oder das Protein anfangs in dena-

118


turierendem Pu�er (mit 1 M Harnsto� versetzt, darin zur vollst�andigen Denaturierung

des Proteins 5 Stunden stehen gelassen) durchgef�uhrt. Mit Hilfe des Ammoniumbicar-

bonatpu�ers wurde eine deutliche Verbesserung der Spektren erzielt, da keine st�orenden

Natriumaddukte auftraten und das Rauschen minimiert werden konnte. Die denaturie-

renden Verdau- bzw. die nicht reduzierenden Messbedingungen f�uhrten weder zu neuen

Informationen noch zu erh�ohter Spektrenqualit�at.

Weiterhin wurde die partielle enzymatische Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN

durchgef�uhrt, die spezi�sch N-terminal an Asparagins�aure und, in geringerem Ausma�,

an Glutamins�aure schneidet. F�ur den Verdau wurden dieselben Bedingungen wie f�ur

GluC getestet, jedoch wurden lediglich 0,2 �g des Enzyms verwendet. Auch hier ergab

die Verwendung von Ammoniumbicarbonatpu�er die besten Resultate. Ein Zeitver-

such, bei dem nach 2, 6, 10, 14 und 18 Stunden Proben gezogen wurden, zeigte, dass

nach 18 h der Verdau maximal war. Da die Endoproteinase AspN relativ teuer ist,

wurden die eingesetzten Protein- und Enzymmengen so weit gesenkt, dass einerseits

noch einwandfreie Spektren generiert werden konnten, andererseits aber die Menge an

AspN so gering wie m�oglich gehalten wurde. Im Vergleich zu den Spektren, die nach der

partiellen Hydrolyse mit GluC erhalten worden waren, zeigte sich, dass AspN f�ur die

Analyse der mit Lactose inkubierten Proteine geeigneter war, da mehr der modi�zierten

Peptide detektiert werden konnten.

Optimierung der Messung mittels MALDI-TOF-MS

Die erhaltenen Peptidl�osungen aus dem enzymatischen Verdau wurden in unterschied-

lichen Verh�altnissen mit einer ges�attigten �-Cyano-4-hydroxyzimts�aurel�osung in 50 %

Acetonitril / 0,1 % Tfa verd�unnt (1:50 - 1:2). Davon wurde zweimal je 1 �L auf einen

Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrocknet. Generell f�uhrte dies kaum zu Unter-

schieden in den Spektren. Insbesondere jedoch f�ur die zuletzt eingesetzten sehr geringen

absoluten Proteinmengen erwies sich eine Verd�unnung von 1:2 am geeignetsten, um eine

optimale Intensit�at der Signale zu gew�ahrleisten. Das Mischen der Cca-Matrix 1:1 mit

10 mM Ammoniumdihydrogenphosphat in 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa verbesserte

zus�atzlich noch das Signal-Rausch-Verh�altnis.

119


6.6.2 Erhitzen der Molkenproteine im Milchmodell

Das Erhitzen der Molkenproteine im Modellsystem erfolgte im Doppelansatz. Daf�ur

wurden 19,5 mg �-Lactalbumin und 740 mg Lactose in 15 mL eines milchsimulieren-

den Pu�ers (10 mM Natriumphosphatpu�er mit 8 mM NaCl, pH 6,8) gel�ost. Au�er-

dem wurden 24 mg �-Lactoglobulin mit 370 mg Lactose in 7,5 mL des Milchpu�ers

gel�ost. Die L�osungen wurden bei einer Temperatur von 60 °C im Sch�uttelwasserbad

erhitzt. Nach 3, 7 und 14 Tagen wurden Proben gezogen, in Eis abgek�uhlt und ge-

gen bidestilliertes Wasser dialysiert (Mwco 8000-10000 Da). Anschlie�end erfolgte die

Gefriertrockung der Proteine. Dar�uber hinaus wurden L�osungen der Molkenproteine

im Milchpu�er ohne den Zusatz von Lactose 14 Tage lang bei 60 °C erhitzt (erhitzte

Kontrolle).

6.6.3 Oxidation der Molkenproteine

F�ur die Oxidation der Molkenproteine wurden L�osungen aus 19,5 mg �-Lactalbumin

in 15 mL bzw. 24 mg �-Lactoglobulin in 7,5 mL Milchpu�er mit 8,4 mM H2O2 im

Trockenschrank bei 120 °C f�ur 10, 20 und 30 min erhitzt. Die anschlie�ende Behand-

lung erfolgte wie oben beschrieben im Milchmodell. Als Kontrolle wurden L�osungen

der Proteine ohne Zugabe von Wassersto�peroxid 30 min bei 120 °C erhitzt (erhitzte

Kontrolle). Die Durchf�uhrung des Oxidationsexperiments erfolgte ebenfalls im Doppel-

ansatz.

6.6.4 Partielle enzymatische Proteinhydrolyse mit den Endo-

proteinasen AspN und Trypsin

2 mg der glykierten bzw. oxidierten Proteine wurden in 500 �L 25 mM Ammoniumbi-

carbonatpu�er pH 8,0 gel�ost. 5 �L dieser L�osungen (entsprechend 20 �g Protein) und

5 �L (0,2 �g) Endoproteinase AspN (bei �-Lactalbumin) bzw. 2,5 �L (0,1 �g) AspN

und 2,5 �L Reinstwasser (bei �-Lactoglobulin) wurden 18 h bei 37 °C inkubiert. F�ur

den Trypsinverdau wurden 5 �L der L�osung des oxidierten �-Lactalbumins (20 �g)

mit 2 �L Trypsin (0,2 �g) versetzt und 15 h bei 37 °C inkubiert. Die Peptide aus der

Hydrolyse wurden im Anschluss durch Zugabe von 1 �L 100 mM Dtt 30 min bei

Raumtemperatur reduziert.

120


6.6.5 Vermessung der Proben mittels MALDI-TOF-MS

F�ur dieMaldi-Tof-Ms-Analyse der intakten Proteine wurden 5 �L der Proteinl�osun-

gen mit 1 �L 100 mM Dtt reduziert. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden 2 �L

der reduzierten Proben mit 2 �L Dhap-Matrix verd�unnt. F�ur die Dhap-Matrix wurde

eine ges�attigte 2,5-Dihydroxyacetophenonl�osung in 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa 4:1

mit einer 10 �M Diammoniumhydrogencitratl�osung in 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa

gemischt. Je 1 �L der Verd�unnungen wurde zweimal auf einen Stahltr�ager pipet-

tiert und an der Luft getrocknet. F�ur die Messung der Peptide wurde 1 �L des re-

duzierten Enzymverdaus mit 14 �L Cca-Matrix verd�unnt. Diese wurde durch 1:1-

Mischung einer ges�attigten L�osung von �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure in 50 % Aceto-

nitril / 0,1 % Tfa und einer 10 mM Ammoniumdihydrogenphosphatl�osung in 50 %

Acetonitril / 0,1 % Tfa erhalten. Je 1 �L der Verd�unnungen wurde zweimal auf einen

Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrocknet.

DieMaldi-Tof-Ms-Analyse erfolgte an einem Bruker Auto ex mit einem Sticksto�-

Laser (� = 337 nm). Die Messung der intakten bzw. verdauten Proteine erfolgte mit

verz�ogerter Extraktion (350 bzw. 140 ns). Nach Beschleunigung bei 20 kV wurden

laserdesorbierte positive Ionen im linearen (intakte Proteine) bzw. bei 19 kV im Re-

ektormodus (Peptide) gemessen. Die externe Kalibrierung wurde mit einer selbst her-

gestellten Proteinmischung aus bovinem �-Lactalbumin, H�uhnerlysozym, bovinem �-

Lactoglobulin A und B bzw. einer kommerziellen Peptidmischung aus Angiotensin I und

II, Substanz P, Bombesin, ACTH Fragment 1-17 und 18-39 und Somatostatin durch-

gef�uhrt. F�ur jedes der abgebildeten Spektren wurden mindestens 150 Einzelspektren

von unterschiedlichen Stellen des Auftragepunktes summiert.

6.6.6 Proteindatenbanksuche

Die Zuordnung der gemessenen Signale zu den zugeh�origen Aminos�auresequenzen im

Protein erfolgte mit Hilfe des frei zug�anglichen Programms"Peptide Mass\ von der

Internetseite www.expasy.org [7]. Folgende Suchparameter wurden eingesetzt: Mono-

isotopische Massen wurden als [M+H]+ angezeigt. Cysteinreste blieben unmodi�ziert.

Als Enzym wurde AspN und AspN + N-terminal Glu bzw. Trypsin gew�ahlt. Eine

verpasste Schnittstelle wurde zugelassen. Angezeigt wurden Peptide mit einer Masse

>750 Da.

121


6.7 Methoden zur massenspektrometrischen Analyse

der Proteinmodi�kationen in Milch und Milch-

produkten

6.7.1 Untersuchung von Modi�kationen an intakten Molken-

proteinen in Milch und Milchprodukten

6.7.1.1 Milchproben

Als Kontrolle f�ur alle in Kapitel 6.7 beschriebenen Versuche diente Rohmilch, die di-

rekt nach dem Melken bei einem lokalen Bauern abgeholt, sofort entfettet und bis zu

den weiteren Versuchen bei -80 °C gelagert wurde. Zur Analyse der Modi�kationen in

Handelsproben wurde eine hocherhitzte (Esl-) Milch, zwei ultrahocherhitzte (Uht-)

Milchproben, eine Sterilmilch, eine sterilisierte Kondensmilch, drei �ussige Folgemilch-

produkte f�ur S�auglinge und eine Folgemilch f�ur S�auglinge in Pulverform herangezogen.

Von letzterer wurden 2 g mit 12 mL Reinstwasser versetzt und im Ultraschallbad zur

maximalen L�osung gebracht.

6.7.1.2 Entfetten der Milchproben

Die Rohmilch bzw. kommerziell erworbenen Milchproben wurden zun�achst durch Zen-

trifugation (3850 rpm, 4 °C, 60 min) entfettet. Die oben schwimmende Fettschicht

wurde mit Hilfe eines Analysenl�o�els entfernt. Die entfetteten Proben wurden bis zur

weiteren Verarbeitung bei -20 °C gelagert.

6.7.1.3 Direkte Vermessung mittels MALDI-TOF-MS

Die entfetteten Milchproben wurden 1:100 mit Reinstwasser verd�unnt. Diese L�osung

wurde f�ur die Messung von �-Lactalbumin 2+2 mit einer Cca/Dhb-Matrix verd�unnt.

F�ur die Herstellung dieser Matrix wurde eine Cca-Stamml�osung aus 20 mg Cca in

1 mL Acetonitril / 5 % Ameisens�aure (70:30), sowie eine Dhb-Stamml�osung aus 20 mg

2,5-Dihydroxybenzoes�aure in 1 mL Acetonitril / 0,1 % Tfa (70:30) hergestellt, die im

Verh�altnis 1:1 gemischt wurden. F�ur die Messung von �-Lactoglobulin wurden die Pro-

ben 2+2 mit einer Dhap-Matrix (s. S. 121) verd�unnt. Je 1 �L der Probenverd�unnungen

wurde zweimal auf einen Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrocknet.

122

6.7 Methoden zur Analyse der Proteinmodi�kationen in Milchprodukten

Die Messung der Milchproteine erfolgte mit verz�ogerter Extraktion (350 ns). Nach

Beschleunigung bei 19 kV wurden laserdesorbierte positive Ionen im linearen Modus ge-

messen. Die externe Kalibrierung wurde mit einer Proteinmischung aus �-Lactalbumin,

H�uhnerlysozym sowie �-Lactoglobulin A und B durchgef�uhrt. F�ur jedes der abgebilde-

ten Spektren wurden 300 Einzelspektren von unterschiedlichen Stellen des Auftrage-

punktes summiert.

6.7.1.4 Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nach metalla�nit�atschromatogra-

phischer Aufreinigung

F�ur die metalla�nit�atschromatographische Aufreinigung der Milchproben f�ur die Ver-

messung mittels Maldi-Tof-Ms kamen kommerziell erh�altliche Imac-Cu-Kits zum

Einsatz. Die Durchf�uhrung erfolgte gem�a� der Anleitung des Herstellers. 5 �L der Sus-

pension mit den magnetischen Partikeln wurden dreimal mit je 50 �L Cu-bindender

L�osung gereinigt. In 20 �L der Bindel�osung wurden dann 5 �L Probe zu den mag-

netischen Partikeln gegeben, vorsichtig gemischt und 5 min lang stehen gelassen. An-

schlie�end wurden die magnetischen Partikel dreimal mit je 100 �L Waschl�osung ge-

waschen. Im letzten Schritt wurden die Peptide und Proteine der Milch in 10 �L der

Elutionsl�osung wieder von den magnetischen Partikeln gel�ost. 2 �L der Elutionsl�osung

wurden mit 2 �L der Cca/Dhb-Matrix (siehe S. 122) verd�unnt und wie in Kapitel

6.7.1.3 beschrieben vermessen.

6.7.2 Methoden zur Proteinisolierung f�ur den anschlie�enden

partiellen enzymatischen Verdau

6.7.2.1 Isolierung von Proteinen mittels Immunoa�nit�atschromatographie

Die Isolierung von Proteinen mittels Immunoa�nit�atschromatographie wurde mit Hilfe

eines kommerziell erh�altlichen Kits durchgef�uhrt. An die enthaltenen magnetischen

Partikel ist das aus Bakterien gewonnene Protein G immobilisiert, das unspezi�sch an

eine Vielzahl von Antik�orpern bindet. Als Standard diente eine w�assrige L�osung aus

�-Lactalbumin der Konzentration 2,4 mg/mL, die 1:10 mit Wasser verd�unnt worden

war. Zudem wurde Rohmilch sowie eine pasteurisierte Milch, die 300 min bei 70 °C

erhitzt worden war, aufgereinigt.

Die Aufreinigung wurde nach Anleitung des Herstellers durchgef�uhrt. Daf�ur wurden

15 �L der Suspension mit den magnetischen Partikeln zum Waschen zweimal mit je

123


100 �L Immobilisierungspu�er versetzt. Anschlie�end wurden 35 �L des Immobilisie-

rungspu�ers sowie 15 �L eines Antik�orpers gegen �-Lactalbumin (c = 1 mg/mL) zu

den magnetischen Partikeln gegeben und vorsichtig gemischt. Zur vollst�andigen Bin-

dung der Antik�orper an das Protein G wurde eine Stunde bei Raumtemperatur auf

dem Mikrotitersch�uttler inkubiert. Nach der Inkubation wurde zweimal mit je 100 �L

Immobilisierungspu�er, anschlie�end zweimal mit je 100 �L Antigen-Bindepu�er ge-

waschen. Daraufhin folgte die Antigen-Antik�orper-Reaktion, indem die magnetischen

Partikel in 10 �L Antigen-Bindepu�er resuspendiert und mit 5 �L Probe versetzt wur-

den. Es wurde f�ur zwei Stunden bei Raumtemperatur auf dem Sch�uttler inkubiert.

Im Folgenden wurde zweimal mit je 100 �L Antigen-Bindepu�er sowie zweimal mit je

100 �L Waschl�osung gewaschen. Abschlie�end wurde 20 min in 10 �L Elutionsl�osung

inkubiert. Die Elutionsl�osung wurde 2+2 mit Cca/Dhb-Matrix (siehe S. 122) ver-

setzt. Davon wurde zweimal je 1 �L auf einen Stahltr�ager pipettiert und an der Luft

getrocknet.

Als Kontrolle wurden die nicht aufgereinigten Proben vermessen. Daf�ur wurden die

Milchproben zus�atzlich 1:100 mit bidestilliertem Wasser ved�unnt. Die Proben wurden

dann 2+2 mit Cca/Dhb-Matrix (siehe S. 122) versetzt und davon wurde 1 �L auf

einen Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrocknet.

Die Vermessung der intakten Proteine mittels Maldi-Tof-Ms erfolgte im linearen

Modus mit verz�ogerter Extraktion (350 ns) und Beschleunigung der positiven Ionen bei

19 kV. Kalibriert wurde gegen einen Proteinmix aus �-Lactalbumin, H�uhnerlysozym

sowie �-Lactoglobulin A und B. Dargestellte Spektren resultieren aus der Summierung

von 300 Einzelspektren.

F�ur den Versuch, das isolierte �-Lactalbumin einer f�ur 30 min bei 120 °C erhitzten

Rohmilch zu verdauen, wurde die Aufreinigung zus�atzlich mit dem optionalen Schritt

B des Herstellerprotokolls durchgef�uhrt und der Antik�orper mit Hilfe von Dimethylpi-

melimidat mit dem Protein G quervernetzt. Nach der Aufreinigung wurde das Eluat an

der Lyophylle getrocknet und der R�uckstand wurde in 8,5 �L 25 mM Ammoniumbicar-

bonatpu�er pH 8,0 gel�ost. Die Inkubation mit 0,06 �g AspN erfolgte f�ur 16 h bei 37 °C.

2 �L der Verdaul�osung wurden mit 2 �L einer ges�attigten �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure

in 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa verd�unnt und wie in Kapitel 6.6.5 vermessen.

Die Aufreinigung eines �-Lactoglobulin-Standards bzw. einer Rohmilch unter Ver-

wendung eines Antik�orpers gegen �-Lactoglobulin erfolgte nach demselben Protokoll.

Als Standards dienten eine 1:5, 1:10, 1:50 sowie eine 1:100 Verd�unnung einer w�assrigen

124


Stamml�osung aus �-Lactoglobulin der Konzentration 2 mg/ml. Rohmilch wurde sowohl

unverd�unnt als auch 1:10, 1:100 und 1:150 verd�unnt f�ur die Aufreinigung eingesetzt.

6.7.2.2 Auftrennung von Proteinen mittels eindimensionaler SDS-PAGE

Die gelelektrophoretische Auftrennung von Milch wurde nach dem Protokoll von Laemm-

li [155] durchgef�uhrt. Rohmilch wurde 1:10 mit L�ammli-Probenpu�er (siehe S. 116)

verd�unnt und zur Reduzierung vorhandener Disul�dbr�ucken 15 min bei Raumtempe-

ratur stehen gelassen. Von dieser Verd�unnung wurden 10, 5 und 2,5 �L pro gro�er

Geltasche f�ur die Gelelektrophorese eingesetzt. Die Trennung der Proteine erfolgte mit

Hilfe eines 15 % Trenngels. Daf�ur wurden 1,15 mL bidestilliertes Wasser, 2,45 mL einer

30 %igen Acrylamid/Bis-L�osung, 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 50 �L 10 % Sds-L�osung,

2 �L Temed und 50 �L 10 % Aps gemischt und ein Gel der Dicke 0,75 mm gegossen.

F�ur die Herstellung eines Sammelgels zur Konzentrierung der Proben im Gel wurden

2,1 mL bidestilliertes Wasser, 500 �L Acrylamid/Bis-L�osung 30 %, 380 �L 1 M Tris

pH 6,8, 30 �L 10 % Sds-L�osung, 3 �L Temed und 20 �L 10 % Aps verwendet. Die

Gelelektrophorese wurde zun�achst f�ur 20 min bei 80 V, dann f�ur 60 min bei 150 V

durchgef�uhrt. Anschlie�end wurde das Gel dreimal je 5 min in bidestilliertem Wasser

gewaschen und f�ur 60 min in BioSafe Coomassie-F�arbel�osung gef�arbt. Im letzten Schritt

wurde das Gel dreimal mindestens je 15 min in bidestilliertem Wasser gewaschen. Zur

maximalen Polymerisierung wurden die gegossenen Gele stets in feuchte Frischhaltefolie

gewickelt und �uber Nacht im K�uhlschrank gelagert, um eine Acrylamidadduktbildung

der zu analysierenden Proteine zu minimieren.

6.7.2.3 Auftrennung von Proteinen mittels zweidimensionaler SDS-PAGE

Die isoelektrische Fokussierung der zweidimensionalen Sds-Page wurde mit kommer-

ziell erh�altlichen Gelstreifen der L�ange 7 cm mit immobilisiertem pH-Gradienten (Ipg-

Streifen) von pH 3-6 durchgef�uhrt. Die Streifen wurden �uber Nacht aktiv bei 50 V

rehydratisiert. Hierf�ur wurden pro Rille 115 �L Rehydratisierungsl�osung (siehe S. 116)

und 10 �L einer 1:20-Verd�unnung von Rohmilch in Probenpu�er (siehe S. 116) in

den Fokussierungseinsatz gegeben und der Ipg-Streifen aufgelegt. Die Fokussierung

der Proteine an ihren isoelektrischen Punkt erfolgte bei maximalem Spannungsanstieg

zun�achst 30 min bei 150 V, 30 min bei 500 V und 30 min bei 1000 V. Im letzten

Schritt wurde f�ur 6000 Vh fokussiert; hierbei wurde eine maximale Spannung von ca.

125


2200 V (bei einer maximal zul�assigen Stromst�arke von 0,05 mA pro Streifen) erreicht.

Im Anschluss an die Fokussierung wurden die Streifen mit Wasser abgewaschen und

f�ur 15 min bei Raumtemperatur in reduzierender �Aquilibrierungsl�osung (siehe S. 116)

gesch�uttelt. Die Streifen wurden danach kurz mit Wasser abgewaschen und plan auf ein

zuvor gegossenes 15 %iges Trenngel (siehe S. 125) gelegt. Zur Fixierung des Streifens

wurde 1 %ige Agarosel�osung �uber den Streifen pipettiert. Die Gelelektrophorese wur-

de f�ur 75 min bei 150 V durchgef�uhrt. Danach wurde das Gel mit Wasser gewaschen,

mit kommerzieller Coomassiel�osung gef�arbt und erneut mit Wasser gewaschen, bis der

Hintergrund des Gels klar war.

Die zweidimensionale Auftrennung der glykierten Modellproteine erfolgte analog.

Daf�ur wurden je 2 mg der Standards bzw. der glykierten Proteine in 500 �L bidestil-

liertem Wasser gel�ost und mit Probenpu�er 1:4 verd�unnt. Davon wurden 5 �L (ent-

sprechend 5 �g Protein) pro Streifen eingesetzt; die Rehydratisierung erfolgte dann

mit 120 �L Rehydratisierungsl�osung, so dass wieder ein Gesamtvolumen von 125 �L

erhalten wurde.

6.7.3 Analyse der Modi�kationen an �-Lactoglobulin in Milch und

Milchprodukten nach gelelektrophoretischer Auftrennung

und partieller enzymatischer Hydrolyse

6.7.3.1 Milchproben

Als Proben dienten die in Kapitel 6.7.1.1 beschriebenen entfetteten Milchprodukte.

6.7.3.2 Erhitzen der Rohmilch

F�ur die Erhitzungsreihe von Rohmilch wurden je 200 �L der entfetteten Rohmilch in

1,5 mL Reaktionsgef�a�e mit Schraubverschluss pipettiert und 10, 20, 30, 40, 50 und

60 min bei 120 °C im Trockenschrank inkubiert. Nach jeder Probenahme wurde das

Reaktionsgef�a� in Eis abgek�uhlt. Die Erhitzung erfolgte im Doppelansatz.

6.7.3.3 Auftrennung der Milchproteine mittels SDS-PAGE

Die Auftrennung der Milchproteine wurde wie in Kapitel 6.7.2.2 beschrieben durch-

gef�uhrt. Es wurden je 10 �L der gem�a� Tab. 6.2 mit L�ammli-Probenpu�er verd�unnten

Proben pro gro�er Tasche eingesetzt.

126


Tab. 6.2: Verd�unnungsfaktoren der Milchproben f�ur die eindimensionale Sds-Page

Probe Verd�unnungsfaktor

Rohmilch 10

erhitzte Rohmilch 10

Esl-Milch 10

Uht-Milch 1 10

Uht-Milch 2 10

Sterilmilch 5

Kondensmilch 10

S�auglingsnahrung 1 ( �ussig) 10

S�auglingsnahrung 2 (gel�ost) 10

6.7.3.4 Partielle enzymatische Hydrolyse der Proteine im Gel mit AspN

Aus dem gef�arbten und ausgiebig gewaschenem Gel wurde mit Hilfe eines Skalpells

die gew�unschte Bande des �-Lactoglobulins ausgeschnitten und in St�ucke der Gr�o�e

ca. 1 mm x 1 mm gew�urfelt. Die Gelst�uckchen wurden in 1,5 mL Reaktionsgef�a�e

�uberf�uhrt und zweimal kurz mit Reinstwasser gewaschen. Anschlie�end wurden zwei-

mal je 100 �L Acetonitril hinzupipettiert und nach kurzem Einwirken mit der Pipette

abgezogen. Es erfolgte ein �Aquilibrierungsschritt mit 100 �L 25 mM Ammoniumbicar-

bonatpu�er pH 8,0, der ebenfalls nach kurzer Einwirkzeit wieder abgezogen wurde. Zur

Entf�arbung wurden 100 �L Acetonitril sowie 100 �L 25 mM Ammoniumbicarbonat-

pu�er pH 8,0 hinzugef�ugt und es wurde 30 min bei Raumtemperatur gesch�uttelt. Nach

der H�alfte der Zeit wurde die Entf�arbel�osung gewechselt. Nach diesem Schritt sollten

die Gelst�uckchen gr�o�tenteils farblos sein, ansonsten wurde der Entf�arbevorgang fort-

gesetzt. Das entf�arbte Gel wurde durch zweimalige Zugabe von je 100 �L Acetonitril

von Wasser befreit und 15 min im Abzug getrocknet, bis keine Fl�ussigkeitsreste mehr

erkennbar waren. Der Inhalt eines Glasgef�a�es mit der Endoproteinase AspN (2 �g)

wurde in 60 �L Reinstwasser gel�ost. Davon wurden 3 �L zu jeder Probe gegeben, wo-

bei darauf geachtet wurde, dass stets die komplette Enzyml�osung in die Gelst�uckchen

einzog. Zur vollst�andigen Quellung des Gels mit der Enzyml�osung wurde der Ansatz

10 min im K�uhlschrank inkubiert. Anschlie�end wurde in jedes Reaktionsgef�a� so viel

25 mM Ammoniumbicarbonatpu�er pipettiert, dass die Gelst�uckchen gerade bedeckt

waren. Es folgte die Inkubation bei 37 °C im Trockenschrank f�ur 18 Stunden.

127


Da die Messung von �-Lactalbumin nach Verdau im Gel stets Probleme bereitete,

wurde nach Fehlerquellen gesucht. Vorstellbar w�are an dieser Stelle, dass das Enzym

durch die Gelmatrix nur ungen�ugenden Zugang zum Protein hat und somit in der

Hydrolyse beeintr�achtigt wird. Dagegen spricht, dass das Enzym aufgrund der gerin-

gen Molek�ulgr�o�e ohne gr�o�ere Probleme ins Gel einzudringen verm�ogen sollte. Zudem

sollte dann der Verdau in erster Linie nur verz�ogert werden, das hei�t nach verl�anger-

ter Inkubation sollte ein vergleichbares Ergebnis wie bei Verdau in L�osung erhalten

werden. Dies war allerdings nicht der Fall. Daraus wird geschlossen, dass ein eventuell

behinderter Zugang des Enzym zum Protein nicht ausschlaggebend f�ur die Probleme

beim In-Gel-Verdau von �-Lactalbumin war.

Um zu testen, ob das Enzym durch Gelbestandteile inhibiert oder anderweitig be-

eintr�achtigt wird, wurde einerseits �-Lactalbumin im Gel"getrennt\ und mit AspN

versetzt, andererseits wurde die gleiche Proteinmenge in L�osung zu leerem Gel gegeben

und verdaut. Parallel erfolgte als Kontrolle ein Verdau des Standards in L�osung. Zu er-

warten waren entweder vergleichbar mangelhafte Spektren, wenn Substanzen aus dem

Gel die Hydrolyse beintr�achtigen, oder Unterschiede in den Spektren, die dann damit

zu erkl�aren w�aren, dass die Einbettung der Proteine in die Gelmatrix einen problema-

tischen Faktor darstellt. Beide Ans�atze mit Gel f�uhrten bei �-Lactalbumin zu keinen

befriedigenden Spektren, da nicht die vom Verdau in L�osung gewohnte Intensit�aten-

verteilung der Signale erhalten wurde und einzelne Peptide dominierten. Das Gel hatte

somit den Versuch beeintr�achtigt. Gleichzeitig wiesen aber die beiden Proben, die in

Anwsenheit von Polyacrylamid enzymatisch hydrolysiert wurden, Unterschiede zuein-

ander auf. Daraus wurde geschlossen, dass die St�orung durch Gelbestandteile nicht die

einzige Fehlerquelle darstellt, sondern noch andere Faktoren Ein uss haben.

6.7.3.5 Elution der Peptide aus dem Gel

F�ur die Elution der Peptide aus dem Gel wurden nach dem Verdau in jedes Reaktions-

gef�a� 100 �L 60 % Acetonitril pipettiert. Nach kurzen Mischen auf dem Vortexer wur-

den die Proben 15 min stehen gelassen und erneut gemischt. Die �uberstehende L�osung

wurde in ein sauberes 1,5 mL Reaktionsgef�a� pipettiert. Zu den Gelst�uckchen wurden

100 �L 80 % Acetonitril / 0,1 % Tfa gegeben. Nach Vortexen, 15 min�utiger Wartezeit

und erneutem Vortexen wurde die Elutionsl�osung mit dem ersten Anteil vereinigt. Ab-

schlie�end wurden die Gelst�uckchen f�ur 10 min in 100 �L Acetonitril inkubiert und so

128


von letzten L�osungsresten befreit. Das �uberstehende Acetonitril wurde zu den anderen

Elutionsl�osungen gegeben. Die L�osungen wurden dann bei -80 °C eingefroren, um sie

anschlie�end an der Lyophylle zu trocknen.

Alternativ wurde versucht, die Elution der Peptide f�ur die Analyse von �-Lactalbumin

zu optimieren. Daf�ur wurde als Elutionsl�osung eine Mischung (5:50:45) aus Essigs�aure,

Acetonitril und Wasser eingesetzt, mit der zweimal mit je 200 �L f�ur 20 min im Ultra-

schallbad die Peptide aus dem Gel eluiert wurden. Abschlie�end wurde ebenfalls mit

100 % Acetonitril inkubiert. Es ergab sich keine Verbesserung der Spektren. Auch aus

einem 13 %igen Trenngel lie�en sich die Peptide nicht besser eluieren, so dass auch die

relativ engen Poren, die eine Elution der Peptide erschwert haben k�onnten, als Ursache

f�ur die mangelhaften Spektren bei �-Lactalbumin ausgeschlossen wurden.

Ein Ansatz mit leerem Gel, das mit Proteinl�osung versetzt wurde, resultierte in un-

terschiedlichen Spektren im Vergleich zu einem Ansatz mit einem Protein, das durch

Sds-Page getrennt worden und somit in die Matrix eingebettet war. Im Gegensatz da-

zu war bei ersterem anzunehmen, dass das Protein neben der Matrix vorlag. Auch bei

dem Ansatz, bei dem Proteinl�osung zum Gel gegeben worden war, wurden h�ohermo-

lekulare Peptide (>2000 Da) nur in relativ geringer Intensit�at gemessen. Dies spricht

daf�ur, dass die Peptide z. B. �uber Adsorptionsvorg�ange an das Gel gebunden waren

und somit trotz hydrophober Bedingungen nicht eluiert worden waren. Gegen diese

Hypothese sprechen allerdings verschiedene Versuche, bei denen die niedermolekularen

Peptide nur in geringer Intensit�at gemessen wurden und gr�o�ere Peptide dominierten.

Um zu verhindern, dass eventuell Peptide an der Kunststo�wand der Reaktions-

gef�a�e anhaften und somit verloren gehen, wurden silikonisierte Gef�a�e getestet, die

laut Herstellerangabe dies minimieren. Dabei wurde keine Verbesserung beobachtet.

6.7.3.6 Aufreinigung der eluierten Peptide f�ur die Messung

Der bei der Trocknung erhaltene R�uckstand wurde in 10 �L 0,1 % Tfa gel�ost und

durch Zugabe von 1 �L 100 mM Dtt 30 min lang bei Raumtemperatur reduziert.

Die reduzierte Peptidl�osung wurde im Folgenden an C18-Zip Tips chromatographisch

aufgereinigt. Daf�ur wurden die Zip Tips zweimal mit 10 �L Acetonitril befeuchtet und

zweimal mit 10 �L 0,1 % Tfa �aquilibriert. Anschlie�end wurden durch zehnmaliges

Aufziehen der Probe die Peptide an das C18-Material gebunden. Mit jeweils f�unfmali-

gem Aufziehen von 10 �L 0,1 % Tfa bzw. 5 % Methanol / 0,1 % Tfa wurden die Zip

129


Tips von Salzen und anderen St�orsubstanzen befreit. Die Elution der Peptide erfolgte

mit 10 �L 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa.

Um zu testen, ob die Zip Tip-Aufreinigung zu Verlusten f�uhrt, wurden sie einer-

seits beim In-Gel-Verdau weggelassen. Die dabei generierten Spektren wiesen jedoch

wohl aufgrund der zu hohen Konzentration an St�orsubstanzen unzureichendes Signal-

Rausch-Verh�altnis auf; teilweise kristallisierten die Proben nicht mehr aus, so dass

keine Messung m�oglich war. Andererseits wurde zus�atzlich im Anschluss an die oben

beschriebene Aufreinigung noch mit 75 % Acetonitril eluiert, um hydrophobe Peptide

von dem C18-Material zu l�osen. Dies f�uhrte jedoch ebenfalls zu keiner guten Kristal-

lisation der Probe auf dem Stahltr�ager. Eine Standardl�osung von �-Lactalbumin, die

�uber Zip Tip-S�aulchen aufgereinigt wurde, zeigte jedoch keine Unterschiede im Spek-

trum im Vergleich zur direkten Vermessung. Daher wurde davon ausgegangen, dass die

Aufreinigung keine signi�kante Fehlerquelle des Protokolls darstellt.

6.7.3.7 MALDI-TOF-MS-Messung der Peptide

Von den bei der Zip Tip-Aufreinigung erhaltenen Eluaten wurden 2 �L mit 2 �L Cca-

Matrix verd�unnt (siehe S. 121). Je 1 �L der Verd�unnung wurde zweimal auf einen

Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrocknet. Die Messung der Peptide erfolgte

mit verz�ogerter Extraktion (140 ns f�ur Peptide >2000 Da, 80 ns f�ur Peptide <2000 Da).

Nach Beschleunigung bei 19 kV wurden laserdesorbierte positive Ionen im Re ektormo-

dus gemessen. Die externe Kalibrierung wurde mit einer kommerziellen Peptidmischung

aus Angiotensin I und II, Substanz P, Bombesin, ACTH Fragment 1-17 und 18-39 und

Somatostatin durchgef�uhrt. F�ur jedes der abgebildeten Spektren wurden mindestens

300 Einzelspektren von unterschiedlichen Stellen des Auftragepunktes summiert.

Grundvoraussetzung f�ur einwandfreie Spektren waren stets optimale Kristalle, die je-

doch bei Ans�atzen mit �-Lactalbumin oft nicht erreicht wurden. Die mangelnde Repro-

duzierbarkeit ist wohl daher zu gro�em Anteil auf die Messung selbst zur�uckzuf�uhren.

Es konnte allerdings nicht endg�ultig gekl�art werden, worin die Ursachen daf�ur lagen.

6.7.3.8 Proteindatenbanksuche

Die Proteindatenbanksuche erfolgte f�ur die Zuordnung der Signale zu den nativen Pep-

tiden analog zu den Modellmischungen (s. Kap. 6.6.6). Zur Identi�zierung von Modi�-

kationen wurde das Programm"Peptide Mass\ verwendet.

130

6.8 Methoden zur Analyse der niedermolekularen Proteinfraktion in Milch

6.7.3.9 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Microsoft O�ce Excel 2003.

Die Signi�kanzniveaus wurden mit einem zweiseitigen, ungepaarten Student T-Test

berechnet.

6.8 Methoden zur massenspektrometrischen Analyse

der niedermolekularen Proteinfraktion in Milch

6.8.1 Milchproben

Rohmilch wurde direkt nach dem Melken von einem lokalen Bauern bezogen. Esl- und

Uht-Milch stammte von der Domspitz GmbH in Regensburg. Diverse pasteurisierte,

hocherhitzte und ultrahocherhitzte Milchproben wurden bei verschiedenen Superm�ark-

ten erworben.

6.8.2 Entfetten der Milchproben

Die Rohmilch bzw. kommerziell erworbenen Milchproben wurden zun�achst durch Zen-

trifugation (3850 rpm, 4 °C, 60 min) entfettet. Die oben schwimmende Fettschicht

wurde mit Hilfe eines Analysenl�o�els entfernt.

6.8.3 Isolierung von Casein- und Molkenfraktion der Rohmilch

Zur Isolierung der Casein- und Molkenfraktion wurden 2 mL Rohmilch mit 250 �L

0,5 M Natriumacetatpu�er pH 4,0 versetzt. Die pH-Kontrolle ergab einen resultie-

renden pH-Wert von 4,6. Der Ansatz wurde zum Durchmischen geschwenkt und zur

vollst�andigen Pr�azipitation 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschlie�end

wurde 2 min bei 3850 rpm und 4 °C zentrifugiert. Um letzte Protein ocken aus dem

Zentrifugat zu entfernen, wurde dieses durch Spritzen�lter (PVDF; 0,45 �m) �ltriert.

Das Filtrat mit den enthaltenen Molkenproteinen wurde mit Koh auf pH 6,8 ein-

gestellt und direkt f�ur die Inkubation eingesetzt. Die Caseine wurden zum Waschen

noch zweimal mit 2 mL 0,1 M Natriumacetatpu�er pH 4,6 versetzt und erneut abzen-

trifugiert. Abschlie�end wurde der R�uckstand in milchsimulierendem Pu�er (10 mM

Natriumphosphatpu�er mit 8 mM NaCl, pH 6,8) suspendiert. Diese Suspension wurde

f�ur die Erhitzung verwendet.

131


6.8.4 Erhitzen der Rohmilch, der Casein- und der Molkenfraktion

Die im Folgenden beschriebenen Erhitzungsreihen wurden in Dreifachbestimmung durch-

gef�uhrt. Daf�ur wurden 0,2 mL der Rohmilch in 2 mL Reaktionsgef�a�e mit Schraub-

verschluss pipettiert und bei 72 °C, 80 °C und 120 °C im Trockenschrank erhitzt.

Die Inkubation der Molkenl�osung bzw. Caseinsuspension erfolgte analog, jedoch aus-

schlie�lich bei einer Temperatur von 120 °C. Nach 10, 20 und 30 min wurden jeweils

Reaktionsgef�a�e entnommen und sofort in Eis abgek�uhlt.

6.8.5 Lagerversuche mit hocherhitzter, ultrahocherhitzter und

sterilisierter Milch

F�ur die Lagerversuche wurde hocherhitzte und ultrahocherhitzte Milch bei der Domspitz-

Milch GmbH in Regensburg am Tag der Produktion erworben bzw. Sterilmilch im Han-

del erworben. Die hocherhitzte Milch wurde bis zu 21 Tage, d. h. bis zum Ende des

vom Hersteller angegebenen Mindesthaltbarkeitsdatums bei 4 °C gelagert. Die Lage-

rung der ultrahocherhitzten bzw. sterilisierten Milch erfolgte bei Raumtemperatur bis

zu 12 Wochen (Ende des Mindesthaltbarkeitsdatums der Uht-Milch). Zur Probenahme

wurden neue Milcht�uten ge�o�net, die Milch wie auf S. 131 beschrieben entfettet und

bis zur Aufreinigung und Vermessung bei -20 °C gelagert. Die Lagerversuche erfolgten

im Dreifachansatz.

6.8.6 Aufreinigung der Milchproteine mittels immobilisierter

Metalla�nit�atschromatographie

Die metalla�nit�atschromatographische Aufreinigung erfolgte wie in Kap. 6.7.2.1 be-

schrieben. F�ur die Messung der Peptidfraktion wurde 1 �L der eluierten Probe mit

5 �L einer ges�attigten �-Cyano-4-hydroxyzimts�aure in 50 % Acetonitril / 0,1 % Tfa

verd�unnt. Davon wurde zweimal je 1 �L auf einen Stahltr�ager pipettiert und an der

Luft getrocknet.

6.8.7 MALDI-TOF-MS-Analyse der Peptide

Die Messung der Peptide erfolgte mit verz�ogerter Ionenextraktion (140 ns). Nach Be-

schleunigung bei 20 kV wurden laserdesorbierte positive Ionen im linearen Modus ge-

132

6.9 Methoden zum Vergleich verschiedener Erhitzungsindikatoren von Milch

messen. Die externe Kalibrierung wurde mit einer Peptidstandardmischung von Bruker

(bestehend aus Angiotensin I und II, Substanz P, Bombesin, ACTH Fragment 1-17

und 18-39 und Somatostatin) durchgef�uhrt. F�ur jedes der abgebildeten Spektren wur-

den mindestens 150 Einzelspektren von unterschiedlichen Stellen des Auftragepunktes

summiert.

6.8.8 MALDI-TOF/TOF-MS-Messung

DieMaldi-Tof/Tof-Ms-Messungen zur Peptididenti�zierung wurden von Dr. Alex-

ander Schmidt von der Eidgen�ossischen Technischen Hochschule in Z�urich auf einem

Proteomics Analyzer 4800 Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, USA)

durchgef�uhrt. Die Identi�zierung der Peptidsequenzen erfolgte mit Hilfe der Softwa-

re Mascot. Folgende Parameter wurden eingestellt: Massentoleranz (Prekursorion):

100 ppm. Massentoleranz (Fragment): 0,25 Da. Nur Tre�er mit einer Irrtumswahr-

scheinlichkeit <0,05 wurden als korrekt angesehen.

6.8.9 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Microsoft O�ce Excel 2003.

Die Signi�kanzniveaus wurden mit einem zweiseitigen, gepaarten Student T-Test be-

rechnet.

6.9 Methoden zum Vergleich einer massenspektrome-

trischen Methode zur Untersuchung der thermi-

schen Behandlung von Milch mit klassischen Hitze-

indikatoren

6.9.1 Milchproben

F�ur alle im Folgenden beschriebenen Versuche wurde eine im Handel erworbene, laut

Kennzeichnung pasteurisierte Milch verwendet; dabei stammten alle Aliquote f�ur die

Erhitzungsreihen aus einer einzigen Packung.

133


6.9.2 Entfetten der Milch

Die pasteurisierte Milch wurde zun�achst durch Zentrifugation (3850 rpm, 4 °C, 60 min)

entfettet. Die oben schwimmende Fettschicht wurde mit Hilfe eines Analysenl�o�els

entfernt und dabei nicht erfasste Fettreste wurden durch anschlie�ende Filtration durch

einen Falten�lter abgetrennt.

6.9.3 Erhitzen der Milch

Die Erhitzung erfolgte im Dreifachansatz. Daf�ur wurden jeweils 1,5 mL der entfetteten

Milch in 2 mL Reaktionsgef�a�e pipettiert und in einem St�ander f�ur Reaktionsgef�a�e im

Trockenschrank bei 70 °C, 80 °C und 100 °C erhitzt. Die Temperaturmessung erfolgte

im Trockenschrank mit Hilfe eines Thermometers. Die Temperaturgenauigkeit w�ahrend

der Inkubation lag bei +1/-2 °C; die Schwankungen waren durch das �O�nen der T�ure

bei der Probenahme bedingt. Nach jeder Probenahme wurden die Reaktionsgef�a�e in

Eis abgek�uhlt.

6.9.4 Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molken-

proteine

Zur Pr�azipitation der Caseine und der denaturierten Molkenproteine wurden in einem

2 mL Reaktionsgef�a� 0,3 mL Milch mit 1,5 mL 0,4 M Natriumacetatpu�er pH 4,6 ver-

setzt. Der Ansatz wurde zum Durchmischen geschwenkt und zur vollst�andigen Pr�azi-

pitation 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschlie�end wurde 5 min bei

3850 rpm und 4 °C zentrifugiert. Um letzte Protein ocken aus dem Zentrifugat zu

entfernen, wurde dieses durch Spritzen�lter (PVDF; 0,45 �m) �ltriert. Die erhaltene

L�osung ("essigsaures Filtrat\) wurde direkt f�ur die Bestimmung des bei pH 4,6 l�osli-

chen Proteingehalts nach Lowry bzw. f�ur die chromatographische Quanti�zierung von

bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin verwendet; f�ur die Messung

des Fast-Indexes wurde das Filtrat nochmals verd�unnt (siehe Kap. 6.9.7).

134


6.9.5 Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Protein

nach Lowry

Die Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Protein der Milchproben erfolgte

nach der Methode von Lowry [34] mit Hilfe des BioRad DC Protein Assays. Daf�ur

wurden zun�achst 4 mL des alkalischen kupfersulfathaltigen Reagenzes A mit 80 �L des

tensidhaltigen Reagenzes B gemischt. 25 �L der Mischung wurden in 96-Kavit�aten-

Mikrotiterplatten zu 5 �L des essigsauren Filtrats pipettiert. Dazu wurden 200 �L von

Reagenz B mit der enthaltenen Folin-L�osung pipettiert. Die Platte wurde mit Alufo-

lie abgedeckt und 15 min bei Raumtemperatur gesch�uttelt, anschlie�end erfolgte die

Messung der Absorption bei 630 nm am Microplate Reader. Die Quanti�zierung erfolg-

te mit Hilfe einer externen Kalibriergeraden, die aus bovinem Serumalbumin erstellt

wurde. Als Stamml�osung diente eine kommerziell erh�altliche Bsa-L�osung der Konzen-

tration 2 mg/mL, die mit 0,4 M Natriumacetatpu�er pH 4,6 zu 1,6, 1,4, 1,2, 1,0, 0,8,

0,6, 0,4, 0,2 und 0,1 g/L verd�unnt wurde und analog zu den Proben vermessen wurde.

6.9.6 Quanti�zierung von �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin

mittels HPLC/Fluoreszenzdetektion

Die hochleistungs �ussigchromatographische Bestimmung des bei pH 4,6 l�oslichen �-

Lactalbumins und �-Lactoglobulins erfolgte direkt aus dem essigsauren Filtrat. In

Tab. 6.3 sind die Parameter der Hplc f�ur die Quanti�zierung von �-Lactalbumin und

�-Lactoglobulin aufgelistet.

Die Flie�mittel wurden vor der Verwendung durch einen Membran�lter �ltriert.

Die Quanti�zierung erfolgte mit Hilfe einer externen Kalibriergeraden. Daf�ur wurden

Stamml�osungen aus �-Lactalbumin (Konzentration ca. 0,7 g/L) und �-Lactoglobulin

(Konzentration ca. 1,6 g/L) in 0,4 M Natriumacetatpu�er pH 4,6 hergestellt. Da es sich

bei den kommerziell erh�altlichen Standards nicht um Reinsubstanzen handelt, wurde

die genaue Konzentration der Stamml�osungen mittels BioRad DC Protein Assay be-

stimmt. Die beiden L�osungen wurden anschlie�end mit 0,4 M Natriumacetatpu�er

pH 4,6 so gemischt, dass Konzentrationen f�ur �-Lactalbumin von ca. 0,3, 0,2, 0,1,

0,05, 0,01 und 0,005 g/L bzw. f�ur �-Lactoglobulin von ca. 0,6, 0,4, 0,25, 0,1, 0,05,

0,01 und 0,005 g/L erhalten wurden (der genaue Proteingehalt wurde aus dem Gehalt

der Stamml�osung berechnet). Die Auswertung der Peak �achen wurde mit Hilfe der

Software Jasco Borwin durchgef�uhrt.

135


Tab. 6.3: Parameter der Hplc f�ur die Quanti�zierung des bei pH 4,6 l�oslichen �-Lactalbu-mins und �-Lactoglobulins

Vors�aule: Macherey-Nagel C8

S�aule: Macherey-Nagel CC 125/3 Nucleosil 100- C8 ec

Fluss: 0,8 mL/min

Probenschleife: 20 �L

Flie�mittel A: Acetonitril

Flie�mittel B: 0,1 % Tri uoressigs�aure

Gradient: 5 min 20 % A; innerhalb von 20 min auf 60 % A;

innerhalb von 2 min auf 20 % A; 8 min auf 20 % A halten

Detektion: Fluoreszenz: �ex = 280 nm; �em = 350 nm

Software: Jasco Borwin

6.9.7 Bestimmung des FAST-Indexes

F�ur die Bestimmung des Fast-Indexes wurde das essigsaure Filtrat 1:5 mit 0,5 M

NaOAc-Pu�er pH 4,6 verd�unnt. Diese Verd�unnung wurde direkt f�ur die Fluoreszenz-

messung eingesetzt. Die Messung erfolgte in Quarzglas-K�uvetten bei einer auf"medi-

um\ gestellten Emp�ndlichkeit; die Emp�ndlichkeit wurde au�erdem �uber die Fein-

regulierung auf 3 gestellt. Zur Fluoreszenzbestimmung des Tryptophans (FTrp) wurde

eine Anregungswellenl�ange von 290 nm und eine Emissionswellenl�ange von 340 nm

gew�ahlt. Die Messung der Fluoreszenz der fortgeschrittenen Maillardprodukte (FAMP)

erfolgte bei einer Anregungswellenl�ange von 330 nm sowie einer Emissionswellenl�ange

von 420 nm. Als Blindwert diente 0,4 M NaOAc-Pu�er pH 4,6. Der Fast-Index wurde

nach folgender Formel berechnet:

Fast =FAMPFTrp

· 100

136


6.9.8 Relative Quanti�zierung des Amadoriprodukts von �-Lact-

albumin mittels MALDI-TOF-MS

Die Milchproben wurden 1:100 mit Reinstwasser verd�unnt. Diese L�osungen wurden

mit 2+2 mit einer Cca/Dhb-Matrix (siehe S. 122) verd�unnt. Je 1 �L der Proben-

verd�unnungen wurde zweimal auf einen Stahltr�ager pipettiert und an der Luft getrock-

net.

Die Messung erfolgte mit verz�ogerter Extraction (350 ns). Nach Beschleunigung bei

19 kV wurden laserdesorbierte positive Ionen im linearen Modus gemessen. Die externe

Kalibrierung erfolgte mit einer Proteinmischung aus �-Lactalbumin, H�uhnerlysozym

und �-Lactoglobulin A und B. F�ur jedes der abgebildeten Spektren wurden mindestens

300 Einzelspektren von unterschiedlichen Stellen des Auftragepunktes summiert.

F�ur die relative Quanti�zierung wurde bei den Spektren mit der Software Flex Ana-

lysis von Bruker eine Basisliniensubstraktion (Modus Convex Hull) und ein Smoothing

(3 Zyklen mit m/z = 1) durchgef�uhrt. Aufgrund der von der Software durchgef�uhrten

fehlerbehafteten Fl�achenberechnung bei nicht isotopisch aufgel�osten Signalen, wie es

bei Proteinen der Fall ist, wurde zur Berechnung nicht die Fl�ache, sondern die Inten-

sit�at des Signals herangezogen. Die Berechnung des relativen Gehalts des mit Lactose

modi�zierten �-Lactalbumins erfolgte nachfolgender Formel:

Rel. Gehalt =Summe Int: (Lactulosyllysin(e))

Summe (Int: ��Lactalbumin + Int: Lactulosylysin(e)�)

* Die Intensit�at von zweifach lactosyliertem �-Lactalbumin wurde dabei mal 2 genommen.

6.9.9 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit Microsoft O�ce Excel 2003. Signi�kanzniveaus

wurden mit einem zweiseitigen, gepaarten Student T-Test berechnet.

137

7 Zusammenfassung

7 Zusammenfassung

Milch und Milchprodukte nehmen in der Ern�ahrung des Menschen eine zentrale Rol-

le ein und bieten ihm nicht nur im S�auglingsalter eine ideale Quelle aller N�ahrsto�e

f�ur ein gesundes Wachstum. Einen besonders wertvollen Inhaltssto� stellen dabei die

Milchproteine dar, die aufgrund ihrer guten Verdaubarkeit sowie ihrer g�unstigen Ami-

nos�aurezusammensetzung eine sehr hohe biologische Wertigkeit aufweisen. Im Zuge der

industriellen Verarbeitung werden jedoch Milchprodukte in der Regel zum Erreichen

einer mikrobiellen Stabilit�at oder aus technologischen Gr�unden erhitzt. W�ahrenddessen

kommt es zu einer Vielzahl chemischer Reaktionen, die die ern�ahrungsphysiologischen

Eigenschaften der Milchproteine bedeutend ver�andern k�onnen.

In der sogenannten Maillard-Reaktion, die auch als nicht-enzymatische Glykierung

bezeichnet wird, reagiert die Aminogruppe eines proteingebundenen Lysins mit der Car-

bonylfunktion des Milchzuckers Lactose zum Amadoriprodukt, welches im Folgenden

zu einem sehr heterogenen Produktspektrum abgebaut wird. Zudem unterliegen Milch-

proteine diversen Oxidationsreaktionen, die den Abbau essentieller Aminos�auren nach

sich ziehen. Parallel dazu f�uhren Quervernetzungen der Proteine zu einem erschwerten

enzymatischen Angri� w�ahrend der Verdauung, so dass als Folge der Hitzebehandlung

die biologische Wertigkeit der Milchproteine drastisch reduziert werden kann.

Eine sorgf�altige Kontrolle der industriellen Behandlung und die Aufkl�arung der da-

bei ablaufenden Reaktionen sind daher von gro�er Bedeutung. In den letzten Jahren

hat sich die Massenspektrometrie als wertvolle Technik erwiesen, das Milchproteom

eingehender zu erforschen und Strukturver�anderungen der Milchproteine w�ahrend der

thermischen Behandlung zu charakterisieren. Als besonders schonende Ionisierungs-

methode �ndet dabei die Matrixunterst�utzte Laserdesorptions-/Ionisierungs-Flugzeit-

Massenspektrometrie (Maldi-Tof-Ms) Anwendung.

138

Im Zuge dieser Dissertation wurde Maldi-Tof-Ms zur systematischen Untersu-

chung von Proteinmodi�kationen w�ahrend der Erhitzung von Milch und Milchpro-

dukten eingesetzt. Zun�achst wurden Modi�kationen analysiert, die beim Erhitzen von

Molkenproteinen in Milchmodellen entstehen, wobei eine partielle enzymatische Hy-

drolyse die Identi�zierung der Modi�kationsstellen in der Aminos�auresequenz erlaub-

te. Anschlie�end wurden verschiedene Techniken zur Proteinabtrennung getestet, um

die Proteinver�anderungen von thermisch behandelten Milchprodukten analysieren zu

k�onnen. Die detektierten Modi�kationen in verschiedenen Handelsproben wurden rela-

tiv quanti�ziert. Weiterhin wurde mittels Maldi-Tof-Ms die bislang nicht komplett

aufgekl�arte niedermolekulare Proteinfraktion der Milch n�aher charakterisiert. Im letz-

ten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde ein massenspektrometrischer Ansatz zur

Beurteilung der thermischen Behandlung von Milch mit verschiedenen klassischen Me-

thoden verglichen.

Im ersten Projekt wurden die beiden wichtigsten Molkenproteine �-Lactalbumin

bzw. �-Lactoglobulin mit Lactose in den Konzentrationen, die in der Milch vorliegen,

in einem Pu�er, der die Salzkonzentrationen der Milch nachahmte, erhitzt und Struk-

turver�anderungen mittels Maldi-Tof-Ms untersucht. Der nicht behandelte Standard

sowie das ohne Lactose inkubierte Protein dienten als Kontrolle. Aufgrund ihrer spe-

zi�schen Massen�anderung im Vergleich zum unmodi�zierten Protein konnten die Mo-

di�zierungen, die im Laufe der Erhitzung entstanden, identi�ziert werden. Im intakten

Protein wurden Addukte von �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin mit null bis vier

Lactosemolek�ulen beobachtet.

F�ur eine bessere Au �osung und einen genaueren Einblick in die Struktur und die

Position der Modi�kationen in der Proteinsequenz wurde eine partielle enzymatische

Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN durchgef�uhrt. Dabei konnten im inkubierten

�-Lactalbumin Lactulosyllysin sowie dessen Abbauprodukt N�-Carboxymethyllysin an

Lysin 5 detektiert werden. Eine weitere Glykierung am N-Terminus konnte dabei nicht

ausgeschlossen werden. Zudem wurde die Oxidation von Lysin 5 zum Lysinaldehyd

beobachtet. Massenver�anderungen von je 16 Da lie�en auf die Bildung von Cysteinsul-

fens�aure an Cystein 28, 111 und 120 oder von Hydroxytryptophan an Tryptophan 26,

104 und 118 schlie�en. Die zus�atzliche Inkubation von �-Lactalbumin mit Wassersto�-

peroxid zeigte die Oxidation von Methionin 90 zu Methioninsulfoxid auf, was vermuten

l�asst, dass eine entsprechende Reaktion auch w�ahrend der Erhitzung mit Lactose auf-

trat. Als zuckerunabh�angige Reaktion cyclisierte die N-terminale Glutamins�aure zu

einem Pyrrolidon.

139

7 Zusammenfassung

In �-Lactoglobulin f�uhrte die Inkubation mit Lactose zum Amadoriprodukt an Ly-

sin 47 und entweder an Lysin 138 oder 141, das bei anhaltender Erhitzung teilweise zu

Cml abgebaut wurde. Lysin 8 wurde selektiv zu Lysinaldehyd oxidiert. Des Weiteren

wurde an Methionin 7, 24 und 145 die Oxidation zum Sulfoxid beobachtet. Die Oxi-

dation von �-Lactoglobulin mittels Wassersto�peroxid f�uhrte zus�atzlich zur Bildung

von Methioninsulfoxid an Methionin 107. Diese Aminos�aure wurde im Spektrum des

mit Lactose inkubierten �-Lactoglobulins nicht abgedeckt, es ist jedoch zu vermuten,

dass auch w�ahrend der Reaktion mit Lactose Methionin 107 oxidiert wurde. Au�er-

dem bewirkte die thermische Behandlung entweder die Oxidation von Methionin 24 zu

Methioninsulfon oder von Tryptophan 19 zu N-Formylkynurenin oder zu Hydroxytryp-

tophan.

Im Folgenden wurden verschiedene Milchprodukte aus dem Handel auf ihre Modi�-

kationen der Molkenproteine untersucht. Mit der direkten Vermessung mittelsMaldi-

Tof-Ms gelang die Detektion von einem bis zu drei Lactose- bzw. Hexoseaddukten.

Durch eine metalla�nit�atschromatographische Aufreinigung vor der massenspektro-

metrischen Vermessung wurde eine Zunahme der Signalintensit�at sowie ein teilweise

deutlich verbessertes Signal-Rausch-Verh�altnis erzielt, was eine emp�ndlichere Detek-

tion der Modi�kationen erlaubte.

Da vor einer partiellen enzymatischen Hydrolyse eine Isolierung der Proteine er-

forderlich ist, wurden drei verschiedene Methoden zur Proteinauftrennung getestet.

Mittels Immunoa�nit�atschromatographie konnten �-Lactalbumin und �-Lactoglobulin

von den restlichen Milchproteinen abgetrennt werden. Auch glykiertes �-Lactalbumin

wurde dabei erfasst. Vorversuche zeigten, dass es au�erdem m�oglich ist, im Anschluss

an die Proteinisolierung einen Verdau mit der Endoproteinase AspN durchzuf�uhren.

Die eindimensionale Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (Sds-Page)

von Milch resultierte ebenfalls in einer sehr guten Trennung der meisten Milchprote-

ine. Mit einer zus�atzlichen isoelektrischen Fokussierung lie�en sich au�erdem geneti-

sche Varianten und Proteine mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad trennen.

Die Analyse von mit Lactose inkubierten Modellproteinen machte au�erdem deutlich,

dass mit Hilfe der zweidimensionalen Sds-Pagemodi�zierte Proteine angereichert wer-

den k�onnen.

Die folgenden Versuche mit verschiedenen Handelsproben wurden mittels eindimen-

sionaler Sds-Page mit anschlie�ender partieller enzymatischer Hydrolyse unter Ver-

wendung der Endoproteinase AspN durchgef�uhrt, wobei sich die Analyse auf die Mo-

140

di�kationen von �-Lactoglobulin beschr�ankte. Zun�achst wurde anhand der bereits un-

tersuchten Modellproteine eine leichte Verminderung der Spektrenqualit�at nach dem

Verdau im Gel festgestellt. Bei der Analyse von erhitzter Rohmilch konnte das Ama-

doriprodukt an Lysin 47 und 138 oder 141 sowie Methioninsulfoxid an Methionin 7, 24

und 145 detektiert werden. In den Handelsproben wurden exakt die gleichen Glykie-

rungsstellen im Protein ermittelt. Eine relative Quanti�zierung des Lactulosyllysins er-

laubte eine quantitative Absch�atzung der hitzeinduzierten Sch�adigung. Dabei erwiesen

sich eine Kondensmilch und eine pulverf�ormige S�auglingsnahrung als die am st�arksten

belasteten Proben. Eine Beurteilung der Proteinoxidation stellte sich als schwierig her-

aus, da die Aufarbeitung zu einer vermehrten Bildung von Methioninsulfoxid f�uhrte.

Tendenziell war ein erh�ohter Gehalt an Methioninsulfoxid in den Handelsproben zu

verzeichnen, jedoch waren die Unterschiede zu Rohmilch nicht signi�kant.

Um die bislang wenig erforschte niedermolekulare Proteinfraktion der Milch n�aher zu

charakterisieren, wurde im n�achsten Abschnitt dieser Arbeit eine metalla�nit�atschro-

matographische Aufreinigung der Milch mit anschlie�ender massenspektrometrischer

Vermessung durchgef�uhrt. Damit konnten f�ur den Massenbereich von ca. 1000 - 6000 Da

Spektren mit �ubersichtlich angeordneten Signalen und einem sehr guten Signal-Rausch-

Verh�altnis generiert werden. Zwei der Peptide konnten mittels Maldi-Tof/Tof-Ms

Fragmenten des �s1-Caseins zugeordnet werden.

Beim Erhitzen von Rohmilch bei 72 °C, 85 °C bzw. 120 °C wurden f�unf neue Peptide

mit den Massen 1974,4, 2218,7, 3730,1, 4297,8 bzw. 4436,8 Da detektiert, die relativ

quanti�ziert wurden. Die Bildung war deutlich abh�angig von der Erhitzungsdauer bzw.

-temperatur.

Im n�achsten Schritt wurde das Peptidpro�l von handels�ublichen Milchproben w�ahrend

der Lagerung analysiert. Dabei konnten in hocherhitzter, bei K�uhlschranktemperatu-

ren gelagerter Milch keine Ver�anderungen detektiert werden, w�ahrend die Lagerung

von ultrahocherhitzter Milch bei Raumtemperatur zu einem signi�kanten Anstieg des

Peptids mit der Masse von 4340,4 Da f�uhrte, einem Fragment von �s1-Casein. In gela-

gerter Sterilmilch, bei der aufgrund der drastischen Bedingungen bei der Herstellung

von keiner Enzymaktivit�at ausgegangen wird, wurde keine entsprechende Zunahme des

Peptids nachgewiesen. Daraus kann gefolgert werden, dass dieses enzymatisch gebildet

wurde.

Die Analyse verschiedener Milchtypen aus dem Handel zeigte die Relevanz der Erhit-

zungsversuche f�ur reale Proben auf: W�ahrend in keiner der pasteurisierten Proben die

141

7 Zusammenfassung

hitzeinduzierten Peptide detektierbar waren, konnten sie in unterschiedlicher Intensit�at

in einer hocherhitzten und in allen ultrahocherhitzten Milchproben nachgewiesen wer-

den. Zudem zeigten die Spektren weitere Unterschiede in der Signalintensit�at einiger

Peptide auf, was vermutlich auf unterschiedliche Rinderrassen oder Laktationsstadi-

en zur�uckzuf�uhren war. Die vorgestellte Methode erlaubt somit einen umfassenden

Einblick in die niedermolekulare Proteinfraktion der Milch, was in der Milchindustrie

zur Kontrolle der Hitzebehandlung oder technologischer Eigenschaften genutzt werden

k�onnte.

Im abschlie�enden Abschnitt dieser Arbeit wurde eine neue massenspektrometri-

sche Methode zur Beurteilung der thermischen Behandlung von Milch mit klassischen

Hitzeindikatoren verglichen. Als etablierte Analysemethoden dienten die kolorimetri-

sche Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 l�oslichem Gesamtprotein nach Lowry,

die chromatographische Ermittlung der Konzentration von bei pH 4,6 l�oslichem �-

Lactalbumin bzw. �-Lactoglobulin { alle drei als Ma� f�ur die Proteindenaturierung {

sowie die uorimetrische Vermessung des Fast-Indexes als Ma� f�ur die Bildung uores-

zierender Verbindungen im Laufe der Maillard-Reaktion. Dar�uber hinaus wurde als zu

testende Methode der relative Anteil des Amadoriprodukts von �-Lactalbumin mittels

Maldi-Tof-Ms bestimmt.

Vorteil letzterer Analytik war ihre sehr schnelle und einfache Durchf�uhrung und ihre

Eignung f�ur st�arker erhitzte Proben und komplexere Matrices wie z. B. S�auglings-

milchnahrung. Hingegen stie�en die aufgef�uhrten klassischen Techniken schnell an ihre

Grenzen, da sie nur in einem begrenzten Erhitzungsintervall einen R�uckschluss auf die

thermische Behandlung zulie�en.

Der getestete massenspektrometrische Hitzeparameter stand in exponentiellem Zu-

sammenhang mit allen klassischen Indikatoren, lediglich der Fast-Index nahm anfangs

erst linear mit der Amadoriproduktbildung zu, um anschlie�end exponentiell zu korre-

lieren. Die Berechnung der Korrelationskoe�zienten ergab Werte zwischen 0,968 und

0,997. Die Korrelationskurve war dabei abh�angig von der Temperatur, nur zwischen

dem relativen Gehalt des Amadoriprodukts an �-Lactalbumin und der Konzentration

an bei pH 4,6 l�oslichem �-Lactalbumin wurde ein von der Erhitzungstemperatur un-

abh�angiger Zusammenhang festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse lassen darauf schlie-

�en, dass die getestete massenspektrometrische Methode eine wertvolle Alternative zu

den Techniken darstellt, die bislang zur Bewertung der thermischen Belastung einge-

setzt werden.

142

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die weitreichenden Einsatzm�oglichkeiten der

Maldi-Tof-Ms in der Milchanalytik aufgezeigt werden konnten. DieMaldi-Tof-Ms

erlaubte es einerseits, Proteinmodi�zierungen w�ahrend der thermischen Behandlung zu

identi�zieren und zu lokalisieren, was Vorhersagen �uber ern�ahrungsphysiologische Ei-

genschaften erlaubt. Andererseits konnte die Technik erfolgreich dazu eingesetzt wer-

den, das noch immer nicht komplett aufgekl�arte niedermolekulare Proteom der Milch

n�aher zu charakterisieren, was vor allem technologische Bedeutung hat und in Be-

zug auf die bioaktive Wirkung von Milch eine Rolle spielen k�onnte. Schlie�lich konnte

zus�atzlich gezeigt werden, dass Maldi-Tof-Ms auch bei der schnellen Kontrolle der

Hitzebelastung von Milchprodukten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Me-

thoden darstellt.

143

8 Summary

8 Summary

Milk and dairy products are of major importance in human nutrition and represent

an ideal source of all nutrients for a healthy growth. Among those, the milk proteins

are an especially important species, featuring a very high nutritional value owing to

their good digestibility and their favorable amino acid composition. However, during

industrial processing dairy products are usually heated to obtain microbial stability

or for technological purposes. Thereby, a multitude of chemical reactions takes place,

signi�cantly changing the nutritional properties of the milk proteins.

In the non-enzymatic glycation, the so-called Maillard reaction, the nitrogen of a

protein-bound amino group, preferentially a lysine residue, reacts with the carbonyl

function of the milk sugar lactose to form the Amadori product, which subsequently

undergoes a series of further reactions yielding a great variety of chemical structures.

Additionally, milk proteins are subjected to various oxidation reactions, leading to

the degradation of essential amino acids. Furthermore, cross linking reactions in the

advanced stage of the Maillard reaction additionally reduce protein digestibility. There-

fore, the nutritional value of the milk proteins might be drastically reduced in the course

of thermal treatment.

Hence, careful control of the industrial processing and the elucidation of the impli-

cated reactions are an important challenge. During the last years, mass spectrometric

techniques have been established as a reliable tool for the investigation of the milk pro-

teom and the characterization of heat induced structural changes of the milk proteins.

In this regard, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (Maldi-

Tof-Ms) has gained increased attention, as it represents a very soft ionization method.

In this dissertation,Maldi-Tof-Ms was used for the systematic analysis of protein

modi�cations during the heat treatment of milk and dairy products. First of all, mo-

di�cations of whey proteins which were formed in heated milk models were analyzed.

144

Partial enzymatic hydrolysis of the proteins allowed the identi�cation of the modi�ca-

tion sites in the amino acid sequence. In the following, several techniques for protein

separation were tested for their suitability for the analysis of dairy products. Detected

modi�cations in commercially available samples were relatively quanti�ed. Further-

more, the low molecular protein fraction of milk, which has not been fully understood

so far, was characterized by means ofMaldi-Tof-Ms. The last project dealt with the

comparison of a new mass spectrometric approach for the evaluation of the thermal

treatment of milk with several classical methods.

Solutions of the two main whey proteins �-lactalbumin and �-lactoglobulin, respec-

tively, were heated with lactose in a milk-resembling bu�er in concentrations that are

usually found in milk. Structural changes were monitored via Maldi-Tof-Ms. The

non-treated commercially available standard as well as the heated protein without the

addition of sugar served as controls. By means of their speci�c mass shift in comparison

to the native unmodi�ed signal, protein modi�cations could be identi�ed. The Amadori

product was determined as main glycation product. �-Lactalbumin and �-lactoglobulin

species with zero to four lactose adducts could be identi�ed in the intact protein.

To achieve a better resolution of the modi�cations and to get a more detailed insight

into the nature and site of further modi�cations, a partial enzymatic hydrolysis was

carried out prior to the mass spectrometric analysis by using the endoproteinase AspN.

Thus, upon incubation of �-lactalbumin with lactose, lactulosyllysine and its degrada-

tion product N�-carboxymethyllysine were identi�ed at lysine 5, whereas glycation at

the N-terminus could not be excluded. Furthermore, the oxidation of lysine 5 to lysine

aldehyde was observed. Mass shifts of 16 Da indicated the formation of cysteine sulfenic

acid at cysteine 28, 111, and 120 or of hydroxytryptophan at tryptophan 26, 104, and

118. Incubation of the protein with hydrogen peroxide led to the oxidation of methio-

nine 90 to methionine sulfoxide, so it stands to reason that an analogous reaction took

place during the heating with lactose. As a sugar independent reaction, the N-terminal

glutamic acid cyclized to a pyrrolidone.

Regarding �-lactoglobulin, the incubation with lactose led to the formation of the

Amadori product at lysine 47 and either at lysine 138 or 141, which subsequently

reacted to Cml. Lysine 8 was selectively modi�ed to lysine aldehyde. Methionine 7,

24, and 145 were oxidized to methionine sulfoxide. Upon treatment of �-lactoglobulin

with hydrogen peroxide, the formation of methionine sulfoxide at methionine 107 was

observed. In contrast, following the reaction of �-lactoglobulin with lactose, the pep-

145

8 Summary

tide containing this amino acid could not be detected. However, it seems very likely

that methionine 107 was also oxidized. Finally, the thermal treatment resulted in the

oxidation either of methionine 24 to methionine sulfone or of tryptophan 19 to N-

formylcynurenine or to hydroxytryptophan.

In the next step, di�erent dairy products were analyzed with regard to their modi�ca-

tions of the whey proteins. By direct measurement via Maldi-Tof-Ms, the detection

of one up to three lactose adducts was achieved. The puri�cation of the samples with

a technique based on metal a�nity chromatography led to an increase of the signal

intensities as well as to an improvement of the signal-to-noise ratio, allowing a more

sensitive detection of the modi�cations.

Since an isolation of the proteins is necessary prior to partial enzymatic hydrolysis,

three di�erent methods for the separation of proteins were tested. By means of immu-

noa�nity chromatography, �-lactalbumin and �-lactoglobulin, respectively, could be

isolated from the rest of the milk proteins. Also glycated �-lactalbumin was captured.

Furthermore, preliminary experiments showed that it is possible to perform a digestion

with the endoproteinase AspN after the isolation of the proteins. One-dimensional so-

dium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Sds-Page) also resulted in a

very good separation of most of the milk proteins. With an additional isoelectric fo-

cusing, genetic variants and proteins with di�erent phosphorylation degree could be

separated. Moreover, the analysis of model proteins which were incubated with lactose

showed that two-dimensional gel electrophoresis renders the separation of modi�ed

proteins possible.

The following experiments with commercially available dairy products were per-

formed with one-dimensional Sds-Page and subsequent partial enzymatic hydrolysis

by using the endoproteinase AspN. Only modi�cations of �-lactoglobulin were investi-

gated. Firstly, a slight decrease of the spectra quality after in-gel-digest was observed

in the model proteins which had already been analyzed previously. In heated raw milk,

the Amadori product could be detected at lysine 47 and 138 or 141 as well as me-

thionine sulfoxide at methionine 7, 24, and 145. Commercially available dairy products

showed the same modi�cations in the amino acid sequence. The relative quanti�cation

allowed a quantitative evaluation of the heat induced protein damage. One condensed

milk and one infant formula turned out to be the most a�ected samples. However, it

was di�cult to assess the protein oxidation since the sample preparation entailed an

increased artefactual formation of methionine sulfoxide. Industrial heat treatment ten-

146

ded to result in higher contents of methionine sulfoxide in the analyzed products. The

di�erences compared to raw milk, however, were not signi�cant.

In order to characterize the low molecular protein fraction of milk, which has not

yet been fully elucidated, milk was puri�ed by means of metal a�nity chromatography

and subsequently measured viaMaldi-Tof-Ms. Applying this technique, spectra with

clearly arranged signals and a very good signal-to-noise ratio could be generated. Two of

the detected peptides were identi�ed as fragments of �s1-casein viaMaldi-Tof/Tof-

Ms.

After heating raw milk at 72 °C, 85 °C, or 120 °C, �ve new peptides with masses

of 1974.4, 2218.7, 3730.1, 4297.8, and 4436.8 Da, respectively, were built, which were

relatively quanti�ed. Their formation was clearly dependent on heating time and du-

ration.

In the next step, the changes in the peptide pro�le during storage were analyzed.

High-temperature milk which was stored for up to 21 days in the refrigerator showed no

changes. In contrast, a signi�cant increase of a peptide with the mass of 4340.3 Da { a

fragment of �s1-casein { was monitored during storage of ultra-high-temperature milk

for up to 12 weeks at room temperature. It could be concluded that this peptide was

formed in an enzymatic reaction, as it did not increase during the storage of sterilized

milk, in which no enzymatic activity is assumed because of the drastic conditions in

the course of industrial processing.

The analysis of di�erent milk samples from the supermarket proved the relevance of

the heating experiments for milk products: Whereas in none of the pasteurized samples

the heat induced peptides were detected, they were present in one high-temperature

and all ultra-high-temperature milk samples to a varying extent. Moreover, further

di�erences in the signal intensities of other peptides were apparent in the spectra,

probably due to di�erent cow races or stages of lactation. The presented method allows

a comprehensive insight into the low molecular protein fraction of milk, which could

be used in the dairy industry for the control of thermal treatment or of technological

properties.

In the �nal project of this thesis, a new mass spectrometric approach for the eva-

luation of the heat treatment of milk was compared with some classical methods. The

colorimetric determination of soluble proteins at pH 4.6 according to Lowry, the chro-

matographic quanti�cation of soluble �-lactalbumin and �-lactoglobulin at pH 4.6 {

all three of them being indicators of protein denaturation { as well as the uorimetric

147

8 Summary

measurement of the Fast-index re ecting the formation of uorescent substances du-

ring the Maillard reaction, served as conventional techniques. Additionally, the relative

content of the Amadori product of �-lactalbumin was determined viaMaldi-Tof-Ms.

The advantage of the latter analysis was its rapid and simple handling and its suita-

bility for products which had been intensively heated or for more complex matrices like

infant formulas. In contrast, an evaluation of the thermal treatment by the conventional

methods became di�cult after severe heating.

The tested mass spectrometric heat indicator correlated exponentially with all clas-

sical parameters, only the Fast-index increased linearly with the formation of the

Amadori product in the beginning. Coe�cients of correlation between 0.968 and 0.997

were achieved. The correlation curve was dependent on the temperature, with the

exception of a temperature independent relation between the relative content of the

Amadori product and the concentration of soluble �-lactalbumin at pH 4.6. The results

show that the tested mass spectrometric method represents a valuable alternative to

the techniques which have been applied for the evaluation of heat induced damage so

far.

In conclusion, this work showed that Maldi-Tof-Ms is a versatile tool in milk

science. On the one hand, Maldi-Tof-Ms allows the identi�cation and localization

of protein modi�cations during thermal treatment, thus permitting predictions of nu-

tritional properties. On the other hand, this technique can be successfully used to

characterize the low molecular protein fraction of milk, which is important for the food

industry and also might play a role in the bioactive e�ects of milk. Finally, it could be

demonstrated that Maldi-Tof-Ms also represents an alternative to previously used

methods for the rapid control of the heat damage of dairy products.

148

Literaturverzeichnis

[1] Wales, J. (Designated Agent Wikimedia Foundation Inc.) Milch. (2007). URL

http://de.wikipedia.org/wiki/Milch.

[2] Pougheon, S. & Goursaud, J. Le lait: caract�eristiques physicochimiques. In

G. D�ebry, Herausgeber, Le lait: nutrition et sant�e (2001).

[3] Walstra, P. & Jenness, R. Dairy chemistry and physics. Wiley, New York (1984).

[4] L�eonil, J., Bos, C., Maubois, J.-L. & Tom�e, D. Prot�eines. In G. D�ebry, Heraus-

geber, Le lait: nutrition et sant�e (2001).

[5] Guy, P.A. & Fenaille, F. Contribution of mass spectrometry to assess quality of

milk-based products. Mass Spectrom. Rev. 25, 290{326 (2006).

[6] Farrell, H.M., Jr., Jimenez-Flores, R., Bleck, G.T., Brown, E.M., Butler, J.E.,

Creamer, L.K., Hicks, C.L., Hollar, C.M., Ng-Kwai-Hang, K.F. & Swaisgood,

H.E. Nomenclature of the proteins of cows' milk{sixth revision. J. Dairy Sci. 87,

1641{1674 (2004).

[7] Bioinformatics, S.I.O. Expert Protein Analysis System, Peptide Mass. (2007).

URL http://www.expasy.org/tools/peptide-mass.html.

[8] Eigel, W.N. Formation of gamma1-A2, gamma2-A2 and gamma3-A caseins by

in vitro proteolysis of beta-casein A2 with bovine plasmin. Int. J. Biochem. 8,

187{192 (1977).

[9] De Wit, J.N. Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food

products. J. Dairy Sci. 81, 597{608 (1998).

149


[10] Lorient, D. In uence des traitements technologiques sur les propri�et�es nutrition-

nelles du lait. In G. D�ebry, Herausgeber, Le lait: nutrition et sant�e (2001).

[11] Berg, H.E. & Van Boekel, M.A.J.S. Degradation of lactose during heat treatment

of milk. 1. Reaction pathways. Netherl. Milk Dairy J. 48, 157{175 (1994).

[12] Pischetsrieder, M. & Severin, T. Advanced Maillard products of disaccharides:

analysis and relation to reaction conditions. In H.J. Lee T.-C. &Kim, Herausge-

ber, Chemical markers for processed and stored foods, 14{23. American Chemical

Society, Washington (1996).

[13] Van Boekel, M.A.J.S. E�ect of heating on Maillard reactions in milk. Food Chem.

62, 403{414 (1998).

[14] Morales, F.J. & Van Boekel, M.A.J.S. Formation of lysylpyrraline in heated

sugar-casein solutions. Netherl. Milk Dairy J. 50, 347{370 (1996).

[15] Ahmed, M.U., Thorpe, S.R. & Baynes, J.W. Identi�cation of N(epsilon)-car-

boxymethyllysine as a degradation product of fructoselysine in glycated protein.

J. Biol. Chem. 261, 4889{4894 (1986).

[16] Glomb, M.A. & Monnier, V.M. Mechanism of protein modi�cation by glyoxal and

glycolaldehyde, reactive intermediates of the Maillard reaction. J. Biol. Chem.

270, 10017{10026 (1995).

[17] Kasper, M. & Schieberle, P. Labeling studies on the formation pathway of

N(epsilon)-carboxymethyllysine in maillard-type reactions. Ann. N. Y. Acad.

Sci. 1043, 59{62 (2005).

[18] Henle, T., Schwarzenbolz, U. & Klostermeyer, H. Detection and quanti�cation

of pentosidine in foods. Z. Lebensm. Unters. Forsch. A 204, 95{98 (1997).

[19] Fritsch, R.J., Ho�mann, H. & Klostermeyer, H. Formation of lysinoalanine during

heat treatment of milk. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 176, 341{345 (1983).

[20] Schmitz, I., Zahn, H., Klostermeyer, H., Rabbel, K. & Watanabe, K. On the

occurence of isopeptide bonds in heated milk protein. Z. Lebensm. Unters. Forsch.

160, 377{381 (1976).

150


[21] Wol�, S.P. & Dean, R.T. Glucose autoxidation and protein modi�cation. The

potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes. Biochem. J. 245, 243{

250 (1987).

[22] Yim, H.S., Kang, S.O., Hah, Y.C., Chock, P.B. & Yim, M.B. Free radicals genera-

ted during the glycation reaction of amino acids by methylglyoxal. A model study

of protein-cross-linked free radicals. J. Biol. Chem. 270, 28228{28233 (1995).

[23] Mossine, V.V., Linetsky, M., Glinsky, G.V., Ortwerth, B.J. & Feather, M.S. Su-

peroxide free radical generation by Amadori compounds: the role of acyclic forms

and metal ions. Chem. Res. Toxicol. 12, 230{236 (1999).

[24] Dean, R.T., Fu, S., Stocker, R. & Davies, M.J. Biochemistry and pathology of

radical-mediated protein oxidation. Biochem. J. 324 ( Pt 1), 1{18 (1997).

[25] Potier de Coury, G. Vitamines. In G. D�ebry, Herausgeber, Le lait: nutrition et

sant�e (2001).

[26] Host, A. Frequency of cow's milk allergy in childhood. Ann. All. Asthma Immu-

nol. 89, 33{37 (2002).

[27] Wal, J.M. Bovine milk allergenicity. Ann. All. Asthma Immunol. 93, S2{S11

(2004).

[28] Reddy, I.M., Kella, N.K.D. & Kinsella, J.E. Structural and conformational basis

of the resistance of beta-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion. J.

Agric. Food Chem. 36, 737{741 (1988).

[29] Calvo, M.M. Flavour of heated milks. A review. Int. Dairy J. 2, 69{82 (1992).

[30] Pizzoferrato, L., Manzi, P., Vivanti, V., Nicoletti, I., C., C. & Colgiandro, E.

Maillard reaction in milk-based food: nutritional consequences. J. Food Prot. 61,

235{239 (1998).

[31] �Oste, R.E., R., M., Sj�ostr�om, H. & Nor�en, O. E�ect of Maillard reaction products

on protein digestion. Studies on pure compounds. J. Agric. Food Chem. 35, 938{

942 (1987).

151


[32] Mauron, J. In uence of processing on protein quality. J. Nutr. Sci. Vitaminol.

(Tokyo) 36 Suppl 1, S57{69 (1990).

[33] Claeys, W.L., Ludikhuyze, L.R., van Loey, A.M. & Hendrickx, M.E. Inactivation

kinetics of alkaline phosphatase and lactoperoxidase, and denaturation kinetics

of beta-lactoglobulin in raw milk under isothermal and dynamic temperature

conditions. J. Dairy Res. 68, 95{107 (2001).

[34] Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. Protein measurement

with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265{275 (1951).

[35] Gliguem, H. & Birlouez-Aragon, I. E�ects of sterilization, packaging, and storage

on vitamin C degradation, protein denaturation, and glycation in forti�ed milks.

J. Dairy Sci. 88, 891{899 (2005).

[36] Geier, H. & Klostermeyer, H. Enzymatische Bestimmung von Lactulose. Z.

Lebensm. Unters. Forsch. A 171, 443{445 (1980).

[37] Ferrer, E., Alegr��a, A., Courtois, G. & Farr�e, R. High-performance liquid chroma-

tographic determination of Maillard compounds in store-brand and name-brand

ultra-high-temperature-treated cows' milk. J. Chrom. A 881, 599{606 (2000).

[38] Resmini, P., Pellegrino, L. & Batelle, G. Accurate quanti�cation of furosine in

milk and dairy productsby a direct HPLC method. Ital. J. Food Sci. 3, 173{183

(1990).

[39] Hartkopf, J. & Erbersdobler, H.F. Stability of furosine during ion-exchange chro-

matography in comparison with reversed-phase HPLC. J. Chrom. 635, 151{154

(1993).

[40] Van Renterghem, R. & De Block, J. Furosine in Consumption Milk and Milk

Powders. Int. Dairy J. 6, 371{382 (1996).

[41] Hewedy, M.M., Kiesner, C., Messner, K., Hartkopf, J. & Erbersdobler, H.F. Ef-

fects of UHT heating of milk in an experimental plant on several indicators of

heat treatment. J. Dairy Res. 61, 305{309 (1994).

152


[42] Birlouez-Aragon, I., Pischetsrieder, M., Lecl�ere, J., Morales, F.J., Hasenkopf, K.,

Kientsch-Engel, R., Ducauze, C.J. & Rutledge, D. Assessment of protein glycation

markers in infant formulas. Food Chem. 87, 253{259 (2004).

[43] Pagliarini, E., Vernile, M. & Peri, C. Kinetic study on color changes in milk due

to heat. J. Food Sci. 55, 1766{1777 (1990).

[44] Birlouez-Aragon, I. & Lecl�ere, J. The uorescence of advanced Maillard products

is a good indicator of lysine damage during the Maillard reaction. J. Agric. Food

Chem. 49, 4682{4687 (2001).

[45] Czerwenka, C., Maier, I., Pittner, F. & Lindner, W. Investigation of the lactosy-

lation of whey proteins by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Agric.

Food Chem. 54, 8874{8882 (2006).

[46] Fenaille, F., Parisod, V., Visani, P., Populaire, S., Tabet, J.C. & Guy, P.A. Mo-

di�cations of milk constitutents during processing: a preliminary benchmarking

study. Int. Dairy J. 16, 728{739 (2006).

[47] L�eonil, J., Moll�e, D., Fauquant, J., Maubois, J.L., Pearce, R.J. & Bouhallab, S.

Characterization by ionization mass spectrometry of lactosyl beta-lactoglobulin

conjugates formed during heat treatment of milk and whey and identi�cation of

one lactose-binding site. J. Dairy Sci. 80, 2270{2281 (1997).

[48] Marvin, L.F., Parisod, V., Fay, L.B. & Guy, P.A. Characterization of lactosylated

proteins of infant formula powders using two-dimensional gel electrophoresis and

nanoelectrospray mass spectrometry. Electrophoresis 23, 2505{2512 (2002).

[49] Scaloni, A., Perillo, V., Franco, P., Fedele, E., Froio, R., Ferrara, L. & Bergamo, P.

Characterization of heat-induced lactosylation products in caseins by immunoen-

zymatic and mass spectrometric methodologies. Biochim. Biophys. Acta 1598,

30{39 (2002).

[50] Fenaille, F., Morgan, F., Parisod, V., Tabet, J.C. & Guy, P.A. Solid-state glyca-

tion of beta-lactoglobulin by lactose and galactose: localization of the modi�ed

amino acids using mass spectrometric techniques. J. Mass Spectrom. 39, 16{28

(2004).

153


[51] Hasenkopf, K., �Ubel, B., Bordiehn, T. & Pischetsrieder, M. Determination of the

Maillard product oxalic acidmonolysinylamide (OMA) in heated milk products

by ELISA. Food 45, 206{209 (2001).

[52] Kislinger, T., Humeny, A., Peich, C.C., Zhang, X., Niwa, T., Pischetsrieder, M.

& Becker, C.M. Relative quanti�cation of N(epsilon)-(Carboxymethyl)lysine,

imidazolone A, and the Amadori product in glycated lysozyme by MALDI-TOF

mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 51, 51{57 (2003).

[53] Karas, M. & Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with mole-

cular masses exceeding 10,000 daltons. Anal. Chem. 60, 2299{2301 (1988).

[54] Fenselau, C. MALDI MS and strategies for protein analysis. Anal. Chem. 69,

661A{665A (1997).

[55] Gevaert, K. & Vandekerckhove, J. Protein identi�cation methods in proteomics.

Electrophoresis 21, 1145{1154 (2000).

[56] Kaufmann, R. Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spec-

trometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal

of Biotechnology 41, 155{175 (1995).

[57] Fugate, R.D. & Song, P.S. Spectroscopic characterization of beta-lactoglobulin-

retinol complex. Biochim. Biophys. Acta 625, 28{42 (1980).

[58] Sawyer, L. �-Lactoglobulin. In P. McSweeney, Herausgeber, Advanced Dairy

Chemistry, Vol. 1 Proteins., 319{386. Kluwer Academic/Plenum, New York, 3rd

part a Au . (2003).

[59] Vanaman, T.C., Brew, K. & Hill, R.L. The disul�de bonds of bovine alpha-

lactalbumin. J. Biol. Chem. 245, 4583{4590 (1970).

[60] Kronman, M.J., Sinha, S.K. & Brew, K. Characteristics of the binding of Ca2+

and other divalent metal ions to bovine alpha-lactalbumin. J. Biol. Chem. 256,

8582{8587 (1981).

[61] Siciliano, R., Rega, B., Amoresano, A. & Pucci, P. Modern mass spectrometric

methodologies in monitoring milk quality. Anal. Chem. 72, 408{415 (2000).

154


[62] Galvani, M., Hamdan, M. & Righetti, P.G. Two-dimensional gel electro-

phoresis/matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry of a milk

powder. Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 1889{1897 (2000).

[63] Patterson, S.D. & Aebersold, R. Mass spectrometric approaches for the identi�-

cation of gel-separated proteins. Electrophoresis 16, 1791{1814 (1995).

[64] O'Donnell, R., Holland, J.W., Deeth, H.C. & Alewood, P. Milk proteomics. Int.

Dairy J. 14, 1013{1023 (2004).

[65] Fenaille, F., Morgan, F., Parisod, V., Tabet, J.C. & Guy, P.A. Solid-state glycati-

on of beta-lactoglobulin monitored by electrospray ionisation mass spectrometry

and gel electrophoresis techniques. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1483{

1492 (2003).

[66] Galvani, M., Hamdan, M. & Righetti, P.G. Two-dimensional gel

electrophoresis/matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry of

commercial bovine milk. Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 258{264 (2001).

[67] Hau, J. & Bovetto, L. Characterisation of modi�ed whey protein in milk ingre-

dients by liquid chromatography coupled to electrospray ionisation mass spectro-

metry. J. Chromatogr. A 926, 105{112 (2001).

[68] Sabbadin, S., Seraglia, R., Allegri, G., Bertazzo, A. & Traldi, P. Matrix-assisted

laser desorption/ionization mass spectrometry in evaluation of protein pro�les of

infant formulae. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 1438{1443 (1999).

[69] Morgan, F., Bouhallab, S., Moll�e, D., Henry, G., Maubois, J.-L. & L�eonil, L. Lac-

tolation of beta-lactoglobulin monitored by electrospray ionisation mass spectro-

mety. Int. Dairy J. 8, 95{98 (1998).

[70] Fogliano, V., Monti, S.M., Visconti, A., Randazzo, G., Facchiano, A.M., Colonna,

G. & Ritieni, A. Identi�cation of a beta-lactoglobulin lactosylation site. Biochim.

Biophys. Acta 1388, 295{304 (1998).

[71] Yeboah, F.K. & Yaylayan, V.A. Analysis of glycated proteins by mass spectro-

metric techniques: qualitative and quantitative aspects. Nahrung 45, 164{171

(2001).

155


[72] Tauer, A., Hasenkopf, K., Kislinger, T., Frey, I. & Pischetsrieder, M. Determi-

nation of N(epsilon)-carboxymethyllysine in heated milk products by immuno-

chemical methods. Eur. Food Res. Technol. 209, 72{76 (1999).

[73] Drusch, S., Faist, V. & F., E.H. Determination of N(epsilon)-carboxymethyllysine

in milk products by a modi�ed reversed-phase HPLC method. Food Chem. 65,

547{553 (1999).

[74] Humeny, A., Kislinger, T., Becker, C.M. & Pischetsrieder, M. Qualitative deter-

mination of speci�c protein glycation products by matrix-assisted laser desorp-

tion/ionization mass spectrometry Peptide mapping. J. Agric. Food Chem. 50,

2153{2160 (2002).

[75] Temple, A., Yen, T.Y. & Gronert, S. Identi�cation of speci�c protein carbonyla-

tion sites in model oxidations of human serum albumin. J. Am. Soc. Mass Spec-

trom. 17, 1172{1180 (2006).

[76] Akagawa, M., Sasaki, D., Kurota, Y. & Suyama, K. Formation of alpha-

aminoadipic and gamma-glutamic semialdehydes in proteins by the maillard re-

action. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1043, 129{134 (2005).

[77] Neumann, N.P. Oxidation with hydrogen peroxide. Methods Enzymol. 25, 393{

400 (1972).

[78] Davies, M.J. The oxidative environment and protein damage. Biochim. Biophys.

Acta 1703, 93{109 (2005).

[79] Claiborne, A., Miller, H., Parsonage, D. & Ross, R.P. Protein-sulfenic acid sta-

bilization and function in enzyme catalysis and gene regulation. FASEB J. 7,

1483{1490 (1993).

[80] Dazzi, C., Candiano, G., Massazza, S., Ponzetto, A. & Varesio, L. New high-

performance liquid chromatographic method for the detection of picolinic acid in

biological uids. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 751, 61{68 (2001).

[81] Chelius, D., Jing, K., Lueras, A., Rehder, D.S., Dillon, T.M., Vizel, A., Rajan,

R.S., Li, T., Treuheit, M.J. & Bondarenko, P.V. Formation of pyroglutamic

156


acid from N-terminal glutamic acid in immunoglobulin gamma antibodies. Anal.

Chem. 78, 2370{2376 (2006).

[82] Wenzel, T., Sparbier, K., Mieruch, T. & Kostrzewa, M. 2,5-Dihydroxy-

acetophenone: a matrix for highly sensitive matrix-assisted laser desorpti-

on/ionization time-of- ight mass spectrometric analysis of proteins using manual

and automated preparation techniques. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20,

785{789 (2006).

[83] Elfagm, A.A. & Wheelock, J.V. E�ect of heat on alpha-lactalbumin and beta-

lactoglobulin in bovine milk. J. Dairy Res. 44, 367{371 (1977).

[84] Baer, A., Oroz, M. & Blanc, B. Serological studies on heat-induced interactions

of alpha-lactalbumin and milk proteins. J. Dairy Res. 43, 419{432 (1976).

[85] Calvo, M.M., Leaver, J. & Banks, J.M. In uence of other whey proteins on the

heat-induced aggregation of alpha-lactalbumin. Int. Dairy J. 3, 719{727 (1993).

[86] Marsilio, R., Catinella, S., Seraglia, R. & Traldi, P. Matrix-assisted laser desorp-

tion/ionizaion mass spectrometry for the rapid evaluation of thermal damage in

milk. Rapid Comm. Mass Spec. 9, 550{552 (1995).

[87] Bruker Daltonik GmbH. Pro�ling Kit MB-IMAC Cu. Product Information

(2004).

[88] Bruker Daltonik GmbH. Immunocapturing Kit MB-IAC Prot G. Product Infor-

mation (2006).

[89] Sparbier, K., Wenzel, T. & Kostrzewa, M. Exploring the binding pro�les of ConA,

boronic acid and WGA by MALDI-TOF/TOF MS and magnetic particles. J.

Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 840, 29{36 (2006).

[90] Weber, K. & Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by

dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 244, 4406{4412

(1969).

[91] Lahm, H.W. & Langen, H. Mass spectrometry: a tool for the identi�cation of

proteins separated by gels. Electrophoresis 21, 2105{2114 (2000).

157


[92] Jungblut, P. & Thiede, B. Protein identi�cation from 2-DE gels by MALDI mass

spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 16, 145{162 (1997).

[93] Williams, L.R. Staining nucleic acids and proteins in electrophoresis gels. Biotech.

Histochem. 73, 127{132 (2001).

[94] Syrovy, I. & Hodny, Z. Staining and quanti�cation of proteins separated by

polyacrylamide gel electrophoresis. J. Chromatogr. 569, 175{196 (1991).

[95] Urech, E., Puhan, Z. & Schallibaum, M. Changes in milk protein fraction as

a�ected by subclinical mastitis. J. Dairy Sci. 82, 2402{2411 (1999).

[96] Lopez-Fandino, R., Olano, A., Corzo, N. & Ramos, M. Proteolysis during storage

of UHT milk: di�erences between whole and skim milk. J. Dairy Res. 60, 339{347

(1993).

[97] G�org, A., Weiss, W. & Dunn, M.J. Current two-dimensional electrophoresis

technology for proteomics. Proteomics 4, 3665{3685 (2004).

[98] Galvani, M., Bordini, E., Piubelli, C. & Hamdan, M. E�ect of experimental con-

ditions on the analysis of sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electro-

phoresis separated proteins by matrix-assisted laser desorption/ ionisation mass

spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 18{25 (2000).

[99] Chiari, M., Righetti, P.G., Negri, A., Ceciliani, F. & Ronchi, S. Preincubation

with cysteine prevents modi�cation of sulfhydryl groups in proteins by unreacted

acrylamide in a gel. Electrophoresis 13, 882{884 (1992).

[100] Watkins, N.G., Neglia-Fisher, C.I., Dyer, D.G., Thorpe, S.R. & Baynes, J.W.

E�ect of phosphate on the kinetics and speci�city of glycation of protein. J.

Biol. Chem. 262, 7207{7212 (1987).

[101] Gobbetti, M., Stepaniak, L., De Angelis, M., Corsetti, A. & Di Cagno, R. Latent

bioactive peptides in milk proteins: proteolytic activation and signi�cance in dairy

processing. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 42, 223{239 (2002).

[102] Severin, S. & Wenshui, X. Milk biologically active components as nutraceuticals:

review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 45, 645{656 (2005).

158


[103] Gru�erty, M.B. & Fox, P.F. Milk alkaline proteinase. J. Dairy Res. 55, 609{630

(1988).

[104] Bastian, E.D. & Brown, R.J. Plasmin in milk and dairy products: un update.

Int. Dairy J. 6, 435{457 (1996).

[105] Harwalkar, V.R., Cholette, H., McKellar, R.C. & Emmons, D.B. Relation bet-

ween proteolysis and adstringent o�- avour in milk. J. Dairy Sci. 76, 2521{2527

(1993).

[106] Harwalkar, V.R. & Elliot, J.A. Isolation of bitter and adstringent fractions of

cheddar cheese. J. Dairy Sci. 54, 8{11 (1972).

[107] Yoshino, U., Samuro, M., Yamauchi, K. & Tsugo, T. Comparative study on the

changes of the casein fractions on heating. Agric. Biol. Chem. 28, 82{89 (1964).

[108] Andrews, A.T. Proteinases in normal bovine milk and their action on caseins. J.

Dairy Res. 50, 45{55 (1983).

[109] Morales, F.J. & Jimenez-Flores, R. Monitoring of heat-induced proteolysis in

milk and milk-resembling systems. J. Agric. Food Chem. 46, 4391{4397 (1998).

[110] Rossano, R., Piraino, P., D'Ambrosio, A., O'Connell O, F., Ungaro, N., McSwee-

ney, P.L. & Riccio, P. Proteolysis in miniature cheddar-type cheeses manufactu-

red using extracts from the crustacean Munida as coagulant. J. Biotechnol. 120,

220{227 (2005).

[111] Singh, T.K., Fox, P.F., Hojrup, P. & Healy, A. A scheme for the fractionation of

cheese nirogen and identi�cation of principal peptides. Int. Dairy J. 4, 111{122

(1994).

[112] Aslam, M. & Hurley, W.L. Peptides generated from milk proteins in the bovine

mammary gland during involution. J. Dairy Sci. 81, 748{755 (1998).

[113] Catinella, S., Traldi, P., Pinelli, C. & Dallaturca, E. Matrix-assisted laser desorp-

tion/ionization mass spectrometry: a valid analytical tool in the dairy industry.

Rapid Commun. Mass Spectrom. 10, 1123{1127 (1996).

159


[114] Catinella, S., Traldi, P., Pinelli, C., Dallaturca, E. & Marsilio, R. Matrix-assisted

laser desorption/ionization mass spectrometry in milk science. Rapid Commun.

Mass Spectrom. 10, 1629{1637 (1996).

[115] Fedele, L., Seraglia, R., Battistotti, B., Pinelli, C. & Traldi, P. Matrix-assisted

laser desorption/ionization mass spectrometry for monitoring bacterial protein

digestion in yogurt production. J. Mass Spectrom. 34, 1338{1345 (1999).

[116] Cozzolino, R., Passalacqua, S., Salemi, S. & Garozzo, D. Identi�cation of adul-

teration in water bu�alo mozzarella and in ewe cheese by using whey proteins as

biomarkers and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.

J. Mass Spectrom. 37, 985{991 (2002).

[117] Angeletti, R., Gioacchini, A.M., Seraglia, R., Piro, R. & Traldi, P. The potential

of matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry in the quality

control of water bu�alo mozzarella cheese. J. Mass Spectrom. 33, 525{531 (1998).

[118] Fanton, C., Delogu, G., Maccioni, E., Podda, G., Seraglia, R. & Traldi, P. Matrix-

assisted laser desorption/ionization mass spectrometry in the dairy industry. 2.

The protein �ngerprint of ewe cheese and its application to detection of adulte-

ration by bovine milk. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 1569{1573 (1998).

[119] Schaar, J. Plasmin activity and proteose-peptone content of individual milks. J.

Dairy Res. 52, 369{378 (1985).

[120] Andrews, A.T. & Alichanidis, E. Proteolysis of caseins and the proteoso-peptone

fraction of bovine milk. J. Dairy Res. 50, 275{290 (1983).

[121] Eigel, W.N. E�ect of bovine plasmin on alpha-s1-B and kappa-A caseins. J.

Dairy Sci. 60, 1399{1403 (1977).

[122] McSweeney, P.L., Olson, N.F., Fox, P.F., Healy, A. & Hojrup, P. Proteolytic spe-

ci�ty of plasmin on bovine alpha-s1-casein. Food Biotechnol. 7, 143{158 (1993).

[123] Le Bars, D. & Gripon, J.C. Hydrolysis of alpha-s1-casein by bovine plasmin. Lait

73, 337{344 (1993).

160


[124] Weinstein, M.J. & Doolittle, R.F. Di�erential speci�cities of the thrombin, plas-

min and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors.

Biochim. Biophys. Acta 258, 577{590 (1972).

[125] Hindle, E.J. & Wheelock, J.V. The release of peptides and glycopeptides by the

action of heat on cow's milk. J. Dairy Res. 37, 397{405 (1970).

[126] Guinot-Thomas, P., Al Ammoury, M., Le Roux, Y. & Laurent, F. Study of

proteolysis of raw milk at 4 °C: e�ect of plasmin and microbial proteinases. Int.

Dairy J. 5, 685{697 (1995).

[127] Saint-Denis, T., Humbert, G. & Gaillard, J.-L. Heat inactivation of native plas-

min, plasminogen and plasminogen activators in bovine milk: a revisited story.

Lait 81, 715{729 (2001).

[128] Alichanidis, E., Wrathall, J.H.M. & Andrews, A.T. Heat stability of plasmin

(milk proteinase) and plasminogen. J. Dairy Res. 53, 259{269 (1986).

[129] Fenaille, F., Campos-Gimenez, E., Guy, P.A., Schmitt, C. & Morgan, F. Monito-

ring of beta-lactoglobulin dry-state glycation using various analytical techniques.

Anal. Biochem. 320, 144{148 (2003).

[130] Claeys, W.L., Ludikhuyze, L.R. & Hendrickx, M.E. Formation kinetics of hy-

droxymethylfurfural, lactulose and furosine in milk heated under isothermal and

non-isothermal conditions. J. Dairy Res. 68, 287{301 (2001).

[131] Chen, W.L., Hwang, M.T., Liau, C.Y., Ho, J.C., Hing, K.C. & Mao, S.J.T. Beta-

lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis

and circular dichroic spectra. J. Dairy Sci. 88, 1618{1630 (2005).

[132] Recio, I. & Olieman, C. Determination of denatured serum proteins in the casein

fraction of heat-treated milk by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis

17, 1228{1233 (1996).

[133] Birlouez-Aragon, I., Lecl�ere, J., Quedraogo, C.L., Birlouez, E. & Grongnet, J.F.

The FAST method, a rapid approach of the nutritional quality of heat-treated

foods. Nahrung 45, 201{205 (2001).

161


[134] Erbersdobler, H.F., Dehn, B., Nangpal, A. & Reuter, H. Determination of furosine

in heated milk as a measure of heat intensity during processing. J. Dairy Res.

54, 147{151 (1987).

[135] Resmini, P., Pellegrino, L., Hogenboom, J.A. & Andreini, R. Thermal denatura-

tion of whey protein in pasteurized milk. Fast evaluation by HPLC. Ital. J. Food

Sci. 1, 51{62 (1989).

[136] Vasbinder, A.J., Alting, A.C. & G., D.K.K. Quanti�cation of heat-induced casein-

whey interactions in milk and its relation to gelation kinetics. Coll. Surf. B 31,

115{123 (2003).

[137] Law, A.J. & Leaver, J. E�ect of pH on the thermal denaturation of whey proteins

in milk. J. Agric. Food Chem. 48, 672{679 (2000).

[138] Torre, M., Cohen, M.E., Corzo, N., Rodriguez, M.A. & Diez-Masa, J.C. Perfusion

liquid chromatography of whey proteins. J. Chromatogr. A 729, 99{111 (1996).

[139] Bordin, G., Cordeiro Raposo, F., de la Calle, B. & Rodriguez, A.R. Identi�cation

and quanti�cation of major bovine milk proteins by liquid chromatography. J.

Chromatogr. A 928, 63{76 (2001).

[140] Elgar, D.F., Norris, C.S., Ayers, J.S., Pritchard, M., Otter, D.E. & Palmano,

K.P. Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey prote-

ins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-

performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene. J. Chroma-

togr. A 878, 183{196 (2000).

[141] Birlouez-Aragon, I., Sabat, P. & Gouti, N. A new method for discriminating milk

heat treatment. Int. Dairy J. 12, 59{67 (2002).

[142] Lecl�ere, J. & Birlouez-Aragon, I. The uorescence of advanced Maillard products

is a good indicator of lysine damage during the Maillard reaction. J. Agric. Food

Chem. 49, 4682{4687 (2001).

[143] Dalgleish, D.G. Denaturation and aggregation of serum proteins and caseins in

heated milk. J. Agric. Food Chem. 38, 1995{1999 (1990).

162


[144] De Wit, J.N. & Klarenbek, G. E�ects of various heat treatments on the structure

stability of whey proteins. J. Dairy Sci. 67, 2701{2710 (1984).

[145] Kulmyrzaev, A. & Dufour, E. Determination of lactulose and furosine in milk

using front-face uorescence spectroscopy. Lait 82, 725{735 (2002).

[146] Morales, F.J., Romero, C. & Jim�enez-P�erez, S. Fluorescence associated with

Maillard reaction in milk and milk-resembling systems. Food Chem. 57, 423{428

(1996).

[147] Birlouez-Aragon, I., Nicolas, M., Metais, A., Marchond, N., Grenier, J. & Calvo,

D. A rapid uorimetric method to estimate the heat treatment of liquid milk.

Int. Dairy J. 8, 771{777 (1998).

[148] Tessier, F. & Birlouez-Aragon, I. E�ect of pH, phosphate and copper on the

interaction of glucose with albumin. Glycoconj. J. 15, 571{574 (1998).

[149] Erbersdobler, H.F. & Somoza, V. Forty years of furosine - forty years of using

Maillard reaction products as indicators of the nutritional quality of foods. Mol.

Nutr. Food Res. 51, 423{430 (2007).

[150] Krause, R., Knoll, K. & Henle, T. Studies on the formation of furosine and

pyridosine during acid hydrolysis of di�erent Amadori products of lysine. Eur.

Food Res. Technol. 216, 277{283 (2003).

[151] Henle, T., Zehetner, G. & Klostermeyer, H. Fast and sensitive determination of

furosine. Eur. Food Res. Technol. 200, 235{237 (1995).

[152] Delgado, T., Corzo, N., Santa-Maria, G., Jimeno, M.L. & A., O. Determination

of furosine in milk samples by ion-pair reversed phase liquid chromatography.

Chromatographia 33, 374{376 (1992).

[153] Tirelli, A. & Pellegrino, L. Determination of furosine in dairy products by ca-

pillary zone electrophoresis: a comparison with the HPLC method. Ital. J. Food

Sci. 7, 379{385 (1995).

[154] Turner, L.G., Swaisgood, H.E. & Hansen, A.P. Interaction of lactose and proteins

of skim milk during ultra-high-temperature processing. J. Dairy Sci. 61, 384{392

(1978).

163


[155] Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature 227, 680{685 (1970).

164

Lebenslauf

Pers�onliche Daten

Name Jasmin Meltretter

Geburtsdatum 20.06.1979

Geburtsort Hammelburg

Staatsangeh�origkeit deutsch

Familienstand ledig

Schulbildung

09/1985 - 07/1989 Kunigundenschule Lauf an der Pegnitz

09/1989 - 06/1998 Christoph-Jacob-Treu-Gymnasium Lauf an der Pegnitz

Hochschulausbildung

10/1998 - 10/2002 Studium der Lebensmittelchemie, Friedrich-Alexander-

Universit�at Erlangen-N�urnberg

10/2002 Erste Staatspr�ufung f�ur Lebensmittelchemiker

02/2003 - 07/2003 Praktikantin am Zentralen Institut des Sanit�atsdienstes der

Bundeswehr, Garching

08/2003 - 01/2004 Praktikantin am Landesamt f�ur Gesundheit und Lebensmittel-

sicherheit (LGL), Erlangen

01/2004 Zweite Staatspr�ufung f�ur Lebensmittelchemiker

10/2004 - 02/2005 Forschungsaufenthalt am Institut National de la Recherche

Agronomique (INRA), Paris

04/2004 - 10/2007 Promotion am Lehrstuhl f�ur Lebensmittelchemie, Friedrich-

Alexander-Universit�at Erlangen-N�urnberg

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Documents

Massenspektrometrische Analytik von Proteinmodi kationen ... · Massenspektrometrische Analytik von Proteinmodi kationen in thermisch behandelter Milch Den Naturwissenschaftlichen