Materi Asistensi Biomedik Fk Uns2009

5/21/2018 Materi Asistensi Biomedik Fk Uns2009

1/

Materi Asistensi Biomedik FK UNS 2009-Afono Agung Prasetyo

BAB I

EKSTRAKSI ASAM NUKLEAT

A. Pendahuluan

Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang

harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi

atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari

komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat

yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik

biologi molekular lainnya.

Protokol ekstraksi atau isolasi asam nukleat biasanya melibatkan proses

fisik dan kimia. Proses tersebut biasanya dimulai dengan homogenisasi jaringan

untuk meningkatkan jumlah sel atau permukaan area yang akan dilisiskan.

Homogenisasi jaringan sangat berguna untuk mengekstrak asam nukleat dari

organ atau jaringan. Langkah selanjutnya biasanya adalah permeabilisasi sel

target. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan detergen non-

ionik (sehingga tidak mengikat asam nukleat) seperti Teen, !"! (Sodium

Dodecyl Sulfate), #onidet, Laureth dan Triton. $ntuk melepaskan asam nukleat di

dalamnya sel perlu dilisiskan terlebih dahulu (biasanya menggunakan bufer

hipotonik). Langkah selanjutnya berupa degradasi dan presipitasi protein (dengan

pemanasan, en%ime proteinase atau dengan menggunakan garam chaotropic).

&sam nukleat yang diperoleh dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam

'olume yang lebih keil. Presipitat yang sering digunakan adalah isopropanol,

etanol, dan PE (polyethylene glycol). !etelah dilakukan penuian, langkah


2/


terakhir adalah solubilisasi asam nukleat.

*etode yang paling dikenal untuk ekstraksi+isolasi asam nukleat adalah

metode fenol+khloroform+isoamilalkohol. *etode ini sangat bermanfaat untuk

aplikasi P karena dapat membantu menghilangkan penghambat P yang

terdapat pada larutan ekstrak. *etode ini akan menghasilkan lapisan air yang

mengandung asam nukleat, lapisan antara fenol dan air yang berisi protein

penghambat yang mengalami presipitasi dan polimer (termasuk karbohidrat), dan

lapisan khloroform-isoamilalkohol yang mengikat lemak. !etelah ektraksi fenol

ini, lapisan air dipindahkan ke tabung mikrosentrifus steril dan asam nukleat

dipresipitasi dengan menambahkan * !odium asetat pH /,0 yang diikuti dengan

penuian menggunakan etanol 1223 dilanjutkan dengan etanol 423 untuk

membuang sisa fenol dan garam. *eskipun sangat murah dan relatif mudah, yang

perlu diingat adalah phenol+khloroform+isoamilalkohol sangat toksik dan

limbahnya perlu perlakukan khusus sebelum dibuang.

B. Ekstraksi DNA

!aat ini kita dapat menemukan berbagai maam metode ektraksi "#&.

Para peneliti selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau

mengurangi jumlah perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan

terlalu kompleks sering meningkatkan resiko kegagalan, terutama bagi pemula.

Tahapan atau perlakuan dalam ekstraksi "#& juga dipengaruhi asal sel+jaringan

target. Pada modul praktikum ini akan dibahas prinsip dasar ekstraksi "#& seara

umum.


3/


"#& biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang

melisiskan sel tetapi menegah fragmentasi "#&. Langkah ini biasanya

melibatkan E"T& (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut

akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh en%im "#ase).

5dealnya dinding sel (jika ada) didigesti seara en%imatis (misalnya dengan en%im

lisosim). !elanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. 6ika

disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin. "alam proses

disrupsi ini en%im nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat menerna

asam nukleat seara efisien, sehingga kerja en%im nuklease harus dihambat.

"isrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada

suhu 7 2, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-

autola'e (fungsi autola'e adalah untuk menghanurkan akti'itas "#ase pada

alat atau larutan tersebut). !etelah melepaskan asam nukleat dari sel, #& dapat

dihilangkan dengan penambahan #ase yang telah diterapi panas untuk

menginakti'asi "#ase kontaminan (#ase relatif stabil terhadap panas karena

adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika

didinginkan). 8ontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan

dengan larutan fenol atau ampuran fenol-khloroform (keduanya akan

mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). !etelah

ampuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. !etelah

pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian baah dan bagian a9ueous

di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi.

airan a9ueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi


4/


material yang terlihat pada lapisan tengah. 8emudian "#& yang sudah tidak

mengandung protein ini diampur dengan dua bagian etanol. "#& akan menjadi

presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. !etelah dipusingkan, pelet "#&

kemudian dilarutkan kembali.

!eara umum mekanisme isolasi total "#& seluler seara kon'ensional adalah

sebagai berikut:

1. homogenisasi sel+jaringan (dalam suhu 7 2, semua bahan dan peralatan steril)

0. lisis seluler (dengan detergen atau lisosim)

. penambahan chelating agents: E"T&+sitrat

7. penambahan proteinase (proteinase 8)

/. ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)

;. presipitasi alkohol (423 atau 1223 etanol)

4. pelarutan kembali "#&, misalnya dengan bufer TE (Tris-E"T&)


5/


tinggi dan konsentrasi garam yang rendah dapat digunakan untuk menui-

lepaskan asam nukleat dari matriks silika. ara lain pemanfaatan silika dalam

proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan perubahan kimia pada

matriks silika sehingga akan seara spesifik berikatan dengan protein atau

polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya). Ekstraksi

asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat

kit komersial. *atriks silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam

berbagai bentuk, seperti filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi

(celite,plain-coarse silicate), bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads).

=iltrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam

nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan

protein melalui langkah pembilasan yang multipel. *etode ini juga mendasari

pembuatan alat ekstraksi asam nukleat. *etode alternatif yang berbasis matriks

silika antara lain teknik hibridisasi fragmen asam nukleat yang menggunakan

probeyang didesain spesifik yang melekat pada matriks solid atau beadmagnetik.

8elemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama proses

pelekatan dan ui-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya "#& target.

"#& juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel 'irus. $ntuk

ekstraksi "#& semaam ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau 'irus

tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi "#&-nya karena isolasi

"#& target dari ampuran "#& ("#& total) relatif sulit. 6ika dibutuhkan isolat

"#& dengan kemurnian yang tinggi, "#& dapat dimurnikan dengan density

gradient centrifugationmenggunakan sl (Caesium chloride).


6/


$ntuk memeriksa integritas "#& dapat dilakukan dengan elektroforesis

pada gel agarose. !eara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada

gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat "#&

kita. ara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian "#&

yang diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer $>. "#& untai

tunggal mempunyai koefisien absorbsi 2,204, "#& untai ganda 2,20 dan #&

2,20/ g per-ml per-m pada panjang gelombang 0;2 nm. asio absorbsi 0;2+0?2

nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol

(protein memiliki absorbsi maksimum pada 0?2 nm). !ampel "#& yang murni

memiliki rasio 0;2+0?2 nm sebesar 1,?-1,@, sedangkan sampel #& yang murni

1,@-0,2. 6ika rasio tersebut di baah 1,? berarti ada ketidakmurnian yang

signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. !aat ini sudah banyak dijual

alat spektrofotometer otomatik yang seara otomatis mengkalkulasi rasio 0;2+0?2

nm dan kuantitas asam nukleat. Aang perlu diingat dalam penggunaan

spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan

larutan BblankC sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel. Aang

digunakan sebagai BblankC adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam

nukleat yang diperiksa.

C. Ekstraksi RNA

*etode untuk ekstraksi #& mirip dengan metode ekstraksi "#&.

#amun, molekul #& relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing

sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. *eskipun begitu,


7/


#& sangat mudah didigesti oleh #ase yang terdapat endogen dengan

konsentrasi yang ber'ariasi di dalam sel dan di eksogen di jari. !ehingga, untuk

ektraksi #& harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan

untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi #ase

yang ada. Proses deproteinisasi harus dilakukan seara lebih agresif karena #&

sering berikatan kuat dengan protein. Penambahan "#ase dapat digunakan untuk

menghilangkan "#&. #& kemudian dipresipitasi dengan etanol. eagen yang

sering digunakan untuk ekstraksi #& adalah guanidinium thiocyanate yang

merupakan inhibitor kuat #ase dan merupakan denaturan protein. 5ntegritas

#& dapat diek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. !pesies #&

yang terbanyak (molekul r#&) berukuran 0! dan 1;! untuk prokariot dan 1?!

dan 0?! untuk eukariot. #& tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit

dalam gel agarose dan mengindikasikan komponen #& lainnya masih utuh.

Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk menegah

terjadinya formasi struktur sekunder pada #&.

#& sangat sensitif terhadap nuklease. !emua basa #& memiliki grup 0-

hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan

merusakkan rantai gulanya. Aang perlu diingat, nuklease (#ase) relatif stabil di

lingkungan dan bahkan kadang masih dapat bertahan setelah proses denaturasi

panas dan ekstraksi fenol.

&kti'itas nuklease selama proses ekstraksi asam nukleat dapat dikurangi dengan

ara:

- *empertahankan suhu inkubasi dan sentrifugasi di baah suhu optimum


8/3


nuklease (4 2), misalnya dengan mempertahankan larutan ekstrak pada suhu

es atau 7 2.

- *enginakti'asi nuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis pakai

dengan bahan kimia seperti "EP (diethylpyrocarbonate).

- 5nakti'asi dan atau penghambatan seara kimiai, misalnya dengan fenol atau

garam guanidinium.

- Penghilangan ion logam ko-faktor untuk nuklease dengan chelating agent.

$ntuk mengisolasi m#& eukariotik (yang hanya 0-/3 dari #& selular)

dari ampuran molekular #& total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi

terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi, m#&

yang mengandung ekor poli(&) akan berikatan dengan molekul oligo(dT)

komplementer pada kolumn afinitas, sehingga m#& tetap tertinggal, sedangkan

molekul #& lainnya dapat diui bersih dari kolumn menggunakan larutan

tinggi garam. !elanjutnya, m#& yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam

berkonsentrasi rendah.

D. Penyimanan Asam Nukleat

Penyimpanan larutan "#& atau #& sering problematik. 6ika ingin

disimpan dalam aktu lama larutan "#& dapat disimpan dalam bentuk ali9uot

dalam -02 2 atau -42 2 untuk menghindari kerusakan karena pengulangan

freeze-thawing. $ntuk pemakaian Bsehari-hariC "#& dapat disimpan dalam 7 2

untuk beberapa bulan. Hanya saja, jika "#& dilarutkan dalam air, kualitas "#&

tersebut dapat memburuk jika disimpan dalam 7 2 ("#& akan bersifat asam

lemah dalam air). $ntuk mengatasinya, "#& dapat dilarutkan dalam bufer TE


9/


(Tris-E"T&). !ayangnya, E"T& merupakan chelating agentyang dapat mengikat

ion *g sehingga dapat menjadi masalah jika digunakan untuk pemeriksaan P.

Tris tidak memiliki efek penghambatan terhadap akti'itas Ta9 polimerase, hanya

saja kesuksesan dan reproduksibilitasnya sering bergantung pada pH reaksi

ampuran P. Larutan #& juga dapat disimpan dalam bentuk ali9uot dalam

-02 2 atau -42 2. $ntuk penyimpanan dalam aktu lama #& sebaiknya

disimpan dalam suhu -422

atau jika memungkinkan dalam nitrogen air (-1@;2).


10


Ekstraksi DNA dari Darah Met!de Ka"asaki untuk Alikasi PCR

Rea#en$

1) Proteinase 8 (02 mg+ml dalam 12 m* Tris-l pH 4,/)

0)


11


BAB II

PCR %POLYMERASE CHAIN REACTION&

A. Prinsi Dasar PCR

P merupakan teknik amplifikasi "#& selektif in vitro yang meniru

fenomena replikasi "#& in vivo. 8omponen reaksi yang diperlukan dalam teknik

ini adalah untai tunggal "#& sebagai etakan, primer (sekuens oligonukleotida

yang mengkomplementeri akhiran sekuens etakan "#& yang sudah ditentukan),

d#TPs (deoxynucleotide triphosphates), dan en%im polimerase "#&.

1. "#&

$ntuk aplikasi P, kemurnian "#& mempengaruhi hasil. "#& yang tidak

murni sering menyebabkan masalah reproduksibilitas. $ntuk tujuan diagnosis

"#& (atau #&) harus dimurnikan dahulu sebelum diproses dengan P.

"alam proses isolasi tersebut "#& yang dihasilkan sebaiknya bebas

nuklease, endo-atau eksoprotease, dan DNA-binding protein. 8husus untuk

#&, karena #& tidak dapat digunakan sebagai etakan langsung untuk

P, maka diperlukan tahapan transkripsi balik untuk membuat m#&

menjadi "#& komplementernya ("#&) yang kemudian dapat digunakan

sebagai etakan untuk P. Teknik ini disebut dengan T-P (reverse

transcription-C!atau P transkripsi balik).

0. Primer

Primer P adalah komponen yang sangat menentukan keberhasilan P.

!angat penting untuk mendesain sepasang primer yang Bbaik-efektif-efisienC.

&da beberapa program untuk mendesain primer P yang dapat digunakan


12


seara gratis, seperti *E"$!&, Primer, Primeruest, dan lain-lain.

Penggunaan program semaam ini sangat disarankan untuk mendesain

protokol P baru. *eskipun begitu, kita juga dapat mendesain primer P

seara manual berbekal beberapa aturan dasar. 8elebihan dari desain primer

seara manual adalah kita dapat mendesain primer P yang efektif dengan

karakteristik yang mungkin Ftidak diijinkanF oleh program yang ada.

&turan dasar tersebut adalah sebagai berikut:

- Panjang primer sebaiknya antara 1?-2 nukleotida (keuali untuk tujuan

tertentu).

- !ekuens dalam primer sebaiknya tidak mengandung daerah

komplementari internal.

- !ebaiknya dalam sepasang primer tidak ada daerah yang saling

berkomplementari.

- "alam primer tidak ada struktur sekunder.

- *emiliki kandungan (guanosine dan cytosine) /23. Hindari

ketidakseimbangan distribusi daerah kaya + dan &+T.

- $ntuk P diagnostik pilih primer P yang mengamplifikasi daerah

yang stabil seara genetik.

-Perbedaan suhu anealing dalam suatu pasangan primer jangan lebih dari

/ 2.

P dapat digunakan untuk berbagai maam aplikasi. &plikasi yang berbasis

P biasanya membutuhkan primer P yang telah dimodifikasi. &da

berbagai maam modifikasi primer P yang mungkin kita lakukan, namun

pada prinsipnya adalah:


13


a. *odifikasi /Gend

-Penambahan tempat restriksi (sekuens yang dapat dikenali oleh

en%im restriksi endonuklease)

- Penambahan sekuens pengatur

- Penambahan Promotor dan

- Penambahan label

- Penambahan "C-clamp

b. Degenerate primer

- Site directed mutagenesis

- "P (degenerate oligonucleotide primer) P

- Translasi sekuens asam amino ke dalam sekuens genomik

- Primer uni'ersal

- Primer kompetitor

. #iscellaneous

- Primer sekuens berulang

- Primer concatemeric

- Primer P multipleks

- *egaprimer

- #olecular beacon

. d#TPs (Deoxynucleotide triphosphates)

d#TP! merupakan blok pembangun molekul asam nukleat yang terdiri dari

deoxyadenosine triphosphate (d&TP), deoxythymidine triphosphate (dTTP),

deoxycytosine triphosphate (dTP), dan deoxyguanosine triphosphate

(dTP). "alam beberapa aplikasi dan protokol P, salah satu dari empat

d#TP tersebut dapat diganti elemen analog. *odifikasi ini berguna untuk


14


aplikasi yang berbasis paska-P.

7. Polimerase "#&

8etika terjadi sintesis "#&, en%im polimerase "#& akan melakukan seleksi

nukleotida yang tepat untuk ditambahkan ke primer untuk melanjutkan rantai

"#& sesuai dengan aturan pasangan basa Iatson-rik (&:T dan :).

Polimerase "#& selalu mengkatalis sintesis "#& dalam orientasi /G ke G.

ent, >ent,

$li, Proofstart,&'@0,fx,wo, dan Thermal &e.

/.


15


5on *ono'alen seperti #aK, 8Kdan #H7Kmenstimulasi akti'itas polimerase

"#& dan melindungi muatan negatif gugus fosfat "#&, sehingga

melemahkan kekuatan elektronik yang saling menolak antara primer dan "#&

target. 5on *g0K berperan sebagai ko-faktor akti'itas polimerase "#&

thermostabil. !eara umum konsentrasi ion *g0K yang sering digunakan

adalah 0,/ m* (antara 2,/-/ m*). Aang perlu diingat, konsentrasi ion

magnesium yang berlebihan menghambat reaksi amplifikasi P.

B. Reaksi PCR

Pada prinsipnya, reaksi P (protokol P kon'ensional) membutuhkan

tiga tahap:

1. "enaturasi (*elting)

Prinsipnya adalah memisahkan "#& untai ganda menjadi komponen untai

tunggal, sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi primer P untai

tunggal pada sekuens targetnya (jika ada).

0. Annealing(Hibridisasi) Primer P

Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer P pada sekuens targetnya. !eara

umum suhu annealing P biasanya berasal dari suhu annealingprimer hasil

kalkulasi matematis dikurangi / derajat elius, dengan kata lain primer

dapat berikatan dengan target komplementarinya dan jika sudah terhibridisasi

tidak mudah mengalami disosiasi. Iaktu yang dibutuhkan biasanya 1/-;2

detik.

. Elongasi (ekstensi rantai "#&)

Tahap ini penting untuk mengamplifikasi daerah yang sudah dihibridisasi


16


oleh primer, dari /Gend ke Gend. !ebagian besar en%ym polimerase

membutuhkan suhu elongasi 40 2. !eara umum suhu elongasi sebaiknya /

2 di baah suhu melting seluruh amplimer. Hal lain yang perlu

dipertimbangkan dalam menentukan langkah elongasi adalah aktu inkubasi,

yaitu sebaiknya ukup panjang bagi polimerase "#& mengamplifikasi

sekuens target seara komplit tetapi ukup pendek untuk menegah

amplifikasi produk non-spesifik yang lebih panjang daripada sekuens target.

!eara detail, protokol suatu P tergantung dari tujuan, en%im polimerase,

primer, bahkan kit yang digunakan.

isualisasi produk amplifikasi P:

1. mengeat "#& untai ganda dengan bahan pearna kimia atau ion perak yang

berinterkalasi di antara untai ganda "#&

0. labelisasi primer P atau nukleotida d#TP dengan bahan pearna fluoresen


17


(fluorophore) atau hapten sebelum amplifikasi P

D. P!siti( Palsu dan Ne#ati( Palsu

1. Positif Palsu

Penyebab tersering hasil P yang positif palsu:

- Primer yang digunakan tidak ukup selektif.

- !uhu annealing primer terlalu rendah.

- Terlalu banyak siklus P.

0. #egatif Palsu

Hasil negatif palsu terjadi jika kontrol positif atau sampel yang telah diketahui

mengandung molekul target P spesifik ternyata memberikan hasil

pemeriksaan yang negatif.

Penyebab tersering hasil P yang negati'e palsud:

- 6umlah "#& target dalam sampel di baah ambang batas deteksi.

- Terdapat faktor yang mendenaturasi atau menghambat kerja Ta9

polimerase.

- pH dan atau sistem bufer yang tidak tepat.

- Prosedur deteksi amplimer yang kurang sensitif.

- Problem pada elektroforesis gel.

- *utasi pada etakan atau oligomer.

- "epurinasi.

- angguan pada proses denaturasi "#& atau hibridisasi primer.

- Problem pada reaksi thermocycling.

- 8ehilangan asam nukleat pada proses ekstraksi asam nukleat.

- &sam nukleat tidak terkestrak.


18/


- !truktur sekunder pada asam nukleat target.

E. Alikasi Medis PCR

&plikasi medis P utama adalah deteksi patogen infeksius dan

identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit.

ontohnya, antara lain:

- "eteksi polimorfisme: =LP (restriction fragment length polymorphisms),

>#T (variable number of tandem repeat se(uences), dan !T (short

tandem repeats)

- !kreening+deteksi mutasi berbasis P

- P kuantitatif: dengan menggunakan kompetitor+mimic(internal exogenous

standards), dengan housekeeping gene (internal endogenous standard), atau

dengan eal-Time P.

>ariasi dan adaptasi protokol P kon'ensional:

- Labelisasi amplimer P untuk 'isualisasi produk P, pembuatan probe

"#& dan kloning.

- P dua langkah (denaturasi dan kombinasi annealing K

ekstensi+amplifikasi).

-P booster (untuk menghambat akumulasi amplimer non spesifik dan

komplek primer dimer).

- P%ot-Startdan $ime-!elease(untuk mengurangi pembentukan amplimer

non spesifik).

- )nverse P (untuk mengamplifikasi daerah yang belum diketahui

sekuensnya yang terletak tepat di atas atau di baah daerah yang sudah


19


diketahui sekuensnya).

-P asimetrik (salah satu primer P mempunyai konsentrasi yang lebih

tinggi dibandingkan primer pasangannya sehingga menghasilkan konsentrasi

tinggi molekul "#& untai tunggal).

- !ekuensing "#& yang dimediasi P.

- P $ouchdown dan $ouch-'p (untuk sampel "#& komplek yang hanya

mengandung sedikit molekul etakan, P multiplek, amplifikasi selektif

daerah target dimana satu atau lebih sekuens primer sangat mirip dengan

sekuens lainnya yang terdapat dalam etakan "#& yang digunakan, untuk

protokol umum P dengan banyak pasangan primer P).

- P multiplek (menggunakan beberapa pasangan primer dalam ampuran

P yang sama untuk mengamplifikasi beberapa target yang berbeda pada

aktu yang sama).

- P degenerasi (menggunakan ampuran primer P yang didesain untuk

mengamplifikasi sekuens target "#& genetik yang sama dimana diharapkan

ada sejumlah keil perubahan nukleotida antara isolat atau indi'idual yang

berbeda)+

- P repeatdan inter-repeat. P repeat(untuk menentukan panjang daerah

genetik yang mengandung sekuens pengulangan tandem. P inter-repeat

dilakukan dengan teknik &P" (random amplification of polymorphic DNA)

atau arbitrary primed (&P-P) untuk mengetahui keberadaan daerah

pengulangan sekuens genetik).

- &=LP-P (amplification fragment length polymorphism) untuk

membedakan isolat atau spesies yang berbeda berdasarkan keberadaan daerah


20


en%im restriksi (polimorfisme daerah restriksi).

-


21


Penegahan terhadap kontaminasi dimulai dari masalah penataan ruang

dan peralatan. *asing-masing alat sebaiknya diletakkan dalam ruangan yang

terpisah sesuai dengan peruntukkannya. !ebaiknya, untuk menghindari terjadinya

kontaminasi, semua langkah yang berhubungan dengan persiapan P

(pengolahan spesimen, persiapan reaksi P, dan sintesis primer) dilakukan di

ruangan yang bertekanan positif untuk menegah masuknya kontaminan dan

aerosol. $ntuk tahapan P (thermocycling) dan elektroforesis gel untuk analisis

produk P sebaiknya dilakukan di ruangan yang bertekanan negatif untuk

menegah keluarnya aerosol yang terkontaminasi produk P ke luar ruangan.

$rutan perjalanan bahan dan personel yang melakukan teknik P harus

dalam urutan yang semestinya dan tidak berulang. !ebagai ontoh, setelah

mempersiapkan reaksi P dilanjutkan dengan langkah memasukkan sampel, lalu

melakukan P, dan terakhir elektroforesis. !pesimen klinis dan produk P

merupakan sumber kontaminasi utama sehingga T5"&8


22


Pakaian laboratorium tersebut juga sebaiknya dilabel yang jelas, diui bersih dan

di-autoclave seara teratur, dan penggunaannya seara ketat dibatasi sesuai

dengan ruangan dan personel yang bersangkutan.

!ebagai langkah penegahan kontaminasi, semua tabung yang

mengandung spesimen klinis, reaksi P, primer, dan asam nukleat disentrifugasi

dahulu sebelum dibuka untuk mengurangi kontaminasi aerosol ketika membuka

tutupnya. !emua bahan yang digunakan (tabung mikrosentrifus, tip, bufer, larutan,

dll) sebaiknya dalam keadaan steril (disterilisasi dahulu sebelum dipakai).

5dealnya permukaan meja laboratorium dibersihkan dengan 1 # Hl seara teratur

atau menggunakan sinar-u' atau radiasi sinar gama selama satu malam untuk

menghanurkan aerosol kontaminan yang dihasilkan selama bekerja seharian.

!umber kontaminasi terpenting pada laboratorium P adalah aerosol.

!ayangnya, hampir semua tahapan dalam teknik biomol dapat menghasilkan

produk aerosol. &erosol ini dapat bertahan di udara ruangan selama beberapa jam

dan dapat menyebar apabila ada aliran udara yang masuk+keluar seperti ketika

pintu laboratorium dibuka+ditutup. &erosol ini dapat menempel pada meja, baju,

tangan, bahkan pada reaksi P yang sedang dibuat. 8ontaminan yang terdapat

pada tangan+baju+rambut juga dapat mengkontaminasi reaksi P BsterilC.

!umber kontaminan penting lainnya adalah debu. "ebu yang terkontaminasi

plasmid, "#&, atau produk P ini dapat menyebar dengan mudah apabila "ood

,aboratory ractice tidak dijalankan dengan baik (misalnya, pakaian dan atau

sarung tangan yang digunakan ketika melakukan elektroforesis produk P

dibaa ke ruangan lain).


23


Pembagian uangan Laboratorium P:

1. uangan B


24


BAB III

ELEKTR+)+RESIS ,EL

A. Pendahuluan

Elektroforesis adalah perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon

terhadap medan listrik. &ngka perpindahan tergantung pada kekuatan medan

listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, 'iskositas, dan

suhu medium yang digunakan oleh molekul tersebut untuk berpindah.

Elektroforesis merupakan alat analisis yang simpel, epat, dan mempunyai

sensiti'itas yang tinggi. Elektroforesis digunakan untuk mempelajari properti

spesies bermuatan tunggal dan juga untuk teknik separasi. Elektroforesis sering

digunakan untuk mengkarakterisasi massa molekular polinukleotida dan

polipeptida, seperti kemurnian, heterogenisitas+adanya degradasi, dan komposisi

subunit polinukleotida dan polipeptida.

&da beberapa 'ariasi teknik elektroforesis. *asing-masing menghasilkan

informasi yang berbeda-beda sehingga mempunyai kegunaan yang berbeda-beda

pula. !eara umum, sampel akan dijalankan di suatu matriks+medium. *edium

yang sering digunakan adalah agarose dan poliakrilamid, yang merupakan gel

berpori, dan dalam kondisi tertentu dapat memisahkan molekul berdasarkan

ukurannya.

B. Elektr!(!resis ,el DNA

*aterial elektroforesis gel yang sering digunakan untuk "#& adalah


25


agarose dan akrilamid. Elektroforesis menggunakan gel agarose atau

poliakrilamid merupakan metode standart untuk memisahkan, mengidentifikasi

dan memurnikan fragmen "#&. *etode paling mudah dan paling sering

digunakan adalah dengan gel agarose horisontal. Teknik ini sangat sederhana,

tidak memakan banyak aktu, dan dapat menghasilkan fragmen "#& yang tidak

dapat dipisahkan seara adekuat dengan prosedur lain seperti density gradient

centrifugation. el agarose dapat digunakan untuk memisahkan molekul yang

berukuran lebih dari 122 bp (base pairs). $ntuk resolusi yang lebih tinggi atau

untuk separasi yang lebih efektif dari molekul "#& yang lebih pendek sebaiknya

menggunakan gel poliakrilamid.

el akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan fragmen "#&

keil, biasanya berukuran kurang dari 122 bp. el ini biasanya menggunakan

akrilamid berkonsentrasi rendah (;3) dan mengandung agen denaturing non-

ionik (urea ;*). &gen denaturing ini berperan untuk menegah pembentukan

formasi struktur sekunder oligonukleotida sehingga memungkinkan penentuan

massa molekular yang akurat.

"#& merupakan molekul yang bersifat asam, sehingga akan bergerak dari

kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda). Pergerakan "#& di dalam gel

tergantung pada berat+ukuran molekul "#&, bentuk konformasi "#&,

konsentrasi agarosa, tegangan listrik yang digunakan dan kekuatan bufer

elektroforesis. 6enis bufer yang digunakan untuk elektroforesis juga

mempengaruhi resolusi pemisahan "#&.


26


dari 7 kb, sedangkan bufer T


27


diantara stacked base-pairs, yang disebut dengan interkalasi, dan akan

menghasilkan arna orange+merah fluoresen ketika diiluminasi dengan ahaya

$>. Et


28/


Elektr!(!resis ,el A#ar!se

Pem-uatan ,el A#ar!se

&lat yang dibutuhkan:

- Submarine gel apparatus, termasuk di antaranya glass plate, comb, dan

surround.

-Ethidium bromide 12 mg+mL atau !A


29


?. !iapkan 1 l ;D gel loading dyeuntuk setiap / l larutan "#&(atau #&),

ampur dengan baik menggunakan pipet. Tuangkan ampuran tersebut ke

dalam sumur.

@. Elektroforesis /2-1/2 >olt, sampai dye marker bermigrasi seukupnya,

tergantung dari ukuran "#& yang akan di'isualisasikan.

6ika gel belum diampur dengan Et


30


Ba- '

Pen#enalan Enym Restriksi

En%im restriksi atau disebut juga en%im endonuklease restriksi merupakan

bagian dari sistem kekebalan bakteri untuk melindungi bakteri dari infeksi "#&

asing. En%im endonuklease restriksi biasanya diberi nama berdasarkan nama

bakteri asal en%im tersebut diisolasi. !aat ini telah dikenal lebih dari 022 en%im

restriksi dengan sekuens tempat pembelahan yang spesifik. $ntuk mempermudah

pemahamam tentang ara kerja en%im restriksi akan digunakan ontoh bakteri

penghasil en%im Eo5.

Eo5 merupakan en%im yang mengenali sekuens /G-O&&TT-G. $ntuk

melindungi "#& dalam selnya, bakteri penghasil Eo5 tersebut menghasilkan

en%im metilase. En%im metilase dalam bakteri tersebut akan memetilasi basa &

kedua dalam urutan sekuens tersebut (&ATT). !eara garis besar en%im

endonuklease restriksi bakteri akan mendigest pada atau di dekat tempat yang

dikenali+dimetilasi oleh en%im metilase yang dihasilkan bakteri tersebut. "alam

hal en%im Eo5, en%im tersebut akan memisahkan dari & pada sekuens

&&TT. #amun, pada bakteri penghasil Eo5, karena basa & kedua pada

sekuens &&TT tersebut telah dimetilasi, maka en%im Eo5 T5"&8 &8

mendigest "#& tersebut. "engan kata lain, pada bakteri penghasil en%im Eo5,

sekuens &&TT-nya akan mengalami metilasi pada basa adenin internalnya

oleh en%im metilase Eo5. En%im endonuklease Eo5 dalam bakteri yang sama

tidak akan mendigest "#& yang telah mengalami metilasi. "#& asing yang


31


belum mengalami metilasi pada sekuens &&TT-nya akan dikenali sebagai

"#& asing dan akan didigest en%im endonuklease Eo5, akibatnya "#& asing

tersebut akan kehilangan fungsinya.leh karena itu, en%im metilase dan

endonuklease berfungsi sebagai sistem imun untuk bakteri, melindungi bakteri

tersebut dari "#& asing (misalnya 'irus). En%im seperti Eo5 tersebut disebut

en%im endonuklease restriksi karena me-restrict"#& dalam sel agar hanya "#&

asli+miliknya saja yang boleh ada ("#& asing tidak boleh ada).

8egunaan suatu ensim endonuklease restriksi tergantung pada spesifisitas

dan frekuensi terjadinya pengenalan tempat restriksi yang terdapat pada sampel

"#& manapun. &lu5 mempunyai spesifisitas nukleotida sebanyak 7 nukleotida

(&OT), sehingga "#& apapun akan mengandung tempat yang dikenali &lu5

setiap 2,0/ kilobasa. !edangkan #ot5 mempunyai spesifisitas nukleotida sebanyak

? nukleotida (O), sehingga "#& akan mengandung sekuens restriksi

#ot5 setiap ;/,/ kilobasa. leh karena itu, #ot5 sangat berguna untuk mengisolasi

daerah yang besar dari "#& terutama pada penelitian yang berhubungan dengan

manipulasi "#& genomik. 8ebalikannya, &lu5 akan mendigest sampel "#&

menjadi banyak fragmen-fragmen keil.

abungan dari kumpulan fragmen "#& hasil digesti suatu sampel "#&

dengan satu atau lebih en%im restriksi dapat menjadi suatu sidik jari. "#& yang

berbeda tidak akan menghasilkan kumpulan fragmen yang beraneka ukuran yang

sama. leh karena itu, "#& dari berbagai sumber dapat diookkan atau

dibedakan berdasarkan kumpulan fragmen yang dihasilkan tersebut. Hal ini

disebut =LP (!estriction &ragment ,ength olymorphisms). &nalisis sederhana


32


ini sering digunakan untuk forensik. !elain untuk tujuan pembuatan sidik jari

"#& seperti tersebut di atas, en%im endonuklease restriksi sering digunakan

dalam proses kloning.

Hidrolisis endonuklease merupakan reaksi yang spontan dan tidak

membutuhkan &TP.

pada keadaan tertentu dapat saja dibutuhkan masa inkubasi yang panjang

(misalnya satu malam+10 jam).

En%im endonuklease restriksi biasanya dijual dalam berbagai konsentrasi

dengan akti'itas yang berdasarkan angka pendigestian sampel "#& standart. !atu

unit akti'itas biasanya didefinisikan sebagai sejumlah en%im yang dibutuhkan

untuk mendigest satu g "#& referensi dalam 1 jam pada suhu 4 derajat

elius.


33


DA)TAR PUSTAKA

erkuil, E., 'an

Documents

Materi Asistensi Biomedik Fk Uns2009