Click here to load reader
Upload
adis-vuic
View
298
Download
21
Embed Size (px)
DESCRIPTION
bromatologija
Citation preview
BIOTEHNOLOGIJA
I CJELINA
OSNOVNA PRAVILA PONAŠANJA U GENETIČKOJ LABORATORIJI
POLUOTVORENOGA TIPA
Sigurnost u laboratoriji podrazumijeva izvođenje naučno-istraživačkih, stručnih i
edukativnih aktivnosti na bezbjedan i siguran način kako za realizatora aktivnosti, tako i za
sve osobe prisutne u laboratoriju.
To ukazuje na činjenicu da je, prije obavljanja bilo kakve aktivnosti u laboratoriji, potrebno
znati slijedeće:
da li postoji određeni rizik pri realizaciji predviđenih aktivnosti;
koje mjere opreza poduzeti u cilju spriječavanja potencijalnih rizičnih situacija;
koje mjere treba preduzeti da bi se zaštitili djelatnici laboratorije;
koje mjere treba preduzeti da bi se zaštitili oprema i cjelokupni resursi laboratorije;
koje mjere preduzeti da bi se onemogućio nekontrolisano iznošenje potencijalno
opasnih materijala izvan laboratorije;
koje mjere preduzeti da bi se pravilno rukovalo opremom.
Zanemarivanje provođenja osnovnih mjera sigurnosti ne samo da ugrožava vlastitu sigurnost,
nego sigurnost i drugih uposlenika.
Par osnovnih pravila vezanih za rad u genetičkim i biotehnološkim laboratorijima:
1) prije no što se pristupi radu u laboratoriji, svaki realizator aktivnosti mora imati
osnovnu zaštitnu opremu: laboratorijski mantil, rukavice, masku za usta i kapu. Ovo
pravilo izričito vrijedi za istraživače koji rade sa humanom DNK, da bi se izbjegla
kontaminacija iste vlastitom DNK sa jedne te da bi se zaštitio realizator od
potencijalnih negativnih uticaj do kojih može doći prilikom rukovanja sa humanim
biološkim materijalom, sa druge strane
2) Radna površina u laboratoriji mora biti oslobođena svih nepotrebnih stvari, tj svih
stvari koje ne trebaju za proces koji se realizira.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
3) Sve posude sa hemikalijama moraju biti označene imenom hemikalije koja se u njoj
nalazi, te pohranjene na odgovarajućoj temperaturi. Nakon svake upotrebe, hemikalije
se vraćaju na svoje mjesto.
4) Iskorišteni potrošni laboratorijski materijali moraju biti odstranjeni u označene posude
namijenjene za datu vrstu otpada.
5) Ukoliko se radi sa otrovnim, isparljivim hemikalijama, neophodno je raditi u
izoliranom prostoru sa precizno reguliranim sistemom ventilatcije,
6) Većina aktivnosti u laboratoriji zahtijevaju sterilne uslove u cilju spriječavanja
kontaminacije materijala kojim se manipulira, dok u tzv «genetičkim» laboratorijama
pod pojmom «sterilno» podrazumjeva se odsustvo svake DNK stranog porijekla (DNA
free conditions). Da bi se stvorili takvi uslovi u laboratorijama svi predmeti otporni na
visoku temperaturu i pritisak moraju biti izloženi suhoj i vlažnoj sterilizaciji, te UV
zračenju. Također, neophodno je i hemijskim putem sterilisati i instrumentarij i radnu
površinu prije početka rada. To obično podrazumjeva primjenu 15% varikine.
7) Svaka laboratorija mora imati Pravilnik o ponašanju u kojem se usko specificiraju
sva pravila jasno precizirana za realizaciju aktivnosti u konkretnom laboratoriju.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
II CJELINA
IZOLACIJA HUMANE DNK IZ UZORKA BUKALNE SLUZNICE
Inicijalni korak u svim istraživanjima koja podrazumijevaju manipulisanje naslijednim
materijalom predstavlja ekstrakcija (izolacija) DNK iz polaznoga uzorka. Postoji više metoda
izolacije ukupnoga nasljednoga materijala, te usljed toga ova metoda danas predstavlja
rutinsku laboratorijsku proceduru..
Osnovne faze DNK ekstrakcije u širem smislu te riječi su:
1. uzorkovanje biološkog materijala (humanog, animalnog, biljnog)
2. oslobađanje DNK iz ćelijskih organela (jedra i citoplazme) a samim tim i iz ćelije
razgradnjom lipoproteinskog kompleksa membrana
3. purifikacija (pročiščavanje) DNK frakcije
4. precipitiranje ili eluiranje DNK u procesiranom uzorku
Ukupna izolirana genomska DNK sadrži oba njena kompartimenta nuklearnu i
mitohondrijalnu DNK, a ukoliko je DNK ekstrahovana iz biljnog materijala, ona također
sadrži i DNK lociranu u hloroplasta.
Postoji više metoda koje se mogu primjeniti za ekstrakciju DNK, a odabir jedne od njih zavisi
o samom tipu uzorka. Pri tome je potrebno napomenuti da količine DNK koje možemo dobiti
iz različitih uzoraka nisu identične, što naravno ovisi i o tipu uzorka i njegovoj količini koju
imamo na raspolaganju.
Dakle, zavisno od toga da li se DNK izolira iz humanog tkiva (bukalna sluznica, kosti, krvi,
idr.), te različitih animalnih i biljnih tkiva, ili pak mikroorganizama, optimizirano je više
metoda DNK ekstrakcije.
Standardna metoda koja je dosegla veliku primjenu za široki spektar biološkog materijala je
organska ekstrakcija. Ona podrazumijeva primjenu digestivnih pufera koji se baziraju na
prisustvu TRIS-a, NaCl-a, SDS-a i EDTA, te ispiranje fenolom, koji obara proteine i masti i
hloroformom, koji obara višak fenola i zaostale ćeliske ostatke, uz popratnu precipitaciju
alkoholom. Također, neophodno je prisustvo proteinaze K, čija se funkcija svodi na digestiju
proteina.Uloga digestivnog pufera je stvaranje povoljnog medija u kojem će proteinaza K
ispoljiti svoje dejstvo, digestiju proteina.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Pored organske ekstrakcije, kao široko aplikativne metode na najširem dijapazonu uzoraka,
danas su popularni i kitovi za ekstrakciju ukupne genomske DNK, a koje proizvode različite
kompanije.
Jedan od najpouzdanijih ekstrakcionih setova je Qiagen kit. U slobodnoj interpretaciji može
se opisati kao kombinacija organske ekstrakcije, ali bez upotrebe fenola i hloroforma.
Proizvodi se u više varijanti, u zavisnosti od toga za koju vrstu biološkog materijala se
primjenjuje. Osnovni postulati na kojima se bazira Qiagen procedura ekstrakcije DNK jesu:
liziranje uzorka
adsorbovanje DNK za silika-gel membranu Qiagen kolonice
(QIAmps Spin Column)
ispiranje membrane ispirajućim puferima
eluiranje DNK sa membrane
Postoji još veliki broj metoda za ekstrakciju ukupne genomske DNK, a koje se baziraju na
različitim principima. Npr. CHELEX metoda je također jedna od široko primjenjivh, a bazira
se na vezivanju polivalentnih metalnih jona na DNK radi njihove zaštite tokom izlaganja
visokoj temperaturi. Osnovna procedura zasniva se na ispiranju kontaminenata, proteina i
ostalih ćelijskih ostataka inkubiranjem uzorka na temperaturi od oko 560C u 5% Chelex
soluciji. Nakon toga supernatant se dodaje direktno u PCR miks.
Puragen metoda se zasniva na lizi ćelija anionskim deterdžentom, u prisustvu DNK
stabilizatora, koji ne dopušta denaturaciju DNK. Moguće prisutnu RNK uklanja RNK
digestivni enzim. Proteini i lipidi se uklanjaju precipitacijom solima. DNK se izdvaja
alkoholnom precipitacijom i ispira se u soluciji koja sadrži DNK stabilizator.
Protokol « Qiagen » metoda ekstrakcije DNK iz uzorka bukalne sluznice
Nakon što je propisno uzorkovan bris bukalne sluznice, uslijedila je ekstrakcija DNK iz
uzorka primjenom Qiagen protokola za ekstrakciju DNK iz bukalne sluznice:
1. sterilnim makazama se odsiječe vatirani dio štapića kojim se uzorkovao bris bukalne
sluznice i stavi utubicu od 2 ml,
2. u tubicu sa uzorkom se doda 400 ul ATL pufera i 20 ul proteinaze K
3. sadržaj tubice se vorteksira u trajanju od 15 sekundi,
4. uzorak se zatim postavlja u vodeno kupatilo da se inkubira u trajanju od 1h na
temperaturi od 560 C,
5. nakon inkubacije, doda se 400 ul AL pufera i vorteksira u trajanju od 15 sekundi
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
6. uzorak se stavi u termoblok da se inkubira na 700 C u trajanju od 10 minuta
7. doda se 200 ul etanola (96-100%), kratko vorteksira, a zatim centrifugira (spinuje) da
se odstrane kapljice sa sa poklopca tubice.
8. pažljivo se prebaci oko 700 ul lizata (miksture) u QIAmp kolonicu, centrifugira pri
brzini od 800 rpm u trajanju od 1 minute, a zatim se odstrani filtrat iz kolekcione
tubice
9. pažljivo se otvori poklopac kolonice i doda 500 ul ispirajućeg AW1 pufera,
centrifugira pri brzini od 8000 rpm u trajanju od 1 minute i nakon toga se odstrani
filtrat iz kolekcione tubice
10. otvori se poklopac kolonice i doda 500 ul ispirajućeg AW2 pufera, centrifugira pri
brzini od 14 000 rpm u trajanju od 3 minute, te se zatim odbaci kolekciona tubica sa
filtratom,
11. kolonica sa uzorkom se prebaci u čistu 1,5 ml tubicu, doda se 50 ul destilovane vode,
inkubira jednu minutu na sobnoj temperaturi, a potom centrifugira 1 minutu pri brzini
od 14 000 rpm, nakon čega se odbacuje kolonica, a uzorak u 1,5 ml tubici zatvori i
obilježi.
12. zatim se uzorak koncentrira metodom koja se bazira na upotrebi «speed-vacum»
pumpe, koja radi na principu kombinovanog dejstva centrifugalne sile i vakumskog
isisavanja. Na taj način pod djelovanjem centrifugalne sile DNK pada na dno tubice, a
va kum isisava vodu.
13. Uzorak se stornira na -200 C u zamrzivač.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
III CJELINA
HORIZONTALNA GEL ELEKTROFOREZA
Gel elektroforeza predstavlja skup tehnika koje se primjenjuju za separaciju bioloških
molekula, baziranu na fizičkim osobinama molekule, kao što su veličina, oblik, izoelektrična
tačka molekule. Najćešće se primjenjuje u analitičke svrhe, za separaciju i analizu DNK
fragmenata različite veličine. Snaga električnog polja podstiče migraciju fragmenata DNK
kroz gel. Gel se odnosi na matrix koji svojom konstitucijom omogućava separaciju tih
fragmenata. U većini slučajeva gel predstavlja crosslink polimer čija kompozicija i poroznost
omogućavaju separaciju. Molekula DNK putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog
negativnog naboja koji nosi DNK molekula. Kompartimenti veće molekulske mase migriraju
sporije kroz gel, u odnosu na one manje molekulske mase čija je migracija brža.
Nakon završene elektroforeze, separirani DNK fragmenti se mogu vizuelizirati primjenom
flueroscentnih boja kao što su etidium bromid, srebro nitrat, coomassie blue. Njihova veličina
se izražava u baznim parovima (bp), kilobazama (kb), ili nukleotidima, u zavisnosti od toga
da li je na gel aplicirana jednolančana ili dvolančana DNK molekula, a determinira se
komparacijom uzorka sa DNK ladder-om, koji sadrži fragmente DNK poznate veličine i služi
kao referentni sistem.
Različiti su tipovi gelova koji se koriste za elektroforezu DNK. Najčešće primjenjivani su
agarozni gel za separaciju velikih segmenata DNK (do 50000 bp), te poliakrilamidni gel za
separaciju manjih kompartimenata.
Najjednostavniji put provjeravnja uspješnosti ekstrakcije DNK i PCR-a, te aproksimativne
kvantifikacije većih molekularnih kompartimenata predstavlja agarozna gel elektroforeza.
Horizontalna agarozna gel elektroforeza
Agarozna gel elektroforeza je najjednostavnija i uobičajeni put separacije i kvantifikacije
DNK. Svrha primjene gela je da se kvantificira ili da se izolira i analizira pojedinačni band.
Na agaroznom gelu obično se vrši separacija velikih DNK molekula, koje sadrže fragmente
500-50000 bp u reinđu.
Pripremanje agarozne gel elektroforeze
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Važna činjenica na koju se mora obratiti pažnja prilikom pripremanja gela jeste koncentracija
agaroze u gelu. Uslovljena je veličinom fragmenata koji se apliciraju na gel, pa shodno tome,
možemo razlikovati 0.4% gel za separaciju DNK fragmenata u rasponu veličina 2000-
30000bp, 0.75% 1000-15000 bp, 1.00% 500-10000bp, 2.00% 100-2500bp. Odgovarajuće
koncentracije agaroze u gelu u skladu sa veličinom fragmenata DNK koja se aplicira na gel
omogućava dobru rezoluciju istih.
Procedura anaize izolirane DNK na 1% agaroznog gela
Instrumentarij i hemikalije neophodni za sprovođenje agarozne gel elektroforeze:
Sistem za elektroforezu (strujno kolo)
Kadica za izlijevanje gela
Češljići za uzorke
Magnetna mješalica sa grijačem
Mikropipete sa tipovima
UV transiluminator
Agaroza
TBE pufer
LDB pufer
Etidium bromid
Priprema gela se vrši prema slijedećem protokolu:
1. pripremi se kadica za elektroforezu odgovarajuće veličine
2. trakom se oblijepi gornji i donji rub kadice
3. na kadicu se zatim postavi češljić koji će napraviti prostor ("đep") na koji će se
aplicirati uzorak
4. pripremi se 1% rastvor agaroze u TBE puferu (0.4g agaroze i 40 ml TBE
pufera)
5. rastvor agaroze se u TBE puferu miješa na magnetnoj mješalici uz zagrijavanje
do ključanja
6. nakon ključanja smjesu ohladiti na oko 50 0C (kada se posuda može uzeti
rukom)
7. u ohlađenu smjesu dodati etidium bromid u količini od 1l
8. smjesu, potom, izliti u pripremljenu kadu za elektroforezu, koja je postavljena
na ravnu površinu
9. ostaviti da se gel ohladi i polimerizira
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
10. kada se gel ohladi, uklone se češljići i trake, a potom se kada postavi u
komoru za gel elektroforezu u kojoj kadica sa gelom mora biti potopljena u
TBE puferu
11. u "đepiće" na gelu se, potom, apliciraju uzorci, koji su prethodno pomiješani s
LDB puferom (loading dye buffer). U svom sastavu sadrži boju bromofenol
plava, koja omogućava vizuelni monitoring migracije uzorka kroz gel u toku
elektroforeze, zatim glicerol koji olaksava aplikaciju uzorka u đepić jer
povećava težinu uzorka, TBE pufer i H2O. Pomiješa se 5ul uzorka i 1ul LDB-
a.
12. pored uzoraka na gel se može nanijeti i marker (ladder), kao referentni sistem
u odnosu na kojeg se može odrediti veličina fragmenata apliciranog uzorka
13. nakon nanošenja uzorka na gel, programira se aparat za elektroforezu da radi
pri konstantnom naponu od 90V u trajanju od pola sata
14. rezultati separacije gel elektroforezom posmatraju se pod UV lampom
Vizuelizacija separacije DNK fragmenata podrazumijeva primjenu etidijum bromida,
boje koja odaje narandžastu fluorescenciju pod UV lampom. Rad sa etidijum
bromidom zahtijevao poseban oprez, jer se radi o supstanici sa izrazito štetnim
djelovanjem na organizam.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
IV CJELINA
PCR / LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM
PCR (polymerase chain reaction), polimerazna lančana reakcija predstavlja in vitro metodu
umnožavanja ciljanih fragmenata DNK. Zapravo, PCR, kao molekularna "kopirnica",
predstavlja mehanizam kojim se omogućava generiranje optimalnog broja kopija ciljanih
fragmenata DNK djelomičnim imitiranjem prirodnog procesa replikacije DNK. In vivo,
replikaciju DNK iniciraju kratke RNK sekvence za čiju sintezu je odgovorna RNK
polimeraza I. RNK sekvence obezbjeđuju startno mjesto za otpočinjanje replikacije DNK. Na
3’ kraju imaju slobodnu -OH grupu. One su, zapravo supstrat za djelovanje DNK ploimeraze
I, koja na odgovarajućoj temperaturi katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid-3-
fosfata na slobodnu -OH grupu 3’ kraja RNK sekvence, dok je ista komlementarno vezana za
DNK matricu. Važan parametar koji je iskorišten za razvoj PCR tehnike jeste taj da su
vodikove veze, kojima su polinukleotidni lanci međusobno povezani, energetski jako slabe, te
da pri zagrijavanju pucaju, što konsekventno dovodi do denaturacije DNK, tj. stvaranja
jednolančanih molekula DNK /single strand DNA/. Hlađenjem se ponovo uspostavljaju iste
veze, što predstavlja proces renaturacije. Upravo različito ponašanje DNK u zavisnosti od
temperaturnog režima predstavlja osnovu na kojoj se temelji PCR tehnika umnožavanja
ciljanih fragmenata DNK.
Reakcione komponente lančane reakcije polimerazom
DNK molekula, koja se želi amplificirati
prajmeri / primers/. Postupak selekcije ciljanih fragmenata DNK koji se žele
amplificirati /umnožiti/ omogućeno je primjenom prajmera, početnica, koji u in vitro
uslovima služe kao supstrat za djelovanje DNK polimeraze. Naime, radi se o kratkim
oligonukleotidnim sekvencama DNK u rasponu od 20-30 baza koji se na bazi
komplementarnosti vežu za granične regione ciljane sekvence. Za uspješnost
amplificiranja ciljanoga segmenta potrebna su 2 prajmera, forward i reverse - po jedan
za svaki lanac DNK nastao denaturacijom primarne matrice. Prajmeri, vežući se na
bazi komplementarnosti za matricu DNK, obezbjeđuju startno mjesto za iniciranje
elongacije novosintetisanog lanca DNK. Prajmeri mogu biti ili specificni ili
univerzalni. Univerzalni prajmeri su komplementarni nukleotidnim sekvencama
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
različitih DNK molekula. Primjera radi, bakterijska rDNK sadrzi nukleotidne
sekvence koje su zajedničke za sve bakterije, pa shodno tome, bakterijski univerzalni
prajmeri se dizajniraju upravo na osnovu tih sekvenci. Primjer bakterijskih
univerzalnih prajmera:
forward 5' GATCCTGGCTCAGGATGAAC 3'
reverse 3' GGACTACCAGGGTATCTAATC 3'
Ovakvi prajmeri najčešće su inkorporirani u sklopu komercijalnih kitova, proizvedenih
od strane različitih kompanija. Oni ne smiju biti međusobno komplementarni, da ne bi došlo
do stvaranja prajmer dimera, niti komplementarni sa nespecifičnim sekvencama DNK, što
umanjuje efikasnost PCR-a.
Taq polimeraza. S obzirom da in vivo replikaciju DNK inicira enzim iz skupine
polimeraza, DNK polimeraza I, neophodan je također enzim polimeraza koji bi vršio
istu funkciju u vještačkim, dirigovanim uslovima. Taj enzim je izoliran iz
termostabilne bakterije Thermus aquaticus. Nazvan je Taq polimeraza i optimalna
temperatura na kojoj ispoljava svoju aktivnost iznosi 72 °C. Na ovoj temperaturi
polimeraza dodaje prosječno 6000 nukleotida u minuti na prajmer. U tipičnoj PCR
enzim ima poluvrijeme života od 2h na temperaturi od 92,5°C, 40 minuta na 95°C, i
manje od 6 min. na 97, 5°C.
MgCl2 – djeluje kao katalizator PCR-a. Taq polimeraza za svoju aktivnost zahtjeva
slobodne Mg+ ione, koji se vezu i za slobodne nikleotide i za samu polaznu DNK.
Slobodni nukleotidi / dNTP/. Neophodni su slobodni nukleotidi / dATP, dTTP, dCTP,
dGTP/ i to podjednake količine svakog. Veoma niske koncentracije svakog od
nukleotida ili njihov neizbalansiran odnos vodi nepovezivanju u lance.
PCR puffer, neophodan je za uspostavljanje optimalne pH vrijednosti za efikasno
realizaciju PCR. 7,0-7,5
H2O, destilovana, DNA-free
Osnovne faze PCR-a
PCR se odvija u 3 osnovne faze, koje prvenstveno determinira odgovarajući temperaturni
režim:
1. denaturacija
2. hibridizacija (matrica-prajmer annealing)
3. elongacija lanca
Denaturacija, kao prva faza PCR-a inicirana je temperaturom od oko 90-95 stepeni na kojoj
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
dolazi do razgradnje stabilnoga dvostrukoga heliksa i stvaranja jednolančane DNK. Tek u
takvome obliku, DNK može poslužiti kao matrica za sintezu naspramnog lanca u slijedećim
fazama PCR-a.
Drugu fazu PCR karakteriše snižavanje temperature na oko 50-60 stepeni (55) čime se
stvaraju uslovi za renaturaciju, tj. ponovno formiranje vodikovih veza. Upravo u ovoj fazi se
prajmeri na bazi komplementarnosti vežu za granične regione sekvence koja se želi
amplificirati (umnožiti). Kako su prajmeri sintetisani u 5'-3' pravcu, to se na njihovom 3' kraju
nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH grupom, što predstavlja supstrat za djelovanje taq
polimeraze. Dakle, drugu fazu PCR-a karakteriše vezivnje prajmera za specifične dijelove
sada jednolančane DNK molekule. Ovaj proces se još označava kao matrica-prajmer
annealing, a ova faza PCR-a, zbog nastajanja hibrida «matrica-prajmer», naziva se
hibridizacija.
Treću fazu PCR-a karakteriše temperaturni režim od oko 70 stepeni, pri čemu dolazi do
elongacije novosintetisanog lanca pod uticajem Taq polimeraze. Taq polimeraza prepoznaje
hibride "matrica-prajmer" nastale u prethodnoj fazi PCR-a, te katalizira vezivanje slobodnih
nukleotida za matricu, što ima za posljedicu ekstenziju lanca. Slobodni dNTP se pod uticajem
Taq polimeraze, vežu preko svoje fosfatne grupe za slobodnu –OH grupu dezoksiriboze na 3'
kraju prajmera. Rezultat navedenog je sinteza naspramnog lanca DNK molekule, koji u
drugom ciklusu može poslužiti kao matrica drugom prajmeru.
Ciklus denaturacije, hibridizacije i elongacije se može ponavljati. Povećanjem broja ciklusa
eksponencijalno raste broj kopija ciljane DNK sekvence.
Broj PCR ciklusa ovisi od polazne količine DNK reakcionoj smjesi i željene količine
produkta. Tipična PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa. Kod ponavljanja PCR ciklusa treba
voditi računa o mogućem deficitu neke od komponenti reakcije, npr. prajmera, slobodnih
nukleotida, enzima ili pak o pjavi inhibitora PCR. To su tzv. ograničavajući faktori PCR.
Primjena PCR tehnike
PCR tehnika se uspješno primjenjuje u širokom dijapazonu naučno-istraživačkih aktivnosti.
Posebna pogodnost je ta što je za njeno odvijanje je dovoljna i mala količina polaznog
biološkog materijala. Jedna od njenih bitnih primjena jeste u oblasti forenzičke DNK analize,
te u oblasti dijagnostike različitih bolesti koje se mogu definirati na nivou sekvenci molekule
DNK (npr. prenatalna dijagnostika naslijednih bolesti). Naime, danas postoji veliki broj
oboljenja za koje se predpostavlja da su naslijednog karaktera, a koje se mogu determinirati
PCR-based tehnikama.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Postavljanje lančane reakcije sa polimerazom za analizu STR multiplex sistem PowerPlex 16
Najčešće se prakticira prethodna priprema smjese koja sadrži odgovarajuće količine svih
neophodnih komponenti PCR-a. Takva smjesa naziva se master mix i priprema se u posebnoj
tubici odakle se odgovarajući alikvoti prenose u pripremljene i obilježene tubice ( singlice ili
stripove) u koje se potom dodaje i DNK koju smo prethodno ekstrahovali. Dakle, master mix
predstavlja smjesu svih komponenti lančane reakcije polimerazom, izuzv DNK molekule koju
naknadno dodajemo. Također, prilikom pripremanja rekcije, bez obzira koliko precizni i
pažljivi bili, postoji uvijek mogućnost standardne greške prilikom pipetiranja. Zbog toga se
uvijek pri izradi master mixa uzima 10% više svih komponenti.
Mašina u kojoj se dešava PCR zove se PCR thermocycler, i ona se može programirati
odgovarajući temperaturni režim i podesiti željeni broj ciklusa.
Bitno je napomenuti da možemo razlikovati single PCR, duplex PCR, multiplex PCR sisteme
(reakcije) u zavisnosti od toga koliko ciljanih sekvenci želimo da amplificiramo.
Dakle multiplex PCR, predstavlja simultanu amplifikaciju više ciljanih sekvenci DNK.
Amplifikacija multiplex STR sistema PowerPlex 16, u biti, predstavlja simultano
umnožavanje 15 ciljanih fragmenata DNK (STR markeri) u jednoj reakciji.
Ukupan volumen PCR-a je iznosio 5l i to:
- 2,7l dH2O ( nuclease free)
- 0,3l Taq polimeraze
- 0,5l prajmera (Power Plex16 Primer Pair Mix)
- 0,5l pufera (Power Plex16 Gold Star buffer)
- 1ul DNK izolata
Bitno je napomenuti da se slobodni nukleotidi kao i MgCl2 nalaze u sastavu pufera u ovom
slučaju.
Tako pripremljen uzorak postavljen je u PCR thermocycler, koji je bio programiran za
odgovarajući temperaturni režim kao i za određeni broj ciklusa:
95°C 1 minuta
96°C 11 minuta
94°C 30 sekundi
60°C 30 sekundi
70°C 45 sekundi
10 ciklusa
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
90°C 30 sekundi
60°C 30 sekundi
70°C 45 sekundi
22 ciklusa
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
V CJELINA
VERTIKALNA GEL ELEKTROFOREZA
Prvo se postave gel – ploče, a nakon toga se pripremi i izlije poliakrilamidni gel izmedju njih.
Receptura za pripremanje gela je slijedeća:
u čistu posudu se izvaze 9 grama uree
doda se 13ml dH2O
rastvor se miješa na magnetnoj mješalici dok se urea ne otopi
napravi se mix LongRanger 25% i 10x TBE pufera, po 2.5ml svake komponente
napravljena mikstura se doda u rastvor uree
novonastali rastvor se degazira
nakon degaziranja, dodaju se akceleratori polimerizacije poliakrilamidnog gela i to
125ul 10% APS i 17,5 ul TEMEDA-a
Gel se izlije, pazeći da se pri tome ne formiraju mjehurici na njemu. Na tako pripremljen gel
se postavi češalj i sačeka 2.5 sata da se završi polimerizacija.
Pripremanje PowerPlex 16 STR postamplifikacijskog sistema za detekciju na genetičkom
analizatoru
Za detekciju se pripreme ranije amplificirani uzorci DNK. Dvije komponenete koje se zajedno
sa uzorkom apliciraju na gel jesu BD (blue dextran) i ILS (Internal Lane Standard). Blue
Dextran je faktor koji olakšava migraciju DNK kroz poliakrilamidni gel, a Internal Lane
Standard (ILS) je neophodna za sizing analizu. U prvom koraku se napravi master mix po
formuli:
(0.7ul BD + 0.3ul ILS) x broj uzoraka
Zatim se miks alikvotira u pripremljene setove tubica. U svaku tubicu se doda 1 ul
mastermixa i 0.7 ul DNK uzorka. Zajedno sa uzorcima neophodno je aplicirati i allelic ladder
koji predatavlja vjestacki sintetiziran niz DNK fragmenata, koji su zapravo sve postojece
alelne varijacije lokusa koji se koriste za analizu 16 STR markera u sklopu komercijalnog
PP16 kita. Tako pripremljeni uzorci se denaturišu na 950C, a zatim postave na kratko na led
da bi se izbjegla renaturacija.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Kada gel plimerizira, vanjske strane gel ploča se očiste i cijeli komplex se postavi na
sekvencer. Prvo se softverski pokrene plate check faza, u kojoj je samo laser aktivan, ali se ne
startuje elektroforeza. Ovim postupkom mašina provjerava da li su su ploče i gel čisti, te da li
su spremni za proces detekcije. Nakon toga se pokreće opcija prerun, pokretanje
elektroforeze, ali bez uzorka na gelu, kojom se stabiliziraju uvjeti u sekvenceru i pomjeraju
eventualne manje nečistoće i mjehurići. Tek nakon toga uzorci se apliciraju na gel i starta se
run faza koja traje 3.5 sata. To je neophodan vremenski period za putovanje uzoraka od
početka gela do reading regiona, tj. regiona laserske aktivnosti.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
VI CJELINA
MOLEKULARNO GENETIČKI MARKERI
Pod molekularnim markerima podrazumijevamo obilježja koja mogu poslužiti u identifikaciji
određenih genetičkih sistema i njihovo razlikovanje od drugih. Definiraju se i kao osobine
genotipa koje variraju između jedinki populacije ili između samih populacija. Dakle, markeri
nam mogu poslužiti kao referentni sistemi u odnosu kojih definišemo ciljane genetičke
sisteme.
Uopćeno se mogu podijeliti na indirektne i direktne genetičke markere. Imdirektni genetički
markeri jesu fenotipska obilježja na osnovu kojih se mogu dobiti informacije o
karakteristikama genotipa. Obuhvataju morfološke i biohemijske markere. Direktne genetičke
markere predstavljaju DNK – bazirani markeri. Naime, postoje DNK regioni koji ispoljavaju
određeni stupanj varijabilnosti, i upravo ta osobina naslijednog materijala se može uspjesno
koristiti kao “marker” u genetici. DNK markere prema tipu sekvence možemo podijeliti na
single copy i repetitivne, te na kodirajuće i nekodirajuće, dok prema usmjerenosti analize na
dio sekvence, dijelimo ih na ciljane i arbitrarne. DNK – bazirani markeri obuhvataju slijedeće
oblike:
RFLP-molekularni markeri (Restriction Fragmenth length Polymorphism)
SSCP (Single-Strended Conformation Polymorphism)
RAPD-molekularni markeri (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
AFLP-molekularni markeri (Amplified Fragment Length Polymorphism)
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ili snipovi
VNTR-molekularni markeri (Variable Number of Tandem Repeats)
STR-molekularni markeri (Short Tandem Repeats)
Detekcija STR markra na poliakrilamidnom gelu primjenom AB377 sekvencera
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Kod detekcije STR markera princip je takav da se konačna sekvenca datog segmenta ne javlja
krajnjim rezultatom. Ta sekvenca se sastoji od već poznatih repetitivnih jedinica. Osnovni cilj
analize STR markera je utvrđivanje broja ponavljanja pojedinih STR sekvenci unutar
analiziranog lokusa. Markiranje se u ovom slučaju vrši po princicpu da se cijeli marker oboji
odgovarajućom bojom. Da bi se izbjegle nedoumice koriste se 3 boje, a u novije vrijeme I 4
boje kojima se markiraju ciljani lokusi. Istom bojom se markiraju dovoljno udaljeni lokusi,
kod kojih je isključeno preklapanje, a različitim bojama se analiziraju lokusi iste veličine, tako
da je i pored istog položaja na gelu, moguća njihova distinkcija zahvaljujući raznobojnom
fluerosciranju alelnih varijanti porijeklom iz različitih lokusa.
Dobijeni pikovi kada se softverski obrade, ne predstavljaju pojedinačne baze nego alelne
varijante, koje su pokazatelji koliko se puta poznata repetitivna jedinična sekvenca ponavlja.
Iako se i analiza STR markera realizira na sekvenceru, riječ sekvenciranje, koje se često u
laboratorijskom žargonu koristi za ovaj postupak, nije prikladna. Stoga je preciznije primjeniti
termin detekcija ili profiliranje.
Preliminarni “sirovi“ rezultati se kompajliraju I analiziraju primjenom softvera, kao što su
Data Collectin Software I Gene Scan Software. Primjenom Powertyper 16 Macro verzije
Genotyper softvera realizirano je numeriranje alelnih varijanti I dizajniranje STR DNK
profila.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
VII CJELINA
KULTURA BILJNIH TKIVA I ĆELIJA
Kultura biljnih tkiva i ćelija obuhvata postupke uzgajanja ćelija, tkiva i organa u vještačkim,
kontrolisanim i aseptičnim uslovima. Biljna ćelija je totipotentna. To znači da svaka biljna
ćelija sadrži informaciju koja je neophodna za diferencijaciju i stvaranje nove biljke. Dakle,
teorijski gledano, dovoljna je samo jedna ćelija biljke i to bilo kojeg njenog dijela da
dobijemo kompletnu odraslu biljku. S obzirom da uzimamo tkiva kao početni eksplantat,
dobijena novonastala biljka biće genetički identična majci biljci. Zato se razmnožavanje u
kulturi naziva još i klonsko razmnožavanje. Klonsko razmnožavanje se danas koristi u
mnogim oblastima biljne proizvodnje ali i u fundamentalnim biološkim istraživanjima.
Sinonimi koji se često koriste za kulturu biljnih ćelija i tkiva su in vitro porpagacija ( in vitro
znači u staklu - biljke se uzgajaju u prozirnim posudama) i mikropropagacija
(mikrorazmnožavanje) jer se u početku dobijaju minijaturne biljčice.
Nekoliko je tehnika kojima se biljke mogu razmnožavati in vitro. Postoje različite
klasifikacije, ali se tehnike generalno mogu podijeliti prema tipu eksplantata koji se uvodi u
kulturu na:
- Kultura ćelija predstavlja uzgoj pojedinačnih ćelija u tečnim hranljivim
podlogama.
- Kultura tkiva kao osnovni cilj ima dobijanje i neograničeno dugo održavanje
tkiva u nediferenciranom stanju. Ovo tkivo se naziva kalus i može se dobiti iz bilo
kojeg početnog ekspalnata.
- Kultura organa – u okviru ove tehnike postoji nekoliko tehnika, pa imamo
kulturu antera (polena), kulturu ovarijuma, kulturu korjenova, kulturu izdanaka i
kulturu listova
- Kultura embriona – početni eksplantat je embrion a tehnika se primjenjuje u
slučajevima kada je embrion nedovoljno razvijen.
- Kultura meristema – tehnika kod koje je polazni eksplantant meristem.
- Kultura protoplasta – tehnika koja se zasniva na mogućnosti uklanjanja
ćelijskog zida. Ovako ogoljene ćelije nazivaju se protoplasti. Uklanjanje ćelijskog zida
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
omogućilo je raznovrsne primjene kao što su fuzija protoplasta i dobijanje somatskih
hibrida čak i taksonomski udaljenih vrsta (vrsta koje se u drugim tehnikama ne bi
mogle usavršavti).
- Somatska embriogeneza – tehnika za indukovanje i razvoj embriona iz
somatskih (tjelesnih ćelija).
U kulturi biljke rastu u kontrolisanim i vještačkim uslovima. To prvenstveno podrazumijeva
uzgoj biljaka na hranjivim podlogama. Pod hranjivom podlogom (medijum) podrazumjevamo
smjesu šećera, mineralnih soli, vitamina, aminokiselina i regulatora rasta rastvorenih u vodi.
Podloge koje sadrže učvršćivač-agar se označavaju kao čvrste hranjive podloge. Pored
čvrstih, postoje i tečne hranjive podloge koje sadrže sve gore navedene elemente osim agara.
Također je važno obezbijediti odgovarajuću kiselost podloge, jer bi kisela ili bazna podloga
negativno uticala na rast i razviće biljka u kulturi. pH vrijednost podloge kasnije mijenja i
sama biljka koja raste na toj podlozi. pH vrijednost je bitna ne samo što određuje čvrstinu
podloge, već i zato što utiče na pristupačnost pojedinih mineralnih soli, a posebno željeza. pH
vrijednost podloge varira za različite biljne vrste, ali za većinu vrsta optimalna kiselost
podloge je blago kisela ( pH 5-6,5 ).
Postoji nekoliko receptura za pripremanje hranjivih podloga a jedna od najčešće korištenih je
Murashige i Skoog (MS) podloga (Murashige i Skoog, 1962). Ova podloga se priprema tako
što se u destilovanu vodu, uz konstantno miješanje dodaju: saharoza, inozitil, makro-soli,
mikro-soli, rastvor željeza, vitamini, a ukoliko je receptura zahtjeva i regulatori rasta. Prije
dodavanja učvrščivaća u podlogu mjeri se kiselost podloge (pH metrom ili papirom za
mjerenje pH). Kada podesimo pH, podloge kuhamo uz konstantno miješenje, dok podloga ne
dosegne temperaturu ključanja.
S obzirom da hranjiva podloga sadrži sve komponente u optimalnim količinama, ona je
idealan medij za rast mikroorganizama. Mikroorganizmi, kao što je poznato, imaju kraći i brži
životni ciklus, pa će oni iscrpiti sve komponente iz podloge i onemogućiti osjetljivom biljnom
tkivu da raste. Zbog toga je potrebno sterilisati, ne samo podloge nego i sav materijal,
instrumentarij i radni prostor. Sterilizacija mora biti detaljna i temeljita kako bi se spriječila
konatminacija kultura.
Sterilizacija može biti hemijska, tj. sterilizacija pomoću hemijskih sredstava (NaOH, varkina
itd.) ili fizička – sterilizacija fizičkim postupcima (visokom temperaturom, UV zračenjem,
itd.). Sterilizacija visokom temperaturom se nadalje dijeli na suhu sterilizaciju i sterilizaciju
pod visokim pritiskom (autoklav).
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Hemijska sterilizacija se koristi za sterilisanje biljnog materijala koji se uvodi u kulturu. Biljni
materijal je vrlo osjetljiv na visoke temperature pa je logično da će se kao sredstvo za
sterilizaciju koristiti hemijske supstance. Međutim, treba biti pažljiv. Hemijska sredstva su
vrlo agresivna, pa je neophodno napraviti razblaženje. Uglavnom se koristi vodena otopina
natrijevog hipohlorita (1-3%) ili 15% varkina. Često se u kratkom trajanu biljni materijal
može isprati u 70% etanolu. Međutim, nekada je infekcija duboko u unutrašnjosti biljnog
uzorka, pa je takve infekcije teško eliminirati. Zato se pri uzimanju početnog uzorka –
eksplantanta izbjegavaju dijelovi biljke sa razvijenim provodnim sistemom (apikalni vrhovi
vegetacijske kupe), jer virusi skoro uvijek bivaju nošeni strujom protoka ksilema i floema.
Postupcima suhe sterilizacije se steriliše stakleno posuđe i termootporne plastične zdjele, te
instrumenti (skalpeli, pincete igle). Suha se sterilizacija se vrši u suhom sterilizatoru na
temperaturi 180°C u trajanju od 3 sata. Nakon sterilizacije posuđe i instrumenti se unose u
sterilnu komoru – laminar, gdje se izlažu dejstvu UV lampe. UV lampa zrači veoma štetno
ultravioletno zračenje koje uništava mikroorganizme. Svaka laboratorija za klonsko
razmnožavanje biljka ima UV lampu koja se pali 15- 30 minuta prije početka rada.
Instrumenti se prije same upotrebe uranjaju u čašu sa 96% etilnim alkoholom, a kontaktni
vrhovi se spaljuju na plameniku špiritusne lampe tokom rada. Laminar ima UV lampu, koja se
uključuje najmanje 1 sat prije početka rada. Prije unošenja uzorka, podloga i instrumentarija
za rad treba isključiti UV lampu, radni pult laminara prebrisati 96% alkoholom te osigurati
cirkulaciju sterilnog zraka barem 15 minuta prije početka rada.
Hranjive podloge i destilovana voda se sterilišu autoklaviranjem na 120°C i pod visokim
pritiskom. Autoklaviranje je postupak vlažne sterilizacije i obavlja se u autoklavu. Autoklav
je aparat konstruisan da obezbijedi pregrijanu vodenu paru koja na temperaturama višim od
100 ° C efikasno uništava većinu mikroorganizama. Budući da treba da izdrže pritisak veći od
atmosferskog, autoklavi su po pravilu masivno izrađeni aparati. Vrijeme sterilizacije u
autoklavu ovisi od količine podloge i njenog tipa, a najčešće traje 15 – 20 minuta. Pregrijana
vodena para i natpritisak autoklava efikasno uništava većinu mikroorganizama. Tek kada su
pripremljene hranjive podloge i obezbjeđeni sterilni uslovi može se pristupiti razmnožavanju
biljaka in vitro.
Sveukupni postupak kloniranja, od uzimanja početnog eksplantanta do dobivanja željenog
broja i vrste biljaka, sastoji se od nekoliko faza:
Nulta faza
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Ovo je početna faza i ona uklučuje sve postupke prije početka uvođenja biljke u kulturu in
vitro. Naziva se „nulta“ jer nije faza samog razmnožavanja, već obuhvata postupke pravilnog
prikupljanja, prenošenja i čuvanja biljnog materijala. Izvorno biljno tkivo od kojeg će se uzeti
eksplantant i postupak koji će se primjeniti imaju kritičnu ulogu u uspješnom dobijanju
kloniranih biljaka. Važno je, dakle, odabrati zdravi i vitalni dio biljke jer od stanja početnog
uzorka zavisi kompletna uspješnost kloniranja u in vitro uslovima. Kao početni materijal, u
postupcima klonskog razmnožavanja biljaka, preporučuje se vršni meristem, jer je to dio
biljke koji ima najveću diobenu aktivnost ćelija, a s obzirom da je zaštićen u pupoljku biljke
najmanja je opasnost od prisustva mikroorganizama koji su izvor zaraze u kulturi in vitro.
Prva faza- uvođenje u kulturu
Ova faza je ustvari prva faza klonskog razmnožavanja. Ona uključuje sterilnu izolaciju
dijela biljke kojeg želimo klonirati (meristem, list, tučak, korijen, prašnik i dr.) a ako postoji
unutrašnja infekcija, potrebno je primijeniti posebne tehnike. Takođe, ovo je faza
cjelokupne sterilizacije (posuđa, prostora i podloga) i pripremanja podloga. Najvažnije u
ovoj fazi je dobivanje sterilnog rasta eksplantanta. Ako se ova faza ne provede uspješno i
detaljno, cijele kulture kloniranih biljka će se kontaminirati i naredne faze u klonskom
razmnožavanju neće biti realizovane.
Druga faza – razmnožavanje
Kao što joj i ime kaže, ovo je faza razmnožavanja, odnosno umnožavanja kloniranih
biljka.Glavna svrha ove faze je postići razmnožavanje bez gubitka genetičke stabilnosti.
Umnožavanje se obavlja na različite načine a koja metoda će biti primijanjena zavisi od
rezultata koji se želi postići (broj biljki, biljke sa određenim osobinama i sl.), od vrste biljke
koja se klonira i njenih bioloških ograničenja. U ovoj fazi se koriste biljni regulatori rasta koji
podstiču rast biljke u kulturi. Tako citokinini utiču na rast biljke, auksini podstiču nastanak
korijena, a giberlini regulišu klijanje i cvijetanje. Pravilan odabir vrste i količine hormona je
veoma važan. Ukoliko se primjene optimalne koncentracije hormona, biljka će moći
nesmetano rasti u kulturi. Nepravilan odabir hormona rezultiraće slabim prinosom,
patuljastim rastom, odsustvom korijena... Kada biljka dosegne određenu veličinu i
odgovarajući broj bočnih izdanaka, ona se može multiplicirati. Umnožavanje se vrši tako što
se od jedne biljke odvoje svi bočni izdanci i postave se na sviježe pripremljene podloge. Ovi
izdanci će u narednim fazama ponovo rasti i davati nove bočne izdanke. Faza multiplikacije
se ponavlja sve dok ne dobijemo dovoljan broj biljaka.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Treća faza – rizogeneza
Neke biljne vrste se zakorjenjuju spontano već u podlozi bez regulatora rasta, međutim
večini je potrebno dodavanje malih količina auksina u podlogu. Tek kada adventivno
korijenje dostigne odgovarajuću dužinu, biljke se mogu postepeno prenositi u ex vitro uslove.
Četvrta faza – priprema i prijenos biljaka u vanjske uslove
Klonirane biljke razlikuju se od biljka uzgojenih u stakleniku ili na otvorenom po brojnim
anatomskim i funkcionalnim karakteristikama. Ove biljke od samog početka imaju u podlozi
sve potrebne hranjive materije, optimalnu temperaturu, visok stupanj vlažnosti i potpunu
zaštitu u sterilnim uslovima od mikroorganizama. Sam prijelaz sa uslova in vitro na uslove
vanjske sredine predstavlja fiziološki stres koji brojne vrste teško preživljavaju te je ovo
kritična faza u klonskom razmnožavanju biljaka.
Uvođenjem siromašnije podloge u zadnjim fazama mikrorazmnožavanja, biljka se polako
navikava na autotrofiju. Prvih dana biljkama se i u stakleniku moraju obezbijediti vlaga i
temperatura na kojoj su se razvijale u uvjetima in vitro. Sve podloge u koje su biljke
prenesene moraju, u prvim fazama, biti sterilne. Postupnim smanjenjem vlage u zraku, biljke
stvaraju jaču kutikulu koja spriječava naglu dehidrataciju. I fotosintetički organi – listovi
postepeno se počinju privikavati na fotosintezu. Tek kada mlade biljke počinju stvarati nove
listove i korijenove, koji su prilagođeni funkcionalnim potrebama u izmijenjenim uslovima
sredine, možemo reći da su se biljke uspješno adaptirale.
Klonsko razmnožavanje biljaka ima niz prednosti u odnosu na konvencionalne načine
razmnožavanja. Neke od njih su:
1. Dobivanje biljaka bez patogenih klica (posebno virus free biljaka).
2. Razmnožavanje in vitro mnogo je brže u odnosu na razmnožavanje in vivo.
3. Moguće je razmnožavati i one biljke koje u uvjetima in vivo nije moguće.
4. Mikroklonirane biljke rastu mnogo brže u odnosu na biljke klonirana in vivo.
5. U kulturi in vitro razmnožavaju se samo samo zdrave biljke.
6. Prostor potreban za podizanje i razmnožavanje matičnih biljaka znatno se smanjuje
upotrebom kulture in vitro.
7. Zahvaljujući optimalnim uvjetima omogućeno je precizno vremensko planiranje
proizvodnje presadnica, čime se poništava sezonski uticaj i postiže proizvodnja kroz
čitavu godinu.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
8. Nova sorte mogu se komercijalno brzo razmnožavati i tako ponuditi tržištu u mnogo
kraćem vremenu.
9. Oplemenjivači mogu brže postići solidne mutante poticanjem advantivnih pupova i
izdanaka.
10. Kultura in vitro posebno je korisna za osnivanje banke gena koja čuva zdrav, od
virusa slobodni biljni materijal, na niskoj temperaturi i malom prostoru.
11. Neke biljke potrebno je ustaliti i razmnožavati vegetativno jer su spolno sterilne .
12. Za postavljane kulture potrebno je vrlo malo početnog materijala.
Ipak, klonsko razmnožavanje ima i nekoliko nedostataka od kojih su najvažniji:
1. Genetička stabilnost u nekim je sistemime razmnožavanja in vitro vrlo niska, što se
posebno odnosi na umnožavanje adventivnim izdancima i somatskom embriogenezom.
2. Biljke iz kulture in vitro mogu nakon prijenosa u vanjske uslove pokazati određene loše
osobina
3. Kod drevenastih vrsta često je vrlo teško potaknuti zakorijevanje reznica in vitro.
4. Mikroklonirani genotip biljaka, koji će se uzgajati u polju na otvorenom, može biti
osjetljiv na bolest i uništen od patogenog organizma koji ga je napao.
5. Regenerativna sposobnost kod biljke se može izgubiti nakon određenog broja
subkultura.
Kultura organa (list i peteljka) vrste Schefflera sp.
Površinska sterilizacija
Početni eksplantati (listovi i peteljke vrste Schefflera sp.) se površinski sterilišu 1 minutu u
apsolutnom alkoholu i 20 minuta u 15% varikini. Nakon toga eksplantati se ispiraju u
autoklaviranoj, destilovanoj vodi 3-4 puta po 5 minuta. Sterilisani eksplantati se suše na
sterilnom filter papiru.
Uvođenje eksplantata u kulturu
Površinski sterilisani eksplantati se režu sterilnim instrumentarijem, koji se prethodno žari na
plameniku. Ovako pripremljeni eksplantati se postavljaju na hranjivu MS podlogu sa malim
koncentracijama citokinina i auksina. Kulture se ostavljaju u klima komori sa regulisanom
temperaturom, vlažnošću zraka i intenzitetom svjetlosti.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
VIII CJELINA
UVOD U DISKUSIJU O ETIČKO LEGALNIM ASPEKTIMA
GENETIČKIH ISTRAŽIVANJA
Nauka koja je, između ostaloga, nastala upravo kao posljedica rapidnog razvoja primijenjene
genetike i biotehnologije je bioetika. Ova naučna disciplina se prvenstveno odnosi na skup
nepisanih pravila o tome šta je zaista «dobro» (ispravno) a šta «zlo» (neispravno). Bioetička
pitanja posebno su zaoštrena pitanjima genetičkih testova i genetičkog inženjeringa, te
pitanjima kloniranja, koja otvaraju vrata za novu eugeniku (primjenu naučnih metoda sa
ciljem stvaranja najboljih nasljednih karakteristika budućih generacija).
Razvoj nauka o živim sistemima uvjetovao je da ljudska prava, poput prava na tjelesni
integritet , dostojanstvo ili privatnost dobiju nove dimenzije.
- dijelovi ljudskog tijela se upotrebljavaju u transplantaciji.
- odstranjeni organi mogu biti izvor za patentiranje novih ćelijskih linija mimo
saglasnosti onoga kome pripadaju.
- Ljudski tijelo u cijelini predstavlja potencijalni objekt biomedicinskog eksperimenta.
Pojedinačna ili grupna genetička testiranja otvraju put za dobijanje genetičkih informacija
koje ne moraju predstavljati samo dijagnostičko sredstvo već potencijalno mogu biti osnov za
diskriminaciju u društvu, u domenu zapošljavanja, osiguranja itd. Takve genetičke analize
kojima se prodire u genetičko naslijeđivanje čovjeka mogu značiti narušavanje ljudskog
dostojanstva i tzv. genetičkog identiteta, kao nove dimenzije prava na ljudsko dostojanstvo
koje bi u eri mapiranja ljudskog genoma moralo biti zaštićeno. Kroz informacije dobijene
genetičkim «skrininzima» i testiranjima moguće je identifikovati osobu, otkriti eventualne
poremećaje na nivou genotipa, te klasificirati je u „rizičnu populaciju“.
Jedan od primjera potiče iz 1907. U 27 američkih država donijet je zakon o sterilizaciji kojim
se zabranjuje određenim kategorijama, koje je su od strane zvaničnih organa proglašeni kao
genetički inferiornih ljudi – duševnim bolesnicima, epileptičarima, ljudima sa minimalnim
fizičkim sposobnostima, da ima j djecu. Jedna od demografskih metoda za zaštitu američkog
gene poola bilo je donošenje zakona kojim se ograničavalo doseljavanje iz istočne i južne
evrope za čiju se populaciju smatralo da posjeduje nepoželjan genetički materijal.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Upravo ovakva zloupotreba genetike u prošlosti, opasnost od genetičke diskriminacije,
otkrivanje potencijala za razvoj bolesti koje možda nikada neće dati kliničke simptome
prdstavljaju osnovne argumente za uspostavljanje etičko- zakonske regulatve iz ove oblasti.
Osnovna pitanja koja se sama po sebi nameću su:
Gdje su granice aplikativne genetike i biotehnologije?
Ko ih postavlja?
Da li spriječiti njihov razvoj i u kojoj mjeri kad dovode do unaprijeđenja medicinske
pomoći?
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
IX CJELINA
DETEKCIJA GENETIČKI MODIFICIRANIH ORGANIZAMA
(UVOD)
Genetička modifikacija - izmjena genetičkog materijala u nekom organizmu na način koji se
ne dešava prirodno ukrštanjem ili prirodnom rekombinacijom.
GMO – organizam u kojem je genetički materijal izmjenjen na način koji se u prirodi ne
događa križanjem ili prirodnom rekombinacijom.
GMM – (genetički modifikovan mikroorganizam), bilo koji modifikovan mikroorganizam,
ćelijski ili nećelijski, sposoban za replikaciju ili za transfer genetičkog materijala, uključujući
viruse, viroide, animalne i biljne ćelije u kulturi.
Tehnike koje rezultiraju genetičkom modifikacijom:
-Tehnike rekombinacije DNK korištenjem vektorskih sistema
-Tehnike koje podrazumjevaju direktnu introdukciju genetičkog materijala u mikroorganizam,
pripremljenog van mikroorganizma, uključujući mikroinjeciranje, makroinjeciranje. Ćelijska
fuzija ili hibridizacija, prilikom koje se formiraju žive ćelije sa novim kombinacijama
nasljednog materijala.
Metode koje ne rezultiraju genetičkom modifikacijom:
-In vitro fertilizacija
-Konjugacija ili neki drugi sličan prirodni proces
-Poliploidna indukcija
GMO detekcija podrazumijeva otkrivanje gnetički modificiranih organizama u uzorcima
biljnog, animalnog ili bakterojskog porijekla. Metode za GMO detekciju se mogu podijeliti na
kvantitativne i kvalitativne. Kvalitativne metode nam pružaju podatke smao o prisustvu ili
odsustvu GMO, a vrše se na dva nivoa:
1. detekcija na nivou proteina
2. detekcija na nivou nukleinskih kiselina
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)
BIOTEHNOLOGIJA
Detekcija na proteinskom nivou vrši se primjenom testnih traka, a bazirana je na reakciji
antigen-antitijelo i pogodna je za skrining u vanlaboratorijskim uslovima (npr. na granicama).
Kvalitativna detekcija na nivou DNK obuhvata metode bazirane na PCR tehnici. Osim
standardnih komponenti potrebnih za PCR, poželjni su uzorci sa pouzdanim prisustvom
ciljanog DNK fragmenta (PCR pozitivna kontrola). Real-Time PCR na tehnika je
najegzaktniji način kvantifikacije prisustva transgenih organizama u uzorku. Zasniva se na
amplifikaciji transgena i njegovoj relativnoj kvantifikaciji u odnosu na standard.
*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)