Biotehnologija u Šumarstvu

8/19/2019 Biotehnologija u Šumarstvu

1/48

BIOTEHNOLOGIJA U

ŠUMARSTVU

Radili: Besim GurdaAsim Djedović

Profesor: Dalibor Ballian

Univerzitet u Sarajevu Šumarski fakultetŠumarska genetika


2/48

dre!ene biote"nologije za istra#ivanja geneti$kevarijabilnosti na indivdualnoj i %o%ula&ijskoj razini'a va#ne za %ro&ese o%lemenjivanja (umskogdrveća' davno su razvijene)

*ako su +unter i Biljegt ,-./) godine otkriliizoenzime' vrlo brzo Biljegt 0oller ,-.-) godineustanovljuje vezu izme!u razli$iti" varijanti enzima1izoenzima2 i organizma' te od tada izoenzimi

%o$inju igrati va#nu ulogu u mnogim granamabiologije' %a tako i (umarstva)


3/48

Izoenzimi u šumarskim istrai!an"ima

Analiza izoenzima %redstavlja osnovni bio"emijski %ostu%ak %rekokoga se mogu utvrditi razlike izme!u %ojedini" vrsta kao i svojstava%ojedina$ni" stabala' a tako i %o%ula&ija) 3a toj osnovi oniomogućavaju i kontrolu sjemenskog sadnog materijala razli$itog%odrijetla' te stoga u zemljama s intezivnim (imarstvom nalazi svojuveliku %rimjenu u kontroli) 4%ak' koliko god ove metode mogu bitizanimljive za %raksu' one %okazuju odre!ene grani&e do koji" semo#e ići s ovim stu%njem razvoja te"nike' te se mo#e otkriti samo567 mogućeg %olimorfizma) 3eki su istra#iva$i is%itivali vezuodre!eni" enzimski" sustava' kod obi$ne jele' te su u tom smislu%ostignuti zadovoljavajući rezultati ada%ta&ije vrste na %arametrima1a%sor%&ijski kom%leks2 kiselosti tla) 8ao i analiza izoenzima' tako ianaliza monoter%ena %okazuje velike mogućnosti' ali odre!enaograni$enja koja se javljaju tijekom istra#ivanja) 0ogućnostiistra#ivanja kod monoter%ena su sukladne onim koje imamo kodizoenzima)


4/48

#N$ u šumarskim istrai!an"ima

Po$etkom 96i" godina %ro(log stoljeća %o$inju se razvijati metodeanalize D38' koje vrlo brzo nalaze i svoju %rimjenu u (umarstvu'%osebi&e %o$etkom -6i" godina)*ako unutar %o%ula&ijske ime!u%o%ula&ijske analize metodom D38 %redstavijaju novibio"emijski %ostu%ak %reko koga se mogu utvrditi razlike izme!u%ojedini" rodova 1genus2' %odredova 1subgenus2 i unutar vrste kao

svojstava %ojedini" %o%ula&ija) ;rlo brzo se ustanvilo da se ovemetode mogu %rimijeniti na fosilnom' kao i "erbarskom materijalu'tako da su se u mnogo slu$ajeva %okazale %ri"vatljivijim odizoenzmski" i monoter%enski" analiza) Stoga je ova metoda analizefosilni" ostataka na(la svoju veliku %rimjenu u %aleobotani&i)Sve metode analize D38 mo#emo %odijeliti u dvije velike gru%e:

Prva gru%a metoda je ona koja omogućava individualnu analizuunutar %o%ula&ija' a tu dolazi RAPD i A


5/48

Osno!ni %rin&i%i mo'eku'arno()eneti*ki+ istrai!an"a

snovni %rin&i%i ovi" te"nika mogu se na isti na$in %rimjenjivati kodsvi" vrsta (umskog drveća' bilo da su u %itanju sastojine' sjeme ilisadni materijal)

>bog razumijevanja ove %roblematike dat će se ne osnovni"%odataka' bez da se ulazi u %itanje oko detalja te"ni$ke %rirode'odnosno samog rada u laboratoriji)4 %ored toga' kao uvod moramo deti nekoliko osnovni" na%omenavezani" za %roblematiku analize izoenzima i D38)


6/48

Biokemi"ski #N$ ,i'"ezi

Aleli koji reguliraju bio"emiljske biljege' tako!er' mogu bitiidentifi&irani) Sku%inu bio"emijski" biljega koja je do sada naj$e(ćekori(tena' %redstavljaju izoenzimi) U znanstvenoj literaturi' naj$e(ćesu definirani alozimi) *emeljom jedne aminokiseline i njezini"izomorfni" oblika' mo#e se razlikovati %ar izoenzima' (to $esto dovodido razlika u nji"ovom elektri$nom %unjenju) Ukoliko se to desi'moguće i" je razdvojti' nakon migra&ije'na agarnom gelu uz

odgovarajuću volta#u 1elektroforeza2) 3adalje' lan&i enzima u gelumogu se obojiti sa odre!enim fiziolo$kim bojama) U (umarskoj geneti&izoenzimska istrativanja su uglavnom uvedena tijekom (ezdeseti"godina %ro(log stoljeća) grani$enje metoda i izonzima svedeno je nasvega nekoliko enzima koji se mogu "isto"emijski bojiti' tako da brojlokusa izoenzima u genomu stabla koje se mo#e izu$avati rejetko

%relazi ?.) Stoga' analiza izoenzma daje samo grubu %ro&jenuuku%noga genoma'jer na taj na$in otkrivamo samo oko 567geneti$ke varijabilonosti) D38 biljezi su uglanom dobiveni &ije%anjemD38 u manje segmente koji se mogu diferen&irati kor(tenjem'elektroforeze) D38 mo#e vodit %odrijetlo iz stani&a nukleusa' stani$neD38' mito"ondrija1mtD382' %lastida1&%D382 i ribosoma 1rD382)


7/48

Postoje razlate te"nike za &ije%anje i analizu D38)

R


8/48

A


9/48

-

ES*13at%is za sekven&u koju ozna&ava2 je %ar&ijalna &D38sekven&a' odnosno sekven&a unutar regije kodiranja gena) ES* sekoristi za razlikovanje aktivni" gena u tkivu i tako!er mo#e bitikori(ten za formiranje kom%arativni" genetski" ma%a $etinja$a)0o#e na %rimjer' ozna$avati i biti kori(ten kao osnova istra#vanjakod R


10/48

Ta,e'a -./

Svojstva D38 biljega uistra#ivanjima (umskogdrveća


11/48

U tabli&i ,9 dajemo svoje mi(ljenje o u$inkovitosti razli$iti" svojstavaza utvr!ivanje me!u%o%ula&ijski" razlika i za %ojedina$nuidentifika&iju)Pret%ostavke izne(ene u tabli&i ,9' koje se odnose na metri$kasvojstva kao sto je ritam rasta %re#ivljavanje i rast stabla iliizoenzime' mogu se analzirati kori(tenjem ras%olo#ivi" %odataka zasmreku i obi$ni bor) Ritam rasta je to$ka u vremenu za %o$etak rastatijekom %roljeća i %restanak rasta tijekom jeseni) ve to$ke uvremenu zna$ajne su za izbjegavanje izlaganja kasnim %roljetnim iliranim jesenskim mrazovima) Sve izoenzimske studije %okazujumnogo manju diferen&ija&iju nego za ranije s%omenuta ada%tivnasvojstva);rijedno je %ak s%omenuti da su statisti$ke te"nike kor(tene za

biljege mnogo manje %re&izne od oni" za metri$ka svojstva) vozna$i da su razlike mo#da %ot&ijenjene) Unato$ ovom' o$igledno je dastudije varijabilnosti izoenzima i varijabilnosti metri$ki" svojstava'daju razli$ite ti%ove obraza&a za varijabilnosti)


12/48

;arijabilnosti koje o%a#amo za neutralne biljege mogu se %ri%isati vezikoja je ranije s%omenuta' ili $injeni&i da je %otrebno nekolikogenera&ija da bi se dostigla jednaka frekven&ija alela u razli$itim%o%ula&ijama %utem %rirodnog toka gena) 8ao kod "umanogidentifi&iranja o&a' kori(itenjem biljega' geneti&ki identifika&ija drvetaolak(ana je brojnim ras%olo#ivim blijezima)0ikrosateliti s nji"ovom "i%ervarijabilnom D38 %o svojoj %rili&i'najbolji su izbor kod te vrste identifika&ije) Budući da mito"ondrijalna"loro%lastna D38 osigurava samo ograni$eni broj biljega oni nisuosobito dobro %rilago!eni %ojedina$noj geneti$koj identifika&iji)4%ak oni imaju jedno drugo svojstvo a to je da se %renose do%otomstva %utem samo jednoga roditelja) 8od angios%erma oni se%renose %utem #enske jedinke' dok kod $etinja&a mu(ka jedinka

%renosi "loro%laste do %otomka' ovo zna$i da je moguće istovremeno%ratiti tok gena %omoću %eludi i sjemena)Uobi$ajeno' dis%erzija je br#a %utem %eludi nego sjemenom'$e(erima ili ora(i&ama)


13/48

Mo)u0nosti %rim"ene izoenzimske i #N$ ana'ize u %o%u'a&i"sko")eneti&i

4zoenzimska analiza osnovna je biokemijska metoda utvr!ivanjarazlika unutar vrste ili utvr!ivanja razlika izme!u %o%ula&ija) Sve vrste(umskog drveća su di%loidni organizmi' s dvostrukim brojem"romosoma 1?n2' te je na taj na$in i svaki gen u stani&ama dvostruko%risutan)Ako su nizovi D38 na oba genska odsje$ka isti govori se o istoj genvanjanti ili alelima' koji se ozna$ava kao $isto nasljedna varijanta ili"omozigot) *ako na odre!enom gen lokusu mogu nastati jedna ilidvije varijante gena' s većim brojem stabala imamo i vi(e varijanti)8ao %osljedi&a toga u stani&ama se javljaju razli$ite varijanteodre!enog enzima' odnosno izoenzima' koji u fiziolo(kim %ro&esima

razmjene materija imaju istu ulogu) Postojanje s%e&ifi$ni" izoenzima'a time i razli$iti" gena mo(e se dokazati izoenzimskim analizama)Budu&i da su enzimi izravni %rodukti gena' izoenzimi omogućujunji"ovo otkrivanje) U sku%inu molekula vazni" u %ro&esu razmjenetvari ubrajaju se i enzimi' kojima %ri%ada uloga ubrzavanja reak&ija)


14/48

Dosad %oznatim te"nikama mo#e se otkriti %ribli#no 56 7aminokiselinski" su%stitu&ija' %a %rema tome samo 567 uku%negeneti$ke varijabilnosti) 4na$e' redoslijed aminokiselina u enzimu u

jasnom je odnosu s%ram redoslijeda baza odre!eni" %odru$ja D3Alana&a tj) gena) Stoga se enzimi mogu u%otnrijebiti za markiranje gena'te tako alozime mo#emo nazvati geneti$kim biljezima) U biljkama je

oko .67 izozimski" lokusa %olimorfno i imaju razli$ite alozime)Enzimi su %rodukti gena) Stoga su varija&ije izozima i alozimafenoti%ske) 3ajvi(e informa&ija o genetskoj varijabilnosti u

%o%ula&ijama' dosada je dobiveno iz elektroforetski" istra#ivanja)S obzirom da jezgrina D38 %odlije#e %ro&esima rekombiniranja izgenera&ije u genera&iju je %romjenjiva) 4%ak' kori(tenjem metodaRAPD A


15/48

*ako imamo dvije faze kretanja gena' %utem #enskog roditelja il %utemsjemena' odnosno %utem mu(kog roditelja %utem %eludi) Stoga geni1genomi2 koji se naslje!uju %utem #enskog roditelja obi$no ostajuunutar %o%ula&ije) >a razliku od ovi" D38' jezgrina D38 je %od

sna#nim utje&ajem %eludi i rekombina&ija' te se mo#e razmjenjivatimaterijal sa relativno veliki" odstojanja) ezgrinu D38 gradi veliki brojgena' te je vrlo u%itno koje će se njene sekven&e u istra#vanjimaus%ore!ivati) Stoga je vrlo za"tjevno da se za analizu una%rijed odredesekven&e i kroz niz testova da se odlu$imo za odgovarajućukombina&iju dok je %ostu%ak kod vanjezgrine D38 nesto jednostavniji)

+loro%lasna' mito"odrijalna i ribozoma4na D38 imaju relativno velikbroj gena 1&%D38 oko ,,62 u odnosu na svoju veli$inu' a i %od manjimsu selek&ijskim %ritiskom od jezgrine D38) *ijekom evolu&ije velik brojgena iz "lors%lasta' mito"ondrija i ribosoma se izgubio jer je tijekomevolu&ije %re(ao u jezgru) ito%lazmatske D3A jo( u %osve is%itane'tako da je broj is%itani" kodirani" gen lokusa vrlo malen) >na se da&%D3A sa svojim informa&ijama sudjeluje u izgradnji oko ,,6bjelan$evinasti" struktura u &ito%lazmi)


16/48

+loro%lasna D38 kod lista$a se naslje!uje samo %utem #enskog

roditelja dok je kod $etinja$a situa&ija ne(to mijenjena jer se nasje!uljeod mu(kog roditelja)8od mito"ondrijalne i ribozomalne D38 nasije!ivanje je uvijek %utem#enskog roditelja) vaj ti% naslje!ivanja je oslobo!en rekombina&ija idosta je konzervativan' za razliku od jezgrne D38' te ostavlja velikemogućnosti za %o%ula&ijska istra#ivanja' %osebi&e za %rćenje

migra&ioni" %ro&esa %oslije zadnje gla&ija&ije)*ako su do danas %rovedena istra#ivanja na mnogim (umskim vrstama'u svr"u istra#ivanja %o%ula&ijskogeneti$ki" struktura kod sijedeći"vrsta: jo"a' buka' borovi' jela' "rast' zelena duglazija itd)Prikazane metode &itirani" autora su se %okazale %ogodnim za%o%ula&ijskogeneti$ke anelize' kao i odre!ivanje srodni$ki" odnosaunutar i me!u %ojedin" rodova ili %o%ula&ija)


17/48

Mo)u0nosti %rim"ene mo'eku'arni+ ana'iza

0olekularne analize iz dana u dan u (umarstvu nalaze sve veću

%rimjenu)Prije svega' najveća %rimjena je u %roizvodnji re%roduk&ionogmaterijala' sjemena i sadni&a' a analize su svoje mjesto na(le ukontroli %rirodne obnove (uma' te u rije(avanju odre!eni"taksonomski" nedoumi&a u suvremenoj sistemati&i)>a bilo koju od nevedeni" aktivnosti bitno je da se u %rvom redu

odgovori na dva vrlo va#na %itanja:

-Jesu li u dva ili više uzoraka prisutne iste gen varijante(haplotipovi), odnosno jesu li samo one prisutne?

-Je li učestalost gen varijanti (haplotipovi) u uzorcima koji se

uspoređuju ista?


18/48

>a (umarsku znanost i %raksu je zna$ajno da se na znanstveno %riznatna$in is%ita %odrijetlo %olaznog materijala' kao i %odrijetlo materijala

koji slu#i u re%roduktivne svr"e' te time kontrolira obnova (uma)*o je vrlo jednostavno kod kontrole klonskog materijala izoenzimskimmonoter%enskim i D38 analizama' jer sve jedinke istog klona moraju%okazati iste vr%&e na florogramu kako kod roditelja 1ortete2 tako kod%otomstva1ramete2)Daleko slo#enija situa&ija je kod materijala generativnog %odrijetla)

Pored već re$enog' ovdje se ne mo#e jednostavno donijeti zaklju$ak' jer imamo razli$iti sastav %ertija sjemena jedne sastojine' %robleme sveli$inom uzorka' ne%ot%uno obu"vatanje svi" sastojina' odnosnoveli$inom sastojine koja je obu"vaćena obnovom)

Stoga se mogu utvrditi samo odre!ene neujedna$enosti u rezultatima'%a se u tom slu$aju %ristu%a %rin&i%ima iskiju$ivanja kao (to je kodanalize izoenzimima dao Gregorius radni&ima 1slika 5.2' a moze se%rimijeniti kod D38 analiza)


19/48

Us%ore!ivanjem %o&etnog materijala jedne sastojine' sjemenom koje je %roizvedeno u istoj sastojini' kao i sadni&a %roizvedeni" iz togsjemena' a ne konstatira se %risustvo strani" nasljedni" svojstava'dobije se dokaz da sjeme ne %otje&e date sastojine) Ako se %ak usastojini javljaju iste gen varijante ili "a%lotf%ovi' to jos ne %otvrduje%rl%adnost istoj sastojini' jer uvijek mogu %ostojati sastojine s istimgen varijantama ill "a%lot%oma' iz koji" %otje$e sjeme)


20/48

*ako za sada' geneti$kim istra#ivanjima' odnosno D38 analizamamo#emo samo reći da sjeme ili sadni materijal %otje$u iz sastojine'uz odre!enu vjerojatnost)Pravilnim %oznavanjem geneti$ke varijabilnosti jedne vrste' kao ime"anizama naslje!ivanja' te %ravilnim izborom uzoraka zaus%ore!ivanje' D38 analiza mo#e dati zna$ajne s%oznaje o %odrijetluvrste)vi %rin&i%i su univerzalni za sve vrste drveta' te se stoga lako%rmjenjuju) Rezultati ovi" istra#ivanja mogu dati korisne %odatke ukontroli sjemena i sadni&a' identifika&iji klonova u %lanta#ama za%rozvodnju sjemena' kao i kod identifika&ije već %odignuti" (umski"nasada za koje ne znamo ta$no %odrijetlo sjemena)*ako je u


21/48

Meto1a izo'a&i"e uku%ne #NA

D3A se izolira iz djelića zimskog %u%oljka' svje#eg lista'

jednogodi(nje svje#e igli&e' ili nekog drugog #ivog dijela biljke)*ako!er' %ostoje i %osebne metode izola&ije iz fosilni" materijala)bi$no je #ivi materijal koji se koristi za analizu mase oko .6 mg)U laboratorijama se rabi jako mnogo %ro&edura za izola&ije' te svakiod laboratorija ima svoju s%e&ifi$nu %ro&eduru' ali se vrlo $esto rabe iveć standardizirani tvorni$ki kom%leti koji daju vr"unske rezultate u

izola&iji)

vdje ćemo se osvrnuti na %ar metoda' %rvo jednu klasi$nu metoduizola&ije koja je modifi&irana za rad s embrionom divlje tre(nje1Ballian' ?66F)2' %otom na %ro&eduru iz izola&ijskog kom%leta za$etinja$e: Dneas@ Plant 0ini 8it' Dneas@ - Plant Proto&ol for4solation of D3A from Plant =eaf *issue od 4AGE3 Gmb"' +ilden'German)


22/48

Izo'a&i"a )enomske #N$ ko1 1i!'"e trešn"e iz em,riona

4zola&ija je izvr(ena za genomsku 1&jeloku%nu stani$nu2 D38 1%rema

Rogers ,--/2) 0ala veli$ina embriona ote#avala je ekstrak&iju' ali jemetoda us%je(no %rilago!ena koli$ini embriona u %rvim eta%amaizola&ije na na$in kako slijedi)Embrioni su dr#ani u tubama na tem%eraturi od /6 ' najmanje ?Fsata) Po nji"ovom va!enju iz fri#idera' odma" je vr(ena ma&era&ijas%e&ijalno konstruiranom alatkom' uz dodavanje ?H *AB buffera 1?7*AB' ,66 m0 *ris' ?6 m0 ED*A' ,'F 0 3al2 u %rilago!enoj koli$iniod .6' (to se %okazalo sasvim dovoljnim za veli$inu embriona)Potom su uzor&i izmije(ani na mje(ali&i i stavljeni na inkuba&iju 1I. u trajanju od ,. min2 uz dodatak "loroform4soam@lalko"ol 1odnossmjese ?F:,2 u koli$ini od .6 Jl) Sadr#aj se nje#no izmije(a i %otom

&entrifugira na ,5)666 obrtajaCmin u trajanju od 5 min) Gornji sloj&entrifugata se %i%etira u nove tube' %azeći da se ne izmije(a s donjimslojem)


23/48

vome se doda 9 Jl .7 *AB oto%ine 1.7 *AB' 6'/ 0 3al2)Sadr#aj tuba se "omogenizira na mje(ali&i i %onovo stavi ,6 min na I.K)Potom se doda .6 Jm "loroformisoam@lalko"ol i sve izmije(a namje(ali&i' &entrifugira na ,5)666 obrtajaCmin u trajanju od . min) Ponovo

se odvoji gornji sloj &entrifugata' i %i%etira u nove tube' te se doda ,66 Jo"la!enog 1?6K2 etanola 1--72) *ube se lagano %rotresu u ru&i i stavena ?6K u trajanju od 56 min) Slijedi &entrifuga na ,5)666 obrtajaCmin utrajanju od F min) 3akon &entrifugiranja u dnu tube se %rimjećuje mala%a"ulji&a koja %redstavlja li%ide' %roteine i D38) *ada lagano odlijemote$nost iz tuba %azeći da kugli&a ne is%adne iz tube) U tube se doda .6 Jl

te(ke soli u obliku buffera 1+ig"salt *E Buffer C,6m0 *ris' , m0 ED*A' ,0 3al2) *uba se zatim lagano rukom izmućka da se %a"ulji&a ras%lete i%otom stavi na I.K u trajanju od ?6 min) 3akon toga doda se ?66Jletanola 1--72' lagano se %rotrese rukom i stavi u &entrifugu na ,5)666obrtajaCmin u trajanju od 5 min) Slijedi dekanta&ija' %azeći na %a"ulji&u dane is%adne iz tube' i jo( jedno is%iranje s ,.6 Jl o"la!enog 1?6K2 etanola19672) Slijedi ru$no mućkanje i &entrifuga na ,5)666 obrtajaCmin utrajanju od , min) dlije se etanol i stavi u &entrifugu s vakuum su(ili&omda se sadr#aj D38 u formi %a"ulji&e osu(i) 8ada se zavr(i su(enje u tubuse doda .6 Jl 6',H*E Buffer 1, m0 *ris' 6', m0 ED*A2 radi resus%enzijeD38) *ada se tube s%reme u fri#ider na ?6K' $ime se ekstrak&ijazavr(ena)


24/48

>a $etinja$e: D3eas@ Plant 0ini 8it' Dneas@ - Plant Proto&ol for isolation of D3Afrom Plant =eaf *issue od AGE3 Gmb"' +ilden' German@)

>a analizu je odvagano .6 mg svje#e jednogodi(nje igli&e' i stavljeno u%ri%remljene %lasti$ne e%ruvete u kojima se %rovodi ma&era&ija)>atim je u e%ruvetu stavljena kugli&a ;olframova karbida' a kom%lete%ruveta stavljen je u a%arat za ma&era&iju 1Rets&" 00566 0iHer 0ill'4AGE32) 0a&era&ija je %rovedena u dva dijela) Prvi dio ma&era&ije u

a%aratu traje oko ? min) E%ruvete se zatim skinu i u svaku se e%ruvetudoda %o F66Jl %ri%remljene kombina&ije %ufera AP,' Rnase A ireagensa DL) *ada se e%ruvete s%uste u tekući du(ik na /6K) Drugidio ma&era&ije %o$inje %onovnim stavljanjem e%ruveta u a%arat zama&era&iju' gdje ostaju ,'. min na 56 ,Cs' a zatim se e%ruvete okrenui %onovno ma&eriraju ,'. min na 56 ,Cs) 3akon zavr(ene ma&era&ijeuzor&i se &entrifugiraju ,6 s na ,.66 H g) >atim se uzor&i stavljaju nainkuba&iju 1I.K2' koja traje ,.?6 min)


25/48

Poslije zavr(ene inkuba&ije uzor&i u e%ruvetama se &entrifugiraju' azatim se doda ,56Jl %ufera AP?' e%ruvete zatvore i sna#no tresu utrajanju od ,. sekundi) 3akon %rotresanja e%ruvete se &entrifugiraju ,6s na ,.66H g' i inkubiraju ,6 min na ?6K) Poslije inkuba&ije e%ruvete

se &entrifugiraju . min na .66H g) U sljedećoj fazi ot%i%etira se F66Jlvodene faze u nove' $iste e%ruvete i doda 66Jl %ufera AP5CE' te see%ruvete sna#no tresu ,. sekundi' zatim &entrifugiraju) Dobivenisadr#aj %ro&ijedi se kroz %lo$u u nove e%ruvete' %azeći da ne do!e dokontamina&ije' te se &entrifugiraju) >atim se u svaku e%ruvetu doda966Jl %ufera AM) Postavi se nova %lo$a i &entrifugira ,. min na .66H

g) Po(to se sadr#aj %ro&ijedi doda se ,66Jl %ufera AE' inkubira jednuminutu na sobnoj tem%eraturi' a zatim &entrifugira ? min na .66H g)Ponovno se %ostavi %lo$a Dneas@ - i &entrifugira ,. min) Po(to sesadr#aj %ro&ijedi' doda se novi" ,66Jl %ufera AE' i time zavr(ava%ostu%ak izola&ije D3A) Dobivena se oto%ina do u%orabe $uva u"ladilniku na ?6K)Us%je(nost izola&ije D38 kontrolirala se a%aratom za mjerenjekon&entra&ije D3A N+oeferN D@3A uant ?66 flurometer's%ektrometrilom ili elektroforezom oto%ine na obi$nom gelu uzvizualiza&iju na U; lam%i uz dodatak etidium bromida)


26/48

Lan*ana reak&i"a %o'imerazom 234R5

Primjer je dat za %o$etni&e s ?, do ?? baze' koje su u%otrijebljene zaam%ifika&iju D38 obi$ne jele 1*abli&a ,-)2)


27/48

Potrebna tem%eratura za %ro&es nalijeganja tijekom am%lifika&ije seobra$unava %omoću jednad#be *OF1G , 2I?1A i *2Q gdje je 1G i2 broj baza G i u %o$etni&i 1A i *2 broj baza A i * u %o$etni&i)>a lan$anu reak&iju %olimerazom %ri%ravlja se reak&ijski volumen koji

mo#e biti od ,, do ?. za %ar %o$etni&a' a (to je %otrebno za jednuanalizu %rikazano je u tabli&i) 8om%letna %ri%rava za lan$anu reak&iju%olimerazom mo#e se uraditi ru$no (to za"tijeva vi(e vremena ili uvelikim laboratorijima se radi na robotnoj radnoj stani&i Blomek ?6661Be&kman 4nstruments2) Slika ?)

Slika ?) Robotna radna stani&aBlomek ?666 1Be&kman

instruments2


28/48

Slika 5) *ermokrug GE3E Am%RPR S@stem -/66


29/48


30/48

=an$ana reak&ija %olimerazom obavlja se u PR strojevima' ilitermokrugu koji mogu biti od razni" %roizvo!a$a' a na sli&i je datstroj %roizvo!a$a GE3E S@stem -/66) >a %ro&es am%lifika&ije za%ret"odno dati %rimjer oto%ine od ?.Jl' rabile su se sljedećetem%erature: %o$etna od -F u trajanju . min' slijedi ?.

krugova 1-FK za , min' ..K za , min' /?K za , min2' izavr(ne tem%erature od /?K u trajanju 9 min) Poslije lan$anereak&ije %olimerazom u termokrugu je tem%eratura $ekanja FK)1*abeli&a ?,)2


31/48

3akon (to se zavr(e lan$ane reak&ije %olimerazom' kontrola us%je(nostiam%lifika&ije %rovodi se elektroforezom na agarnom gelu'%ri%remljenom %rema re&e%tu iz tabli&e) U gel se unesu uzor&i dobivenilan$anom reak&ijom %olimeraze) >a elektroforezu %otrebno je oko ?6

min) 3a%on istosmjerne struje za elektroforezu iznosio je ,56;) Bojenjegela %rovedeno je etidijum bromidom koji je u gel dodan u koli$ini/Cml) Poslije zavr(ene elektroforeze gel je %ostavljen na ultravioletnilaminator i fotografiran) Slika 59)


32/48

E'ektro6oreza na %o'iakri'ami1nom )e'u

Poslije us%je(no zavr(ene lan$ane reak&ije %olimerazom %ri%rema sesmjesa za digestiju %rema re&e%toru iz tabli&e 5?' a obi$no se radi%rema broju uzoraka %o jednom radnom krugu sekven&era i kreće se od5 kod stari" sekven&era do - kod novi")Digestija se %rovodi tako da se %ri%ravak 5 do . min grije u termokruguGE3E Am%%PR S@stem -/66 na -. ) *ad se uzor&i brzo izvade i

stave u led do %ostavljanja uzoraka na %oliakrilamidni gel da ne bido(lo do nji"ove %onovne "ibridiza&ije)Poliakrilamidni gel se uvijek %ri%ravlja na temelju gotovi" %re%arata1tabli&a 552 koji se ne%osredno %rije %ostavljanja gela izmije(aju iutisnu u odgovarajuću (ablonu za gel' koja se rabi na sekven&eruP"arma&ia =8Ba)


33/48


34/48

Slika 5-) Alf eH%ress dna seuen&er

>a elektroforetski rad sekven&era %otrebno je %ri%remitioto%inu %ufera %rema re&e%turi iz tabli&e 5F)Rad sekven&era traje maksimalno od . do /6 minuta)


35/48

O*ito!an"e )e'o!a i statisti*ka o,ra1a %o1ataka

Sekven&er je %ovezan s mikro%ro&esorom u kojemu je instaliran jedanod statisti$ki" %rograma' i to sve u ovisnosti o vrsti sekven&era' koji je%ode(en za mjerenje am%lifi&irani" fragmenata) Prilikom radasekven&era selek&ioniraju se %olimorfni am%lifi&irani fragmenti u oblikuvr"ova) ;rijednosti se o$itavaju automatski' uz %ret"odno %oravnanje uz%omoć vanjski" mjera$a) 8ao krajnji %rodukt dobije se florogram s

veli$inama odre!eni" fragmenata) Po(to se zavr(i sekven&ioniranje svi"uzoraka radi se &ross&"e&k' temeljom kojeg se %rovede korek&ijadobiveni" vrijednosti) *e nove' korigirane vrijednosti unose se ura$unalni %rogram EH&el' a zatim se %oda&i konvertiraju u statisti$ki%rogram i statisti$ki obrade) Statisti$ki%rogrami nam omogućavaju da do!emo do sljedeći" %odataka:


36/48

Broj alela 1+2 Postotak s%e&ifi$ni" alela 1P"2 Efektivni broj alela 13e2 Alelna raznolikost 1+eH%2 Unutar%o%ula&ijska raznolikost 1ST2 +a%erding test 1+R42 Srednja alelna diferen&ija&ija %arova 1Lij2 Geneti$ka odstojanja metodom %arova Geneti$ka odstojanja linearnom metodom %arova Pot%una alelna odstojanja metodom %arova Pot%una alelna odstojanja linearnom metodom %arova

8om%onentna analiza za uku%nu raznolikost PA analiza na temelju %arova


37/48


38/48

Ana'iza izoenzima 4zoenzimska analiza osnovna je biokemijska metoda utvr!ivanjarazlika unutar vrste ili utvr!ivanja razlika izme!u %o%ula&ija) Prema

%otrebi i &ilju analize mo#e se rabiti razli$iti broj enzimski" gen lokusau jednoj analizi) bi$no se rabe za svaku vrstu svojstveni enzimskisustavi' a za obi$nu jelu su dati u tabli&i 5.)


39/48

0etoda %ri%rave ma&erata za izoenzimsku analizu >a ma&era&iju se rabi P; %lo$a s %olukuglastim udubljenjima u koja sestavi talka na vr"u manje laboratorijske #i&e' i 6Jl ekstra&ijskog%ufera te F do 1re&e%ti u tabeli&i 52 svje#i" %u%ova ili dijelovasvje#eg lista' do oko ,66 mg) Postu%ak ma&era&ije izvodi se %omoćustaklenog tu$ka 1staklene mje(ali&e2) Po(to se materijal dobroizma&erira' u ma&erat se stavi %o %et komadića filter %a%ira' da u%ijuma&erat' a zatim se %a%irići %o"rane u male kasete i do u%orabe

smjeste u ledeni&u na /6 )


40/48

3ri%ra!a )e'a Gel se %ri%ravlja %rema enzimskim sustavima koji se rabe uistra#ivanju %rema re&e%tima koji su %rilo#eni u tabli&i 5/)Poslije %ri%rave' odnosno ku"ana' gel se izlijeva u (ablone odre!eni"dimenzija' %rema komorama za elektroforezu 1Slika F,2) Pri %ri%ravitreba voditi i ra$una o gel %uferu koji se stavlja u gel' akarakteristi$an je za svaki gel sustav 1*abli&a592)


41/48


42/48


43/48

E'ektro6oreza

3akon (to se %ri%ravi gel i na njega u %ri%ravljene ureze %ostave filter

%a%iri' gel se stavi u komore) Prije %ostavljanja gela u komore stavi seelektrodni %ufer) Po(to se %ri%ravi komora s gelom' %usti se

jednosmjerna struja $ija ja$ina i na%on karakteriziraju svaki gel sustav)

Potrebna ja$ina u A i na%on u ; dani su u tabli&ama' s re&e%tima zasvaki enzimski sustav 1Slika F? i F52) *rajanje elektroforeze

karakteristi$no je za svaki enzimski sustav)

Po(to se zavr(i %ostu%ak' gel se izre#e na onoliko dijelova koliko semo#e uraditi analiza enzimski" sustava od jednog gel sustava) Re#e se%osebno konstruiranim reza$ima' odnosno s%e&ijalnom #i&om) Slika FF

Po(to je gel izrezan' boji se "istolo(kim bojama %rema odgovarajućemre&e%tu za svaki enzimski sustav %osebno)


44/48


45/48


46/48

O*ito!an"e )e'o!a i statisti*ka o,ra1a %o1ataka

Poslije bojenja fiziolo(kim bojama %rovodi se analiza zimograma'identifi&iraju se aleli za svaki gen lokus' fotografira se i eventualno'su(i gel) >a identifika&iju rabi se ustaljena nomenklatura' tako dabrojke ,,' ??' 55' FF ozna$avaju "omozigote' a brojke,?',5',F'?5'?F'5F ozna$avaju "eterozigote)

Poda&i se unesu u %ri%remljeni formular' a kasnije se veli$ine unesu ura$unalni %rogram EH&el)>atim se %oda&i sla#u u ra$unalnom %rogramu Dbasis' a %otom sekoristi standardizirani statisti$ki %rogram SAS 1Statisti&al Anal@sisSistem2 u kojem se %oda&i obra!uju)


47/48

Statisti*kim %ro)ramom o,ra7u"u se s'"e1e0i %arametri8

-/ Geneti*ka unutar%o%u'a&i"ska !ari"a,i'nost Stvarna srednja "eterozigotnost *eoretska "eterozigotnost Geneti$ka raznolikost Diferen&iranje unutar %o%ula&ije

9/ Geneti*ka !ari"a,i'nost izme7u %o%u'a&i"a Geneti$ka odstojanja Geneti$ko diferen&iranje izme!u %o%ula&ija 8laster analiza


48/48

H!a'a na %an"i:

Documents

Biotehnologija u Šumarstvu