PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

YAKLAŞIMLARYAKLAŞIMLAR

•Proteinler dışındaki moleküller karışımdan uzaklaştırılır:

Örneğin, ham özüte streptomisin sülfat eklenerek DNA çöktürülür.

Daha sonra da santrifüjleme ile uzaklaştırılır.

•Proteinler çöktürülür.

(TCA-NH4 sülfat-organik çözücüler kullanılarak)

Santrifüjlemeyle ayrılıp ileri saflaştırma işlemleri uygulanır.

PROTEİNLER çoğunlukla

• Büyüklük ve şekil,• Toplam yük,• Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar,• Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi

gibi özelliklerinin farklı olmasına dayanarak

KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLEKROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLEayrılıp saflaştırılabilir.

Kolon kromatografisi kolon dolgu maddesi (durağan faz, matris) ile doldurulmuş alttan musluklu basit bir cam boruda gerçekleştirilebilir.

Protein karışımı uygun bir elüsyon çözeltisiyle kolonda sürüklenir. Durağan fazla etkileşim (adsorbsiyon) ve kolondan ayrılma (dezorbsiyon) özelliği bakımından farklı proteinler belli zaman aralıklarında veya hacimlerde toplanarak farklı fraksiyonlara ayrılır.

Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve absorbsiyonlarının ölçüldüğü sistemler de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi, peristaltik pompa ile sürekli de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar fraksiyon kollektörü tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim aktivitesi ölçülerek izlenebilir.

Kolon kromatografisinin farklı temellere dayanan çeşitli tipleri vardır:

• Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı yapısal özelliklere dayanan:

• iyon değişimi kromatografisi,iyon değişimi kromatografisi,hidrofobik etkileşim kromatografisi,hidrofobik etkileşim kromatografisi,metal-kelat kromatografisimetal-kelat kromatografisi

• Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel uyum ve etkileşim temeline dayanan:afinite kromatografisi (lektin afinite kromatografisi, afinite kromatografisi (lektin afinite kromatografisi, immünopürifikasyon)immünopürifikasyon)

• Molekül boyutuna dayanan:jel geçirgenlik kromatografisi(jel filtrasyonu veya jel geçirgenlik kromatografisi(jel filtrasyonu veya moleküler elek tekniğimoleküler elek tekniği de denir)

Proteinleri oluşturan amino asitler farklı yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve

glutamik asit pH 7.0 değerinde negatif yüklü asidik gruplar taşırken; lizin,

arjinin ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar içerir.

arginin

lizin

histidin

aspartik asit glutamik asit

Her protein, bu beş amino asiti farklı oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin

net yükü yapısındaki bu amino asitlerin miktarına ve protein çözeltisinin pH’sına

bağlı olarak değişir.

Proteinler toplam yüklerinin 0 olduğu pH değerinin (izoelektirik nokta, pI) üzerindeki

pH değerlerinde negatif, altındaki pH değerlerinde ise pozitif elektrik yüküne

sahiptir.

İyon değişimi kromatografisinin temelini, proteinin yüklü grupları ile

katı matriks arasındaki

elektrostatik elektrostatik etkileşimleretkileşimler

oluşturmaktadır.

+ yüklü iyon değiştirici matrisler ANYON ANYON DEĞİŞTİRİCİLERDEĞİŞTİRİCİLER,

- yüklü iyon değiştirici matrisler KATYON KATYON DEĞİŞTİRİCİLERDEĞİŞTİRİCİLER

+ +++

+ ++

- ---

- --

Proteinler, ya kullanılan tampon çözeltisinin pH’sını ya da tuz

konsantrasyonunu değiştirmek suretiyle kolondan ayrılırlar.

Bir anyon değiştiricide negatif yüklü proteinlerin ayrılması. Kolon ayırımı yapılacak proteinle zıt yükte olan dolgu maddesi (matriks) ile doldurulur. (a) Pozitif ve negatif yüklü proteinlerden oluşan karışım kolona yüklenir. Zıt yüke sahip proteinler kolon dolgu maddesine adsorbe olurken, matriksle aynı yükte olanlar kolonu terkederler. (b) Kolon içinde tutulmuş proteinlerin ayrılması için, kolon NaCl çözeltisi ile yıkanır. Tuz iyonları (karşıt iyonlar, counter ions) matriks yüzeyindeki yüklü gruplarla rekabet ederek ilgili proteinin kolondan ayrılmasına yol açarlar. Tuz konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması ile, daha fazla yüke sahip proteinlerin de kolonu terketmesi sağlanır.

GENEL ANYON GENEL ANYON DEĞİŞTİRİCİLER’DEĞİŞTİRİCİLER’de yer alan + yüklü gruplar:

Aminoetil

C2H4N+H3

Dietilaminoetil

C2H4NH+(C2H5)2

Trietilaminoetil C2H4N+

(C2H5)3

GENEL KATYON GENEL KATYON DEĞİŞTİRİCİLER’DEĞİŞTİRİCİLER’de

yer alan - yüklü gruplar:

Sülfo

SO3-

Karboksimetil

CH2COO-

Anyon değiştirici mi, katyon değiştirici mi seçmeliyiz?

• Ayırmak istediğimiz proteinin pH stabilitesi önem taşır.

• pI değerinin üzerindeki pH değerlerinde (yani – yüklü olduğu durumda mı daha kararlı, yoksa pI değerinin altındaki pH değerlerinde (yani + yüklü olduğu durumda mı daha kararlı?

• Hangisinde daha kararlı ve dayanıklı ise onu seçmeliyiz.

pH 4-9’un dışındaki pH değerlerinde stabilitesini koruyan

protein sayısı azdır. Onun için adsorban sayısı sınırlıdır. En çok

kullanılan adsorbanlarselüloz, agaroz ve dekstranınselüloz, agaroz ve dekstranın

karboksimetil (CM)karboksimetil (CM) ve dietilaminoetil (DEAE)dietilaminoetil (DEAE) türevleridir.

Tablo 2. Proteinlerin ayrılmasında kullanılan iyon değişimi matriksleria,b.

Anyon değiştirici matriksler

Anyon değiştirme kapasitesi

Katyon değiştirici matriksler Katyon değiştirme kapasitesi

Polistiren

AG 1 Kuvvetli AG 50W Kuvvetli

AG 2 Kuvvetli Bio-Rex 70 Zayıf

Bio-Rex 5 Orta

AG 3-X4A Kuvvetli

Bio-Rex MSZ 1-X8 Kuvvetli

Sellüloz

Aminoetil sellüloz Zayıf CM-sellüloz Zayıf

DEAE-sellüloz Zayıf

Benzil DEAE-sellüloz Zayıf

ECTEOLA-sellüloz Zayıf

PEI-sellüloz Zayıf

QAE-sellüloz Kuvvetli

TEAE-sellüloz Zayıf

DEAE-sepasel (sephacel) Zayıf

Sefadeks (sephadex)

Dekstran esaslı matrikslerdir.

DEAE-sefadeks(A-25 veya A-50)

Zayıf CM-sefadeks(C-25 veya C-50)

Zayıf

QAE-sefadeks(A-25 veya A-50)

Kuvvetli SP-sefadeks(C-25 veya C-50)

Kuvvetli

Sefaroz (sepharose) Agaroz esaslı matrikslerdir.

DEAE-sefarozCL-6B

Zayıf CM-sefarozCL-6B

Zayıf

DEAE-sefaroz(hızlı akışlı)

Zayıf CM-sefaroz(hızlı akışlı)

Zayıf

Q sefaroz(hızlı akışlı)

Kuvvetli S sefaroz(hızlı akışlı)

Kuvvetli

aKısaltmalar: CM, karboksimetil; DEAE, dietilaminoetil; ECTEOLA, epiklorohidrin trietanolamin; PEI, polietilenimin; Q, kuaterner amin; QAE, dietil-2-hidroksipropil-aminoetil; S, sülfonat; SP, sülfopropil; TEAE, trietilaminoetil.bSephadex, Sephacel ve Sepharose Pharmacia tarafından üretilmektedir. Sellülozun çeşitli türevleri Whatman, Sigma ve diğer bazı üretici firmalardan da sağlanabilir. AG ve Bio-Rex Bio-Rad firması tarafından üretilen polistiren esaslı matrikslerdir. Başka firmalar da benzer maddeler üretmektedirler (örneğin, Dow ("Dovex"), Rohm ve Haas ("Amberlite") gibi.

Por özelliği önemli mi?

EVETEVET

Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir

MW10.000-100.000 proteinler için DEAE-Sephacel veya –Sepharose;

Daha büyük proteinler için Sephadex A-25 veya C-25 kullanılır.

İyon değişimi kromatografisinde hareketli faz daima tamponlanırhareketli faz daima tamponlanır.

Tamponlanmayan çözeltiler, proteinler yerine, anyon

değiştiricilerin yüzeyinde OH ve katyon değiştiricilerin yüzeyinde H+

iyonlarının lokalize olmasına (Donnan etkisiDonnan etkisi) yol açar. Bu da olumsuz iyon değişimlerine ve

protein denatürasyonuna neden olur.

• Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin derecesine göre farklı proteinler farklı zamanlarda kolonu terkederler.

Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler

Örnek, yüksek derişimde tuz içeren (not: denatürasyona yol açmayacak türden olmalı, örneğin amonyum sülfat) bir tamponda çözündürülerek kolona yüklenir. Proteinler tampondaki tuz konsantrasyonu azaltılarak kolondan ayrılır.

• Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu metal komplekslerinden yararlanılır.

Örneğin, İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC)

Bu teknik, Psödoafinite (Yalancı İlgi) teknikleri olarak da adlandırılan bir gup teknik içinde ele alınmaktadır.

Bu grubun diğer örnekleri ise:

Tiyofilik Adsorpsiyon Kromatografisi (TAC)dir.

Boya Ligand Kromatografisidir.

Bu yöntem biyolojik etkileşim temeline dayanır ve bu nedenle son derece özgül ayırımların yapılabilmesini sağlar.

A (makromolekül) + B (ligand) A:B biyolojik yanıt

• Bu teknikte proteinler ligandligand adı verilen maddelere geri dönüşümlü olarak bağlanırlar.

• Ligandlar, aktif taşıyıcıya kovalent olarak bağlanan ve saflaştırılacak makromoleküle özel ve seçimli afinite gösteren küçük moleküllerdir.

• Örneğin, antikor, bir enzimin inhibitörü, kofaktörü ve özel hallerde substratı olabilir. Birçok ligand önce inert destek metaryaline bağlanır ve kromatografi kolonuna paketlenir.

• Bu sistemde sadece istenilen protein kolondaki liganda bağlanır. Diğer proteinler bağlanmadan ayrılır. Daha sonra kolonun uygun bir tampon ile yıkanması sonucunda istenmeyen proteinler tamamen uzaklaştırılır. Bir sonraki adımda ise tamponun uygun bir şekilde değiştirilmesi ile liganda bağlanan protein kolondan geri kazanılır.

Yöntemin, ligand ile ayrılacak protein arasındaki etkileşimin tipine göre farklı uygulamaları vardır:

İmmobilize protein A veya

İmmobilize protein G veya

İmmobilize protein L içeren kolonda ANTİKOR saflaştırma yapılabilir.

I. Adım:İmmünoadsorban hazırlanır. Antijenler (mavi) katı matrise (pembe yuvarlaklar, selüloz, agaroz vb.) kovalent olarak bağlanır (İMMOBİLİZASYON).

II. 2. Adım: Protein karışımı (ör. Serum) kolondan geçirilir. Antijene afinitesi olan antikorlar (kırmızı) antijene kovalent olmayan etkileşimlerle bağlanacak ve kolonu daha geç terkedecektir.

III. 3. Adım: Antijene tutunmuş antikoru kolondan ayırmak için elüsyon sıvısı (yüksek derişimde tuz içeren ve/veya düşük pH’da bir tampon) geçirilir.

IV. 4. Adım: Kolondan toplanan örneğin (elüent) dializ edilerek tuzlardan arındırılması

Bu yöntemde proteinler molekül büyüklüklerinin farklı olması esasına göre ayrılırlar.

Kolon dolgu maddesi küresel yapılı ve belirli boyutta gözeneklere sahip inert jel

parçacıklarından oluşmuştur. Farklı boyutta molekülleri içeren bir çözelti kolondan

geçirildiğinde, büyük moleküller gözenekli taneciklerin aralarındaki boşluklardan

geçerek kolonda hızla ilerlerler; gözenek boyutlarından küçük moleküller ise gözenek içerisine diffüzlenir ve molekül küçüldükçe

artan bir alıkonma süresi ile kolondan çıkarlar.

Jel geçirgenlik kromatografisinde kullanılabilecek matris materyallerinden örnekler.

Ticari adı Matriks tipi Üretici pH aralığı

Sıcaklık stabilitesi(oC)

Sefadeks Dekstran Pharmacia 2 120

Sefaroz Agaroz Pharmacia 4-9 40

Sefaroz CL Çapraz bağlı agaroz

Pharmacia 3-14 120

Sefasiril Dekstran/bis Pharmacia 2-11 120

Ultrogel A Agaroz IBF 4-9 40

Biogel A Agaroz Bio-Rad 4-9 40

Biogel P Poliakrilamid Bio-Rad 2-10 120

Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve

diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.

HPLC’nin klasik sıvı kromatografilerine göre önemli

üstünlükleri vardır:

• 1) çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir, 2) kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir, 3) ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir, 4) aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir, 5) büyük boyuttaki (preparatif) ayırım süreçlerine uygulanabilir.

286296

Waters 2795 Alliance HPLC, 486 and Peaksimple...

                

                              Make: Waters Model: 2795 Price $19,900

Waters 2795 Alliance HPLC is an integrated solvent and sample management platform which combines two traditional high-performance liquid chromatography (HPLC) components: a solvent management system and a sample management system. ... more

Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda

bu tekniğe gaz-sıvı kromatografisi ya da kısaca

gaz kromatografisi (GC) denir.

Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir. Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.

Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine (200-250oC) dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayırımında kullanılabilir.

              

    

5890II PIDELCD VOA GC Code:Z-5890IIPIDELCD1Price:$21,900.00 "Hewlett Packard - 5890 Series II Gas Chromatograph with Packed Inlet, O.I. Corp. PID/ELCD, O.I. Corp. 4560 Purge & Trap Concentrator with MPM16 Autosampler (other options available), Pentium IV Computer Data System with ChemStation. Tested System with Six (6) Month Warranty, Installation and Training Options are Available."