MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011

8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011

1/13

ENZM AKTVTESNNENZM AKTVTESNN

LLMESLLMESveveHESAPLANMASIHESAPLANMASI

UVUV--VIS ABSORPSYONVIS ABSORPSYONSPEKTROFOTOMETRSSPEKTROFOTOMETRS

FLUORESANSFLUORESANSSPEKTROFOTOMETRSSPEKTROFOTOMETRS

RADYOAKTFRADYOAKTFYNTEMLERYNTEMLER

Enzimlerin doku ve hcrelerdeki konsantrasyonu son derecedk olduundan miktarlarn lmek ok gtr. En iyilme yntemi enzimin katalitik aktivitesinikatalitik aktivitesini lmektir.


2/13

ENZM AKTVTESN LMEK:ENZM AKTVTESN LMEK:

Belli bir zaman aralnda enzimin katalizetkinlii sonucu oluan

DEMDEMsaptamaktr.

RNOLUUMU SUBSTRATEKSLMES

SPEKTROFOTOMETRK YNTEMLERLESPEKTROFOTOMETRK YNTEMLERLE

Enzim miktar, genelde, enzimkonsantrasyonu ile doru orantlolarak meydana gelen rn miktar

llerek saptanr.


3/13

Balang Hz "Initial rate":Balang Hz "Initial rate":

vvoo Aktivite lm, henz reaksiyon hzndabir dmenin olmad ksa zaman

aralnda yaplr.


4/13

Bu dnemde gvenilirgvenilir bir lm

iin: Enzim ve substrat deriimi reaksiyonun

optimum hzda gereklemesine yetecek

ekilde ayarlanmal, Scaklk kontrol altnda tutulmal,

lm yaplan karmn homojen olmassalanmal,

ok salkl kr ve kontrol lmleri

yaplmaldr.


5/13

KR (BLANK)KR (BLANK)allan dalga boyundaki n

absorplayacak maddeyiiermeyen reaksiyon ortam

KONTROL(LER)KONTROL(LER)

Reaksiyon ortamndaki etkinliipheli olan bileenler (r.Koenzimler)


6/13

LEMLERLEMLER

Spektrofotometre lmden 10-15 dak ncealtrlr; alma ortamnn scakl

ayarlanr; doru ve temiz kvetler seilir. Reaksiyonu balatacak bileen hari diertm bileenler kvete (ift nl aletlerde

her iki kvete) konulur. Alet sfrlanr("Auto-Zero").

Reaksiyonu balatacak bileen eklenir veetkin bir ekilde karmas salanarak lma lr.


7/13

Yksek Km deeri sz konusu ise aktivite lmnde substratkonsantrasyonu yksek tutulmaldr.

Olanaklar el verdii lde safsaf enzimle almakta yararvardr.

zelti eklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybolaca unutulmamaldr. Liyofilize halde saklamak dahaelverilidir.

lmlerde kullanlan kimyasallarn saf olmas arttr. Kalitene kadar yksek olursa, hata pay o kadar azalr.

Cam eyalarn temiz olmas, deterjan art bulunmamas, safsuyun yksek kalitede olmasna zen gsterilmelidir.

Reaksiyon karmna katlacak maddelerin pH'lar elveriliolmaldr.

TEKNK OLARAK DKKATTEKNK OLARAK DKKATEDLECEK NOKTALAREDLECEK NOKTALAR


8/13

ENZM AKTVTESNN HESAPLANMASI:ENZM AKTVTESNN HESAPLANMASI:

Birimler ve Spesifik AktiviteBirimler ve Spesifik AktiviteAbsorpsiyon (Ekstinksiyon) KatsaysAbsorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsays

Spektrofotometrik lmn dayand BeerSpektrofotometrik lmn dayand Beer--Lambert yasasna gre Absorbans (A; ya daLambert yasasna gre Absorbans (A; ya da

Optik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapanOptik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapanmaddenin deriimi (c) ve nn katettii yol (d)maddenin deriimi (c) ve nn katettii yol (d)

ile doru orantldr:ile doru orantldr: A=A=IIPPcdcd

Buna gre:Buna gre: c =c = AAIIPPdd c =c = AAIIPP

1 cm old.


9/13

Deriimi 1 M olan bir kromoforunDeriimi 1 M olan bir kromoforunk yolu 1 cm olan birk yolu 1 cm olan bir

spektrofotometrede ortaya koyduuspektrofotometrede ortaya koyduuabsorbansabsorbans Molar AbsorpsiyonMolar Absorpsiyon

(Ekstinksiyon) Katsays ((Ekstinksiyon) Katsays (IIPP)) olarakolaraktanmlanr.tanmlanr.

Birimi MBirimi M--11cmcm--11 'dir.'dir.(lmol(lmol--11cmcm--11 veya mmolveya mmol--11cmcm22 'ye edeerdir)'ye edeerdir)

cmcm22molmol--11 (M(M--11cmcm--11'in 1000 kat) olarak da ifade edilir'in 1000 kat) olarak da ifade edilir

A=A=IIPPcdcd

1 cm1 M


10/13

Bu durumda hesaplanan deriiminBu durumda hesaplanan deriimin(c'nin) birimi M (mol/l)'dr.(c'nin) birimi M (mol/l)'dr.


11/13

Bir enzimin aktivitesini eitli biimlerde ifade etmek

mmkndr:rnein,Birim zamanda enzim tarafndan meydana getirilen

absorbans deiimi: (dA/dt)Ancak daha standart bir birim olan NTE (U;NTE (U;"International Unit", IU)"International Unit", IU) daha genikullanm alan bulur.Buna gre 1 nite Enzim, 1 dakikada 1 Qmol rnnoluumunu (veya 1 Qmol substratn dnmn)katalizleyen enzim miktardr (U= Qmol /dak)

Enzim Aktivitesinin TanmlanmasEnzim Aktivitesinin Tanmlanmas


12/13

rnekteki Enzimrnekteki Enzimnitesi =nitesi =

VVtt x dA/dt x 1000 x sulandrma faktrx dA/dt x 1000 x sulandrma faktr

IIPPvvss x dx d

Deneysel lmlerin niteye DntrlmesiDeneysel lmlerin niteye Dntrlmesi

VVtt = Reaksiyon karmnn toplam hacmi (ml)= Reaksiyon karmnn toplam hacmi (ml)

dA/dt = dakikada Absorbans deiimi (dakdA/dt = dakikada Absorbans deiimi (dak--11))

IIPP= Absorpsiyon katsays (cm= Absorpsiyon katsays (cm22molmol--11))

VVss = Reaksiyon ortamna katlan rnek (enzim) hacmi= Reaksiyon ortamna katlan rnek (enzim) hacmi(ml)(ml)

D = kvetteki k yolu (genellikle 1 cm)D = kvetteki k yolu (genellikle 1 cm)

1000 arpan enzimi1000 arpan enzimi QQmole evirmek iindir.mole evirmek iindir.


13/13

SPESFK AKTVTE = U/mg proteinSPESFK AKTVTE = U/mg protein

Saf bir enzimin spesifik aktivitesiSaf bir enzimin spesifik aktivitesisabittir ve o enzime zg bir deerdir.sabittir ve o enzime zg bir deerdir.Bu aktivite birimi, enzimin saflnBu aktivite birimi, enzimin safln

tanmlayan bir lttr.tanmlayan bir lttr.

Ham ztlerde protein deriimiHam ztlerde protein deriimi

yksektir. Dolaysyla ilgilenilen enziminyksektir. Dolaysyla ilgilenilen enziminspesifik aktivitesi DK kar. Enzimispesifik aktivitesi DK kar. EnzimiSAFLATIRDIKA spesifik aktivitesiSAFLATIRDIKA spesifik aktivitesi

YKSELR.YKSELR.

Documents

MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011