Regulación de los mecanismos de transcripción y traducción en células eucariotas

1. 1. Introducción

Las diferencias entre una célula neuronal y un hepatocito son claramente evidentes desde el punto de vista funcional y estructural. Aunque todas las células que componen a un organismo multicelular contienen el mismo genoma –es decir, la información genética contenida en el ADN- no todas expresan los genes simultáneamente: la diferencia entre los subtipos celulares surge de la expresión específica de genes en determinado momento y lugar para producir finalmente proteínas que darán identidad a esa célula.

La transcripción es el primer paso de una serie de pasos en el camino de la expresión de un gen hacia una proteína funcional. Básicamente, es el proceso por el cual a partir de una hebra de ADN (que contiene una secuencia génica), se sintetiza una hebra de ARN mensajero (ARNm), que es complementaria al molde. Es un proceso bastante simple en teoría, pero en la regulación del mismo interviene un número importante de factores, cuyo desbalance puede llegar a ocasionar severos desórdenes en humanos.

La enzima central en la transcripción es la ARN Polimerasa (ARN Pol). En bacterias existe solamente un tipo de ARN Pol, mientras que en una célula eucariota existen tres subtipos nucleares (ARN Pol I, II y III) que sintetizan distintas clases de ARN. En este capítulo nos enfocaremos sobre la ARN Pol II, la enzima que sintetiza ARNm (Figura 1).

Se puede decir que la transcripción del ARNm es un proceso en pasos: el primero de ellos es el reconocimiento de una secuencia específica de ADN por parte de la ARN Pol II, con el consecuente comienzo de la síntesis de ARN. La transcripción se mantiene luego con la elongación del transcripto y finalmente, ocurre un reconocimiento de una secuencia específica en el ADN asociada a la finalización de la transcripción (Figura 2).

Figura 1. Esquema indicando el proceso básico de transcripción de una secuencia de ADN en ARNm.

Figura 2. Pasos principales en el proceso de transcripción, los cuales involucran diferentes tipos de interacción entre la ARN Pol y el ADN. Adaptado de Lewin, 1990.

A continuación se detallarán algunos de los puntos claves de regulación en la transcripción de una secuencia génica a un transcripto primario y los posibles casos médicos asociados.

2. Puntos de regulación de la transcripción

2. 1. Estado de la cromatina

En el núcleo de una célula eucariota, el ADN se envuelve de manera muy compacta alrededor de un centro de ocho proteínas histonas para formar la unidad básica de repetición conocida como nucleosoma (Figura 3).

Figura 3. Un nucleosoma está compuesto de ocho proteínas histonas centrales: un par de H2A, un

par de H2B, un par de H3 y un par de H4. El ADN que envuelve al núcleo de histonas tiene una longitud de 146 pares de bases. El ADN que no rodea a las histonas se refiere como ADN linker.

El alto grado de compactación de la cromatina (la combinación de ADN y proteínas) impide estéricamente la acción de enzimas, entre ellas las nucleasas como así también las responsables del inicio de la transcripción. Diversos factores actúan sobre los nucleosomas para determinar el estado funcional de la cromatina. Entre estos factores se puede mencionar la incorporación de distintos tipos de isoformas de histonas y el grado de acetilación de las mismas.

La acetilación es una modificación post-traduccional que ocurre en ciertos residuos de Lisina del extremo N-terminal de las histonas centrales, las cuales se posicionan hacia el exterior del nucleosoma. La hiperacetilación de histonas dirige un cambio alostérico en la conformación del nucleosoma, desestabilizando la estructura de tal manera de favorecer la accesibilidad de factores de transcripción hacia el ADN nucleosomal. Estas transiciones estructurales son una consecuencia de la reducción de la carga positiva de los extremos N-terminal acetilados. Así, al desestabilizar la estructura de la cromatina, se alivian las interacciones represivas ADN-histonas y facilitan el proceso de transcripción.

Existe una correlación general entre el nivel de la acetilación de histonas y la actividad transcripcional de un dominio cromosómico: las histonas hiperacetiladas se acumulan dentro de regiones de cromatina activas, mientras que histonas hipoacetiladas se acumulan en dominios transcripcionalmente silenciosos. Este tipo de modificación post-traduccional está modulado por el intercambio entre enzimas acetil-transferasas (HAT, por sus siglas en inglés Histone Acetyltransferase) y deacetilasas (HDAC por Histone deacetylase), cuyo desequilibrio puede estar asociado a enfermedades multisistémicas en humanos, tal como Síndrome de Rubinstein-Taybi (OMIM 180849), Síndrome de Rett (OMIM: 312750) y varios tipos de cáncer (Figura 4).

Figura 4. La acetilación tiene una participación importante en la transcripción altamente regulada en

organismos eucariotas. En general, la deacetilación de las histonas (por las HDCAs, histone deacetylases) resulta en la represión transcripcional, mientras que el aumento en la acetilación de las histonas (por las

HATs, histone acetylases) conduce a la estimulación de la transcripción génica.

2. 2. Complejo de pre-iniciación

El inicio de la transcripción de un mARN eucariota requiere del ensamblaje de un complejo de preiniciación (PIC, por sus siglas en inglés, Pre-Initiation Complex), el cual consiste en la ARN Pol II y factores de transcripción basales (TF, por sus siglas en inglés, Transcription Factor) TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH (Figura 5). Todos los genes que codifican para proteínas contienen una región promotora basal con una secuencia de 7 bases (TATAAAA) denominada TATA (TATA box).

Figura 5. Ensamblado del complejo de preiniciación. Adaptado de Green, 2005.

El factor TFIID es un complejo multiproteico que incluye en su parte central a la proteína de unión a la secuencia TATA (TBP, por TATA-binding protein) y factores asociados a TBP (proteínas TAF) que son esenciales para la regulación de la transcripción in vitro. El ensamblaje del PIC sobre la secuencia promotora está nucleado por la TBP, la cual además de interaccionar físicamente con múltiples TFs basales y la secuencia TATA, provoca la curvatura y relajación de la porción de ADN a ser transcripto.

En la transcripción mediada por la ARN Pol II también participa un complejo coactivador multiproteico, conocido como Mediator. Mediator funciona como puente en la transmisión de información de factores regulatorios unidos a enhancers a la maquinaria transcripcional de la ARN Pol II. Este gran complejo multiproteico es reclutado por promotores y/o activadores unidos a enhancers seguido de la asociación con FT generales (Figura 6).

Figura 6. El ensamblaje del PIC comprende al complejo Mediator y a la maquinaria basal de la

ARN Pol II en la región promotora. Mediator entre los activadores específicos de genes (Act) unidos a elementos regulatorios (ER) en el ADN y la maquinaria general de transcripción que comprende a la

ARN Pol II y los factores de transcripción generales. Adaptado de Larivière y col., 2012.

Mientras que la transcripción puede comenzar en principio luego del ensamblaje total de PIC, los pasos siguientes dependen del estado de fosforilación del extremo C-terminal de la subunidad grande de la ARN Pol II, denominado CTD (por sus siglas en inglés C-Terminal Domain). El modelo aceptado de la función y fosforilación del CTD es el esquematizado en la Figura 7. La ARN Pol II es reclutada hacia el PIC con el CTD no fosforilado. Luego en el promotor, una kinasa (enzima que adiciona grupos fosfato) dependiente de ciclinas (CDK-7, por sus siglas en inglés, Cyclin Dependent Kinase-7) fosforila al CTD en el residuo 5 de Serina, de manera tal que esta fosforilación permite a la ARN Pol II alejarse de la región promotora, resultando en el reclutamiento de la enzima de capping 5´ de mARNs (capping es una modificación post-transcripcional que se verá en la sección 3. 1.). El CTD es luego fosforilado por otra kinasa, llamada CDK-9, en otro residuo de Serina. La fosforilación en esta Serina promueve la elongación de la transcripción, y permite que los factores de procesamiento y terminación del mARN sean reclutados directamente al CTD. De esta manera, el CTD actúa como un integrador molecular que acopla físicamente la transcripción a eventos nucleares río abajo que incluyen procesamiento y terminación del mARN.

Figura 7. Esquema de los pasos de fosforilación del CTD de la ARN Pol II. nonP indica sin fosforilación. Ser5P es el aminoácido Serina 5 fosforilado por CDK-7. Ppase es una fosfatasa que

remueve el grupo fosfato de Ser5.

2. 3. ¿Cómo interaccionan los factores de transcripción con el ADN?

Los factores de transcripción (FT) son proteínas que reconocen de manera específica secuencias promotoras y la interacción de los mismos con el ADN produce cambios en la expresión génica. La estructura de un FT consiste en dos componentes funcionales: un dominio de unión al ADN y otro dominio de activación transcripcional.

De acuerdo a la estructura del dominio de unión al ADN, los FTs se clasifican en (Figura 8):

Hélice-vuelta-hélice (helix-turn-helix): se establecen tres planos diferentes de una hélice y se unen a los surcos mayors en el ADN.

Dedos de Zinc (Zinc fingers): residuos de Cisteína e Histidina unen un ion Zn2+, haciendo que el aminoácido tome forma similar a un dedo que se depositará dentro de los surcos menores del ADN.

Cierre de Leucinas (Leucine zipper): en cada vuelta de una -hélice los residuos de Leucina hacen que dimericen las proteínas, formando una configuración similar a unas tijeras.

Figura 8. Los factores de transcripción están clasificados en diversas estructuras de unión al ADN.

Los FTs se unen al ADN en forma de homo o heterodímeros. La formación de dímeros agrega un elemento extra de complejidad y versatilidad al proceso de transcripción de un gen.

Luego de la unión al ADN, el FT interacciona con otros FTs o con la maquinaria basal de transcripción a través del dominio de activación transcripcional, el cual en la mayoría de los casos abarca entre 30 a 100 aminoácidos de longitud. Por medio de este dominio, un FT puede afectar la eficiencia de la formación o de unión del complejo de transcripción. El dominio de transactivación permite que el FT actúe directamente o reclute proteínas coactivadoras que poseen propiedades de activación pero carecen de la capacidad de unión al ADN.

2. 4. Más elementos de control

Otros elementos regulatorios del ADN tal como enhancers, silenciadores e insulators se encuentran dentro de los genomas y controlan la expresión de genes durante el desarrollo.

2. 4. 1. Secuencias enhancer

Las secuencias enhancer son regiones de ADN que estimulan la activación de un gen mediante la unión de FTs específicos. Para un gen en particular, la unión de un FT al enhancer incrementa la tasa de transcripción del mismo. Los enhancers pueden estar localizados a varios miles de pares de bases de distancia en dirección 5’, 3’, o incluso dentro del gen al cual controlan.

¿Cómo regula el enhancer la transcripción de un gen que esta a miles de bases alejado? Un posible modelo es que las proteínas de unión al enhancer –además de sus dominios de unión al ADN- tengan sitios de unión a FTs ensamblados en el promotor del gen. Esto haría que el ADN se curve en una especie de lazo. En la Figura 8, se muestran otros posibles modelos que describen la acción del enhacer en la transcripción de un gen (Figura 9).

Figura 9. Modelos existentes para la función de los enhancers. (A) Modelo de tracking, donde un FT (hexágono rosado) se posiciona en el enhancer y se mueve a lo largo de la cromatina hacia el

promotor, donde estimula la transcripción mediante la asociación con la RNA Pol II (óvalo rosado). (B) Modelo de linking, donde el FT cargado sobre el enhancer dirige la polimerización de proteínas en dirección al promotor. (C) Modelo de relocalización, donde un gen se reubica a subcompartimentos

nucleares (halo rosado) favoreciendo las interacciones enhancer-promotor. (D) Modelo del lazo, donde el enhancer se acerca al promotor debido a interacciones proteína-proteína. Adaptado de Kolovos y col.,

2012.

2. 4. 2. Silenciadores

Existen secuencias regulatorias con características similares a los enhancers, pero de efecto opuesto. Son los denominados silenciadores o silencers.

Los silenciadores son regiones de control del ADN que, al igual que los enhancers, pueden estar localizados a miles de pares de bases alejados del gen que controlan. Sin embargo, cuando los factores de transcripción se unen a un silenciador, la tasa de transcripción de un gen se ve reprimida o disminuída.

2. 4. 3. Secuencias aislantes o Insulators

Los insulators son regiones de ADN, en general de secuencias cortas (alrededor de 40 pares de bases) localizados entre el enhancer y el promotor, o entre el silenciador y el promotor de genes adyacentes o grupos de genes adyacentes. Su función es prevenir que un gen sea influenciado por la activación (o represión) de sus vecinos. Dado que los enhancers pueden incrementar la tasa de transcripción de un gen, aún cuando este se encuentra a miles de pares de base de distancia, la función de los insulators es prevenir que un gen en particular sea activado de manera no específica por la activación de otro en el mismo cromosoma.

Todos los insulators descubiertos hasta ahora en vertebrados actuán solamente cuando están unidos a una proteína llamada CTCF (factor de unión a CCCTC, ya que es la secuencia nucleotidica encontrada en todos los insulators). CTCF tiene 11 dedos de zinc. Un ejemplo en humanos: solamente el alelo para el factor de crecimiento 2 similar a insulina (IGF-2) heredado del padre es activo, el heredado de la madre no lo es –un fenómeno llamado imprinting. El mecanismo es el siguiente: el alelo de la madre tiene un insulator entre el promotor y el enhancer de IGF-2. También lo tiene el del padre, pero en este caso, el insulator ha sido metilado. CTCF ya no puede unirse al insulator metilado, y así el enhancer está libre para encender el promotor IGF-2 del padre.

3. Modificaciones Post-transcripcionales

La transcripción del ADN ocurre en el núcleo de una célula eucariota. El ARNm que es sintetizado en este proceso es luego transferido hacia el citoplasma de la célula donde será, luego de una serie de controles, traducido en una proteína. En organismos procariotas (como una bacteria) el ARNm que va siendo sintetizado durante la transcripción está listo para ser codificado a proteínas. En cambio, en organismos eucariotas, el ARNm recién transcripto no está inmediatamente listo para la traducción y requiere de todo un procesamiento extensivo para su maduración final a un ARNm.

Los eventos post-transcripcionales incluyen: la modificación del extremo 5’ (capping), poliadenilación en el extremo 3’ y splicing (Figura 10).

Estos modificaciones post-transcripcionales sobre la molécula de ARNm cumplen primariamente dos funciones: 1) las modificaciones aumentan las probabilidades de reconocimiento del ARNm por parte de moléculas mediadoras en la traducción a proteínas; 2) el procesamiento post-transcripcional ayuda a aumentar la eficiencia de la síntesis proteica al permitir que solamente moléculas de ARN codificante para proteínas específicas sean traducidas. Sin la participación de las modificaciones post-transcripcionales, la síntesis proteica podría convertirse en un proceso significativamente lento al momento de reconocimiento del ARNm por parte de la maquinaria de traducción y también por la innecesaria codificación a proteínas de ARNm.

Figura 10. Esquema de los eventos post-transcripcionales que ocurren en la maduración de un pre-ARNm hacia un ARNm maduro.

3. 1. Modificación del extremo 5’: Capping

La primer modificación sobre el ARNm precursor es la reacción que ocurre en la porción 5’ en el cual el grupo trifosfato de ese extremo es reemplazado con un nucleótido especial conocido como 5’cap (o ‘capuchón’). El 5’cap consiste en una 7-metilguanosina unida al primer nucleótido mediante un puente 5’-5’ trifosfato. Durante la transcripción, el 5’cap es agregado sobre el extremo 5’ del pre-ARNm, aparentemente cuando la ARN Pol II ha polimerizado 20-100 nucleótidos. La enzima guanililtransferasa, la cual puede interactuar primero con la polimerasa, es la responsable de catalizar la adición de 7-metilguanosina.

Es en el núcleo donde el 5’cap puede unirse a dos proteínas, la CBP20 y CBP80 (por sus siglas en inglés, Cap Binding Protein) formando así un complejo de unión al 5’cap (CBC, por Cap Binding Complex). Diversos estudios han mostrado que el CBC

tiene una participación importante en otra modificación post-transcripcional del precursor ARNm, el splicing, además de influenciar el transporte del mismo hacia el citoplasma.

Diversas funciones han sido adjudicadas al 5’ cap dentro de la célula, entre ellas

la prevención de la degradación del pre-mARN en el núcleo luego de la liberación del transcripto. En el citoplasma, el 5’cap es importante para el inicio de la traducción de proteínas dado que existe un factor de inicio de la traducción eucariota (eIF4A, por sus siglas en inglés, eukaryotic Initiation Factor 4A) muy importante en los primeros pasos de este proceso, que se une directamente a la estructura de 5’cap.

3 . 2. Modificación del extremo 3’: poliadenilación.

El procesamiento post-transcripcional del ARNm en el extremo opuesto del transcripto se presenta en la forma de una secuencia de bases Adenosina (A) agregadas a la poción 3’. Esta secuencia de A es conocida como la cola de poliA. La adición de adenosinas es catalizada por la enzima poliA polimerasa (PAP), la cual reconoce la secuencia AAUAAA en el pre-ARNm como una señal para la adición. Casi todos los ARNm tienen un número de residuos de A en su extremo 3’, los cuales no están codificados en los genes.

La reacción procede luego de un clivaje específico en una parte del extremo 3’ y la posterior poliadenilación. Ambos eventos están acoplados a la terminación de la transcripción, dado que se ha demostrado que la ARN Pol II transcribe el molde de ADN hasta varios cientos de nucleótidos rio abajo del sitio de clivaje y poliadenilación. Factores proteicos relacionados con esta modificación post-transcripcional son reclutados hacia señales específicas en el pre-ARNm, como CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor), CstF (Cleavage Stimulation Factor) y CFI y CFII (Cleavage Factors I y II) y se cree que se unen a la ARN Pol II. Una característica especial de la reacción de poliadenilación es que la PAP se pega débilmente al extremo del pre-ARNm mientras aproximadamente 20 residuos de A han sido adicionados. Luego, una proteína conocida como PAB (PolyA-binding protein) se une a esta cola corta de poliA favoreciendo que la PAP se una más firmemente hasta la adición de 150-200 residuos de A.

Diversas funciones han sido propuestas para la cola de poliA en un ARNm maduro, las cuales varian desde otorgar estabilidad a la molécula, promover la eficiencia de traducción del ARNm y transporte del transcripto maduro desde el núcleo hacia el citoplasma.

3 . 3. Splicing o Ensamblado

La mayoría de los genes que codifican proteínas en una célula eucariota están interrumpidos. Las regiones codificantes están divididas en numerosos bloques llamados exones y estos a su vez están separados por intrones. El splicing es el estadio durante el cual los intrones son removidos de la molécula de ARNm y los exones remanentes son ensamblados en un ARNm maduro que está listo para ser traducido a

proteína. Los exones están definidos por sitios de splicing que son secuencias más bien cortas en los límites de intrón/exón (sitio de splicing 5’, 3’ y sitio de ramificación.

La reacción de splicing es compleja. La célula debe clivar el transcripto primario en cada extremo del intrón mientras sostiene al mismo tiempo los exones flanqueantes de tal manera que el ARNm cortado no se separe. Luego, los dos exones deben ser unidos. Para genes que codifican proteínas, las reacciones de splicing están catalizadas por un complejo de ARN/proteínas llamado spliceosoma. El spliceosoma lleva a cabo dos funciones primarias: el reconocimiento de los límites intrón/exón y la catálisis de las reacciones de corte y pegado que remueven los intrones y unen los exones.

Existen secuencias consenso en el proceso de splicing. Las únicas bases casi invariables son GU en el extremo 5´del intrón y AG en el extremo 3´ del mismo. La adenosina (A) del punto de ramificación, también invariable, casi siempre está a 20-50 bases del sitio de splicing del extremo 3’. La región central del intrón, que puede comprender de 40-50 kb de longitud, en general no es necesaria para que ocurra splicing (Figura 11).

Figura 11. Los varios components del spliceosoma tienen que ensamblarse en el extremo 5’ del intrón (flecha izquierda) y en el 3’ (flecha derecha). Existe un tercer sitio en el medio llamado punto de

ramificación (flecha indicando A). Los tres sitios están identificados por secuencias consenso cortas en el pre-ARNm.

3 . 3. 1. Spliceosoma o maquinaria del proceso de splicing

En el splicing participan cinco ARNs nucleares pequeños (snARNs, por sus siglas en inglés, small nuclear ARN) ricos en Uridina (U), designados U1, U2, U4, U5 y U6. Se asocian con 6-10 proteínas de ribonucleoproteinas nucleares pequeñas (snRNPs) en el núcleo de las células eucariotas.

De acuerdo con el modelo vigente de splicing del pre-ARNm, se piensa que los cinco snRNPs se ensamblan sobre el pre-ARNm y forman un gran complejo de ribonucleoproteinas denominado spliceosoma. El ensamblaje del spliceosoma comienza con el apareamiento de bases de los snARNs de las snRNP U1 y U2 al pre-ARNm. El aparemiento extensivo de bases entre los snARN en las snRNP U4 y U6 forma un complejo que se asocia con la snRNP U5. El complejo U4/U5/U6 se asocia luego con el complejo pre-mARN U1/U2 para producir el spliceosoma.

Tras la formación del spliceosoma, los reordenamientos extensivos en el apareamiento de los snARN y el pre-ARNm conducen a la liberación de los snRNP U1 y U4. Luego el spliceosoma reordenado, catalíticamente activo, media la primera reacción entre el punto de ramificación y el extremo 5’ del intrón. Tras otro reordenamiento de las snRNP, la segunda reacción liga los dos exones y libera al intrón como una estructura de lazo asociada con las snRNP (Figura 12). Este complejo final snRNP-

intrón se disocia con rapidez y las snRNP individuales liberadas pueden participar en un nuevo ciclo de splicing. El intrón cortado es degradado rápidamente por ARNsas nucleares.

Figura 12. Esquema indicando los pasos y componentes del proceso de splicing.

3 . 3. 2. Splicing alternativo

Es el mecanismo más común para expresar diferentes proteínas a partir de una única unidad de transcripción. El splicing alternativo genera segmentos de variabilidad de ARNm que pueden insertar o remover aminoácidos, cambiar el marco de lectura o introducir un codón de terminación de la traducción. También afecta la expresión génica al remover o insertar elementos regulatorios que controlan la traducción, la estabilidad del ARNm o localización.

Esta forma de procesamiento alternativo suele estar regulada de manera específica según el tipo de célula; es decir, un posible mARN se expresa en un tipo de célula o tejido, mientras que otro se expresa en diferentes tejidos o células. Otros factores que pueden influenciar sobre el comienzo del splicing alternativo son el estadio de desarrollo, género y estímulos externos. Un claro ejemplo es el de la proteína de matriz extracelular, la fibronectina (FN). Los fibroblastos expresan un tipo de FN, mientras que los hepatocitos producen otro tipo. Ambas isoformas de FN están codificadas por la misma unidad transcripcional, que sufre splicing de manera diferente en los dos tipos de células para producir dos ARNm diferentes. En otros casos, el procesamiento alternativo puede tener lugar en el mismo tipo celular en respuesta a diferentes señales de desarrollo o del entorno.

Con la finalización del proyecto del genoma humano ha quedado en claro que la cantidad de genes existentes no pueden explicar la complejidad del proteoma humano. Entre los varios mecanismos propuestos, el splicing alternativo del pre-mARN es considerado uno de las formas más eficientes y ampliamente distribuidas para generar múltiples isoformas proteicas a partir de genes individuales. Estimaciones actuales, indican que alrededor del 60% de todos los genes humanos sufren splicing alternativo, incrementando así enormemente el potencial codificante de nuestro genoma.

4. Modificaciones Post-traduccionales

Las modificaciones post-traduccionales tienen una importante participación en numerosos eventos celulares. Un gran número de modificaciones pueden estar conjugadas covalentemente a aminoácidos de las proteínas blanco para regular las características bioquímicas, enzimáticas, conformacionales y biofísicas de las proteínas aceptoras. Durante la traducción, las proteínas empiezan a plegarse a medida que abandonan el ribosoma. Algunas proteínas pueden adquirir estructuras 3D de manera espontánea, mientras que otras necesitan a proteínas accesorias (chaperonas).

Las modificaciones post-traduccionales pueden abarcar una región de la cadena polipéptidica (modificaciones del extremo N- o C-terminal) o aminoácidos individuales. Dentro de este último grupo, podemos mencionar:

- Fosforilación.-Oxidación.-Metilación.- Isoprenilación.-Adición de grupos prostéticos.- Procesamiento proteolítico.- Formación de puentes disulfuro.-Glicosilación.

A continuación se detallará solamente algunas de las modificaciones

mencionadas.

4. 1. Metilación

La metilación en el residuo Arginina es una modificación post-traduccional muy común, que ocurre predominantemente en el núcleo y el principal grupo de proteínas que es modificado de esta manera posee propiedades de unión al ARN. Las enzimas que facilitan la acetilación de histonas (como por ejemplo, la enzima CBP/300) y tal vez las histonas mismas, también están metiladas en Arginina (implicando así a esta modificación en la regulación de la transcripción).

La metilación está catalizada por al menos dos metiltransferasas diferentes que pertenecen a las proteínas PRMT (por Protein Arginine Methyltransferase). Las regiones de proteínas que son metiladas son a menudo, pero no siempre, ricas en Glicina y Arginina.

Las consecuencias biológicas directas de la metilación de Arginina son a nivel de interacciones proteína-proteína. En sentido más amplio, ha sido implicada en una variedad de procesos celulares, incluyendo tráfico de proteínas, transducción de señales y regulación de la transcripción.

3 . 2. Clivaje proteico

La mayoría de las proteínas sufre clivaje proteolítico luego de la traducción. La forma más simple es la remoción de la metionina de iniciación. Muchas proteínas son sintetizadas como precursores inactivos que son activados luego en condiciones fisiológicas adecuadas mediante una proteólisis limitada. Las proteínas precursoras inactivas que son activadas por remoción de polipéptidos se denominan proproteinas.

Un ejemplo de procesamiento post-traduccional de una proproteina es el clivaje de prepro-opiomelanocortina (POMC), sintetizada en la glándula pituitaria. Esta preproproteina sufre una serie de complejos clivajes. El producto primario proteico a partir del gen POMC es un precursor de 285 aminoácidos que puede sufrir un procesamiento diferencial pudiendo dar al menos 8 péptidos, dependiendo de la localización celular de la síntesis de POMC.

En el lóbulo anterior de la pituitaria, los productos principales de procesamiento son la hormona adrenocorticotropica (ACTH) y -lipotropina-LPH) mientras que en el lóbulo intermedio de la misma, los productos principales del procesamiento son la hormona estimuladora de melanocitos (-MSH) y -endorfina.

Otro ejemplo: En relación al mayor entendimiento sobre el virus del SIDA, se descubrieron otros blancos de drogas además de la transcriptasa reversa. Entre ellas, a la proteasa viral, la enzima responsable de la maduración de las partículas virales hacia viriones infecciosos listos para infectar a nuevas células hospedadoras. Las proteínas del núcleo de HIV-1 son producidas como parte de largos polipéptidos que son clivados en fragmentos pequeños por proteasas para crear proteínas maduras y funcionales. Los inhibidores de proteasas se unen al sitio activo de la enzima donde ocurre el clivaje proteico de manera tal que las nuevas partículas virales no pueden madurar para volverse infecciosas.

4 . 3. Fosforilación

Es una de las modificaciones post-traduccionales de proteínas más común. La gran mayoría de las fosforilaciones ocurren como un mecanismo para regular la actividad biológica de una proteína. Y como tal, es un fenómeno transitorio. En otras palabras, se agrega un grupo fosfato y luego se lo remueve.

Las enzimas que fosforilan proteínas se denominan kinasas y las que remueven los grupos fosfato son fosfatasas. Las kinasas catalizan las reacciones del siguiente tipo:

ATP + proteína fosfoproteina + ADP

En la fosforilación de proteínas, se sabe que son tres los aminoácidos cuyas cadenas laterales son fosforiladas (Serina, Treonina y Tirosina). En el genoma humano se han identificado alrededor de 500 kinasas. Por ejemplo, la protein kinasa A (PKA) tiene aproximadamente 100 sustratos identificados.

La fosforilación reversible de proteínas regula casi todos los aspectos de la vida de la célula, mientras que los defectos en la fosforilación son una causa o consecuencia de varias enfermedades.

4 . 4. Formación de puentes disulfuro

El principal tipo de enlace que sirve para entrecruzar proteínas o porciones de las mismas es la formación de enlaces disulfuro por la oxidación de Cisteínas. Para que una reacción de este tipo se lleve a cabo es necesario un entorno en condiciones oxidantes. Sin embargo, los compartimientos citoplasmáticos y nucleares en las células eucariotas son microambientes mas bien reductores. El microambiente oxidativo se va formando en los compartimientos a medida que la proteína va pasando a través de la vía de secreción. Por eso, los enlaces disulfuro no son comunes en las proteínas intracelulares. Este tipo de modificación puede estabilizar la arquitectura proteica a medida que la proteína alcanza la superficie externa de la célula o es secretada al espacio extracelular. Un caso típico es el de las formas zimogenas de la proteasa pancreática. A medida que estas son empaquetadas en los lisosomas, que ofrecen un microambiente oxidante, los puentes disulfuro se van formando.

La formación incorrecta de puentes disulfuro en general se produce cuando las proteínas se pliegan en el interior de la célula. Para ello, la célula contiene una enzima, una isomerasa, que cataliza la reducción de los puentes disulfuro inapropiados al oxidar sus propias cisteínas a disulfuros. De esta manera, la proteína mal plegada tiene una segunda oportunidad para hacerlo correctamente.

4 . 5. Glicosilación

Las superficies celulares de las células de mamíferos están decoradas con un complejo y denso arreglo de estructuras oligosacáridas conjugadas mediante un enlace covalente a proteínas (glicoproteínas y proteoglicanos) y lípidos (glicolípidos) (en conjunto denominados glicoconjugados). Dentro de los eventos post-traduccionales más comunes (como fosforilación, acetilación, etc), la glicosilación es la forma de modificación post-traduccional predominante que ofrece un nivel mayor de complejidad al proteoma humano, conformado por aproximadamente 30000 proteínas, un número sorprendentemente bajo (Venter et al, 2001). Además, más del 50% de las proteínas totales están glicosiladas, de acuerdo a estimaciones basadas en la base de datos SwissProt (Apweiler et al, 1999). Esto justifica que en los últimos años se haya acuñado el concepto de glicómica, un importante dominio emergente detrás, por ahora, de la genómica y proteómica.

En eucariotas, la glicosilación de proteínas generalmente involucra la adición covalente de glicanos a residuos de Serina (Ser), Treonina (Thr) o Asparagina (Asn). La glicosilación de proteínas ha sido clasificada en dos principales vías de biosíntesis, la N- y la O-glicosilación. En los N-glicanos, el extremo reductor del residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) está unido al grupo amida de Asparagina (Asn), formando de esta manera un enlace aspartilglicosilamina. En los O-glicanos,

los azúcares son adosados a los grupos hidroxilo (OH) de los aminoácidos Serina o Treonina (Ser/Thr) en la cadena polipeptídica.

4 . 5. 1. Defectos en la glicosilación asociados a enfermedades

Uno de los puntos cruciales de regulación en la biosíntesis de glicoconjugados es a nivel de la transcripción de genes que codifican para glicosiltransferasas (GT), las enzimas que transfieren un residuo de azúcar a una molécula aceptora.

Una correcta glicosilación de ciertas glicoproteínas es un factor primario en el desarrollo de algunas formas de distrofia muscular congénita. En el músculo esquelético, la glicoproteína de matriz extracelular -dystroglican participa en la estabilización de la membrana plasmática al actuar como un puente a través del cual la matriz extracelular se une fuertemente al citoesqueleto. La -dystroglican está muy glicosilada y sus azúcares tienen un rol importante en la unión con varias proteínas del espacio extracelular, como laminina, neurexina y agrina. Esta glicoproteína tiene manosas unidas en un enlace del tipo de O-glicosilación, una variante de modificación poco común en mamíferos. Las GTs involucradas en la adición de O-manosas sobre -dystroglican son dos manosiltransferas (POMT1 y POMT2). Otra enzima que participa en la O-manosilación es POMGnT1, que cataliza la adición de un residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) a la proteína manosilada.

Varios trabajos han demostrado que mutaciones en Pomt1, Pomt2 y Pomgnt1 están asociadas al desarrollo de un grupo de enfermedades neuromusculares en humanos, agrupadas dentro de Distrofias Musculares Congénitas (CMD, por sus siglas en inglés). El Síndrome de Walker-Warburg (WWS) es un tipo de CMD con anormalidades muy severas en músculos, cerebro y ojos. Se ha determinado que alteraciones genéticas que producen mutaciones de cambio del marco de lectura en la protein O-manosiltransferasa 1 (POMT1) humana causan la aparición de WWS (Beltrán-Valero de Bernabé et al, 2002). Los pacientes con la enfermedad Muscle-Eye-Brain (MEB) también presentan CMD y malformación cerebral, pero algunos pueden sobrevivir hasta la adultez. El gen causante para la aparición de MEB fue identificado como POMGnT1, enzima que modifica O-Manosa con GlcNAc1,2 (Yoshida et al, 2001).

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