MECHANISMUS RACEMISACE DERIVA.TU AMINOKYSELIN

MICHAL LEBL a KAREL JOST

Ustav orqanicke chemie a biochemic,

Ceskoslovellska akademie vld. 166 10 Praha

Doslo dne 9. II. 1977

I. (hod

Biologicky aktivni peptidy obsahuji sve stavebni kameny, aminokyseliny, v optickyaktivni forme. Vetsinou pati'i k L-rade, vyjimku tvofi nektere peptidy, isolovanehlavne z mikroorganismu, ktere obsahuji i n-aminokyseliny, Stereochernicka jednot­nost (optlcka cistota) do znacne miry urcuje biologicke aktivity i Iysikalne-chemickechovdni peptidu. Je proto nutne, aby opticka cistota byla zachovana jak pfi isolacipeptidu, tak i pfi jejich chemicke synthese. Racemisaci je moino definovat jakopochod, vedouci k racemicke modifikacijednoho z cistych enantiomeru. Jen v nekolikamalo pripadech byIo popsano jeji vyuziti. Jedna se zejmena 0 datovani fosilniho ma­terialu1 nebo prevedeni snadno pristupne L-aminokyseliny na vzacnejsi enantiomer",Ve vsech ostatnich pfipadech je racemisace negativnimjevem. PIati to zejmena a syn­these peptidu, kdy milie vzniknout racemisaci jednotlivych aminokyselinovychzbytkil smes diastereoisomeril (1).

(Asymetricke uhlikove atomy jsou oznaceny hvezdickou.) Jestlize dochazi v kazdemstupni, ve kterem se tvofi peptidicka vazba, k i% racemisaci, pak v konecnem deka­peptidu marne tak male mnozstvi diastereoisomernich sloucenin, ie cistota syntheti­sovaneho peptiduje dostacujicl pro vetsinu ticeli'!. Jestliie by se vsak podil racemisacezvYSiI v kazdem stupni na 10%, pak mnozstvi diastereoisomeru v synthetisovanempeptidu se bude blifit mnozstvi iadaneho produktu a pro fysikalne-chemicka a zejme­na biochemicka studia by takovy peptid byIjen steii pouzitelny.

Vzhledem k tomu, i, se vznikle diastereoisomery zjiSfuji a oddeluji podstatneobtizneji nez jakekoliv jine vedlejsl produkty, bylo venovano mnoho tisili vypraco­vdni metod, schopnych zjistit i nizky stupeii racemisace, prave tak jako nalezeni

RI Rl1* 1*

NH,-CH-CO-NH-CH-COOH

RI

I'NH,-CH-COOH +

L

R'I'

NH,-CH-COOH

L LL + to + DL + DD

rninoritni slofky

(/)

III

252 Chemicke /isty I suazek 72 (1978)

vhodnychmetodpfisynthese peptidft,zajiSfujicich conejvyssistupeii opticke eislo­ty '. Mnozstvi vznikleho racemickeho produktu nezalefi jen na typu reakce, ale je doznacne miry ovliviiovano konkretnimi reakcnimi podminkami, jako je teplota, druhpouziteho rozpoustedla, chemicka struktura a mnozstvi base v reakcnirn prostredia konecne i primarni strukturou synthetisovaneho peptidu. Vsechny tyto faktory jsoupfi synthese peptidu promenlive a daji sejen velmi obtizne unifikovat a pouzivat pouzestandardni, pfedem otestovane postupy.

Ye .snaze.vyhnout se racemisaci muze nam do znacne miry pomoci znalost mecha­nismutohoto procesu. Ueelem elanku jepodat pfehled 0 dosavadnich znalostechmechanismu racemisacc".

2. Racemisace v kyseICm prostfedi

Predpokladem zaniku opticke aktivity aminokyseliny je odtrzeniprotonu z asy­metrickeho uhliku a vytvofeni planarnihoutvaru zahrnujiciho tento uhlik, nasledo­vane zpetnym pfipojenim protonu. Jizpred ~Tice nez padesati lety byl navrZen4 - 6

oxazolou jakomezistupefi. Pusobenim anhydridu kyseliny octove vznika primarneNeacerylaminokyselinajkteraje zvlaste nachylna k tvorbe cyklu. Vznikly 2-methyl­-4-alkyl-4,5-dihydro-l,3-oxazol-5-on (I)jemozne isolo~atjako opticky aktivni Iatku7,

ovsem dalsim pftsobenim acetanhydridu dochazi k ionisaci a .resonancni stabilisacivznikleho .aniontu nasledovanou pfipojenim protonu, vedoucim k racemickernuproduktu (2).

RI

NH,-CH-COOH

RI

CHJCO-NH-CH-COOH

RICH-C~O

I I~ /0 (2)

CI

CH J I(L)

RIc ..·.C·-:·:-..ojl'-:'I 1-N~ /0

cICH,

H'- I(Dl)

* ... Z:kratkY(%7aminokyselin,ch~anfcfcha .. aktivuji~idl skupin jscu pouzfvany.podlc .. monografle'[,AMK.zna01e~a lib.o"olnou o:-aI11iu?kyselinu. Prc aktivnf estery je pouzitonasledujlcich zkratek:OSU proN-hydroxysukcinimidovY,ONP pro p-nitrofenylovy,OTc:P pro 2,4,5~trichlorfenylovY.

OPCP -pro ·pentachlorfenylovY a OPFp·pro peritafluorfenylovy ester.

M echantsmus rqce"l isace derivat It {lintnokvselin ;253

Silnezvyseni .racemisace bylo pozorovano vpfitomuosti acetatovychiontu! (3).

L-AMK ~

Raeemisaee N-aeetylaminokyselin v aeetanhydridu a kyseline octove je take vysvetlo­varia" tvorbou smesneho anhydridu II, ktery pomoei silne vodikove vazby napornahaodtrzeni e-protonu.

II

Volne aminokyseliny raeemisnji v kyselem prostredi jinym mechanismem. V pfi­tomnosti kyseliny sirove se karboxylove skupiny aminokyselin ehovaji jako akeeptoryprotonu a ve vzniklem dikationtu muze dojit, diky silnemu tahu elektroml, k odstepc­ni "'-protonu a vznikly ion se stabilisuje resorianci za ztraty opticke aktivity? (4).

",PR-CH-C

I "-NH OH1+\ 1

,.,"PH

R-CH-CI "-NH OH

("'j . 1

,.,OH_(-I·#,

R-C-CI "­NH, OH,.,

/OHR--C=C (4)

I "-NH OH«+1· 3

Racemisace byla ·pozorovana v 6M~kyse1inesolnel 0, coz znamena, ze ie nutno s nipoeitat pei totalni hydrolyse peptidu (korekce je mozna poniitim 'Hel a merenimmnoistvi inkorporovaneho tritia do aminokyseliu'{; dalsi korekce je vsak nutnana pozorovany isotopovy efekt).

Pro navrzeny meehanismus raeemisace v kyselern prosti'edi svedei i vysledky studiachovdni N-methylaminokyselin pfi odstepovanl benzyloxykarbonylove chraniciskupiny bromovodikem v kyseline octove, U N-methylaminokyselin byla pozorovdnaznacna racemisace'": zatimeo u benzyloxykarbonyl-alanyl-Ieucinu bylo nalezeno0,1% diastereoisomeru, ciniljelio podilu analogickeho Nsmethylleucinoveho derivatu17%. N,N-Dimethylaminokyseliny racemisuji snadno i v horke kyseline oetove13

•

Rozpoustedlo a pouzita kyselina maji znacny vliv na racemisaci, ktera se s klesajicipolaritou rozpoustedla zmensuje aje nepatma pfi pouzitl ehlorovodiku nebo kyselinytrifluoroctove. Dukladne bylo studovano chovdni peptidu pfi parcialni a totalriikysele hydrolyse!", Pfi parcialni hydrolyse pouze karboxyterminalnl dipeptid neni

254

ohrozen: racernisaci, ostatni •.·dipeptidy ·obsahuji· .male mnozstvi ·.··diastereoisomeru;V totalnich hydrolysatech nebyla nalezena racemisace pouze pro amino- a karboxy­koncovou aminokyselinu. Pro analyticke ucely bylo studovtino chovarii smesivolnychaminokyselin vkyselemroztoku; bylo zjisteno, ze·kracemisaci·smesi volnych amino­kyselin dochazi vetsinou v menslm rozsahu! 0, nez pfi hydrolysepeptidu. Tento nalezjenutno mit na pameti pfi eventualni korekci obsahu n-aminokyselin v hydrolysatu.

Radapraci se zabyvala vlivem struktury jednotlivych aminokyselin na racemisaei.U kyseliny glutamove byla nalezena zavislost racemisace na koncentraei kyselinychlorovodikove'". Pfi piIsobeni 6M-HCl na aminokyseliny majici v postrannim fe­tezci alifaticky zbytek (Ala, Abu, Val, He, Leu) bylo zjis:eno 1 6

, ze rychlostni konstantaisorr.erisace zavisi silne na teplote ajenizsi u aminokyselin rozvetvenych na ji-uhliku.Japonsti autofi'? studovaIi rychlosti vyrneny vodiku za deuterium a .raoemisacevkyscline octave u derivatu fenylglyeinu a alaninu. Zjistili, ze rychlost vymenya racemisace jsou sf Y mezich experimentalnlch chyb··rovny.

Velka pozornost byla venovana aminokyselinam, majicim v molekule siru. U cysti­nu nebyl nalezen rozdil rychlosti racemisace mezi pusobcnimkyseliny chlorovodikovea sirove18.Proobjasneni eitlivosti cystinuk racemisaei bylo provedeno.mnoho po­kusn s podobnymiIatkami, Vyplynulo ~ nich, ze disulfidicktivazba vpoloze ji rnanektere zvlastni. vlastuosti!". Naptiklad cystein, S-methylcystein, cystathionin,lanthionin ahomocystin prakticky neracemisuji za podminek, kdy cystin poskytuje50% racematu.iPokusy s deuterovanyrn chlorovodikem a vodou prokazaly, ze race­misace neprobiha pres stadium meziproduktulII, nebof nebylo naIezeno zadne deute­riumvazane na ji-uhlik; Prcdpoklad, ze racemisace uzce souvisis intermolekulamivymenou disulfidicke vazby, nebyI potvrzen, nebof tato vyrnena jemnohem rychlejsinezracemisace 19;

(+] i+fNH 3 NHJI [C~CH-S-S-CH,-CH

[ [COOH COOH

III

NH, CH, CH, NH,[ [ [[ -CH--C-S-S-C--CHI [ [[

COOH CH, CH, COOH

IV

Usriadneni odtrzeni protonu z «-uhllku, tedy zvyseni jeho kyseIosti, rnusi byt zpuso­beno tim, ze sira disulfidickeho mustku]e schopna nest kladny riaboj.jehof vliv klesase vzdalenosti ad a-uhliku. Velky vliv naboje v polozeji byI ovefen i tim, ze c<,ji-diami­nopropionova. kyselioa racemisujevkyselemprostredi jeste· rychleji .nez cystina a,y-diaminomaselna .• kyselina racemisuje V podobnem rozsahu jakohomocystin.Naboj, ktery nese disulfidicka vazba, by melbyt mensi nez naboj amoniove skupiny:a vetSi nez naboj .indukovany 2,4-dinitrofenylovou skupinou v S-(2,4-dinitrofenyl)­cysteinu.iktery racernisujeoneco pomaleji nez cystin. ZJaktu, ze penicilamindisulfid1VpodleM racemisaei jennapatme, vyplyva, ze dye methylove skupiny na ji-uhlikuzfejme vliv tohoto naboje doznacne miry snizujl. Derivaty S-benzylcysteinu, ktere

M echanismils racemtsace. dertvd tItamtnokyselin 255

pfedstavujl dulezity meziprodukt ph synthese cystinovych peptidir', se zabyvalipolst! autori2 0

• Soustfedili se na jejich chovani v kyseline octove a opet ukazali nadulezitost volne aminoskupiny pfi racemisaci.

Kinetikou racernisace aminokyselin v zavislosti na pH a teplote se zabyval Bada"v souvislosti s datovanim kosti z archeologickych nalezu. Z jeho vysledku, zamefenychhlavne nakyselinu asparagovou a valin, Ize uvest zjisten], ze pfi pH mezi 5 - 8 rychlostracemisace prakticky nezavisi na pH, coz je vlastne jednou z diiIeiitych podminektete metody datovani (srv.'),

3. Racemisace v basickem .• prostfedi~ oxazolonovymechanismus

Z hlediska synthesypeptidu Je daleko diiIezitejsimpripadem chovani derivatuaminokyselin a peptidii vzasaditern prosti'edi. I kdyz v nekterych pfipadech dochazik.racemisaci pi'imouabstrakci protonu z a-uhliku,je ztejmenejcastejslrn mechanis­mernpfechodna tvorba oxazolonu.

y Iiteratufe je popsana radapristupii produkaz tohotomechanismu.Pi'iaIkalickehydrolyse Z-Gly-Phe-ONP bylo zjisteno 22 , zerychlost racemisaceje desetkrat votSinez.rychlost. hydrolysya navic Se podafilo isolovat racernickyp-nitrofeuylester.Zapodobnych podminek autoi'i2 2nepozorovali racemisaci .:Z-GIy-MePhe-ONP.. (Jenutnomitna pameti, ze derivatya-N-methylaminokyselin jsoujeste nacliylnejsi k ra'cemisaci.nez .derivaty a-aminokyselin; .racemisacc. ovsem probihajinym. mechanis­mem>- Vizdale;) Porner rychlosti.tvorby oxazolonu a racemisace zavisi napouzitebasI'3: uBz-Leu-OH jepf pouziti triethylaminutvorba oxazolonu 6000 xpoma­lejsim procesemncz jeho racemisace, pi'i pouziti ethyldiisopropylaminu pouze 700 xpomalcjsim. Ph reakci Bz-Leu-ONP s triethylaminem byl prokazan-? vznik oxazo­lonu podle charakteristickehoabsorpcniho maxima vIR spektru a po reakci s ethyl­esterem glycinu se podafilo isolovat casteene racemisovany dipeptid a inaktivnioxazolon'd.Teden z nejdiiIezitejSich dukazu oxazolonovehornechanismu spocival napOkUSU2 5 •2 6, kdy -k roztokuBz-Gly-Phe-ONP v dichlormethanu byl-pfidanjedenekvivalent triethylaminu a. deset ekvivalentu D,L-2-(N-benzyIoxykarbonyI)-4-benzyI­-4,5-dihydro-l,3-oxazol-5-onu.Kdyz opticka otaeivost roztoku poklesla na 51% pu­vodni hodnoty, bylareakcezastavena a. smes esteru byla.isolovdna.iKdyby.reakceprobihala pfimou vyrnenou protonu na a-uhliktt,pakbyis010yany ester 111e1 byt ze49%racemicky. Jestlize naoPtlkrtlcemisaceprobihipi'es stadium .oxazolonu.welkypfebytek,dodaneho racemjckehooxazolonu vychytava p-nitrofenylatovy ion, vznikly'cyklisaci p-nitrofenylesteru,azabranuje tudiz zpetne reakci ("2) (5).

k~.

tr:

I

III

IIII

IiII:w';&B.~.

Bz-Gly- Phe-ONP + NEt,

256

~N"'C,H,CONHCH,-C CH-CH,C,H, +I IO---C~O

+1+JNHEtj+ 1-IOC6H.;N02

CltemicklUsty>Iscazek·.. 72.··.(J978)

Isolaee oplicky cisteho pilvodnihop-nitrofenylesteru pfinas! presvedCivy dukaz oxa­zolonoveho mechanismu racemisace.

Existuje fada faktoru, ktere.ovliviiuji tvorbu oxazolonu a jeho raeemisaei. V prvefade jeto druh chranlci skupiny na e-aminoskupine. Pfi tvorbe peptidickevazby-mcziacyl-t-leucinern a ethylesterem glycinu pomoci karbodiirnidove metody bylo naleze­no27 - 3 0 , ie opticka cistota byla zachovtina z 54, 70 a 94% u benzoylove, acetyloveev. formylove chranicl skupiny, Totcpofadi je mozno odhadnout i z teoretickehopohledu,kdy vpofadl odpovidajicimsnadnosti vzniku oxazolonu vzrusta i.nukleofi­lita karbonyloveho kysliku pfislusneho acylu, Je nepravdepodobne, ze by faktoremovliviiujicim snadnost vzniku oxazolonu byl porner obsahu cis a trans arnidovevazby31, protoze v dusledku ryehle se ustavujici rovnovahy mezi obema konformeryje v roztoku vzdy dostatecna koncentrace reaktivni konformace'". Rozdily meziacylovou a alkoxykarbonylovou skupinou byly studovany P pomoci IR a NMRspektroskopie. Karbonyl v acylove skupinevykazujeabsorpci pfi nizSim vlnoctu(1680-1690 em -I), nez ve skupine alkoxykarbonylove (1720-1725 cm"); eozsvedC! 0 delSivazbe C-o.(a tudif i 0 nizsim podilu dvojne vazby) v amidovem karbo­nylu ve srovnanl 5 urethanovym, Z toho vyplyva, ze karbonylovy kyslik amidu jenukleofilnejsl nez tentyz v urethanu.

1011- 1

IR-C=N-R'

IH

Va

1(51'-'I

R-O-C~N-R'- I

H

Vb

Pravdepodobnejsi je vzoree Va nez Vb, eoz vylucuje moznost tvorby oxazolonove­ho kruhu u urcthanovych derivatu aminokyselin. V NMR spektreeh amidu v kyselinetrifluoroctove je zachovan jasny signal N-H protonu, zatimeo u urcthanu se tentosignal ztrtici, coz svedei 0 zachovane basicite dusiku v posledne uvedenych Idtkacha tedy 0 nepravdepodobnosti struktury Vb. Na dnlezitost snizeni nukleofility atomuacylove chninici skupiny poukazali take polsti autori.'", kteff zjistili, ze benzylthio­karbonylova skupina diky velke nukleofilite siry neposkytuje narozdil od skupinybenzyloxykarbonylove zadnou ochranupfed racemisaci.

Pro vlastni synthesu peptidu z uvedenych vysledku vyplyva, ie je vyhodne pouzivatchranlci. skupiny 5 minimalni moznosti tvorby oxazolonu: krome ruznych skupinurethanoveho typu Je to i skupina o-nitrobenzensulfenylova, p-toluensulfonylovaatrifenylmethylova. Nektere chranici skupiny, jako napf.ftaloylovd.islce neumoziiujitvorbu oxazolonu, zato vsak napomahaji prime abstrakci protonuz Cl-uhliku, a protovhodnenejsou.

Nachylnost-kraccmisaci zavisi ovsern do znacne miry na kyselostiprotonu na«-uhliku, tedynasnadnosti jeho odtrZeni,a ta jeovlivnena nejen arninochraniciskupinou a skupinou aktivujlci karboxyl, ale i druhem aminokyseliny, tedy substi-

Meehan ismus racemisace deritxu Ic aminokyselin 257

tuentem na IX-uhIiku. .Japonstlautoti" 5 zjistili',Zetendenee IIk Iraeemisaci., odpovidavelmi dobreTaftove, rovnici.ijsou-Iipouzity a*polarnLkonstanty substituentu a ne­dochazi-li ke sterickemubraneni odtrzeni protonu na IX-uhIiku. Z tohovyplyva.: zerozsah racernisace je ovlivnen elektronegativitou substituentu na IX-uhIiku., Vyjimkouz tohotopravidlajsouderivaty cystinu, ktere.dlky moznostiizapojeni elektronud-orbitalu siry do interakee selektrony vazby C.-H prostorem a ne pouze po uhli­katem fetezci, nezaujimaji. misto urcene jim pofadim nukleofilit substituentu-",Totezplatlpro meehanismus prime abstrakee protonu z IX-uhIiku, jehoz kyselost jevsakvnejvyssllTIlreovlivnovanachninici a aktivujici skupinou.

U N-methylaminokyselin byla nalezena raeemisaee12•37, af jiz pfi alkalickehydro­

Iyseestenicizapodmineksynthesy peptidu. ZjiSteni, ze rozsah raeemisaee nezavisinakoncentraci baseukazuje.na jiny mechanismus racemisace, nez je pfimaabstrakceprotonu zIX-uhIiku.Tyto. derivaty aminokyselin mohou poskytovat oxazoloniovykation VI, kterYmllze snadno odstepit proton a prejit na oxazolium-5-oxid (VII)nebo 5-hydroxyoxazoliovy kation VIII. Tyto Iatky jsou velmi nestale a dukazy jejiehexistence byly nejprve podany pornocl kryoskopickych dat'· a pozdeji prlpravounekolika stabilnich perchlorattr'",

,.,CH,-N--C-R'

II 11_RI-C C-OI'-'

'0""'" -V/l

-,.,

CH,-N--CH-R'II I

R'_C c=o''0/ r

VI

-VIII

Kanadskym autorum" 7 se podafilo dokazat jejich pfitomnost v reakcni smesi pomocireakce s propiolatem methylnatym (6).

11II

Z-AJa~Mc Leu-OH

+ HCsaC-:-:COOCH.1,( CO,)

,.,CH,-N---c-cl-r,CH(CH,h

- 1111_ -C C-'-OJI-1/ -, ./ -

Z-NHCHCH, 0

CH'-~--1i-CH2CH(CH,h

~C'" /CH .Z-NHCHCH, C-COOCH,

IX

(6)

I!

Isolaee pyrroloveho derivatulX spolu se zavislosti na polarite a iontove sile rozpou­stedla dava presvMcivy dukaz pro navrhovany mechanisrnus,

Velkym pfinosem pro studium raeemisaee probihajicl oxazolonovym mechanisrnembyla phprava opticky aktivnich.roxazolonu/r'"; Prvni-z.uechto latek, 2-fenyl-L­-4-benzyI.,4,5-dihydro-t3-oxazol-5-o11 pfipraveny z Bz-Phe-OH, pnsobenlm acetan­hydriduv dioxanu, byl pouzit ke studiurychlosti raeemisaee a otvirdni oxazolono-

258 Cliemicke fistyI svazek72 (1978)

veho kruhu ruznymi nukleofily7• Vysledkem techto pokusi'l bylo zjisteni, ze ve vsechpripadech je racemisace mnohem rychlejsim procesem nez otvinini kruhu a.ze obetyto reakce jsou druheho radu. Pozdeji sepodafilo pfipravit opticky aktivni oxa­zolony odvozene od dipeptidil41 •42 , jak pusobenim acetanhydridu, tak i N,N'-di­cyklohexylkarbodiimidu v ethenr".

Polsti autofi dokazali?", :i.e dusikovy atom oxazolonu je dostateene basicky protvorbu soli s kyselinou chlorovodikovou nebo trichloroctovou..Tato vlastnostslouzila pro vysvetleni racemisace u oxazolonu v neutralnim prosttedi tzv. autora­cemisaci (7).

RI-CH-C~O"I I r

2 IN",- }OlCIR'

-RI-CH-C=O)

I IHN" /101 +

(-+1 "cIR'

_I-I _::-...RI-C--C=O

I I rIN~ }Ol

CI

R'

(7)

II

Takovy mechanismus vsak nepfichazi V uvahu v pfitomnosti silnych basi, ob­vyklych pfi synthese peptidu.

Byl rovnez studovan29.3 0,45 tzv. "chloridovy efekt", ktery bylvysvetlovan znacnoubasicitou chloridoveho aniontu v organickych rozpoustedlech!", Podstata spocivav tom, zeuvolnenresteri'l aminokyselin z jejich hydrochloridi'l (nebo obecne soli)bezprostfedne v reakcni smesi vede ke zvysene racemisaci. Vzhledem k tomu, ze vsaksamotny hydrochlorid aminu nezvysujeracernisaci oxazolontr'", ale za pfitornnostiesteru aminokyseliny zmensuje zuaeue rychlost jejich oteviranl, byl pozorovanyefekt pfipsan spise zvetsene.iontove sile rozpoustedla. Vposlednidobe byl "chloridovyefekt" podrobne zkouman?" za poufitl ruznych iontu a je nyni vysvetlovan jak zvj­senou iontovou silouroztoku, tak i basicitou pouziteho iontu. "Solny efekt" byldiskutovant" v souvislosti S obecnou a specifickou katalysou tvorby oxazoloni'l49,50.

Jsou-li rychlosti racemisace a otvirdni kruhu srovnatelne, coz bylo v nekterychpfipadech pozorovdno't", jsou obe druheho radiI. Naproti tomu probiha-li racemisacemnohem rychleji, je tato reakce pseudo-prveho radu. Charakter nukleofilu je nejdu­lezitejsim faktorem ovliviiujiclm pomer obou reakci a tudiz i rozsah zachovanlpi'lvodni konfigurace. Atak oxazolonoveho kruhu je mefitkem nukleofility cinidlaa naopak racemisace, tj. odtrzeni protonu z cyklu, je mefitkem jeho basicity. Methyl­ester glycinu rna nejvetsi pomer nukleofility k basicite a tudiz pi'! jeho pouziti dochaziv nejvetsi mire k zachovanl opticke aktivity, U estern alaninu dochazlme k meneuspokojivym vysledkum a methylester kyseliuy z-aminoiscrndselne poskytuje prak­ticky pouze racernicky produkt; je ovsem nutno mit na pameti, ze se v techto pfipa­dech mi'lze uplatnit i stericka zabrana objemnych postrannich zbytki'l. Pokud tedyje pouzivan ester glycinu v testech pi'!stanoveni mnozstvi vznikleho racemdtu, musimepocltatsilm, ze vlastne dostavarne lepsi vysledek, nez jaky Ize ocekavat pri pouzitlkterekoli jine aminokyselinyt".

Tvorbaoxazolonuz derivatu aminokyselin problha daleko snadneji nez z peptidu.

Meclianismus. racemisace derivatli aminokyselin 259

Rozsah racemisace peptidu neni prilis ovllvnen/" charakterem pfedposledni amino­kyseliny peptidickeho fetezce, ale znacne jej ovliviiuje aminochninici skupina. Signi­fikantni rozdfl byl zjisten mezi Z-Gly-Phe-ONP a Bz-Gly-Pbe-ONP, kde poslednipeptid podleha racemisaci daleko rychleji-", Z taba je videt, ze vliv arninochraniclskupiny muze byt prenasen po peptidickern retezci.

Pomoci tvorby oxazolonu je mozno vysvetlit i racemisaci predposledni arninokyse­liny, ktera bylanekolikrat pozorovana pfiruznych pfilezitostech4.9.52.53.54 a v posled­ni debe i podrobne studovana",56. Ztrata opticke aktivity probiha podle schematunavrzeneho jii Bergmannem a Zervasern" (8).

R'I

R'-CO-NH-CH-C=N",I CH-RJO-CO/

R'I

R'-CO-NH-C=C-NH (8)I 'CH-RJO-Co"

Jestlize peptid obsahuje jako. karboxyterminalni aminokyselinu glycin, dochazik racemisaci jen ve velmimalern rozsahu. V techto pfipadech (na rozdfl ad pcptiduobsahujicich jinou karboxyterminalni aminokyselinu) nezalezi na mnozstvi pouziteliotrietbylaminu". Tojevysvetlovanomalou tendenci glycinu k tvorbOoxazolonfi57,5 •.Jestlize je karboxykoncovou aminokyselinou prolin,k racernisaci predposlednihozbytku riedochazf'".

Diskutovane. poznatky o oxazolonovem mechanismu racemisace za podminekobvyklych pfi synthese peptidu je mozno shrnout do nasledujiciho schematu7,25,59,60,podle.kterehojeracc111isacc. zpusobena rovnovahou obou enantiomernich oxazolonfiustavujici se pres stadium pscudoaromatickeho aniontu (9).

R,I

R-CONHCH-COOH

H ~," ..C---C=O/I IN~ /0

CIR Xb

~+L_A~tK

DL-peptid

uktivace

Rl

/(}

I IiC-···_·cI I u-

N .. /0":cIR

R,I

R-CONHCH-COX

~HXJt+HX

RIIJ,.c--c=cj>I I

N", /0CIR XU

~+L-A~IK

LL-peptid _---'

(9)

+L-AMK-HX

Je nutnopoznamenat,)e 4,S-dihydro-l,3-oxazol-S-ony reaguji s aminokornpo­nentou prednostne za vzniku DL-diastereoisomeru vpripade otevlrant esteremt-aminokyseliny a .r.p-diastereoisomeru, pouzijeme-li ester n-aminokyseliny. To zna-

260 . Chernick'; fisty I scazek 72 (1978)

mend, ze enantiomerni oxazolonyXa aXb,kterejsou v rovnovaze, se otevirajiaminokomponentou rozdilne rychle za vzniku peptidu60 •6 1• Rovnez rychlostreakcem-aminokyselinovych derivatu s opticky eistou karboxykomponentou zavisi na jejikonfiguraci'P. S estery L-aminokyselin vznikaji pfednostne DL-peptidy, pi'ieemz po­mer diastereoisomeru sleduje Curtinuv-Hammetuv princip, tj. je v. prime zavislostina volne enthalpii pi'echodovych stavu a mliie byt vypocitan podle semiernpirickerovnice'", zahrnujiciparametry chirality obou reakcnich komponent.

4. Pi'ima abstrakce protonu z o:-uhliku

Pro pfipady, kdy dochazi ke ztratc opticke cistoty derivatu aminokyselin, u nichzje tvorba oxazolonu velmi nepravdepodobna, byl navrzen9.64,65mechanismus primeabstrakce a readice protonn na IX-uhliku.Tyka se to hlavne N-ftaloyl- a Nsbenzyloxy­karbonylaminokyselin. Ackoliv je zoaene nepravdepodobny vznik oxazolonu u de­rivatu ..'aminokyselin. 5 ·urethanovou aminochranici skupinou65,66, byla racemisaceNsbenzyloxykarbonylaminokysefin opakovane pozorovdna'T"?". Prvnirn krokemv. tomtomechanismu racemisace je odtrfeni protonu z «-uhllku, nasledovane stabili­saci vzniklehoraniontu. Derivaty N-benzyloxykarbonylaminokyselin,. ktere majiv p-poloze skupiny pritahujici elektrony nebo schopne zapojeni do konjugace, by melybyt zvlasrnachylne k racemisaci. Tento zaver byl potvrzenl ' pro derivaty p-kyano­alaninu, S-benzylcysteinu, anhydridu kyseliny asparagove a jejiho fJ-benzylesteru Cipro arornaticke aminokyseliny'", Labilita protonu na ce-uhliku zavisi tel' na druhuchranici skupiny ana aktivaci karboxylu. K mnohem vets! racemisaci nez u N-benzyl­oxykarbonylderivatu dochazi u N-ftaloylaminokyselin, col' milze byt vysvetleno 73

silnym indukcnim efektem dvou karbonylovych skupin v blizkosti «-uhllku a moz­nosti rozsahle konjugace vznik1eho aniontu, zahrnujici i benzenove jadro.

Velmi vhodnym objektern pro studium racemisace probihajici odtrzenim protonuz z-uhliku je p-kyanoalanin, ktery byl i pouzit jako jedna slozka modeloveho peptidupro testovani racemisace 74,7 5 . Na teto aminokyseline bylo rovnez overeno ovlivnenirozsahu racernisace pouzitym esterem; bylo zjisteno,zeracemisace vzrusta s klesaji­cim pK fenolu pouzitym k aktivaci karboxylu?". Nebezpeci prime abstrakce protonunastava rovnez v pfipade pouziti smesnych anhydridu, kdy muze maze dojit k labi­lisaci protonu na «-uhliku tvorbou vodikoveho mustku ke kysliku anhydridove sku­piny?" (viz Xla, Xlb, Xlc).

O=C-OEt

: '"H· 0-, I /

N-C-C=O/ I

R

xt« X/b Xlc

Mechanismus racemisacedel'ivdttiamillokyselill 261

Znacna pozornost byla venovana stndiu78-.0 racemisace aktivnich estern N-ben­zyloxykarbonyl-S-benzyleysteinn, ktera: probiha abstrakciprotonu z a-uhliku.Vyznam techto praci spociva V tom, ze soucasne se stanovenim rychlostnich konstantraeemisaee byla studovana rovnef kinetika kondensacni reakce aktivniho esterns derivatern arninokyseliny.vvetsinou s methylesterem valinu. 0 teto aminokyselineje znamo, ze tvofi. peptidovonvazbu velmi neochotne a tudiz vysledky s ni ziskanebudon menc priznivevesrovnani s ostatnimi aminokyselinami. Pozdejibyly studova­ny I aktivni estery jinych aminokyselin. 1,.2, aby byl zjisten vliv postranniho fetezcena raeemisaei. NejdulezitejSim kriteriem pro hodnoeeni vhodnosti urciteho derivatupro synthesn peptidu je pomer rychlosti kondensaee a racernisace, nebof na nem zavislopticka cistota produktu. Rychlost raeemisaee se snizuje v poradi: Cys > Ser >> Asp> Phe > Glu> Trp > Ala. Pofadi rychlosti racemisace aktivniho esternnezavisi na struktufe.postrannlho rethee a je OSU > OPFP > OTCP > ONP>> OPCP.. Rovnez ryehlost kondensaee s methylesterem valinu neni vyznamneovlivnena eharakterem postranniho retezee a je nasledujici: OPFP > OSU >> OPCP>OTCP>ONP. Z uvedenych udaju je videt, ze pofadi tendenee k ra­cemisaci neni.shodne s pofadim ryehlosti kondensacnich reakci; z toho vyplyva po­fadi pomeru rychlosti.kondensacni reakee a raeemisaee: OPFP > OPCP > OSU >> OTCP > ONP. V zavislosti na.charakteru postranniho fetezce je pofadi pomerurychlosti kondensaee k raeemisaci: Ala> Trp > Gin> Phe» Asp> Ser > Cys;toto pofadi je opacne nez pofadi ryehlosti racemisace, Pro alanin a tryptofan je pomerryehlosti velmi vysoky.vtakze vyber druhu aktivniho estern neni tak kriticky jakov pfipade fenylalaninn nebo zvlaste eysteinn79,. " . 2.

Sloucenina kclkrac

Z-Ala-OPFP 23060

Z-Ala-ONP 1100

Z-Phe-OPFP 1450

Z-Phe-ONP 35

Z-Cys(Bzl)-OPFP 245

Z-Cys(BzI)-ONP 5,3

Pri studiu aktivnich estern Z-Gly-Phe-OB, kde muze dochazet k racemisaci oxazo­lonovym mechanismern, bylo zjiSteno·2, ze tento dipeptid je racemisovan ryehlostisrovnatelnon s rychlosti raeernisaee aktivnich esteru Z-Cys(BzI)-OBa tudiz ze mecha­nismus raeemisaee pfimcu abstrakci protonu z «-uhliku muze byt vaznon konku­rend oxazolonoveho mechanismu a nesmibyt zanedbavan.

Podobnou citlivost jako cystein s benzylovou chranici skupinou vykazuji i jinakna sire chranene cysteinove derivaty?". Citlivost cysteinu je pi'ipisovana3 6 sehopnosti

262 Chemic~e listy!· svazek 72 (1978)

siry v postrannim fetezci zeslabovat a-C-H vazbu pfijetim zaporneho naboje, vzni­kajiciho pi'! odtrzeni protonu z e-uhliku do svych volnych d-orbitalil. RacemisaceS-benzylcysteinu a derivatu serinu byla dfive vysvetlovana tzv. p-eliminaen!m­readicnim mechanismem7 0

,.B3. Ackoliv p-elimlnace byla prokazana isolaci dibenzyl­disulfidu10 nebo N-benzyloxykarbonyl-2,3-dldehydroalaninuB4 , pfipadne produktujeho hydrolysy - kyseliny pyrohroznove'f (po pusobenl alkaliemi na derivaty cys­teinu nebo serinu), nebo pfevedenim O-p~toluensulfonylserinu na S-tritylcysteinB6

,

readici odstupujiei skupiny se prokazat ncpodafilo, Studiem inkorporace [35S]­

benzylmerkaptanu do S-benzylcysteinu bylo zjisteno, ze pres znacnou.pozorovanouracemisaci nedoslo k zabudovdni radioaktivni siry do molekuly derivatu aminokyse­liny' 9.BO,,,; v tomto pfipade je tedy rnozno p-eliminaen! - readicni mechanismusvyloucit.

5. Isoracemisace

V souvislosti se studiem racemisace S-benzylcysteinu bylo zjisteno pomoci in­korporace deuteria do molekuly aminokyseliny za podminek racemisace, ze tatoreakce probiha mechanismem tzv.. isoracemisace, to '. znarnena, fie· vodik na o-uhllkuzilstava v molekule enantiomeru zachovan BB

• K tomuto jevu dochazi v nepolarnichrozpoustedlech za pi'itomnosti donoru deuteria (50 ekvivalentil deuteromethanolu)a base. V polrirnich rozpoustedlech je vymena vodiku paralelni s racemisaci'".

Terrain isoracemisace navrhl Cra1ll9 0 ' 91 pro reakce, u kterych plati, ze pomer

rychlosti substituce ku rychlosti racemisace je roven nebo blizky nule. (Je~li tentopomer roven jedne, jde 0 prostou racemisaci, je~liO,5 jde 0 inversi a pfi nekonecnehodnote tohoto pomeruse jedna 0 uplnou retenci konfigurace pfi substituci.)

ProZ-Cys(BzI)-OPCPbyla nalezena hodnotapomeru k su b"fk", 0,055 (lit.",92)a pro Z-Phe-OPCP 0,03 (lit"3

) , coz svOde! o.znacnem zastoupeni isoracemisacev techto pfipadech. Pro vysvetleni zachovani vodiku v molekule cysteinu bylo navrze­no toto schema" (10):

.. INEtI '

H 0 H 0I II NEt, i,., II

Z-NH-C-C-OC,CI,~ Z-NH-C-C-OC,CI, -I ICH,-S-B21 CH,-S-Bzl

'"NEtI I

H----Ol-II

Z-NH-C~C-OC,CI,

ICH,-S-B71

(10)

Isoracemisace neni vyloucena ani u oxazolonil, nebyla vsak ve spojitosti s temitoIatkami jeste studovana,

Mechantsmus racemisace del'ivcittiasninokyselln ,~263

Litcratii.r a

1.·.· ••.Vicar J.: .•.Chern.·..Listy·.71••••··.160••·(1977)..•··•••• •••••••••••·•• •••.••••••••.•••••••••••.••.••.••..••.••.•.•••..

2. Greenstein J. P.,Winit~M.:Cltelllistryofth~AminoAcids.·.Wile)'I.New York.196L3. Houben-Weyl; Methoden derorganischell Chemle, Vol. .15. Synthese uonPeptidett (E. WUnsch,

Ed.);' Thieme Verlag, Stuttgart 1974;4. BergmannMe. Zervas LcBicchem. Z/203, 280 (1928).5.du Vigneaud V., Meyer e.E.:J.BioJ. Chern. 99,.143 (1932);6. du VigneaudV.,.Meyer. C; E.: J. Biol. Chern. 98, 295 (1932).7. Goodrnan¥"L~vine L::J, Arner. Chern. Soc. 86, 2918 (1964).8.WeygandF., ProxA.,Tilak M.A., HolfterD.,Fritz H.: Chern. B~r. 97,1024 (1964).9. Neuberger A.: Advan. ProteinChern. 4, 359(1948).

10. Manning J. M.: J.BioL Chern. 243, 5591 (1968).II. ManningJ, M.:J. Arner. Chern. Soc. 92, 7449 (1970).12. MeDerrnottI.R., BenoitonN.L.: Can. I. Chern: 51, 2555 (1973).13. IkutaniY.: Bull. Chern. Soc. Jap, 43,3602 (1970).14. Wcygand FcKonlgWc Prox A., BurgerKc Chem-Ber. 99, 1443 (1966).15. WielandT., Paul W.:.Chern. Ber. 77,34 (1944).16.Nakaparksin S., Gil-Av E., Or6J.:AnaJ. Biochem, 33,374 (1970).17. Matsuo H.,KawazoeY.,Sato M.,Ohnishi M.,Tatsuno T.: Chern. Pharm. Bull./8, 1794

(1970).

18-. Andrews I.e.: J. Biol, Chern. 97, 657(1932);19.Jas~bsonS.J.,WHsonC G.,RapoportH.:J, Org.Chern. 39,1075 (1974).20.. Li berek B., Grzonka Z., .. ¥ichaHk A.:.Rocz.•Chern. 40, .. 683 (1966).21. Badal. L: J.Arner.Chern. Soc.94, 1371(1972).22. Goodman M., Stueben K. c. I.Org. Chern.27, 3409 (1962);23. Grahl-Nielsen 0,: Chern. Commun, 1971,1588.24.. Williams M.W.,yolingG. T.:.J .. Chern. Soc. .19M, 3701.25.AntonovicsI.,Young G.T.:Chern. Cornrnun.1965, 398.26. Antonovics r., Young G. T.: J. Chern. Soc. C 1967, 595.27. AntonovicsL, HeardA.L,HugoJ., Williams M. W.,YoungG. T.: Peptides, Proc, 6th

European Peptide Symposium, Athens 1963, str.12I. Pergamon Press, OxfordJ966.28. Heard.A.L.,yourgG.T~:J.Chern.Soc.. 1963,5807.29.Smart rv£' 1\" Young G·T.,WilIiams M. W.:J.Chem. Soc. 1960, 3902.30. Williams M. W.,Young G.T.:J. Chern. Soc. 1963, 881.31. Siemion I. Z., Konopinska.DcPeptides. Proc, 8th European Peptide Symposium, Noordwijk

1966, str, 79. North-Holland, Amsterdam 1967.32. GoodrnanM., Glaser C. 8.: Tetrahedron Lett. 1969,3473.33. Deterrnann H., Heuer J.,PfaenderP., Reinarzt M. L.: Justus Liebigs Ann. Chern. 694, 190

(1966).

34. Siemion I. Z., Konopinska D., Dzugaj A.: Rocz, Chern. 43,989 (1969).35, Sato M., Tatsuno T., Matsuo H.:Chern;Pharrn. BulL 18, 1794 (1970).36. Barber.Mi..JonesJ, Hc.Peptides.vf'roc. 14th European Peptide SymposiumyWepion 1976,

str. 109. Editions Unlv.Bruxelles, Bruxelles 1976.37. McDermottJ. R.,Benoiton N.Lo: Can.T. Chern. 51, 2562 (1973).38. O'Brien I.L., Niemann c.rr. Arner. Chern. Soc. 79, 80 (1957).39. Boyd G. V., Wright P.H.: J;Chern. Soc; Perkin Trans. 11972,909.40.NowakK.,SiernionI. Z.: Rocz,Chell1.35,153(196I}....•......41. LeplawyM.T., JonesD. S.,Kenner G.W., Sheppard R. C.: Tetrahedron 11,39 (1960).42. MeGahren W. J., Goodman M.: Tetrahedron 23,2017 (1967);

Chemickelisty /.H'lIzek72 (1978)

43. ·.. Siemlon.I. Z;, .. Nowak Kc.Rocz. Chem.34, ·1479 (1960).44. Slemicn L Z;,Dzugaj Ac Rocz. Chern. 40,1699 (1966);45. Konig W., Geiger R.: Chern. Ber. 103, 2024 (1970).46. Goodman M., McGahren W. J.: Tetrahedron 23,2031 (1967).47. WiIliams A. W., Young G.T.: J. Chern. Soc. Perkin Trans.11972, 1194.48. Goodman M., Glaser C. n.: Peptides: Chemistry and Biochemistrv.Pscc.Lst American Peptide

Symposium, Yale 1968, str. 267. Dekker, New York 1970.49. Kemp D. S.: Peptides. Proe. 11th European Peptide Symposium, Vienna 1971, str. 1. North-

Holland, Amsterdam 1973.

50. Kemp D. S., Chien S. W.: J. Amer. Chern. Soc. 89, 2745 (1967).51. Lande S., Landowne R. A.: Tetrahedron 22,3085 (1966).52. Esko K., Karlsson S.: Acta Chern. Scand. 24, 1415 (1970).53. Prox A., Weygand F., Konig W., Schmidhammer L.: Peptides. Proc. 6th European Peptide

Symposium, Athens 1963, str. 139. Pergamon Press, Oxford 1966.54. Weygand E: Angew. Chern. 76, 61 (1964).55. Dzieduszycka M., Smulkowski M., Taschner E.: Peptldes. Proc. 12th European Peptide

Symposium, Reinhardsbrunn 1972, str. 103. North-Holland, Amsterdam 1973.56. Weygand F;, Prcx A., Konig W.: Chern. Ber. 99, 1446 (1966).57. De TarD. F., Silverstein R., Rogers F. F.:J. Amer.Chem. Soc. 88, 1024 (1966)~

58. Schnabel E.: Justus Liebigs Ann. Chern. 688, 238 (1965);59. Cit. 3, str. 36.60. Weygand F.,. Stcglich .W.,. de Ia Lama B. X.: Tetrahedron, Suppl ..8, 9 (1966).61. Steglich W., Mayer D., de la Lama B. X.,TannerH.,Weygand F.: Peptides. Proc. 8th

European Peptide Symposium, Noordwijk 1966, str. 67. Ncrth-Holand, Amsterdam 1967.62. Orvos L.. Mohacsi T., Tdmdskdz! 1., Boromissza E.: Radiochem. RadioanaI. Lett. 3. 169

(1970).

63. Ugi I.: Z. Naturforsch. B 20, 405 (1965).64. Wieland T., Determann H.: Angew. Chern. 75, 539 (1963).65. Young G. T.: Peptides. Proceedings of the Symposium on Methods of Peptide Synthesis,

Prague 1958. Collect. Czech. Chern. Commun. Special Issue 24, 33 (1959).66. Stelakatos G. c.: J. Amer. Chern. Soc. 83, 4222 (1971).67. Bodanszky M., Birkhimer C. A.: Chirnia 14, 368 (1960).68. Geiger R., Sturm K., Siedel W.: Chern. Ber, 96,1080 (1963).69. Iselin B., Feurer M., Schwyzer R.: Helv. Chim. Acta 38, 1508 (1955).70. Maclaren J. A., Savige W. E., Swan J. M.: Aust. J. Chern. II, 345 (1958).71. WeygandF.. Prox A., Schmidhammer L., Konig W.: Angew. Chern. 75, 282 (1963).72. Liberek B.: Tetrahedron Lett. 1963, 925.73. Liberek B.: Tetrahedron Lett. 1963, 1103.74~ Liberek B., Michalik A.: Pep/ides. Proc. 7th European Peptide Symposium, Budapest 1964.

Acta Chirn. (Budapest) 44, 71 (1965).75. Liberek B., Michalik A.: Rocz. Chern. 40, 597 (1966).76. Martynov V. E, Sarnarcev M. A.: Z. Dbse. Chirn. 39, 940 (1969).77. Liberek B., Grzonka Z., Michalik A.: Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Sci. Chirn. 12, 375 (1964).78. Kovacs J., Mayers G. L., Johnson R. H., Cover R. E., Ghatak U. R.: Chern. Commun.

1970, 53.

79. Kovacs J., Mayers G. L., Johnson R. H., Cover R. E., Ghatak U. R.: J. Org. Chern. 35,1810 (1970).

80. Kovacs L, Mayers G. L., Johnson R. H., Ghatak U. R.: Chern. Ccmmun. 1968. 1066.81. Kovacs J.,Johnson R. H., Kalas T. J., Mayers G. L., Roberts J. E.: J. Org. Chern. 38, 2518

(1973).

Mecltanisnius racemtsace derivdtll aminokyselin 265

82. ~ovacSJ.,pavisE.J.,JOhns6nIt.f[.,~~rtegianO.H.,RlJberts.J. : . ··Chemistry . · and Biol()gyofPeptides, Proc, 3rd American Peptide Symposium.Boston 1972, str, 359. Ann Arbor Science,Michigan 1972.

83. Bodanszky M., BodanszkyAi: Chern. Commun.1967, 591.84. Riley G., TurnbuH J.,Wilson W.: LChem: Soc. 1957,1373.85. Hiskey R. G., Upham R. A., Beverly G, M;, Jones W. C.: J. Org, Chern. 35,513 (1970);86. PhotakiLrJ. Amer, Chern. Soc.S5, 1123 (1963).87. Kovacs J.,Mayers G. L., Johnson R. H., Ghatak U. R.: Peptides: Chemistry and Biochemistry,

Proc. 1st American Peptide SYmposium, Yale 1968, str, 337. Dekker, New York 1970.88. MayersG. L., Kovacs J.:Chem.Commun. 1970, 1145.89. Matsuo H., Kawazoe Y., Sato M., Ohnishi M., TatsunoT.: Chem. Pharm. Bull. 15, 391 (1967).90. Almy I., Cram D. I.: J. Amer, Chern. Soc. 91,4459 (l969).91. Cram D. J., GosserL.: J. Amer, Chern. Soc. 86, 5457 (1964).92•. Kovacs J., Mayers G. L.: 7th International Symposium on the Chemistry of Natural Products,

Riga 1970, str.17, Zinatne, Riga 1970.93. Kovacs J., CortegianoH., Cover R. E., Mayers G. L.: J. Amer, Chern. Soc. 93, 1541 (1971).

M. Lebl and K. Josf (Institute ofOrganic Chemistry and.Biochemistry, Czechoslovak Academy ofSciences, Prague): Mechanism of Racemization of IX-Amino-acid Derivatives

Racemization of IX-amino-acid derivatives andpeptides is discussed in terms of reactionmechanism with particular reference to peptide synthesis.

266 Chemicke listy I svazek72 (1978)