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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
ABORDAGEM GENÉTICA DA DOENÇA DE ALZHEIMER
FAMILIAR: DO DIAGNÓSTICO AO TRATAMENTO
Leticia de Bastos
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera e pelo Dr.
Carlos José Faria Diogo Cortes, e coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
2018
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
ABORDAGEM GENÉTICA DA DOENÇA DE ALZHEIMER
FAMILIAR: DO DIAGNÓSTICO AO TRATAMENTO
Leticia de Bastos
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera e pelo Dr.
Carlos José Faria Diogo Cortes, e coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
2018
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
3
Prefácio
O presente trabalho é parte integrante do plano de estudos do Curso de Mestrado em
Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Este documento é
composto por duas partes fundamentais, que visam alcançar objetivos distintos, mas
interligados.
A primeira é composta pelo relatório de estágio, onde é apresentado todo o trabalho
desenvolvido e os conhecimentos adquiridos, de uma forma sintetizada, nas áreas da
Bioquímica, Hematologia e Microbiologia. O estágio de Bioquímica decorreu no Serviço de
Patologia Clínca do Hospital de Cascais e o estágio das valências de Hematologia e
Microbiologia foram realizadas no Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da
Graça, em Tomar, tendo tido deste modo o privilégio de conhecer a dinâmica de dois Serviços
distintos.
A segunda parte é composta pela dissertação, que foi desenvolvida na área da genética,
com o tema: “Abordagem genética da doença de alzheimer familiar: do diagnóstico ao
tratamento.” A escolha do tema deveu-se ao interesse em aprofundar os conhecimentos
relativamente à doença de Alzheimer, aliada à importância da genética no possível diagnóstico
e tratamento precoce.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
4 Leticia de Bastos
Resumo
O presente trabalho é parte integrante do plano de estudos do Mestrado em Análises
Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e constitui um dos principais
elementos da avaliação final. Este documento encontra-se dividido em duas partes
fundamentais. A primeira parte consiste no relatório de estágio e a segunda é constituída pela
dissertação.
No relatório de estágio é apresentado o local onde decorreram os estágios e as atividades
desenvolvidas em cada valência, focando os aspetos mais relevantes no que diz respeito à
experiência desenvolvida e ao enquadramento dos conhecimentos adquiridos no contexto real
de trabalho num Laboratório e da sua aplicação à Clínica.
O estágio foi realizado em Laborotórios de Serviços de Patologia Clínica de dois
hospitais. No Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, decorreu o estágio de Bioquímica, no
período compreendido entre os dias 9 de janeiro e 10 de março de 2017. No Hospital da Nossa
Senhora da Graça, em Tomar, foram realizadas as valências de Hematologia e Microbiologia,
entre os dias 3 de abril e 4 de agosto de 2017.
Na dissertação, é apresentada uma revisão da literatura na qual é desenvolvido o tema:
"Abordagem genética da doença de Alzheimer Familiar: do diagnóstico ao tratamento".
A doença de Alzheimer (DA) de início precoce é a forma rara da doença (5-10% dos
casos diagnosticados), apresentando um padrão de hereditariedade autossómico dominante e
tendo essencialmente origem em mutações nos genes que codificam as presenilinas (PSEN1 e
PSEN2) e a proteína precursora amilóide (APP), que levam ao aumento do péptido Aβ42 e,
consequentemente, à perda de função e morte neuronal.
Atualmente, o diagnóstico definitivo desta patologia é obtido a partir da autópsia dos
tecidos cerebrais, pois os procedimentos de diagnóstico tradicionais da DA assentam
essencialmente na exclusão de outras causas de demência. Contudo, diversas pesquisas estão
centradas na possibilidade do diagnóstico precoce recorrendo a biomarcadores específicos, que
capturam tanto a extensão da patologia quanto os seus efeitos sobre a função cerebral, passando
de uma abordagem de diagnóstico de exclusão para um diagnóstico positivo. Os biomarcadores
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
5
encontram-se divididos em duas grandes categorias permitindo uma observação sequencial de
eventos relacionados com os processos fisiopatológicos da doença, sendo fundamentais para
uma possível caracterização da situação clínica do doente.
Relativamente ao tratamento, este é baseado essencialmente na sintomatologia, sendo
usados inibidores da acetilcolinesterase e antagonistas do recetor do N-Metil-D-Aspartato. No
entanto, diversos tratamentos baseados na etiologia encontram-se já em estudo e englobam, não
só a imunoterapia Aβ, mas também inibidores das secretases, da agregação do péptido Aβ, e da
fosforilação e agregação da proteína tau.
No futuro, os micro-RNAs (miRNAs), elementos reguladores da expressão de genes,
constituem biomarcadores promissores para o diagnóstico precoce e as tecnologias baseadas
em RNA de interferência poderão abrir novos caminhos para o tratamento da DA.
Palavras-chave: DA, APP, presenilinas, péptido Aβ, biomarcadores.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
6 Leticia de Bastos
Abstract
The present work is an integral part of the study plan of the Masters in Laboratorial
Medicine of the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon and is one of the main
elements of the final evaluation. This document is divided into two fundamental parts. The first
part consists of the internship report and the second part consists of the monograph.
The internship report presents the place where the internships and activities developed
in each valency took place, introducing the most relevant aspects regarding the experience
developed and the framework of the knowledge acquired in the real context of work in a
Laboratory and its application to the Clinic.
The internship was carried out in Clinical Pathology Laboratories of two hospitals. At
the Dr. José de Almeida Hospital in Cascais, the biochemistry course was held from January 9
to March 10, 2017. At the Nossa Senhora da Graça Hospital in Tomar, the Hematology and
Microbiology, areas took place between April 3 and August 4, 2017.
In the monograph, a review of the literature in which the theme "Genetic Approach of
Familial Alzheimer's Disease: from Diagnosis to Treatment" is presented.
Early-onset Alzheimer's disease (AD) is the rare form of the disease (5-10% of
diagnosed cases), presenting an autosomal dominant inheritance pattern and essentially
originating from mutations in genes encoding presenilins (PSEN1 and PSEN2) and amyloid
precursor protein (APP), which lead to the increase of the Aβ42 peptide and, consequently, loss
of neuronal function and death.
Currently, the definitive diagnosis of this pathology is obtained from the autopsy of
brain tissues, since the traditional diagnostic procedures of AD are essentially based on the
exclusion of other causes of dementia. However, several studies are focused on the possibility
of early diagnosis using specific biomarkers, which capture both the extent of the disease and
its effects on brain function, moving from an exclusion diagnosis approach to a positive
diagnosis. Biomarkers are divided into two broad categories allowing a sequential observation
of events related to the pathophysiological process of the disease and are fundamental for a
possible characterization of the clinical situation of the patient.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
7
Regarding treatment, this is based essentially on symptomatology, using
acetylcholinesterase inhibitors and N-methyl-D-Aspartate receptor antagonists. However,
several treatments based on the etiology are already under study and encompass not only Aβ
immunotherapy, but also inhibitors of secretases, aggregation of Aβ peptide, and
phosphorylation and aggregation of tau protein.
In the future, micro-RNAs (miRNAs), regulators of gene expression, are promising
biomarkers for early diagnosis and interference-based RNA technologies may open new
avenues for AD treatment.
Key words: DA, APP, presenilins, Aβ peptide, biomarkers.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
8 Leticia de Bastos
Agradecimentos
É com satisfação que expresso o meu agradecimento a todos os que contribuíram para
que chegasse até aqui.
Aos meus pais, Glória e Fernando, pois sem eles nada disto seria possível. Obrigada por
tudo, pelos valores transmitidos, pelo amor e apoio incondicional que me têm dado ao longo da
vida.
À minha irmã por acreditar em mim e ter estado sempre presente quando lhe pedi ajuda.
Ao Patrick por todo o amor e paciência que tem demonstrado ao longo desta caminhada.
Aos colegas de mestrado, pelos momentos que passamos juntos, pela amizade, troca de
experiências e sabedoria.
Aos Professores do Mestrado em Análises clínicas, pela aprendizagem que
proporcionaram, em especial à Doutora Isabel Bettencourt, pela força que me deu quando a
minha vontade era desistir, à Doutora Isabel Rivera, pela orientação na dissertação e à Doutora
Cristina Marques, por todo o apoio no processo transição de local de trabalho/estágio.
Às minhas colegas de trabalho que fizeram com que a conciliação entre a minha vida
profissional e académica se tornasse mais fácil.
A todos, os meus sinceros agradecimentos.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
9
Índice Geral
Relatório
Índice………………………………………………………………………………………….14
Índice de Figuras ……………………………………………………………………………...19
Índice de Tabelas...………………………………………………………………...…………21
Siglas e Abreviaturas …………………………………………………………………………23
1. Introdução ……………………………………………………………………………….27
1.1. Objetivo ……………………………………………………………………………..27
2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica ……………………………………….28
2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida …………………….28
2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça ………………..30
3. Higiene e Segurança no Laboratório …………………………………………………….33
4. Fluxograma Geral ………………………………………………………………………..37
5. Amostras Inadequadas para Análise …………………………………………………….39
6. Controlo de Qualidade …………………………………………………………………..40
6.1. Controlo de Qualidade Interno ……………………………………………………..40
6.2. Avaliação Externa da Qualidade ……………………………………………………42
7. Valência de Bioquímica ………………………………………………………………….43
7.1. Bioquímica Clínica …………………………………………………………………43
7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos …………...90
7.3. Análise da Urina Tipo II ……………………………………………………………91
7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado ……………………………………….103
8. Valência de Hematologia ………………………………………………………………105
8.1. Hemogramas……………………………………………………………………….105
8.2. Hemoglobina Glicada ……………………………………………………………..124
8.3. Eletroforese das Hemoglobinas ……………………………………………………126
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
10 Leticia de Bastos
8.4. Hemostase …………………………………………………………………………128
9. Valência de Microbiologia ……………………………………………………………..139
9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia …………………………………………...139
9.2. Exame Microscópico ………………………………………………………………141
9.3. Exame Cultural ……………………………………………………………………146
9.4. Testes de Identificação Presuntiva ………………………………………………...154
9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7 ……………………………..157
9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae …………………………...158
9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos 159
9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A ………………………………….162
9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae …………………………………162
9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila ………………………………….163
9.11. Teste Screening para Clostridium difficile ……………………………………...164
9.12. Teste Screening para Campylobacter spp.…..…………………………………..166
9.13. Pesquisa de Vírus………………………………………………………………..167
9.14. Pesquisa de Micobactérias ………………………………………………………170
9.15. PCR em Tempo Real ……………………………………………………………175
9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras ……………….176
9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos ………………….202
9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos …………………..204
9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras …………………………………..205
9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos ……………………….206
9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes …………………………………………..206
10. Fase Pós-Analítica……………………………………………………………………208
11. Conclusão …………………………………………………………………………….209
12. Referências Bibliográficas …………………………………………………………...210
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
11
Dissertação
Índice………………………………………………………………………………………...225
Índice de Figuras …………………………………………………………………………….227
Índice de Tabelas ……………………………………………………………………………228
Siglas e Abreviaturas ………………………………………………………………………..229
1. Introdução ………………………………………………………………………………231
1.1. Objetivos …………………………………………………………………………..233
2. Doença de Alzheimer Familiar …………………………………………………………234
2.1. Proteína Precursora Amilóide ……………………………………………………..235
2.2. Presenilinas 1e 2 …………………………………………………………………...241
2.3. Apolipoproteína E …………………………………………………………………248
2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1……………………………………………………….249
3. Em Portugal …………………………………………………………………………….250
4. Diagnóstico ……………………………………………………………………………..251
4.1. História Clínica do Doente ………………………………………………………..253
4.2. Entrevista a Informante Informado ………………………………………………..254
4.3. Testes Cognitivos Breves ………………………………………………………….255
4.4. Investigação Laboratorial ………………………………………………………….256
4.5. Testes Neuropsicológicos ………………………………………………………….256
4.6. Testes Genéticos …………………………………………………………………...256
4.7. Neuroimagem ……………………………………………………………………..257
4.8. Outros Biomarcadores …………………………………………………………….259
5. Hipóteses Terapêuticas …………………………………………………………………261
5.1. Tratamento Sintomático …………………………………………………………...261
5.2. Tratamento Baseado na Etiologia………………………………………………….262
6. No futuro………………………………………………………………………………..269
7. Materiais e Métodos ……………………………………………………………………272
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
12 Leticia de Bastos
8. Discussão e Conclusão …………………………………………………………………273
9. Referências Bibliográficas ……………………………………………………………..275
Anexos
Anexo I………………………………………………………………………………………283
Anexo II ……………………………………………………………………………………..285
Anexo III …………………………………………………………………………………….287
Anexo IV …………………………………………………………………………………….288
Anexo V ……………………………………………………………………………………..289
Anexo VI …………………………………………………………………………………….291
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Leticia de Bastos
Relatório de estágio orientado pelo Dr. Carlos José Faria Diogo Cortes,
coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
2018
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
14 Leticia de Bastos
Índice
Índice ........................................................................................................................................ 14
Índice de Figuras ...................................................................................................................... 19
Índice de Tabelas ...................................................................................................................... 21
Siglas e Abreviaturas ................................................................................................................ 23
1. Introdução ......................................................................................................................... 27
1.1. Objetivo ..................................................................................................................... 27
2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica ............................................................ 28
2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida ................................ 28
2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça .......................... 30
3. Higiene e Segurança no Laboratório ................................................................................. 33
4. Fluxograma Geral ............................................................................................................. 37
5. Amostras Inadequadas para Análise ................................................................................. 39
6. Controlo de Qualidade ...................................................................................................... 40
6.1. Controlo de Qualidade Interno .................................................................................. 40
6.2. Avaliação Externa da Qualidade ............................................................................... 42
7. Valência de Bioquímica .................................................................................................... 43
7.1. Bioquímica Clínica .................................................................................................... 43
7.1.1. Avaliação do Ionograma .................................................................................... 45
7.1.2. Avaliação do Metabolismo do Ferro .................................................................. 47
7.1.3. Avaliação da Função Cardíaca ........................................................................... 50
7.1.4. Avaliação da Função Renal ................................................................................ 55
7.1.5. Avaliação da Função Pancreática ....................................................................... 58
7.1.6. Avaliação da Função Hepática ........................................................................... 60
7.1.7. Avaliação da Glicémia ....................................................................................... 66
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
15
7.1.8. Avaliação do Metabolismo Lipídico .................................................................. 67
7.1.9. Avaliação das Proteínas ..................................................................................... 72
7.1.10. Avaliação da Gonadotrofina Coriónica Humana ............................................... 74
7.1.11. Avaliação da Desidrogenase Láctica .................................................................. 75
7.1.12. Avaliação da Creatina-Cinase ............................................................................ 76
7.1.13. Metabolismo Mineral-Ósseo .............................................................................. 77
7.1.14. Avaliação da Proteína C Reativa ........................................................................ 81
7.1.15. Monitorização de Drogas Terapêuticas .............................................................. 81
7.1.16. Rastreio de Drogas de Abuso ............................................................................. 85
7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos .................. 90
7.3. Análise da Urina Tipo II ............................................................................................ 91
7.3.1. Exame Físico e Químico da Urina Tipo II ......................................................... 92
7.3.2. Avaliação Microscópica do Sedimento Urinário ............................................... 98
7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado ............................................................. 103
8. Valência de Hematologia ................................................................................................ 105
8.1. Hemogramas ............................................................................................................ 105
8.1.1. Esfregaço de Sangue Periférico ........................................................................ 115
8.1.2. Velocidade de Sedimentação Eritrocitária ....................................................... 123
8.2. Hemoglobina Glicada .............................................................................................. 124
8.3. Eletroforese das Hemoglobinas ............................................................................... 126
8.4. Hemostase ................................................................................................................ 128
8.4.1. Determinação do Tempo de Protrombina ........................................................ 132
8.4.2. Determinação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada ......................... 132
8.4.3. Determinação do Tempo de Trombina ............................................................. 133
8.4.4. Determinação do Fibrinogénio ......................................................................... 133
8.4.5. Determinação do Anticoagulante Lúpico ......................................................... 133
8.4.6. Determinação da Antitrombina III ................................................................... 134
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
16 Leticia de Bastos
8.4.7. Determinação da Proteína C ativada ................................................................ 136
8.4.8. Determinação da Proteína S Livre ................................................................... 136
8.4.9. Determinação dos D-Dímero ........................................................................... 137
8.4.10. Fator von Willebrand ........................................................................................ 137
8.4.11. Fator VIII .......................................................................................................... 138
9. Valência de Microbiologia .............................................................................................. 139
9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia .................................................................. 139
9.2. Exame Microscópico ............................................................................................... 141
9.2.1. Exame Direto a Fresco ..................................................................................... 141
9.2.2. Exame após Coloração ..................................................................................... 141
9.2.3. Exame Direto a Fresco com Contraste Negativo por Tinta da China .............. 145
9.2.4. Análise Morfológica de Fungos Filamentosos ................................................. 145
9.3. Exame Cultural ........................................................................................................ 146
9.3.1. Técnica de Sementeira ..................................................................................... 152
9.3.2. Condições de Incubação ................................................................................... 153
9.3.3. Aspeto Macroscópico das Colónias ................................................................. 154
9.4. Testes de Identificação Presuntiva .......................................................................... 154
9.4.1. Prova da Catalase ............................................................................................. 154
9.4.3. Prova de Sensibilidade à Optoquina ................................................................. 155
9.4.4. Prova da Urease ................................................................................................ 156
9.4.5. Prova da Coagulase .......................................................................................... 156
9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7 .............................................. 157
9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae .......................................... 158
9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos 159
9.7.1. Preparação da Suspensão ................................................................................. 160
9.7.2. Identificação de Microrganismos ..................................................................... 160
9.7.3. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos ................................................. 161
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
17
9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A .................................................... 162
9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae .................................................... 162
9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila .................................................... 163
9.11. Teste Screening para Clostridium difficile ........................................................... 164
9.11.1. Pesquisa da Desidrogenase do Glutamato ........................................................ 165
9.11.2. Pesquisa das Toxinas A/B ................................................................................ 165
9.12. Teste Screening para Campylobacter spp. ........................................................... 166
9.13. Pesquisa de Vírus ................................................................................................. 167
9.13.1. Teste Screening para Rotavírus e Adenovírus ................................................. 167
9.13.2. Teste Screening para Vírus Sincicial Respiratório ........................................... 168
9.13.3. Pesquisa do Vírus Influenza A e B ................................................................... 169
9.13.4. Pesquisa do Vírus Papiloma Humano de Alto Risco ....................................... 170
9.14. Pesquisa de Micobactérias ................................................................................... 170
9.14.1. Exame Direto e Cultural ................................................................................... 171
9.14.2. Hemoculturas ................................................................................................... 173
9.14.3. Pesquisa por PCR ............................................................................................. 175
9.15. PCR em Tempo Real ........................................................................................... 175
9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras ......................... 176
9.16.1. Trato Respiratório Superior .............................................................................. 177
9.16.2. Trato Respiratório Inferior ............................................................................... 178
9.16.3. Exsudado Ocular .............................................................................................. 180
9.16.4. Exsudado Auricular .......................................................................................... 181
9.16.5. Exsudados Purulentos ...................................................................................... 182
9.16.6. Biópsias Cirúrgicas e Material de Próteses ...................................................... 184
9.16.7. Líquido Biliar e Líquidos de Serosas: Ascítico, Pleural, Sinovial e Pericárdico.
………………………………………………………………………………...184
9.16.8. Líquido Cefalorraquidiano ............................................................................... 186
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
18 Leticia de Bastos
9.16.9. Urina Asséptica ................................................................................................ 187
9.16.10. Esperma e Exsudado Vaginal, Endocervical e Uretral .................................... 191
9.16.12. Hemoculturas ................................................................................................... 195
9.16.13. Catéteres ........................................................................................................... 198
9.16.14. Fezes ................................................................................................................. 199
9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos ............................ 202
9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos .............................. 204
9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras ...................................................... 205
9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos ..................................... 206
9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes .................................................................. 206
10. Fase Pós-Analítica ....................................................................................................... 208
11. Conclusão .................................................................................................................... 209
12. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 210
Anexo I ................................................................................................................................... 283
Anexo II .................................................................................................................................. 285
Anexo III ................................................................................................................................ 287
Anexo IV ................................................................................................................................ 288
Anexo V ................................................................................................................................. 289
Anexo VI ................................................................................................................................ 291
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
19
Índice de Figuras
Figura 1. Pictogramas de perigo. .............................................................................................. 34
Figura 2. Fluxograma geral que se aplica ao Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Cascais
e ao do C.H.M.T. ...................................................................................................................... 38
Figura 3. Dimension® EXLTM with LM, da Siemens. .............................................................. 44
Figura 4. Equipamento Aution Max, da A. Menarini Diagnostics .......................................... 92
Figura 5. Sysmex XN-1000TM. ............................................................................................... 108
Figura 6. Tecnologia da focagem hidrodinâmica ................................................................... 108
Figura 7. Histograma de plaquetas (à esqueda) e dos eritrócitos (à direita). ......................... 109
Figura 8. Tecnologia da citometria de fluxo e sinais de dispersão da luz frontal, lateral e da
fluorescência lateral ................................................................................................................ 110
Figura 9. Diagramas de dispersão normal dos leucócitos do canal DIFF, à esquerda e diagrama
de dispersão com a localização das diferentes células da série branca, consoante as suas
características físico-químicas, à direita. ................................................................................ 111
Figura 10. Diagramas de dispersão normal do canal WNR ................................................... 112
Figura 11. Diagramas de dispersão normal do canal das plaquetas fluorescentes. ................ 112
Figura 12. Diagrama de dispersão no canal dos reticulócitos com distribuição normal ........ 113
Figura 13. Ilustração de como fazer um esfregaço de sangue periférico, à esquerda e esfregaço
bem executado, à direita ......................................................................................................... 115
Figura 14. Equipamento de coloraçãoAutomate RAL Stainer. ............................................. 116
Figura 15. Alifax Test 1 THL ................................................................................................. 124
Figura 16. Arkray Adams A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics ................................. 125
Figura 17. Representação esquemática da percentagem da produção de diversos tipos de
hemoglobinas desde o inicio da gestação até à idade adulta .................................................. 127
Figura 18. HYDRASYS, da sebia. ......................................................................................... 127
Figura 19. Migração, em pH alcalino, das hemoglobinas normais à esquerda e as variantes mais
frequentes à direita. ................................................................................................................ 128
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
20 Leticia de Bastos
Figura 20. Cascata da coagulação. ......................................................................................... 129
Figura 21. Sistema fibrinolítico e inibidores da fibrinólise .................................................... 130
Figura 22. STA Compact Max®, da Satgo. ........................................................................... 130
Figura 23. Princípio de medição por cronometria. ................................................................. 131
Figura 24. Marcha laboratorial em Microbiologia, quando um doente possui uma infeção. . 140
Figura 25. Representação esquemática da parede celular das bactérias Gram negativo e Gram
positivo ................................................................................................................................... 143
Figura 26. Representação esquemática da técnica de sementeira em quatro quadrantes. ...... 152
Figura 27. Representação esquemática da técnica de sementeira por espalhamento. ............ 152
Figura 28. Representação esquemática da técnica de sementeira semi-quantitativa. ............ 152
Figura 29. Equipamento GeneXpert® System, em cima e cartucho de reação em baixo. ..... 176
Figura 30.Fluxograma para identificação de cocos Gram negativos. .................................... 202
Figura 31. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram negativo. ................................ 203
Figura 32.Fluxograma para a identificação de cocos Gram positivo. ................................... 204
Figura 33. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram positivo. ................................. 205
Figura 34. Fluxograma para identificação de leveduras. ....................................................... 205
Figura 35. Fluxograma para identificação de fungos filamentosos. ...................................... 206
Figura 36. Representação esquemática da hematopoiese…………………………………...293
IX Mestrado em Análises Clínicas
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21
Índice de Tabelas
Tabela 1. Triagem e acondicionamento de resíduos num laboratório ...................................... 35
Tabela 2. Causa do aumento e da diminuição dos eletrólitos no soro ..................................... 46
Tabela 3. Marcadores bioquímicos após situação de EAM sem complicações ....................... 51
Tabela 4. Causa do aumento e da diminuição do cálcio, fósforo e magnésio no soro ............. 80
Tabela 5. Compostos dosados na urina para o rastreio de drogas de abuso e respetivo conjugado
.................................................................................................................................................. 89
Tabela 6. Concentrações utilizados para estabelecer valores de índice HIL ........................... 90
Tabela 7. Células que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado clínico
.................................................................................................................................................. 99
Tabela 8. Cilindros que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado
clínico ..................................................................................................................................... 100
Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se encontram
................................................................................................................................................ 101
Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas ................................................. 117
Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a coloração
de May-Grünwald-Giemsa e principais causas ...................................................................... 121
Tabela 12. Alterações quantitativas da serie plaquetar que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas. .................................................... 123
Tabela 13. Teste de primeira linha para investigação de alterações hemostáticas ................. 135
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados ............................................................................ 147
Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do Hospital de
Cascais. ................................................................................................................................... 283
Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do Hospital
de Tomar. ............................................................................................................................... 285
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22 Leticia de Bastos
Tabela 17. Estirpes bacterianas disponíveis manipuladas semanalmente segundo a ordem
estabelecida, e respetivo teste de identificação e TSA executados no equipamento automático.
................................................................................................................................................ 287
Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL ........................................................................... 289
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23
Siglas e Abreviaturas
α-KG α-cetoglutarato
AEQ Avaliação Externa da Qualidade
ADH (Anti-diuretic Hormone) Hormona Anti-diurética
ADP Adenosina Difosfato
ALP (Alkaline Phosphatase) Fosfatase Alcalina
ALT Alanina Aminotransferase
aPTT (Activated Partial Thromboplastin Time) Tempo de Tromboplastina Parcial
Ativada
AST Aspartato Aminotransferase
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosina Trifosfato
BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
BHI (Brain Heart Infusion) Caldo Cérebro e Coração
BK Bacilo de Koch
BNP (Brain Natriuretic Peptide) Péptidos Natriuréticos Cerebral
CAM Gelose Campylosel
CAN2 Gelose chromIDTM Candida
CHGM Concentração de Hemoglobina Globular Média
CIVD Coagulação Intravascular Disseminada
CK Creatina CCinase
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24 Leticia de Bastos
CKMB Isoenzima MB da Creatina CCinase
CLED Gelose Cistina, Lactose, Deficiente em Eletrólitos
CNA Gelose COS com Ácido Nalidíxico e Colistina
COS Gelose de Columbia +5% de Sangue de Carneiro
CPR (Chlorophenol Red) Vermelho de Clorofenol
CPRG (Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside) Vermelho de Clorofenol-β-D-
galactopiranosido
CQ Controlo de Qualidade
CQI Controlo de Qualidade Interno
EAM Enfarte Agudo do Miocárdio
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
FSC (Forward) Dispersão da Luz Frontal
GDH Desidrogenase Específica do Glutamato do Clostridium difficile
GGT Gama-glutamil Transferase
GLDH Glutamato Desidrogenase
G-6-PDH Glucose-6-fosfato Desidrogenase
HAE2 Gelose Chocolate Heamophilus 2
Hb Hemoglobina
HbA1c Hemoglobina Glicosilada ou Glicada
hCG Gonadotropina Coriónica Humana
HEK Gelose Hektoen
HDL (High Density Lipoprotein) Lipoproteínas de Alta Densidade
HGM Hemoglobina Globular Média
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25
HIL Hemólise, Icterícia e Lipémia
HK Hexocinase
HPV (Human Papillomavirus) Papiloma Vírus Humano
HTC Hematócrito
ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva
IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) Federação Internacional de
Química Clínica
INR (International Normalized Ratio) Índice Internacional Normalizado
LCR Líquido Cefalorraquidiano
LDH (Lactate Dehydrogenase) Desidrogenase Láctica ou Lactato Desidrogenase
LDL (Low Density Lipoprotein) Lipoproteínas de Baixa Densidade
MCK Gelose MacConkey
NAD+ Nicotinamida e Adenina Dinucleótido (forma oxidada)
NADH Nicotinamida e Adenina Dinucleótido (forma reduzida)
NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (forma oxidada)
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (forma reduzida)
NRBC (Nucleated Red Blood Cells) Eritroblastos
NT-proBNP N-terminal proBNP
OMS Organização Mundial de Saúde
PCR Proteína C-reativa
PDW (Platelet Distribution Width) Coeficiente de Dispersão Plaquetária
PEG Polietilenoglicol
PLT Plaquetas
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26 Leticia de Bastos
PVX Gelose Chocolate PolyViteX
RBC (Red Blood Cells) Eritrócitos
RDW (Red Cell Distribution Witdth) Coeficiente de Dispersão Eritrocitária
RSV (Respiratory Syncytial Virus) Vírus Sincicial Respiratório
SFL Fluorescência Lateral
SGC2 Gelose Sabouraud com Cloranfenicol 2
SNC Sistema Nervoso Central
SSC (Scatter) Dispersão da Luz Lateral
STRB Gelose chromIDTM Strepto B
TP Tempo de Protrombina
TSA Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos
TSDT Técnico Superior de Diagnóstico e Terapêutica
TT Tempo de Trombina
UFC Unidade Formadora de Colónias
VCA3 Gelose Chocolate VCAT
VGM Volume Globular Médio
VPM Volume Plaquetário Médio
VS Velocidade de Sedimentação Eritrocitária
YER Gelose Yersinia
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27
1. Introdução
O Relatório de Estágio pretende fazer uma apresentação do local onde decorreram os
estágios, descrever as atividades desenvolvidas em cada valência, realçando a importância do
controlo de qualidade interno e da avaliação externa da qualidade, bem como alguns aspetos da
fase pré-analítica. Dentro de cada valência encontra-se destacado o tipo de produto biológico
necessário à execução dos diferentes parâmetros analíticos, quais os equipamentos utilizados
ou técnicas manuais desenvolvidas, o fundamento dos métodos, apresentando os aspetos mais
relevantes no que diz respeito à experiência desenvolvida e ao enquadramento dos
conhecimentos adquiridos no contexto real de trabalho num Laboratório e da sua aplicação à
Clínica.
O estágio é de grande importância para sedimentar e aprofundar conhecimentos, assim
como adquirir capacidade de organização e de execução das tarefas diárias num Laboratório.
Neste caso, tive o privilégio de conhecer a dinâmica de dois Serviços de Patologia Clínca
distintos.
O estágio profissional da valência de Bioquímica decorreu no Serviço de Patologia
Clínca do Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, no período compreendido entre o dia 9 de
janeiro e o 10 de março de 2017. As valências de Hematologia e Microbiologia foram realizadas
no Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, em Tomar, entre o dia 3
de abril e 4 de agosto de 2017.
1.1. Objetivo
O principal objetivo do estágio e da execução do relatório é a aquisição competências e
métodos de trabalho, bem como consolidar conhecimentos.
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Relatório de Estágio
28 Leticia de Bastos
2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica
Os Serviços de Patologia Clínca, do Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, bem
como o do Hospital Nossa Senhora da Graça, em Tomar, respondem às necessidades da
urgência hospitalar tendo um funcionamento permanente para garantir um rápido e adequado
apoio aos doentes. Também são realizadas análises de rotina aos doentes internados, bem como
aos utentes da consulta que procuram estas unidades de saúde, que se regem segundo os mais
rigorosos padrões de qualidade, respeitando as Boas Práticas Laboratoriais.
Ambos os Serviços de Patologia Clínica possuem um fluxo de trabalho bastante
organizado e encontrando-se na sua maioria automatizados e informatizados, conseguido, deste
modo, a total rastreabilidade de todo o processo.
Possuem ainda uma diferenciada secção de Microbiologia que presta apoio ao Hospital
e à Comissão de Controlo da Infeção Hospitalar.
Os Serviços de Patologia Clínca têm ainda implementado um Sistema de Gestão de
Qualidade e encontram-se Certificados pela norma NP EN ISO 9001.
2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida
O Hospital Dr. José de Almeida, situado em Alcabideche, é um hospital público de
gestão privada que presta cuidados de saúde à população de Cascais e Sintra (na área materno-
infantil) tendo como objetivo tornar esta região um exemplo na prestação dos cuidados de
saúde. Atualmente possui um total de 287 camas.
O Serviço de Patologia Clínica, gerido pela empresa Labco, foi instalado de forma a
proporcionar aos utentes, um serviço de qualidade e excelência. A Direção Técnica encontra-
se a cargo do Doutor Luís Santos, Patologista Clínico.
Para além do Diretor Técnico, existe ainda uma Patologista Clínica, uma Técnica
Superior de Saúde, a Dra. Joana Domingues, responsável pela secção de Microbiologia, uma
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Leticia de Bastos
29
Técnica Superior de Regime Geral, coordenadora do serviço, diversos Técnicos Superiores de
Diagnóstico e Terapêutica (TSDT) e uma Assistente Operacional.
O Serviço de Patologia Clínica é constituído de uma central de colheitas com sala de
espera e um laboratório que possui diversas secções, nomeadamente, Microbiologia,
Hematologia, Hemóstase, Bioquímica e Imunologia. Tudo o que não é processado no
laboratório é encaminhado para o Laboratório Central, situado em Lisboa.
2.1.1. Missão
A General Lab é um grupo de laboratórios dedicados à realização de análises clínicas,
que oferece aos seus clientes um serviço responsável, profissional e inovador, com eficiência e
qualidade, tanto humana como técnica.
2.1.2. Visão
A General Lab pretende ser o líder europeu no setor das Análises Clínicas e proporcionar
um serviço que acompanha e tende a superar as expectativas dos clientes utilizando os nossos
valores.
2.1.3. Valores
O potencial dos Recursos Humanos;
A capacidade de adaptação dos nossos processos às necessidades dos clientes;
Espirito de inovação na procura constantes de novas soluções técnicas;
A parceria e a integração de todos os profissionais e colaboradores incluindo os
fornecedores;
O poder de estabelecer alianças estratégicas com outras Organizações;
O compromisso com o meio ambiente e a sociedade em geral.
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30 Leticia de Bastos
2.1.4. Política da Qualidade
A política de qualidade do Grupo General Lab consiste em fomentar o trabalho em
equipas, no controlo e melhoria contínua dos processos para garantir a satisfação do cliente e
superar as suas expectativas.
2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça
O Centro Hospitalar do Médio Tejo, E.P.E. (C.H.M.T.) é constituído por três Unidades
Hospitalares, Abrantes (Hospital Doutor Manoel Constâncio) Tomar (Hospital Nossa Senhora
da Graça) e Torres Novas (Hospital Rainha Santa Isabel), distribuídas, entre si, a uma distância
de 30-35km. O C.H.M.T possui um total de 400 camas, disponíveis para o internamento de
doentes, tendo como objetivo o tratamento e a reabilitação, em tempo clinicamente adequado,
com condições ótimas de qualidade e humanidade dos serviços prestados.
O Serviço de Patologia Clínica encontra-se centralizado no Hospital Nossa Senhora da
Graça que possui uma estrutura laboral bem definida que compreende as áreas de Hematologia,
Bioquímica, Imunoquímica, Imunologia, Microbiologia e Urgência, tendo cada setor um
especialista responsável. Possui ainda uma sala de colheitas com sala de espera e consulta de
hipocoagulação, que se realiza uma vez por semana. Para além de dar resposta aos serviços do
próprio Hospital, também processa amostras da consulta vindas dos Hospitais de Abrantes e
Torres Novas. No entanto, em cada unidade existe um Serviço de Patologia Clínica que possui
uma central de colheitas, um laboratório com capacidade de dar resposta à urgência e ao
internamento, bem como um espaço para a execução da consulta da hipocoagulação. O sector
de Microbiologia encontra-se totalmente centralizado em Tomar.
A direção do Serviço de Patologia Clínica é da responsabilidade do Dr. Carlos Cortes e
a coordenação dos TSDT encontra-se a cargo da TSDT Sandra Paredes. O Serviço de Patologia
Clínica abrange trabalhadores qualificados nomeadamente, 4 Técnicos Superiores de Saúde, 2
Técnicos Superiores de Regime Geral, 5 Patologistas Clínicos, diversos TSDT e 4 Assistentes
Operacionais.
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31
2.2.1. Visão
O C.H.M.T. pretende ser reconhecido como um Centro Hospitalar de referência na
prestação de cuidados de saúde, com especialidades diferenciadas, apostando no
desenvolvimento de serviços eficientes e inovadores com uma gestão adequada dos recursos,
sempre com o objetivo de atingir a satisfação dos seus utentes.
2.2.2. Missão
Prestação de cuidados de saúde diferenciados, com eficiência e qualidade, em
articulação com outros serviços de saúde e sociais da comunidade, a custos comportáveis,
assumindo-se como um Centro de elevada competência na organização e prestação assistencial,
uma referência no esforço de investigação, desenvolvimento e inovação, promovendo a
complementaridade entre as 3 Unidades Hospitalares.
2.2.3. Valores
Qualidade, procurando obter os melhores resultados e níveis de serviço na
prestação de cuidados, tendo como base a satisfação das necessidades da comunidade,
assumindo o princípio da melhoria contínua e promovendo a cooperação entre os
diferentes Serviços;
Ética e integridade, orientando as ações tomadas segundo os mais nobres
princípios de conduta, nas relações;
Respeito pelos direitos individuais, assumindo o compromisso de salvaguardar
a dignidade de cada indivíduo nas relações decorrentes da sua operacionalidade;
Competência e inovação, promovendo o desenvolvimento da Instituição e a
implementação de novas soluções que permitam assegurar a prestação dos melhores
cuidados de saúde.
2.2.4. Política da Qualidade
O C.H.M.T. orienta a prestação de cuidados de saúde na perspetiva dos princípios da
Gestão pela Qualidade, visando a satisfação dos utentes e colaboradores.
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32 Leticia de Bastos
Neste sentido, a política da qualidade é estabelecida pelos seguintes princípios:
Competência e respeito pelos requisitos legais, éticos e deontológicos no
exercício das suas atividades, sempre orientadas para a satisfação das necessidades dos
utentes.
Cumprimento dos requisitos aplicáveis a de melhoria contínua da eficácia do
Sistema de Gestão da Qualidade.
Cultura de Qualidade e Segurança assente num modelo de gestão global de risco.
Cultura de competências assente na responsabilidade e formação contínua dos
colaboradores, garantindo a sua satisfação e otimizando a performance organizacional.
Garantia de uma comunicação eficaz com os colaboradores e com a comunidade
envolvente à área de influência do Médio Tejo.
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33
3. Higiene e Segurança no Laboratório
Em ambos os Laboratórios existe um procedimento escrito de Higiene e Segurança, que
contempla os requisitos para a segurança de pessoas e instalações, planos de emergência,
tratamento de resíduos, requisitos para a limpeza das instalações, bem como para a lavagem e
esterilização de materiais.
As Normas Gerais de Segurança visam minimizar o risco de acidentes, assim como
estabelecer normas que garantem a proteção dos profissionais saúde, nomeadamente os
técnicos, sendo fundamental:
A utilização de equipamentos de segurança individual e coletivos, sempre que
necessário;
Tratar todos os produtos como sendo potencialmente perigosos;
Os recipientes e/ou requisições visivelmente conspurcados com matéria orgânica
não devem ser aceites pelo laboratório;
Colocar tampas nos tubos antes de se proceder à sua centrifugação e
armazenamento;
Frascos que contenham produtos transferidos ou preparados a partir de frascos
originais devem ser etiquetados com a identificação do produto, data da preparação e
de validade, modo de preparação, rúbrica de quem o preparou e simbologia de perigo
adequada (Figura 1);
Não comer, fumar, beber ou conservar alimentos/bebidas na zona laboratorial;
Manter as áreas de trabalho limpas e desimpedidas;
Fechar portas e gavetas de armários após utilização;
Minimizar o uso de objetos pessoais;
Os acessos de saída devem ser desobstruídos.
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34 Leticia de Bastos
Antes de se iniciar qualquer operação, é necessário conhecer as características dos
equipamentos, reagentes e produtos que se irão manipular e os seus requisitos de segurança.
Quanto à gestão de resíduos do Laboratório, os resíduos hospitalares são classificados
de acordo com o Despacho conjunto nº242/96 de 5 de julho bem como de acordo com a Portaria
nº 209/2004 de 3 de março (Lista Europeia de Resíduos) (Tabela1).
Figura 1. Pictogramas de perigo [1].
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35
Tabela 1. Triagem e acondicionamento de resíduos num laboratório (Adaptado de [2]).
Res
ídu
os
Não P
erig
oso
s
Grupo I - Resíduos equiparados a urbanos
Grupo II - Resíduos hospitalares não perigosos
Embalagens vazias com exceção dos incluídos no Grupo III
e IV.
Material não contaminado e sem vestígios de sangue.
Material de proteção individual utilizados nos serviços de
apoio, com exceção dos utilizados na recolha de resíduos.
Res
ídu
os
Per
igoso
s
Grupo III - Resíduos com risco biológico
Amostras biológicas;
Material contaminados ou com vestígios de sangue;
Material de proteção individual em que exista contacto com
produtos contaminados.
Grupo IV - Resíduos hospitalares específicos
Resíduos cortantes e perfurantes;
Citostáticos e todo o material utilizado na sua manipulação e
administração;
Produtos químicos passíveis de incineração.
Resíduos Especiais Perigosos
Resíduos líquidos de risco biológico.
Reagentes não identificados ou obsoletos ou
outros resíduos sujeitos a recolha pontual.
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36 Leticia de Bastos
A eliminação e tratamento dos resíduos depende da classe a que pertencem. A
Legislação aplicável à gestão de resíduos são o D.L nº 178/2006 e o D.L nº73/2011.
A recolha de resíduos é efetuada por uma empresa contratada, especializada e licenciada
neste tipo de serviço – Stericycle Portugal ®. A recolha periódica deve ser registada em modelo
próprio para posterior elaboração do relatório anual a enviar à Direção Geral de Saúde.
Os resíduos sólidos perigosos não descartáveis (Grupo III) são colocados em recipiente
contendo lixívia diluída. No fim do dia, a lixívia é despejada sob água corrente e o material é
lavado numa cuba de lavagem contendo detergente e lixívia diluída.
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37
4. Fluxograma Geral
Colheita e identificação das amostras
Fornecer instruções para colheita(s)
Prescrição médica
Registo da colheita
Acondicionamento e envio das
amostras ao Laboratório
Receção das amostras
Requisição conforme?
É atribuído um número de registo
que servirá para a identificação da
amostra, com os dados do utente
(nome, número de processo e data
de nascimentos/idade), serviço,
tipo de tubo e secção a que se
destina ou origem do produto (no
caso da microbiologia) e código de
barras.
Não Contacto com o médico prescritor
Retificação da requisição
Sim
Dependendo dos analitos a serem
doseados o transporte é feito à
temperatura ambiente, refrigerado
ou a 37ºC.
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38 Leticia de Bastos
Amostra conforme? Não Rejeição da amostra
Solicitação de nova colheita
Sim
Dar entrata dos produtos no sistema
informático do Serviço de Patologia
Clínica
Centrifugar as amostras se necessário
Distribuição dos produtos pelas
diversas secções analíticas ou
aliquotar e armazenar a fim de
manterem a estabilidade até serem
processadas.
Todas as amostras que não são
processadas in situ são
devidamente acondicionadas para
serem enviadas a outro
Laboratório (externo ou do
grupo/centro hospitalar).
Processamento das amostras
Amostra conforme?
(se não repetir passos anteriores)
A programação pode ser manual
ou automática, recorrendo à
transmissão bidirecional entre os
equipamentos e o programa
informático do Laboratório (veio
minimizar erros de programação e
de transcrição de resultados).
Validação de resultados
Figura 2. Fluxograma geral que se aplica ao Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Cascais e ao do
C.H.M.T.
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39
5. Amostras Inadequadas para Análise
A fase pré-analítica concentra a grande maioria dos erros laboratoriais que geram a
rejeição de amostras biológicas, com possibilidade de vir a ser necessário a repetição da
colheita. Entre eles, destacam-se aspetos relacionados com o não cumprimento das
recomendações que antecedem à colheita ou com a colheita em si:
Hemólise: Libertação do conteúdo intracelular do eritrócito para o plasma, que
leva à elevação de alguns parâmetros analíticos e a cor vermelha que pode causar
interferências analíticas na leitura das absorvências (dependendo do grau de hemólise,
o grau de interferência varia). Pode ser patológico ou resultante de erro pré-analítico.
Lipémia: Turvação do soro devido à elevada concentração de lipoproteínas ricas
em triglicéridos que leva a interferências em diversas técnicas analíticas. Atenua se o
tempo de jejum for cumprido.
Icterícia: Relacionada com patologia hepatobiliar. Pode causar interferência
nalgumas técnicas analíticas.
Amostra coagulada: Deve-se geralmente colheitas difíceis e demoradas, ou à não
homogeneização dos tubos que contenham anticoagulante logo após colheita. Leva a
interferência nos resultados e poderá entupir o equipamento.
Proporção sangue-anticoagulante não respeitada: leva a alterações nos resultados
analíticos. É importante encher os tubos até a marca. A largura da marca presente nos
tubos indica a margem de tolerância.
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40 Leticia de Bastos
6. Controlo de Qualidade
O Controlo de Qualidade (CQ) num Laboratório de Análises Clínicas, trata-se de um
processo estatístico útil na monitorização e avaliação dos processos analíticos, assegurando a
qualidade e fiabilidade dos resultados, através de um conjunto de ações pré-estabelecidas e
sistemáticas, que abrange as fases pré-analítica, analítica e pós-analítica [3,4].
Os procedimentos de controlo incluem o controlo de qualidade interno (CQI) e a
avaliação externa da qualidade (AEQ) [3], sendo que as matérias de controlo devam ser
examinadas periodicamente, com uma frequência baseada na estabilidade do procedimento e
tendo em conta o risco de danos para o utente de um resultado errado [4].
6.1. Controlo de Qualidade Interno
O CQI define-se como um conjunto de procedimentos que se destinam a assegurar e
controlar a qualidade dos resultados obtidos durante a execução de análises laboratoriais [3].
Permite avaliar a precisão dos sistemas analíticos. A precisão é a concordância entre os vários
valores medidos de um analíto (mínimo 20 réplicas), na mesma amostra, sob as mesmas
condições (repetibilidade) ou sob condições variáveis (reprodutibilidade), sendo afetada pelo
erro aleatório. A imprecisão é medida através do cálculo do coeficiente de variação (CV).
𝐶𝑉 (%) =𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑜 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜 (𝐷𝑃)
𝑀é𝑑𝑖𝑎 (𝑋)× 100
𝐷𝑃 = √∑ (𝑋𝑖 − 𝑋)𝑛
𝑖=1
𝑛 − 1
𝑋 = ∑ 𝑋𝑖𝑛
𝑖=1
𝑛
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41
Em ambos os Serviço de Patologia Clínca, são processados diariamente CQI, no entanto
os níveis de controlo e a periodicidade com que são passados depende do que está estabelecido
na instrução de trabalho e aprovado pelo Diretor Técnico (Anexos I e II).
Para além do que está estipulado na rotina diária, existem outras situações em que é
necessário processar CQI: após uma calibração ou recalibração, sempre que se utilize um novo
reagente, após uma manutenção específica ou procedimentos de resolução rápida de um
problema no equipamento, quando se verifica uma possível tendência nos resultados, e sempre
que se achar necessário.
Os controlos, tal como as amostras, são programados através de um sistema de códigos
de barras. A transmissão bidirecional permite que os resultados sejam transmitidos para um
programa informático e registados em cartas de Levey-Jennings que diariamente são analisadas,
sendo os critérios de aceitação estabelecidos pelo responsável da qualidade do laboratório,
tendo como base as Regras de Westgard.
Quando alguma regra de controlo de qualidade é violada, ou se verifica uma tendência,
os resultados das análises podem ser suscetíveis de conter erros clinicamente significativos.
Neste caso, as amostras devem ser de novo examinadas após a correção do erro, podendo ser
necessário executar manutenções, recalibrar ou colocar um novo regentes. Qualquer ação
corretiva ou preventiva tem de ser devidamente registada.
Antes de se iniciar o processamento das amostras dos utentes é necessário validar os
resultados de controlo e verificar se tudo está operacional.
No que diz respeito à secção de Microbiologia, o CQI é executado com base na
manipulação e conservação de estirpes bacterianas ATCC (do inglês American Type Culture
Collection), que têm características fenotípicas previamente conhecidas. As estirpes a utilizar é
quase sempre obtidas a partir das culturas de trabalho. A cultura de trabalho é preparada uma
vez por semana com início de procedimento às segundas, terças ou quartas-feiras (Anexo III,
A). O controlo é realizado semanalmente (uma estirpe diferente por semana), procedendo-se à
sua identificação e teste de suscetibilidade aos antimicrobianos no equipamento automático
(Anexo III, B). Quando algum resultado não estiver conforme o esperado, deverá procurar-se a
causa do erro e corrigir-se sempre que possível. Nestas situações, o teste deverá ser repetido na
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42 Leticia de Bastos
semana seguinte, juntamente com o programado para essa semana, devendo qualquer ação
corretiva ficar devidamente registada.
Relativamente às técnicas manuais, os controlos são processados sempre que uma caixa
nova é colocada a uso, e, se possível (se os controlos não foram de uso único), sempre que haja
dúvidas no desempenho ou interpretação do resultado de um teste, sendo o dia da abertura, lote
do Kit e o desempenho do controlo registado no dossier das técnicas manuais.
6.2. Avaliação Externa da Qualidade
A AEQ corresponde à avaliação por um organismo exterior da qualidade dos resultados
fornecidos pelo laboratório. Permite a melhoria dos níveis de desempenho do laboratório e a
comparabilidade de resultados com outros laboratórios, dando uniformidade e credibilidade ao
trabalho desenvolvido [3]. Quando um resultado de controlo não cumpre os critérios de
desempenho pré-estabelecidos tem de se implementar ações corretivas.
Em ambos os Serviço de Patologia Clínca, a grande maioria dos parâmetros são alvos
da AEQ, permitindo deste modo aferir a exatidão dos resultados, avaliar e quantificar a
inexatidão e as tendências dos sistemas analíticos. As amostras são enviadas com uma
periodicidade adequada, para que se possa efetuar correções aos eventuais desvios observados
em tempo útil. A exatidão é afetada pelo erro sistemático.
A inexatidão (ou bias) corresponde à percentagem do afastamento entre o valor medido
em relação ao valor verdadeiro.
𝐵𝑖𝑎𝑠(%) =|𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑖𝑟𝑜|
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑖𝑟𝑜× 100
O resultado da AEQ é avaliado pelo Diretor Técnico, em conjunto com o responsável
da qualidade do Serviço de Patologia Clínca e o responsável da secção.
Os planos de controlo da AEQ em que os Serviços de Patologia Clínica participam
encontram-se apresentados no Anexo IV.
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43
7. Valência de Bioquímica
7.1. Bioquímica Clínica
A área da Bioquímica Clínica é uma área multidisciplinar, que tem por objetivo
determinar os parâmetros bioquímicos, permitindo a sua utilização no diagnóstico, prognóstico,
tratamento e monitorização da doença.
Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Dr. José de Almeida, Cascais
Responsáveis da secção:
Dr. Luis Santos (Patologista Clínico)
Dra. Stela Lopes (Patologista Clínico)
Dra. Joana Domingues (Técnica Superior de Saúde)
Período de Estágio: 09/01/2017 - 10/03/2017
Volume de trabalho: Em média cerca de 6900 pedidos/mês (estatística feita com base no
número de pedidos ionograma/mês)
Atividades realizadas na seção no referendo período:
Colheitas de produtos biológicos no internamento e consulta externa;
Receção de produtos e avaliação da sua conformidade;
Manutenção dos equipamentos;
Execução e avaliação CQI e das amostras da AEQ;
Processamento de amostras;
Validação técnica de resultados;
Gestão de stocks.
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44 Leticia de Bastos
Equipamento em funcionamento na secção:
Equipamento: Dimension® EXLTM with LM, da Siemens
O Dimension® EXLTM possui um sistema automatizado que permite a determinação dos
parâmetros bioquímicos em amostras de soro, plasma, urina e líquidos orgânicos,
nomeadamente, líquido cefalorraquidiano (LCR).
Os produtos que se destinam a determinações bioquímicas neste equipamento são
centrifugados a 3500rpm, 10 minutos. As urinas não precisam de nenhum tratamento específico
a não ser que se apresentem muito turvas ou com uma consistência viscosa, e neste caso também
têm de ser centrifugadas, a fim de prevenir o entupimento das agulhas do equipamento.
Quanto aos líquidos orgânicos, sempre que haja pedido de citoquímico1, primeiro tem
de se avaliar a cor e o aspeto do líquido e posteriormente centrifugar para ser processado no
equipamento. Quando é pedido a densidade e o pH esta determinação é efetuada recorrendo a
tiras de teste de análise de urina tipo II.
Diversos parâmetros bioquímicos são doseados no Dimension® EXLTM with LM
(Figura 3) com o objetivo de auxiliar o médico no diagnóstico e prognóstico de determinada
patologia ou condição clínica.
1 Geralmente, o pedido do citoquímico vem sempre acompanhado do exame citológico (líquido colhido em tubo contendo
como anticoagulante o EDTA), em que após a contagem de células pelo analisar automático, proceder-se à montagem da
câmara de Nageotte para contagem dos leucócitos, com contagem diferencial entre células polimorfonucleares e
mononucleares, assim como efetuar uma avaliação semi-quantitativa dos eritrócitos.
Figura 3. Dimension® EXLTM with LM, da Siemens.
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45
7.1.1. Avaliação do Ionograma
A função dos eletrólitos no corpo humano é múltipla, sendo que quase todos os
processos metabólicos são dependentes dos eletrólitos ou afetados por eles. O aporte destes
eletrólitos no organismo é feito através da dieta [5].
Os iões de cloretos (Cl-) e sódio (Na+) são os principais iões extracelulares, sendo
responsáveis pela osmolalidade do plasma e desempenham um papel fundamental na
manutenção da distribuição da água e da pressão osmótica no compartimento líquido
extracelular [5]. A hiponatrémia leva a convulsões, letargia, desorientação, edema pulmonar,
cefaleias, coma ou até mesmo à morte. A hipernatrémia pode levar à agitação, espasmos
musculares, letargia e irritação [6].
Os iões de potássio (K+) são os principais catiões intracelulares, sendo responsáveis por
manter o equilíbrio da água, em conjunto com o sódio, regular processos metabólicos e
excitabilidade muscular. A hipocaliémia leva a fraqueza muscular, diminuição dos reflexos e
arritmias cardíacas. A hipercaliémia pode levar a confusão mental, fraqueza, dormência,
formigueiro nas extremidades, fraqueza muscular e paragem cardíaca [5].
Diferentes causas podem estar na origem das alterações hidro-eletrolíticas, sendo que
algumas delas encontram-se apresentadas na Tabela 2.
Amostra: Soro, plasma heparinizado2 ou urina [7].
Método: Potenciometria.
Existem 3 elétrodos incorporados no Multisensor Integrado QuikLYTE® que são
seletivos para os iões de sódio, potássio e cloro, para além do elétrodo de referência. Depois
de uma amostra ser posicionada no sensor, os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície
do elétrodo. É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da atividade da substância
a analisar na amostra, que é comparado com o potencial gerado numa solução padrão. A
concentração dos iões é calculada com recurso à Equação de Nernst [7].
2 Heparina é um anticoagulante. Ativa (co-fator) a antitrombina III que exerce ação anticoagulante, principalmente pela inibição
da trombina (fator IIa) mas também dos fatores IXa, Xa, XIa e XIIa, impedindo a formação da rede de fibrina.
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Intervalo de Medição Analítica: Soro:Na+: 50-200mmol/L, K+: 1.0-10.0mmol/L, Cl-:
50-200mmol/L; Urina: Na+: 5-300mmol/24H, K+: 1.0-300mmol/24H, Cl-: 10-330mmol/24H[7]
Valores de Referência: Soro: Na+: 136-145mmol/L, K+: 3.5 -5.1mmol/L, Cl-: 98-
107mmol/L; Urina: Na+: 40-220mmol/24H; K+: 25-125mmol/24H, Cl-: 110-250mmol/24H
Tabela 2. Causa do aumento e da diminuição dos eletrólitos no soro (Adaptado de [5]).
Eletrólitos Aumento Diminuição
Sódio
Desidratação
Níveis diminuídos de ADH
Produção excessiva de mineralocorticóides
Infusão intravenosa de Na+
Ingestão excessiva de sal sem entrada de
água
Insuficiência renal
Hiperaldosteronismo
Queimaduras
Diurese osmótica
Ingestão diminuída
Perdas gastrointestinais
Sudação excessiva
Insuficiência de mineralocorticóides
Hipoaldosteronismo
Acetoacidose diabética
Acidose tubular renal
Insuficiência cardíaca
Insuficiência renal
Hipoalbunimémia
Níveis aumentados de ADH
Administração excessiva de água
Potássio
Infusão intravenosas de K+
Desidratação
Rabdomiólise
Queimaduras graves
Insuficiência renal
Hemorragias
Acidose metabólica
Défice de mineralocorticóides
Diuréticos
Ingestão diminuída
Perdas gastrointestinais
Perdas renais
Alcalose metabólica
Incorporação celular
Doença hepática
Insuficiência cardíaca
Queimaduras
Diurese osmótica
Cloro
Desidratação
Insuficiência renal aguda
Acidose metabólica
Diabetes insipidus
Nefropatia
Perdas intestinais de bicarbonato
Insuficiência adrenal
Alcalose metabólica
ADH hormona anti-diurética (do inglês anti-diuretic hormone)
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7.1.2. Avaliação do Metabolismo do Ferro
O ferro é um elemento fundamental e vital para o bom funcionamento do organismo. O
tecido com maior necessidade de aporte em ferro é a medula óssea para a síntese de
hemoglobina, sendo este aporte garantido pela dieta [8]. O ferro que não é utilizado é
armazenado nas formas de ferritina e hemossiderina [9]. Porém, capacidade de armazenamento
é limitada e em excesso torna se tóxico para o organismo [8].
A transferrina é fundamental para o transporte do ferro para os locais de armazenamento
(células do sistema reticuloendotelial do fígado, baço e medula óssea) e para as células que
sintetizam compostos contendo ferro, tais como hemoglobina, mioglobina e citocromo. Esta
glicoproteína é produzida no fígado, sendo os seus níveis plasmáticos influenciados pela
disponibilidade de ferro. A carência de ferro leva a um aumento da sua síntese [10].
Os níveis de ferritina circulante refletem com exatidão os níveis de ferro que se
encontram armazenados no organismo e são úteis em situações de suspeita de deficiência ou
sobrecarga de ferro [9]. É um indicador precoce, manifestando alterações antes da diminuição
dos níveis séricos de ferro e do aparecimento de anomalias morfológicas nos eritrócitos [11].
Existe um forte mecanismo homeostáticos, no entanto podem surgir distúrbios do
metabolismo do ferro que levam a situações patológicas, das quais de destacam a anemia
ferropénica, anemia da doença crónica [12], hemossiderose, hemocromatose, anemia
sideroblástica [11], anemia hemolítica e necrose hepática aguda (por libertação aumentada do
ferro armazenado) [13].
Na anemia ferropénica verifica-se uma diminuição dos níveis plasmáticos de ferro
resultante da depleção das reservas, podendo ser consequência de deficiências nutricionais,
perdas sanguíneas ou problemas de absorção [12].
Frequentemente, as doenças infeciosas, inflamatórias, traumáticas, neoplásicas ou com
comprometimento hepático, são acompanhadas por uma anemia leve a moderada, com
diminuição dos níveis plasmáticos de ferro e níveis normais ou ligeiramente aumentados de
ferritina, denominada de anemia de doença crónica, causada pela resposta de fase aguda
associada à inflamação crónica [12].
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Ferritina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [14].
Método: Imunoensaio enzimático.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a ferritina (FERR) e com um conjugado (β-galactosidase marcada
com anticorpo monoclonal específico para um segundo local de ligação na ferritina). O que não
se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com um substrato cromogénico, o
vermelho de clorofenol-β-D-galactopiranosido (CPRG, do inglês chlorophenol red-β-D-
galactopyranoside). A hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o vermelho de clorofenol
(CPR, do inglês chlorophenol red). A concentração de ferritina é diretamente proporcional à
taxa de variação de cor devido à formação de CPR medida a 577/700nm [14].
Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000ng/mL [14]
Valores de Referência: Mulher: 8 – 252ng/mL [µg/L]; Homem: 26 – 388ng/mL
[µg/L]; Combinadas: 8 – 388ng/mL [µg/L]
Ferro
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [13].
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Método: Adaptação do método desenvolvido por Smith et al. utilizando o cromóforo
Ferene®3, que possui uma elevada sensibilidade para a determinação do ferro. A potencial
interferência do cobre é minimizada pela adição de tioureia.
Em condições ácidas, o ferro férrico (Fe3+) ligado à transferrina é libertado. Na presença
do agente redutor, ácido ascórbico, o Fe3+ é reduzido para ferro ferroso (Fe2+). O Fe2+ forma
um complexo azul com o sal dissódico do àcido 5,5’(3-(2-piridil)-1,2,4-triazina-5,6-diil)-bis-2-
furano-sulfónico (Ferene®). A absorvência do complexo é medida por uma técnica bicromática
de ponto final (600, 700nm) sendo diretamente proporcional à concentração do ferro presente
na amostra [13].
Intervalo de Medição Analítica: 5 – 1000µg/dL [0.9 – 179.0µmol/L] [13]
Valores de Referência: Homens: 65 – 175µg/dL [11.6 – 31.3µmol/L]; Mulheres: 50 –
170µg/dL [9.0 – 30.4µmol/L]
Transferrina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [15].
Método: Turbidimétrico.
A transferrina liga-se a anticorpo policlonal levando à formação de imunocomplexos. A
adição de polietilenoglicol (PEG) que acelera a sua formação. O aumento da turvação é
proporcional à concentração de transferrina, medida através de uma técnica bicromática de
ponto final (340, 700nm) [15].
3 Ferene® é uma marca registada da Diagnostic Chemicals, LTD., Charlottetown, P.E.I, Canada C1A4H5.
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Intervalo de Medição Analítica: 40 – 750mg/dL [0.40 – 7.50g/L] [15]
Valores de Referência: 202 – 364mg/dL [2.02 – 3.64g/L]
7.1.3. Avaliação da Função Cardíaca
O enfarte agudo do miocárdio (EAM) é uma das principais causas de morte e de
incapacidade em todo o mundo, sendo a sua deteção precoce crucial. A nível laboratorial define-
se com a subida e/ou descida do biomarcador cardíaco (de preferência troponina, ou como
alternativa a isoenzima MB da creatina cinase - CKMB), pelo menos um valor acima do
percentil 99 do Limite Superior de Referência [16].
No entanto, existem outros marcadores bioquímicos cardíacos e o conhecimento da sua
cinética tem grande importância não só para auxiliar no diagnóstico, como na estratificação do
risco, prognóstico, monitorização do doente, mostrando a extensão e comprometimento
cardíaco.
A mioglobina é uma proteína heme encontrada no músculo cardíaco e esquelético sendo
libertada para a circulação quando ocorre lesão celular. Na ausência de traumatismos do
músculo esquelético ou de outros fatores que levam a um aumento de mioglobina circulante de
origem não cardiaca, a sua determinação é utilizada como um marcador precoce de EAM
(Tabela 3) [17].
A CKMB encontra-se essencialmente ao nível do músculo cardíaco e em concentrações
substancialmente mais baixas no músculo esquelético. Esta isoenzima para além de ser um
biomarcador de eleição para o perioperatório de EAM nas primeiras 48h, a sua determinação
também tem sido utilizada para avaliar a extensão do enfarte e reenfartes subsequentes,
apresentando uma boa sensibilidade, especificidade e eficiência para o diagnóstico (Tabela 3)
[18].
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O complexo da troponina é constituído por três componentes polipeptídicos distintos: a
troponina C, troponina I e a troponina T, que desempenham um papel essencial na contração
do musculo estriado. O doseamento da troponina I pode ser utilizada como auxiliar no
diagnóstico de EAM e na estratificação de risco em doentes com síndrome coronário agudo
relativamente ao risco relativo de mortalidade. Também está aumentada em traumatismos no
peito, cirurgia, insuficiência cardíaca congestiva (ICC), insuficiência renal, toxicidade cardíaca
provocada por fármacos, miocardite, embolismo pulmonar, doenças infiltrativas e doenças
neurológicas agudas. Este biomarcador é mais específico do que a CKMB para a deteção de
lesões do miocárdio na presença de lesões do músculo esquelético (Tabela 3) [19].
Os péptidos natriuréticos cerebrais (BNP, do inglês Brain natriuretic peptide) têm
propriedades natriuréticas, diuréticas e também são eficazes no controlo do funcionamento do
sistema cardiovascular. O proBNP é segregado principalmente ao nível do ventrículo esquerdo,
que posteriormente se dissocia em BNP (fisiologicamente ativo), e no fragmento N-terminal
proBNP (NT-proBNP), que pode ser utilizado para fins de diagnóstico, prognóstico e
estratificação do risco em doentes com síndromes coronários agudos e insuficiência cardíaca.
A determinação do NT-proBNP ajuda a identificar indivíduos com disfunção no ventrículo
esquerdo, que pode ocorrer devido a uma doença coronária, hipertensão arterial, doença
valvular e doença primária do miocárdio, insuficiência cardíaca crónica. Nestes casos, ambas
as concentrações de BNP e NT-proBNP aumentam. Também se verifica um aumento dos níveis
de NT-proBNP em doentes com angina instável e após EAM [20].
Tabela 3. Marcadores bioquímicos após situação de EAM sem complicações (Adaptado
de [17-19]).
EAM: enfarte agudo do miocárdio; CKMB: isoenzima MB da creatina cinase.
Marcadores
Bioquímicos
Aumento após a
EAM Pico
Regresso aos Valores
Basais
Mioglobina 1-3h 6-12h 24-36h
CKMB 4-8h 12-24h 48h
Troponina I 4-8h 12-16h 5-9 dias
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Mioglobina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [17].
Método: Imunoensaio enzimático.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a mioglobina (MYO), formando um complexo partícula/MYO.
O que não se ligou é removido. Posteriormente, o complexo é incubado com o conjugado
(anticorpos monoclonais específicos para a MYO marcados com β-galactosidase). O que não
se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico
CPRG. A hidrólise do substrato liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de MYO
presente na amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação
do CPR, medida a 577nm [17].
Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000 ng/mL [µg/L] [17]
Valores de Referência: Homem 16 – 96 ng/mL [µg/L]; Mulher 9 – 82 ng/mL [µg/L]
Isoenzima MB da Creatina Cinase
Amostra: Soro, plasma EDTA4 (ácido etilenodiaminotetracético) ou heparinizado [18].
Método: Imunoensaio enzimático.
4 Anticoagulante EDTA K3 é um quelante de cálcio ionizado (Ca2+). O facto de deixar de haver cálcio disponível para a cascata
da coagulação, leva a que o sangue não coagule. Assegura a conservação das células até 24h após a colheita, a 4ºC, e a sua
morfologia até 2h após a colheita.
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Relatório de Estágio
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A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a subunidade CKMB e um conjugado (anticorpos monoclonais
específicos para a isoenzima CKMB marcados com β-galactosidase). O que não se ligou é
removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico CPRG. A
hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de CKMB presente na
amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação do CPR,
medido a 577nm [18].
Intervalo de Medição Analítica: 0.5 – 300ng/mL [µg/L] [18]
Valores de Referência: 0.00 – 3.6ng/mL
Troponina I Cardíaca
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [19].
Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®5.
Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti-
troponina I e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads que contém esferas revestidas
com estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas
revestidas com um anticorpo monoclonal anti-troponina I e um corante quimioluminescente.
A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo biotinilado formando uma uma
sandwich esfera/troponina I/anticorpo biotinilado. Posteriormente, o reagente Sensibeads é
adicionado e liga-se à biotina formando imunocomplexos. A iluminação do complexo a 680nm
produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para o
5 LOCI®: Imunoensaio luminescente de canalização de oxigénio, do inglês Luminescent oxygen channeling immunoassay.
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reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é
medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração da troponina I presente na
amostra [19].
Intervalo de Medição Analítica: 0.017 – 40ng/mL [µg/L] [19]
Valores de Referência: 0.000 – 0,056ng/mL [µg/L]
N-terminal pro-péptido natriurético cerebral
Amostra: Soro ou plasma EDTA ou heparinizado [20].
Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®.
Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti-
NT-proBNP e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads contém esferas revestidas com
estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas
revestidas com um anticorpo específico para um segundo epítopo no NT-proBNP e um corante
quimioluminescente. A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo
biotinilado para formar uma sandwich esfera/NTP/anticorpo biotinilado. O Sensibeads é
adicionado e liga-se à biotina para formar imunocomplexos. A iluminação do complexo a
680nm produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para
o reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é
medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração de NT-proBNP na amostra
[20].
Intervalo de Medição Analítica: 5 – 35000pg/mL [20]
Valores de Referência: 0 – 125pg/mL
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7.1.4. Avaliação da Função Renal
O rim é responsável pela formação de urina, regulação do equilíbrio hidro-eletrolítico e
ácido-base, excreção de produtos do metabolismo, assim como também é responsável pela
produção de hormonas e de vitamina D [21].
A ureia, creatinina e o ácido úrico são compostos azotados não proteicos e são
considerados marcadores endógenos mais frequentemente utilizados na avaliação da função
renal e na discriminação entre alterações pré-renal, pós-renal ou renais [22].
A ureia, por vezes referida como BUN (Blood Urea Nitrogen), constitui o principal
produto do catabolismo oxidativo proteico, responsável pela excreção de mais de 75% do azoto
não proteico. No figado, as proteínas são degradadas a aminoácidos que sofrem reação de
desaminação, formando amónia, que é rapidamente convertida a ureia (ciclo da ureia), para
evitar a toxicidade, sendo posteriormente transportada no sangue até aos rins onde é filtrada
livremente pelo glomérulo. Em condições normais, 40 a 50% é reabsorvida ao nível do túbulo
proximal [22].
Uma ampla variedade de doenças renais e fatores não-renais podem levar ao aumento
dos níveis de ureia em circulação, limitando a sua utilização como indicador da função renal.
A sua concentração no sangue é condicionada pela função e perfusão sanguínea renal, fluxo
urinário, distúrbios pós-renais, assim como pelo teor proteico da dieta, catabolismo proteico,
hemorragia gastro-intestinal, estado de hidratação, jejum prolongado e lesão hepática grave [22].
A creatinina, marcador clássico do volume de filtração glomerular, resulta da
degradação não enzimática da creatina no músculo. A quantidade de creatinina endógena
produzida é proporcional à massa muscular, por isso varia em função da idade e do sexo, não
sofrendo grandes alterações com a dieta. A sua taxa de excreção, na ausência de doença renal
ou pós-renal, é relativamente constante, correlacionando-se com a produção endógena. É
filtrada pelo glomerulo e praticamente não é reabsorvida pelos túbulos renais, contudo, a sua
concentração também depende da secreção tubular proximal (7- 10%) [22]. A nível sérico, a
concentração de creatinina só se altera quando a função renal apresenta uma redução de pelo
menos 30% do volume de filtração glomerular [23], sendo por isso considerado um parâmetro
mais estável e especifico do que a ureia na avaliação da função renal [24].
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O ácido úrico é sintetizado no fígado, e constitui o produto final do metabolismo das
purinas, e a excreção é feita ao nível dos rins, sendo excretada apenas 6-12% da quantidade
filtrada. Em líquidos corporais supersaturados, o urato monossódico precipita e deposita-se nas
articulações e tecidos, sendo responsável pelo aparecimento de sinais e sintomas clínicos. A
deposição de cristais de urato pode levar ao aparecimento de artrite gotosa, nefrolitíase,
deposição intratubular aguda de cristais de urato ou nefropatia gotosa [22].
A hiperuricémia pode ser atribuída a defeitos enzimáticos específicos na via do
metabolismo das purinas (embora seja raro), doença renal, síndrome mieloproliferativo e
terapêuticas citotóxicas. A hipouricémia, pode ser secundária a doença hepatocelular grave,
defeitos na reabsorção tubular renal e tratamento para a hiperuricémia [22].
Ureia
Amostra: Soro, plasma ou urina [25].
Método: Enzimático.
A urease hidrolisa a ureia com formação de amónia e dióxido de carbono. A amónia é
utilizada pela enzima glutamato desidrogenase (GLDH) para aminar por redução o α-
cetoglutarato (α-KG), com oxidação simultânea da forma reduzida da nicotinamida adenina
dinucleótido (NADH). A redução da absorvência, pelo desaparecimento da NADH, é
diretamente proporcional à concentração de ureia na amostra, medida utilizando uma técnica
cinética bicromática (340, 383nm) [25].
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 150mg/mL [0 – 53.5mmol/L] [25]
Valores de Referência: Soro: 7 – 18mg/dL [2.5 – 6.4mmol/L]; Urina: 7 – 20g/24h [249
– 714mmol/24h]
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57
Creatinina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [24].
Método: Técnica cinética de Jaffé modificada.
Na presença de NaOH, o picrato reage com a creatinina para formar um cromóforo
vermelho. O aumento da absorvência, causada pela formação deste cromóforo, é diretamente
proporcional à concentração de creatinina na amostra, medida utilizando uma técnica cinética
bicromática (510, 600nm). A bilirrubina é oxidada pelo ferricianeto de potássio para evitar
interferências [24].
Intervalo de Medição Analítica: Soro ou plasma: 0.15 – 20.00mg/dL [13 –
1768µmol/L]; Urina: 5.00 – 400.00mg/dL [442 – 35360µmol/L] [24]
Valores de Referência: Soro ou plasma: Homens: 0.70 – 1.30mg/dL [62 – 115µmol/L];
Mulheres: 0.55 – 1.02mg/dL [49 – 90µmol/L]; Urina: Homens: 0.95 – 2.49g/24h [8.4 –
22.0mmol/24h]; Mulheres: 0.60 – 1.80g/24h [5.3 – 15.9mmol/24h]
Ácido Úrico
Amostra: Soro, plasma ou urina [26].
Método: Método da uricase modificado.
O ácido úrico que absorve a 293nm é convertido pela uricase em alantoína, que não
absorve neste comprimento de onda. A diminuição da absorvência é diretamente proporcional
à concentração de ácido úrico presente na amostra, medida utilizando uma técnica bicromática
de ponto final (293, 700nm) [26].
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58 Leticia de Bastos
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 20.0mg/dL [0 – 1190µmol/L] [26]
Valores de Referência: Soro: Mulher 2.6 – 6.0mg/dL [155 – 357µmol/L]; Homem 3.5
– 7.2mg/dL [208 – 428µmol/L]; Urina: 150 – 990mg/24h [0.89 – 5.89mmol/24h]
7.1.5. Avaliação da Função Pancreática
O pâncreas é uma glândula composta por tecido endócrino, responsável pela produção
de hormonas envolvidas no metabolismo dos hidratos de carbono e tecido exócrino que produz
suco pancreático e muitas enzimas digestivas, nomeadamente -amilase e lipase [27].
A lipase, sintetizada essencialmente no pâncreas, também pode ser secretada pela
língua, mucosa gástrica, pulmonar e intestinal. A sua determinação é utilizada no diagnóstico
de distúrbios pancreáticos como, por exemplo, pancreatite aguda e crónica, alterações intra-
abdominais agudas, obstrução do canal pancreático e neoplasia pancreática [28].
A amilase é secretada, fundamentalmente, pelas glândulas salivares e pelo pâncreas.
A sua determinação é principalmente utilizada para o diagnóstico e avaliação do tratamento de
pancreatite aguda e crónica, abcesso pancreático, lesões traumáticas e carcinoma pancreático.
No entanto, também pode apresentar valores elevados em patologias não-pancreáticas,
designadamente na insuficiência renal, tumor pulmonar, derrame pleural, apendicite, peritonite
e doenças das glândulas salivares [28].
Lipase
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [30].
Método: Adaptação do método colorimétrico descrito por Neumann et al.
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59
Este método utiliza como substrato o éster de 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-ácido
glutárico-(6'-metilresorufina) que é hidrolisado pela lipase em pH alcalino, na presença de
colipase, sais biliares e cloreto de cálcio, produzindo 1,2-O-dilauril-rac-glicerol e éster de ácido
glutárico-6'-metilresorufina. O éster de ácido glutárico-6'-metilresorufina fragmenta-se e
produz metilresorufina, um composto cromogénico livre que é proporcional à atividade da
lipase na amostra. A taxa de produção de metilresorufina é medida por uma técnica cinética
bicromática (577, 700nm) [30].
Intervalo de Medição Analítica: 10 -1500U/L [30]
Valores de Referência: 73 – 393U/L
Alfa-amilase
Amostra: Soro, plasma heparinizado ou urina [31].
Método: Enzimático.
A α-amilase catalisa a hidrólise de um substrato sintético, o 2-cloro-4-nitrofenil-a-D-
maltotriósido (CNPG3), para produzir 2-cloro-4-nitrofenol (CNP), 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-
maltósido (CNPG2), maltotriose (G3) e glicose. Após uma incubação a 37°C, a formação do
CNP é proporcional à atividade da amilase, medida utilizando uma técnica cinética bicromática
(405, 577nm) [31].
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 650U/L [31]
Valores de Referência (37ºC): Soro: 25 – 115U/L; Urina: 59 – 401U/24h
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60 Leticia de Bastos
7.1.6. Avaliação da Função Hepática
O fígado é um órgão complexo com grande capacidade funcional e de regeneração
celular. Desempenha um papel fundamental no metabolismo, síntese de proteínas plasmáticas
(exceto imunoglobulinas), armazenamento de ferro, glicogénio, lípidos e vitaminas;
desintoxicação de xenobióticos e excreção de produtos metabólicos [32].
As análises laboratoriais para avaliação da função hepática são baseadas na avaliação
da síntese, de algumas funções de excretoras e na determinação da atividade das enzimas
hepáticas libertadas para a circulação [32].
As transaminases são enzimas intracelulares presentes em grandes quantidades nos
hepatócitos, embora amplamente distribuídas no organismo. A alanina aminotransferase (ALT
ou transaminase glutâmica-pirúvica, GPT) encontra-se principalmente ao nível do citoplasma,
enquanto que a aspartato aminotransferase (AST ou transaminase glutâmica-oxalacética, GOT)
possui duas isoenzimas, a citoplasmática e a mitocôndrial, sendo que a mitocôndrial apenas
surge em circulação quando a lesão hepática é mais grave. Assim quando a lesão hepática é
ligeira, a enzima libertada para o sangue é essencialmente a que está presente no citoplasma.
Deste modo, em situações agudas a razão de Ritis, AST/ALT é menor que 1 e em situações de
doença crónica esta razão é superior a 1 [33].
Observam-se elevações significativas das transaminases, por vezes mesmo antes do
aparecimento clínico da icterícia, nas doenças hepáticas como a hepatite, necrose, icterícia e
cirrose [34]. Também podem estar elevadas na mononucleose infeciosa, colestase extra-hepática
aguda, embolia pulmonar, pancreatite aguda [29]. A ALT apresenta uma maior atividade que a
AST na hepatite alcoólica, cirrose hepática, carcinoma hepático e consumo de certas drogas ou
fármacos [34].
A AST também pode estar aumentada noutras patologias, como EM, ICC, distrofias
musculares, dermatomiosite ou nas patologias do músculo esquelético [34].
A fosfatase alcalina (ALP, do inglês alkaline phosphatase) está presente em
praticamente todos os tecidos do organismo, especialmente ao nível das membranas celulares,
ocorrendo em níveis particularmente elevados ao nível do fígado, epitélio intestinal, túbulos
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61
renais, osso (osteoblastos) e placenta. Contudo, as formas presentes em circulação têm origem
no sistema hepatobiliar e no esqueleto [35].
A ALP aumenta em resposta à obstrução biliar, uma vez que os principais locais de
síntese ocorrem nos hepatócitos adjacentes aos canalículos biliares. A elevação tende a ser mais
marcante nas obstruções extra-hepáticas do que na intra-hepáticas, e será tanto maior quanto
mais completa for a obstrução. Também se verifica um aumento moderado em situações de
hepatite viral. Relativamente às doenças ósseas, observam-se níveis elevados da atividade da
fosfatase alcalina na doença de Paget, síndrome de Fanconi, hiperparatiroidismo e cancros
ósseos. Verifica-se ainda um aumento fisiológico desta enzima no crescimento ósseo e na
gravidez [35].
A gama-glutamil transferase (GGT) está presente na membrana citoplasmática de todas
as células, exceto no músculo. No entanto, quando presente em circulação é essencialmente
proveniente do sistema hepatobiliar, apresentando valores elevados em todas as formas de
doença hepática, especialmente na obstrução biliar, sendo mais sensível que a fosfatase alcalina
em situações de icterícia obstrutiva, colangite e colecistite [36]. Também se observam valores
aumentados em situações de hepatite viral ou medicamentosa, pancreatite, corticoterapia e
metástase hepáticas [34].
Assim, o doseamento da GGT é útil para diferenciar causas de elevação da ALP,
apresentando valores normais na gravidez, crescimento e patologias de carácter ósseo [36].
A bilirrubina que resulta do catabolismo do grupo heme, cerca de 85% deriva da
hemoglobina e os restantes 15% são provenientes dos percursores dos eritrócitos, mioglobina,
citocromos e peroxidase [37]. O grupo heme é metabolizado no sistema reticuloendotelial, dando
origem à bilirrubina não conjugada (insolúvel em água). Esta é ligada à albumina e transportada
para o fígado onde é conjugada com ácido glucorónico. A bilirrubina conjugada (direta ou
hidrossolúvel) passa para os canalículos biliares sendo eliminada através do aparelho digestivo.
Uma parte é reabsorvida, voltando ao fígado, onde é excretada na bílis e a outra parte é filtrada
para a urina [32].
O doseamento das bilirrubinas é útil no diagnóstico diferencial, tratamento e
monitorização de doenças ou alterações hepatobiliares e colestáticas, doenças genéticas,
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metabólicas e hemolíticas [38, 39]. Sendo também muito importante o seu doseamento na
avaliação da icterícia do recém-nascido.
A amónia, que resulta do catabolismo dos aminoácidos, em circunstâncias normais é
metabolizada em ureia por enzimas hepáticas. Contudo, várias doenças e distúrbios metabólicos
produzem um excesso de amónia, que tem efeitos tóxicos para o sistema nervoso central (SNC).
As deficiências hereditárias de enzimas do ciclo da ureia são a principal causa de
hiperamonémia em crianças. As causas adquiridas resultam frequentemente de insuficiência
hepática ou renal e síndrome de Reye [40].
Aspartato Aminotransferase
Amostra: Soro ou plasma [41].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela Federação Internacional de
Química Clínica (IFCC, do inglês International Federation of Clinical Chemistry).
A AST catalisa a transaminação do L-aspartato em α-cetoglutarato, formando L-
glutamato e oxalacetato. O oxalacetato é reduzido para malato pela malato desidrogenase
(MDH) com oxidação simultânea da forma reduzida do NADH. A redução da absorvência
devida à conversão de NADH em NAD+, é diretamente proporcional à atividade da AST,
medida utilizando uma técnica cinética bicromática (340, 700nm) [41].
Intervalo de Medição Analítica: 6 – 1000U/L [41]
Valores de Referência: 15-37U/L
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Alanina Aminotransferase
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [42].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC. Este método utiliza o
piridoxal-5-fosfato (P5P) como ativador enzimático.
A ALT catalisa a transaminação de L-alanina em α-KG, formando L-glutamato e
piruvato. O piruvato formado é reduzido para lactato pela desidrogenase láctica (LDH, do inglês
lactate dehydrogenase) com oxidação simultânea da forma reduzida do NADH. A redução da
absorvência é diretamente proporcional à atividade da ALT, medida utilizando uma técnica
cinética bicromática (340, 700nm) [42].
Intervalo de Medição Analítica: 6 – 1000U/L [0.10 – 16.70µkat/L] [42]
Valores de Referência: Mulheres: 14 – 59U/L [0.24 – 0.99µkat/L]; Homens: 16 –
63U/L [0.27 – 1.05µkat/L]
Fosfatase Alcalina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [43].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37ºC.
A ALP catalisa a transfosforilação do p-nitrofenilfosfato (p-NPP) em p-nitrofenol (p-
NP), na presença do tampão transfosforilante, 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). A reação é
melhorada com a utilização de iões de magnésio e zinco. A variação da absorvência pela
formação de p-NP é diretamente proporcional à atividade da ALP, sendo medida utilizando
uma técnica cinética bicromática (405, 510nm) [43].
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Intervalo de Medição Analítica: 10 – 1000U/L [0.17 – 16.70µkat/L]
Valores de Referência: 46 – 116U/L [0.77 – 1.90µkat/L]
Gama-Glutamil Transferase
Amostra: Soro ou plasma [44].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC.
A GGT catalisa a transferência da glutamil da γ-glutamil-3-carboxi-4-nitranilida
(GCNA) para a glicilglicina, com libertação do 5-amino-2-nitrobenzoato, medido utilizando
uma técnica de cinética bicromática (405, 600nm), sendo proporcional à atividade da GGT [44].
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 800U/L [44]
Valores de Referência: Mulheres 5 – 55U/L; Homens 15 – 85U/L
Bilirrubina Total
Amostra: Soro, plasma EDTA ou heparinizado [38].
Método: Adaptação do método diazo, descrito por Jendrassik e Grof.
A bilirrubina (não conjugada) na amostra é solubilizada por diluição numa mistura de
cafeína/benzoato/acetato/EDTA. Com a adição de ácido sulfanílico diazotado, a bilirrubina
solubilizada, incluindo a bilirrubina conjugada, é convertida em diazo-bilirrubina, um
cromóforo vermelho, medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540, 700nm),
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que é proporcional à concentração de bilirrubina total presente na amostra. Nesta técnica é
utilizado um branco de amostra para eliminar a interferência de outros pigmentos que não a
bilirrubina [38].
Intervalo de Medição Analítica: 0.1 – 25.0mg/dL [2 – 428µmol/L] [38]
Valores de Referência: 0.2 – 1.0mg/dL [3 – 17µmol/L]
Bilirrubina Direta
Amostra: Soro, plasma EDTA ou heparinizado [39].
Método: Adaptação do método diazo, descrito por Jendrassik e Grof.
A amostra é diluída em HCl 0.5M. É efetuada uma leitura de um branco de amostra para
eliminar a interferência de outros pigmentos que não a bilirrubina. Com a adição de ácido
sulfanílico diazotado, a bilirrubina conjugada é convertida em diazo-bilirrubina, um cromóforo
vermelho, medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540, 700nm), que é
proporcional à concentração de bilirrubina direta presente na amostra [39].
Intervalo de Medição Analítica: 0. 05 – 16.0mg/dL [0.86 – 274µmol/L] [39]
Valores de Referência: 0.0 – 0.2mg/dL [0 – 3µmol/L]
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Amónia
Amostra: Plasma EDTA ou heparinizado. O tubo deve ser conservado em gelo e
centrifugado de imediato, devendo ser analisada no espaço de 30 minutos após a centrifugação.
Se o plasma for separado e refrigerado (2-8°C), permanece estável 2h [45].
Método: Enzimático.
A amónia (NH4+) reage com α-cetoglutarato e o cofactor reduzido, que na presença da
GLDH irá formar L-glutamato e o cofactor oxidado. A diminuição da absorvência pela
oxidação do cofactor é monitorizada a 340/700nm, sendo proporcional à concentração de
amónia presente na amostra [45].
Intervalo de Medição Analítica: 17 – 1277μg/dL [10 – 750μmol/L] [45]
Valores de Referência: 19 – 54μg/dL [11 – 32μmol/L]
7.1.7. Avaliação da Glicémia
As medições de glucose são utilizadas no diagnóstico e tratamento de distúrbios do
metabolismo dos hidratos de carbono, tais como a diabetes mellitus, gestacional,
endocrinopatias diversas, diabetes induzida por químicos ou fármacos, hipoglicémia neonatal
e o insulinoma [46].
A causa mais frequente de hiperglicémia é a diabetes mellitus, originada pelo défice de
secreção ou da ação da insulina. Outros fatores secundários podem contribuir para a existência
de níveis altos de glicose, como a pancreatite, disfunção da tiroide, a insuficiência renal e
hepatopatias [46].
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67
Relativamente à hipoglicémia, pode surgir por um jejum prolongado, ou ser secundária
a outras patologias, tais como o insulinoma, deficiências enzimáticas congénitas ou hormomais,
disfunção hepática severa, falência renal crónica ou induzida pelo excesso de insulina.
A determinação da glucose na urina (glicosúria), pode ser utilizado para o despiste e/ou
monitorização da diabetes mellitus e para detetar defeitos tubulares renais [47].
Amostra: Soro, plasma, urina e LCR [47].
Método: Adaptação do método da hexoquinase.
A hexocinase (HK) catalisa a fosforilação da glucose na presença de adenosina trifosfato
(ATP) e magnésio, formando glicose-6-fosfato e adenosina difosfato (ADP). A glicose-6-
fosfato é então oxidada pela glucose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH) na presença de NAD+
para produzir 6-fosfogliconato e NADH. A absorvência é determinada utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (340, 383nm). A quantidade de NADH produzida é diretamente
proporcional à quantidade de glucose presente na amostra [47].
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 500mg/dL [0 – 27.8mmol/L] [47]
Valores de Referência: Soro: 74 – 106mg/dL [4.1 – 5.9mmol/L]; LCR: 40 – 70mg/dL
[2.2 – 3.9mmol/L]; Urina tipo II: 1 – 15mg/dL [0.1 – 0.8mmol/L]; Urina: <0.5 g/24h [<
2.8mmol/24h]
7.1.8. Avaliação do Metabolismo Lipídico
Os lípidos e as lipoproteínas em circulação têm sido fortemente associados a doença
coronária, distúrbios associados ao metabolismo lipídico e aterosclerose [48]. Deste modo, é
fundamental efetuar-se o diagnóstico da dislipidémia, através da análise do colesterol total,
triglicéridos, colesterol das lipoproteínas de alta densidade (HDL, do inglês high density
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lipoprotein) e colesterol das lipoproteínas de baixa densidade (LDL, do inglês low density
lipoprotein), após um jejum de 12h. Os resultados devem ser confirmados com uma segunda
determinação realizada com um intervalo de mínimo de 4 semanas e antes de se iniciar qualquer
terapêutica. As dislipidémias podem ser primárias, em que há uma interação entre uma
predisposição genética e fatores ambientais, ou secundária, isto é, relacionada com outras
doenças [49].
O colesterol é o principal componente das membranas celulares, mas também atua como
precursor de muitas moléculas sinalizadoras, incluindo hormonas esteroides e cortisol. Uma
parte é proveniente da dieta, mas a maioria é de síntese endógena. Na corrente sanguínea, é
transportado e solubilizado essencialmente por duas lipoproteínas, as HDL e as LDL [48]. A sua
concentração ao nível sérico depende de muitos fatores, tais como a idade, sexo, estilo de vida
e outras doenças existentes.
As HDL têm como principal função transportar o colesterol dos tecidos periféricos para
o fígado, onde é metabolizado, sendo considerado um mecanismo de proteção contra doenças
cardiovascular. A sua determinação é útil na identificação de doentes em risco de doença
aterosclerótica [48].
O colesterol das LDL fornece a principal fonte de substrato para a síntese de hormonas
esteroides, no entanto quando presente em níveis elevados ocorre a deposição de colesterol na
parede das artérias, podendo levar à aterosclerose [48].
A hipercolesterolémia familiar é a forma mais comum e a mais grave de todas as
hipercolesterolémias sendo causada maioritariamente por defeitos no gene do recetor das LDL,
cuja função é a remoção do colesterol-LDL do plasma. O diagnóstico é geralmente baseado
num conjunto de critérios clínicos, bioquímicos e na história familiar de hipercolesterolémia e
de doença cardiovascular prematura [49].
A hipercolesterolémia secundária pode ser causada por hipotiroidismo, síndrome
nefrótico, gravidez, síndrome de Cushing, anorexia nervosa, agentes imunossupressores e
terapêutica com corticosteroide [49].
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69
Quanto aos triglicéridos, uma fração é obtida na dieta e outra é sintetizada pelo fígado,
circulando no organismo ligados as lipoproteínas [48]. A determinação de triglicéridos é útil no
diagnóstico de dislipidémias.
A hipertrigliceridémia pode ter origem genética (hipertrigliceridémia familiar), ou ser
secundária ao consumo de álcool, dieta rica em hidratos de carbono simples, obesidade, diabetes
mellitus, hipotiroidismo, doença renal, gravidez, doenças autoimunes e terapia com
corticosteroides, estrogénios (especialmente os administrados oralmente), ciclosporina e
antirretrovirais [49]. A avaliação dos triglicéridos deve ser feita em conjunto com o restante perfil
lipídico.
Colesterol Total
Amostra: Soro ou plasma [50].
Método: Enzimático.
A esterase do colesterol (CE) catalisa a hidrólise dos ésteres de colesterol para produzir
colesterol livre que, juntamente com o colesterol livre pré-existente, é oxidado numa reação
catalisada pela colesterol oxidase (CO) para formar colest-4-eno-3-ona e peróxido de
hidrogénio. Na presença da peroxidase (HPO), o peróxido de hidrogénio irá oxidar a N,N-
dietilanilina-HCl/4-aminoantipirina (DEA-HCl/AAP), produzindo um cromóforo. A
absorvência é medida utilizando uma técnica policromática de ponto final (452, 540, 700nm),
sendo diretamente proporcional à concentração de colesterol total presente na amostra [50].
Intervalo de Medição Analítica: 50-600mg/dL [1.3 – 15.5mmol/L] [50]
Valores de Referência: Desejável <200mg/dL [5.2mmol/L]; Acima da média: 200-
239mg/dL [5.2 – 6.2mmol/L]; Elevado: ≥ 240mg/dL [6.2mmol/L]
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Colesterol-HDL
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [51].
Método: Enzimático.
Na primeira reação as quilomicras, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL, do
inglês very low density lipoprotein) e as LDL formam, na presença de sulfato de magnésio,
complexos hidrossolúveis com o sulfato de dextrano, tornando-os resistentes à ação das
enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase modificadas pelo PEG, que reagem com o
colesterol-HDL. Na presença de oxigénio, o colesterol-HDL é oxidado pela com produção de
peróxido de hidrogénio. O peróxido de hidrogénio reage com a 4-aminoantipirina e a N-(2-
hidroxi-3-sulfopropil)-3.5-dimetoxianilina sódica (HSDA), que na presença de peroxidase irá
firmar um composto colorido que é medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final
(600, 700nm). A intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração sérica do
colesterol-HDL [51].
Intervalo de Medição Analítica: 3 – 150mg/dL [0.08 – 3.89 mmol/L] [51]
Valores de Referência: Colesterol-HDL baixo <40mg/dL [1.04mmol/L]; Colesterol-
HDL alto ≥60mg/dL [1.55mmol/L]
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Colesterol-LDL
O colesterol-LDL é calculado pela Fórmula de Friedewald, se os triglicéridos forem
inferiores a 400 mg/dL:
Colesterol-LDL(mg/dL)= Colesterol Total – (colesterol-HDL+ 𝑇𝑟𝑖𝑔𝑙𝑖𝑐é𝑟𝑖𝑑𝑜𝑠
5 )
Para valores de Triglicéridos ≥400 mg/dL a fórmula não pode ser aplicada, pelo que tem
de ser efetuada a determinação laboratorial (efetuado no Laboratório Central).
Triglicéridos [52]
Amostra: Soro ou plasma [52].
Método: Enzimático.
A amostra é incubada com um reagente enzimático, a lipoproteína lipase (LPL), que
converte os triglicéridos em glicerol livre e ácidos gordos. A glicerol cinase (GK) catalisa a
fosforilação do glicerol pela ATP para glicerol-3-fosfato. A glicerol-3-fosfato-oxidase (GPO)
oxida o glicerol-3-fosfato para fosfato de di-hidroxiacetona e peróxido de hidrogénio (H2O2).
A ação catalítica da peroxidase (POD) forma quinoneimina a partir de H2O2, aminoantipirina e
4-clorofenol. A variação da absorvência pela formação de quinoneimina é diretamente
proporcional à quantidade de glicerol presente na amostra, que corresponde ao teor de
triglicéridos. A absorvência é medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (510,
700nm) [52].
Intervalo de Medição Analítica: 15 – 1000mg/dL [0.17 – 11.3mmol/L] [52]
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Valores de Referência: Normal <150mg/dL [< 1.70mmol/L]; Acima da linha limite
150 – 199mg/dL [1.70 – 2.25mmol/L]; Elevada 200 – 499mg/dl [2.26 – 5.64mmol/L]; Muito
alta ≥ 500mg/dL [≥ 5.65mmol/L]
7.1.9. Avaliação das Proteínas
As proteínas plasmáticas são sintetizadas sobretudo no fígado, células plasmáticas,
gânglios linfáticos, baço e medula óssea. O doseamento das proteínas totais no soro é utilizado
no diagnóstico e tratamento de diversas patologias que envolvem o fígado, rim ou medula óssea,
assim como perturbações metabólicas ou nutricionais [53].
A hipoproteinémia deve-se, essencialmente, à hemodiluição ou diminuição da
concentração de uma ou mais proteínas especificas no plasma. A hiperproteinémia ocorre em
casos de desidratação grave (hemoconcentração) ou por aumento da concentração de uma ou
mais proteínas especificas no plasma [54].
A determinação das proteínas totais na urina e no líquido cefalorraquidiano é utilizada
no diagnóstico e tratamento de doenças renais e do SNC, respetivamente [55].
A albumina, sintetizada pelo fígado, é a proteína presente em maior concentração no
plasma. Tem como principal função o transporte de diversos componentes, nomeadamente o
cálcio, ácidos gordos, bilirrubina, hormonas, vitaminas e fármacos. É igualmente importe na
manutenção da pressão osmótica coloidal [56].
A hipoalbuminémia pode dever-se a hiper-hidratação, reações de fase aguda,
analbuminémia congénita, doença renal, hepática, má nutrição ou dieta pobre em proteínas [57].
Proteínas Totais
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [53].
Método: Adaptação do método do Biureto. Este método incorpora o tartarato como um
agente complexante para evitar a precipitação de Cu(OH)2.
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O ião de cobre (Cu2+) reage com as ligações peptídicas da proteína, numa solução básica,
formando um complexo proteíco de cobre (II) azul que é proporcional à concentração de
proteína total na amostra, sendo medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540,
700nm) [53].
Intervalo de Medição Analítica: 2.0 – 12.0g/dL [20 – 120g/L] [53]
Valores de Referência: 6.4 – 8.2g/dL [64 – 82g/L]
Proteínas Urinárias/Líquido Cefalorraquidiano [55]
Amostra: Urina e LCR [55].
Método: Adaptação do método vermelho de pirogalolmolibdato.
O vermelho de pirogalolmolibdato de sódio, que absorve a 470nm, reage com a proteína
presente na amostra, em solução ácida, formando um complexo azul arroxeado que absorve a
600nm e que é diretamente proporcional à concentração de proteína na amostra [55].
Intervalo de Medição Analítica: 6 – 250mg/dL [60 – 2500mg/L] [55]
Valores de Referência: Urina <11.9mg/dL, <149.1mg/dia [<119mg/L]; LCR 15 –
45mg/dL [150 – 450mg/L]
Albumina
Amostra: Soro ou plasma [57].
Método: Adaptação do método púrpura de bromocresol (BCP).
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74 Leticia de Bastos
Na presença de um agente solubilizante, o BCP liga-se com elevada especificidade à
albumina a um pH de 4.9. A formação do complexo é medida utilizando uma técnica
policromática de ponto final (600, 540, 700nm), sendo directamente proporcional à
concentração de albumina presente na amostra [57].
Intervalo de Medição Analítica: 0.6 – 8.0g/dL [6 – 80g/L] [57]
Valores de Referência: 3.4 – 5.0g/dL [34 – 50g/L]
7.1.10. Avaliação da Gonadotrofina Coriónica Humana
A gonadotrofina coriónica humana (hCG) é uma glicoproteína produzida pela placenta
imediatamente após a implantação de um óvulo fertilizado na parede uterina. A hCG no soro
começa a aumentar pouco tempo depois da conceção, tornando-a um excelente marcador para
a confirmação e monitorização da gravidez [58]. Fisiologicamente, a hCG é vital para a
manutenção e promoção da secreção de progesterona pelo corpo lúteo no início da gravidez e
na sustentação do endométrio [59].
Amostra: Soro ou plasma [60].
Método: Imunoensaio enzimático.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos
monoclonais específicos para a subunidade α da hCG, formando imunocomplexos. Todo o que
não se ligou é removido. Posteriormente, os imunocomplexos são incubados com o conjugado
(anticorpos monoclonais específicos para a subunidade β da hCG marcados com β-
galactosidase). O conjugado que não se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada
com o substrato cromogénico CPRG que catalisa a hidrólise do substrato em CPR. A
absorvência é medida a 577/700nm, sendo diretamente proporcional à concentração de hCG na
amostra [60].
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75
Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000mIU/mL [IU/L] [60]
Valores de Referência: Mulher não grávida (22-87anos): 0-6mIU/mL [IU/L]; Homem
adulto (19-83anos): 0-2mIU/mL [IU/L]. Na gravidez, aumenta rapidamente na primeira semana
de gestação, duplicando aproximadamente a cada dois dias, atingindo um nível máximo entre
as 10-12 semanas, seguindo-se uma diminuição lenta no terceiro trimestre [60].
7.1.11. Avaliação da Desidrogenase Láctica
A desidrogenase láctica também designada de lactato desidrogenase, está presente no
citoplasma de todas as células, sendo mais abundante no miocárdio, rins, fígado, músculo e
eritrócitos. Uma pequena de lesões nos tecidos pode levar ao aumento significativo da LDH no
soro [61].
A LDH apresenta valores muito aumentados na anemia megaloblástica, carcinoma
metastático, hepatite viral e hipoxia. Embora com valores mais baixos, também se encontra
elevada no EAM, miocardite, ICC, anemia hemolítica e das células falciformes, hepatite não
viral, linfoma, pancreatite aguda, cirrose, icterícia obstrutiva, doença renal, doenças músculo-
esqueléticas e doenças neoplásicas [61].
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [62].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37°C.
Este método utiliza L-lactato tamponado a um pH de 9.4 como substrato. A LDH oxida
o substrato na presença de NAD+ para formar piruvato e NADH. A formação do NADH, medida
por uma recção de cinética a 340nm, é proporcional à atividade da lactato desidrogenase
presente na amostra [62].
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76 Leticia de Bastos
Intervalo de Medição Analítica: 6 – 1000U/L [0.10 – 16.70μkat/L] [62]
Valores de Referência: Homens: 85 – 227U/L [1.42 – 3.7μkat/L]; Mulheres: 81 –
234U/L [1.35 – 3.91μkat/L]
7.1.12. Avaliação da Creatina-Cinase
A creatina cinase (CK) é um dímero composto por 2 subunidades: a B, de brain
(cérebro) e a M, de muscle (músculo). Podem existir 3 pares diferentes de subunidades: BB,
MB e MM, que correspondem, respetivamente, à CK1, CK2 e CK3, classificadas de acordo
com a mobilidade eletroforética. A CK1, predomina no cérebro, próstata, intestino, pulmão,
bexiga, útero, placenta e tiroide, a CK2 encontra-se essencialmente no músculo cardíaco e a
CK3 no musculo cardíaco e esquelético [63].
A atividade da CK total, no soro, está sujeita a uma gama de variações fisiológicas,
estando dependente da massa muscular do indivíduo. Apresenta valores aumentados após lesão
muscular, exercício físico extenuante, doenças músculo-esqueléticas, particularmente na
distrofia muscular, EAM, isquemia cerebral, doença vascular cerebral aguda e traumatismo
craniano [63]. A sua determinação é útil não só no diagnóstico, como na monitorização do
tratamento.
Amostra: Soro, plasma EDTA ou heparinizado [64].
Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37°C.
A CK total, presente na amostra do doente, catalisa a transfosforilação do fosfato, do
fosfato de creatina para a ADP, produzindo ATP, que na presença de HK fosforila a glucose
levando à formação de glucose-6-fosfato, que será oxidada pela G-6-PDH, com a redução
simultânea da NADP+. A taxa de formação do NADPH é diretamente proporcional à atividade
da CK na amostra, medida bicromaticamente a 340 e 540nm [64].
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Intervalo de Medição Analítica: 7 – 1000U/L [0.12 - 16.67μkat/L] [64]
Valores de Referência: Homens: 39 – 308U/L [0.65 – 5.1µkat/L]; Mulheres: 26 –
192U/L [0.43 – 3.19µkat/L]
7.1.13. Metabolismo Mineral-Ósseo
O osso é constituído por células e matriz extracelular, que contém componentes minerais
e orgânicos. O mineral é constituído essencialmente por cálcio e fosforo, enquanto que a matriz
orgânica é composta essencialmente por colagénio [65].
As concentrações de cálcio, fósforo e magnésio em circulação são dependentes do
equilíbrio entre a velocidade de deposição do mineral ósseo, reabsorção óssea, absorção
intestinal e depuração renal [65].
O cálcio encontra-se essencialmente em três compartimentos: osso, tecido mole e
líquido extracelular. Em circulação, o cálcio pode estar na forma livre, ligado a proteínas (80%
ligado à albumina e o restante associado às globulinas) ou complexado. A nível extracelular, é
útil para fornecer iões para a manutenção do cálcio intracelular, mineralização óssea,
coagulação, manutenção do potencial de membrana citoplasmática, contração muscular,
atividade enzimática e secreção hormonal. Uma diminuição do cálcio livre em circulação pode
levar a excitabilidade neuromuscular aumentada e tetania, enquanto que o aumento dos seus
níveis diminui a excitabilidade muscular [65].
O fósforo, na sua forma de fosfato inorgânico, encontra-se amplamente distribuído no
organismo. No osso desempenha um papel importante no apoio estrutural do corpo e no
fornecimento de fosfato para os meios intra e extracelulares, faz parte da constituição dos ácidos
nucleicos, membranas fosfolipídicas, fosfoproteínas, assim como da NADP+. Os níveis de
fosfato são críticos para a atividade de vários sistemas enzimáticos, assim como na transcrição
de genes e crescimento celular [65].
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Relativamente ao magnésio, cerca de 55% encontra-se ao nível do esqueleto, 1% é
extracelular e o restante é intracelular. Do magnésio extracelular 55% encontra-se na forma
livre, 30% associado a proteínas (essencialmente à albumina) e 15% encontra-se complexado
[65].
O magnésio é fundamental para a atividade de muitas enzimas, no entanto também é
importante para a fosforilação oxidativa, glicólise, replicação celular, metabolismo nucleotídico
e biossíntese proteica. A nível extracelular fornece iões para a manutenção do magnésio
intracelular. A redução dos níveis de magnésio em circulação resulta no aumento da
excitabilidade neuromuscular, pois inibe competitivamente a entrada de cálcio para dentro dos
neurónios [65].
De um modo geral, a determinação do cálcio, fósforo inorgânico e magnésio é utilizada
no diagnóstico e tratamento de doença óssea, da paratiroide e renal. As causas do aumento e da
diminuição deste analítos, no soro, estão representados na tabela 4.
Cálcio Total [66]
Amostra: Soro ou urina [66].
Método: Modificação da reação do cálcio o-cresolftaleína complexona (OCPC). Este
método incorpora o 8-quinolinol para reduzir a interferência do magnésio e tampão de glicina
para controlo de pH.
O cálcio reage com a OCPC para formar um complexo de cor púrpura. A quantidade de
complexo formado é proporcional à concentração de cálcio, medido utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (577, 540nm) [66].
Intervalo de Medição Analítica: 5.0 – 15.0mg/dL [1.25 – 3.75mmol/L] [66]
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Valores de Referência: Soro: 8.5 – 10.1mg/dL [2.12 – 2.52mmol/L]; Urina: 42 –
353mg/24h [1.0 – 8.8mmol/24h]
Fósforo
Amostra: Soro, plasma EDTA, heparinizado ou urina [67].
Método: Modificação do método do fosfomolibdato.
O fósforo inorgânico (PO4-3) reage com molibdato de amónia na presença
de ácido sulfúrico para formar um complexo que é medido a 340nm. A quantidade de complexo
formado é proporcional à concentração de fósforo inorgânico presente na amostra [67].
Intervalo de Medição Analítica: Soro e plasma: 0.5 – 9.0mg/dL [0.16 – 2.91mmol/L];
Urina: 5.0 – 90.0mg/dL [1.61 – 29.07mmol/L] [67]
Valores de Referência: Soro e plasma: 2.6 – 4.7mg/dL [0.84 – 1.52mmol/L]; Urina:
0.4 – 1.3g/24h [12.9 – 42.0mmol/24h]
Magnésio
Amostra: Soro, plasma heparinizado ou urina [68].
Método: Modificação do método complexométrico do azul de metiltimol (MTB). A
interferência do cálcio é minimizada pela formação de um complexo com o sal de bário do
ácido etilenobis (oxietilenonitrilo) tetracético (Ba-EGTA) - agente quelante [68].
O MTB forma um complexo azul na presença de magnésio (Mg2+). A quantidade de
complexo formado é proporcional à concentração de magnésio, medido utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (600, 510nm) [68].
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Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 20.0mg/dL [0.00 – 8.22mmol/L] [68]
Valores de Referência: Soro: 1.8 – 2.4mg/dL [0.74 – 0.99mmol/L]; Urina: 24 –
255mg/24h [0.99 – 10.5mmol/24h]
Tabela 4. Causa do aumento e da diminuição do cálcio, fósforo e magnésio no soro
(Adaptado de [65]).
Parâmetros Aumento Diminuição
Cálcio
Hiperparatiroidismo primário
Hipertiroidismo
Insuficiência adrenal aguda
Doenças granulomatosas
Proteínas séricas aumentadas
Imobilização
Ingestão aumentada
Hipoalbuminémia
Insuficiência renal crónica
Défice de magnésio
Hipoparatiroidismo
Osteomalacia
Raquitismo
Fósforo
Insuficiência renal
Hipoparatiroidismo
Acromegalia
Ingestão aumentada
Acidose láctica
Acidose respiratória
Cetoacidose diabética não tratada
Rabdomiólise
Hemólise intravascular
Terapia citotóxica
Alcalose respiratória
Hiperparatiroidismo
Defeitos tubulares renais
Distúrbios gastrointestinais
Síndrome de má absorção
Cetoacidose
Magnésio
Ingestão excessiva
Insuficiência renal
Rabdomiólise
Hipercalcémia
Hipocalciúrica familiar
Distúrbios gastrointestinais
Doenças renais
Diabetes mellitus
Interações medicamentosas que levam à
perda renal
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7.1.14. Avaliação da Proteína C Reativa
A proteína C-reativa (PCR) é uma proteína sintetizada no fígado de “fase aguda
positiva” [69], sendo que a sua determinação é útil no diagnóstico presuntivo e monitorização de
um processo infecioso e/ou inflamatório [70].
Como é um parâmetro inespecífico o seu valor apenas deve ser interpretado em conjunto
com a história clínica do doente [69].
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [69].
Método: Imunoensaio turbidimétrico.
As partículas sintéticas revestidas com anticorpos específicos para a PCR agregam-se
na presença de PCR na amostra. O aumento de turvação devido à formação de imunocomplexos
é proporcional à concentração de PCR na amostra (absorve a 340nm) [69].
Intervalo de Medição Analítica [69]: [0.5 – 250.0mg/L] 0.05 – 25.00mg/dL
Valores de Referência: <0.3mg/dL [3mg/L]
7.1.15. Monitorização de Drogas Terapêuticas
A determinação dos níveis plasmáticos de determinado fármaco em circulação é
utilizada para a monitorização da terapêutica, assim como no diagnóstico e tratamento de
sobredosagens. Em determinadas situações também pode ser útil para averiguar o cumprimento
da terapêutica [71-78].
Digoxina
A digoxina é um glicósido cardíaco, utilizado no controlo da insuficiência cardíaca,
arritmia supraventricular e fibrilação auricular. No entanto, tem uma janela terapêutica estreita
o que exige que o clínico esteja atento às várias características do paciente, incluindo a função
renal e uso concomitante de outros medicamentos, de modo a evitar a toxicidade potencialmente
fatal [79].
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Amostra: Soro ou plasma heparinizado [71].
Método: Imunoensaio.
O acetato de magnésio é utilizado para ativar a enzima e o tampão de ácido N-2-
hidroxietilpiperazina-N-1-etanossulfónico (HEPES) para proporcionar um pH ótimo à reação
[71].
A digoxina, presente na amostra, liga-se ao F(ab΄)2-ß-galactosidase (conjugado).
Partículas magnéticas revestidas com o análogo da digoxina são adicionadas para se ligarem ao
conjugado livre, que será removido magneticamente. Posteriormente é adicionado um substrato
CPRG. A fração ß-galactosidase (ß-gal) do complexo Digoxina-F(ab’)2-ß-galactosidase
catalisa a hidrólise do CPRG em CPR. A variação da absorvência a 577nm causada pela
formação de CPR é diretamente proporcional à atividade da ß-galactosidase, que corresponde
à quantidade de digoxina presente na amostra, medida utilizando uma técnica cinética
bicromática (577, 700nm) [71].
Intervalo de Medição Analítica: 0.20 – 5.00ng/mL [0.26 – 6.41nmol/L] [71]
Intervalo Terapêutico: 0.90 – 2.00ng/mL [1.15 – 2.56nmol/L]; Toxicidade
>2.00ng/mL [2.56nmol/L]
Carbamazepina
É utilizado essencialmente no tratamento de determinado tipo de convulsões, no
tratamento de algumas doenças neurológica, tais como a nevralgia do trigémeo, assim como em
certas situações psiquiátricas. Possui um metabolismo hepático, sendo o principal responsável
pelas concentrações plasmáticas do fármaco [80].
Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 20.0µg/mL [0.0 – 84.7µmol/L] [72]
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Intervalo Terapêutico: 4.0–12.0µg/mL [16.9 – 50.8µmol/L]; Toxicidade:> 15.0µg/mL
[63.5µmol/L] [72]
Gentamicina
Antibiótico (aminoglicosídeo) de largo espectro, que se liga à subunidade ribossómica
30S das bactérias, inibindo assim a síntese proteica [80]. É eficaz, essencialmente, contra
bactérias aeróbias Gram negativo e possui uma toxicidade relativamente baixa. É administrada
por via intramuscular ou intravenosa [73].
Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 12.0µg/mL [0.0 – 25.92µmol/L] [73]
Intervalo Terapêutico: 4.0 – 10.0µg/mL [8.64 – 21.6µmol/L]; Toxicidade >2µg/mL
[4.32µmol/L] durante períodos superiores a 10 dias [73].
Fenobarbital
Especialmente utilizado como sedativo e tranquilizante [74], mas também no tratamento
de convulsões, exceto em crises de ausência. O metabolismo hepático é uma das principais
vias de eliminação, sendo que a redução da função hepática leva ao prolongamento de semi-
vida do fármaco e se a função renal também estiver afetada ocorre uma diminuição da sua
depuração [80].
Intervalo de Medição Analítica: 0.0 a 80.0µg/mL [0 – 344 µmol/L] [74]
Intervalo Terapêutico: 15.0 – 40.0µg/mL [64 – 172µmol/L]; Toxicidade >50.0µg/mL
[215µmol/L] [74]
Fenitoína
Antiepilético e anticonvulsivante, eficaz em todos os tipos de perturbações convulsivas,
com exceção de crises de ausência. Também pode ser utilizado no controlo de arritmias
cardíacas. A fenitoína é metabolizada a nível hepático, contudo o seu metabolismo pode ser
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saturado dentro do intervalo terapêutico. Nestes casos, pequenos incrementos da dose resultam
em grandes alterações da concentração plasmática, o que explica a grande variação
interindividual da dose necessária para obter o efeito terapêutico [80].
Intervalo de Medição Analítica: 0.5 – 40.0µg/mL [2.0 – 158.4µmol/L] [75]
Intervalo Terapêutico: 10.0 – 20.0µg/mL [39.6 – 79.2µmol/L]; Toxicidade >
30.0µg/mL [118.9µmol/L] [75]
Teofilina
Tem efeito broncodilatador utilizado no alivio e prevenção da asma. O metabolismo
hepático é a principal via de eliminação do fármaco da corrente sanguínea. Na presença de
doença ou imaturidade hepática e insuficiência cardíaca uma semi-vida do fármaco pode ser
prolongada [80].
Intervalo de Medição Analítica: 2.0 – 40.0µg/mL [11 – 222µmol/L] [76]
Intervalo Terapêutico: 10 – 20µg/mL [56 – 111µmol/L]; Toxicidade >20.0µg/mL
[111µmol/L] [76]
Ácido Valpróico
Utilizado para o tratamento de crises de ausência, sendo útil no controlo de certo tipo
de convulsões, quando administrado com outros agentes antiepiléticos [80].
Intervalo de Medição Analítica: 3.0 – 150.0µg/mL [20.8 – 1040.0µmol/L] [77]
Intervalo Terapêutico: 50 – 100µg/mL [346 – 693µmol/L] [77]
Vancomicina
Antibiótico glicopéptidico que atua inibindo a polimerização de peptidoglicano na
parede celular das bactérias. É utilizada para o tratamento e prevenção de várias infeções
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85
bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus resistente
à meticilina (MRSA). Possíveis complicações são a ototoxicidade, que tende a ser permanente
e dependente da dose, e a nefrotoxicidade, embora pouco comum, normalmente é reversível.
Dosagem de vancomicina com base na depuração estimada da creatinina é uma técnica
comumente utilizada para prevenir nefrotoxicidade [81].
Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 50.0µg/mL [0.0 – 33.5µmol/L] [78]
Intervalo Terapêutico: Pico: 18 – 26µg/mL [12.1 – 17.4µmol/L]; Vale: 5 – 10g/mL
[3.4 – 6.6µmol/L] [78]
Determinação quantitativa de Carbamazepina, Gentamicina, Fenobarbital, Fenitoína, Teofilina,
Ácido Valpróico e Vancomicina [72-78]:
Amostra: Soro ou plasma [72-78].
Método: Imunoensaio de inibição turbidimétrico melhorado de partículas homogéneas
(PETINIA). Utiliza um reagente de partículas sintéticas análogas ao fármaco a dosear e um
anticorpo monoclonal específico desse fármaco [72-78].
O fármaco presente na amostra compete com as partículas sintéticas pelo anticorpo,
diminuindo a sua taxa de agregação. A taxa de agregação é inversamente proporcional à
concentração do fármaco presente na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas
bicromáticas (340, 700nm) [72-78].
7.1.16. Rastreio de Drogas de Abuso
O rastreio de drogas de abuso é utilizado no diagnóstico, tratamento do consumo ou
sobredosagem de droga de abuso [82-87].
O método utilizado fornece apenas um resultado preliminar de teste analítico. Para obter
um resultado analítico confirmado, deve utilizar-se um método químico alternativo com maior
especificidade, como por exemplo a cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG/EM)
[82-87].
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86 Leticia de Bastos
Cocaína
A cocaína é um estimulador do SNC que provoca um estado de alerta aumentado e
euforia. É praticamente toda metabolizada ao nível hepático com formação dos metabolitos
benzoilecgonina e éster metílico de ecgonina, que posteriormente são eliminados pela urina.
Apenas uma pequena quantidade de cocaína é excretada na urina na forma inalterada [88].
Os metabolitos da cocaína podem ser detetados na urina até cerca de 2 dias após o
consumo. No entanto, a taxa de excreção varia de indivíduo para indivíduo e de acordo com o
modo de administração e a frequência do consumo. Com este teste é doseado de forma semi-
quantitativa a benzoilecgonina [82].
Intervalo de Medição Analítica: 35 – 900ng/mL (cut-off: 300ng/mL) [82]
Anfetaminas/ Metanfetaminas
As anfetaminas são substâncias estimuladoras do SNC. Uma porção significativa da
dose ingerida é eliminada na forma inalterada na urina, de modo dependente do pH urinário,
outra porção sofre metabolização hepática [88].
As anfetaminas surgem na urina no período de 3h após qualquer tipo de administração,
podendo ser detetadas durante 24-48h após a última administração [83].
Intervalo de Medição Analítica: 95 – 900ng/mL (cut-off: 300ng/mL) [83]
Opiáceos
Os opiáceos são alcaloides analgésicos de ocorrência natural ou semi-sintéticos,
derivados do ópio. A morfina e a codeína são alcalóides de ocorrência natural e a heroína é um
derivado semi-sintético da morfina. Apenas a morfina e a codeína são consideradas drogas
legais [88].
Os opiáceos são absorvidos rapidamente, sendo a heroína convertida rapidamente em 6-
acetilmorfina (6-AM), que por sua vez é hidrolisada a morfina. Posteriormente, é inativada pela
conjugação com o glucuronato. Da morfina total na urina, cerca de 90% é eliminada na forma
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87
de metabolito glucuronidado e 10% na forma de livre [88]. A excreção decorre por um período
de 2 dias [84].
A presença de opiáceos na urina indica o uso de heroína, morfina e/ou codeína [84].
Intervalo de Medição Analítica: 50 – 1800ng/mL (cut-off: 300ng/mL) [84]
Benzodiazepinas
As benzodiazepinas são sedativo-hipnóticos, sendo que alguns fármacos são de
utilização generalizada. As diferentes benzodiazepinas são absorvidas a taxas diferentes e os
efeitos psicoativos variam de acordo com a taxa de absorção. São metabolizadas no fígado e
podem potenciam o efeito de outros depressivos do SNC, tal como o álcool etílico [85].
Intervalo de Medição Analítica: 30 – 900ng/mL (cut-off: 200ng/mL) [85]
Barbitúricos
Os barbitúricos, uma classe de depressores do SNC, são rapidamente absorvidos, dos
quais 30-40% encontram-se ligados a proteínas plasmáticas, estando os restantes distribuídos
pelo músculo, tecido adiposo e fígado (onde são desativados) [86].
A forma como o fármaco é excretado depende da sua duração da ação, sendo que os de
curta duração normalmente excretados na urina na forma de metabolitos, enquanto que os de
longa duração irão aparecer inalterados [86].
Intervalo de Medição Analítica: 20 – 720ng/mL (cut-off: 200ng/mL) [86]
Canabinóides
O canabinóide ∆9-tetrahidrocanabinol (THC), principal composto psicoativo da
marijuana e do haxixe [88], é rapidamente absorvido, sendo quase totalmente metabolizado por
enzimas hepáticas [87].
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88 Leticia de Bastos
Aproximadamente, 30% da dose de THC é excretada na forma de metabolitos urinários
nas 72h após a exposição, sendo esta concentração depende da quantidade absorvida, da
frequência do consumo e da hora da colheita. Em utilizadores crónicos, o THC pode acumular-
se no tecido adiposo originando tempos de deteção mais longos na análise de urina em relação
aos utilizadores ocasionais [87].
Intervalo de Medição Analítica: 15 – 85ng/mL (cut-off: 50ng/mL) [87]
Determinação semi-quantitativa de Drogas de Abuso [82-87]:
Amostra: Urina - colhidas em recipientes de vidro ou plástico (certos plásticos podem
absorver determinados fármacos), limpos e estanques. O ácido bórico não deve ser utilizado
como conservante. As amostras devem possuir um pH entre 5-8, caso contrário deverão ser
ajustadas através da adição de HCI 1N ou NaOH 1N [82-87].
Método: Imunoensaio de competição [82-87].
A droga de abuso excretada na urina (Du) compete com um análogo desse composto
marcado com a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (C-G6PDH) pelo anticorpo (Atc). A
concentração de Du determina a quantidade de C-G6PDH que está ligado ao anticorpo e
consequentemente a quantidade que se encontra livre. O conjugado livre catalisa a oxidação da
glucose-6-fosfato com a redução simultânea da NAD para NADH. O aumento da absorvência
a 340nm, está relacionado com a concentração da droga presente na amostra (Tabela 5).
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89
Tabela 5. Compostos dosados na urina para o rastreio de drogas de abuso e respetivo
conjugado (Adaptado de [82-87]).
Droga de Abuso Rastreada Du C-G6DH
Metabolitos da Cocaína Benzoilecgonina Benzoilecgonina
Anfetaminas/ Metanfetaminas Anfetamina/
Metanfetaminas
d-anfetamina/
d-metanfetaminas
Opiáceos Opiáceos Morfina
Benzodiazepinas Benzodiazepinas Diazepam
Barbitúricos Barbitúricos Secobarbital
Canabinóides Canabinóides ∆9 –THC
Du: produto de excreção da droga de abuso na urina; C-G6DH: conjugado (composto marcado com a enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase)
Etanol
O álcool etílico é a droga mais popular e fortemente consumida pelos seres humanos.
O principal local de absorção é o intestino delgado, sendo posteriormente distribuído
uniformemente pela água do organismo e atravessa facilmente a barreira hematoencefálica,
bem como a placenta, podendo causar a síndrome alcoólica fetal. Cerca de 95% da totalidade
do etanol ingerido é metabolizado ao nível hepático [89].
A determinação do etanol pode ser utilizada no diagnóstico, controlo de intoxicação e
envenenamento por álcool etílico [89].
Amostra: Soro, plasma EDTA, heparinizado ou urina. Não desinfetar o braço com
soluções alcoólicas [89].
Método: Enzimático.
A álcool desidrogenase (ADH) catalisa a oxidação do álcool etílico em acetaldeído.
Durante esta reação, a NAD é reduzida a NADH com um aumento concomitante da absorvência
a 340nm proporcional à concentração de álcool presente na amostra [89].
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Intervalo de Medição Analítica: 3 – 300mg/dL [0.7 – 65.1mmol/L] [89]
7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos
Equipamento: Dimension® EXLTM with LM, da Siemens
A automatização de um processo de inspeção de amostras, com avaliação de
interferências espectrais da Hemólise, Icterícia e Lipémia6 (HIL) veio padronizar e uniformizar
os procedimentos laboratoriais. A interferência HIL é geralmente uma interferência direta
devido aos espectros de absorção da cor do interferente. Para efetuar essa determinação o
equipamento necessita apenas de 20μL de soro/plasma, e irá medir a absorvência a 405, 452 e
700nm, convertendo automaticamente os resultados obtidos para os valores do índice HIL,
correspondentes aos intervalos de concentração apresentados na Tabela 6 [90].
Tabela 6. Concentrações utilizados para estabelecer valores de índice HIL (Adaptado de
[90]).
Índices Hemoglobina
(mg/dL) Bilirrubina (mg/dL) Lipémia (mg/dL)
1 H ≤ 25 I ≤ 2 L ≤ 25
2 25 < H ≤ 50 2 < I ≤ 5 25 < L ≤ 50
3 50 < H ≤ 200 5 < I ≤ 20 50 < L ≤ 200
4 200 < H ≤ 300 20 < I ≤ 40 200 < L ≤ 600
5 300 < H ≤ 500 40 < I ≤ 60 600 < L ≤ 1000
6 500 < H ≤ 1000 60 < I ≤ 80 1000 < L ≤ 3000
H: Hemoglobina; I: Ictrícia; L: Lípémia.
Os valores dos índices HIL para cada método são apresentados em Anexo, na Tabela 18
(Anexo V) e representam os níveis de índice em que hemólise, icterícia ou lipémia interferem
6 O que é doseado não é a quantificação real de lípidos, mas a estimativa é baseada na medição da turvação da amostra.
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91
nos resultados do teste em pelo menos ± 10%, em comparação com amostras sem interferentes
[90].
Devido às interferências da hemólise e da lipémia na determinação do ionograma esses
métodos também foram incluídos, mesmo que não sejam fotométricos [90].
Tendo em conta a política do Serviço de Patologia Clínca, as amostras que possuem um
índice de hemólise de 2 ou 3, em todos os métodos que sofrem interferência com este grau de
hemólise, ao resultado é adicionada a mensagem de “amostra hemolisada” e essa informação é
disponibilizada ao clínico. Se o resultado obtido, mesmo com interferência da hemólise, estiver
abrangido na tabela dos resultados crítico, o resultado é comunicado, sugerindo-se a repetição
da colheita para confirmação de resultado. As amostras que apresentam um índice de hemólise
igual ou superior a 4, os métodos que apresentam interferências são bloqueados, não sendo
disponibilizado o resultado para o clínico, com indicação de “amostra hemolisada, solicita-se
nova colheita”.
As amostras lipémicas são doseadas e se necessário procede-se a uma diluição para que
seja possível efetuar-se o doseamento. Nas amostras em que o índice de lipémia interfere com
o método, a acompanhar o resultado a mensagem de “amostra lipémica” é disponibilizada para
o clínico. Quando não é possível efetuar-se o doseamento, o parâmetro é bloqueado e apenas é
libertada a mensagem de “amostra lipémica” no boletim de resultados.
7.3. Análise da Urina Tipo II
A análise de urina fornece uma ampla variedade de informações clínicas úteis, sendo
importante no diagnóstico, monitorização de patologias do trato urinário, screening de doenças
em populações assintomáticas e avaliação do efeito terapêutico. A análise de urina tipo II
consiste no exame físico e químico da urina e no exame microscópico do sedimento urinário.
A amostra utilizada é, preferencialmente, a primeira urina da manhã, por ser a amostra
mais concentrada, assegurando a deteção de substâncias químicas ou de elemento figurados que
podem não estar presentes numa amostra colhida aleatoriamente, bem como permite excluir a
proteinúria ortostática. As amostras de urinas devem ser processadas, preferencialmente, até 2h
após a colheita.
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7.3.1. Exame Físico e Químico da Urina Tipo II
Equipamento: Aution Max, da A. Menarini Diagnostics
O equipamento Aution Max (Figura 4) destina-se à primeira fase da análise da urina
tipo II, possibilitando a determinação de diferentes parâmetros, nomeadamente efetuar a leitura
dos resultados da tira de teste, diminuindo assim os erros de leitura visual por parte do técnico.
Densidade ou Gravidade Específica
A densidade é uma medida que permite avaliar as substâncias químicas dissolvidas na
urina, sendo dependente do poder de excreção e de concentração dos rins [91].
Valores de densidade baixos podem ser encontrados em casos de ingestão aumentada
de água, uso de diuréticos, incapacidade de concentração e diabetes insipidus. Enquanto que
valores de densidade elevados podem ocorrer em situações de desidratação, insuficiência
adrenal [91], febre, glicosúria e proteinúria.
Método: Índice de refração [92]
A luz emitida pelo díodo emissor de luz (LED) transforma-se num feixe de luz ao
atravessar uma fenda e lentes. O feixe de luz atravessa a célula do prisma que contém a amostra
de urina e, em seguida, é dirigido para o detetor. O índice de refração altera-se de acordo com
a gravidade específica da amostra contida na célula do prisma [92].
Figura 4. Equipamento Aution Max, da A. Menarini Diagnostics
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Valores de Referência: 1.010 – 1.025
Cor
A cor normal da urina é amarela, que se deve, sobretudo, à presença de um pigmento
denominado urocromo, que é um produto do metabolismo produzido de uma forma constante,
em condições normais. Outros pigmentos, tais como a uroeritrina e a urobilina também estão
presentes embora em menor quantidade. As alterações não patológicas devem-se
essencialmente ao estado de hidratação e à capacidade de concentração da urina. No entanto,
existem alterações com importância clínica [91]:
Cor âmbar – possível presença de bilirrubinas;
Cor vermelha, rosa, castanha – possível presença de sangue;
Quase incolor - diabetes insipidus:
Cor preta – presença de ácido homogentísico, característico da alcaptonúria.
Método: Reflectância a diferentes comprimentos de onda (635nm; 565nm; 430nm;
760nm), sendo analisadas 23 tonalidades [92].
Aspeto/ Turvação
O aspeto refere a transparência da urina. A urina normal é límpida, porém pode aparecer
uma turvação não patológica causada pela precipitação de cristais amorfos (frequente em
amostras refrigeradas), células epiteliais de descamação, muco, uso de cremes vaginais e sémen.
Uma turvação patológica pode estar relacionada com a presença elementos celulares, bactérias,
lípidos, linfa, leveduras e matéria fecal [91]. Uma urina límpida nem sempre é sinónimo de
normalidade.
Método: Luz dispersa. O resultado da turvação é apresentado com a seguinte
nomenclatura: Límpida, Turva ou Muito Turva [92].
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Tira de Teste
Método: Reflectância bicromática, exceto para a avaliação de sangue na urina em que
é monocromática. Os comprimentos de onda diferem consoante o parâmetro em estudo [92].
As amostras são pipetadas e dispensadas sobre as tiras de teste (URIFLET S 9UB). As
tiras de teste são tiras de plástico com áreas impregnadas com reagentes para a determinação
de diversos parâmetros, recorrendo a diferentes métodos de leitura. Os parâmetros
determinados resultam da reação da urina com a área de teste impregnada com reagente,
levando a uma alteração da cor. Posteriormente, para efetuar a leitura, um multi-LED irradia
luz com 1ou 2 comprimentos de onda diferentes, consoante o parâmetro em estudo, nas áreas
de reação das tiras de teste e na secção de compensação da tonalidade7. A luz refletida é recebida
por três detetores [92].
pH
O rim, bem como os pulmões, é dos maiores reguladores do conteúdo ácido-base do
organismo. A determinação do pH urinário é importante para a deteção de possíveis distúrbios
hidro-electrolíticos. O valor do pH da urina varia consoante o teor da dieta [91].
Método: Princípio de duplo indicador de pH que reagem com os iões H+ levando à
produção de cor, permitindo a diferenciação do nível do pH de 4.5 – 9 [93].
A contaminação bacteriana pode conduzir a falsos resultados [93].
Valores de Referência: 5.0 - 8.0
Glucose
Em circunstâncias normais, a urina normal contém quantidades mínimas de glucose. No
entanto, em situações de hiperglicémia, ao se atingir o limiar de reabsorção renal, observa-se
glucosúria (160-180mg/dL). A glucosúria com hiperglicémia pode ocorrer na diabetes mellitus,
tumor pancreático, hipertiroidismo e outras alterações hormonais ao nível da hipófise e glândula
adrenal. A glucosúria sem hiperglicémia é geralmente associada à lesão tubular renal. Na
7 Secção de compensação da tonalidade: zona branca da tira, que não contém reagentes, permite ao analisador fazer uma
compensação na determinação de diversos parâmetros tendo em conta a cor intrínseca da urina.
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gravidez pode-se verificar glucose na urina com níveis baixos de glicémia, devido ao aumento
da taxa de filtração glomerular [91].
Método: Glucose oxidase-peroxidase. Esta área de teste não é afetada pela presença de
substâncias redutoras ou de outros açúcares, nomeadamente, sacarose, lactose e frutose [93].
Falsos negativos: Grandes quantidades de ácido ascórbico [93].
Falsos positivos: Substâncias oxidantes como o hipoclorito e cloro, assim como urinas
com pH inferior a 4 [93].
Valores de Referência: 0.0 – 30.0mg/dL
Bilirrubinas
A presença de bilirrubina na urina pode ser indicativa de patologia hepática ou biliar,
podendo observar-se em situações de hepatite, cirrose ou colestase [91].
Método: Ligação da bilirrubina a um sal de diazóico, com produção de uma coloração
azo castanho-avermelhada. Esta área de teste reage de uma forma mais sensível à bilirrubina
direta. Este teste é instável na presença de luz solar [93].
Falsos negativos: Presença de ácido ascórbico, ácido úrico e nitritos [93].
Falsos positivos: Presença de urobilinogénio e metabolitos de medicamentos [93].
Valores de Referência: 0.0 – 0.2mg/dL
Proteínas
Podem ser detetadas pequenas quantidades de proteínas na urina de indivíduos
saudáveis, variando de 2 a 10mg/dL (inferior ao limite de deteção da tira de teste). No entanto,
a deteção de uma quantidade anormal de proteínas na urina é indicativa de patologia renal [91].
Método: Princípio do “erro proteico” de um indicador de pH, o azul de tetrabromofenol.
A reação é particularmente sensível à albumina, mas menos sensível à globulina, proteína de
Bence-Jones e às mucoproteínas [93]. Este método não deteta proteinúria abaixo dos 8-10mg/dL
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Falsos negativos: pH inferior a 3 [93].
Falsos positivos: pH superior a 8, grandes quantidades de hemoglobina, substâncias de
alto peso molecular, desinfetantes incluindo compostos de amónia quaternário [93].
Valores de Referência: 0.0 – 10.0mg/dL
Sangue
O sangue pode estar presente na urina sob a forma de eritrócitos íntegros (hematúria) ou
de hemoglobina livre (hemoglobinúria) resultando da destruição dos eritrócitos, sendo
importante a observação do sedimento ao microscópio para auxiliar na distinção destas duas
condições [91].
A hematúria pode estar relacionada com patologias de origem renal ou urogenitais e a
hemoglobinúria pode ocorrer devido à lise de eritrócitos no trato urinário ou ser resultante de
hemólise intravascular [91].
A presença de mioglobinúria, surge raramente, resultando de distúrbios decorrentes de
destruição do tecido muscular [91].
Método: Baseia-se na atividade da pseudoperoxidase que catalisa a oxidação do
indicador de pH na presença do peróxido de hidrogénio na área de teste, originando uma
coloração azul-esverdeada, sendo mais sensível à hemoglobina e mioglobina do que aos
eritrócitos. A ausência de hemólise poderá levar a resultados negativos apesar da presença de
eritrócitos no sedimento [93].
Falsos negativos: Elevada densidade da urina, elevado teor proteico, presença de
inibidores de origem biológica ou farmacológica (ácido úrico, ácido ascórbico, glutatião) [93].
Falsos positivos: Presença de substâncias oxidantes como o hipoclorito e o cloro [93].
Valores de Referência: 0.0 – 0.03mg/dL
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Corpos cetónicos
Geralmente não surgem em quantidades mensuráveis na urina, contudo sempre que haja
um defeito no metabolismo dos hidratos de carbono, na absorção ou no aporte inadequado da
dieta, o organismo compensa aumentando o metabolismo lipídico que, em grande escala, leva
ao aumento dos corpos cetónicos no sangue que consequentemente são excretados pela urina.
Verificando-se em situações de cetoacidose diabética, jejum prolongado, após exercício físico
intenso e hiperemese gravídica [91].
Método: Princípio do teste de Legal: o ácido acetoacético e a acetona reagem com
nitroprussiato de sódio, em meio alcalino, originando um complexo cor violeta [93].
Falsos positivos: Presença de fenilcetona, cefalosporina e anti-enzima redutora da
aldose [93].
Valores de Referência: 0.0 – 5.0mg/dL
Urobilinogénio
O urobilinogénio é um pigmento biliar que resulta da redução da bilirrubina pelas
bactérias intestinais. Cerca de metade do urobilinogénio é reabsorvido pelo intestino, entra na
circulação porta, sendo excretado na bílis. A maioria é excretado pelas fezes, encontrando-se
em pequenas quantidades na urina, podendo aumentar em patologias hepáticas, colestase e
colangite. Na presença de distúrbios hemolíticos observa-se o aumento do urobilinogénio com
ausência de bilirrubinas na urina [91].
Método: Reação do urobilinogénio com um sal diazónio estável originando um corante
azo castanho avermelhado [93].
Falsos negativos: Grandes quantidades de ácido ascórbico [93].
Falsos positivos: Presença de carbapenem [93].
Valores de Referência: 0.0 – 0.2mg/dL
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Nitritos
A presença de nitritos é sugestiva de infeções urinárias, mesmo quando assintomáticas,
pela capacidade de algumas bactérias patogénicas reduzirem nitratos a nitritos, levando ao seu
aparecimento na urina [91].
Método: Princípio da reação de Griess. Na presença de nitritos a zona de teste surge
com uma coloração rosa-vermelha [93].
Falsos negativos: Presença de ácido ascórbico e densidade elevada da urina [93].
Falsos positivos: Urinas não frescas [93].
Valores de Referência: Não detetável.
Leucócitos
Os leucócitos aparecem frequentemente na urina, podendo ser sugestivos de infeção do
sistema urogenital [91].
Método: O teste baseia-se na reação da esterase dos leucócitos com produção de um
corante violeta [93].
Falsos negativos: Glucosúria superior a 500mg/dL, proteinúria superior a 300mg/dL,
pH reduzido e elevada densidade na urina [93].
Falsos positivos: Presença de formaldeído ou bilirrubinas na urina [93].
Valores de Referência: 0.0 – 25/uL
7.3.2. Avaliação Microscópica do Sedimento Urinário
A existência de parâmetros positivos na tira de teste ou a sua solicitação pelo clínico
constituem os critérios para a execução do exame microscópico do sedimento urinário. Para tal,
a amostra de urina é centrifugada a 1500rpm, 10 minutos, posteriormente é decantado o
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sobrenadante, permanecendo com cerca de 1mL de amostra de forma a ressuspender o
sedimento, que será observado a fresco, ao microscópio ótico na objetiva de 10x e 40x.
Elementos que podem ser observados
O exame microscópico do sedimento urinário tem como objetivo detetar, identificar
e/ou quantificar de forma semi-quantitativa células, cilindros, cristais, formas leveduriformes,
bactérias e parasitas. É preciso ter atenção aos artefactos para não serem confundidos com
nenhuma outra estrutura.
Células
Na tabela 7 encontram-se as diferentes células que podem ser observadas num
sedimento urinário e o seu significado clínico.
Tabela 7. Células que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado
clínico (Adaptado de [91]).
Imagem Células Significado Clínico
Células tubulares renais
Necrose tubular renal, rejeição de
transplante renal e outras lesões
isquémicas renais.
Células do epitélio de
transição
Quando em número elevado e com
morfologia anormal é sugestivo de
malignidade.
Células epiteliais de
descamação
Contaminação vaginal ou uretral. Sem
significado patológico. Mais abundante
na mulher.
Eritrócitos
Doença renal, infeção, calculo renal,
doença extra-renal, reação tóxica a
drogas ou causa fisiológica.
Leucócitos Infeção ou inflamação do trato urinário.
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Cilindros
Os cilindros são os únicos elementos exclusivamente de origem renal encontrados no
sedimento urinário. São compostos de mucoproteínas Tamm-Horsfall presentes na urina na
forma solúvel, que em situações de estase urinária precipitam tomando a forma do local onde
se formaram. Existem diversos fatores que aumentam a sua predisposição, tais como: a
concentração aumentada de proteínas, pH urinário baixo e a presença de sais. Quaisquer
elementos presentes no filtrado tubular podem prender-se à matriz do cilindro e estão na base
da sua classificação (Tabela 8) [91].
Tabela 8. Cilindros que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu
significado clínico (Adaptado de [91]).
Fotografia Cilindros Significado Clínico
Cilindros hialinos
Doença renal, febre, desidratação, terapia
com diuréticos, ICC, transitório com o
exercício.
Cilindros granulosos Doença glomerular e tubular renal
Cilindros cerosos
Doença renal crónica, inflamação e
degeneração tubular.
Cilindros eritrocitários Glomerulonefrite
Cilindros leucocitários Pielonefrite, nefrite intersticial, síndrome
nefrótico
Cilindros de células
epiteliais Lesão tubular renal
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101
Cristais
Embora raramente tenham significado clínico, deve proceder-se à sua identificação para
confirmar se representam ou não um estado patológico. São formados pela precipitação de sais
na urina quando submetidos a alterações de pH, temperatura ou concentração, podendo aparecer
na forma de cristais verdadeiros ou de material amorfo [91].
Os cristais considerados patológicos são os de cistina, que aparecem em casos de erros
congénitos do metabolismo, e os de leucina e tirosina que ocorrem em situações de patologia
hepática grave [91].
Um dos recursos mais úteis na identificação dos cristais é o conhecimento do pH
urinário, pois este determinará o tipo de substância precipitada (Tabela 9) [91].
Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se
encontram (Adaptado de [91]).
Fotografia Cristais pH urinário
Cristais de ácido úrico pH ácido
Cristais de oxalato de cálcio pH ácido ou neutro
Cristais de cistina pH ácido
Cristais de leucina pH ácido
Cristais de tirosina pH ácido
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Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se
encontram (Adaptado de [91]). Continuação.
Uratos amorfos
(cálcio, magnésio, sódio e
potássio)
pH ácido e neutro
Cristais de fosfato triplo
(amónio, magnésio) pH alcalino e neutro
Fosfato de cálcio pH alcalino ou neutro
Fosfatos amorfos
(cálcio e magnésio)
pH alcalino e neutro
Outras estruturas que podem ser observadas:
Formas leveduriformes
Bactérias
Parasitas: Trichomonas vaginalis, Schistosoma haematobium
Muco
Espermatozoides
O sedimento urinário normal pode conter diversos elementos, mas quando presentes em
determinadas quantidades é considerado patológico:
Mais de 5 eritrócitos ou leucócitos por campo;
Mais 2 células tubulares renais por campo;
Mais de 3 cilindros hialinos por campo;
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1 Cilindro granuloso;
Mais de 10 bactérias por campo;
Presença de fungos;
Presença de parasitas;
Presença de cristais patológicos;
Grandes quantidades de cristais normais.
7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado
A colheita de urina a tempo determinado é útil na avaliação da função renal, permitindo
determinar a diurese, bem como dosear diversos metabolitos ou outras substâncias que são
excretados na urina.
A diurese é determinada pelo grau de hidratação do organismo, podendo ser
influenciada, pela secreção de ADH, necessidade de excretar quantidades aumentadas de
substâncias dissolvidas e patologia pré-renal, renal ou pós-renal. Uma diurese considerada
normal situa-se entre os 600-2000mL/24h [92].
A determinação da clearance de creatinina é utilizada como indicador da filtração
glomerular. No entanto, o seu valor é ligeiramente superior ao débito de filtração glomerular,
pois cerca de 10% da creatinina é secretada pelos túbulos renais [92].
Como existem muitos erros associados à colheita da urina a tempo determinado,
atualmente utilizam-se equações que permitem estimar o débito de filtração glomerular a partir
da creatinina sérica [94]. A Fórmula de Cockroft e Gault pode predizer-se à clearance de
creatinina (Cl. Creat):
Cl. Creatinina calculada (mL/min) = (140−𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (𝑎𝑛𝑜𝑠))𝑥𝑝𝑒𝑠𝑜 (𝐾𝑔)𝑥𝑓
𝐶𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 𝑠é𝑟𝑖𝑐𝑎 (𝑚𝑔/𝑑𝐿)𝑥72
f = 1 para o homem e 0.85 na mulher
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104 Leticia de Bastos
Contudo, esta fórmula não pode ser aplicada quando o índice de massa corporal é
inferior a 19 ou superior a 35Kg/m2, quando se verificam alterações importante da massa
muscular, na gravidez, insuficiência renal aguda, hepatopatias graves, edema generalizado ou
ascite.
Para o doseamento de diversos produtos excretados na urina (como por exemplo
proteínas para avaliar a proteinúria e consequentemente o grau de lesão renal) muitos clínicos
já não recorrem à urina a tempo determinado, pedindo o seu doseamento numa urina aleatória
e estabelecem uma razão em função da creatinina urinária.
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105
8. Valência de Hematologia
8.1. Hemogramas
O hemograma é uma das análises de rotina mais requisitadas. Contudo, é uma análise
complexa composta por vinte e seis parâmetros, acrescentando-se a contagem de eritroblastos
e reticulócitos se necessário:
Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, Tomar
Responsáveis da secção:
Dr. Mohsen Rostami (Assistente Hospitalar)
Dra. Sandra Monteiro (Técnica Superior de Saúde)
Período de Estágio: 03/04/2017 - 02/06/2017
Volume de trabalho: Em média cerca de 6150 hemogramas/mês.
Atividades realizadas na seção no referendo período:
Colheitas de produtos biológicos aos utentes da consulta externa;
Receção de produtos e avaliação da sua conformidade;
Manutenção dos equipamentos;
Execução e avaliação CQI e processamento de amostras para a AEQ;
Execução e interpretação de hemogramas;
Execução de velocidades de sedimentação eritrocitária;
Doseamento da hemoglobina glicada (HbA1C);
Estudo de hemoglobinopatias;
Avaliação da hemostase;
Realização e observação de esfregaços de sangue periférico.
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106 Leticia de Bastos
Eritrograma: Hematócrito (HTC), Concentração de hemoglobina, Contagem de
Glóbulos Vermelhos, Índices Hematimétricos (Volume Globular Médio, VGM;
Hemoglobina Globular Média, HGM; Concentração de Hemoglobina Globular Média,
CHGM) e Coeficiente de Dispersão Eritrocitária (RDW, do inglês Red Cell
Distribution Witdth);
Leucograma: Contagem total de leucócitos e Fórmula leucocitária
Plaquetograma: Contagem de plaquetas, Plaquetócrito, Volume Plaquetário
Médio (VPM) e o Coeficiente de Dispersão Plaquetária (PDW, do inglês Platelet
Distribution Width).
Como exemplo de patologias diagnosticadas em Hematologia Laboratorial, sublinha-se
a Anemia, uma das doenças mais prevalentes do mundo. Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS) é definida pelo valor da hemoglobina, inferior a 13g/dL no homem, inferior a
12g/dL na mulher, sendo variável em crianças de acordo com a idade [95].
A classificação das anemias pode ser morfológica ou fisiopatológica. A classificação
morfológica engloba o MCH (anemia normocrómica ou hipocrómica) assim como outros
índices, como o MCV (normocítica, microcítica ou macrocítica). Enquanto que a classificação
fisiopatológica recorre à contagem de reticulócitos, de forma a designar as anemias como
resultando da diminuição da produção/produção inadequada, eritropoiese ineficaz ou aumento
da destruição/perdas hemorrágicas [97]. A determinação de alguns parâmetros bioquímicos,
designados fatores da hematopoiese, como a ferritina, vitamina B12, ácido fólico, e outros,
torna-se mandatório no estudo da etiologia das anemias [96].
A policitémia é classicamente definida pela elevação do hematócrito acima do valor
normal, ou pelo aumento da concentração da hemoglobina, com valores de Hb superior a
18,5g/dL no sexo masculino e superior a 16,5g/dL no sexo feminino, ou do número de glóbulos
vermelhos [96, 97].
Para classificar as Policitémias em primárias (Policitemia Vera) ou secundária, é
importante ter em consideração, para além dos factores enunciados anteriormente, o número de
leucócitos, plaquetas, saturação de oxigénio e quantidade de eritropoietina presente em
circulação [96].
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107
Existem outras patologias prevalecentes em que o estudo do eritrograma se torna
fundamental para o respetivo diagnóstico, como por exemplo na Hemocromatose.
O leucograma avalia as alterações fisiológicas e patológicas dos glóbulos brancos. As
alterações podem ser diagnosticadas através do estudo quantitativo, morfológico, citoquímico,
citogenético ou por técnicas de biologia molecular.
Relativamente às plaquetas, estas possuem um papel muito importante ao nível da
hemostase primária. As alterações ao nível das plaquetas podem ser quantitativas ou
qualitativas, no entanto, o plaquetograma permite essencialmente fazer uma avaliação
quantitativa.
A observação do esfregaço de sangue periférico é fundamental no diagnóstico e
seguimento das hemopatias mais prevalentes.
Equipamentos em funcionamento na secção:
Equipamento: Sysmex XN-1000TM
Amostra: Sangue total colhido em tubos com anticoagulante EDTA K3. Na presença
de pseudotrombocitopénias despista-se a possível reação das plaquetas ao anticoagulante, que
leva à agregação plaquetar, através da contagem de plaquetas em sangue total colhido em tudo
com anticoagulante citrato trissódico8 0,109M.
O Sysmex XN-1000 é um analisador eficiente para a realização de hemogramas,
proporcionando informações clínicas pertinentes. Para além da determinação quantitativa,
também permite fazer uma avaliação qualitativa das 3 séries e ainda apresenta alarmes para
alertar determinadas anomalias (Figura 5).
8 Anticoagulante, atua como agente quelante do cálcio ionizado com formação de citrato de cálcio.
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108 Leticia de Bastos
Contagem de Eritrócitos e Plaquetas
A contagem de eritrócitos (RBC, do inglês Red Blood Cells) e plaquetas (PLT) é
efetuada no canal RBC/PLT [98].
Método: Focagem hidrodinâmica com deteção por impedância elétrica.
Uma porção da amostra é injetada, para uma câmara cónica, formando uma coluna de
partículas que passam por uma abertura (célula de contagem) que contém um elétrodo de cada
lado, onde passa uma corrente contínua. A passagem de uma partícula/célula, envolvidas num
líquido condutor, pela abertura gera um impulso elétrico, resultando na alteração da
condutividade da corrente elétrica (Figura 6). O número de impulsos está relacionado com o
número de partículas e a amplitude (intensidade) com o volume da célula. Os dados obtidos são
convertidos em histogramas (Figura 7). A separação destas 2 populações celulares é efetuada
por discriminadores automáticos [98].
Figura 6. Tecnologia da focagem hidrodinâmica [99].
Figura 5. Sysmex XN-1000TM.
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109
O objetivo da focagem hidrodinâmica é minimizar a perda e a variação dos impulsos
elétricos na zona de deteção e a recirculação de células, de forma a evitar interferências nas
contagens celulares, melhorando a precisão e reprodutibilidade do método [98].
O hematócrito, definido como o volume relativo ocupado pelos glóbulos vermelhos, é
determinado diretamente através da deteção individual do volume de cada eritrócito [98].
Doseamento da Hemoglobina
O doseamento da hemoglobina é feito no canal da hemoglobina [98].
Método: Lauril Sulfato de Sódio (SLS, do inglês Sodium Lauryl Sulfate).
A amostra é colocada em contacto com um reagente de lise, que irá destruir os eritrócitos
e leucócitos. Posteriormente, ocorre a oxidação do ferro presente na hemoglobina, permitindo
a ligação do reagente SLS ao grupo heme, formando um complexo corado estável. A
quantificação da hemoglobina é feita recorrendo a um método fotométrico, sendo a absorvência
medida a 555nm proporcional à concentração da hemoglobina presente na amostra [98].
Este método apresenta uma boa correlação com o método de referência
(cianometahemoglobina) [98].
Contagem Diferencial dos Leucócitos
A análise diferencial dos leucócitos (WBC, do inglês White Blood Cell) é feita no canal
WDF [98].
Figura 7. Histograma de plaquetas (à esqueda) e dos eritrócitos (à direita) [100].
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110 Leticia de Bastos
Método: Citometria de fluxo de fluorescência.
Uma porção da amostra é colocada em contacto com um surfactante que induz a lise dos
RBC e a formação de poros ultramicroscópicos ao nível da membrana dos glóbulos brancos
através dos quais um marcador de fluorescência patenteado de polimetina migra e se liga aos
ácidos nucleicos. Em seguida, a amostra é transportada para o citometro de fluxo, onde é
emitido um feixe de lazer de díodo semicondutor (633nm), que separa as células usando três
sinais diferentes (Figura 8) [98]:
Dispersão da luz frontal (forward ou FSC): determina o volume/tamanho célular;
Dispersão da luz lateral (scatter ou SSC): avalia o conteúdo/complexidade
(núcleo e grânulos) celular;
Fluorescência lateral (SFL): a intensidade de fluorescência é proporcional ao
conteúdo em ácidos nucleicos presentes nas células nucleadas.
A dispersão da luz frontal e lateral são recebidos por fotodíodos, e a florescência lateral
é recebida por um fotomultiplicador. A luz recebida é convertida em impulsos elétricos,
permitindo diferenciar os leucócitos em neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos, com
elevada precisão [98].
Posteriormente, os resultados são apresentados em diagrama de dispersão (Figura 9). O
algoritmo adaptável de alarmes Sysmex, baseado no reconhecimento da forma da área da
Figura 8. Tecnologia da citometria de fluxo e sinais de dispersão da luz frontal, lateral e da fluorescência
lateral [101].
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111
população celular, consegue discriminar linearmente o agrupamento celular do gráfico de
dispersão, analisando a forma e o posicionamento de diferentes populações de células
mononucleares [98].
Contagem Total de Leucócitos e Eritroblastos
O canal WNR é o principal canal para contagem de leucócitos e eritroblastos.
Método: Citometria de fluxo de fluorescência, que utiliza um reagente ácido que
provoca a lise celular, nomeadamente dos eritrócitos e das plaquetas, e um corante de
polimetina específico que cora os ácidos nucleicos. As diferenças em termos volumétricos e de
complexidade existentes são analisadas a partir dos sinais de dispersão dos feixes frontal e
lateral (Figura 10) [98].
Figura 9. Diagramas de dispersão normal dos leucócitos do canal DIFF, à esquerda [101] e diagrama de dispersão
com a localização das diferentes células da série branca, consoante as suas características físico-químicas, à direita
[100].
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Contagem de Plaquetas Fluorescentes
Método: Citometria de fluxo de fluorescência com corante específico, a Oxazina.
No canal de plaquetas fluorescentes, as plaquetas são identificadas e quantificadas pelo
corante que tem afinidade para a superfície do retículo endoplasmático rugoso e mitocôndrias.
Essa reação tem excelente correlação com a análise de CD41/CD61, minimizando as
interferências na presença de fragmentos celulares. É ainda capaz de analisar graus de
imaturidade das plaquetas (Figura 11).
Figura 10. Diagramas de dispersão normal do canal WNR [101].
NRBC: eritroblastos; BASO: basófilos; WBC: leucócitos.
Figura 11. Diagramas de dispersão normal do canal das plaquetas fluorescentes [101].
RBC: eritrócitos; IPF: fração de plaquetas imaturas; PLT-F: plaquetas fluorescentes.
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113
Contagem de Reticulócitos
Método: Citometria de fluxo com fluorescência
No canal RET O, o surfactante, presente no reagente, perfura ligeiramente as
membranas permitindo a entrada do marcador de fluorescência que irá marcar os ácidos
nucleicos presentes no interior dos WBC, eritroblastos (NRBC, do inglês Nucleated Red Blood
Cells) e reticulócitos, pelo que a intensidade do sinal de fluorescência resultante é diretamente
proporcional ao teor de ácido nucleico, podendo ser divididos em três categorias consoante o
grau de maturidade (Figura 12) [98].
Índices Hematimétricos
Os índices eritrocitários são calculados pelo software do equipamento [98].
Volume Globular Medio (VGM)
Indica o volume médio de um eritrócito do indivíduo:
𝑉𝐺𝑀 (𝑓𝑙) =𝐻𝑇𝐶 (%)
𝑅𝐵𝐶 (𝑥106/µ𝐿) 𝑥 10
Figura 12. Diagrama de dispersão no canal dos reticulócitos com distribuição normal [101].
RET: reticulócitos; RBC: eritrócitos; LFR: reticulócitos de baixa fluorescência; MFR: reticulócitos de fluorescência média; HFR:
reticulócitos de alta fluorescência; IRF: reticulócitos imaturos e resulta da soma dos MFR com os HFR; PLT: Plaquetas.
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Hemoglobina Globular Média (HGM)
Indica o peso médio da hemoglobina contida num eritrócito médio do indivíduo:
𝐻𝐺𝑀 (𝑝𝑔) =𝐻𝐺𝐵 (𝑔/𝑑𝐿)
𝑅𝐵𝐶 (𝑥106/µ𝐿) 𝑥 10
Concentração da Hemoglobina Globular Média (CHGM)
Indica a concentração média de hemoglobina do indivíduo por unidade de volume de
eritrócitos:
𝐶𝐻𝐺𝑀 (𝑔/𝑑𝐿) =𝐻𝐺𝑀 (𝑔/𝑑𝐿)
𝐻𝑇𝐶 (%)𝑥100
Coeficiente de Dispersão Eritrocitário
O RDW indica o grau de anisocitose eritrocitária (em percentagem), sendo obtido a
partir do histograma de distribuição de volume dos eritrócitos (coeficiente de variação) [98].
Coeficiente de Dispersão Plaquetário
O PDW indica o grau de anisocitose plaquetar (em percentagem), sendo obtido a partir
do histograma de distribuição do volume das plaquetas (coeficiente de variação) [98].
Análise de Líquidos Biológicos
Método: Citometria de fluxo de fluorescência.
Permite a análise precisa de líquidos biológicos, sem necessidade de preparação prévia
da amostra [98].
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115
8.1.1. Esfregaço de Sangue Periférico
Um esfregaço de sangue periférico consiste na preparação de uma fina camada de
células sobre uma lâmina de vidro, que posteriormente será corada para posterior observação
ao microscópico, sendo essencial para uma correta investigação hematológica.
Apenas é efetuado quando solicitado pelo clínico, ou quando quem está a validar achar
pertinente a sua execução para confirmar e/ou complementar os resultados fornecidos pelo
equipamento.
Amostra: Sangue total colhido em tubo com EDTA K3.
Execução do Esfregaço de Sangue Periférico
1. Depositar uma gota de sangue na extremidade de uma lâmina (lâmina 1),
próximo da zona esmerilada (figura 13-A);
2. Segurar outra lâmina (lâmina 2) ou lamela e deslocá-la, sempre apoiada na
lâmina 1, até à gota de forma a que ambas façam um ângulo de 30º a 45º (figura 13-
B);
3. Deixar que a gota se difunda ao longo da lâmina 2 (figura 13-B);
4. Com um movimento uniforme, deslizar a lâmina 2 no sentido da extremidade
livre até que o sangue se esgote (Figura 13-C e D);
5. Identificar a amostra e deixar secar.
Figura 13. Ilustração de como fazer um esfregaço de sangue periférico,
à esquerda e esfregaço bem executado, à direita [102].
A B C D
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Coloração do Esfregaço de Sangue Periférico
Equipamento: RAL Stainer (Figura 14)
Método: Coloração de May-Grünwald-Giemsa (coloração panótica)
1. Solução May-Grünwald, permite fixar o esfregaço, pelo metanol presente na
solução (solução metanólica de eosinato de azul de metileno);
2. Solução May-Grünwald com tampão fosfato, permite dissociar o corante em
eosina e azul de metileno;
3. Solução de Giemsa com tampão fosfato, permite a dissociação do corante em
eosina, azul de metileno e azur de metileno.
A eosina (corante ácido) cora os componentes citoplasmáticos básicos da célula de rosa-
alaranjado (eosinófilos ou acidófilos) e o azul de metileno (corante básico) cora o núcleo e os
componentes citoplasmáticos ácidos da célula de azul-arroxeado (basófilos). A granulações que
coram com o azul de metileno e a eosina ficam rosas (neutrófilas). O azur de metileno cora as
granulações azurófilas de vermelho-púrpura.
Observação ao Microscópio Ótico do Esfregaço de Sangue Periférico Corado
Para observar um esfregaço morfológico de sangue periférico é necessário em primeiro
lugar observar o esfregaço com uma objetivas de baixa ampliação (10x) para avaliar a qualidade
Figura 14. Equipamento de coloraçãoAutomate RAL Stainer.
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117
da preparação e a distribuição celular. Posteriormente, com a objetiva de maior ampliação (40
e 100x) observar a morfologia da serie eritrocitária, plaquetar e leucocitária bem como realizar
a contagem de leucócitos e eritroblastos, numa região do esfregaço onde as células se encontram
individualizadas.
Série Vermelha
As alterações da série vermelha podem manifestar-se de diversas formas, podendo
observar-se reticulócitos e/ou eritroblastos no sangue periférico, anisocitose9, poiquilocitose,
anisocromia, mas também inclusões eritrocitárias (que podem ser causadas ou não por infeção
parasitária) (Tabela 10) [103].
Na presença de eritroblastos o Sysmex XN-1000TM efetua automaticamente a correção
da fórmula leucocitária.
Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas (Adaptado [103]).
Imagem Alteração Principais Causas
Tamanho
Microcitose
Anemia ferropénica
Algumas hemoglobinopatias
Anemia da doença crónica
Macrocitose
Anemia megaloblástica
Mielodisplasia
Doença hepática crónica
Alcoolismo
Quimioterapia
9 A avaliação do RDW juntamente com o grau de anisocitose é importante nas anemias microcítica hipocrómicas para auxiliar
na distinção ente anemia ferropénica (RDW> 15% com elevada anisocitose eritrocitária) e hemoglobinopatias (RDW normal).
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118 Leticia de Bastos
Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas (Adaptado [103]).
Continuação.
Cor
Hipocromia
Anemia ferropénica
Talassemias
Anemia da doença crónica
“Hipercromia”10 Esferocitose hereditária
Policromasia11
Anemia regenerativa
Tratamento de anemias
Anemia hemolítica
Forma
Esferócitos
Esferocitose hereditária
Doença hemolítica do recém-nascido por
incompatibilidade ABO
Reações transfusionais
Anemia hemolítica autoimune
Queimaduras extensas
Eliptócitos
Eliptocitose hereditária
Anemia megaloblástica
Anemia ferropénica
Talassemias
Estomatócitos
Estomatocitose hereditária
Alcoolismo
Doença hepática obstrutiva
10 Geralmente cursa com CHGM entre 36 a 38g/dL, no entanto quando não se observam esferócitos no sangue periférico,
possivelmente a amostra estará hemolisada ou será um erro do equipamento (por exemplo, poderá ser necessário calibrar). 11 Coloração acinzentada dos eritrócitos, devido à presença de proporções idênticas de componentes ácidos e básicos –
correspondente aos reticulócitos.
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119
Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas (Adaptado [103]).
Continuação.
Células em alvo ou target cells
Hemoglobinopatias
Anemia ferropénica
Drepanocitose
Doença hepatobiliar
Pós-esplenectomia
Drepanócitos Drepanocitose
Acantócitos
Acantocitose hereditária
Doença hepática
Pós-esplenectomia
Má absorção lipídica
Equinócitos
Urémia
Insuficiencia renal
Défice de piruvato cinase
Queimadura grave
Dacriócitos
Talassemia
Anemia ferropénica
Anemia megaloblástica
Mielofibrose
Esplenomegalia
Síndromes Mielodisplásicas
Esquizócitos
e
Queratócitos
Anemia hemolítica secundária a implantes
Doença hemolítica microangiopática
Coagulação intravascular disseminada
(CIVD)
Inclusões Eritrocitárias
Pontuado Basófilo
Perturbações da eritropoiese
Intoxicação por chumbo
Drepanocitose
Talassemia
Anemia megaloblástica e sideroblástica
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Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas (Adaptado [103]).
Continuação.
Doença hepática (alcoolismo)
Corpos de Howell-Jolly
Pós-esplenectomia
Anemia megaloblástica
Anemia hemolítica
Anel de Cabot
Anemia perniciosa
Intoxicação por chumbo
Em determinadas situações pode observar-se alterações na distribuição dos eritrócitos
(rouleaux12, aglutinação13) ou a presença de 2 populações distintas (dimorfismo), podendo ser
consequência da doença, tratamento ou transfusão.
Série Branca
Permite observar a morfologia dos leucócitos, estado de maturação (aspeto da
cromatina/citoplasma) (Anexo VI), presença de blastos, assim como corrigir/confirmar
fórmulas leucocitárias emitidas pelo equipamento. Também permite analisar a presença de
linfócitos atípicos, célula picnóticas, bastonetes de Auer, corpos de Döhle, céluas de Pelger-
Huët ou Pseudo Pelger-Huët, a granulação dos neutrófilos ou a presença de vacúolos. Algumas
alterações quantitativas da fórmula leucocitária encontram-se na Tabela 11 [103].
12 Eritrócitos aderem uns aos outros formando pilhas de eritrócitos. Pode ocorrer em situações de gravidez e doenças
inflamatórias, infeciosas ou mieloma múltiplo. 13 Pode ocorrer pela presença de auto-anticorpos ou crioaglutininas.
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121
Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas (Adaptado [103]).
Leucócitos
(4-10x109/L)
Alterações
(V.R) Causa Possível
Neutrófilos
(45-70%)
Neutropénia
(<1.5x109/L)
Hereditária
Drogas, Alcolismo
Anemia megaloblástica
Causa medicamentosa
Hemoglobina Paroxística Noturna
Hiperesplenismo
Imune
Doença hemato-oncológica
Aplasia medular
Neutrofilia
(>7.0x109/L)
Hereditária
Inflamação/Infeção
Síndrome Mieloproliferativo
Tratamento com corticosteroides
Últimos meses de gravidez
Intoxicação
Tabagismo
Eosinófilos
(1-5%)
Eosinofilia
(>0.4x109/L)
Alergias
Síndrome hipereosinofílica idiopática
Hipersensibilidade medicamentosa
Infeção parasitária
Doença linfoproliferativa
Síndrome Mieloproliferativo
Doenças autoimunes
Basófilos
(<1%)
Basofilía
(> 0.1x109/L)
Síndromes Mieloproliferativos
Leucemias
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122 Leticia de Bastos
Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas (Adaptado [103]). Continuação.
Leucócitos
(4-10x109/L)
Linfócitos
(20-40%)
Linfopénia
(<1.0x109/L)
Terapêutica com corticosteroides
Imunodeficiências
Linfocitoses
(>3.7x109/L)
/L)
Infeções viral
Mononucleose Infeciosa
Lupus Sistémico Eritematoso
Toxoplasmose
Doenças Autoimunes
Leucemia Linfocítica Aguda e
Crónica
Macroglobulinémia de Waldenström
Monócitos
(2-10%)
Monocitopénia
(<0,2x109/L)
Leucemia a “hairy cells”
Terapêutica com glucocorticoides
Monocitose
(>0.7x109/L)
Infeções (tuberculose, malária, febre
tifoide, endocardite bacteriana…)
Doenças inflamatórias
Linfoma de Hodgkin
Leucemias Mielomonocítica e
Monocítica
Síndromes Mielodisplásicos
V.R: Valores de referência do Adulto; >: acima de; <: abaixo de.
Série Plaquetar
Permite observar a morfologia das plaquetas (anisocitose plaquetar, plaquetas gigantes),
granulação, distribuição (agregados, satelitismo) e confirmar alterações quantitativas (Tabela
12) [103].
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Tabela 12. Alterações quantitativas da serie plaquetar que podem ser observados com a
coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas.
Alterações
(V.R) Causa Possível
Trombocitopénias
(< 150x109/L)
Presença de auto ou alo-anticorpos, infeções virais, malária, Púrpura
Trombocitopenia Imune, Síndrome Hemolítico Urémico, CIVD, trombocitopénia
gestacional, sequestração esplénica, cirrose hepática, neoplasias hematológicas,
aplasia medular, infiltração medular ou trombopoiese ineficaz.
Trombocitoses
(> 450x109/L)
Processos inflamatórios agudos, após hemorragias ou distúrbios
mieloproliferativos.
V.R: Valores de referência do adulto; >: acima de; <: abaixo de.
8.1.2. Velocidade de Sedimentação Eritrocitária
A velocidade de sedimentação eritrocitária (VS) reflete a presença de uma resposta
inespecífica do organismo a uma agressão, embora seja útil para auxiliar e identificar um
processo inflamatório, infecioso ou neoplásico, avaliar a extensão e atividade da doença, bem
como a resposta à terapêutica. Um resultado normal não exclui a existência de doença [104].
A VS é definida pela distância, em milímetros, que os RBC percorrem por ação da
gravidade num determinado período de tempo, geralmente 1h [104].
Na presença de doença inflamatória verifica-se o aumento de proteínas de fase aguda
no plasma, nomeadamente do fibrinogénio. Como possuem carga positiva são atraídas para a
superfície dos RBC, neutralizando as cargas repulsivas. Deste modo, os eritrócitos tendem a
agregar-se com formação de rouleaux, aumentando a massa celular o que consequentemente
leva ao aumento da VS. No entanto, patologias que levam a anomalias na forma dos eritrócitos
levam à diminuição da VS, por interferir com a formação de rouleaux. Na insuficiência hepática
e cardíaca, no uso de anti-inflamatórios e na hipofibrinogenémia, a VS está diminuída por
dificuldade de agregação celular [104].
Por outro lado, em situações de anemia, leucemia, policitémia, no decurso de neoplasias
malignas, bem como nos recém-nascidos, a VS está aumentada, por diminuição das forças
repulsivas que mantêm as células em suspensão [104].
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124 Leticia de Bastos
No laboratório, a medição da VS é feita num equipamento automatizado:
Equipamento: Alifax Test 1 THL (Figura 15)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.
Método: Fotometria capilar de fluxo.
O sangue é aspirado para um capilar o qual é centrifugado a 20g, a uma temperatura de
37ºC e a leitura é feita por fotometria de infravermelhos a 950nm. Os impulsos elétricos
captados por um detetor de fotodíodos estão diretamente relacionados com a concentração de
eritrócitos no capilar. O número de impulsos medidos, por metade do tempo, é usado para
delinear a curva de sedimentação para cada amostra. Estes valores são depois convertidos para
valores comparados ao Método de Westergreen (método de referência) [105].
Valores de Referência: 0 - 20mm/h.
8.2. Hemoglobina Glicada
O doseamento da hemoglobina glicosilada ou glicada (HbA1c) é um indicador de grande
utilidade clínica, principalmente nos doentes diabéticos, pois permite obter uma retrospetiva
dos níveis médios de glicémia dos últimos 120 dias [106]. O seu doseamento é efetuado na seção
de hematologia por uma questão de logística do próprio Serviço de Patologia Clínca.
Figura 15. Alifax Test 1 THL
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125
A HbA1c resulta de uma reação não enzimática, lenta e irreversível (glicação), que
ocorre entre a glucose que circula no sangue e os grupos amina livres existentes na hemoglobina
A (HbA) dos eritrócitos. Esta reação varia em função da concentração da glucose a que os
eritrócitos são expostos, ao longo do seu tempo de vida [106, 107]. As vantagens do seu doseamento
prendem-se como facto de [107]:
Os indivíduos não necessitarem de estar em jejum para efetuar a colheita,
podendo ser feita a qualquer hora do dia;
Refletir a concentração de glucose no sangue dos últimos 3-4 meses;
A sua concentração predizer o desenvolvimento de complicações
microvasculares da diabetes;
Orientar o tratamento.
Tem como desvantagens a possibilidade de o resultado ser falseado pela presença de
hemoglobinopatias ou outras doenças que alterem o tempo de vida dos eritrócitos [107].
Equipamento: Arkray AdamsTM A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics (Figura 16)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.
Método: Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC, do inglês High Performance
Liquid Chromatography).
Esta metodologia utiliza uma coluna composta por uma resina de troca catiónico de fase
Figura 16. Arkray Adams A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics
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126 Leticia de Bastos
reversa. As hemoglobinas (Hb), carregadas positivamente, são separadas nas diferentes
componentes através da adsorção na fase estacionária (carregada negativamente), presente na
coluna cromatográfica, sendo posteriormente eluída pela fase móvel [108].
A identificação das diferentes hemoglobinas baseia-se na análise dos tempos de retenção
da amostra em relação aos controlos e a deteção é feita pela determinação da absorvência a 415
e 500nm. Podendo assim obter-se as seguintes frações: HbA1c, HbA1, HbF, HbA2 e
hemoglobinas variantes. A HbE pode sobrepor-se à HbA2. Este aparelho é capaz de diluir,
hemolisar e remover a base de Schiff (resultado da reação responsável pela formação da
hemoglobina glicosilada) automaticamente [108].
Para quantificar a hemoglobina, basta calcular a área abaixo do pico [108].
Valores de Referência: 4-6%
8.3. Eletroforese das Hemoglobinas
A hemoglobina é o principal constituinte do eritrócito e tem como principal função o
transporte de oxigénio e dióxido de carbono. É uma proteína globular com estrutura tetramérica,
constituída por dois pares de subunidades polipeptídicas, designadas de globinas. Cada cadeia
de globina encontra-se ligada a um grupo prostético - o heme, cada um contendo um átomo de
ferro, ao qual se liga o oxigénio, se se apresentar na forma ferrosa (Fe2+) [109].
Ao longo do desenvolvimento são sintetizadas quantidades variáveis de vários tipos de
hemoglobina até à altura em que o seu padrão de síntese é praticamente igual ao do adulto
(Figura 17) [96].
As hemoglobinopatias são doenças hereditárias caracterizadas por mutações dos genes
das globinas, levando a alterações quantitativas da síntese de alguma das cadeias de globina
(talassémias) ou à síntese de uma globina estruturalmente diferente - alteração qualitativa -
levando à formação de uma hemoglobina anómala, comprometendo a sua função vital [111].
Existem diversas variantes de hemoglobina, tais como a hemoglobina C, E, H e S [112].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
127
Figura 17. Representação esquemática da percentagem da produção de diversos tipos de hemoglobinas desde o inicio
da gestação até à idade adulta [110].
Equipamento: HYDRASYS, da Sebia (Figura 18)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.
Método: Eletroforese das hemoglobinas em pH alcalino (pH 8.0-9.0) e coloração com
solução de negro de amido, sendo o excesso de corante eliminado com uma solução ácida [112].
A estrutura espacial da Hb e outras propriedades moleculares dependem da sua natureza
e da sequência de aminoácidos que formem as cadeias. Uma mutação, que leva à substituição
de aminácidos, é responsável pelo aparecimento de variantes de Hb que possuem diferentes
cargas superficiais e consequentemente diferentes mobilidades eletroforéticas, dependendo do
pH, força iónica do tampão e da natureza do suporte [112].
Hemoglobinas embrionárias
Hb Gower 1 ζ2ε2
Hb Gower 2 α2ε2
Hb Portland ζ2γ2
Hb Fetal α2γ2
Hb adulto α2β2
α2δ2
Figura 18. HYDRASYS, da sebia.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
128 Leticia de Bastos
As eletroforeses são executadas a partir do hemolisado dos eritrócitos e a separação
eletroforética ocorre em gel de agarose. As hemoglobinas, carregadas negativamente, quando
submetidas a um campo elétrico irão migrar em direção ao polo positivo. Posteriormente, são
analisadas visualmente e avaliadas por densitometria, o que permite obter uma quantificação
relativa e precisa das diferentes hemoglobinas presentes no sangue periférico. Este método
permite separar e identificar hemoglobinas normais e as principiais hemoglobinas anómalas:
HbS ou HbD e HbE ou HbC (Figura 19) [112].
HbS: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma valina.
HbC: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma lisina.
HbE: substituição do ácido glutâmico na posição 26 da cadeia β por uma lisina.
HbD: substituição do ácido glutâmico na posição 121 da cadeia β por uma glutamina.
Valores de Referência: Adulto - HbA1 ≥ 96.5%; HbA2 ≤ 3.5% e HbF ≤ 2.0%
8.4. Hemostase
A hemostase é um processo fisiológico complexo que permite preservar a normal
funcionalidade da circulação sanguínea, tendo um papel importante na manutenção da
integridade vascular e fluidez do sangue [113].
Figura 19. Migração, em pH alcalino, das hemoglobinas normais à esquerda e as variantes mais frequentes à direita.
+
-
Migração
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129
O sistema hemostático engloba cinco componentes fundamentais, os vasos sanguíneos,
plaquetas, que devem ser normais em número e funcionalmente, fatores plasmáticos, seus
inibidores e o sistema fibrinolítico [113].
Após uma lesão vascular ocorre uma vasoconstrição local e a exposição ao colagénio
conduz à adesão e agregação plaquetária, com formação de um trombo plaquetário, e à ativação
da cascata da coagulação - hemostase primária [113].
Na hemostase secundária, segundo o modelo clássico14, existem 2 vias distintas que
convergem para uma via comum, com formação do coágulo de fibrina. A via intrínseca é
ativada quando o quininogénio de alto peso molecular, a pré-calicreína e o fator XII entram em
contacto com a superfície dos fosfolípidos das plaquetas ativadas (carga negativa), enquanto
que a via extrínseca é ativada pelo fator tissular, sendo a sua expressão induzida, na superfície
das células, pela lesão dos tecidos e citocinas inflamatórias (Figura 20) [113].
Toda a cascata da coagulação é regulada por vários mecanismos inibidores, que têm por
objetivo limitar a extensão e a disseminação do processo da coagulação, sendo de destacar o
sistema da proteína C/proteína S, a antitrombina e o inibidor do fator tissular [113].
14 Foi proposto um novo conceito para a cascata da coagulação, que começa a ser cada vez mais evidente a existência de apenas
uma via para a formação do trombo de fibrina.
Figura 20. Cascata da coagulação [114]. Ambas as vias intrínseca e extrínseca convergem na
ativação do fator X, que juntamente com o fator V
ativado, Ca2+ e fosfolípidos irão converter o fator II a
trombina, desencadeando a formação do coágulo de
fibrina. O feedback positivo amplifica o sinal, no
entanto um feedback negativo promove a ativação de
vários mecanismos anticoagulantes, com a inibição de
diversos fatores procoagulantes pela antitrombina,
inibição do complexo TF/FVIIa/FXa pelo inibidor da
via do fator tissular, e inativação proteolítica do FVa
e FVIIIa pela proteína C ativada. A trombina, aPC e
outras proteases de coagulação regulam a inflamação
e a remodelação do tecido.
TF: fator tissular (do inglês tissue factor); a: ativado;
F: fator; AT: Antitrombina; TFPI: inibidor da via do
fator tissular (do inglês tissue factor pathway
inhibitor), PC: proteína C.
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Relatório de Estágio
130 Leticia de Bastos
Por fim, segue-se a fibrinólise (hemostase terciária), importante para restaurar a
integridade do vaso, sendo mediada pelo ativador do plasminogénio tissular (t-PA) que converte
o plasminogénio em plasmina, que por sua vez, degrada a fibrina, podendo ser inativada pela
α2-antiplasmina (α2-AP). A fibrinólise é bloqueada pelo inibidor do ativador do plasminogénio
(PAI-1), produzido essencialmente pelas células endoteliais (Figura 21) [113].
É necessário que haja um equilíbrio constante entre a coagulação e a fibrinólise, tanto
que uma potencial disfunção em qualquer uma das etapas pode levar ao aparecimento de
hemorragias ou tromboses, sendo por isso muito importante a avaliação laboratorial da
hemostase. Testes específicos devem ser efetuados sempre que se verifiquem alterações nos
testes de rastreio, e são necessários para determinar a natureza do defeito.
Equipamento: STA Compact Max® (Figura 22)
Figura 21. Sistema fibrinolítico e inibidores da fibrinólise [115].
PDF: Produtos de degradação da fibrina; PAI-1: inibidor do ativador do plasminogénio, t-PA: ativador do plasminogénio
tecidual; u-PA: urocinase; α2-AP: α2-antiplasmina.
Figura 22. STA Compact Max®, da Satgo.
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131
Amostra: Plasma citratado, obtido por centrifugação de sangue total colhido para tubo
com anticoagulante citrato trissódico 0,109M, a 1500rpm, 10 minutos. Para pedidos de
coagulação especiais tem de se proceder a uma dupla centrifugação da amostra para se obter
plasma pobre em plaquetas. A contagem de plaquetas é efetuada no equipamento dos
hemogramas, sendo que apenas se processam os plasmas que apresentarem um valor de
plaquetas inferior a 5x109/L; se o valor obtido for superior procede-se a uma nova
centrifugação.
O STA Compact Max® é concebido para auxiliar no diagnóstico de distúrbios
hemostáticos ou na monitorização da terapêutica anticoagulante. Possui 2 tecnologias
fundamentais: o princípio de medição por cronometria e o princípio de medição por fotometria
[116].
O princípio de medição por cronometria consiste na deteção mecânica do coágulo, em
que se mede a variação da amplitude de oscilação da esfera, através de sensores indutivos. Cada
cuvete de reação possui uma esfera metálica que apresenta um movimento pendular obtido
graças a um campo eletromagnético alternativo criado por 2 bobinas independentes. À medida
que a viscosidade aumenta, devido à formação do coágulo de fibrina, a amplitude de oscilação
diminui, sendo medido o tempo, em segundos, que o coágulo demora a formar-se (Figura 23)
[116].
O princípio de medição por fotometria é o principio de deteção das análises
cromogénicas (reacção enzimática) ou imunoturbidimétricas. Baseia-se na determinação da
absorvência (densidade ótica) de uma fonte de luz monocromática (405 ou 540nm) que
posteriormente é convertida em concentração, pela aplicação da Lei de Lambert-Beer [116].
No laboratório, diversos parâmetros são determinados para avaliar a hemóstase.
Figura 23. Princípio de medição por cronometria [117].
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132 Leticia de Bastos
8.4.1. Determinação do Tempo de Protrombina
O tempo de protrombina (TP) é utilizado para monitorizar a terapêutica com
anticoagulante oral, controlo da síntese hepática e na avaliação da presença de distúrbios na
cascata da coagulação ao nível da via extrínseca e comum (Tabela 13) [118].
Método: Cronométrico [119]
Na presença de tromboplastina cálcica é medido o tempo de coagulação do plasma do
doente [119].
Valores de Referência: 12,8-15,70seg; 74,8-106,5%
Na tentativa de obviar a enorme discrepância entre os diferentes tipos de testes que
avaliam o TP, a OMS preconizou o uso do Índice Internacional Normalizado (INR, do inglês
International Normalized Ratio) para padronizar os resultados do teste. Para o cálculo do INR
os fabricantes da tromboplastina fornecem o International Sensitivity Index (ISI) [120]:
𝐼𝑁𝑅 = (𝑇𝑃 𝑈𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑚 𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜𝑠
𝑇𝑃 𝑅𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑚 𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜𝑠)
𝐼𝑆𝐼
8.4.2. Determinação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada
O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, do inglês, activated partial
thromboplastin time) avalia a via intrínseca e comum da cascata da coagulação, sendo também
utilizado na monitorização da terapêutica com heparina (Tabela 13) [118].
Método: Cronométrico [121]
Na presença de cefalina (substituto plaquetário), caulino (ativador do fator XII) e cloreto
de cálcio é medido o tempo de coagulação do plasma [121].
Valores de Referência: 25,4-34,3seg
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133
8.4.3. Determinação do Tempo de Trombina
O tempo de trombina (TT) avalia o tempo de conversão do fibrinogénio em fibrina [118];
no entanto, não sofre alterações em situações de défices de fator XIII (fator estabilizador da
fibrina) (Tabela 13) [122].
Método: Cronométrico [122]
Na presença de uma determinada quantidade de trombina cálcica é medido o tempo de
coagulação do plasma [122].
Valores de Referência: 11-16seg
8.4.4. Determinação do Fibrinogénio
Glicoproteína de fase aguda positiva, sintetizada a nível hepático, presente em grande
quantidade no plasma, fundamental para a formação do trombo de fibrina (Tabela 13) [118].
Método: Cronométrico (método de Clauss) [123]
Na presença de um excesso de trombina, o tempo de coagulação de um plasma, diluído
em proporções adequadas, depende diretamente do nível de fibrinogénio plasmático [123].
Valores de Referência: 2-4g/L
8.4.5. Determinação do Anticoagulante Lúpico
Imunoglobulinas dirigidas contra complexos fosfolípidos/proteínas, com ação
procoagulantes. interferindo com teste laboratoriais dependentes de fosfolípidos. Encontra-se
associado a doenças auto-imunes, tromboses e abortos recorrentes, sendo que a sua presença
pode ser transitória ou persistente [125].
Método: Cronométrico [125]
O teste de screening é realizado na presença de uma baixa concentração fosfolípidos,
em que na presença de anticoagulante lúpico o tempo de coagulação será prolongado.
Posteriormente, o teste confirmatório é realizado com uma concentração mais elevada de
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134 Leticia de Bastos
fosfolípidos que neutralizam os anticoagulantes lúpicos presentes no plasma a testar, e
consequentemente o tempo de coagulação será mais curto, comparativamente ao teste de
screening [125].
Os reagentes contêm fosfolípidos, cálcio, um inibidor da heparina e veneno de víbora
Russell (um ativador do fator X que na presença de cálcio desencadeia a coagulação,
eliminando as interações dos fatores da via intriseca e extrínseca) [125].
Valores de Referência: Negativo ou Positivo (rácio superior a 1.2)
8.4.6. Determinação da Antitrombina III
Gliciproteína de síntese hepática, responsável pela inibição de diversos fatores da
coagulação, nomeadamente os fatores IIa (trombina), IXa, Xa, XIa, XIIa, sendo esta reação
acelerada pela presença de heparina [126].
Os défices de antitrombina III podem ser hereditários ou adquiridos, podendo ocorrer
em situações de CIVD, síndromes nefróticos ou alterações hepáticas [126].
Método: Cromogénico [126]
Primeiro ocorre a incubação do plasma com heparina e um excesso de trombina. De
seguida, é medida a trombina residual, pela sua atividade amidolítica no substrato cromogénio.
A libertação de paranitroanilina é medida a 405nm. A quantidade de trombina neutralizada é
proporcional à quantidade de antitrombina presente no meio [126].
A quantificação não é influenciada pela heparina terapêutica [126].
Valores de Referência: 80,0-130,0%
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135
Tabela 13. Teste de primeira linha para investigação de alterações hemostáticas
(Adaptado de [124]).
Parâmetros doseados
Condições
TP aPTT TT Fibrinogénio Contagem
Plaquetas
N N N N N
Hemostase normal
Disfunção plaquetária (congénita ou adquirida)
Défice de FXIII
Défice/doença leves da coagulação
Distúrbios fibrinolíticos
Distúrbios vasculares
N N N N
Défice FVII (congénito ou adquirido)
Anticoagulante oral (cumarínicos)
Doença hepática crónica
N N N N
Défice de fatores da via intrínseca (congénito
ou adquirido)
Doença de von Willebrand (défice de FVIII)
Anticoagulante lúpico
Terapêutica com heparina
N N N
Défice de Vitamina K
Anticoagulantes orais
Défice de fatores da via intrínseca e extrínseca
Doença hepática
N/Anormal N
Altas doses de heparina
Doença hepática
Disfibrinogénia ou Hipofibrinogenémia
Inibição da polimerização da fibrina
Hiperfibrinólise
N N/Anormal Doença hepática
Doença hepática aguda
CIVD
N: normal; ↑: alto; ↓: baixo.
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136 Leticia de Bastos
8.4.7. Determinação da Proteína C ativada
Proteína de síntese hepática, vitamina K-dependente, que se encontra no plasma na
forma de pro-enzima, sendo ativada na presença da trombina, cálcio e fosfolípidos. Esta
ativação é potencializada por um fator endotelial, a trombomodulina. Quando ativada e na
presença da proteína S, regula o processo de coagulação, neutralizando os fatores Va e VIIIa.
A sua ação é inibida pelo inibidor da proteína C ativada e pela α1-antitripsina [127].
Os défices de proteína C podem ser congénitos, que se traduzem essencialmente na
trombose venosa com recidivas, ou adquiridas, podendo ocorrer pela presença de doença
hepáticas, tratamento com medicamentos anti-vitamina K e CIVD [127].
Método: Cromogénico [127]
Na presença de um ativador específico, a proteína C presente no plasma é ativada. A
quantidade de enzima formada é doseada pela sua atividade amidolítica sobre um substrato
sintético. A libertação de paranitroanilina é medida a 405nm [127].
Valores de Referência: 70,0-130,0%
8.4.8. Determinação da Proteína S Livre
Proteína plasmática, vitamina K-dependente, sintetizada no fígado, que atua como
cofator da proteína C ativada, amplificando a sua ação anticoagulante [128].
Os défices em proteína S predispõe a um estado de hipercoaguabilidade que aumenta o
risco de doença tromboembólica, os quais podem ser de origem congénita ou adquirida, e
podendo estar associados a síndromes inflamatórios, alterações hepáticas, síndrome nefrótico,
contracetivos orais e tratamentos com medicamentos anti-vitamina K [128].
Método: Imunoturbidimétrico [128].
As microesferas de látex possuem anticorpos monoclonais específicos para a proteína
S; na presença da proteína S livre, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas microesferas,
elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [128].
Valores de Referência: 54-124%
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137
8.4.9. Determinação dos D-Dímero
Ao nível do trombo, a fibrina é degradada pela plasmina em D-Dímeros, que
testemunham a atividade fibrinolítica, secundária a ativação da coagulação, sendo útil a sua
determinação para a exclusão de tromboembolismo venoso, quando o seu valor é inferior a 500
µg/L. Também se verifica o aumento dos D-Dímeros na CIVD, períodos pós-operatórios,
neoplasias, hemorragias e patologias infeciosas graves [129].
É recomendado a determinação dos D-Dímeros antes de se iniciar qualquer terapêutica
anticoagulante [129].
Método: Imunoturbidimétrico [129]
As microesferas de látex possuem anticorpos monoclonais específicos para D-Dímeros;
na presença de D-Dímeros, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas microesferas,
elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [129].
Valores de Referência:0-500µg/L
8.4.10. Fator von Willebrand
Glicoproteína sintetizada pelas células endoteliais e macrófagos. Desempenha um papel
preponderante na adesão das plaquetas ao sub-endotélio vascular e na formação de trombos
pela sua ligação aos complexos glicoproteicos Ib/IX e IIb/IIIa. Também intervém na hemostase
secundária como transportador do fator VIII, protegendo-o da degradação [130].
O défice de factor von Willebrand está associado à doença de von Willebrand; no
entanto, outras patologias podem levar à diminuição deste fator, nomeadamente mieloma,
linfoma e lúpus sistémico eritematoso. O aumento desta glicoproteína ocorre sempre que o
epitélio vascular é lesado [130].
Método: Imunoturbidimétrico [130]
As microesferas de látex possuem anticorpos específicos para o fator von Willebrand;
na presença do fator von Willebrand, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas
microesferas, elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [130].
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138 Leticia de Bastos
Valores de Referência: Grupo sanguíneo O: 42.0-141.0%; 0.42-1.41UI/mL e Grupo
sanguíneo A, B e AB: 66.1-176.0%; 0.66-1.76UI/mL
8.4.11. Fator VIII
Glicoproteína sintetizada no fígado, baço, rins e linfócitos, que circula no plasma ligado
ao fator de von Willebrand (ligação não covalente). Pode ser ativado pela trombina e pelo fator
Xa. O fator VIIIa acelera a ativação do fator X, na presença do fator IXa, fosfolípidos e cálcio
[131].
Encontra-se diminuído na Hemofilia A, na presença de inibidores específicos do fator
VIII, e nalgumas doenças como a de von Willebrand. No entanto, pode estar aumentado em
complicações tromboembólicas, aterosclerose coronária, insuficiência renal, diabetes e
síndromes inflamatórios [131].
Método: Cronométrico [131]
Na presença de cefalina e do ativador, é determinado o tempo de coagulação de um
sistema onde todos os fatores são presentes em excesso, à exceção do fator VIII da amostra a
testar [131].
Valores de Referência: 50-150%
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139
9. Valência de Microbiologia
9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia
O Laboratório de Microbiologia pode fornecer informações cruciais para o diagnóstico
e tratamento de doenças infeciosas suspeitas ou confirmadas, contudo tal só é possível se as
amostras forem de boa qualidade e acompanhadas por informação clínica pertinente (Figura
24).
Neste setor, todo o procedimento que envolva manipulação de amostras
biológicas/microrganismos é feito em câmaras de fluxo laminar, de modo a assegurar a
manutenção do ar estéril na zona de trabalho e a proteção do operador. Na câmara de fluxo
Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, Tomar
Responsáveis da secção:
Dra. Paula Gama (Patologista Clínica)
Dra. Arminda Gonçalves (Técnica Superior de Saúde)
Dr. Luís Morais (Técnico Superior de Saúde)
Período de Estágio: 05/06/2017 - 04/08/2017
Volume de trabalho: Em média cerca de 1641pedidos/mês
Atividades realizadas na seção no referendo período:
Receção de produtos e avaliação da sua conformidade;
Processamento de amostras biológicas;
Execução, fixação e coloração de esfregaços;
Realização de testes screening para identificação de microrganismos;
Execução de testes de identificação e testes de suscetibilidade aos
antimicrobianos.
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140 Leticia de Bastos
laminar existe um bico de Bunsen para a esterilização do material a uso (pinças ou tesouras) e
fixação dos esfregaços. As ansas utilizadas são estéreis e de uso único.
Figura 24. Marcha laboratorial em Microbiologia, quando um doente possui uma infeção.
Doente com Infeção
Colheita e transporte da amostra
Receção da amostras e avaliação da
conformidade
Observação do Exame Direto
Observação do Exame Cultural
Provas Complementares
Culturas Puras
Identificação
Teste de suscetibilidade aos
antimicrobianos
Informação
preliminar
Validação
final
INF
OR
MA
ÇA
O C
LÌN
ICA
Processamento da Amostra
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141
9.2. Exame Microscópico
O exame microscópico, que inclui o exame “a fresco” e/ou após coloração, é a primeira
etapa do estudo para identificação de microrganismos. Também permite avaliar a qualidade da
amostra, bem como observar a existência de possíveis elementos celulares cuja presença pode
facilitar o diagnóstico.
9.2.1. Exame Direto a Fresco
Amostra: Produto biológico.
Objetivo: Permite fazer uma avaliação semi-quantitativa de elementos celulares e
microrganismos (bactérias, fungos e parasitas).
Procedimento: Colocar o produto numa lâmina, cobrir com uma lamela e observar ao
microscópio com a objetiva de 10 e 40x. No caso da urina, centrifugar a 1500rpm, 10 minutos,
antes de observar.
9.2.2. Exame após Coloração
Equipamento: Poly Stainer, da IUL Instruments®
Antes de se proceder à coloração, os esfregaços têm de estar secos e fixados pelo calor,
à chama do bico de Bunsen. Deste modo, as formas vegetativas morrem e aderem à lâmina.
Depois de corados e secos, a observação é feita essencialmente com a objetiva de
imersão (100x).
Técnica de Esfregaços
Amostras biológicas líquidas e culturas de caldo: colocar o produto numa
lâmina e estender em camada fina.
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142 Leticia de Bastos
Amostras biológicas sólidas e culturas de meios sólidos: colocar sobre a lâmina
uma gota de água destilada e juntar uma pequena porção do produto, emulsioná-la na
gota, estendendo de seguida.
Amostras espessas ou purulentas: técnica de estiramento - colocar uma porção
de produto numa lâmina e pressionando com outra lâmina, fazer deslizar as duas
lâminas ao longo uma da outra, várias vezes.
Exsudados colhidos por zaragatoa: rolar a zaragatoa sobre a lâmina. Se tiver
vindo só uma zaragatoa, primeiro proceder à sementeira dos meios de cultura sólidos,
de seguida fazer 2 esfregaços e só depois inoculá-la em meio líquido de
enriquecimento, se for necessário.
Coloração de Gram
Amostra: Produtos biológicos ou colónias isoladas provenientes do exame cultural.
Objetivo: Permite o diagnóstico presuntivo do agente infecioso, avaliação da qualidade
da amostra e da flora saprófita existente, para além de ser útil na classificação das bactérias em
Gram positivo ou Gram negativo, assim como distinguir a forma e o arranjo das células após
divisão celular. As bactérias podem apresentar-se, essencialmente, sob a forma de cocos
(redondas), bacilos (alongadas ou em bastonete), vibrião (curva) ou espirilo (espiralada).
Princípio: As bactérias podem ser classificadas em Gram positivo ou Gram negativo,
tendo em conta a estrutura da parede celular e a sua percentagem em peptidoglicano. As
bactérias Gram positivo possuem uma parede celular rica em peptidoglicano, capaz de reter o
primeiro corante, logo adquirem a cor púrpura. Como a parede das bactérias Gram negativo é
formada por uma fina camada de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de
lipopolissacarídeos e proteínas, que não retém o cristal violeta, sendo contra-coradas pela
safranina apresentando uma coloração vermelha (Figura 25) [132].
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Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
143
Procedimento: Colocar as lâminas no suporte do equipamento, verificar os reagentes e
selecionar o programa no aparelho de coloração. O programa executa os seguintes passos:
1. Cristal de violeta (1º corante): 1 minuto;
2. Lavagem com água corrente: 1,5 minutos;
3. Iodina (mordente, ajuda a fixar o primeiro corante): 1 minuto;
4. Lavagem com água corrente: 1,5 minutos;
5. Descoloração com solução álcool/acetona (solvente orgânico): 1 minuto;
6. Lavagem com água corrente: 1 minuto;
7. Safranina (2º corante, contraste): 1 minuto;
8. Secagem da lâmina.
Coloração de Kinyoun
Amostra: Líquidos serosos após descontaminação (observação de interferências
quando corados pela Auramina) e todos os produtos após exame cultural.
Objetivo: Permite detetar a presença de bacilos ácido-álcool resistentes (BAAR).
Figura 25. Representação esquemática da parede celular
das bactérias Gram negativo e Gram positivo [133].
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144 Leticia de Bastos
Princípio: Os bacilos de Koch (BK), quando corados pela Fuscina, por possuírem uma
quantidade elevada de lípidos na parede celular, que lhe confere hidrofobicidade, vão resistir
fortemente à descoloração com soluções ácido-álcool, apresentando-se vermelhos sobre um
fundo azul.
Procedimento: Colocar as lâminas no suporte do equipamento, verificar os reagentes e
selecionar o programa no aparelho de coloração. O programa executa os seguintes passos:
1. Fucsina (1º corante): 4 minutos;
2. Lavagem com água corrente: 30 segundos;
3. Descorante ácido-álcool: 5 segundos;
4. Lavagem com água corrente: 30 segundos;
5. Azul de Metileno (2º corante, contraste): 30 segundos;
6. Lavagem com água corrente: 30 segundos;
7. Secagem da lâmina.
Coloração de Auramina O
Amostra: Observação de produtos descontaminados, exceto líquidos serosos.
Objetivo: Detetar a presença de BAAR.
Princípio: A Auramina O é um corante fluorescente que cora os BAAR de amarelo-
esverdeado, o que permite distingui-las de outros microrganismos e estruturas celulares
presentes na lâmina. Este é um bom método para rastrear amostras em caso de suspeita de
tuberculose, onde a contagem de bacilos é geralmente baixa.
Procedimento: Colocar as lâminas no suporte do equipamento, verificar os reagentes e
selecionar o programa no aparelho de coloração. O programa executa os seguintes passos:
1. Auramina (1º corante): 15 minutos;
2. Lavagem com água corrente: 40 segundos;
3. Descorante ácido-álcool: 40 segundos;
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
145
4. Lavagem com água corrente: 30 segundos;
5. Fuscina (2º corante): 2 minutos;
6. Lavagem com água corrente: 30 segundos;
7. Secagem da lâmina.
9.2.3. Exame Direto a Fresco com Contraste Negativo por Tinta da China
Amostra: Produtos biológicos, nomeadamente LCR, ou colónias em cultura
Objetivo: Permite evidenciar a presença de Cryptococcus spp.
Princípio: A Tinta da China é utilizada como material contrastante. A presença da
cápsula do Cryptococcus spp. exclui a tinta, criando um halo transparente ao redor da cápsula
fúngica.
Procedimento: Diluir uma gota de Tinta da China em uma gota de soro fisiológico num
tubo e homogeneizar, posteriormente:
Se a amostra biológica for líquida ou de cultura em meio líquido, é necessário
proceder à sua centrifugação (1500rpm, 20 minutos) e pipetar uma gota do sedimento
para o tubo contendo a Tinta da China diluída;
Se forem colónias em meio sólido retirar uma porção da colónia em estudo e
colocar no tubo que contem a Tinta da China diluída.
Homogeneizar bem a preparação e pipetar uma pequena gota sobre uma lâmina e cobrir
com uma lamela. De seguida, observar ao microscópio.
9.2.4. Análise Morfológica de Fungos Filamentosos
Amostra: Colónias de fungos filamentosos em cultura.
Objetivo: Permite observar o tipo de hifas (septadas ou não), o pigmento (hialinos ou
demácios), bem como as estruturas reprodutoras dos fungos filamentosos, de modo a auxilixar
na sua identificação.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
146 Leticia de Bastos
Procedimento: Tocar com a fita-cola na periferia da colónia e colocar sobre uma
lâmina que comtém uma gota de líquido de montagem (Azul de Lactofenol). De seguida
cobrir com uma lamela e observar ao microscópio.
9.3. Exame Cultural
A cultura primária de produtos biológicos para o estudo microbiológico destina-se à
recuperação de microrganismos para posterior identificação e eventual teste de suscetibilidade
aos antimicrobianos, quando justificável e possível. Para tal, é necessário adequar os meios de
cultura ao produto biológico a analisar assim como conhecer o tempo e as condições ideias de
crescimento dos agentes patogénicos.
Existem meios de cultura de natureza sólida, semi-sólida e líquida. No laboratório,
apenas são usados meios sólidos e líquidos. Os sólidos permitem a observação de colónias que
se desenvolvem à superfície da gelose e auxiliam na sua identificação. Os meios líquidos são
usados para o enriquecimento de produtos biológicos.
Os meios de cultura são escolhidos conforme o protocolo estabelecido pelo laboratório,
podendo ser:
Não seletivos: sem inibidores de crescimento e com nutrientes, permitem o
crescimento da grande maioria dos microrganismos encontrados em produtos
biológicos.
Seletivos: contêm uma mistura de antimicrobianos ou substâncias químicas que
permitem o crescimento de alguns microrganismos em detrimento de outros, cujo
crescimento é inibido.
Diferenciais: com substâncias químicas ou corantes, que permitem distinguir
grupos de microrganismos presentes no mesmo inóculo.
De enriquecimento: com nutrientes, permitem a multiplicação de
microrganismos de interesse que se encontram no produto biológico em baixo inóculo.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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147
De transporte: mantêm a viabilidade dos microrganismos até 24h, geralmente,
inibindo a sua multiplicação e a sua escolha depende do produto biológico (meio
Amies, Cary-Blair, Portagerm Amies Agar).
De identificação: evidenciam características bioquímicas de determinadas
espécies, permitindo o seu reconhecimento e identificação.
No laboratório estão à disposição os seguintes meios (Tabela 14):
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]).
Meio de Cultura Princípio Classificação
BHI
(Caldo Cérebro e
Coração, do
inglês Brain
Heart Infusion)
Meio de enriquecimento composto por uma base
nutritiva de coração e cérebro. Meio líquido de
enriquecimento
não seletivo
Selenito
Utilizado para coprocultura. A seletividade do
meio baseia-se na presença de selenito, que inibe a
maioria das Enterobacteriaceae, incluindo
algumas estirpes de Shigella spp e bactérias Gram
positivo. A subcultura para meios sólidos deve
ocorrer entre 6-12h (prazo médio de inibição de
outras estirpes, tal como o Proteus spp.)
Meio líquido de
enriquecimento
seletivo para
Salmonella spp.
COS
(Gelose de
Columbia +5% de
Sangue de
Carneiro)
Meio nutritivo, rico, complementado com sangue
desfibrinado de carneiro que permite observar a
presença ou não de hemólise e o tipo de hemólise
(critério básico para orientação da identificação de
algumas bactérias, como os Streptococcus spp. e
Staphylococcus spp.). Também é adequada para o
isolamento de microrganismos anaeróbios.
Meio sólido não
seletivo
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148 Leticia de Bastos
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.
CNA
(Gelose COS com
ácido nalidíxico e
colistina)
Meio rico que contém uma mistura de peptonas
adaptado à cultura de microrganismos exigentes
(Streptococcus spp., Listeria spp.). A mistura de
antimicrobianos inibe o crescimento da grande
maioria das bactérias Gram negativo e dos
Bacillus.
Meio sólido
seletivo para
Gram positivo
PVX
(Gelose
Chocolate
PolyViteX)
A Gelose de Chocolate é obtida a partir da Gelose
Columbia ao qual foi adicionado sangue de
carneiro aquecido a 80ºC (hemólise dos
eritrócitos), sendo rica em fatores X (hemina) e V
(NAD) fornecidos pela hemoglobina. É ainda
adicionado o PolyViteX, que fornece ao meio
vitaminas, aminoácidos, co-enzimas, glucose e
outros fatores que melhoram o crescimento de
estripes fastidiosas como Neisseria spp.,
Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae.
Meio sólido não
seletivo
HAE2
(Gelose
Chocolate
Heamophilus 2)
Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma
mistura de antimicrobianos que permitem inibir a
maioria das bactérias Gram positivo e das
leveduras.
Meio sólido
seletivo para
Haemophilus spp.
VCA3
(Gelose
Chocolate
VCAT)
Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma
mistura de antimicrobianos (Vancomicina,
Colistina, Anfotericina B, Trimetoprim) que
permitem inibir a maioria das bactérias e leveduras.
Meio sólido
seletivo para
Neisseria
gonorrhoeae e
Neisseria
meningitidis
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Leticia de Bastos
149
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.
HEK
(Gelose Hektoen)
O meio permite evidenciar colónias que fermentam
1 dos 3 açúcares contidos no meio (lactose,
sacarose, salicina) formando colónias amarelas ou
amarelas-salmão; os restantes produzem colónias
verdes ou verdes-azuladas. Os microrganismos que
reduzem o tiossulfato de sódio produzem sulfureto
de hidrogénio (H2S) formam colónias com centro
negro. As colónias de Salmonella são verdes ou
verdes-azuladas, com ou sem centro negro. As
colónias de Shigella são verdes ou verdes-azuladas
sem centro negro. A presença de sais biliares inibe
o crescimento das bactérias Gram positivo e
retardam o crescimento de algumas
Enterobacteriaceae.
Meio sólido
seletivo e
diferencial para a
Salmonella spp. e
Shigella spp.
CAM
(Gelose
Campylosel)
A presença de sangue de carneiro facilita o
crescimento da espécie pesquisada. A fertilidade é
aumentada devido à utilização de redutores. A
seletividade é assegurada pela presença de
antimicrobianos no meio que inibem a maior parte
das bactérias e fungos. As colónias características
de Campylobacter são pequenas e acinzentadas.
Meio sólido
seletivo para
Campylobacter
spp.
YER
(Gelose Yersinia)
Meio destinado à deteção e diferenciação das
diferentes espécies de Yersinia spp. O manitol e o
vermelho neutro presente no meio, permitem a sua
diferenciação pela coloração das colónias rosa-
escuro a vermelhas. A presença de colato,
desoxicolato, cristal violeta, Irgasan e de
antimicrobianos inibe o desenvolvimento das
bactérias Gram positivo e da maioria das Gram
negativo.
Meio sólido
seletivo
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150 Leticia de Bastos
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.
CLED
(Gelose Cistina,
Lactose,
Deficiente em
Eletrólitos)
O meio permite diferenciar os microrganismos que
fermentam a lactose dos que não fermentam,
recorrendo ao indicador azul de bromotimol. As
bactérias fermentadoras da lactose originam
colónias amarelas por acidificação do meio,
enquanto que as não fermentadoras originam
colónias verdes, azuis ou incolores. A baixa
concentração de eletrólitos impede o swarming do
Proteus.
Meio sólido não
seletivo e
diferencial
MCK
(Gelose
MacConkey)
A presença de lactose no meio permite evidenciar
as bactérias fermentadoras pela viragem do
indicador de pH, originando colónias rosa ou
vermelhas. As que não fermentam originam
colónias incolores. A seletividade é proporcionada
pelos ácidos biliares e cristal violeta, que impedem
o crescimento de bactérias Gram positivo.
Meio sólido
seletivo para
Gram negativo e
diferencial
STRB
(Gelose
chromIDTM
Strepto B)
Este meio contém base nutritiva que associa
diferentes peptonas e 3 substratos cromogénicos.
As colónias sugestivas de S. agalactiae
apresentam-se rosa claro a vermelho, redondas e
em forma de pérola. A maioria das outras espécies
bacterianas e leveduras não se desenvolvem neste
meio ou não formam colónias características.
Meio sólido
cromogénico e
diferencial para
Streptococcus
agalactiae
(Grupo B)
SGC2
(Gelose
Sabouraud com
Cloranfenicol 2)
A acidificação do meio e a presença de peptonas e
dextrose favorecem o desenvolvimento de fungos e
leveduras. A presença de gentamicina e
cloranfenicol inibem o crescimento bacteriano.
Meio sólido
seletivo para
leveduras e
fungos
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151
Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.
CAN2
(Gelose
chromIDTM
Candida)
Meio cromogénico para isolamento seletivo de
fungos leveduriformes e identificação de espécies
de Candida albicans, que apresentam uma
coloração azul pela hidrólise de um substrato
cromogéneo de hexosaminidase. Também permite
a diferenciação presuntiva de um conjunto de
espécies que agrupa C. tropicalis, C. lusitaniae e C.
kefyr, que hidrolisam um segundo substrato,
apresentando colónias com uma coloração rosa.
Assim, permite diferenciar as culturas mistas e
orientar a identificação para outras espécies. A
mistura de inibidor permite inibir o crescimento da
maior parte das bactérias.
Meio sólido
cromogénico
Meio Müller
Hinton
Possui uma substancial fonte de proteínas e
carboidratos que proporcionam o crescimento
bacteriano, e uma baixa concentração de timina e
timidina e níveis adequados de cálcio e magnésio.
Meio
recomendado para
TSA pelo método
de Kirby-Bauer,
segundo a
EUCAST.
TSA: teste de susceptibilidade aos antimicrobianos; EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.
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152 Leticia de Bastos
9.3.1. Técnica de Sementeira
Meios Sólidos em Placa
Quatro quadrantes
Espalhamento
Semi-quantitativa
Figura 26. Representação esquemática da técnica de sementeira em quatro quadrantes.
Figura 27. Representação esquemática da técnica de sementeira por espalhamento.
Rotação da placa cerca de 90º
Figura 28. Representação esquemática da técnica de sementeira semi-quantitativa.
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153
Inundação
Verter uma porção do líquido biológico em estudo sobre a gelose e espalhar girando a
placa em movimentos rotativos.
Método de Maki
Rolar o catéter sobre a gelose com auxílio de uma pinça ou ansa esterilizada.
Meios Líquidos
Com uma pipeta, ansa ou zaragatoa, dependendo do produto, transferir uma pequena
porção da amostra para o meio líquido e homogeneizar
9.3.2. Condições de Incubação
As condições e o tempo de incubação dos meios de cultura vão variar consoante as
necessidades dos microrganismos em estudo.
Existem disponíveis no laboratório três estufas: duas com atmosfera de aerobiose e uma
com atmosfera enriquecida com 5% de CO2. Também existem saquetas comercias para gerar
atmosferas de microaerofilia em sacos.
A temperatura ótima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos ronda os
35+2ºC, tendo um desenvolvimento otimizado com uma humidade igual ou superior a 70%,
sendo também importante para a manutenção da hidratação dos meios durante o período de
incubação. Uma das estufas de aerobiose encontra-se a 25+2ºC, para a incubação dos meios de
cultura na suspeita da presença de fungos filamentosos.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
154 Leticia de Bastos
9.3.3. Aspeto Macroscópico das Colónias
Depois das culturas terem cumprido o período de incubação, após uma observação
diária, os meios sólidos permitem avaliar a dimensão, densidade, bordo, cor, textura,
consistência, produção de pigmento, tipo de hemólise e cheiro das colónias.
A expressão da hemólise ajuda na diferenciação e identificação presuntiva das bactérias:
β-hemólise (hemólise total): Presença de halo transparente ao redor das colónias;
α-hemólise (hemólise parcial): Presença de halo esverdeado ao redor das colónias;
γ-hemólise (sem hemólise): Os eritrócitos permanecem íntegros.
No exame cultural, se apresentar o desenvolvimento de bactérias potencialmente
patogénicas ou estritamente patogénicas deverá proceder-se à identificação do microrganismo
e realização do teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA). Caso contrário, se não
houver desenvolvimento de bactérias patogénicas, o resultado deverá ser expresso por “não se
desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”, ou como “negativo”, se o produto for
de origem esteril.
9.4. Testes de Identificação Presuntiva
9.4.1. Prova da Catalase
Teste Comercial: ID color Catalase (ID-ASE), da bioMérieux.
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva, com 18-24h de incubação
Objetivo: Distinguir os Staphylococcus spp., que são detentores da enzima catalase, dos
Streptococcus spp. ou Enterococcus spp.
Princípio: Na presença da enzima catalase o peróxido de hidrogénio (H2O2) é
hidrolisado em água e oxigénio, verificando-se uma efervescência pela libertação de O2 (teste
positivo) [135].
Procedimento: Com uma ansa retirar 1 a 2 colónias, e introduzi-las num tubo contendo
1,5mL de H2O2 (3%) e observar de imediato. Devido à existência de catalase nos eritrócitos, a
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Leticia de Bastos
155
prova deve ser interpretada com muito cuidado quando efetuada a partir de colónias retiradas
de meios contendo sangue (possibilidade de falsos positivos) [135].
9.4.2. Prova da Oxidase
Teste Comercial: BD BBLTM DrySlideTM Oxidase
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva, com 18-24h de incubação.
Objetivo: Diferenciar os bacilos de Gram negativo com metabolismo oxidativo
(Pseudomonas spp. e Neisseria spp.) dos oxidase-negativa (Enterobacteriaceae) [136].
Princípio: O di-hidrocloreto de N,N,N ',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina é um reagente
é incolor no estado reduzido. Na presença do citocromo oxidase, produzido pelo
microrganismo, não ocorre a oxidação direta do reagente, mas sim do citocromo C que, por sua
vez, irá oxidar o reagente para formar um composto de cor púrpura, sendo indicativo de um
teste positivo [136].
As citocromo-oxidases são hemoproteínas que atuam como aceitadores finais de
eletrões na cadeia de respiração aeróbia, transferindo eletrões para o oxigénio, com formação
de água [136].
Procedimento: Esfregar as colónias diretamente sobre o papel de filtro impregnado
com N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina dihidrocloridrato e examinar dentro de 20
segundos. O ácido ascórbico, incorporado no reagente, age enquanto agente redutor para limitar
a auto-oxidação e melhorar a estabilidade do reagente [136].
9.4.3. Prova de Sensibilidade à Optoquina
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α-
hemólise, com 18-24h de incubação.
Objetivo: Diferenciar Streptococcus pneumoniae de outros estreptococos α-
hemolíticos, tendo em conta que é o único sensível à optoquina (cloridrato de etil-
hidrocupreína).
IX Mestrado em Análises Clínicas
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156 Leticia de Bastos
Princípio: Difusão da optoquina em meio COS e medição do diâmetro do halo de
inibição. Se for superior ou igual a 14mm pode-se presumir a identificação de Streptococcus
pneumoniae.
Procedimento: Executar uma suspensão da colónia a testar em 1mL de soro fisiológico,
com uma densidade ótica de 0.5 na escala de McFarland (medida no densitómetro). De seguida,
semear a suspensão em meio COS, com estrias apertadas de forma a gerar colónias confluentes.
O disco de optoquina é colocado no centro da gelose e incubado a 35+2ºC, 18-24h, em
atmosfera enriquecida com 5% de CO2.
9.4.4. Prova da Urease
Teste Comercial: Meio ureia indol, da bioMérieux
Amostra: Colónias em meio HEK não fermentadoras da lactose, com 18-24h de
incubação.
Objetivo: Excluir a presença de Salmonella spp. e Shigella spp. caso a prova seja
positiva.
Princípio: Na presença de urease, a ureia presente no meio reacional é hidrolisada em
amónia, água e dióxido de carbono. A amónia produzida irá alcalinizar o meio fazendo com
que o indicador de pH, o Vermelho de Fenol, passe de amarelo a vermelho, sendo uma reação
positiva para a presença de urease [137].
Procedimento: Num tubo de hemólise pipetar cerca de 0,5mL de reagente e inocular
cerca de 2-3 colónias do microrganismo em estudo. Posteriormente incubar a 35 + 2ºC, 18-24h
e observar [137].
9.4.5. Prova da Coagulase
Teste Comercial: BD BBLTM Coagulase Plasmas
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157
As infeções mais comuns causadas por Staphylococcus aureus são cutâneas, no entanto
também pode ser responsável por infeções severas (septicémias, endocardites, meningites,
pneumonias, osteomielites) em meio hospitalar.
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Staphylococcus spp., 18-24h de
incubação.
Objetivo: Diferenciar Staphylococcus aureus de outras espécies de Staphylococcus spp.
Princípio: Capacidade do S. aureus produzir uma coagulase extracelular livre, que atua
sobre a protrombina presente no plasma de coelho, dando origem a um produto semelhante à
trombina, que irá atuar no fibrinogénio originando um coágulo de fibrina [138].
Procedimento: Num tubo contendo cerca de 0,5mL de plasma de coelho citratado
inocular uma colónia isolada e incubar a 35 ± 2ºC, com leitura após 4h de incubação, se ainda
não se tiver formado o coágulo prolongar a incubação até às 24h, para descartar possíveis falsos
negativos. Pode ocorrer lise do coágulo antes da sua observação por produção de enzimas
fibrinolíticas pela estirpe em estudo (falsos negativos) [138].
9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7
Teste Comercial: E. coli O157 Latex Test, da Oxoid.
A Escherichia coli é parte integrante da microbiota do trato intestinal em humanos
saudáveis, contudo, algumas são patogénicas podendo levar a alterações gastrointestinais. O
serotipo O157:H7 da E. coli tem sido o mais frequentemente isolado nos casos de colite
hemorrágicas e síndrome urémica hemolítica, com produção de uma Verotoxina, sendo esta E.
coli designada de entero-hemorrágica [139].
A transmissão ocorre através da ingestão de água ou alimentos contaminados, ou pelo
contacto com animais ou pessoas infetadas (transmissão fecal-oral) estando muito associadas a
surtos alimentares [139].
Amostra: Fezes depois de semeadas em meio MCK. As colónias de interesse são as
sugestivas de E. coli, não fermentadoras de sorbitol. É necessário testar pelo menos 10 colónias.
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Objetivo: Identificação do serogrupo E. coli O157.
Método: Reação de aglutinação [140].
O reagente teste contém partículas de latex sensibilizadas com anticorpos específicos
reativos contra o antigénio somático O157. O controlo contém partículas de latex sensibilizadas
com imunoglobulina de coelho pré-imunizada [140].
Procedimento: Realizar uma suspensão, com 1 gota de solução salina e parte de 1
colónia. Posteriormente, adicionar 1 gota de reagente teste e misturar de forma a cobrir a área
de reação. Empreender movimentos circulares ao cartão, 1 minuto, procurando visualizar sinais
de aglutinação. Se aglutinar, testar a outra porção da colónia com o controlo para garantir que
o isolado não é uma estirpe auto-aglutinante [140].
Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%
9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae
Teste Comercial: Oxoid Dryspot™ Pneumo Test
O Streptococcus pneumoniae é o principal agente causador da pneumonia bacteriana,
meningite, otite e bacteriémia. Os sintomas são diversos dependendo da parte do corpo infetada
e em casos mais graves pode levar à perda de audição, lesões cerebrais irreversíveis e morte
[141].
Os grupos de risco são os adultos com 65 anos ou mais, crianças menos de 2 anos de
idade e indivíduos imunodeprimidos [141].
A virulência deste microrganismo deve-se às propriedades anti-fagocitárias do
polissacárido capsular [142].
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α-
hemólise, com 18-24h de incubação.
Objetivo: Pesquisa do antigénio capsular do Streptococcus pneumoniae, para o
diferenciar de outros estreptococos α-hemolíticos.
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159
Método: Reação de aglutinação [142].
O teste utiliza partículas de látex desidratadas em cartão, sensibilizadas com anticorpos
específicos para o pneumococo, na área de teste e partículas de látex desidratadas,
sensibilizadas com imunoglobulinas não reativas, na área de controlo [142].
Procedimento: Adicionar 1 gota de solução salina na região branca da área teste e da
área de controlo e emulsionar algumas colónias sugestivas de modo a obter uma suspensão
ligeiramente opalescente e homogénea. De seguida, misturar a suspensão com o reagente látex
desidratado até à completa reidratação e homogeneização sobre a área de reação. Proceder da
mesma forma na área de controlo. Empreender movimentos circulares ao cartão, durante 1
minuto, e observar. A presença de aglutinação é indicativa da presença do antigénio. O teste é
invalidado se ocorrer aglutinação na área de controlo, sendo indicativo de auto-aglutinação [142].
Sensibilidade: 97.9%; Especificidade: 93.2%
9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos
Antimicrobianos
Equipamento: VITEK® 2, da bioMérieux
A identificação e TSA só devem ser realizados a partir de colónias isoladas em cultura
pura.
Não é necessário proceder-se à identificação e TSA caso seja isolada a mesma espécie
de microrganismo em amostras idênticas colhidas em dias sucessivos. No entanto, se a segunda
amostra tiver vindo com um intervalo igual ou superior a 5 dias já será necessário, pois pode
ter havido alterações na flora ou no padrão de suscetibilidade.
O VITEK® é um equipamento capaz de fazer a identificação de microrganismos de
interesse e TSA. É constituído por uma estação de enchimento de cartas por vácuo, que força a
suspensão da amostra a fluir para as cartas, uma zona de selagem, outra de incubação e leitura
automática de cartas.
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160 Leticia de Bastos
O reconhecimento das cartas de identificação e de TSA é feito através de uma unidade
de leitura de códigos de barras. O software tem a capacidade de cruzar a informação da
identificação com a do antibiograma e alerta caso o resultado do antibiograma não seja
consistente com a bactéria identificada.
9.7.1. Preparação da Suspensão
O primeiro passo para se proceder à identificação de microrganismos e/ou TSA é
preparar uma suspensão das colónias em estudo, em 3mL de solução salina, com a ajuda do
densitómetro (Densichek). Para diferentes microrganismos, diferentes densidades são
requeridas:
0.50-0.65 McFarland para a maioria das bactérias Gram positivo e Gram
negativo;
1.8-2.20 McFarland para leveduras;
2.8-3.30 McFarland para Neisseria spp., grupo HACEK (Haemophilus spp.,
Aggregatibacter, actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella
corrodens e Kingella kingae), anaeróbios e Corynebacterium spp.
Para cada ensaio faz-se um controlo da suspensão, inoculando 1µL em meio COS,
permitindo manter a viabilidade do microrganismo, assim como averiguar a pureza da
suspensão.
Depois de preparadas as suspensões, são acondicionadas numa rack que será
programada no equipamento, em que é associado o número de cultura às cartas de identificação
e/ou TSA.
9.7.2. Identificação de Microrganismos
Método: Colorimetria
As cartas de identificação utilizadas no laboratório possuem poços que contêm
substratos bioquímicos liofilizados, que são utilizados pelas bactérias ou leveduras. A
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161
metabolização destes substratos com alteração da sua cor é lida por sensores fotométricos,
permitindo, deste modo, efetuar a identificação do microrganismo em estudo.
No laboratório são utilizadas as seguintes cartas de identificação:
Carta GP (para bactérias Gram positivo);
Carta GN (para bactérias Gram negativo);
Carta NH (para Neisseria spp., Haemophilus spp., Campylobacter spp.).;
Carta YST (para leveduras);
Carta ANC (para bactérias anaeróbias e Corynebacterium spp).
9.7.3. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos
Método: Turbidimetria.
As cartas de TSA contém diversos antimicrobianos liofilizados, em diferentes poços,
com os quais as bactérias ou leveduras irão reagir, resultando numa alteração da turvação do
meio, que será lida pelos sensores fotométricos permitindo, assim, fazer o TSA do
microrganismo em estudo.
No laboratório foram utilizadas as seguintes cartas de TSA:
Carta AST-N355 (para Enterobacteriaceae)
Carta AST-N354 (para Pseudomonas spp., e eventualmente Enterobacteriaceae
multirresistentes)
Carta AST-P648 (para Staphylococcus spp.);
Carta AST-P586 (para Enterococcus spp.);
Carta AST-ST03 (para Streptococcus spp.).
Os resultados são expressos com base em breakpoints e classificados como sensível,
intermédio ou resistente. O analisador está programado para interpretar os resultados consoante
as diretrizes em vigor, que são as da EUCAST (do inglês European Committee on Antimicrobial
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162 Leticia de Bastos
Susceptibility Testing). Para casos duvidosos, ou caso não haja cartas de testes de
suscetibilidade, como é o caso de Haemophillus spp., fazem-se os antibiogramas de forma
manual, usando o método de difusão em disco.
9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A
Teste Comercial: Clearview® Exact Strep A Cassette, da AlereTM.
O Streptococcus β-hemolítico do grupo A é um dos principais agentes responsáveis por
infeções respiratórias superiores, nomeadamente da faringite. O diagnóstico precoce e terapia
imediata adequada demostrou reduzir a gravidade dos sintomas e outras complicações, como
febre reumática e glomerulonefrite [143].
Amostra: Exsudado faríngeo sem meio de transporte.
Objetivo: Pesquisa do antigénio do Streptococcus β-hemolítico do Grupo A (Strep A).
Método: Imunocromatografia.
Procedimento: Extrair o antigénio da zaragatoa usando reagentes de extração. A
solução extraída é colocada na cassete. Na presença do antigénio este irá complexar-se com o
conjugado, migrar por capilaridade até à zona de teste e ao entrar em contacto com os anticorpos
anti-Strep A adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão formar uma linha visível.
Independentemente da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo,
formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento.
Quinze minutos depois ler o resultado do teste. Um resultado negativo não exclui a presença de
infeção pois a quantidade de antigénio presente na amostra pode ser inferior ao limite de deteção
do teste [143].
Sensibilidade: 95.2%; Especificidade: 99%.
9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae
Teste Comercial: Streptococcus pneumoniae Antigen Card, da AlereTM BinaxNOW®.
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163
A progressão da doença é muito rápida sendo decisivo o diagnóstico e tratamento
imediato.
Amostra: Urina (pneumonia pneumocócica) ou LCR (meningite pneumocócica).
Objetivo: Pesquisa do antigénio solúvel Streptococcus pneumoniae.
Método: Imunocromatografia.
Procedimento: Procedimento e interpretação do teste semelhante ao apresentado na
secção 9.8. No entanto, antes de se iniciar o teste é necessário mergulhar uma zaragatoa
esterilizada na amostra, que de seguida será inserida no cartão de teste. Adicionar a solução
tampão e fechar o cartão, colocando a amostra em contacto com a membrana de nitrocelulose.
O conjugado é composto por anticorpo anti-S. pneumoniae e anticorpo anti-Streptococcus
marcados e na zona de teste encontram-se adsorvidos na membrana anticorpos anti-
S. pneumoniae [144].
Sensibilidade: Urina – 90%; LCR - 97%; Especificidade: Urina - 78%; LCR - 99%
9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila
Teste Comercial: Legionella K-SeT, da Coris BioConcept.
A Legionella é responsável por pneumonias graves, sendo que aproximadamente 90%
das infeções é causada pela Legionella pneumophila, das quais 80% pelo serogrupo1 [145].
A L. pneumophila também pode ser responsável por infeções extra-pulmonares ou não-
pulmonares, apresentando uma sintomatologia menos grave, semelhante a um caso de gripe
leve. A maioria dos pacientes desenvolve febre geralmente superior a 39,5°C. A tosse pode ser
o primeiro sinal de infeção pulmonar. Outros sintomas incluem dores de cabeça, musculares,
no peito e falta de ar. Os sintomas gastrointestinais também são comuns [145].
A Legionella é ubiquitária e encontra-se em habitats aquáticos, principalmente de água
doce, torres de arrefecimento e sistemas de água potável, podendo sobreviver numa ampla gama
de condições e de temperaturas [145].
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Relatório de Estágio
164 Leticia de Bastos
A doença do legionário é transmitida por aerossóis e as pessoas com maior risco de
contrair a doença são os imunodeprimidos, idosos, portadores de doença pulmonar obstrutiva
crónica ou doença renal crónica [145].
Amostra: Urina
Objetivo: Pesquisa do antigénio solúvel da Legionella pneumophila do serogrupo1.
Método: Imunocromatografia.
Procedimento: Procedimento e interpretação do teste semelhante ao apresentado na
secção 9.8. No entanto, neste teste uma porção da amostra é diretamente colocada na cassete, o
o conjugado é constituído de anticorpos anti-Legionella e na zona de teste encontram-se
adsorvidos na membrana anticorpos anti-Legionella [145].
Sensibilidade: 97.6%; Especificidade: 100%
9.11. Teste Screening para Clostridium difficile
Teste Comercial: RIDA®QUICK da R-biopharm
O Clostridium difficile, bactéria anaeróbia obrigatória formadora de esporos, é parte
integrante da flora intestinal normal dos seres humanos. A taxa de colonização em condições
normais vai diminuindo ao longo dos anos apresentando uma percentagem média de 2-10% na
idade adulta. Em circunstâncias específicas, com a diminuição da flora intestinal protetora,
antibioterapia ou outros fatores que possam comprometer a imunidade intestinal, a colonização
é favorecida podendo mesmo desenvolver-se quadros sérios de colite pseudomembranosa [146,
147].
Relativamente à infeção provocada por esta bactéria, um dos fatores determinantes é a
produção das toxinas A (Enterotoxina) e B (Citotoxina), que podem atuar individual ou
sinergicamente. Visto que nem todas as estirpes são produtoras de toxina, em caso de suspeita
de diarreia associada ao Clostridium difficile, a deteção das toxinas A e B é o único
procedimento de significado patognomónico [146, 147].
Amostra: Fezes diarreicas.
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165
Método: Imunocromatografia.
9.11.1. Pesquisa da Desidrogenase do Glutamato
Objetivo: Pesquisa da desidrogenase específica do glutamato (GDH) do Clostridium
difficile.
Procedimento: Diluir uma porção da amostra com uma solução contendo anticorpos
anti-GDH, homogeneizar e deixar sedimentar 5 minutos. Na presença do antigénio, haverá a
formação de imunocomplexos. Posteriormente, 150µL do sobrenadante é pipetado para a
cassete, e irá migrar por capilaridade pela membrana de nitrocelulose até à zona de teste, onde
se encontra adsorvida a estreptavidina que liga os imunocomplexos afluentes através da biotina
acoplada ao anticorpo anti-GDH, levando à formação de uma linha visível. Independentemente
da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo, formando uma linha
visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento. Quinze minutos depois
ler o resultado do teste. Um resultado negativo não exclui a presença de infeção, pois existem
muitos fatores que podem interferir, no entanto se houver uma forte suspeita devem ser
solicitadas mais amostras para serem analisadas [146].
Sensibilidade: 100%; Especificidade: 95%
Um resultado positivo obriga a determinação da produção das toxinas A e B associadas
à infeção [146].
9.11.2. Pesquisa das Toxinas A/B
Objetivo: Pesquisa das toxinas A e B do Clostridium difficile.
Procedimento: Procedimento do teste é semelhante ao apresentado na secção 9.11.1. O
que difere é a composição da solução com que a amotra é diluída, que possui anticorpos anti-
toxina A e B, e na zona de teste a estreptavidina irá ligar os imunocomplexos afluentes através
da biotina acoplada à anti-toxina A e a anti-toxina B [147].
Sensibilidade: 100%; Especificidade: 91%
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166 Leticia de Bastos
Caso a pesquisa do antigénio seja positiva e a toxina negativa por teste
imunocromatográfico é obrigatório a pesquisa do gene da toxina por PCR (ver secção 9.15).
9.12. Teste Screening para Campylobacter spp.
Teste Comercial: RIDA®QUICK da R-biopharm
O Campylobacter geralmente encontra-se no intestino das aves e animais,
nomeadamente galinhas e vacas, sem que apresentem sinais de doença. A transmissão ao
homem ocorre via fecal-oral, pela da ingestão de fruta, vegetais, água ou leite contaminado com
fezes que possuem a bactéria. O leite também se pode contaminar se a vaca possuir uma infeção
mamária por Campylobacter [148].
A pasteurização do leite e boas condições de higiene ajudam a prevenir a doença [148].
Os indivíduos infetados geralmente desenvolvem diarreia, dor abdominal e febre. A
diarreia pode ser sanguinolenta e acompanhada de náuseas e vómitos. Estes sintomas
geralmente surgem 2 a 5 dias após a exposição ao microrganismo podendo prevalecer cerca de
1semana. No entanto, algumas pessoas permanecem assintomáticas. Em imunodeprimidos,
ocasionalmente, pode ocorrer bacteriémia levando a infeções graves [148].
O Campylobacter jejuni e Campylobacter coli são os principais causadores da
gastrenterite nos humanos, sendo a dose infetante relativamente baixa [148].
Amostra: Fezes
Objetivo: Pesquisa do Campylobacter jejuni e/ou Campylobacter coli.
Método: Imunocromatografia.
Procedimento: Procedimento e interpretação do teste semelhante ao apresentado na
secção 9.11.1. O que difere é a composição da solução com que a amotra é diluída, que possui
anticorpos anti-Campylobacter, e na zona de teste a estreptavidina irá ligar os imunocomplexos
afluentes através da biotina acoplada ao anticorpo anti-Campylobacter, com formação de uma
linha visível [149].
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167
Sensibilidade:98,4%; Especificidade: 98,6%
9.13. Pesquisa de Vírus
9.13.1. Teste Screening para Rotavírus e Adenovírus
Teste Comercial: Teste RIDA®QUICK Rotavirus/Adenovirus Combi da R-biopharm
Os adenovírus (família Adenoviridae) são vírus de dupla cadeia DNA, relativamente
resistentes a desinfetantes comuns e podem ser detetados em superfícies, tais como maçanetas,
objetos e água de piscinas [150].
Embora muito associado a doenças respiratórias agudas, também já foram descritas
epidemias com adenovírus entéricos. A doença gastrointestinal é muito frequente na infância
[151], sendo que os bebés e indivíduos imunodeprimidos correm alto risco de desenvolver
doenças graves. Algumas pessoas podem permanecer assintomáticas [150].
Os rotavírus (família Reoviridae) são vírus de dupla cadeia de RNA, estáveis no meio
ambiente. São os principais agentes causadores de gastroenterite não bacteriana, caracterizada
por vómitos e diarreia aquosa de 3-8 dias, podendo ser acompanhada de febre, dor abdominal,
perda de apetite e desidratação. O período de incubação é de aproximadamente 2 dias [152].
O principal modo de transmissão é a via fecal-oral, geralmente através do contato
próximo entre pessoas, objetos/superfícies, água ou alimentos contaminados. A doença
apresenta um padrão sazonal de inverno, observando-se uma maior taxa de infeção em lactentes
e crianças pequenas, principalmente com idade inferior a 5 anos. Os adultos também podem
contrair a doença, no entanto tende a ser mais suave [151].
Nem a vacina, nem a infeção natural oferecem imunidade total, contudo a primeira
infeção na criança é a que causa os sintomas mais graves [152].
Amostra: Fezes
Objetivo: Pesquisa da presença de Adenovirus/Rotavirus.
Método: Imunocromatografia.
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168 Leticia de Bastos
Procedimento: Procedimento do teste é semelhante ao apresentado na secção 9.8. No
entanto é necessária uma preparação prévia da amostra. Diluir uma porção da amostra num
tampão de extração, homogeneizar e deixar sedimentar 3 minutos. Posteriormente, 200µL do
sobrenadante é pipetado para a cassete. O conjugado é composto anticorpos acoplados a
partículas de látex coloridas (vermelhas – rotavírus e azuis - adenovírus) e na zona de teste
encontra-se adsorvida anticorpos específicos [150].
Interpretação do resultado do teste [150]:
Positivo para Adenovírus - linha azul e verde são visíveis.
Positivo para Rotavírus - linha vermelha e verde são visíveis.
Positivo para Adenovírus e Rotavírus - tiras azul, vermelha e verde são visíveis.
Negativo: somente a tira verde é visível.
Um resultado negativo não exclui uma possível infeção causada pelo
adenovírus/rotavírus. Existem muitos fatores que podem interferir. Se houver uma forte
suspeita devem ser solicitadas mais amostras para serem analisadas [150].
Adenovírus - Sensibilidade: 90%; Especificidade: 100%
Rotavírus - Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%
9.13.2. Teste Screening para Vírus Sincicial Respiratório
Teste Comercial: BinaxNOW® RSV, da AlereTM
O Vírus Sincicial Respiratório (RSV, do inglês Respiratory Syncytial Virus), família
Paramyxoviridae, é responsável por infeções e surtos que ocorrem no outono, inverno e
primavera. Geralmente, as pessoas infetadas apresentam sintomas leves, sendo que a maioria
recupera ao fim de 1 a 2 semanas. Embora também possam causar doenças respiratórias em
crianças mais velhas e adultos, a doença tende a ser mais grave em crianças com menos de 1
ano, sendo o causador mais comum de bronquiolite e pneumonia [153].
Amostra: Exsudado nasofaríngeo ou lavado nasal
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169
Objetivo: Pesquisa do antigénio das proteínas de fusão do RSV, em bebés ou crianças
com menos de 5 anos [154].
Método: Imunocromatografia.
Procedimento: Procedimento e interpretação do teste semelhante ao apresentado na
secção 9.8. No entanto, os exsudados nasofaríngeos colhidos em zaragatoa têm de ser eluídos
numa solução de extração, posteriormente, uma porção do lavado nasal ou do produto de
extração é pipetado para o cartão e de seguida é fechado, colocando a amostra em contacto com
a membrana de nitrocelulose. O conjugado é composto de anticorpo anti-RSV e na zona de
teste encontram-se adsorvidos na membrana anticorpos anti-RSV [154].
Sensibilidade: Lavado nasal 89%; Zaragatoa 93%; Especificidade: Lavado nasal
100%; Zaragatoa 93%;
9.13.3. Pesquisa do Vírus Influenza A e B
O vírus influenza é responsável por doenças respiratórias contagiosas. Geralmente,
ocorre repentinamente e os sintomas são febre ou calafrios, tosse, dor de garganta, nariz
entupido, fadiga, dores musculares e cabeça. Nas crianças, é comum observar-se vómitos e
diarreia [155].
A maioria das pessoas recupera ao fim de 2 semanas, no máximo, mas algumas pessoas,
nomeadamente crianças, adultos com 65 anos ou mais, grávidas ou indivíduos que padeçam de
doenças crónicas possuem alto risco de desenvolver complicações graves, requerendo
hospitalização, podendo levar à morte. Uma grande variedade de complicações pode ser
causada pelo vírus isoladamente ou ser resultante da co-infeção com bactérias, podendo até
mesmo levar à pioria de algumas condições crónicas do doente [155].
Amostra: Exsudado nasofaríngeo em meio de transporte (VIRCELL15).
Objetivo: Pesquisa de RNA do Vírus Influenza A e B com alerta de H1N1.
Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15)
15 O meio de transporte evita a secagem da amostra, mantém a vitalidade dos microrganismos entre a colheita e a inoculação e
retarda o sobrecrescimento bacteriano em amostras muito contaminadas.
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170 Leticia de Bastos
9.13.4. Pesquisa do Vírus Papiloma Humano de Alto Risco
O Papiloma Vírus Humano (HPV, do inglês Human Papillomavirus) é um vírus
responsável por infeções sexualmente transmissíveis, sendo que pessoas assintomáticas podem
transmitir o vírus e os sintomas desenvolverem-se apenas ao fim de vários anos [156].
Existem vários subtipos que podem causar diferentes problemas de saúde. Na maioria
dos casos, a infeção resolve-se sozinha, mas quando persiste é responsável pelo aparecimento
de verrugas genitais e cancro, nomeadamente cervical, da vulva, vagina, pénis, ânus e
orofaringe. Os indivíduos imunodeprimidos são mais propensos a desenvolver problemas de
saúde resultante da infeção pelo HPV [156].
O rastreio de mulheres com idade entre 21 a 65 anos pode prevenir cancro cervical [156].
Amostra: Exsudado endocervical sem meio de transporte.
Objetivo: Rastreio de DNA do Vírus do Papiloma Humano de alto risco e genotipagem
dos sub-tipos16, 18/45.
Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15)
9.14. Pesquisa de Micobactérias16
A tuberculose é uma doença causada na maioria dos casos pela bactéria Mycobacterium
tuberculosis, também designada de BK [157].
A transmissão da tuberculose ocorre quando indivíduos com tuberculose pulmonar ou
laríngea tossem, espirram ou gritam e se geram gotículas infeciosas que são transportadas pelo
ar podendo ser inaladas e atingir os alvéolos pulmonares de outra pessoa. A maioria destes
bacilos são destruídos ou inibidos pelos macrófagos alveolares; no entanto, um pequeno número
pode multiplicar-se no seu interior e serem libertados para os canais linfáticos ou corrente
sanguínea atingindo vários tecidos e órgãos [157].
Objetivo: Pesquisa de BK.
16 No Serviço de Patologia Clínica existe uma sala destinada para o efeito.
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Leticia de Bastos
171
9.14.1. Exame Direto e Cultural
Colheita
Amostras são diversas dependendo do quadro clínico do doente.
Transporte e Conservação da Amostra
Enviada em contentor estéril, sem meio de transporte e refrigerada.
Exame Micobacteriológico
Todas as amostras antes de serem processadas para exame direto e/ou cultural têm de
ser descontaminadas, à exceção dos líquidos serosos e LCR que forem estéreis para bactérias
ou fungos.
Descontaminação da amostra:
Dissolver a amostra com o MycoPrep na proporção de 1:1 (solução de digestão
e descontaminação) e homogeneizar bem;
Deixar repousar à temperatura ambiente 15 minutos e posteriormente perfazer o
volume (45 mL) com água bi-destilada estéril e homogeneizar (para parar a reação de
digestão e descontaminação);
Centrifugar 15 minutos a 3000rpm;
o Enquanto centrifuga a amostra, reconstituir o frasco PANTA/F BACTEC
liofilizado (constituído por antimicrobianos que ajudam a eliminar tudo o
que não seja micobactérias que tenham sobrevivido à descontaminação)
com 10mL de Suplemento/F BACTEC (para favorecer o crescimento do
M. tuberculosis). Para amostras estéreis não utilizar o PANTA/F, utilizar
apenas o Suplemento/F.
o Após reconstituição, inocular cada frasco de cultura BACTEC Myco/F
Lytic com 2 mL da mistura (PANTA/F e Suplemento/F).
Após a centrifugação, decantar o sobrenadante;
IX Mestrado em Análises Clínicas
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172 Leticia de Bastos
Ressuspender o sedimento com 1 mL de água bi-destilada, verificar o seu pH,
que deve estar entre 6,8 – 7 e, se necessário, acertar adicionando HCl ou NaOH;
Exame Direto:
É efectuado:
Quando é pedido a pesquisa de BK direto;
Antes de inocular os frascos de cultura, a fim de dar uma resposta imediata ao
clínico.
Corar consoante o tipo de amostra (ver secção 9.2.2).
Exame Cultural:
Inocular 1mL, de amostra descontaminada, nos frascos de cultura BACTEC
Myco/F Lytic (formulação do meio líquido de Middlebrook 7H9 e de BHI).
Introduzir o frasco no aparelho BACTECTM9000MB. Onde os frascos são
agitados a cada 10 minutos para obter um isolamento ótimo. Cada garrafa possui um
sensor capaz de detetar a diminuição da concentração de O2 no seu interior, resultante
do metabolismo e do crescimento dos microrganismos. O sensor é monitorizado pelo
equipamento a cada 10 minutos. A velocidade de diminuição do oxigénio é medida
pelo aumento da fluorescência, determinando a sua positividade [158].
Nota:
Os frascos de cultura que se mantenham negativos ao fim de 42 dias são retirados do
equipamento e o resultado sai como negativo. Se algum frasco positivar é realizado um
esfregaço sujeito à coloração de Kinyoun.
Na observação de BAAR no esfregaço, procede-se à pesquisa de antigénio de M.
tuberculsosis. Caso o antigénio seja detetado, as garrafas são enviadas para o Instituto Nacional
de Saúde, Ricardo Jorge (INSA) para eventual TSA. Por outro lado, se a pesquisa de antigénio
de M. tuberculosis for negativa, tem de se considerar a valorização do resultado, em termos da
natureza da amostra, critérios clínicos e imagiológicos; caso seja relevante, segue também a
garrafa para o INSA, para identificação e eventual TSA.
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Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
173
Se a positividade for resultante de uma má descontaminação e o tempo de incubação
tenha sido curto, a amostra é novamente descontaminada e recolocada no equipamento; no
entanto, se positivar quando estiver quase a perfazer os 42 dias de incubação, a garrafa é
colocada na estufa e quando tiver completado o tempo é feito novo esfregaço. Se a etiologia da
infeção for bacteriana ou fúngica o exame micobacteriológico sai como negativo.
Teste screening para a pesquisa do M. tuberculsosis
Teste Comercial: SD Bioline TB Ag MPT64 Rapid, da AlereTM
Método: Imunocromatografia.
Objetivo: Pesquisa do antigénio MPT-64 do M. tuberculsosis.
Procedimento: Na presença do antigénio este irá complexar-se com o conjugado,
migrar por capilaridade até à zona de teste e ao entrar em contacto com os anticorpos anti-
MPT64 adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão formar uma linha visível.
Independentemente da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo,
formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento.
Quinze minutos depois ler o resultado do teste [158].
Sensibilidade:98,6%; Especificidade: 100%
9.14.2. Hemoculturas
Colheita
O sangue deve ser sempre colhido por punção venosa de veia periférica, após uma
correta desinfeção da pele com solução antissética deixando-a secar. É importante desinfetar
também a tampa do frasco de hemocultura, tendo o cuidado de deixar evaporar o desinfetante
antes de puncionar a borracha. Após a colheita, inocular 5mL de sangue total para a garrafa de
hemocultura específica para pesquisa de Micobactérias, sem mudar de agulha.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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174 Leticia de Bastos
Transporte e Conservação da Amostra
Enviar hemocultura de imediato ao laboratório, mantendo a garrafa à temperatura
ambiente até ser colocada no BACTECTM9000MB, que possui um sistema automatizado de
incubação (37ºC), homogeneização e monitorização das hemoculturas.
Incubação
Equipamento: BACTECTM9000MB
Os frascos de hemocultura contêm um meio de cultura com condições nutricionais e
ambientais adequadas aos microrganismos [158].
Os frascos de cultura que se mantenham negativos durante um período mínimo
de 42 dias e que não apresentem sinais visíveis de positividade são retirados do
equipamento e o resultado sai como negativo. Caso algum frasco dê positivo, é feito o exame
micobacteriológico.
Exame Micobacteriológico
Retirar as hemoculturas positivas do equipamento, desinfetar a tampa com solução
antisséptica e deixar secar. Posteriormente, perfurar a tampa com uma agulha que contem um
dispensador, que permite retirar o conteúdo da garrafa. Depois de feitos os esfregaços,
desinfetar novamente a tampa dos frascos das hemoculturas.
Exame Direto:
Coloração de Kinyoun
Nota:
Na observação de BAAR no esfregaço, procede-se à pesquisa de antigénio de M.
tuberculsosis (Ver nota da secção 9.14.1).
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175
9.14.3. Pesquisa por PCR
Amostra: Diversas. Enviadas refrigeradas até serem processado e não podem vir em
meio de transporte.
Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15).
Efetuado sempre que haja um pedido específico para pesquisa de DNA de Mycobacterium
tuberculosis por PCR.
9.15. PCR em Tempo Real
Equipamento: GeneXpert® System, da Cepheid®.
Amostra: Produtos em contentor estéril ou zaragatoa sem meio de transporte, exceto
para pesquisa de vírus Influenza em que o produto deverá vir em meio de transporte específico.
Método: PCR (do inglês, Polymerase Chain Reaction) em tempo real, para pesquisa
de:
MRSA (exsudado nasal e perineal) [160]
Enterococcus resistentes à Vancomicina (exsudado perianal) [161]
Carbapenemases com diferenciação de KPC (do inglês Klebsiella pneumoniae
Carbapenemase), NDM (do inglês New Delhi metallo-β-lactamase), VIM (do inglês
Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase), IMP-1& (do inglês IMP-type
metallo-beta-lactamase), OXA-48 (OXA abreviatura do inglês Carbapenem-
hydrolysing oxacillinase), cobrindo OXA-181 e OXA-232 (exsudado retal) [162]
Gene da Toxina do Clostridium difficile (ver secção 9.11) [163]
RNA do Vírus Influenza A e B com alerta para H1N1 (ver secção 9.13.3) [164]
DNA do HPV de alto risco e genotipagem dos subtipos 16,18/45 (ver secção
9.13.4) [165]
DNA do Mycobacterium tuberculosis (ver secção 9.14.3) [166]
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176 Leticia de Bastos
Eluir a zaragatoa/amostra numa solução de eluição fornecida no kit e homogeneizar no
vórtex, posteriormente pipetar a solução dentro do cartucho e introduzi-lo no equipamento. No
caso da pesquisa do vírus Influenza, as zaragatoas já vêm em meio de transporte pronto a ser
utilizado sendo apenas necessário pipetar o sobrenadante para o cartucho.
O sistema GeneXpert® realiza de modo completamente automatizado a preparação de
amostras e PCR em tempo real, realizando todos os passos da extração de DNA ou RNA e
amplificação, com ciclos rápidos de aquecimento e arrefecimento necessários (Figura 29) [160-
166].
As reações são continuamente monitorizadas em cada cartucho de modo a criar
rapidamente cópias suficientes de ácido nucleico da amostra para uma medição fiável [160-166].
9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras
Um produto biológico para estudo microbiológico tem de ser colhido em condições de
assepsia e ser representativo do local anatómico em estudo, evitando a sua contaminação com
a flora saprófita do doente e/ou com bactérias do meio ambiente. É fundamental que a amostra
seja colhida em quantidade suficiente e se possível antes de se ter inicido a antibioterapia.
O modo de processamento do exame cultural e valorização clínica das estirpes isoladas,
baseia-se na compreensão da patogenia da infeção nos diferentes locais anatómicos.
Sempre que o exame pretendido não fizer parte da rotina laboratorial, deve ser
contactado o Laboratório de Microbiologia.
Figura 29. Equipamento GeneXpert® System, em cima e cartucho de reação em baixo [167].
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177
9.16.1. Trato Respiratório Superior
As infeções respiratórias são comuns e localizam-se maioritariamente ao nível da
orofaringe, nasofaringe e cavidade nasal, provocando angina, corrimento nasal e, por vezes,
febre, sendo frequentemente de etiologia viral. Concomitantemente surgem muitas vezes
infeções secundárias, resultantes do desequilíbrio da flora normal, diminuição da imunidade ou
lesão, por bactérias que habitualmente pertencem à microbiota do trato respiratório superior.
Em doentes sujeitos a antibioterapia pode também surgir candidose [168].
A maioria das infeções bacterianas da nasofaringe é causada por Streptococcus β-
hemolítico do grupo A (Streptococcus pyogenes), Corynebacterium diphteriae e Bordetella
pertussis [168].
A presença de Neisseria gonorrhoeae pode causar faringites exsudativas,
particularmente em indivíduos que praticam sexo oro-genital [168].
No exsudado nasal apenas se faz o estudo de colonização para MRSA (ver secção 9.15).
Colheita
Exsudado faríngeo: Pedir ao utente que abra a boca, afastar a língua e com recurso a
uma espátula de madeira colher o produto ao nível das amígdalas e porção posterior da faringe
utilizando uma zaragatoa seca. Durante o procedimento deve evitar-se o contacto com outras
regiões da cavidade oral, a fim de minimizar a contaminação. Não obter amostra se existir
inflamação da epiglote, pois pode causar espasmos com consequente obstrução respiratória.
Transporte e Conservação da Amostra
Zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies);
Zaragatoa seca colhida há menos de 1h.
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Relatório de Estágio
178 Leticia de Bastos
Exame Microbiológico
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, o meio COS e de seguida inocular para BHI. Incubar
18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2 o meio COS e em atmosfera de
aerobiose o BHI.
Nota:
Não se faz Gram para exsudados faríngeos. A flora é, invariavelmente, mista e o Gram
não é informativo.
Outros testes que podem ser pedidos pelo Clínico:
Teste screening para Streptcoccus do grupo A (Pediatria).
9.16.2. Trato Respiratório Inferior
Ao contrário do trato respiratório superior, no trato respiratório inferior, normalmente,
não se verifica colonização por bactérias comensais. No entanto, quando o sistema imunitário
está debilitado, ou após infeção primária causada por um vírus, fica sujeito a invasão pelos
microrganismos das vias respiratórias superiores, ou até mesmo sofrer infeção primária por
microrganismos patogénicos que possam ser inalados, como é o caso da tuberculose [169]. Os
indivíduos mais afetados são os que padecem de doenças crónicas concomitantes, tais como a
bronquite crónica, doença pulmonar obstrutiva crónica e diabetes.
Os microrganismos mais frequentemente valorizados são Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinobacter baumannii, Bordetella spp. e
Mycobacterium tuberculosis. Nos doentes imunodeprimidos, os agentes mais comuns de isolar
são os bacilos Gram negativo (Klebsiella. pneumoniae, E. coli, Pseudomonas spp.)
Pneumocistiis carinii (em HIV positivos) e Aspergillus spp.
Um dos principais sintomas de infeção do trato respiratório inferior é a tosse produtiva,
sendo o exame microbiológico da expetoração uma ferramenta essencial para o diagnóstico.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
179
Por vezes, esse diagnóstico é dificultado pela contaminação das amostras pela flora comensal
da orofaringe durante a colheita, por isso, o laboratório deve processar apenas as amostras de
boa qualidade.
Colheita
Expetoração: a colheita deve ser efetuada em jejum, após lavar a boca e
gargarejar apenas com água. Colher a expetoração através de tosse profunda para
contentor estéril. Amostras com mais de 24h, saliva e amostras contaminadas com
restos alimentares, são rejeitadas.
Secreções Brônquicas;
Lavado Bronco-Alveolar.
Transporte e Conservação da Amostra
Colher para um recipiente estéril, seco e de boca larga. O transporte para o laboratório
deve demorar menos de 2h, se não for possível, refrigerar até 24h.
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Se a amostra estiver muito diluída centrifugar a 1500rpm 20 minutos e semear o
sedimento.
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e HAE2. As porções da amostra que
devem ser utilizadas para o efeito são aquelas que contenham pus ou sangue. Incubar 18-24h,
a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h ou 5 dias, a 25+2ºC, na suspeita de
Aspergillus.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
180 Leticia de Bastos
Nota:
Avaliação qualitativa da uma amostra de expetoração, a partir do Gram: observar ao
microscópio ótico (cerca de 10 campos) com objetiva 10x e verificar a presença de células
epiteliais pavimentosas (da orofaringe) e leucócitos. São consideradas amostras de boa
qualidade as que tiverem menos de 10 células epiteliais e cerca de 25 ou mais leucócitos por
campo.
Não deve ser aplicado este critério em doentes neutropénicos e na pesquisa de outros
agentes específicos, tais como Mycobacterium sp., Legionella sp. e Mycoplasma sp. que não
fazem parte da flora normal da orofaringe e não a colonizam.
Outros testes que podem ser pedidos pelo Clínico:
Teste screening para RSV em secreções brônquicas (Pediatria).
9.16.3. Exsudado Ocular
As infeções oculares incluem infeções das estruturas externas do olho (blefarites,
conjuntivites e queratites), estruturas internas do olho (endoftalmites) e infeções do sistema
lacrimal (canaliculites, dacriocistites, dacrioadenites).
A conjutivite bacteriana é a infeção ocular mais frequente, sendo os principais agentes
responsáveis o Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catarrhalis. No recém-nascido,
os agentes infeciosos mais frequentes são Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae,
Staphylococcus aureus e bacilos Gram negativo.
Colheita
Com uma zaragatoa seca ou humedecida com soro fisiológico e passá-la ao longo da
conjuntiva tarsal inferior do olho, rodar e pressionar suavemente a zaragatoa perto do canal
lacrimal. Enviar sempre e em separado, amostras dos dois olhos, devidamente identificados,
indicando também o lado da infeção.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
181
Transporte e Conservação da Amostra
Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies).
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX (ou HAE2) e de seguida inocular
em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS
e PVX (ou HAE2), e em atmosfera de aerobiose o BHI.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
9.16.4. Exsudado Auricular
A infeção auricular pode localizar-se no ouvido externo e no ouvido médio.
A otite média é uma infeção muito comum em bebés e crianças, uma vez que a trompa de
Eustáquio ainda está muito aberta, sendo normalmente causada por Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae. No entanto também pode ser causada pelo
Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Enterobacteriaceae e microrganismos
anaeróbios, embora sejam menos frequentes [168].
As infeções do ouvido externo são tipicamente causadas por Staphylococcus aureus ou
Pseudomonas aeruginosa (“ouvido de nadador”) [168].
Colheita
Exsudado do ouvido externo: Introduzir uma zaragatoa, humedecida com soro
fisiológico estéril, no canal auricular tendo o cuidado de não tocar nas paredes, retirar
o pus com movimentos de rotação suaves;
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182 Leticia de Bastos
Exsudado do ouvido interno: Timpanocentese.
Transporte e Conservação da Amostra
Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), permitindo manter a
viabilidade das bactérias cerca de 24h se conservada de 2-8°C, sendo rejeitadas as colheitas
enviadas em zaragatoa sem meio de transporte colhidas há mais de 1h.
Se a colheita for por timpanocentese o produto deverá vir em recipiente estéril.
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX (ou HAE2) e de seguida inocular
em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS
e PVX (ou HAE2), e em atmosfera de aerobiose o BHI.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
9.16.5. Exsudados Purulentos
As secreções purulentas provenientes de supurações superficiais e de abcessos são
heterogéneas tanto pela fisiopatologia da infeção como pelos agentes bacterianos envolvidos,
nomeadamente Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e outros β-hemolíticos,
pneumococos, Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa,
Candida spp., bem como microrganismos anaeróbios [170].
Colheita
Superficial: Proceder à limpeza do local de colheita com uma zaragatoa
embebida em soro fisiológico estéril para retirar o excesso de pus em contacto com o
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Leticia de Bastos
183
penso e, se necessário, limpar também o pus seco. De seguida, com uma zaragatoa
estéril, colher uma porção de pus, pressionando levemente no local da lesão ou na
fístula;
Profundo: Descontaminar a pele, colher a amostra por aspiração.
Todas as amostras têm de ser identificadas com os dados demográficos do doente, data
e hora da colheita, identificação do produto e local anatómico da colheita.
Transporte e Conservação da Amostra
Superficial: Zaragatoa colocada em meio de transporte (Meio Amies). Rejeitar
colheitas com mais de 1h caso não venham em meio de transporte;
Profundo: Recipiente seco, esterilizado, de boca larga, enviar a própria seringa
sem agulha, mas devidamente fechada, ou em frasco Portagerm Amies Agar se não se
pretender estudo micológico ou micobacteriológico. A amostra tem de ser enviada o
mais rápido possível ao laboratório, no máximo até 2h após a colheita.
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e MCK de seguida inocular em BHI.
Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, o meio COS e em
atmosfera de aerobiose o BHI e o meio MCK.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
Nota:
Tem de ter em consideração o local da punção, a história clínica, nomeadamente dados
epidemiológicos, o tipo de infeção e o modo de colheita.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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184 Leticia de Bastos
9.16.6. Biópsias Cirúrgicas e Material de Próteses
Transporte e Conservação da Amostra
Amostra enviada em contentor seco, estéril, de boca larga.
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Coloração de Gram, dependendo da consistência da amostra.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX e de seguida inocular em BHI.
Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS e PVX,
e em atmosfera de aerobiose o BHI.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
No caso das amostras sólidas ou materiais de próteses, colocar BHI dentro do contentor
das amostras, agitar no vórtex e incubar a 35±2ºC em atmosfera de aerobiose, 18-24h.
Posteriormente, semear os meios COS e PVX.
9.16.7. Líquido Biliar e Líquidos de Serosas: Ascítico, Pleural, Sinovial e Pericárdico.
Os líquidos orgânicos são normalmente estéreis e qualquer microrganismo encontrado
deve ser investigado. A interpretação final deve ter em conta o estado clínico do doente e o
microrganismo isolado.
Colheita
Colheita por aspiração e os volumes mínimos recomendados são:
Exame bacteriológico: 1mL;
Exame micológico: 2mL;
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
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185
Exame micobacteriológico: 3mL.
Transporte e Conservação da Amostra
Colocar a amostra em recipiente seco e esterilizado ou em frasco Portagerm Amies Agar
se não se pretender estudo micológico ou micobacteriológico.
Eventualmente, quando indicado os produtos podem ser inoculados em frascos para
hemocultura (segundo procedimento idêntico ao das hemoculturas).
Excecionalmente, para a colheita de líquido biliar, colher para um contentor contendo
100mg de carbonato de sódio de modo a alcalinizar o meio e manter a viabilidade dos
microrganismos.
Exame Microbiológico
Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação (20 minutos a 1500rpm)
sendo necessário aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando cerca de 1 ml
de líquido no qual se ressuspende o sedimento, que irá ser processado.
As amostras purulentas podem ser inoculadas diretamente nos meios de cultura.
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural
Semear, por inundação ou em quatro quadrantes dependendo do aspeto do líquidos os
meios COS e PVX, e de seguida inocular em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2ºC em atmosfera
enriquecida com 5% de CO2, os meios COS e PVX, e em atmosfera de aerobiose o BHI.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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186 Leticia de Bastos
9.16.8. Líquido Cefalorraquidiano
Sempre que existe uma suspeita de meningite é fundamental efetuar-se a análise
laboratorial do LCR, permitindo nos casos de meningite infeciosa determinar qual o agente
responsável, a fim de se iniciar um tratamento apropriado, o mais rapidamente possível [171].
A meningite pode ser purulenta ou asséptica. Na meningite purulenta, o LCR é turvo,
pela presença de grande número de leucócitos, na sua maioria polimorfonucleares, e geralmente
é causada pela Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae,
que atingem as meninges a partir do trato respiratório, pela corrente sanguínea. Em recém-
nascidos e crianças pequenas a meningite pode ser provocada pelo Streptococcus agalactiae, e
menos frequentemente pela Escherichia coli, Pseudomonas spp., Salmonella spp. e Listeria
monocytogenes [171].
Na meningite asséptica, o LCR é límpido ou ligeiramente turvo, e contém um número
moderado de leucócitos, com predomínio de linfócitos, exceto na fase inicial, sendo a maioria
dos casos de origem viral [171].
Colheita
Punção lombar, sendo recomendado colher 3 tubos esterilizados de fundo cónico,
devidamente numerados, sendo o último utilizado para exame bacteriológico por ser o mais
estéril e menos sujeito a contaminação.
Volumes mínimos recomendados:
Exame bacteriológico: 1mL;
Exame micológico: 2mL;
Exame micobacteriológico: 3mL.
Transporte e Conservação da Amostra
Enviar de imediato ao laboratório para ser processado. Nunca refrigerar, a não ser que
seja pedido a pesquisa de vírus.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
187
Exame Microbiológico
Antes de ser processado, avaliar o volume da amostra e o aspeto macroscópico. Se o
volume de amostra for superior a 1mL centrifugar 20 minutos a 1500rpm. Remover o
sobrenadante, que deverá ser refrigerado, deixando cerca de 1mL para ressuspender o
sedimento. O LCR geralmente é um produto estéril e a carga microbiana pode ser baixa.
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, por inundação, os meios COS e PVX e de seguida inocular em BHI. Incubar
18-24h, a 35±2ºC, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2 os meios COS e PVX, e em
atmosfera de aerobiose para o BHI.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
Nota:
Pela observação do Gram, qualquer resultado positivo deve ser comunicado
imediatamente ao clínico.
Outros testes que podem ser pedidos pelo Clínico:
Teste screening para Streptococcus pneumoniae.
Exame direto a fresco com contraste negativo por Tinta da China, para pesquisa
de Cryptococcus spp.
9.16.9. Urina Asséptica
As infeções do trato urinário são as mais frequentes, sendo geralmente causadas pela
flora intestinal saprófita que invade o aparelho urinário por via ascendente através da uretra. As
infeções do trato urinário são mais frequentes nas mulheres, devido, sobretudo às diferenças
anatómicas da uretra feminina.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
188 Leticia de Bastos
Os microrganismos mais frequentemente responsáveis por infeções urinarias são as
enterobactérias, como é o caso da Escherichia coli e do Proteus mirabilis.
No entanto, os doentes internados, crianças/ idosos que usam fralda, doentes algaliados,
doentes com patologias do trato urinário ou que estão sob antibioterapia, são mais propensos a
infeções urinárias, podendo ser causadas por um leque de agentes etiológicos, tais como
Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus
spp. e fungos.
Colheita
Podem chegar ao laboratório amostras colhidas do “jato intermédio”, saco coletor
(crianças sem controlo dos esfíncteres), punção de catéter urinário (algália) e punção supra-
púbica.
Colheita do “jato intermédio”:
1. Lavar bem as mãos;
2. Com uma compressa esterilizada embebida em água e sabão,
disponibilizada pelo laboratório, lavar os genitais externos (na mulher,
sempre da frente para trás e, no homem, afastando o prepúcio);
3. Repetir o procedimento anterior utilizando uma compressa esterilizada
embebida em água;
4. Com uma das mãos afastar os grandes lábios ou prepúcio mantendo-os
nessa posição durante o processo, e com a outra segurar no recipiente
esterilizado próprio para a recolha de urina;
5. Rejeitar as primeiras gotas e colher o jato intermédio para o recipiente,
desperdiçando a restante urina.
A urina é um fluido biológico habitualmente estéril, mas a sua passagem através da
uretra durante a micção arrasta os microrganismos que usualmente a colonizam, podendo
induzir a erros na interpretação da urocultura, daí a importância de colher o “jato intermédio”.
Preferencialmente, deve ser colhida a primeira urina da manhã, pois é a mais concentrada, ou
efetuar a colheita após uma retenção de 3h.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
189
Colheita do saco coletor:
1. Lavar as mãos;
2. Lavar os genitais externos com água e sabão, com auxílio de uma
compressa esterilizada e, posteriormente, repetir o procedimento com
uma compressa esterilizada embebida em água;
3. Colar o saco coletor em torno do meato urinário;
4. Mudar o saco de 30 em 30 minutos caso a criança ainda não tenha urinado.
5. Transferir a urina para recipiente esterilizado.
Transporte e Conservação da Amostra
As urinas assépticas, vindas do Hospital de Abrantes e de Torres Novas, chegam ao
Laboratório Central em contentores contendo um estabilizador (ácido bórico), que permite
manter a viabilidade dos microrganismos até 48h, à temperatura ambiente, sendo necessários
10mL de urina para obedecer à proporção urina-conservante. Se o volume de amostra for
inferior a 10mL, ou no caso de se querer pesquisar a presença de Mycoplasma, Mycobacterium
tuberculosis, Leptospira e Chlamydia, a urina deve ser armazenada em contentor estéril,
refrigeradas (2-4ºC) e processadas até 24h após a colheita, pois o ácido bórico iria inibir o seu
crescimento.
As urinas do Hospital de Tomar, tanto do ambulatório como das enfermarias, chegam
ao laboratório em contentor estéril e são processadas de imediato.
Exame Microbiológico
Exame cultural:
Homogeneizar a urina e semear para o meio CLED com uma ansa calibrada de 1µL,
utilizando a técnica de sementeira semi-quantitativa.
Uroculturas pedidas pela consulta de obstetrícia ou urinas obtidas por punção supra-
púbica, semear também em meio COS.
Incubar a 35±2ºC em atmosfera de aerobiose, 18-24h.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
190 Leticia de Bastos
Nota:
Após incubação, observam-se as culturas e faz-se a contagem do número de colónias. O
cálculo da concentração bacteriana é efetuado tendo em conta a densidade das colónias
presentes na placa:
Nº de UFC/mL = 0: cultura negativa;
Nº de UFC/mL < 104: contaminação provável, uretral ou vaginal;
Nº de UFC/mL entre 104 e 105: a urina deve ser avaliada segundo critérios clínicos;
Nº de UFC/mL > 105: provável infeção urinária.
A valorização dos resultados deverá ter em conta uma série de parâmetros tais como:
método de colheita da urina, tipo de doente (por ex. urológico, geriátrico, etc.), sintomatologia
e resultados de exames bacteriológicos anteriores.
Considera-se contaminação a presença de 2 ou mais colónias diferentes num Nº de
UFC/mL < 104. No caso de haver uma colónia predominante com um Nº de UFC/mL > 105
deverá ser investigada, tendo em conta a história clínica do utente, presença de sintomatologia,
sistema imunitário, entre outros.
No caso das urinas colhidas por punção supra-púbica, deve-se valorizar todos os
microrganismos isolados com exceção das bactérias comensais da pele. Em relação às urinas
que foram colhidas do saco coletor, a sua avaliação deve ser mais cuidadosa, pois a
probabilidade de contaminação pela flora do períneo é elevada. Se necessário recorrer a nova
colheita.
Nas grávidas, uma gelose COS é semeada em paralelo com o CLED para despiste de
Streptococcus do grupo B de Lancefield (Streptococcus agalactiae).
Outros testes que podem ser pedidos pelo Clínico:
Teste screening para Legionella spp.
Teste screening para Streptococcus pneumoniae
Para a execução dos testes mencionados, a amostra de urina deve ser colhida em
recipiente estéril.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
191
9.16.10. Esperma e Exsudado Vaginal, Endocervical e Uretral
O esperma e os exsudados genitais são solicitados com o objetivo de diagnosticar
infeções sexualmente transmissíveis ou agentes causadores de desequilíbrio da flora normal,
sendo de grande importância na escolha do tratamento e na prevenção da infeção de recém-
nascidos durante o parto.
É importante que haja informação sobre o tipo de amostra, data de colheita, idade e uma
breve história clínica.
Infeções do Trato Genital Feminino
O aparelho genital feminino baixo, encontra-se colonizado por uma flora saprófita rica
em bacilos de Döderlein. No entanto, na infância e após a menopausa, dada a ausência de
estrogénios, o pH vaginal é mais neutro e a sua microbiota altera-se passando a ser constituída
por outras espécies microbianas. O aparelho genital alto geralmente é estéril.
As infeções do aparelho genital feminino geralmente são devidas a microrganismos
endógenos cuja patogenicidade é ativada por fatores do hospedeiro ou por desequilíbrio da flora
saprófita [172].
Na vulvo-vaginite aguda, há invasão do epitélio escamoso da parede vaginal e
inflamação, sendo frequentemente provocada pela Trichomonas vaginalis ou Candida albicans.
Quando causada pela Trichomonas vaginalis ocorrem secreções vaginais espumosas
amarelada, com irritação da vulva, dor ao urinar e durante o coito. Quando causada pela
Candida albicans, além do corrimento espesso e esbranquiçado, verifica-se a existência de
prurido e dor. A candidose geralmente ocorre devido a antibioterapia ou toma de contracetivos
orais que alteram a microbiota vaginal [172].
Na vaginose, geralmente causada pela Gardnerella vaginalis ou pelo Mobiluncus,
observa-se uma leucorreia acinzentada, com cheiro pútrido [172].
A cervicite, com ou sem uretrite, geralmente assintomática, pode ser causada por
diversos microrganismos, sendo os principais agentes etiológicos a Neisseria gonorrhoeae e
Chlamydia trachomatis, podendo originar corrimento vaginal [172].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
192 Leticia de Bastos
A salpingite pode ser ou não acompanhada de descarga vaginal e geralmente é causada
pela Neisseria gonorrhoeae ou por Streptococcus spp [172].
A ulceração genital pode ser causada pelo Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi
ou Chlamydia trachomatis [172].
A gonorreia, doença sexualmente transmissível, causada pela Neisseria gonorrhoeae,
pode infetar as mucosas da uretra, colo do útero, garganta e conjuntiva ocular (principalmente
nos recém-nascidos durante o parto). As mulheres geralmente são assintomáticas, e quando
apresentam sintomas são ligeiros [172].
Infeções do Trato Genital Masculino
De um modo geral, as infeções no homem são causadas pelos mesmos microrganismos
que determinam as da mulher, mas raras vezes são assintomáticos [172].
A uretrite gonocócica, causada pela Neisseria gonorrhoeae, leva ao aparecimento de
secreções purulentas provenientes do pénis, dor ao urinar, mas com grande necessidade de
urinar. A uretrite não gonocócica pode ser causada pela Chlamydia trachomatis, Ureaplasma
urealyticum, Mycoplasma hominis ou Trichomonas vaginalis. Na uretrite causada pela
Trichomonas vaginalis, os homens são, normalmente, assintomáticos, mas quando sintomáticos
podem apresentar secreção uretral, dor e ardor ao urinar, dor testicular, irritação da uretra e
infeção da próstata [172].
As úlceras genitais são essencialmente causadas pela Chlamydia trachomatis,
Haemophilus ducreyi e Treponema pallidum. A epididimite pode ser causada pela Chlamydia
trachomatis ou Neisseria gonorrhoeae, a orquite e a prostatite por Enterobacteriaceae ou
Pseudomonas spp [172].
Colheita
O utente não deverá ter efetuado qualquer tratamento local nos 3 dias anteriores à
colheita e, no próprio dia, pode efetuar a sua higiene, só não pode é utilizar soluções
antissépticas. É importante questionar o utente sobre a sintomatologia.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
193
Exsudado vaginal: Colocar a utente em posição ginecológica, introduzir um
espéculo17 e colher o exsudado das paredes vaginais com recurso a uma zaragatoa
dacron seca em movimentos rotativos.
Exsudado endocervical: Colocar a utente em posição ginecológica, introduzir
um espéculo e colher com zaragatoa dacron uma amostra do fundo de saco vaginal
posterior e endocolo.
Exsudado uretral: Se possível colher o exsudado uretral antes da primeira micção
da manhã, caso não seja possível esperar pelo menos 1h após a última micção. Para se
proceder à colheita é necessário limpar cuidadosamente a mucosa circundante com
uma compressa esterilizada e, de seguida, introduzir uma zaragatoa flexível na uretra,
cerca de 1 cm para a mulher e 2cm para o homem, e com movimento rotativo recolher
o exsudado.
Esperma: Lavar as mãos e o pénis retraindo o prepúcio com uma gaze
esterilizada humedecida com sabão e depois passar com uma gaze esterilizada
humedecida só com água; colher o sémen por masturbação e todo o volume ejaculado
deve ser colocado no frasco fornecido. A colheita deve ser feita no Serviço de
Patologia Clínca e entregue de imediato. Se tiver também pedido de urocultura,
primeiro colher a urina e só depois o esperma.
No caso da colheita do exsudado vaginal, endocervical e uretral, sempre que possível,
repetir a operação com uma segunda zaragatoa para a realização de exame direto.
A pesquisa de Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. e
Trichomonas vaginalis devem ser orientadas. Para a pesquisa de Mycoplasma hominis e
Ureaplasma urealyticum, limpar primeiro o excesso de muco do exocolo com uma zaragatoa
estéril e de seguida introduzir nova zaragatoa de dacron estéril para efetuar a colheita, com um
movimento de rotação durante 5 a 10 segundos, arrastando cuidadosamente as células.
17 O espéculo é colocado sem lubrificante ou humedecido com soro fisiológico estéril e apenas deve ser utilizado em mulheres
não-grávidas ou que já tiverem iniciado a sua vida sexual.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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194 Leticia de Bastos
Transporte e Conservação da Amostra
Colocar a primeira zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), que será utilizada
para a sementeira, e a segunda em meio seco, que será utilizada para exame direto. Manter
ambas as zaragatoas à temperatura ambiente até serem processadas.
O esperma deve ser colhido para um recipiente estéril, seco e de boca larga. A colheita
tem de ser feita no Serviço de Patologia Clínca e entregue o mais rapidamente possível.
Exame Microbiológico
Exame Direto:
Exame a fresco e após coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios COS, VCA3 e CAN2. Incubar a 35±2°C em
atmosfera enriquecida com 5% de CO2 os meio COS e VCA3, e em atmosfera de aerobiose o
meio CAN2, 18-24h, excepto o meio VCA3 que deverá incubar até 72h.
Nota:
O exame a fresco deverá ser feito logo após a colheita, caso não seja possível guardar a
zaragatoa na estufa a 35+2ºC. Este exame permite a pesquisa de Trichomonas vaginalis
(observação da mobilidade), elementos leveduriformes, contagem de células epiteliais,
leucócitos e eritrócitos.
A coloração de Gram é utilizada para a observação semi-quantitativa de Lactobacillus
spp., pesquisa de “clue cells” (células epiteliais cobertas de bactérias Gram variável), que são
sugestivas de Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, e avaliação da flora ou de outras estruturas
que possam auxiliar no diagnóstico.
9.16.11. Exsudado Vaginal/Rectal
O exsudado vaginal/retal é particularmente utilizado para a pesquisa de Streptococcus
agalactiae (estreptococo β-hemolítico do grupo B) no caso das grávidas entre as 35 e 37
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
195
semanas de gestação, a fim de evitar a contaminação perinatal de recém-nascidos. Esta bactéria
está particularmente associada a septicémia, pneumonias e meningite do recém-nascido, com
uma taxa de mortalidade entre 20-25%.
Colheita
Com a mesma zaragatoa fazer a colheita do exsudado da porção distal vaginal e da
região anal-retal, introduzindo a zaragatoa suavemente através do esfíncter anal e deixar 10-30
segundos para fixar os microrganismos e retirar.
Transporte e Conservação da Amostra
Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), mantida à temperatura
ambiente.
Exame Microbiológico
Exame Cultural:
Semear por espalhamento com zaragatoa o meio STRB e incubar a 35±2ºC em
atmosfera de aerobiose, 18-24h.
9.16.12. Hemoculturas
A cultura de sangue (hemocultura) representa um dos meios mais importantes para a
deteção de uma septicémia ou bacteriémia, que pode ser transitória, intermitente ou contínua.
O isolamento de um microrganismo a partir duma hemocultura é geralmente o agente etiológico
da infeção, sendo urgente a sua identificação para o estabelecimento de uma terapêutica
adequada [173].
As hemoculturas são pedidas essencialmente em caso de febre, choque, sintomas
associados à suspeita de infeção de um determinado local, ou quando se está perante um quadro
de febre de origem desconhecida [173].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
196 Leticia de Bastos
Colheita
O sangue deve ser sempre colhido por punção venosa de veia periférica, após uma
correta desinfeção da pele com solução antissética deixando-a secar. É importante desinfetar
também as tampas dos frascos de hemoculturas, tendo o cuidado de deixar evaporar o
desinfetante antes de puncionar a borracha. Após a colheita inocular os frascos, sem mudar de
agulha, respeitando as proporções recomendadas pelo fabricante.
Para cada frasco de hemoculturas de adulto e pediátricas são necessários 8-10 mL e 1-3
mL de sangue total, respetivamente [174, 175]. Uma vez colhidas as hemoculturas, homogeneizar
cuidadosamente os frascos por inversão.
Para cada utente, colher 2 pares de hemoculturas (cada par é constituído por uma garrafa
de aerobiose e uma de anaerobiose). O ideal será colher cada par de hemoculturas em braços
opostos e antes de ser ter iniciado a antibioterapia. Na suspeita de endocardite, colher 3 pares
de hemoculturas.
Para a pesquisa de micobactérias no sangue ver secção 9.14.2.
Transporte e Conservação da Amostra
Enviar as hemoculturas de imediato ao laboratório, mantendo os frascos à temperatura
ambiente até serem colocados no BACT/ALERT®, que possui um sistema automatizado de
incubação (37ºC), homogeneização e monitorização das hemoculturas.
Incubação
Equipamento: BacT/ALERT®, da bioMérieux
Os frascos de hemocultura contêm um meio de cultura com condições nutricionais e
ambientais adequadas aos microrganismos. Na presença de microrganismos, estes irão
metabolizar os substratos existentes no meio com produção de CO2, que irá alterar a cor do
sensor colorimétrico presente no fundo da garrafa, mudando de verde-azulado para amarelo. A
reflectância dos frascos é monitorizada e registada pelo sistema a cada 10 minutos. Se os níveis
de CO2 não se alterarem significativamente durante a incubação, a amostra é considerada
negativa [174, 175].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
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197
Por norma, o tempo de incubação no caso de uma hemocultura negativa é de 5 dias, à
exceção da suspeita de Brucella em que a incubação é prolongada para 21 dias, na suspeita de
endocardite a incubação é de 12 dias e para a pesquisa de fungos a incubação é de 11 dias.
As amostras consideradas negativas são retiradas do equipamento e este é o resultado
que sairá para o clínico. Se alguma hemocultura positivar é feito o exame microbiológico.
Exame Microbiológico
Retirar as hemoculturas positivas do equipamento, desinfetar a tampa de borracha com
solução antisséptica e deixar secar. Posteriormente, perfurar a tampa com uma agulha que tem
um dispensador permitindo retirar o conteúdo da garrafa. Depois de processadas, desinfetar
novamente a tampa dos frascos das hemoculturas, que serão armazenadas um mês na estufa.
Exame Direto:
Coloração de Gram.
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, o meio COS e incubar a 35±2ºC em atmosfera
enriquecida com 5% de CO2, 18-24h.
Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e
incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.
Nota:
Caso se observe no Gram microrganismo e não crescer nada em cultura, significa que o
microrganismo necessita de meios mais nutritivos que o COS, como o Haemophilus, por
exemplo, ou colocar a hipótese de ser um microrganismo anaeróbio. Caso se suspeite de um
microrganismo anaeróbio, enviar os frascos para o INSA, para identificação e eventual TSA.
Para valorizar o crescimento numa hemocultura é suficiente o crescimento de um
microrganismo potencialmente patogénico. No caso de se ter isolado um microrganismo
comensal da pele, valorizar apenas se houver crescimento em pelo menos duas hemoculturas
de punções diferentes.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
198 Leticia de Bastos
9.16.13. Catéteres
A presença de um catéter constitui uma porta de entrada para muitos microrganismos e
por vezes, encontram-se colonizados ou podem até mesmo ser um foco de infeção e levar a
bacteriémias ou septicémias. O envio de catéter para exame bacteriológico só é aconselhado se
existirem sinais de infeção relacionados com o catéter.
O principal agente responsável pela infeção dos catéter é o Staphylococcus epidermidis.
Contudo, também podem ser provocadas por Staphylococcus Coagulase negativa,
Staphylococcus aureus, Enterobacteriáceas, Candida spp., Bacilos Gram negativo e
Enterococcus spp.
A probabilidade de um catéter ficar colonizado é tanto maior quanto maior for a sua
permanência no organismo.
Colheita
Antes de retirar o catéter, colher hemoculturas de uma veia periférica, pois só assim será
possível valorizar o exame cultural. De seguida, desinfetar a pele em redor do catéter com um
antisséptico e retirar o catéter. Cortar cerca de 3-5cm da sua porção terminal para um recipiente
esterilizado, mantendo as condições de assepsia em todo o procedimento.
Transporte e Conservação da Amostra
Recipiente seco e esterilizado de boca larga. Manter à temperatura ambiente até ser
processado.
Exame Microbiológico
Exame Cultural:
Semear, pelo método de Maki, em meio COS e incubar a 35±2ºC em atmosfera
enriquecida com 5% de CO2, 18-24h.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
199
Nota:
Caso se desenvolvam menos de 15 colónias o resultado é lançado como negativo. Se se
observarem mais de 15 colónias só valorizar se a hemocultura for positiva.
9.16.14. Fezes
As causas mais frequentes de diarreia, em adultos e crianças com idade superior a 2-3
anos, é a infeção por Campylobacter spp., algumas espécies de Salmonella e Shigella,
Staphylococcus aureus [176] e Clostridium difficile. No entanto, um pequeno número de casos
pode ser provocado pela Giardia lamblia, Yersinia enterocolitica e E. coli O157:H7 [176].
Nas crianças com idade inferior a 3 anos são numerosos os casos de gastroenterite viral,
assim como por estirpes intestinais de Escherichia coli enteropatogénica [176].
Os indivíduos que viajam para o estrangeiro podem ser contaminados por diversos
microrganismos patogénicos intestinais, tais como Escherichia coli enterotoxinogénica,
Shigella dysenteriae, Aeromonas hidrophyla e parasitas como Entamoeba histolytica, entre
outros. Dai a importância de se saber se o utente esteve recentemente no estrangeiro e em que
país [176].
Nos doentes tratados com antibióticos, ocorre um desequilíbrio da flora normal, que
predispõe a infeção por diversas bactérias resistentes, Candida albicans, Cryptosporidium,
podendo ainda ocorrer uma enterocolite grave devida a uma estirpe de Staphylococcus aureus
resistente ou colite pseudomenbranosa por Clostridium difficile [176].
Colheita
O tipo de fezes de interesse para análise bacteriológica são as fezes diarreicas. Colher 3
amostras em dias sucessivos, pois a libertação dos microrganismos para as fezes pode não ser
contínua.
Colher uma porção equivalente a uma noz ou, no caso de fezes líquidas, um terço do
frasco.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
200 Leticia de Bastos
Transporte e Conservação da Amostra
As fezes devem ser colhidas para um recipiente limpo e seco e enviadas ao laboratório
até 2h após a colheita. Caso não seja possível, manter as amostras refrigeradas.
Nos laboratórios de Torres Novas e Abrantes, as amostras destinadas a coprocultura são
transferidas para o meio de transporte Cary Blair para serem enviadas para o Laboratório
Central, à temperatura ambiente, podendo ser conservada até 24h. As fezes recebidas do
ambulatório e internamento do Hospital de Tomar são processadas de imediato, não
necessitando da transferência para o meio de transporte.
Exame Microbiológico
Exame Cultural:
Semear, em quatro quadrantes, os meios YER, MCK e HEK e de seguida inocular em
Selenito. Incubar a 35+2ºC em atmosfera de aerobiose, 24h.
Em todas as unidades do CHMT sempre que são recebidas fezes para coprocultura é
feito o teste de screening para Campylobacter spp. Se o teste for positivo, para além dos meios
habituais, semear também o meio CAM e incubar em atmosfera de microaerofilia, 5 dias a
35+2ºC.
Exame Parasitológico
Teste Comercial: Concentrador Easy-Copros para Parasitas Intestinais, da Iberkit
Em caso de suspeita clínica de parasitose intestinal, é fundamental a análise
parasitológica das fezes como a forma de proceder à identificação correta de ovos de helmintas,
quistos ou trofozoítos de protozoários e / ou vermes intestinais [177].
Objetivo: Concentrar a amostra de fezes para pesquisa de parasitas ao microscópio
ótico, de forma a aumentar o número de quistos, trofozoítos, ovos ou larvas na preparação;
remover a maior parte da matéria fecal orgânica; e preservar os microrganismos, num estado
inalterado, para que possa ser mais fácil a sua deteção e identificação [177].
Método: Método de sedimentação por centrifugação [177].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
201
Procedimento: Colocar uma pequena porção da amostra num tubo contendo formalina
a 10% e homogeneizar no vórtex. Adicionar 1,25 ml de acetato de etilo. Colocar o tubo com
fundo cónico no tubo primário, e filtrar todo o conteúdo, por inversão. Por fim, centrifugar a
suspensão 10 minutos a 1500rpm e decantar sobrenadante, para se poder obter o sedimento, que
é onde se encontram as estruturas parasitárias. O sedimento é observado “a fresco”, entre lâmina
e lamela. É necessário também fazer-se um esfregaço a partir do sedimento para corar com
coloração de Kinyoun para pesquisa de Cryptosporidium, Isospora belli e Microspora [177].
Outros Testes que podem ser pedidos pelo Clínico:
Teste screening para Clostridium difficile;
Teste screening para Adenovírus e Rotavírus;
Pesquisa de sangue oculto.
Para a execução dos testes mencionados, as amostras de fezes devem vir em recipiente
estéril e refrigerado.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
202 Leticia de Bastos
9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos
Figura 30.Fluxograma para identificação de cocos Gram negativos.
Cocos Gram Negativos
Neisseria spp.
Moraxella spp.
Haemophilus spp.
Positivo Negativo
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
Prova da Oxidase
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
203
Figura 31. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram negativo.
Bacilos Gram Negativos
Positivo Negativo
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
Pseudomonas spp.
Amostra de Fezes,
em HEK: não
fermentadoras da
lactose e H2S
positivas
Positivo Negativo
Flora saprófita E. coli
Salmonella spp. ou
Shigella spp.
.
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
Serologia para E.coli
O157:H7 em
crianças com idade
inferior a 2 anos
Prova da Urease
Prova da Oxidase
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204 Leticia de Bastos
9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos
Figura 32.Fluxograma para a identificação de cocos Gram positivo.
Staphylococcus spp. Streptococcus spp.
Staphylococcus
coagulase negativos
S. pneumoniae
Cocos Gram Positivos
Positivo Negativo
Prova da Catalase
Prova da Coagulase
Positivo Negativo
S. aureus
β-hemólise γ-hemólise α-hemólise
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
Prova da Sensibilidade à
Optoquina ou Teste
rápido para identificação
de S. pneumoniae
Sensível/Positivo Resistente/Negativo
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
205
Figura 33. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram positivo.
9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras
Figura 34. Fluxograma para identificação de leveduras.
Leveduras
SGC2 CAN2
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
Bacilos Gram Positivos
Identificação +
TSA VITEK® 2,
da bioMérieux
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Relatório de Estágio
206 Leticia de Bastos
9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos
9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes
Teste Comercial: Teste FOB da Chemtrue®
O cancro colo-rectal é o terceiro carcinoma mais frequente em Portugal [178], sendo o
seu rastreio fundamental, para ajudar na deteção precoce, reduzindo deste modo a mortalidade.
Amostra: Três amostras de fezes, colhidas em dias sucessivos.
Objetivo: Deteção qualitativa da hemoglobina em amostras fecais, para auxiliar no
diagnóstico de perturbações gastrointestinais inferiores, tais como cancro colorectal, pólipos e
adenomas [179].
Método: Imunocromatografia.
Cor da frente e do
verso da colónia
Observação
macroscópica da
colónia
Fungos
Filamentosos
Observação
microscópica da
colónia
Micélio aéreo ou
rasteiro
Aspeto/Textura
Hifas septadas ou
não septadas
Hifas pigmentadas
ou hialinas
Crescimento
rápido ou lento
Estruturas
reprodutoras
Figura 36. Fluxograma para identificação de fungos filamentosos.
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Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
207
Procedimento: Retirar uma porção da amostra com um bastão e introduzi-la no tubo
que contém tampão salino, fornecido pelo kit. Homogeneizar e pipetar 2 gotas desta suspensão
na cassete. Na presença de hemoglobina, complexa-se com o conjugado (anticorpo anti-
hemoglobina humana) e irá mover-se por capilaridade até à zona de teste que ao complexar-se
com os anticorpos anti-imunoglobulina humana adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão
formar uma linha visível. Independentemente da presença de hemoglobina, a migração continua
até à zona de controlo, formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho
adequado do procedimento. Cinco minutos depois ler o resultado do teste. Resultados negativos
não excluem sangramento, uma vez que alguns pólipos ou cancros da região cólon-retal podem
sangrar intermitentemente ou não sangrar e quando o fazem o sangue pode não se encontrar
distribuído uniformemente nas fezes [179].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
208 Leticia de Bastos
10. Fase Pós-Analítica
A fase pós-analítica compreende a validação dos resultados. Para tal, é necessário ter
em consideração informações obtidas no ato da colheita (jejum, medicação), as condições de
transporte e acondicionamentos das amostras, bem como o resultado de outros parâmetros
laboratoriais, para além da idade, sexo, história clínica do doente e contexto clínico no qual
foram solicitadas as análises.
Os resultados obtidos pelos equipamentos são enviados para o sistema informático do
Serviço de Patologia Clínca. Posteriormente, é feita a validação biopatológica dos resultados
pelos Especialistas em Patologia Clínica ou Análises Clínicas.
Durante a validação, caso se verifique alguma discrepância nos resultados, é necessário
verificar as condições da amostra (hemólise, presença de fibrina, coágulo), e se a amostra
estiver conforme, repetir as análises, para confirmação de resultados lançados pelo
equipamento, no entanto, em determinadas situações, pode ser necessário solicitar uma nova
colheita.
Depois de validados, os resultados são disponibilizados ao clínico podendo ser uteis no
diagnóstico, prognóstico, monitorização e/ou planeamento da terapêutica de um utente.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
Leticia de Bastos
209
11. Conclusão
O Mestrado em Análises Clínicas (MAC), bem como o Estágio profissional que integra
o Curso constituem uma excelente oportunidade para a aquisição de competências e
experiência, bem como de novos conhecimentos e consolidar outros adquiridos aquando da
licenciatura.
O estágio da valência de bioquímica foi efetuado no Hospital Dr. José de Almeida, onde
me encontrava a trabalhar há 4 anos. Foi uma experiência bastante enriquecedora, a nível
profissional, motivando para o aperfeiçoamento do trabalho laboratorial e desenvolvimento do
espirito crítico, uma vez que a validação técnica era feita pelos TSDT, bem como a validação
biopatológica da urgência, o MAC pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa foi
sem dúvida uma mais-valia.
Por motivos pessoais, comecei a trabalhar no Centro Hospital Medio Tejo, E. P.E, e no
Hospital de Tomar realizei o estágio das valências de hematologia e microbiologia. Foi uma
grande mudança, desde a integração, à dinâmica e organização laboratorial e, principalmente,
quanto ao tipo de trabalho executado e à multiplicidade de tarefas realizadas diariamente.
Contudo, consegui uma boa integração, tendo a possibilidade de adquirir novos métodos de
trabalho e conhecimentos em diversas áreas, assim como a possibilidade de interligá-los com
os adquiridos no MAC.
De um modo geral, durante o período de estágio, tive a possibilidade de demonstrar e
desenvolver tarefas de forma autónoma, bem como em equipas multidisciplinares, mas também
adquirir, aplicar e partilhar conhecimentos teórico-práticos.
A realização destes estágios proporcionou-me uma formação extra, atualizada e
consistente nas várias valências descritas no presente documento, que só foi possível de
alcançar em contexto real de trabalho, permitindo desse modo, consolidar os ensinamentos
recebidos no Curso. Para finalizar, considero que os objetivos propostos foram alcançados.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Relatório de Estágio
210 Leticia de Bastos
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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
ABORDAGEM GENÉTICA DA DOENÇA DE ALZHEIMER
FAMILIAR: DO DIAGNÓSTICO AO TRATAMENTO
Leticia de Bastos
Dissertação orientada pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera.
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
2018
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
Leticia de Bastos
225
Índice
Índice ...................................................................................................................................... 225
Índice de Figuras .................................................................................................................... 227
Índice de Tabelas .................................................................................................................... 228
Siglas e Abreviaturas .............................................................................................................. 229
1. Introdução ....................................................................................................................... 231
1.1. Objetivos .................................................................................................................. 233
2. Doença de Alzheimer Familiar ....................................................................................... 234
2.1. Proteína Precursora Amilóide .................................................................................. 235
2.1.1. Mutações no gene APP .................................................................................... 237
2.2. Presenilinas 1e 2 ...................................................................................................... 241
2.2.1. Mutações no gene PSEN1 ................................................................................ 243
2.2.2. Mutações no gene PSEN2 ................................................................................ 246
2.3. Apolipoproteína E.................................................................................................... 248
2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1 .................................................................................... 249
3. Em Portugal .................................................................................................................... 250
4. Diagnóstico ..................................................................................................................... 251
4.1. História Clínica do Doente ...................................................................................... 253
4.2. Entrevista a Informante Informado .......................................................................... 254
4.3. Testes Cognitivos Breves ........................................................................................ 255
4.4. Investigação Laboratorial ........................................................................................ 256
4.5. Testes Neuropsicológicos ........................................................................................ 256
4.6. Testes Genéticos ...................................................................................................... 256
4.7. Neuroimagem .......................................................................................................... 257
4.8. Outros Biomarcadores ............................................................................................. 259
5. Hipóteses Terapêuticas ................................................................................................... 261
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
226 Leticia de Bastos
5.1. Tratamento Sintomático .......................................................................................... 261
5.1.1. Inibidores da Acetilcolinesterase ..................................................................... 261
5.1.2. Antagonista do Recetor N-Metil-D-Aspartato ................................................. 261
5.2. Tratamento Baseado na Etiologia ............................................................................ 262
5.2.1. Inibidores das Secretases .................................................................................. 264
5.2.2. Imunoterapia Aβ ............................................................................................... 264
5.2.3. Inibidores da Agregação do Péptido Aβ .......................................................... 266
5.2.4. Inibidores da Fosforilação da Proteína Tau ...................................................... 266
5.2.5. Inibidores da Agregação da Proteína Tau ........................................................ 268
6. No futuro… ..................................................................................................................... 269
7. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 272
8. Discussão e Conclusão .................................................................................................... 273
9. Referências Bibliográficas .............................................................................................. 275
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
Leticia de Bastos
227
Índice de Figuras
Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA
(direita). .................................................................................................................................. 231
Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar. ....................... 232
Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não
amiloidogénica (à esquerda) e da via amiloidogénica (à direita). .......................................... 237
Figura 4. Mutações no gene APP. Representação da sequência proteica da APP do aminoácido
647 ao 730. ............................................................................................................................. 238
Figura 5. Apresentação esquemática da estrutura das proteínas PSENs. ............................... 241
Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada. ............ 243
Figura 7. Variantes PSEN1. Representação da sequência proteica da presenilina 1 ............. 244
Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2. ............ 247
Figura 9. Resumo dos principais alvos dos fármacos na DA e como monitorizar a terapêutica.
................................................................................................................................................ 263
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
228 Leticia de Bastos
Índice de Tabelas
Tabela 1. Indicadores de mortalidade pela DA em Portugal no ano 2015 ............................. 250
Tabela 2. Fatores que influenciam o risco da DA .................................................................. 254
Tabela 3. Testes Cognitivos Breves, aplicação e respetiva sensibilidade e especificidade. .. 255
Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o péptido Aβ
................................................................................................................................................ 265
Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da DA.
................................................................................................................................................ 270
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229
Siglas e Abreviaturas
Aβ Beta-Amilóide
AICD (Amyloid Intracellular Domain) Domínio Intracelular Amilóide
APP (Amyloide Percursor Protein) Proteína Precursora Amilóide
ApoE Apolipoproteína E
AVC Acidente Vascular Cerebral
BACE-1 (β-Site Amyloid Precursor Protein Cleaving Enzyme 1) β-secretase 1
CTFα (C-terminal Fragment α) Fragmento C-terminal α
CTFβ (C-terminal Fragment β) Fragmento C-terminal β
DA Doença de Alzheimer
FDG 2-desoxi-2-[18F]fluoro-D-glucose
GSK-3 glicogénio sintase cinase 3
iRNAs (interfering RNAs) RNA interferente
LCR Líquido Cefalorraquidiano
MCI (Mild Cognitive Impairment) Comprometimento Cognitivo Ligeiro
miRNAs Micro-RNAs
NMDA N-Metil-D-Aspartato
PET (Posítron Emission Tomography) Tomografia de Emissão de Positrões
PSEN1 Presenilina 1
PSEN 2 Presenilina 2
p-tau Proteína Tau Hiperfosforilada
RM Ressonância Magnética
sAPPα Proteína Precursora α-Amilóide Segregada
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Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
230 Leticia de Bastos
sAPPβ Proteína Precursora β-Amilóide Segregada
SORL1 Recetor Ligado a Sortilina 1
TC Tomografia Computadorizada
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231
1. Introdução
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa complexa e devastadora,
constituindo um importante problema de saúde pública a nível mundial [1-3]. Estima-se que 50-
75% dos doentes com demência apresentam DA, o que corresponde a cerca de 23 a 35 milhões
de pessoas em todo o mundo [3], sendo mais comum nos países desenvolvidos [1]. Esta doença
ocorre principalmente ao nível da população idosa [1,3,4], e, embora não seja uma consequência
normal do envelhecimento, a idade constitui um dos principais fatores de risco, seguido da
história familiar [5].
A Doença de Alzheimer (DA) resulta de perda irreversível de neurónios,
particularmente no córtex e no hipocampo [6] com atrofia cortical bruta e dilatação ventricular
[1,3]. Clinicamente, define-se por um início insidioso com perda progressiva de memória, das
funções cognitivas, dependência e morte [2,5,7]. Neuropatologicamente, é caracterizada pela
presença de placas neuríticas extracelulares (placas senis18), que resultam da deposição do
péptido β-amilóide (Aβ), sendo as formas oligoméricas de Aβ cruciais para iniciar a patogénese
da doença [1,3,6], levando à morte celular e consequentemente à demência (Figura 1 e 2) [8, 9].
Esse péptido também reveste as paredes dos vasos cerebrais, levando à angiopatia amilóide
cerebral [10].
18 Placas neuríticas, senis ou amilóides: Depósitos extracelulares esféricos que possuem um núcleo fibrilar rodeado por
microglia, astrócitos reativos e neurites distróficas resultantes do processo neurodegenerativo neuronal. O principal
componente é o péptido Aβ [12].
Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA (direita) [11].
Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar [9].
Corte histológico do neocórtex de um doente que morreu de DA, corado pelo método de Bielschowsky modificado. À esquerda,
placa amilóide extracelular e à direita, emaranhado neurofibrilar que circunda o núcleo do neurónio.
Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA (direita) [11].
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
232 Leticia de Bastos
Também se verifica a acumulação intraneuronal de emaranhados neurofibrilares19
compostos por proteína tau hiperfosforilada (p-tau) [1,3,6]. Estes eventos levam à disfunção
sináptica que está intimamente relacionada com a duração e gravidade da doença (Figuras 1 e
2) [13].
Uma vez que os sintomas clínicos da DA se sobrepõem substancialmente a outros
distúrbios do sistema nervoso central, o diagnóstico definitivo desta patologia só pode ser
obtido com o exame neuropatológico post-mortem dos tecidos cerebrais [2,5].
A DA é uma doença multifatorial e heterogénea, que pode ser classificada em dois
subtipos tendo em conta a idade em que surge: DA de início precoce, que normalmente surge
antes dos 65 anos de idade; e DA de início tardio, ou Alzheimer “esporádico”, que se
desenvolve nos indivíduos com mais de 65 anos [1,2,14]. Ambos os subtipos possuem
manifestações clínicas semelhantes, principalmente nos estádios finais, sendo por vezes a idade
um dos únicos critérios que permitem fazer esta distinção [3].
A DA de início precoce é uma forma relativamente rara da doença, correspondendo a
5-10% dos casos diagnosticados [14]. A história familiar está presente em cerca de 35-60% dos
casos de DA de início precoce e aumenta em 15% quando existe uma hereditariedade
autossómica dominante [15].
A forma predominante da DA é a de início tardio [1], que corresponde a mais de 95%
dos casos [5,6]. Esta apresenta uma associação familiar menos evidente, embora 60-80% dos
19Emaranhados neurofibrilares: A proteína tau é uma proteína de ligação aos microtúbulos, quando hiperfosforilada acumula-
se em agregados intracelulares conhecidos como emaranhados neurofibrilares [16].
Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar [9].
Corte histológico do neocórtex de um doente que morreu de DA, corado pelo método de Bielschowsky modificado. À esquerda,
placa amilóide extracelular e à direita, emaranhado neurofibrilar que circunda o núcleo do neurónio.
Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não amiloidogénica (à
esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado
neurofibrilar [9].
Corte histológico do neocórtex de um doente que morreu de DA, corado pelo método de Bielschowsky modificado. À esquerda,
placa amilóide extracelular e à direita, emaranhado neurofibrilar que circunda o núcleo do neurónio.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
Leticia de Bastos
233
casos possam ter origem hereditária; a etiologia dos casos esporádicos é mais complexa devido
a interações entre componentes ambientais e genéticos, existindo outros fatores que contribuem
para o início, progressão e gravidade da doença [2,5,14]. O alelo ε4 do gene que codifica a
apolipoproteína E (ApoE) é o principal fator de risco para a patogénese de DA de início tardio,
aumentando em 3,7 o risco para a doença nos indivíduos heterozigóticos e 14 vezes nos
indivíduos homozigóticos [1-3,5,17]. Diversos investigadores identificaram inúmeras mutações e
polimorfismos associados ao aumento do risco de desenvolvimento da DA esporádica, estando
a maioria localizados em genes ligados ao metabolismo lipídico, resposta inflamatória e
endocitose. Contudo, o envelhecimento continua a ser considerado o principal fator de risco,
seguida da hipertensão, dislipidémia, síndrome metabólica e diabetes [17].
Com o avanço da genética molecular, a pesquisa de genes responsáveis por ambas as
formas de Alzheimer tem sido amplamente realizada [6]. Embora a maioria dos doentes
desenvolva a doença em idade avançada, é principalmente a investigação realizada sobre a
forma rara que levou a um maior conhecimento acerca da patogénese da doença [2].
1.1. Objetivos
O objetivo desta dissertação é conhecer um pouco mais acerca da DA, nomeadamente
da sua forma familiar, quais as alterações genéticas com maior relevância clínica, a
fisiopatologia, o diagnóstico e as possíveis opções terapêuticas.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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234 Leticia de Bastos
2. Doença de Alzheimer Familiar
Em 1906, Alois Alzheimer relatou o caso de uma mulher que apresentava uma demência
peculiar aos 51 anos, correlacionada com a função cognitiva, características comportamentais
e achados histopatológicos no córtex cerebral característicos da doença [6], nomeadamente a
presença de placas senis e de emaranhados neurofibrilares [7]. Posteriormente, Emil Kraeplin
nomeou esta demência pré-senil (início <65 anos) de "Doença de Alzheimer". O Alzheimer
familiar foi relatado pela primeira vez por Sjogren et al. em 1952, e a partir de 1980, vários
casos começaram a ser reportados [6].
Os indivíduos que desenvolvem Alzheimer familiar de inicio precoce apresentam os
primeiros sintomas entre 30 e os 65 anos, sendo a maioria diagnosticados entre os 45 e os 60
anos. Como esta doença atinge pessoas que ainda se encontram com uma vida ativa, o impacto
é mais devastador. A progressão clínica da doença é mais rápida, ocorrendo sintomas
comportamentais intensos e psicóticos. Alguns estudos relataram uma maior carga
neuropatológica ou uma deterioração da conectividade funcional das redes neurais mais
extensa, não se encontrando confinada à região temporal mediana, podendo envolver também
o neocórtex [4]. Para além da apresentação clínica típica, os doentes apresentam com maior
frequência manifestações atípicas como sintomas corticais focais, disfunção visual, apraxia,
discalculia, afasia e disfunção executiva [3].
A DA familiar é essencialmente causada por mutação raras, altamente penetrantes, em
genes que codificam para a proteína precursora amilóide (APP), a presenilina 1 (PSEN1) e a
presenilina 2 (PSEN2). Mutações nestes genes resultam na alteração da formação do péptido
Aβ [5,6,17].
A execução de estudos funcionais levou ao desenvolvimento da “hipótese da cascata
amilóide” [18]. Este é o modelo mais influente da patologia molecular da DA desenvolvido ao
longo dos últimos 25 anos [8]. Nas formas genéticas da doença com transmissão autossómica
dominante, esta hipótese pressupõe que a deposição dos péptidos Aβ é o evento patológico
inicial para o desenvolvimento da doença [17], sendo o péptido Aβ42, a variante insolúvel e auto-
agregante, que leva à formação de placas senis e emaranhados neurofibrilares [1,8,19], levando à
destruição de sinapses, morte neuronal [3,17] e consequentemente à demência [8].
IX Mestrado em Análises Clínicas
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Leticia de Bastos
235
As variantes genéticas da APP estão localizadas na sequência Aβ, perto desta e/ou na
proximidade dos locais de clivagem das secretases, ao passo que as variantes das presenilinas
podem ser encontradas em qualquer local da proteína [3].
A frequência estimada para as mutações nos genes APP, PSEN1 e PSEN2 são 14%, 81%
e 6%, respetivamente, as quais podem explicar até 71% do padrão de transmissão autossómico
dominante da DA familiar [18].
Durante muitos anos, estes genes foram descritos como sendo os únicos responsáveis
pela DA familiar de início precoce e o gene que codifica a ApoE como o único gene de
suscetibilidade confirmado para a DA esporádica. Contudo, desde o início dos anos 90, centenas
de genes têm sido implicados no aumento do risco da doença [20].
Atualmente, sabe-se que a ApoE e variantes raras no recetor relacionado com a sortilina
1 (SORL1) podem estar também relacionadas com o aparecimento da DA de início precoce,
nomeadamente com a DA familiar [1,15]. Ainda assim, muitos casos apresentam origem
geneticamente inexplicada ou desconhecida [18].
2.1. Proteína Precursora Amilóide
A proteína precursora amilóide (APP) é uma glicoproteína transmembranar e ubíqua
constituída por 770 aminoácidos [1,12]. Este polipéptido encontra-se nas membranas celulares e
de uma forma abundante no cérebro. A proteína APP atua como uma proteína chaperone
exercendo funções citoprotetoras e, aparentemente, também se encontra envolvida nas
reparações sinápticas, sinalização celular, podendo ainda mediar as interações que facilitam o
transporte de substâncias sintetizadas no corpo celular dos neurónios para as sinapses distais
[17].
O gene APP, localizado no cromossoma 21q21.1 - 21q21.3 [1], possui 18 exões que após
transcrição e splicing alternativo originam pelo menos cinco isoformas da APP designadas de
acordo com o seu comprimento em aminoácidos. As únicas formas presentes no cérebro são a
APP695, APP714, APP751 e APP770, sendo a APP695 expressa em maior quantidade [1,12].
A APP é clivada por duas vias proteolíticas independentes, não-amiloidogénica ou
amiloidogénica, pela ação de três enzimas denominadas α-, β-, e y-secretases [19].
IX Mestrado em Análises Clínicas
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236 Leticia de Bastos
Na via não-amiloidogénica, a proteólise da APP ocorre pela ação das enzimas α- e y-
secretases dando origem a fragmentos não patogénicos [1]. A α-secretase cliva a proteína APP,
libertando a proteína precursora α-amilóide (sAPPα) para o meio extracelular. Em seguida, um
fragmento carboxi-terminal com 83 resíduos de carbono (C83) é digerido pela γ-secretase,
libertando o domínio intracelular amilóide (AICD, do inglês Amyloid Intracellular Domain –)
(Figura 3) [19].
A via amiloidogénica combina ações sequenciais das enzimas β- e y-secretase, gerando
péptidos Aß ao nível do complexo de Golgi e em menor extensão no retículo endoplasmático
[13]. Este péptido é codificado pelos exões 16 e 17 do gene APP [12].
A enzima β-secretase, também designada por BACE-1 (β-site amyloid precursor
protein cleaving enzyme 1), cliva a APP libertando para o meio extracelular a extremidade N-
terminal da proteína precursora β-amilóide (sAPPβ) (Figura 3) [19]. O péptido C-terminal com
99 resíduos de carbono (C99) é inicialmente clivado pela ε-secretase, produzindo o péptido
Aβ48 ou Aβ49 e o AICD. Posteriormente, o péptido Aβ resultante é clivado consecutivamente
pela γ-secretase a cada três ou quatro aminoácidos levando à formação dos péptidos Aβ42, com
42 aminoácidos, e Aβ40, com 40 aminoácidos, respetivamente [9,21], podendo, no entanto, ser
observadas pequenas quantidades de outros fragmentos [22]. Quando a proteólise da APP
catalisada pela γ-secretase é normal, a espécie predominante é o péptido Aβ40, sendo que o
péptido Aβ42 representa apenas 5-15% do total dos péptidos amilóides produzidos [22]. No
entanto, o fragmento que se encontra mais associado à DA é o Aβ42, pois é o mais neurotóxico
e propenso à agregação [9,23].
O AICD, gerado por ambas as vias, é libertado no citoplasma após clivagens sucessivas
e transportado para o núcleo, onde passa a influenciar os processos de transcrição [19].
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237
2.1.1. Mutações no gene APP
Diversos estudos têm demonstrado que doentes com DA familiar, portadores de
mutações no gene APP, apresentam alterações nas características neuropatológicas centrais e
nas autópsias tendem a apresentar maior quantidade de placas senis neocorticais do que
indivíduos com DA esporádica. Estes dados, apesar de terem sido observados em poucos casos,
confirmam uma ampla sobreposição de resultados [9]. Outra característica comum nestes
doentes é a existência de angiopatia amilóide cerebral, que muitas vezes ocorre em simultâneo
com hemorragias cerebrais [25].
A primeira mutação no gene APP foi descoberta por Goate et al., em 1991, (p.Val717Ile,
exão 17) [6,12]. Com o avanço das metodologias de genética molecular, diversos investigadores
começaram a identificar mutações no gene APP, relacionando-as com a possibilidade de serem
a causa da DA (Figura 4) [9].
Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não amiloidogénica (à
esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].
APP: proteína precursora amilóide; sAPPα: proteína precursora α-amilóide segregada, AICD: domínio amilóide intracelular;
sAPPβ: proteína precursora β-amilóide segregada; Aβ: péptido β-amilóide; APH-1, anterior pharynx-defective 1; CTFα:
fragmento C-terminal α; CTFβ: fragmento C-terminal β; PEN-2, presenilin enhancer 2.
Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não amiloidogénica (à
esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].
APP: proteína precursora amilóide; sAPPα: proteína precursora α-amilóide segregada, AICD: domínio amilóide intracelular;
sAPPβ: proteína precursora β-amilóide segregada; Aβ: péptido β-amilóide; APH-1, anterior pharynx-defective 1; CTFα:
fragmento C-terminal α; CTFβ: fragmento C-terminal β; PEN-2, presenilin enhancer 2.
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238 Leticia de Bastos
Figura 4. Mutações no gene APP. Representação da sequência proteica da APP do aminoácido 647 ao 730 [3].
Verde: sequência do domínio extracelular; Laranja: sequência do domínio transmembranar; Azul-escuro: sequência do domínio
intracelular. Púrpura: mutações patogénicas conhecidas; duplicações genómicas não estão representadas na figura; Vermelho:
duas mutações recessivas patogénicas; Cinza: mutações não patogénicas. Um círculo envolve o p.A673: porque a mudança
para T está descrita como protetora contra a DA, bem como a mudança para V no estado heterozigótico. =: marca uma mutação
silenciosa não patogénica em p.G708; Delta: indica uma eliminação. Os locais de clivagem das secretases estão marcados com
linhas a tracejado preto.
Até à data, 54 mutações no gene APP foram associadas à DA, sendo a maioria do tipo
missense, podendo, no entanto, também ocorrer deleções parciais ou duplicações do gene [3].
Até à data, 52 variantes patogénicas da APP foram relatadas em 119 casos índex de famílias
que apresentam um padrão de hereditariedade autossómico dominante; contudo, foram
reportadas duas mutações apresentando transmissão recessiva, p.A673V e p.E693D, capazes de
causar DA familiar [1,3].
A maioria das mutações está localizada nos exões 16-17, que codificam o domínio
transmembranar onde se encontram os locais de reconhecimento das secretases. De um modo
geral, estas mutações alteram o processamento da APP levando à acumulação de fragmentos
Aβ42 [14,12].
A mutação APP Swedish (p.LysMet670/671AsnLeu), identificada em duas famílias
suecas [6], é a única dupla mutação pontual localizada na extremidade N-terminal do domínio
Aß, adjacente ao local de clivagem da β-secretase, em que os aminoácidos lisina-metionina são
substituídos por asparagina-leucina [1]. Esta variante está associada ao aumento da deposição
do péptido Aβ42 no cérebro [12], uma vez que a quantidade do péptido Aβ produzido a partir da
APP mutada é 2-3 vezes superior á que é produzida pela APP não mutada (wild-type). Embora
haja um excesso de produção, a sequência de aminoácidos é normal pois a mutação ocorre fora
da região codificante do péptido Aβ, sendo o excesso de produção suficiente para causar DA
[9].
Curiosamente, diversos estudos têm demonstrado que os doentes com Síndrome de
Down (trissomia 21) desenvolvem DA com alterações neuropatológicas extensas que podem
IX Mestrado em Análises Clínicas
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Leticia de Bastos
239
ocorrer desde muito cedo, a partir dos 40 anos de idade, devido à sobre-expressão do gene APP
que conduz à acumulação de péptido Aβ [14].
Outras mutações APP responsáveis pela DA ocorrem na ou após a região codificante do
C-terminal do domínio Aβ. Exemplos de mutações localizadas junto à extremidade distal C-
terminal do domínio Aβ adjacente ao local de ação da γ-secretase são as mutações Iranian
(p.Thr714Ala), Australian (p.Thr714Ile), French (p.Val715Met), German (p.Val715Ile),
Florida (p.Ile716Val) e London (p.Val717Ile). As mutações Flemish (p.Ala692Gly), Italian
(p.Glu693Lys), Dutch (p.Glu693Gln), Arctic (p.Glu693Gly) e Iowa (p.Asp694Asn) estão
localizadas dentro da sequência de codificação do Aβ [6].
A mutação London (p.Val717lle), a mais comum a nível mundial, altera a atividade
funcional da γ-secretase levando ao aumento da razão Aβ42/Aβ40, devido ao incremento do
péptido Aβ42 e à diminuição dos níveis do péptido Aβ40, não ocorrendo necessariamente uma
mudança na quantidade total de péptido Aβ produzido [9]. Achados neuropatológicos numa
família Inglesa revelaram corpos de Lewy20 a nível cortical e angiopatia amilóide suave, e numa
família Americana foram encontradas placas senis e emaranhados neurofibrilares, com ausência
de angiopatia amilóide ou corpos de Lewy [1].
A mutação Flemish (p.Ala692Gly) ocorre dentro da região do domínio Aβ, afetando a
atividade da γ-secretase e levando ao aumento de duas a quatro vezes a produção dos péptidos
Aβ42 e Aβ40. Esta mutação origina a deposição do péptido Aβ nas paredes dos vasos
sanguíneos cerebrais e nas placas senis, formando grandes placas densas [9], não se observando
emaranhados neurofibrilares. Clinicamente, os doentes apresentam, por volta dos 40 anos de
idade, sintomas relacionados com alterações cerebrovasculares ou disfunção cognitiva [6].
Os portadores da mutação Dutch (p.Glu693Gln) apresentam angiopatia amilóide
cerebral com deposição de raras placas amilóides, podendo ocorrer hemorragias cerebrais [2,3].
Clinicamente, são caracterizados por sintomas focais relacionados com alterações
cerebrovasculares recorrentes, a que geralmente se segue uma demência entre os 40 e 50 anos
[6]. Nestes indivíduos, o declínio cognitivo progressivo está relacionado com a lesão vascular
cerebral [9].
20 Corpos de Lewy: achados histológicos, localizados no interior ou fora dos neurónios, com forma ovóide ou alongada [26].
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240 Leticia de Bastos
A mutação Arctic (p.Glu693Gly) é uma mutação missense que ocorre na região
codificante do domínio Aβ. Esta mutação aumenta a taxa de agregação do péptido mutado, com
presença marcada de angiopatia amilóide cerebral acompanhada por abundantes placas
neuríticas em anel e emaranhados neurofibrilares [1,9]. Contudo, imagens do cérebro mostram
que não há sinais de acidentes vasculares cerebrais ou lesões vasculares. Indivíduos portadores
desta mutação apresentam um fenótipo puramente cognitivo aos 50 anos de idade [1,9,6].
Portadores da mutação Iowa (p.Asp694Asn) desenvolvem demência progressiva com
comprometimento da fala, sem quaisquer sintomas aparentes de alterações cerebrovasculares
[6]. Tanto a mutação Iowa como a mutação p.Ala713Thr estão associadas a angiopatia amilóide
cerebral grave, no contexto das características neuropatológicas centrais da DA [9].
Diversas mutações foram identificadas nos aminoácidos Val717 e Glu693, tornando
ambos os locais hotspots de mutações no gene APP [6].
As mutações no gene APP geralmente apresentam um padrão de transmissão
autossómico dominante. No entanto, existem duas mutações de transmissão autossómica
recessiva, uma deleção do aminoácido ácido glutâmico na posição 693 (p.Glu693del) que em
homozigotia pode levar à DA, e a mutação missense na posição 673, com substituição de uma
alanina por uma valina (p.Ala673Val), que em heterozigotia apresenta propriedades anti-
amiloidogénicas, sugerindo portanto um efeito protetor [3], mas que em homozigotia pode levar
ao surgimento da doença. Curiosamente, no mesmo local, a mutação p.Ala673Thr demonstrou
um forte efeito protetor contra DA, observando-se in vitro a redução da produção dos péptidos
amilóides em cerca de 40% [19].
Diversos estudos apontam para o papel dos péptidos Aβ com propriedades alteradas
como sendo a chave da patogénese da DA [1]. No entanto, os processos neurodegenerativos são
consequência de um desequilíbrio entre a sua produção e depuração, sugerindo a existência de
outros genes envolvidos que contribuem como fatores de risco para DA [2].
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241
2.2. Presenilinas 1e 2
Os genes PSEN1 (cromossoma 14) e PSEN2 (cromossoma 1), que codificam para as
presenilinas 1 e 2 respetivamente, são dois genes altamente homólogos (67%) em que 10 dos
seus exões (exões 3-12) codificam uma proteína com aproximadamente 450 aminoácidos [8].
As duas proteínas diferem apenas na região N-terminal e na região hidrofílica. A região
hidrofóbica é altamente conservada [24]. As presenilinas possuem 9 domínios transmembranares
[24] e são expressas em vários tecidos, nomeadamente no cérebro, principalmente ao nível dos
neurónios, estando presentes no complexo de Golgi, retículo endoplasmático, membranas
plasmáticas e mitocôndrias (Figura 5) [12].
Durante o desenvolvimento, a presenilina 1 é expressa no sistema nervoso central em
níveis mais elevados e encontra-se em maior quantidade do que a presenilina 2. No entanto,
num cérebro adulto as presenilinas são expressas e distribuem-se de modo semelhante [12].
A função das presenilinas foi descrita pela primeira vez por Wolfe et al. em 1995 [36],
que propôs que dois resíduos de aspartato transmembranar (257 e 385) em PSEN1 eram críticos
para a atividade da γ-secretase [14]. Atualmente, é sabido que as presenilinas em conjunto com
nicastrina, APH1 (anterior pharynx-defective 1) e PEN2 (presenilin enhancer 2) [23] formam o
complexo catalítico γ-secretase [8,27].
As presenilinas, para além de estarem envolvidas na proteólise intramembranar da APP
e de outras proteínas, intervêm na homeostasia do cálcio ao nível celular, na libertação de
Figura 5. Apresentação esquemática da estrutura das proteínas PSENs [3].
A região com topologia variável encontra-se enquadrada: inclui um domínio intermembranar com C-terminal intracelular ou
um nono domínio transmembranar com C- terminal extracelular. Os pontos pretos nos domínios transmembranares indicam a
localização dos aspartatos catalíticos. Os locais de clivagem da α, β e γ- secretase estão indicados esquematicamente.
Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].Figura 5. Apresentação
esquemática da estrutura das proteínas PSENs [3].
A região com topologia variável encontra-se enquadrada: inclui um domínio intermembranar com C-terminal intracelular ou
um nono domínio transmembranar com C- terminal extracelular. Os pontos pretos nos domínios transmembranares indicam a
localização dos aspartatos catalíticos. Os locais de clivagem da α, β e γ- secretase estão indicados esquematicamente.
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neurotransmissores [8,12], assim como estão envolvidas em diversas vias metabólicas essenciais
[27], necessárias para o desenvolvimento e manutenção das funções do cérebro, da função
sináptica, sobrevivência neuronal, sendo também importantes para a memória e a aprendizagem
[28,12].
Múltiplos substratos da γ-secretase intervêm direta ou indiretamente em muitos
processos celulares, tais como regulação da transcrição, controlo do ciclo celular [27], via de
sinalização Notch21 [8], angiogénese, oncogénese, adesão celular, e modulação dos canais de
sódio/potássio que intervêm na geração e propagação dos potenciais de ação [27].
Mutações ao nível dos genes PSEN são um importante fator de risco para a DA [24], pois
conduzirão inevitavelmente a alterações na conformação da proteína resultante, o que levará à
alteração das interações alostéricas com a γ-secretase, afetando a afinidade de ligação ao
substrato e a taxa de hidrólise. Estas alterações físico-químicas irão levar à perda ou ganho de
atividade enzimática e especificidade, com graves consequências sobre a homeostasia do
cérebro [27].
Existem fortes evidências de que mutações ao nível das presenilinas afetam várias vias
de sinalização e aumentam a vulnerabilidade do cérebro para a toxicidade devido ao aumento
do péptido Aβ [36]. Mutações ao nível do complexo γ-secretase podem levar a um aumento dos
níveis de péptido Aβ42 [1] ou ocorrer a uma diminuição da formação do péptido Aβ40,
sugerindo um mecanismo de perda de função [2], podendo ser parcial ou total [8,28].
As mutações, em qualquer um dos dois genes, podem estar na origem da DA familiar
[9]. Contudo, as que ocorrem no gene PSEN1 constituem um maior fator de risco [6]. As
mutações podem localizar-se em toda a sequência do gene, ocorrendo, no entanto, a maioria
nos domínios transmembranares [12] e em algumas das ansas hidrofílicas [2].
O espectro de mutações ao nível dos genes PSEN inclui mutações missense, as quais
constituem a grande maioria [19], mas também pequenas inserções e deleções têm sido relatadas,
como por exemplo deleções genómicas específicas em PSEN1 que levam à eliminação in frame
do exão 9 [3].
Existe uma grande heterogeneidade fenotípica entre os portadores destas mutações. A
variabilidade clínica e neuropatológica pode estar relacionada com o mecanismo de ação das
21 A via de sinalização Notch é um regulador crucial de inúmeros processos, nomeadamente inflamação, stress oxidativo,
apoptose, proliferação, crescimento e diferenciação celular [37].
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243
diferentes variantes ou com co-morbidade de outras doenças neurodegenerativas. É possível
observar-se uma grande quantidade de emaranhados neurofibrilares, assim como achados
neuropatológicos distintivos, incluindo placas “algodão-lã22” (Figura 6), corpos de Lewy,
alterações da substância branca com aglomerados atípicos de placas amilóide e um grau
variável de micro-hemorragias [38].
2.2.1. Mutações no gene PSEN1
O gene PSEN1 está localizado no cromossoma 14q24.3 [1] e possui 12 exões; contudo,
a região codificante situa-se entre os exões 3-12, originando uma proteína com 467 aminoácidos
[24].
Até à data, 227 mutações patogénicas foram identificadas no gene PSEN1 (Figura 7),
das quais apenas 23 foram classificadas como não estando associadas, ou associadas de uma
forma não clara, à DA [27]. Das mutações patogénicas associadas à DA, 70% ocorrem nos exões
5, 6, 7 e 8 [1]. As mutações observadas são essencialmente do tipo missense, pequenas inserções
ou deleções [3].
Os doentes com mutações PSEN1 podem desenvolver sintomas de DA na faixa dos 30
aos 50 anos [14]. Apesar de algumas exceções, a penetrância da doença é completa na presença
de mutações no gene PSEN1 [3,19], isto é, todos os portadores da mutação desenvolvem a doença
[9].
22 Placas “algodão-lã”: Muitas vezes associadas a uma variante morfológica das placas Aβ, ocorrem nas mesmas regiões do
cérebro que as placas senis [9] e tendem a ser mais imunorreativas para o péptido Aβ42 do que para o Aβ40 [1].
Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].
Placas de Aβ sem um núcleo denso ou distrofia neurítica.
Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].Figura 6. Placas "algodão-lã"
coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].
Placas de Aβ sem um núcleo denso ou distrofia neurítica.
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Cinco mutações diferentes no resíduo 143 do gene PSEN1
(p.Ile143Val/Phe/Asn/Thr/Met, codificado pelo exão 5) foram identificadas, tornando este
resíduo um hotspot mutacional [6].
Figura 7. Variantes PSEN1. Representação da sequência proteica da presenilina 1 [3].
Azul: domínios citoplasmáticos; Amarelo: domínios transmembranares; Vermelho: domínios luminais; Verde: domínio
intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: variantes patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:
variantes com patogenicidade pouco clara; Cinza: variantes não patogénicas. Delta: deleções; •: 2 aspartatos (D) localizados
nos domínios transmembranares (TM) VI (D257) e VII (D335); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de
cada domínio topológico.
Outras mutações são responsáveis pela DA familiar, tais como a mutação p.Ala431Glu
encontrada em famílias mexicanas, e a mutação p.Leu166Pro encontrada numa adolescente
com a doença a desenvolver-se muito precocemente comparativamente ao que é considerado
normal. Estudos in vitro indicaram que esta mutação induz níveis extremamente elevados de
Aβ42, bem como alterações na via de sinalização Notch [19].
A mutação de transmissão autossómica dominante p.Glu280Ala, com penetrância
completa, tem sido alvo de diversas investigações. Clinicamente, os indivíduos portadores desta
mutação apresentam um declínio cognitivo com grau variável de défices neurológicos,
distúrbios da marcha, e transtornos psiquiátricos e comportamentais [27].
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245
Uma mutação missense no exão 8 do gene PSEN1 (p.Leu271Val) resulta na falta de
transcrição deste mesmo exão. Esta mutação não tem sido associada ao aumento das placas
senis, mas sim ao aumento da acumulação da proteína tau e outras alterações neurofibrilares [9].
Uma deleção de três pares de bases no exão 12 do gene PSEN1 foi associada a corpos
de Lewy difusos e a placas “algodão-lã”. Embora as placas “algodão-lã” sejam características
da mutação do gene PSEN1 também foram observadas em casos de DA esporádica [9].
Mutações ao nível do gene PSEN1 levam a um comprometimento da memória e de
múltiplos domínios cognitivos. Além de sintomas cognitivos, no início da doença os indivíduos
também podem apresentar sintomas menos comuns, nomeadamente mioclonia e convulsões [6],
bem como cefaleias [25]. Também foram observados sinais extrapiramidais, comportamentais,
bem como alterações psiquiátricas (agitação, depressão, desilusão e alucinações) e afasia.
Embora não sejam sintomas exclusivos da DA familiar, são significativamente mais frequentes
em portadores de mutações no gene PSEN1 [6].
Dois perfis histopatológicos distintos foram identificados na DA familiar causada por
mutações no gene PSEN1, sendo que o tipo de patologia parece estar relacionado com a
localização da mutação no gene. As mutações que ocorrem antes do codão 200 são mais
frequentemente associadas a um padrão de patologia tipo 1, com presença de muitas placas
difusas e poucas de matéria branca. A angiopatia amilóide é apenas ligeira a moderada e é
geralmente confinada aos vasos leptomeníngeos e, de um modo geral, assemelha-se à patologia
observada na DA esporádica. As mutações situadas além do codão 200 tendem a apresentar
uma distribuição das placas difusa muito mais extensa e concentrada em torno das artérias,
sendo a angiopatia amilóide quase sempre grave [22].
No entanto, esta distribuição não é absoluta, pois algumas mutações que ocorrem antes
do codão 200 já foram associadas à angiopatia amilóide generalizada, tal como p.Glu184Asp e
as deleções p.Ile83/Met84del. E do mesmo modo, mutações que ocorrem após o codão 200,
como é o caso da mutação p.Asn405Ser, podem apresentar uma angiopatia amilóide limitada
[22].
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2.2.2. Mutações no gene PSEN2
O gene PSEN2 encontra-se localizado no cromossoma 1q31-q42 [3] e possui 12 exões
[24], apenas 10 dos quais são traduzidos para gerar uma proteína com 448 aminoácidos [12].
Após transcrição e splicing alternativo resultam duas isoformas da proteína PSEN2: a
isoforma 1, que está presente ao nível da placenta, músculo-esquelético e coração, e a isoforma
2, que não possui os aminoácidos 263-296, encontra-se essencialmente no cérebro, coração,
placenta, fígado, músculo esquelético e rim [24].
Tal como a presenilina 1, a presenilina 2 é um dos principais componentes do complexo
γ-secretase; no entanto, embora haja uma grande homologia entre as duas proteínas, menos
péptidos amilóides são produzidos a partir da presenilina 2 [1]. As mutações associadas ao gene
PSEN2 são mais raras [1], tendo sido descritas apenas 38 mutações (Figura 8), das quais 16 estão
relacionadas de uma forma clara à DA [27] e são maioritariamente do tipo missense [3].
A primeira mutação no gene PSEN2 associada à DA foi descrita em 1995 por Levy-
Lahad et al. [14,18].
A maioria das mutações associada ao gene PSEN2 foram descobertas na Europa e em
África. Até agora, apenas 2 mutações missense foram associadas a DA familiar em populações
asiáticas: a mutação p.Asn141Tyr numa família chinesa e a mutação p.Arg62Cys descrita num
doente coreano [24].
O grupo mais bem estudado para uma mutação no gene PSEN2 é a família Volga alemã,
portadora da mutação p.Asn141Ile. O início dos sintomas começa por volta dos 40 anos de
idade, podendo estender-se até à sétima ou oitava década de vida [6,18]. Estes doentes têm
tendência a desenvolver corpos de Lewy [9].
As mutações p.Met239Ile, p.Met239Val, p.Ser130Leu e p.Met239Ile também são
responsáveis pelo aparecimento da DA familiar, levando ao aumento da quantidade do péptido
Aβ42 e, consequentemente, ao aumento da razão Aβ42/Aβ40. As mutações p.Ser130Leu e
p.Met239Ile também alteram a homeostasia do cálcio a nível celular [24].
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247
Os portadores de mutações no gene PSEN2 apresentam uma idade mais tardia para o
aparecimento do início dos sintomas quando comparados com os portadores de mutações no
gene PSEN1, podendo a sintomatologia surgir entre os 39 e os 75 anos [1]. A nível
neuropatológico, observa-se essencialmente a vasta formação de placas neuríticas, acumulação
de emaranhados neurofibrilares e angiopatia amilóide cerebral que pode ser proeminente,
podendo mesmo resultar em acidente vascular cerebral hemorrágico. Quanto aos aspetos
clínicos, apresentam alterações precoces e progressivas na memória e nas funções executivas.
A ocorrência de convulsões verifica-se em cerca de 30% dos indivíduos portadores destas
mutações [6]. A penetrância da doença entre os membros da família também é mais baixa e
variável, pois menos famílias foram relatadas como sendo portadoras de mutações neste gene
e a faixa etária para o aparecimento da doença é muito mais alargada [3,9,14].
Diversos estudos verificaram que mutações ao nível do gene PSEN2 podem estar
associadas a outras patologias, nomeadamente à DA esporádica, assim como à demência
frontotemporal, demência com corpos de Lewy e doença de Parkinson, o que sugere que fatores
ambientais podem ser significativos para o desenvolvimento da doença [27].
Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].
Azul: domínios citoplasmáticos; Amarelo: domínios transmembranares; Vermelho: domínios luminais; Verde: domínio
intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: mutações patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:
mutações com patogenicidade pouco clara; Cinza: mutações não patogénicas. •: 2 aspartatos (D) localizada nos domínios
transmembranares (TM) VI (D263) e VII (D366); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de cada domínio
topológico.
Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da DA
(Adaptado de [50]).Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].
Azul: domínios citoplasmáticos; Amarelo: domínios transmembranares; Vermelho: domínios luminais; Verde: domínio
intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: mutações patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:
mutações com patogenicidade pouco clara; Cinza: mutações não patogénicas. •: 2 aspartatos (D) localizada nos domínios
transmembranares (TM) VI (D263) e VII (D366); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de cada domínio
topológico.
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2.3. Apolipoproteína E
Em 1991, Pericak-Vance et al. identificaram uma ligação genética entre a DA e uma
região do cromossoma 19 que alberga o gene codificante da apolipoproteína E (ApoE).
Posteriormente, diversos investigadores verificaram que polimorfismos dentro do gene APOE
estavam fortemente associados à doença [9].
O gene APOE, localizado no cromossoma 19q13.2, é um dos maiores fatores de risco
genético associado à DA de início tardio. Esta lipoproteína é a principal transportadora de
colesterol no cérebro, estando também envolvida em diversos outros mecanismos,
nomeadamente, controle da inflamação, metabolismo do colesterol, função sináptica,
neurogénese, depuração, agregação e deposição do péptido Aβ [1], regulação imunológica e
sinalização intracelular [9].
Existem três alelos comuns no gene APOE denominados ε2, ε3 e ε4, e que codificam as
isoformas da proteína. Os polimorfismos situados no exão 4 [19] mostram a associação existente
entre esses três alelos [9]. O alelo ε2 codifica para uma cisteína tanto na posição 112 como na
posição 158, o alelo ε3 codifica uma cisteína na posição 112 e para uma arginina na posição
158, enquanto o alelo ε4 codifica uma arginina, tanto na posição 112 como na 158 [9].
A variante codificada pelo alelo ε2 está associado a uma diminuição do risco da DA,
tendo sido demonstrado o seu efeito protetor [3], pois apresenta uma grande afinidade para o
péptido Aβ, sendo eficiente na sua remoção a partir do meio extracelular [1]. Em contrapartida,
a variante ε4 é a forma de alto risco para a doença, possuindo uma menor afinidade para o
péptido Aβ e portanto sendo menos eficiente na sua remoção do meio extracelular, podendo
mesmo inibir a sua depuração. O alelo ε3 é o que codifica a variante mais comum no ser humano
e é considerado um alelo neutro [1]. A nível populacional, indivíduos que possuem o alelo ε4 da
ApoE desenvolvem DA muito mais cedo do que aqueles que possuem o alelo ε2 [9,19],
observando-se também níveis aumentados da proteína tau [1].
A presença do alelo ε4 da ApoE em heterozigotia aumenta o risco de DA de início
precoce apenas em indivíduos com história familiar; em contrapartida, a presença deste alelo
em homozigotia é suficiente para aumentar significativamente o risco da doença
independentemente de outros fatores genéticos [3].
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249
O mecanismo subjacente entre o genótipo ApoE ε4 e a DA é complexo [1]. O alelo ε4
da ApoE não tem um efeito direto na doença, contudo parece modificar a expressão de outros
fatores genéticos que contribuem para a doença [3].
2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1
O recetor ligado a sortilina 1 (SORL 1), codificado pelo gene SORL1 localizado no
cromossoma 11q23.2-q24.2 [1], é uma proteína transmembranar [15] que se encontra altamente
expressa no cérebro [29], estando associada à sinalização intracelular e possui uma atividade
semelhante à chaperone [1,9,15]. Também atua como recetor da ApoE, participando no
metabolismo lipídico, e interage com a proteína tau. No entanto, o seu papel principal prende-
se com o processamento e transporte da proteína APP, impedindo o seu processamento
amiloidogénico [20].
Atualmente existem várias hipóteses que tentam elucidar a relação entre as vias de
processamento da proteína APP e o SORL1; contudo, todo este processo ainda está longe de
estar completamente esclarecido [20], embora existam evidências de que a SORL1 exerce um
papel protetor na DA [15]. Diversos investigadores têm observado níveis diminuídos de SORL1
no LCR de indivíduos com a doença, os quais se correlacionam positivamente com a
acumulação do péptido Aβ [1].
Existe uma forte evidência de que o gene SORL1 está implicado no risco DA [9], tanto
familiar como esporádica, podendo levar à doença pela alteração de qualquer uma das vias
acima mencionadas [20].
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3. Em Portugal
Segundo o Instituto Nacional de Estatística, os dados mais recentes existentes em
Portugal sobre a DA são de 2015. Nesse ano observaram-se 1 753 mortes por DA, atingindo
principalmente as mulheres (66%). Para idades inferiores a 55 anos, não se registaram mortes
por esta causa [30].
As mortes provocadas por DA representaram 1,6% da mortalidade no país, observando-
se um maior número de óbitos na Área Metropolitana de Lisboa (29.2%), enquanto na Região
Autónoma dos Açores e Alentejo Litoral se registaram as menores percentagens, 1.3% e 0.7%,
respetivamente [30].
A taxa bruta de mortalidade pela DA, nesse mesmo ano, foi de 16.9 óbitos por 100 000
habitantes. A taxa de mortalidade padronizada para as idades de 65 e mais anos foi de 63.4
óbitos, e de 0.3 para idades inferiores a 65 anos. A idade média de morte foi de 83.7 anos (82.8
para os homens e 84.2 para as mulheres) (Tabela 1) [30].
Tabela 1. Indicadores de mortalidade pela DA em Portugal no ano 2015 (Adaptado de
[30]).
Indicadores de Mortalidade Total Sexo
Masculino
Sexo
Feminino
Idade (anos) média de morte 83.7 82.8 84.2
Proporção de óbitos (% em relação ao total de
óbitos por DA para o total)
1.6 1.1 2.1
Taxa total de mortalidade padronizada por 100000
habitantes
7.2 6.4 7.8
Taxa total de mortalidade padronizada com menos
de 65 anos por 100000 habitantes
0.3 0.3 0.3
Taxa total de mortalidade padronizada com 65
anos e mais anos por 100000 habitantes
63.4 55.8 68.3
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251
4. Diagnóstico
Um diagnóstico preciso é o pré-requisito para a terapia ideal [31]. Os critérios publicados
em 1984, pelo Instituto Nacional de Neurologia e Distúrbios Comunicativos e Acidentes
Vasculares Cerebrais e a Associação de DA e Distúrbios Relacionados (NINCDS-ADRDA, do
inglês National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the
Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association), têm sido bastante bem-sucedidos e
foram utilizados por mais de 27 anos apresentando uma sensibilidade e especificidade de 81%
e 70%, respetivamente [32]. No entanto, quando estes critérios foram enunciados, acreditava-se
que os sintomas clínicos tinham sempre uma correspondência estreita com a patologia
subjacente, de modo que apenas os indivíduos que apresentavam demência tinham
desenvolvido DA, não entrando em linha de conta com o facto dos défices cognitivos evoluírem
gradualmente e de a demência representar o estádio final da doença, podendo surgir ao fim de
muitos anos. Atualmente é sabido que essa correspondência clínico-patológica nem sempre é
consistente, podendo mesmo apresentar manifestações atípicas [33].
Em 2009, o Instituto Nacional de Envelhecimento (INE) e a Associação de Alzheimer
(AA, antigo NINCDS-ADRDA) propuseram uma revisão dos critérios da DA [33] incorporando
inovações no diagnóstico, com grandes avanços na avaliação neuropsicológica, na
neuroimagem e compreensão patológica, bioquímica e genética desta doença [47].
A demência, nomeadamente a demência secundária à fisiopatologia da DA, é
diagnosticada quando existem sintomas cognitivos ou comportamentais (neuropsiquiátricos)
que interfiram com a capacidade de funcionamento no trabalho, nas atividades habituais, ou
quando há um declínio dos níveis anteriores de funcionamento e desempenho, que não seja
explicado pelo delírio ou transtorno psiquiátrico maior [32].
Para ser considerada a existência de comprometimento cognitivo ou comportamental,
tem de se verificar pelo menos dois dos seguintes itens [32]:
Alteração da capacidade de adquirir e lembrar-se de novas informações -
perguntas ou conversas repetitivas, esquecer eventos ou compromissos, perder-se em
rotas familiares;
Alteração do raciocínio e da capacidade de executar tarefas complexas - má
compreensão dos riscos de segurança, incapacidade de gerir finanças, má capacidade
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252 Leticia de Bastos
de tomada de decisão, incapacidade de planear atividades complexas ou atividades
sequenciais;
Alteração das capacidades visuoespaciais - incapacidade de reconhecer rostos
ou objetos comuns, incapacidade de fazer coisas simples ou orientar a roupa para usar;
Alteração das funções de linguísticas - dificuldades na fala, leitura e escrita;
Alterações de personalidade ou comportamento - flutuações de humor pouco
características, agitação, apatia, perda de movimentação, retirada social, perda de
interesse por atividades anteriores, comportamentos obsessivos ou compulsivos,
comportamentos socialmente inaceitáveis.
A diferenciação entre demência e comprometimento cognitivo ligeiro (MCI, do inglês
Mild Cognitive Impairment) só pode ser feita por um clínico qualificado, com base nas
circunstâncias individuais do doente e na descrição das tarefas diárias fornecidas pelo doente
ou informante [32].
Para a classificação da DA é proposta a seguinte terminologia: DA provável, DA
possível, DA provável ou possível com evidência do processo fisiopatológico da doença. As
duas primeiras são destinadas ao uso clínico, enquanto a terceira está atualmente destinada para
fins de pesquisa [32].
A DA provável é diagnosticada quando o doente atende aos critérios de demência
descritos anteriormente, apresentando um início insidioso (podendo levar meses a anos) e
história clara de declínio da função cognitiva, podendo ser amnésica (mais comum) ou não. As
alterações não-anamnésica podem ter uma apresentação visuoespacial, em que os défices mais
proeminentes estão na cognição espacial, incluindo agnosia de objetos, reconhecimento de
rostos e alexia, alterações ao nível da linguagem, ou disfunção executiva. Em qualquer uma das
situações, défices noutros domínios podem estar também presentes [32].
A doença é diagnosticada com maior grau de certeza quando acompanhada de mutação
nos genes APP, PSEN1 ou PSEN2 e quando o declínio cognitivo é documentado com avaliações
subsequentes baseadas em informações de familiares e testes cognitivos, no contexto da
avaliação neuropsicológica formal ou exames de estado mental padronizados [32].
O seu diagnóstico não pode ser aplicado quando há evidência de doença cerebrovascular
concomitante, definida pela história de acidente vascular cerebral (AVC) associado
temporariamente ao início ou agravamento do comprometimento cognitivo, presença de
IX Mestrado em Análises Clínicas
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Leticia de Bastos
253
enfartes múltiplos ou extensos, Demência de Corpos de Lewy, Demência Frontotemporal,
afasia progressiva primária, outra doença neurológica ativa, co-morbidade médica não
neurológica ou uso de medicação que possa ter um efeito substancial na cognição [32].
Um diagnóstico de DA possível deve ser feito caso se verifique qualquer das
circunstâncias mencionadas anteriormente, podendo apresentar um decurso atípico, em termos
da natureza dos défices cognitivos para demência da DA. Contudo, verifica-se um
comprometimento cognitivo de inicio súbito, detalhes históricos insuficientes ou documentação
cognitiva objetiva de declínio progressivo. Pode ainda apresentar uma etiologia mista, isto é,
embora se observem os critérios clínicos fundamentais para a DA, também existe evidência de
doença cerebrovascular concomitante [32].
O diagnóstico da DA é feito através da combinação da história clínica do doente, exames
neuropsicológicos, testes cognitivos, neuroimagem estrutural e estudos laboratoriais [32], sendo
essencialmente um diagnóstico de exclusão, permitindo excluir outras causas de demência [35].
O acompanhamento longitudinal também pode ajudar a confirmar o decurso típico de DA [35].
Um diagnóstico definitivo da DA ainda só pode ser feito por neuropatologia, sendo
considerado o gold-standard e baseia-se na deteção post-mortem de lesões patológicas
específicas: placas Aβ no espaço extracelular e vasos sanguíneos, emaranhados neurofibrilares
intracelulares, perda neuronal e sináptica em regiões específicas do cérebro [35,36].
4.1. História Clínica do Doente
A história clínica deve focar-se na doença e na sua relação com eventos
cerebrovasculares concomitantes e outros possíveis fatores de risco de demência, tais como
abuso de álcool, insuficiência renal, hipertensão, diabetes mellitus, tabagismo, antecedentes
familiares de AVC, obesidade e dislipidémia [31,34]. A história familiar de demência,
traumatismos cranianos repetitivos, assim como fatores protetores, como o alto nível de
escolaridade, também devem ser determinados (Tabela 2) [31].
IX Mestrado em Análises Clínicas
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254 Leticia de Bastos
Tabela 2. Fatores que influenciam o risco da DA (Adaptado de [34]).
Antecedentes Efeito na
doença Possível mecanismo
Doença cardiovascular Aumenta Destruição do parênquima e aumento da deposição
do péptido Aβ.
Tabagismo Aumenta Efeitos cerebrovasculares e stress oxidativo.
Hipertensão Aumenta Doença microvascular.
Diabetes mellitus Aumenta Efeitos cerebrovasculares e a insulina e péptido Aβ
competem pela depuração.
Obesidade Aumenta Aumenta o risco de diabetes mellitus.
Lesão traumática na
cabeça
Aumenta Aumento da deposição do péptido Aβ e de proteínas
percursoras amilóides.
Educação Diminui Fornece reserva cognitiva.
Atividades de lazer Diminui Melhora o metabolismo lipídico e estimula a mente.
Dieta mediterrânica Diminui Antioxidante e anti-inflamatória.
Atividade física Diminui Promove a vascularização cerebral.
O clínico também deve prestar atenção aos potenciais sinais de AVC, incluindo
hiperreflexia, reflexo de Babinski, apraxia frontal e paralisia pseudobulbar, pois a doença
cerebrovascular isquémica de pequenos vasos com presença de placas senis e emaranhados
neurofibrilares aumenta o risco de demência em 20 vezes [31].
A maioria dos doentes com doença neuropatológica possui outras patologias, sendo que
apenas uma pequena percentagem apresenta exclusivamente patologia associada à DA [38].
4.2. Entrevista a Informante Informado
A história vinda de um informante informado, podendo ser ou não um membro da
família, é obrigatória na ausência do doente, pois relatos de "comportamentos embaraçosos" ou
deficiências funcionais muitas vezes só serão mencionadas nestas circunstâncias. O
comprometimento funcional deve ser avaliado questionando o informante sobre o desempenho
independente do utente nas suas atividades diárias, como alimentação e higiene. Na demência
IX Mestrado em Análises Clínicas
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Leticia de Bastos
255
precoce, o comprometimento funcional é mais provável que surja em funções mais
diferenciadas, como na gestão financeira, utilização de transportes públicos, direcionamento da
atenção normal para passatempos e aprendizagem do uso de novas máquinas ou aparelhos [31].
4.3. Testes Cognitivos Breves
Os testes cognitivos breves são necessários para auxiliar na confirmação de uma
suspeita de demência e apresentam uma boa correlação com a doença [39]. No entanto, todos
eles têm menor sensibilidade e especificidade do que a avaliação neuropsicológica completa,
mas têm a vantagem de serem muito mais rápidos (5-30minutos) e acessíveis, do que os testes
mais especializados. Consoante o resultado do teste, é dada uma pontuação que será útil para
avaliar o estado de demência [31].
Existem muitos outros testes que permitem avaliar múltiplos domínios cognitivos,
alguns estão representados na Tabela 3 [31].
Tabela 3. Testes Cognitivos Breves, aplicação e respetiva sensibilidade e especificidade
(Adaptado de [39]).
Breves Testes Cognitivos Doença Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
Addenbrooke’s Cognitive Examination
Revised Demência 84 100
Mini-Cog Demência 76 89
Memory impairment screen DA 80 96
Cognitive Assessment Screening Test Demência 88 100
Mini-Mental State Examination Demência 87 82
Addenbrooke’s Cognitive Examination DA 93 100
Brief Alzheimer Screen DA 96 98
Abbreviated Mental Test Demência 91 75
Seven Minute Screen Test DA 92 96
Short Test of Mental Status Demência 86 92
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256 Leticia de Bastos
De uma avaliação para outra, a pontuação obtida pode variar. As barreiras linguísticas,
a idade avançada e a baixa escolaridade também podem confundir os resultados e fornecer
pontuações falsamente positivas [31].
4.4. Investigação Laboratorial
Os testes laboratoriais são necessários para descartar causas de demência tratáveis [35].
Para tal, devem ser realizados testes que permitam excluir causas de encefalopatia metabólica
crónica, anemia, défices de vitamina B12 e ácido fólico, insuficiência renal, hipotiróidismo,
hiponatrémia, hipercalcémia e diabetes. Com base na história clínica do indivíduo, outros
exames laboratoriais podem ser selecionados [31].
4.5. Testes Neuropsicológicos
O teste neuropsicológico fornece uma avaliação detalhada e padronizada numa ampla
gama de domínios cognitivos [32], ajudando a obter sinais objetivos de distúrbios da memória
[35], permitindo a distinção entre MCI e alterações cognitivas subjetivas [40]. O teste
neuropsicológico tem maior sensibilidade e especificidade do que os testes cognitivos breves.
Há evidências de que os testes neuropsicológicos podem contribuir para determinar a
probabilidade de futuras demências nos grupos de risco, tendo ainda utilidade na distinção entre
diferentes tipos de demência [31]. No entanto são mais caros e demorados (2-4h) [31], só devendo
ser realizados quando as avaliações anteriores não fornecerem um diagnóstico preciso [32].
4.6. Testes Genéticos
A presença de mutações genéticas APP, PSEN1 e 2 está na base da fisiopatologia da DA
familiar, levando à produção de péptido Aβ42. Na DA esporádica o principal fator de risco é o
alelo ε4 do gene APOE que está envolvido na diminuição da depuração do péptido Aβ [33].
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257
No entanto, os testes genéticos não podem ser utilizados no diagnóstico definitivo da
DA, pois os valores preditivos positivos e negativos são baixos [31].
4.7. Neuroimagem
A neuroimagem, obtida por Tomografia Computadorizada (TC) e Ressonância
Magnética (RM), ajuda no diagnóstico da DA, excluindo outras causas de demência, como
tumor cerebral, hematoma subdural, doença cerebrovascular, como enfartes cerebrais e lesões
de substância branca [35], e identificam atrofia cerebral pela observação de ventrículos
aumentados e sulcos corticais. No entanto, a sobreposição com o envelhecimento normal e
outras formas de demências limitam seu valor no diagnóstico [38].
Na RM funcional, as anomalias podem ser observadas numa fase pré-clínica da DA,
sendo considerado por alguns autores o primeiro biomarcador a manifestar alterações [41].
Também podem ser realizadas técnicas de imagem molecular, como a Tomografia de
Emissão de Positrões (PET, do inglês Posítron Emission Tomography) e a Tomografia
Computadorizada por Emissão de Fotões Únicos (SPECT, do inglês Single-Photon Emission
Computed Tomography) [38].
A imagem cerebral é uma ferramenta promissora para a deteção precoce da DA,
particularmente graças à sua capacidade de caracterizar a sucessão temporal do envolvimento
anatómico, juntamente com a progressão da doença. Durante anos, a PET foi o único método
utilizado para medir efeitos funcionais indiretos da neurodegeneração da DA [35], recorrendo ao
2-[18F] fluoro-2-Deoxy-D-glucose (FDG), um análogo da glucose, para avaliar a taxa de
metabolismo da glucose, refletindo a atividade neuronal [38]. Atualmente, estão disponíveis
diversos biomarcadores para a PET-amilóide, permitindo visualizar o processo fisiopatológico
da doença in vivo, ao ligar-se às formas fibrilares de Aβ, sendo os mais conhecidos o N-metil-
[11C] 2- (4'-metilaminofenil) -6-hidroxibenzotiazole, também conhecido como composto-B de
Pittsburgh (PIB), 4-N-[11C-metil] amino -4'-hidroxistilbeno (SB13), 2-(1-96-(2-18F-fluoroetil)
(metil) amino) -2-naftil) etildeno) malono nitrilo (FDDNP) e mais recentemente o trans-4- (N-
metil-amino) -4'- {2- [2- (2- [18F] fluoroetoxi) -etoxi] -etoxi} -stilbeno (BAY94-9172) [35]. A
PET-amilóide apresenta alta especificidade para a patologia da DA [35], permitindo avaliar a
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258 Leticia de Bastos
densidade das placas neurítica, observando-se uma retenção anómala nos indivíduos com DA
[33].
Na PET-FDG, a DA caracteriza-se por um padrão regional específico com redução do
metabolismo da glucose nas áreas parietotemporais, córtex cingulado posterior e no lobo
temporal médio [38], existindo uma relação entre a extensão das áreas atingidas e a gravidade do
comprometimento cognitivo. Este padrão de hipometabolismo encontra-se em mais de 85% dos
casos de DA confirmados patologicamente [35]. Esta técnica apresenta uma alta sensibilidade
(cerca de 90%) para o diagnóstico precoce, apresentando, no entanto, uma baixa especificidade
71-73% [38]. O aumento da especificidade pode ser conseguido através da combinação com a
PET-amilóides [35].
Relativamente à PET-amilóide, o biomarcador PIB é o mais amplamente utilizado e
melhor caracterizado em termos cinéticos e analíticos. Vários estudos demonstraram que
indivíduos com DA apresentavam uma retenção significativa de PIB ao nível do córtex frontal,
parietotemporal, córtex cingulado posterior, lobos occipitais e tálamo, consistente com o padrão
de deposição de placas Aβ observadas post-mortem. Apesar de fornecer informações espaciais
sobre a localização do péptido Aβ no cérebro, um resultado positivo não é suficiente para o
diagnóstico da doença [33,38], pois uma retenção significativa do PIB é encontrada em mais de
90% dos doentes diagnosticados com DA, mas também em cerca de 60% dos MCI e até 50%
em indivíduos idosos, podendo ser também observada noutros distúrbios neurodegenerativos
[35]. O recurso a esta técnica parece ser adequado para excluir a DA na presença de uma retenção
negativa do PIB [35].
A PET-PIB apresenta uma correlação mais fraca com os sintomas clínicos, quando
comparada com a PET-FDG, o que pode ser justificado pelo facto do PIB não ser específico
para placas Aβ densas. Segundo um estudo publicado, o PIB liga-se a uma família de substratos
amilóides variando de placas difusas a placas no sistema vascular [35].
Em portadores de mutações genéticas autossómicas dominantes associadas à DA
familiar, num estado pré-sintomático, a PET-FDG apresentam um padrão típico de
hipometabolismo e as anomalias foram observadas até 13 anos antes do início dos sintomas em
portadores de mutação APP e PSEN2. Com o PET-PIB, observou-se uma maior carga de
péptido Aβ em indivíduos portadores de mutações PSEN1 e APP em relação aos controles [35].
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259
Atualmente, embora nenhuma destas tecnologias seja recomendada para o diagnóstico
de rotina da DA, podem auxiliar no diagnóstico precoce [31] e ajudar a melhorar a sensibilidade
e a especificidade na discriminação de outras demências neurodegenerativas primárias [35].
Estudos adicionais de validação são necessários antes que a PET possa entrar na prática clínica,
bem como a determinação do seu valor preditivo e o estabelecimento das limitações e vantagens
de ambos os biomarcadores para o diagnóstico precoce da DA [35].
4.8. Outros Biomarcadores
Atualmente, os biomarcadores encontram-se divididos em duas grandes categorias:
podendo ser de acumulação do péptido Aβ, mais dinâmicos antes do aparecimento dos
sintomas, cerca de 10 a 20 anos antes, ou de degeneração neuronal/lesão, mais dinâmicos pouco
antes do aparecimento dos sintomas clínicos, estando a sua progressão intimamente relacionada
com o agravamento dos biomarcadores neurodegenerativos [33].
Os biomarcadores mais amplamente estudados incluem a determinação do péptido Aβ
e da proteína tau no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a PET-PIB. A PET-FDG é considerada
como um biomarcador da disfunção sináptica (geralmente observada na fase sintomática da
DA) [42].
O doseamento do péptido Aβ42 no LCR constitui um biomarcador sensível da
deposição do péptido Aβ no cérebro, encontrando-se os seus níveis geralmente diminuídos em
indivíduos com DA, não se correlacionando com a duração ou gravidade da doença. No entanto,
esta diminuição também foi relatada noutras doenças neurodegenerativas e pouco se sabe sobre
a sua depuração no envelhecimento normal. Um estudo comparou o doseamento do péptido
Aβ42 no LCR com a neuroimagem obtida por PET-PIB e verificou uma forte correlação entre
os resultados obtidos [42].
Relativamente aos biomarcadores de degeneração/lesão neuronal, verifica-se o aumento
dos níveis das proteínas tau total e p-tau, no LCR [33]. Contudo, este aumento não se verifica
apenas na DA, mas também noutras doenças neurodegenerativas [42]. A proteína p-tau apresenta
maior especificidade para DA [32], pelo facto de existirem vários epitopos fosforilados que
podem ser eficazes no diagnóstico diferencial [42].
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260 Leticia de Bastos
A diminuição dos níveis do péptido Aβ42 e níveis aumentados de proteína p-tau são
atualmente os biomarcadores químicos mais precisos e reprodutíveis para a DA de início
precoce [31,36]. As proporções da proteína tau/Aβ42 e p-tau/Aβ42 no LCR em indivíduos com
cognição normal predizem fortemente a progressão para o estado clínico de DA. Um estudo
seguiu durante 3-4 anos indivíduos com proporções elevadas de tau/Aβ42 e 70%
desenvolveram a DA [42].
Em pessoas que atendem aos critérios clínicos centrais para DA provável, a utilização
de biomarcadores pode aumentar o grau de certeza do diagnóstico. Para o diagnóstico de DA
possível em pessoas que atendem critérios clínicos para uma demência não-DA, mas que
apresentam evidência de biomarcadores para o processo fisiopatológico de DA ou que cumprem
os critérios neuropatológicos da doença, não exclui a possibilidade de que uma segunda
condição fisiopatológica também esteja presente [32].
Uma observação sequencial de eventos relacionados com os processos fisiopatológicos
da doença é fundamental para a caraterização da situação clínica do doente, implicando uma
classificação hierárquica dos biomarcadores. São necessários mais estudos para priorizar os
biomarcadores e determinar o seu valor e validade na prática [32].
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261
5. Hipóteses Terapêuticas
A terapêutica está direcionada para a melhoria e alívio dos sintomas, sendo baseada em
inibidores da acetilcolinesterase e antagonistas do glutamato. Tratamentos baseados na
etiologia ainda estão em estudo [43].
5.1. Tratamento Sintomático
5.1.1. Inibidores da Acetilcolinesterase
O aumento da produção do péptido Aβ reduz a eficácia da transmissão colinérgica do
cérebro [43]. Assim, o tratamento efetuado com inibidores da enzima acetilcolinesterase, como
é o caso da Rivastigmina, Donepezil e Galantamina, promove níveis mais elevados de
acetilcolina (neurotransmissor que desempenha um papel crucial na aprendizagem e memória),
ao inibirem a acetilcolinesterase e a butirolcolinesterase (enzimas responsáveis pela hidrólise
da acetilcolina), melhorando a função colinérgica do cérebro [44]. Embora estes fármacos não
exibam diferenças notáveis na sua eficácia clínica, possuem diferentes mecanismos de atuação,
dependendo da especificidade para o alvo proteico [45].
Na maioria dos estudos, as melhoras encontradas são frequentemente subtis e, por vezes,
simplesmente consistem na estabilização temporária, ou num desenvolvimento mais lento da
patologia quando comparado com doentes não tratados [44].
De um modo geral, os inibidores da acetilcolinesterase são bem tolerados e os efeitos
adversos são leves, sendo principalmente gastrointestinais [43,44].
5.1.2. Antagonista do Recetor N-Metil-D-Aspartato
A excitotoxicidade mediada pelo glutamato é conhecida por levar à sobrecarga de
cálcio, disfunção mitocondrial e aumento da produção de oxidantes que levam à apoptose de
neurónios. Esta super-estimulação pode ser bloqueada por antagonistas do recetor do N-Metil-
D-Aspartato (NMDA) [43]. A Memantina possui um mecanismo que permite proteger os
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262 Leticia de Bastos
neurónios da excitotoxicidade causada pela estimulação excessiva do glutamato, bem como da
sobre-ativação direta ou indireta dos recetores NMDA [45], sendo recomendada para o
tratamento da DA moderada a grave; pode ser administrada sozinha ou combinada com um
inibidor da acetilcolinesterase, embora existam poucas alterações significativas favoráveis
resultantes da terapia combinada [43].
A Memantina bloqueia o canal recetor do NMDA na presença de uma estimulação
prolongada de intensidade moderada pelo glutamato (o que se verifica em condições
patológicas); no entanto, na presença concentrações elevadas, mas transitórias, deste
aminoácido (na chegada de um sinal fisiológico), a Memantina dissocia-se do recetor e
prossegue a neurotransmissão. Assim, este fármaco reduz o "ruído de fundo", o que leva a uma
reversão das deficiências de aprendizagem induzidas pela sobre-ativação dos recetores de
NMDA [45].
De acordo com alguns autores, o péptido Aβ também pode estimular os recetores
NMDA, quer como agonista, quer como resultado de interações secundárias com outras
proteínas [45].
Foram relatados efeitos significativos da Memantina em funções cognitivas específicas
de utentes com DA moderada a grave, incluindo linguagem, memória e praxis. Por outro lado,
existe falta de evidências para o tratamento da DA leve a moderada [44].
De um modo geral, a Memantina é bem tolerada e os efeitos colaterais geralmente são
leves e de baixa incidência, sendo a tontura o mais comum [44].
Em estudo encontram-se outros sistemas de neurotransmissores envolvidos na memória
e cognição, que podem ser utilizados para possíveis tratamentos da DA ao melhorar a
neurotransmissão [43].
5.2. Tratamento Baseado na Etiologia
Os ensaios clínicos para novos fármacos para o tratamento do DA enfrentam pelo menos
dois grandes desafios. O primeiro está relacionado com a capacidade destes novos
medicamentos atacarem os processos que estão na base da doença, sendo provavelmente mais
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Leticia de Bastos
263
eficazes em estádios iniciais, e o segundo prende-se com a possibilidade de retardarem o
processo degenerativo [46].
Existem três processos patológicos fundamentais que se pensa estarem envolvidos na
DA e sobre os quais irá incidir a terapêutica: a cascata amilóide, a hiperfosforilação da proteína
tau e a ativação da micróglia com neuroinflamação. Alguns biomarcadores permitem a deteção
e monitorização da terapêutica (Figura 9) [46].
Figura 9. Resumo dos principais alvos dos fármacos na DA e como monitorizar a terapêutica [46].
Os inibidores da β-secretase devem reduzir os níveis das isoformas Aβ no LCR. Os inibidores da γ-secretase reduzem os
péptidos Aβ40 e Aβ42 no LCR e no plasma, aumentando os péptidos Aβ14/15/16 e 37 no LCR. Tanto a imunoterapia Aβ como
os agentes anti-agregação podem ser monitorizados pela determinação dos níveis Aβ40 e Aβ42, no LCR. A degradação dos
péptidos Aβ induzida pela terapêutica pode ser monitorada pelo doseamento dos diferentes péptidos Aβ, no LCR, dependendo
da via proteolítica utilizada para a degradação. O efluxo do péptido Aβ para o sangue pode ser monitorizado pela sua
determinação no LCR e plasma. Os marcadores inflamatórios, tanto no plasma como no LCR, bem como os marcadores da
atividade da microglia podem mudar em resposta à terapêutica direcionada. O tratamento com inibidores da hiperfosforilação
da proteína tau podem ser monitorizados através do doseamento da proteína p-tau no LCR. Efeitos da degeneração axonal
poderiam ser monitorizados com o doseamento da proteína tau total.
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264 Leticia de Bastos
5.2.1. Inibidores das Secretases
Desde o reconhecimento do seu papel central no processamento da proteína APP, as
secretases foram identificadas como um possível alvo para a terapêutica da DA [47]. Os
inibidores das secretases devem prevenir a acumulação do péptido Aβ no cérebro [46].
A regulação da atividade da α-secretase com Gemfibrozil ou com Melatonina, previne
a formação do péptido Aβ, por estimulação do processamento não-amiloidogénico da APP [43].
Inibidores da BACE1 também foram propostos; no entanto, poucos compostos
chegaram a ensaios clínicos. Os mais promissores foram os modelos NCT01739348 (ensaios
clínicos de fase II) e NCT02245737 (ensaios clínicos de fase III) [43].
Houve muitos estudos com inibidores da γ-secretase, no entanto, como induziam muitos
efeitos secundários, nomeadamente alterações gastrointestinais e o aumento do risco de cancro
da pele, pois um dos seus substratos é a proteína Notch [43].
5.2.2. Imunoterapia Aβ
A imunização ativa e passiva tem sido utilizada em ensaios para o tratamento da DA [48]
e para a prevenção da formação de placas senis [43]; no entanto, a imunização ativa tem
apresentado muitos efeitos colaterais [48]. As imunoterapias atualmente utilizadas em ensaios
clínicos foram descritas em detalhes por Goure e seus colaboradores (2014) [48].
As imunoterapias dependem da alta seletividade dos anticorpos para um determinado
antigénio-alvo relacionado com a doença. No entanto, todas as imunoterapias direcionadas
contra o péptido Aβ, que se encontram em desenvolvimento clínico, são baseadas em anticorpos
não seletivos que se ligam a múltiplas espécies do péptido Aβ, reduzindo os seus níveis totais
para baixo do limiar tóxico. No entanto, no caso dos doentes com toxicidade sináptica aguda,
se a terapia com anticorpos anti-Aβ tiver afinidade seletiva para as formas oligoméricas solúveis
poderia proporcionar mais benefícios terapêuticos [49].
Existem diversas terapêuticas relevantes em estudo, com diversos anticorpos
monoclonais viáveis contra o péptido Aβ (Tabela 4) [49].
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Leticia de Bastos
265
Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o
péptido Aβ (Adaptado de [49]).
Anticorpos Aβ Afinidade do
Anticorpo Observações
Solanezumab/
266
Liga-se a formas
monoméricas e
oligoméricas do
péptido Aβ.
Com o tratamento repetido verificaram um
abrandamento do declínio cognitivo em cerca
de 34% dos doentes com DA leve, apoiando a
hipótese que a terapia pode ser mais eficaz
quando aplicada em estágios iniciais da doença
ou antes do aparecimento dos sintomas visíveis
[48].
Bapineuzumab/
3D6
Liga-se de forma não
seletiva mas com
afinidade semelhantes
a monómeros,
oligómeros e formas
fibrilares do péptido
Aβ.
Liga-se as placas de amilóide vascular e placas
Aβ em cérebros de ratos transgênicos com
mutação APP e humanos com DA, removendo-
as.
Ponezumab/
2H6
Liga-se de formas não
seletiva a formas
monoméricas,
oligoméricas e
fibrilares do péptido
Aβ40.
Após a injeção intracraniana de ratos
transgénicos, com 20 meses, na análise
histológica verificaram uma redução
significativa da placa amilóide no hipocampo e
córtex frontal, comparando com os tecidos
controlo.
BAN2401/
mAb158
Liga-se a agregados
de péptido Aβ de
maior peso molecular
com alta afinidade,
incluindo formas
oligoméricas e
fibrilares e ligações de
baixa afinidade com .
Após injeção intracraniana num modelo de
ratos transgénicos com mutação APP
verificaram uma redução significativa na placa
amilóide em 72H. Contudo, noutro estudo
realizado com ratos transgénicos com a mesma
mutação, após 4 meses de injeções semanais
intraperitoneais houve uma redução
significativa de formas protofibrilares de Aβ
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266 Leticia de Bastos
Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o
péptido Aβ (Adaptado de [49]). Continuação.
formas monoméricas. (74%), mas não ocorreu uma redução
significativa dos níveis totais de péptido Aβ no
córtex cerebral ou hipocampo. As diferenças
podem dever-se ao modo de administração.
Gantenerumab
Ligação não seletiva,
com alta afinidade
para formas
oligoméricas e
fibrilares do péptido
Aβ e com um menor
grau de afinidade para
formas monoméricas.
Levou a uma redução significativa, dose-
dependente, das placas amilóides em humanos
com DA.
Um estudo de tratamento de 5 a 6 meses em
ratos transgénicos com doença crónica, levou a
uma redução significativa das pequenas placas
pré-existentes, no entanto, houve um aumento
das placas maiores, o que sugeriu que este
fármaco causa uma redistribuição do péptido
Aβ, desagregando placas menores e menos
maduras.
5.2.3. Inibidores da Agregação do Péptido Aβ
Entre os inibidores da agregação do péptido Aβ que se encontram em ensaios clínicos,
foram utilizados Tramiprosato (ensaios clínicos de fase III), Clioquinol, Scylloinositol (ambos
em ensaios clínicos de fase II) e Epigallocatechin-3-galatte (ensaios clínicos de fase II/III) que,
embora tenham levado à estabilização dos monómeros Aβ, têm demonstrado efeitos colaterais
importantes [43].
5.2.4. Inibidores da Fosforilação da Proteína Tau
A proteína tau é expressa essencialmente ao nível dos neurónios e desempenha um papel
importante na manutenção da estrutura e estabilidade dos microtúbulos, bem como no
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267
transporte intracelular de proteínas motoras. Em condições fisiológicas normais, o equilíbrio
entre a fosforilação e desfosforilação da proteína tau coordena a adesão dos microtúbulos, sendo
que quando hiperfosforilada a capacidade de ligação aos microtúbulos diminui, resultando num
aumento anómalo da proteína tau livre, aumentando a probabilidade de formação de oligómeros
e agregados. A fosforilação da proteína tau é dependente da atividade das proteínas cinases e
fosfatases, sendo que a inibição das cinases e a ativação das fosfatases representam possíveis
alvos terapêuticos para o tratamento da DA [41].
A glicogénio sintase cinase 3 (GSK-3) e a cinase dependente de ciclina 5 (CDK5) foram
considerados os melhores alvos terapêuticos, pois encontram-se envolvidos na fosforilação da
proteína tau, num grande número de locais, e apresentam uma elevada expressão no cérebro
[41].
O Tideglusib, um inibidor irreversível da GSK-3β [43], foi administrado em ratos
transgénicos que co-expressavam mutantes humanos APP e tau, resultando numa diminuição
de fosforilação da proteína tau, bem como na diminuição da deposição de péptido Aβ,
prevenindo a morte celular [41]. No entanto, em ensaios posteriores verificou-se que os
benefícios observados não eram estatisticamente significativos [43].
Embora outras proteínas cinases estejam em estudo, ainda nenhuma entrou em ensaios
clínicos, pois o desenvolvimento de inibidores específicos para as cinases envolvidas na
fosforilação da proteína tau tem sido um desafio. Estas enzimas possuem múltiplos substratos,
e a inibição de outros substratos, que não os desejados, pode causar efeitos colaterais [41].
A desfosforilação da proteína tau é regulada pela fosfoproteína fosfatase 2A (PP2A) que
está envolvida na transdução de múltiplos sinais que mantêm a homeostasia celular; no entanto,
a ativação indiscriminada da PP2A é suscetível de levar a muitos efeitos colaterais indesejáveis.
A desfosforilação da proteína tau induzida pelo selenato de sódio é dependente da PP2A e levou
à redução da fosforilação de proteína tau em ratos reduzindo a insolubilidade bem como os
défices comportamentais, além de evitar a perda neuronal [41].
A Memantina, um antagonista do recetor NMDA, possui a capacidade de atenuar a
fosforilação da proteína tau através da diminuição da atividade da GSK-3β [43] e de melhorar a
função da PP2A, de forma indireta [41]. Tratamentos com este fármaco, durante 1 ano, revelaram
uma diminuição significativa no nível de proteína p-tau no LCR em indivíduos com DA [41].
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268 Leticia de Bastos
5.2.5. Inibidores da Agregação da Proteína Tau
Várias moléculas mostraram ser bons inibidores da agregação da proteína tau. O
Leucometiltionínio (ensaios clínicos de fase III) e o Cloreto de Metiltionínio (ensaio clínico de
fase II) demonstraram reduzir a agregação de proteína tau e reverter défices em modelos de
ratos transgénicos e retardar a progressão da doença em indivíduos com DA. No entanto, os
mecanismos exatos dos efeitos neuroprotetores in vivo ainda não estão completamente
esclarecidos [43].
Outros inibidores promissores da agregação da proteína tau são N-Fenilaminas,
Antraquinonas, Rodaninas, Benzotiazoles e Fenotiazinas [43].
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269
6. No futuro…
Para o diagnóstico precoce da DA é necessária a existência de um método que tenha alta
sensibilidade e especificidade. Recentemente, os micro-RNAs (miRNAs) emergiram como uma
nova classe de elementos reguladores da expressão de genes que desempenha um papel
importante no cérebro, estando envolvidos no desenvolvimento e diferenciação neuronal [50].
Os miRNAs são pequenos RNAs endógenos conservados, não codificantes, que
modulam a expressão de genes ao nível da pós-transcrição [51].
Vários estudos têm demonstrado que uma expressão alterada de miRNAs em indivíduos
com DA pode ser responsável pela expressão de genes relacionados com a doença e
subsequentes manifestações fenotípicas. Um único miRNA pode atingir centenas de genes.
Assim, pequenas alterações na sua expressão podem afetar múltiplas vias de sinalização
envolvidas em diversas funções fisiológicas celulares [50].
Os miRNAs também são considerados potenciais biomarcadores precoces da DA e
miRNAs específicos podem facilitar a distinção e identificação de diferentes processos
neurodegenerativos, bem como a sua monitorização [50]. Os seus níveis podem ser facilmente
detetados por técnicas de biologia molecular, no LCR e no sangue [38], sendo transportados nos
fluídos biológicos em exossomas, lipoproteínas de alta densidade e outras proteínas que os
protegem da degradação [51].
Numerosos estudos foram realizados nos últimos anos que levaram à identificação de
mais de 50 miRNAs, que podem estar associados à DA [38].
Em 2007, Schipper et al. relataram a expressão aumentada de 9 miRNAs no sangue
periférico de indivíduos com DA, ao nível das células mononucleares. Mais tarde, Cogswell et
al. (2008) examinaram LCR post-mortem e verificaram alterações na expressão de 60 miRNAs
em indivíduos com DA comparando com os controlos normais. No entanto, no LCR livre de
células, ante-mortem, a maioria dos miRNAs selecionados foram praticamente indetectáveis,
produzindo resultado altamente variáveis quando comparado com estudos anteriores [50].
Em 2012, Geekiyanage et al. descobriram que o miR-137, o miR-181c, o miR-9 e o
miR-29 apresentavam valores diminuídos no soro de indivíduos com a doença [50]. O miR-29
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encontra-se associado à BACE1 e a diminuição da sua expressão está associada a um aumento
concomitante de enzima e, portanto, a níveis elevados de péptido Aβ [38].
Posteriormente, em 2014, Tan et al. identificaram o miR-342-3p como um potencial
biomarcador sérico com sensibilidade e especificidade de 81,5% e 70,1%, respetivamente; no
entanto, mais estudos serão necessários, bem como a validação desses resultados [50].
Vários outros miRNAs estão associados à DA, podendo estar envolvidos na fosforilação
da proteína tau, diferenciação neuronal, processamento de APP, neuroinflamação e ciclo celular
(Tabela 5) [38].
A potencial desvantagem da deteção destes biomarcadores no LCR é a possível
contaminação da amostra com sangue, devido a punções traumáticas, na medida em que seus
níveis estão fortemente correlacionados com o número de células sanguíneas presentes na
amostra [38].
O estudo dos miRNA também se mostrou útil na terapêutica da DA, sendo mais evidente
nas formas hereditárias do que em distúrbios esporádicos. Em indivíduos com DA, o
silenciamento da via amiloidogénica, recorrendo a pequenos RNA interferentes (iRNAs, do
Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da
DA (Adaptado de [50]).
Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da
DA (Adaptado de [50]).
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271
inglês, interfering RNAs) levou a melhorias fenotípicas. O principal desafio desta terapia é o
fornecimento de iRNAs aos neurónios apropriados e esta questão pode ser superada pelo
desenvolvimento de plasmídeos com expressão melhorada, mas a segurança da sua utilização
a longo prazo permanece incerta. Estudos in vivo usando modelos animais com DA pode
fornecer a respostas a essas questões [38].
Os resultados obtidos por diversos investigadores são promissores e sugerem que os
miRNAs e as tecnologias baseadas em iRNA podem abrir novos caminhos para o tratamento
da DA [38].
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272 Leticia de Bastos
7. Materiais e Métodos
O presente estudo consiste numa revisão da literatura de trabalhos científicos que
estudaram a DA, nomeadamente a forma familiar, bem como a forma de diagnóstico precoce
da doença e possíveis opções terapêuticas existentes e em estudo. A pesquisa de artigos
realizou-se entre janeiro e dezembro de 2017, essencialmente na base de dados da PUBMED.
Como estratégia apenas se procurou artigos com menos de 10 anos, e preferencialmente com
menos de 5 anos, e as palavras chave utilizadas foram: “alzheimer’s disease”; “EOAD” (do
inglês, early onset alzheimer's diseases); “diagnostic alzheimer’s disease”; “criteria for the
diagnosis of alzheimer’s disease”; “treatment alzheimer’s disease”.
Também foi consultado o site do instituto nacional de estatística a fim de se obter dados
relativos à DA em Portugal e no motor de busca Google, na secção das imagens, pesquisou-se
“placa amilóide” para se obter uma ilustração da doença.
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273
8. Discussão e Conclusão
Embora tenham sido feitos progressos na identificação de genes associados à DA, as
causas ainda não são totalmente compreendidas. A DA familiar de início precoce é rara e tem
origem essencialmente em mutações de transmissão autossómica dominante nos genes PSEN1,
PSEN2 e APP, que levam ao aumento do péptido Aβ42 associado à perda de função e morte
neuronal. O principal determinante genético da DA de início tardio foi identificado como sendo
o alelo ε4 da APOE, que aumenta o risco global de desenvolver a doença em 5-20%. Estas
descobertas sustentam a "hipótese da cascata amilóide", em que o processamento incorreto da
proteína APP ou a redução da eficácia da depuração do péptido Aβ42 pelo alelo ε4 da APOE
são os principais eventos responsáveis pelo desencadear da cascata que levam à DA [38]. Apesar
do papel fulcral do péptido Aβ na DA, o processo é multifacetado [3]. À luz dos achados
recentes, o péptido Aβ não é o principal promotor da degeneração neuronal, mas sim os
oligómeros Aβ é que conferem a neurotoxicidade, interrompendo as vias de sinalização nervosa
[35].
O diagnóstico precoce e preciso da DA é crucial para que seja feita uma intervenção
terapêutica precoce e retardar da progressão da doença [51]. Contudo, é complicado pois apenas
alguns doentes apresentam patologia exclusivamente associada à DA [38].
Os biomarcadores começam a ser integrados em critérios diagnósticos para DA, com o
objetivo de se passar de uma abordagem de diagnóstico diferencial de exclusão para um
diagnóstico positivo. Permitindo um diagnóstico mais precoce e preciso do que a avaliação
clínica tradicional, no entanto, o uso de um teste de diagnóstico com desempenho fraco ou
validade insuficiente pode levar a falsos resultados e, portanto, os médicos devem estar
conscientes das implicações clínicas e éticas do uso dos biomarcadores [40]. Embora tenha
havido progressos, ainda não existe um biomarcador ideal [31,36] e a combinação de
biomarcadores apenas tem sido útil para melhorar a precisão do diagnóstico [40]. É muito
importante que os biomarcadores capturem não só a extensão da patologia como os seus efeitos
sobre a função cerebral e, portanto, a cognição [35]. No entanto, estudos adicionais serão
necessários para determinar o valor de cada biomarcador e a sua validade na prática clínica [32].
Quanto à terapia, atualmente está direcionada para a melhoria e alívio dos sintomas; no
entanto, tratamentos baseados na etiologia encontram-se em estudo [43]. A falta de eficácia
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observada nas imunoterapias Aβ não é inesperada, devido à falta de seletividade dos anticorpos
[49]. Alguns autores defendem que terapias direcionadas para a diminuição do péptido Aβ podem
exercer efeitos apenas nos estados iniciais da DA, e que depois do declínio cognitivo surgir,
podem ser necessárias terapêuticas mais direcionadas para a proteína tau, a fim de modificar o
decurso natural da doença [41].
Recentemente, encontraram-se evidências de que os miRNA desempenham um papel
crítico no envelhecimento e desenvolvimento neuronal, estando também associados à
neurodegeneração, e à patogénese da DA, tanto de origem genética como esporádica, sendo
considerados importantes na regulação da expressão génica e por isso poderem vir a ser
considerados possíveis biomarcadores úteis para o diagnóstico precoce da doença, bem como
em tratamentos futuros. No entanto, estudos adicionais deverão ser realizados, pois os
resultados ainda não são consistentes, sendo necessário esclarecer melhor a interação
fisiopatológica dos miRNAs com as proteínas relacionadas com a DA [38,50].
No futuro, estudos de comparação/combinação de biomarcadores e uma validação mais
completa dos resultados com estudos post-mortem serão necessários, bem como a padronização
de biomarcadores antes de serem recomendados para o diagnóstico com um amplo consenso
sobre a sua interpretação. Relativamente ao tratamento baseado na etiologia, mais estudos
deverão ser feitos, nomeadamente acerca dos possíveis efeitos adversos a longo prazo.
IX Mestrado em Análises Clínicas
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Garibotto V, Giannakopoulos P, Gietl A, Hansson O, Herholz K, Jack CR, Nobili
F, Nordberg A, Snyder HM, Kate MT, Varrone A, Albanese E, Becker S, Bossuyt
P, Carillo MC, Cerami C, Dubois B, Gallo V, Giacobini E, Gold G, Hurst S,
IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
280 Leticia de Bastos
Lönneborg A, Lovblad KO, Mattsson N, Molinuevo JL, Monsch AU, Mosimann
U, Padovani A, Picco A, Porteri C, Ratib O, Saint-Aubert L, Scerri C, Scheltens P,
Schott JM, Sonni I, Teipel S, Vineis P, Visser PJ, Yasui Y, Winblad B. Strategic
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IX Mestrado em Análises Clínicas
Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento
Leticia de Bastos
281
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https://doi.org/10.7555/JBR.30.20150131.
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
ANEXOS
Leticia de Bastos
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
2018
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
Leticia de Bastos
283
Anexo I
Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do
Hospital de Cascais.
Equipamento
CQI Parâmetros
controlados Periodicidade
Au
tion
Max,
da A
.
Men
ari
ni
Dia
gn
ost
ics
Nível normal e
patológico
Cor, densidade, pH,
leucócitos, bilirribina,
urobilinogénio, corpos
cetónicos, sangue, nitritos,
glucose e proteínas.
Diariamente, no inicio do
turno da manhã
Dim
ensi
on
® E
XL
TM
wit
h L
M, d
a S
iem
ens
Liquid Assayed
Multiqual
(Níveis 1,2 e 3)
Ferro, ferritina, ureia,
creatinina, ácido úrico,
amílase, lípase,
transaminase, gama-glutamil
transferase, fosfatase
alcalina, bilirrubinas,
glucose, HDL, triglicéridos,
colesterol, ionograma,
proteínas totais, albumina,
desidrogenase láctica,
creatina cinase, fosforo,
magnésio, cálcio e drogas
terapeuticas*
O equipamento da rotina
é controlado 1 vez por
dia pelo tuno da manhã e
apenas nos dias úteis. O
da urgência é controlado
todos os dias, 2 vezes por
dia, no inicio do turno da
manhã e passado 12h.
Cardiac Markers Plus
Control LT
(Níveis 1,2 e 3)
Mioglobina, troponina I,
isoenzima MB da Creatina
Cinase, N-terminal pro-
péptido natriurético cerebral
Liquichek
Immunology Control
(Níveis 1,2 e 3)
PCR e transferrina
Immunoassay Quality
Controls*
(Níveis 1,2 e 3)
Vancomicina e β-HCG Diarriamente,1 vez por
dia pelo turno da manhã.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
284 Leticia de Bastos
Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do
Hospital de Cascais. Continuação.
Urine chemistry
Quality Controls*
(Níveis 1 e 2)
Ionograma, cálcio
Microproteinas, albumina,
ureia, creatinina, magnésio,
fosforo, glucose, ácido úrico
e amílase.
Nos dias uteis, passar
controlos 1 vez por dia
pelo turno da manhã.
Fins de semana e
feriados se houver
pedidos.
LiquichekTM
Spinal Fluid Quality
Control*
(Níveis 1 e 2)
Microproteínas e glucose Apenas quando há
pedido.
LiquichekTM
Ethanol/Ammonia
Control*
(Níveis 1 e 2)
Etanol e amónia Apenas quando há
pedido.
Drogas de abuso
positivas e Drogas de
abuso negativas*
Drogas de abuso Apenas quando há
pedido
*Paramentros apenas doseados no equipamento da urgência.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
Leticia de Bastos
285
Anexo II
Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do
Hospital de Tomar.
Equipamento CQI Parâmetros
controlados Periodicidade
Sysm
ex X
N-
1000
TM
XN CHECKTM
(Níveis 1, 2 e 3)
Hemogramas
Diariamente no início do turno
da manhã
XN CHECKTM BF
(Níveis 1 e 2)
Líquidos biológicos Quanto há pedido
Ali
fax
Tes
t 1
TH
L Latex Test Tube
(Níveis 1, 2 e 3)
VS 1 vez por semana à quinta-
feira
ST
A C
om
pact
Max
®
System Control
(Níveis 1e 2)
TP, aPTT, INR
Diariamente no início do turno
da manhã
Fibrinogénio
Só quando há pedido
Coagulação especial
Controlo TT (Nível 1) +
Nível normal do System
Control
TT
Control LA
(Níveis 1 e 2)
Anticoagulante Lúpico
Liatest Control
(Nível normal e
patológico)
D-Dímeros
Diariamente no início do turno
da manhã
Ark
ray
Ad
am
s A
1c
HA
-81
60, d
a
A. M
enari
ni
Dia
gn
ost
ics 2 níveis de controlo HbA e HbF No inicio do turno:
2ª, 4ª e 6ªf.
Eurotrol
2 níveis
Doseamento de Hb Só quando há pedido
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
286 Leticia de Bastos
Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do
Hospital de Tomar. Continuação.
HYDRASYS,
da Sebia
Hb AFCS
HbA2
Eletroforese das
hemoglobinas Só quando há pedido
VS: velocidade de sedimentação; TP: tempo de protrombina; aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada; TT: tempo de
trombina; Hb: hemoglobina.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
Leticia de Bastos
287
Anexo III
A) Manipulação das estirpes ATCC:
*Só quando não houver culturas de armazenamento.
B) Calendário do CQI da Microbiologia
Tabela 17. Estirpes bacterianas disponíveis manipuladas semanalmente segundo a
ordem estabelecida, e respetivo teste de identificação e TSA executados no equipamento
automático.
Estirpes Bacterianas Cartas Vitek®2
Enterococcus faecalis
ATCC29212
Carta GP
TSA para Enterococcus
Escherichia coli
ATCC25922
Carta GN
TSA para Enterobactérias
Streptococcus pneumoniae
ATCC49619
Carta GP
TSA para S. pneumoniae
TSA para Streptococcus spp.
Staphylococcus aureus
ATCC29213
Carta GP
TSA para Staphylococcus spp.
Pseudomonas aeruginosa
ATCC27853
Carta GN
TSA para Pseudomonas
ATCC: American Type Culture Collection; TSA: teste de suscetibilidade aos antimicrobianos; GP: Gram positivo; GN: Gram
negativo.
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Cultura de
armazenamento
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Estirpe ATCC
nova*
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Passagem da
cultura de
trabalho
Equipamento
Equipamento
Equipamento
Equipamento
Equipamento
Equipamento
Equipamento
Equipamento
1º dia
1º dia
1º dia
1º dia
1º dia
1º dia
1º dia
1º dia
2º dia
2º dia
2º dia
2º dia
2º dia
2º dia
2º dia
2º dia
3º dia
3º dia
3º dia
3º dia
3º dia
3º dia
3º dia
3º dia
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
288 Leticia de Bastos
Anexo IV
A) Planos de Controlo de AEQ em que o Serviço de Patologia Clínca do Hospital
de Cascais participa:
Sociedade Espanhola de Química Clínica (SEQC): Química Clínica para
sangue e urina e drogas na urina;
RIQAS: etanol/amónia, marcadores cardíacos, gases no sangue e
Coagulação;
Asociación Española de Hematología y Hemoterapia: Hematologia;
Programa de Garantia de la Calidad para Laboratórios Clínicos:
Microbiologia;
UKNEQAS: Microbiologia.
B) Planos de Controlo de AEQ em que o Serviço de Patologia Clínca do C.H.M.T
participa:
RIQAS: Coagulação, Hematologia, hemoglobina glicada, Química
Clínica, imunoensaio, gases no sangue, marcadores cardíacos,
etanol/amónia, grupo TORCH, anticorpos EBV, líquido
cefalorraquidiano;
Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA): eletroforese
das proteínas, hemoglobinopatias, morfologias de sangue periférico,
velocidade de sedimentação, reticulócitos, imunologia (proteínas
específicas), urina químicas quantitativa, alergologia, morfologia
parasitária.
UKNEQAS: Microbiologia.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
Leticia de Bastos
289
Anexo V
Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL (Adaptado de [90]).
Método Unidades Valores de alerta dos índices
“H” “I” “L”
Ácido úrico mg/dL 0 0 4ª
Ácido valpróico µg/mL 0 0 0
Albumina g/dL 0 0 5a
ALP U/L 6ª 5 4ª
ALT U/L 6ª 0 4ª
Amónia µg/dL 2b 4ª 3ª,b,c
Amilase U/L 6 0 6ª
AST U/L 3 4 4
CK U/L 3 0 0
CKMB U/L 2b 3b 3b
Cloro mmol/L 6 0 6
Colesterol mg/dL 6 3 5ª
Creatinina mg/dL 0 5 4ª
Bilirrubina direta mg/dL 2b n.a 3
Bilirrubina total mg/dL 0 n.a 4
Digoxina ng/mL 0 0 6ª
Etanol mg/dL 0 0 0
Ferritina ng/dL 0 6 0
Gentamicina µg/mL 0 0 6ª
GGT U/L 5ª 5 3
Glucose mg/dL 5 4 3
HCG mIU/mL 0 6 0
HDL mg/dL 0 0 0
Fenitoína µg/mL 0 0 5ª
Fenobarbital µg/mL 0 0 4
Ferro µg/dL 3 0 0
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
290 Leticia de Bastos
Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL (Adaptado de [90]). Continuação.
Fosforo mg/dL 3 3 4
LDH U/L 2b 6 6ª
Lipase U/L 0 0 0
Magnésio mg/dL 4 5 6
Mioglobina ng/mL 0 6 6
NTP ng/mL 0 6 0
PCR mg/dL 6 5 6
Potássio mmol/L 2b 0 6
Proteínas totais g/dL 5 3 4ª
Sódio mmol/L 6 0 6
Teofilina µg/mL 0 0 6ª
Transferrina mg/dL 0 0 5ª
Triglicéridos mg/dL 5 3 D
Troponina ng/mL 6 5 0
Ureia mg/dL 0 0 4
Vancomicina µg/mL 0 0 3ª
n.a: não aplicado; a: acima deste nível a Siemens não pode determinar interferência real, surgindo a mensagem de relatório de
teste de "reação anormal"; b: resultados demonstraram interferências significativas; c: não determinar a amónia em amostras
com este índice de lipémia; d: devido ao método utilizado e ao teste em si não foi possível determinar a interferência.
IX Mestrado em Análises Clínicas
Anexos
Leticia de Bastos
291
Anexo VI
Figura 36. Representação esquemática da hematopoiese [180].