Marie VASSALLOUniversité Pierre et Marie CurieMaîtrise de biologie des populations et des écosystèmes

~---------'------'---'-------------

MESURE DE LATRAN8MISSIOl'J"DU PALUDISMEADIEEM()

fSENEGXJZJ y•·•····· ·

Sous la direction des DocteursD. FONTENILLE et L. LOCHOUAItN

laboratoire d'entomologie médicale

Antenne ORSTOMInstitut Pasteur de DAKAR

Année universitaire 1995/ 1996

SOMMAIRE

RESUME

1· INTRODUCTION

II - MATERIELS ET METHODES

1 • Zone d'étude2 - Echantillonnage

2-1 Capture sur appât humain2-2 Récolte de la faune résiduelle matinale

3 - Détermination des espèces

3-1 Etude morphologique3-2 Détermination des espèces appartenant au complexe gambiae par la

méthode de la polymerase chain-réaction (PCR) :

3.2.1 Principe de la PCR3.2.2 Application à la détermination des espèces du complexe gambiae3.2.3 Protocole

4 - Recherche des anophèles infestants

4-1 Par dissection des glandes salivaires4-2 Par utilisation de la technique ELISA

4.2.1 Principe4.2.2 Protocole

5 - Détermination des espèces plasmodiales

6 - Recherche de l'origine des Repas de sang

6-1 Principe6-2 Protocole

li - RESULTATS

1 - Faune anophélienne2 - Bioécologie

2-1 Variation horaire de l'agressivité et taux moyen d' endophagie2-2 Variation hebdomadaire de l'agressivité

3 - Transmission des plasmodies humaines3-1 Indice circumsporozoïtique3-2 Identification spécifique des sporozoïtes3-3 Taux d'i rvoculation

IV DISCUSSION

BIBLIOGRAPHIE

01

02

04

04

07

17

21

22

25

27

29

Résumé

Une étude entomologique longitudinale est réalisée à Dielmo depuis 1990, village situé

en zone de savane soudanienne au Sénégal.

La présente étude porte sur des moustiques capturés pendant la période du 8.04 au

505.96 Les moustiques ont été échantillonnés à partir de captures de nuit sur appâts humains,

et de pulvérisation intra domiciliaire de pyréthrine

L'utilisation de la technique de la polymérase chain réaction (PCR) permet de

déterminer les espèces du complexe gambiae.

La technique ELISA est utilisée pour la recherche des anophèles infestant s, pour la

détermination des espèces plasmodiales dont ils sont vecteurs et pour identifier l'origine du

repas de sang du moustique

Cinq espèces anophéliennes ont été collectées: An. funestus, An. gambiae ss, An.

arabiensis, An. pharoensis. el An. rufipes. An. funestus a constitué 73% des anophèles

capturés

P. falciparum et P. malariae, ont été présents respectivement dans 95% et 5% des

moustiques infestants. Le taux d'inoculation entomologique a été estimé à 1,25 piqûre

infestante par homme et par semaine.

- 1 -

Introduction

Près de 2 milliardsde personnes (34% de la population mondiale) vivent dans des zones

où le paludisme endémique sévit ou réapparaît et on estime à plus de 100 millions le nombre de

cas annuels dans le monde.

La stratégie d'éradication du paludisme définie par l'Organisation Mondiale de la

Santé, de 19"" à 1969 s'avérera inefficace, malgré les moyens considérables employés

utilisation massive de chloroquine et de DDT dirigés respectivement contre le plasmodium et

les anophèles.

L'échec a été marqué notamment par l'apparition des chimiorésistances du Plasmodium

[alciparum à la chloroquine (Gentilini, 1988).

Les espoirs sont maintenant tournés vers la mise au point d'un vaccin antipaludique

Face aux mécanismes d'échappement immologique du plasmodium dus à un polymorphisme

élevé, la mise au point d'un vaccin s'avère laborieuse.

C'est dans cet objectif que, L'Institut Pasteur de DAKAR l'ORSTOM et l'Université

Cheikh Anta Diop de DAKAR. ont lancé un important programme de recherche sur les

relations hôtes-vecteurs parasites et sur les mécanismes de l'immunité protectrice dans le

paludisme. Ce programme a débuté en 1990 dans le village de Dielmo où cette affection est

holoendémique. Dans ce programme, les études entomologiques sont associées à des études

parasitologiques, cliniques et séro-immologiques permettant une analyse approfondie de la

relation entre la transmission et les modalités de l'infection dans les populations exposées

(Konaté, 1994).

Vingt espèces d'anophèles sont actuellement connues du Sénégal Les espèces

distribuées dans l'ensemble du pays sont : An gambiae, An arabiensis, An rufipes et An

ziemanni. Probablement en raison des modifications climatiques, An funestus autrefois

largement réparti est désormais absent de plusieurs régions du nord et du centre du pays.

Seuls, Ail gambiae, Ail arabiensis et An funestus ont une importance épidémiologique dans la

transmission du Paludisme.

- 2 -

Dans ce mémoire, sont exposées:

• Les méthodes entomologiques de captures des anophèles

• Les méthodes de détermination des principales espèces vectorielles par identificationmorphologique et par la technique de la polymerase chain réaction (PCR).

• Les méthodes de détection des anophèles infestants par dissection des glandes salivaires etrecherche de la protéine circumsporozoïtique (CSP) par ELISA.

• Les méthodes de détermination db ..spèces plasmodiales dont ils sont vecteursP. falciparum, P. malariae et, P.ovale, P. vivax étant quasiment absent en Afrique, au suddu Sahara

Les moustiques étudiés pendant le stage et sur lesquels on a effectué ces tests ont été capturés

à Dielmo les 0804,15.04,22.04 et 2904.96.

La technique ELISA repas de sang, utilisée pour déterminer l'origine du repas sanguin chez les

moustiques gorgés est décrite dans ce mémoire. Elle a été pratiquée sur des moustiques de

Dielmo mais capturés avant la période du stage

- 3 -

Matériels et méthodes

1) Zone d'étude

Le village de Dielmo (13° 45' Nord, 16°25' Ouest) est situé en zone de savane soudanienne, à

280 Km au Sud-Est de DAKAR et à une quinzaine de Km de la frontière gambienne (Figure

1)

La particularité de ce village est d'être riverain d'un cours d'eau douce permanente, la Nérna,

qui procure ainsi toute l'année des gîtes larvaires aux anophèles.

Le village est peuplé d'environ 250 habitants, en majorité d'ethnie sérère, 47% de la

population a moins de 15 ans. La population se divise entre le village principal de Dielmo qui

compte 195 habitants pour 20 concessions et le petit hameau de Santhe-Mouride avec

55 habitants pour 9 concessions ( figure 2 ).

71 % des habitations sont de constitution traditionnelle avec des murs en banco (boue séchée)

et toit de chaume, les autres ont un toit en tôle ondulée non jointifs avec le haut des murs

La population active est constituée exclusivement d'agriculteurs sédentaires.

Les animaux domestiques ( boeuf, cheval, chèvre, poule) sont parqués la nuit autour des

habitations ( Konaté, 1994 )

2) Echantillonnage

2-1 Capture sur appât humain

Les captureurs, habitants du village et volontaires, sont disposés dans 4 postes situés à Dielmo­

village, à l'intérieur et à l'extérieur de 2 chambres considérées comme représentatives

Les moustiques sont capturés de 19 heures à 7 heures une fois par semaine Les captureurs se

relayent toutes les heures. Ils sont jambes nues et attendent dans l'obscurité qu'une femelle se

pose dessus, ils allument alors leur lampe torche et enferment le moustique dans un tube à

hémolyse bouché par du coton

- -l -

12°

.... ".... .

13°

MAüRITAJ'JIE

domaine soudano-guinéen~ "

domaine sahélo-soudanien

domaine sahélien

...............................•........................ .... •• + G CINEE .....

1

domaine soudanien............ .... ..+. ....

• + .... " +. .. ........ ••• .... .. ....... .. .... +. .." ..

•••GAMBIÊ ~... ••.. .+ +. .. ~ .............. ........ ..t ......" ••••• .... ..... . ..... ....

ISO

IsohyeteJOOmm

/Dakar

'\Isohyete

l~o600 mm

Figure 1 Plan du Sénégal

~'.r:......•r,

...... ,,."-,J

1QOm

DIELMO

•. :=~-==~--~.> Slnl~~

1...--___________________ "----

Figure 2 Plan du village de Dielmo et du Hameau de Santhe Mouride montrant

la localisation des 29 concessions et de la rivière, la Nema

- 5 -

Les moustiques ainsi récupérés sont placés dans des sacs marqués de la tranche horaire et du

lieu de leur capture. Les moustiques sont placés dans une glacière et ramenés dès le mardi­

matin à DAKAR où s'effectueront la détermination et le dénombrement des espèces.

Les captures sur appâts humains permettent la récolte des anophèles femelles agressives, après

détermination, on pourra établir le taux d'agressivité par espèces.

Les moustiques sont classés par tranche horaire pour déterminer à quelle période de la nuit, les

femelles sont le plus agressives (pic d'agressivité), ces captures s'effectuant à j'intérieur et à

l'extérieur afin de comparer le comportement des femelles exophages et endophages

2-2 Récolte de la faune résiduelle matinale

Des chambres choisies sont soumises le matin à une pulvérisation d'insecticide (pyréthrinoide),

portes et fenêtres fermées afin d'éviter que les moustiques ne s'échappent

Après une dizaine de minutes, les moustiques tombés sur des draps blancs préalablement étalés

dans la pièce sont recueillis avec des pinces souples dans une boîte portant le numéro de la

chambre et de la concession

La détermination morphologique de l'espèce de ces femelles endophiles s'effectue sur le

terrain, puis elles sont classées selon l'état de réplétion de leur abdomen à jeun (abdomen

mince et noir) - gorgé (dilaté et rougeâtre) - semi gravide - gravide (blanchâtre , ovaires

développés). (Figure 3).

L'abdomen des femelles gorgées et serni-gavides est séparé du reste du corps et étalé sur du

papier filtre Whatrnan, pour l'obtention d'un spot de sang.

Le reste du moustique est récupéré dans un tube avec du dessiccateur Spot et tube portent le

même numéro.

Cette technique permet la récolte des femelles endophiles et gorgées de sang. On pourra ainsi

déterminer par la méthode ELISA repas de sang, leur préférence trophique et le taux

d'Anthropophilie pour chaque espèce.

- 6 -

3) Détermination des espèces

3-1 Etude Morphologique

Les moustiques récoltés sur appâts humains sont déterminés, dénombrés et classés suivant

l' heure et le lieu de captures.

Les vecteurs du paludisme appartiennent tous au genre Anophèles de la sous famille des

Anophelinae (famille des cuucidae, ordre des Diptères)

L'identification s'effectue à partir des clefsde détermination de Gillies et de Meillon (1968)

• genre Anophèles: présence d'écailles sur les ailes induisant un "rnouchetage".

• An. funestus : - palpes présentant 3 Bandes blanches de longueur égale- pattes uniformes. (figure 4).

• An.gambiae s.l . . - Les palpes présentent une bande blanche terminale plus longue que lesdeux autres.

- Les pattes ont des anneaux blancs sur toute leur longueur (figure 6 et 7)

• An. pharœnsis : figure 5

• An. rufipes : figure 3

Après détermination, on attribue à chaque moustique un numéro et on le classe suivant l'heure

et le lieu de capture.

Les moustiques sont ensuite placés dans des tubes numérotés contenant un dessicateur et

conservés au congélateur (- 20°)

- 7 -

non gorgé1=r.JJ

gorgé

gravide

Figure 3 • Etat de l'abdomen des Anophèles femelles (d'après: A praticaJ guide for

Malaria entomologist in the African Region, WHO, 1961)

. An. rufipes (Gough),1910

Figure 3' : Aile, patte postérieure et palpe maxillaire de femelle d'An. rufipes

An. [uitestus Cites, 1900

Figure 4 • Aile, patte postérieure et palpe maxillaire de femelle d'an.funestus

An. pharoensis Theobald, 1901

Figure 5 • Aile, patte postérieure et palpe maxillaire de femelle d'AtL pharoensis

- R-

An. gambiae 5.1. Giles, 1902

Figure 6 : Aile, patte postérieure et palpe maxillaire de femelle d'An. gambiae s.L

- 9 -

3-2 Détermination des espèces appartenant au complexe gambiae parla méthode de la polymérase chain réaction (Pf.R)

3.2.1 Principe de la PCR:

C'est une succession de 3 étapes

• dénaturation: l'ADN double brin à amplifier est dénaturé par élévation de la température

(ta ~'Ji doit être supérieure à la tm := tO pour laquelle 50% de l'ADN est dénaturé) On

obtient ainsi des fragments simple brin.

• Hybridation: les amorces s'hybrident à leur séquence complémentaire sur l'ADN cible, lors

du refroidissement.

• L'extension. chaque amorce fixée sur l'un des deux brins va s'étendre à partir de son côté

3' par appariement des bases nudéotidiques. L'appariement s'effectue sous l'action de

l'enzyme ADN polymérase

Ces trois étapes sont répétées 20 à 35 fois selon les quantités d'ADN à amplifier. (figure 8)

3.2.2 Application à la détermination des espèces du complexe gambiae

L'utilisation de la PCR., dans J'identification des espèces de moustiques du complexe gambiae

a été initiée par Paskewitz et Collins en 1990.

Les études du génome chez les diptères et plus précisément chez les moustiques ont montré

que les ADN ribosomaux sont formés d'unités répétées jusqu'à 500 fois rendant ainsi la PCR

très sensible. Ces unités sont séparées par un espace intergénique (IGS) (Beckingharn, 1982)

(figure 9).

Au niveau de ces IGS, existent une partie bien conservée chez toutes les espèces du complexe

et une partie présentant une polymorphisme important interspécifique (Bechingham 1982, Mac

Iain et Collins, 1989)

Une amorce universelle (lJN) s'hybridera sur le site conservé, une autre amorce spécifique

s'hybridera sur le site polymorphique (Scott et al, 1993).

L'extension se fera selon la figure 10.

- 10 -

§l Amorcesru)

___ ~ sens del'extension

,111111111

Séquencesd'ADN àamplifier

Dénaturation ouséparation des brins

d'ADN

/8:

t

ADNnéoformé

t

Hybridationdes amorces

Polymérisation ouextension des amorcespar l'ADN polymérase

1

1

..:.- Dénaturation,hybridation puispolymérisation

--;-1

1

Figure 8 . Schéma du principe de la PCR

- II -

3'

5'

ETS lBS) Il5,SS\

ITSl ITS2

28S lGS

Figure 9 : Organisation générale des gènes des ARN ribosomaux chez les

eukaryores (d'après Kumar et Rai, 1993)

An. gambiae UN 390 nt GA

--~- -.. ~~

An. arabiensis UN 315 nt AR

_-~__.-J --r-t- ~~~\,\j----~=~

~Bloc A .Bloc B ~ Bloc C

Figure 10 : Em placemen t des amorces diagnostiq ues d'A n, gambiae s.S.,

d'An. arabiensis et d'An. melas (d'après Scott et al, 1993)

. 12 -

3.2.3 Protocole

Pour déterminer l'espèce, il n'est pas nécessaire d'effectuer une extraction d'ADN avant de

lancer la PCR :

• Préparer la fiche PCR.

• Mettre une ou deux pattes de chaque moustique dans un tube rnicroarnp de 0,2 ml

• Placer les tubes sur le portoir dans l'ordre déterminé par le plan, ajouter deux tubes

contenant les pattes de témoins positifs. An. arabiensis et An. gambiae s.s et un tube ne

contenant rien qui représentera le témoin négatif.

• Préparer le MIX : - pour chaque tube: - 9,05 ~I d'eau bidistillée - 1,25 ~l de tampon taq ­0,5 ul d'amorce gambiae - 0,5~1 d'amorce arabiensis - 0,5~1 d'amorce melas - 0, 1~1 desolution de dNTP, 0 1 ~I de solution de taq polymérase 500 U. (Cette ADN polymérase quiest issue d'une archébactérie, thermus aquaticus, est thermostable) (ex: pour 30 tubes9,05 ml d'eau distillée x 30, etc.).

• Vortexer le \11X

• Mettre 12,5 ~l de MIX par tube (sans toucher le tube afin d'éviter les contaminations, sinon,changer l'embout).

• Avec une pointe fine, placer les pattes bien au fond du tube dans le MIX (de cette étape,dépend en partie le résultat)

• Mettre le couvercle du portoir et les bouchons des tubes puis sortir le portoir du support etle placer dans l'appareil PCR Perkin ELMER 9600 préalablement allumé.

• Lancer la PCR (Run, programme 20, volume de réaction 13 /JI,) fermer l'appareil: 30 cyclesPCR s'effectueront (figure 11)

• Les produits d'amplification sont révélés par migration sur gel dagarose et marquage aubromure d' éthidium

Préparation du gel d'Agarose

• Pour un gel de trois peignes ( chaque peigne contient 15 où 20 dents qui formeront les puits

de dépôt): ISO ml de TBE 1 X, 2,25 g dagarose, faire bouillir 2'30" au four micro-ondes"

refroidir

- 13 -

• Ajouter 10 ~t de bromure d'éthidium (BET) (pour un peigne: 50 ml de TBE 1 X, 0,75 gd'agarose et 4 ~I de BET)

• Mélanger et verser sur la plaque après y avoir placer les peignes

• Laisser refroidir (1 h 10) puis retirer les peignes

• Sortir la plaque avec le gel et la plonger dans la cuve à migration qui contient du TBE

• Sur un morceau de papier de parafit-r rléposer autant de gouttes de 2 d de bleu de chargeque de puits à utiliser

• Sortir les tubes de l'appareil PCR (où ils étaient conservés à 4 Oc)

• Pour le premier puits; mélanger 1,3 ~I de marqueur de taille (MW) + 10 ~I de TBE 1 X + 2~I de la goutte de bleu de charge; déposer 10 ~I de ce mélange dans le 1cr puits de chaquepeigne

• Pour les puits suivants (correspondants aux moustiques à identifier, aux 2 témoins positifset au témoin négatif), mélanger 10 ~I de la solution du tube avec la goutte de bleu de chargeet distribuer 10 ~1 de ce mélange dans les puits

• Fermer le couvercle de la cuve

• Brancher le générateur 200 mA, 140 volts, temps: 1 h 00)

• Après migration, photographier le gel sous UV (figure 13)

• Si obtention de résultats négatifs, on recommence une PCR mais avec de l'ADNpréalablement extrait avec une résine: chelex : (protocole: figure 12)

- 14 -

PROGRAMMES:Cycles:

Ol Il94° 94°

20 ---> 1-4-2-3 2' 10" 172° 72°

15' 10'

~II. 15" 'Ir

X30

Figure Il : Schéma d'un cycle de peR du programme utilisé dans la détermination des

espèces du complexe gambiae

EXTRACTION PAR CHELEX® 100 D 1ADN

D'ANOPHELES GAMBIAEA PARTIR DES PATTES

Date: 11/01/95, J.J. Lemasson(protocole Chelex® 100: P.Sean Walsh.David A. Metzger and Russell Higuchi)).

- Safe-lock 1.5 ml:

1 ou 2 patteslOOpl de Chelex® 100 à 5%

- 1 heure à 56°C (bain sec)

- vortexer (vitesse lente 4 à 5)

- portoir avec couvercle hermétique: 30' à 95° (étuve)

- vortexer (vitesse lente 4 à 5)

- centrifuger 3' à 13500tr.

- conserver le surnagent à -20 0 e

Figure 12 :

- 15 -

peR perkin Elmer 960 0

Saisi et contrô lé le:

OPERATE UR: . }( ifASYl t.LO .

Origine des moustique s: Dl-d.u..w -)14ly 1~

LL, l r tI ~ kS' -:'> 1.q-1 =t ~ .

Date : Z~ 10 YI 1996

Date cap ture : D -) 12 lo~ / S 6

2 3 4 5 6 7 9 lO 11 12

MIX

CONDITIONS:

l TUBE

EAU 9,o(-iTampo n Taq :- -A J 15""Prim er GA 0 , \"

Prim er A R 0 J 'Î

Pnmer ML --~oJ'; '

Prim er UN - -- 1- 0 );­

dN T P °1 ,)

Taq Pol _'-°1 )

ADN

MgCI2

f igure 13 : Exemple de fiche PCR et résultats (photographie du gel)

- 16 -

4) Recherche des Anophèles infestants

Les anophèles infestants sont ceux qui contiennent des sporozoïtes dans leurs glandes salivaires

4-1 Par dissection des glandes salivaires

On peut rechercher directement les sporozoïtes dans les glandes salivaires de moustiques frais.

Ces glandes sont retirées sous la loupe binoculaire selon la figure 16. Les sporozoïtes sont

visibles sans colora.i,,., par examen microscopique des glandes salivaires dans du sérum

physiologique (figure 17). On ne peut déterminer l'espèce plasmodiale à ce stade

4-2 Par utilisation de la technique ELISA

Le stade sporozoïte se prête très bien à la détection antigénique puisque la protéine de surface,

la circumsporozoïte est la seule présente en quantité suffisante. Cette technique est donc basée

sur la recherche de cette protéine dans la tête et le thorax.

4.2.1 Principe

Le test ELISA CSP est une méthode indirecte pour mettre en évidence la protéine CSP Celle­

ci est prise en "sandwich" entre des anticorps monoclonaux de capture anti-CSP • les anticorps

du "dessus" sont associés à une enzyme, la peroxydase qui, en présence de son substrat,

l'orthotolidine, met en évidence la protéine par une réaction colorée (figure 14)

4.2.2 Protocole

• La tête et le thorax sont séparés du reste du corps et placés pendant au moins 1 heure

dans 20 III de NP 40 (détergent) à 1,25 %, puis broyés dans 2 fois 190 III de tampon

Blocking Buffer (BB), le broyât est conservé à - 200e

• Après avoir préparé la fiche, la plaque ELISA (plaque immulon 2) est sensibilisée avec

une solution d'anticorps monoclonaux (Acm). Cette solution est un mélange de 3

anticorps anti-CSP (P. falciparum, P. malariae et P. ovale, P. vivax n'étant pas présent

et Afrique, au sud du Sahara).

- 17 -

/.}-, substrat peroxydase« orthotolidine »

1------------- Acm conjugué àla peroxydase

CSP

Acrn de captureanti CSP

Puits « polystyrène»

Figure 14 : Principe du test ELISA CSP

T -:88

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figure 15 • Schéma d'une plaque ELISA CSP

- 18 -

5 .

fi c=t'

1. Après avoir immobilise le thorax 011 fait une traction po ur retire r la tête .2 . Les glandes salivaires salit entrainées avec la tête M n! 0 11 les sépare.3.4 .011 sépare les glandes salivaires du. thorax et 0 11 les pluce dans du sérum physiologique.5 .011 place une lamelle sur Ces glandes salivaires pour l'examen ex-temporan é.

Figure 16 Extraction des glandes salivaires des Anophèles

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.- ... ." ...' 1. <, or ~ 4( .\.. a ~\ ' . .. .:. ,'J-, ,),,;..,Figure 17 : Sporozoïtes de plasmodium dans les gla nd es saliv aires d'un moust ique

(cliché OMS)

- 19 -

• pour 1 plaque: - 20 ~l de solution d'Acm de capture P. falciparum + 5 ml de PBS

- 40 ~l de solution d'Acm de capture de P. malariae + 5 ml de PBS

- 20 ~I de solution d' Acm de capture de P. ovale + 5 ml de PBS

• Distribuer 3 X 50 ~l = 150 ~l par puits de cette solution

• Attendre une nuit à température ambiante, les Acm de captures se fixent aux parois du puits

• Après avoir vidé les plaques, on distribue 205 ~I de BB par puits et VII laisse agir pendant

1 heure à température ambiante afin de saturer les sites de fixation des Acm de capture

(pour que seule la protéine CSP se fixe sur les Acm)

• Vider les plaques et mettre 50 fJI de solution du broyât de moustiques par puits, pour les

témoins positifs: 50 ~I de témoin synthétique (peptide), pour les témoins négatifs: 50 ~l de

BB

• Laisser incuber pendant 2 heures à température ambiante

Environ dix minutes avant la fin des deux heures, préparer la solution des Acm conjugués à

la péroxydase (Acm*): pour une plaque: - 12,5 ~1 d'Acm* de Pfdans 15 ml de BB - 12,5

>JI d'Acm* de Pm dans 15 ml de BB - 15 ~I d'Acm* de Po dans 15 ml de BB

• A la fin des deux heures d'incubation avec le broyât de moustiques, vider les plaques et les

laver deux fois au Tween 20

• Distribuer 3 x 50 = 150 ~l par puits de solution d' Acm conjugués

• Laisser une heure à température ambiante

• Vider les plaques et les laver quatre fois au Tween 20

• Distribuer 100 ~l par puits de substrat à la péroxydase (orthotolidine) et au bout de

30 minutes d'incubation à l'obscurité, ajouter 50 ~l par puits d'acide sulfurique 4 N pour

bloquer la réaction.

• Lecture au lecteur ELISA à 450 nm et 620 nm.

- 20 -

• Le seuil de positivité est fixé à deux fois la moyenne de la DO des témoins négatifs.

NP 40 : Nonidet P. 40

Pour une plaque: 25 ~l de 1'-11> 40 + 2 ml de BB, agiter

PBS : 10 pastilles PBS diluées dans un litre d'eau distillée

Tween 20 : 0,5 ml de Tween 20 dans un litre de PBS, agiter

BB : Blocking Buffer : dans un litre de PBS, ajouter: - 5 g de caseïn- 0,1 g de thiomerosal- 0,04 g de Phemol Red-IOgdeBSA

Agiter deux heures

Solution Acm : 0,5 mg d'Acm + 1 rnl de milieu de reconstitution ('/2 volume d'HO + 1/2 Vol

de glycérol)

Substrat de Peroxydase: pour 3 plaques:- 5 mg d'orthotolidine dans 0,25 rnl de N-N dimethyl formarnide- 30 ml de tampon citrate •-4~ld'H202à30%(ou 12j.Jlà 10%)

• Tampon citrate pH4 : - acide citrique, 1 H20, 11,77 g- hydroxyde de sodium, 4,43 g.

Dissoudre la soude dans 200 ml d'eau bidistillée puis l'acide citrique dans cette solution,

ajouter 400 ml d'eau bidistillee. Ajuster le pH à 4 avec de l'acide chlorhydrique IN. Compléter

à liavec de l'eau bidistillée

5) Détermination des espèces plasmodiales

Les moustiques qui sont positifs au test ELISA CSP SCREEN sont retestés par la technique

ELISA monospécifique Cette technique est identique à celle de l'ELISA SCREEN mais

- 21 -

n'utilise qu'un seul type d'anticorps spécifiques à une espèce plasmodiale par puits (50 !JI de

solution d' Acm de capture par puits au lieu de 3 x 50 = 150 !JI).

6) Recherche de l'origine des repas de sang

6-1 Principe

Pour déterminer les préférences trophiques des femelles endophiles, on effectue le test ELISA

repas de sang. L'identification de la nature du repas sanguin est basée sur des caractères

sérologiques du plasma (Recherche d'Immunoglobuline IgG).

Cette technique de Beir et al (1988), légèrement modifiée, permet de déterminer l'origine du

repas sanguin, donc d'établir les préférences trophiques, et ainsi, évaluer l'indice

d'anthropophilie

Elle consiste à faire agir sur le sang absorbé par les femelles, des anticorps spécifiques d'un

certain nombre d'hôtes potentiels (homme, boeuf, mouton, poule, cheval). Ces anticorps sont

marqués par une enzyme, la péroxydase qui, en présence de son substrat (orthotolidine)

révèlera par une coloration, la présence de l'IGg à identifier (Figure 18)

6-2 Protocole

• Découper les spots de sang, les mettre dans 0,8 ml de PBS

• Vortexer et laisser au moins une heure

• Sensibiliser les plaques en distribuant 50 !J\ de la solution à tester par puits, laisser incuber

3 heures à température ambiante où la nuit à + 4 oc. Les témoins positifs sont constitués de

sang dilué au 11 IOOème (l 0 !JI de sang dans 1 ml de PBS)

• Préparer les anticorps spécifiques d'espèces marqués à la péroxydase : une plaque permet

de tester 16 moustiques, il faut distribuer 50 !JI par puits, soit 50 x 16 = 800 (+ 100) = 900

!JI de solution de chaque IGg marqué. Les anticorps conjugués doivent être dilués au :

- 22 -

1I1000ème pour l'homme1/500 ème pour le boeuf11500ème pour le mouton1/2000ème pour la poule112000 ème pour le cheval

soit pour une plaque:

Tampon RS. Anticorps" Sérum

Homme 0,9 ml 0,9 (JI == 1 (JI 0,9 ~l

Boeuf 0,9 ml 1 0 1 0,9 ,,1~ ,

Mouton 0,9 ml 1,8 (JI 0,9 dPoule 0,9 ml 0,45 == 0,5 ,,1 0,9 ~ICheval 0,9 ml 0,45 == 0,5 (JI 0,9 d

Dans chaque tube, ajouter les sérums hétérologues dilués au 1Il OOOéme pour éviter les

réactions croisées.

• Laver deux fois au PBS Tween

• Distribuer 50 ,,1 par puits de solution d'IgG marquées

• Laisser incuber 1 heure à température ambiante

• Vider les plaques, laver quatre fois au PBS Tween

• Distribuer 100 ,,1 de substrat péroxydase par puits

• Laisser incuber 30 minutes à l'obscurité

• Bloquer la réaction par 50 ,,1 d'acide sulfurique 4 N

• Lecture à 450 nm.

Tampon repas de sane;

Pour V2 litre

- 2,5 g de casein dans 50ml de Na OH 0,1 N, faire bouillir jusqu'à totale dissolution- Ajouter 450 ml de PBS- Ajouter 0,025 % Tween 20 (soit 125 ,,1 pour Y2 1)- Ajouter 0,05 g de triomerosal- Ajouter 0,01 g de Phénol Rouge

Substrat peroxydase : c,' EUSA CS? SCREEN

~ 23 -

Rf----~~Substrat peroxydase (orthotol idi ne)

anticorps spécifiques marqués à laperoxydase

Puils---~

(polystyrène)

IGg aidenufier

Figure 18 •Principe du test ELISA repas de sang

o C Cl) cE "- 0

c:J ëii E "- 0 (li

E :l ... > E :l ... c:J >en Cl) :l :l Cl) Cl) :l :l Q)

CIl 0 0 0 0 s: en 0 0 0CIl 0 .s:

a..,..

a: :::E c, J: :::Eu a. co o, U

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figure 19 • Schéma d'une plaque ELISA repas de sang

- 24 -

Résultats

1) Faune anophélienne

Lors des captures de nuits, 469 femelles d'Anophèles ont été récupérées. Il s'agissait de An.

P{mes/us (72,9%), An. arabiensis (20,9%), An. gambiae .'II non déterminées (3,62%), Ali./

pharoensis (0,42%) et An. rufipes ( 0,21 %). e.t 1(...,. 5a.m<h/ac. s.s .(.-1,.9 ï.).

2) Bioécologie

2-1 Variation horaire de l'agressivité et taux endophagie

192Or--------------------------,15f------

S

o21 h 22 h 23 h 24 h

12

1 h 2h 3h 4h Sh

: _ Intérieur

_ extérieur!

6 h Tranche horaire

Variation horaire de l' agressivité d'Ali. gambiae .'II à l'intérieur et à l'extérieur des habitations.

4Or--------~--r.r_----""----__,=_---__,

o ~-'------.>-

_ intérieur

_ extérieur.

21 h 22 h 23 h 24 h 1 h 2h 3h 4h 5h 6 h Tranche horaire

Variation horaire de ['agressivité d'A /1. funestus à l'intérieur et à l'extérieur des habitations

L'agressivité maximale a été observée dans la deuxième partie de la nuit pour Ali. funestus, etdans la tranche horaire 24 h - 2 hOO pour Ali. gambiae sr Le taux d'endophagie moyen d'Ali.funestus et d'An. gambiae est respectivement de 54,26% et 36%

- 25 -

2-2 Variation hebdomadaire de l'agressivité d'An [unestus et An gambiae

PHS (piqûre par homme et par semaine)

120 ,---------------.

100

80

60

40

20

o

ji"An. gambia~,.An. fumestusL -1

Semaine804 15.04 2204 2904

3)Transmission des pJasmodies humaines

Indice circumsporozoïtique

Pendant la période du 8 04 au 5 05 96, le pourcentage de moustiques positifs au test ELISA

CSP est de 4,26 %

Identification spécifique des sporozoïtes

Les moustiques infestés ne portaient qu'une seule espèce plasmodiale ; P. falciparum dans 95

% des cas et 5 % pour P malariae.

Taux d'in .oculation

Pendant la période du 8.04 au 5.05.96, le nombre moyen de piqûre infestante par homme et par

semaine a été de 1,25.

- 26 -

DISCUSSION

Sur les 20 espèces d'anophèles dont la présence est connue au Sénégal, 5 espèces ont

été identifiées à Dielrno pendant la période du 8.04.96 au 50596 ; An. funestus, An. gambiae

S5, An arabiensis, An pharoensis et Ail. rufipes.

An funestus a été le plus présent (73 %)

A Dielmo, alors que le rôle de vecteur majeur du paludisme d'An. gambiae s.l. est

constamment observé au Sénégal, (Vercruysse et Jancloes, 1981 ; Vercruysse et al, 1985 ;

Trape et al, 1992 ; Faye et al, 1993) le maintien d'une petite rivière permanente, malgré un

important déficit pluviométrique, permet à An. [unestus de conserver un rôle essentiel dans la

transmission du paludisme pendant la saison sèche (Konaté et al, 1994)

En effet, les gîtes larvaires de cet anophèle sont constitués par des collections d'eau

permanente (ou semi permanente) en savane comme en forêt, souvent avec une végétation

émergente qui ombrage la surface de l'eau (bord des rivières) alors que ceux des anophèles du

complexe gambiae : An. Arabiensis et An. gambiae 55, sont surtout constitués par des

collections d'eau temporaire liée aux pluies (Diagne et al, 1994).

An pharoensis, vecteur secondaire possible dans certaines régions du Sénégal ou

l'espèce est très abondante, et An. rufipes, strictement zoophile ne jouent aucun rôle dans la

transmission à Dielrno (Konaté et al, 1994) :

L'utilisation de la PCR pour distinguer les espèces du complexe gambiae, permet d'obtenir

rapidement des résultats, An. arabiensis a été trouvé à 79 % et An. gambiae 55 à 7,25 %

(13,75 % n'ont pas été identifiés)

La technique ELISA CSP, dans la recherche des Anophèles infestants, est rapide et

permet de traiter un grand nombre de moustiques à la fois, cependant en comparant les

résultats avec ceux obtenus par dissection des glandes salivaires, il s'est avéré que cette

technique surestimait de 50 % les résultats positifs (Fontenille et al, 1996). ceci est dû à ce que

dans le broyât tète-thorax du moustique, la protéine CSP peut être présente alors Gue les

sporozoïtes n'ont pas encore atteint les glandes salivaires. On obtient alors un résultat positif

pour des moustiques qui ne sont pas encore infestants.

Le taux d'infestation de 4,26 % est donc à revoir à la baisse.

Pendant la période du 8.04 au 5.05.96, le taux d'i noculation était de 1,25 piqûre

infestante par homme et par semaine.

- 27 -

La transmission du paludisme à Dielmo s'effectue donc de façon permanente et reste

élevée pendant la saison sèche

- 28 -

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