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Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedicosede di Rovereto
Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica
Metodi e tecniche di Immunoematologia
Anno accademico 2012‐2013
Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica
Metodologie Diagnostiche di Patologia clinica
Immunoematologia ed emostasiDott.ssa Gina Rossetti
3 CFU
Immunoematologia ed emostasiDott.ssa Gina Rossetti
3 CFU
Metodi e tecniche di ImmunoematologiaTLB Mauro Waldner
2 CFU
Metodi e tecniche di ImmunoematologiaTLB Mauro Waldner
2 CFU
Patologia ClinicaDott. Michele Schinella
1 CFU
Patologia ClinicaDott. Michele Schinella
1 CFU
Mauro Waldner
Laboratorio di immunoematologia
Servizio Trasfusionale Ospedale S.Chiara di Trento
Tel. Segreteria: 0461.903204
Ricevimento: dal LUN al VEN dalle 8:00 alle 16:00
mailto:[email protected]
Timetable
Esame
• Esame scritto Domande a quiz
Interpretazione dei risultati di laboratorio
Cosa impareremo
Tecniche in uso nel Laboratorio di Immunoematologia e nei Servizi Trasfusionali
– Determinazione del gruppo ABO e Rh(D)– Ricerca di anticorpi irregolari antieritrocitari– Identificazione degli anticorpi irregolari– Esecuzione delle prove pretrasfusionali– Test per accertamenti in caso di M.E.A.– Test per accertamenti in caso di M.E.F.N.– Preparazione degli emocomponenti per uso clinico
Background
• Biologia
• Istologia
• Genetica
• Immunologia
• Laboratorio
Attività di laboratorio
• Laboratorio Pratico con TLB Marco Torboli
• Nel Laboratorio di Immunoematologia del SIT di Trento e del CT di Rovereto
Laboratoriopratico
Laboratoriopratico
LezioniteoricheLezioniteoriche
Esperienzanei ServiziEsperienzanei Servizi
Dove studiare
• Slides delle lezioni
• Technical Manual della AABB (15^ edizione)
• Internet
• Manuale delle Metodiche
Non dovete avere paura di…
• Chiedere, se non avete capito.
• Di farvi rispiegare un argomento (anche di un’altra materia)
• Farmi approfondire una cosa che vi sembra interessante per la vostra professione
• Di fermarmi se parlo troppo veloce
Il buon tecnico di laboratorio
• Usa la testa• Sa quello che fa• Sa come lo deve fare• Sa con cosa lavora• Conosce i limiti della metodica
• Applica i protocolli per la sicurezza
Un Servizio… tanti utenti!
• Paziente politraumatizzato• Paziente chirurgico
– CCH, NCH, Chirurgia Generale Maggiore– Ortopedia, Urologia, ecc…
• Paziente ematologico• Paziente talassemico/drepanocitico• Paziente oncologico• Paziente anziano• Paziente prematuro• …
Chi siamo?Chi siamo?
Il Servizio TrasfusionaleIl Servizio Trasfusionale
URUR
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Servizio Trasfusionale e ImmunoematologiaTRENTO
Servizio Trasfusionale e ImmunoematologiaTRENTO
Centro TrasfusionaleROVERETO
Centro TrasfusionaleROVERETO
www.centronazionalesangue.it
Donatore periodicoMedico e I.P. di BdSScreening sierologiciProduzione EmcConservazioneMedico e I.P. repartoLaboratorio di ImmunoematologiaAssegnazione & DistribuzioneMedico e I.P. di repartoPaziente
Da vena.. a vena!
TracciabilitTracciabilitàà di di tutti i processitutti i processi
Incidenti trasfusionali (1)Tutti i punti della catena
sono a rischio
Possono essere fatali
Vanno monitorati
Dall’errore si deve imparare!
Le procedure devono essere
standardizzate e condivise
con TUTTI gli operatori
Incidenti trasfusionali (2)1 errore ogni 16.000 unità trasfuse in UK (Williamson, Cohen, Love, et al.), 2000
Risk of HIV transfusion-associated infection = 1 in 1.000.000
Eventi sentinella
Near-miss
Errori (non segnalati)
Gli emocomponenti disponibiliEmazie senza buffy coat
FiltrateIrradiateLavate
Plasma fresco congelatoda Aferesi (500/550 ml)da Frazionamento (200 ml)
Piastrineda Aferesi (Cito)da Pool di 5/6 donatori
La Banca del Sangue…
La produzione degli Emc
La procedura aferetica
La validazione degli EmcRicerca anticorpi:
Anti-HBVAnti-HCVAnti-HIV
Test sierologici per LUE
Test biologia molecolare (NAT):
HCVHIVHBV
Controllo del gruppo ABO/Rh di tutte le sacche
What is a blood group?
‘An inherited character of the red cellsurface, detected by a specificalloantibody’
“Essential Guide to Blood Groups”, G.Daniels & I.Bromilow
IN
OUT
COOH
NH2COOHNH2
NH2
HOOC
oligosaccaridioligosaccaridi
Proteine one‐pass
Proteine multi‐pass glicoproteine
Antigeni eritrocitari
“Essential Guide to Blood Groups”, G.Daniels & I.Bromilow
Quale linfocita? La selezione clonale
Da linfocita a plasmacellula
Isotipi anticorpali
Plasmacellula
Anticorpi
Photographed celebrating the announcement of the Nobel Prize in Physiology or Medicine Awarded to Jerne, Köhler and Milstein on 15 October 1984
Monoclonal antibodies: the story of a discovery that revolutionized science and medicineSefik S. Alkan Nature Reviews Immunology 4, 153‐156 (February 2004)
Antisieri TipizzantiPoliclonaliPoliclonali
MonoclonaliMonoclonali
Alto peso MolecolareAlbumina
Basso peso MolecolareLISS, PeG
AnticorpoAnticorpo
Mezzopotenziante
Mezzopotenziante
Mezzi conservanti
Mezzi conservanti
Molte cellule B Una cellula B
Tutti gli epitopi di un antigene
Un solo epitopo
Miscela di anticorpi (isotipi)
Singola classe
AnticorpopoliclonaleAnticorpoAnticorpopoliclonalepoliclonale
AnticorpomonoclonaleAnticorpoAnticorpo
monoclonalemonoclonale
SintesiSintesiSintesi
LegameLegameLegame
ClasseClasseClasse
A‐ anti‐D B‐ anti‐E
‘60 ‐ Alexander Wiener nel suo Laboratorio di Brooklyn
Miscela di anticorpi a diversa affinità (alta e bassa)
Disponibilità limitata
Molteplici manipolazioni industriali (diluizioni, assorbimenti, purificazioni, ecc…)
Possibile contaminazione con anticorpi diretti verso antigeni a bassa frequenza
Svantaggi anticorpi policlonali
Specificità verso un singolo epitopo
Indisponibilità per tutti gli antigeni
Sensibilità al cambio di conformazione degli
antigeni
Reattività dipendente da variabili tecniche (pH,
temperatura, ecc…)
Impossibile utilizzo per adsorbimenti
Costi elevati
Svantaggi anticorpi monoclonali
Etichettatura dei reagenti
GMP e CQ
Accreditati CE
Accreditati FDA
Marchiati IVD
‐‐‐‐‐> “only for research”
Antisieri commercialiAntiAnti-- AA BB A,BA,B DD CDECDE CC cc EE ee CCww
Mono/Poly Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Mono Polyumano
Classe AbIgM
BlendIgM
BlendIgM
BlendIgM/IgG
IgM IgM IgM IgM IgM IgM
AntiAnti-- KK kk KpKpaa KpKpbb JsJsaa JsJsbb FyFyaa FyFybb JkJkaa JkJkbb
Mono/Poly Mono Polyumano
Polyumano
Polyumano
Polyumano
Polyumano
Polyumano
Polyumano
Mono Mono
Classe Ab IgM IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgM IgM
AntiAnti-- XgXgaa LeLeaa LeLebb SS ss MM NN PP11 LuLuaa LuLubb
Mono/Poly Polyumano
Mono Mono Polyumano
Polyumano
Polyconiglio
Polyconiglio
Polycapra
Polyumano
Polyumano
Classe Ab IgG IgM IgM IgG IgG IgM IgM IgM IgG IgG
La reazione La reazione aantigenentigene‐‐anticorpoanticorpo
L’agglutinazione
Variabili della reazione Ag‐Ab
Isotipo IgIsotipo Ig AbAb completi, completi, AbAb incompletiincompleti
[[AgAg] [] [AbAb] ] Effetto Effetto prozonaprozona, , postzonapostzona
TemperaturaTemperatura AbAb caldi, caldi, AbAb freddifreddi
TempoTempo Mezzi potenziantiMezzi potenzianti
pHpH PBS, PBS, AbAb acidi (antiacidi (anti‐‐M)M)
[Ag] e [Ab]: effetto prozona
4+
3+
2+
1+
0
Temp. °C
4+
3+
2+
1+
0
Score
L’optimum di temperatura
22 26 28 32 36 40 44 48
Anti‐DAnti‐M
Il tempo: i mezzi potenzianti
Senza mezzipotenzianti
Albumina
LISS
PeG
60 min.
30 min.
10‐15 min.
10‐15 min.
‐‐
Aumento costante dielettrica del mezzo
Diminuzionepotenziale ζ
Allontanamento molecole H2O
Enzimi proteolitici 30 min.
Diminuzione caricheelettriche
Il potenziale ζ
‐‐‐‐‐‐ ‐ ‐ ‐
‐‐‐‐
‐ ‐ ‐ ‐‐‐
++++
++
+ + + ++
+ +
+
+
+
+
++
++
+
‐‐‐‐‐‐ ‐ ‐ ‐
‐‐‐‐
‐ ‐ ‐ ‐‐‐
++++
++
+ + + ++
+ +
+
+
+
+
++
++
+Piano di scivolamento
Na+ Cl‐
Potenziale ζ : ∑ d.d.p. (misurato in milliVolt)
ζ = f × τD× μ
f τ
D μ
costante
costante dielettricadel mezzo
Albumina, destrano, PVP
carica elettrica delleemazie
Enzimi proteoliticiL.I.S.S.
forza ionica del mezzo
L.I.S.S.
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
HOH
Come funziona il PeG: l’acqua
Il pH
pH ottimale: 7,0 ‐ 7,4 (PBS, Fisiologica
tamponata)
Anti‐M: optimum a pH 6,5 (HCl)
Eluizione acida a pH 2 con glicina acida
(Elu‐Kit II Immucor)
Le metodiche Le metodiche per la reazione per la reazione
antigeneantigene‐‐anticorpoanticorpo
Slide test: il vetrino
Ratio sangue intero:anti‐siero = 1:2
Mescolare e aspettare 2‐5 minuti
Leggere e registrare la reazione
!! Le deboli reazioni non sono evidenziate Le deboli reazioni non sono evidenziate !! Si può usare solo con anticorpi completi Si può usare solo con anticorpi completi IgMIgM
Tube test: la provettaRatio RBC 3%:anti‐siero = 1:2
IS o Incubazione per 15‐30’ a T.A.
Centrifugazione: 15’’ alti giri60’’ bassi giri
Lettura e registrazione dei risultati
!! Leggere per emolisi e agglutinazioneLeggere per emolisi e agglutinazione!! Non scuotere troppo: tecnica Non scuotere troppo: tecnica ““tiptip & & rollroll””
!! Usare lente o microscopio per Usare lente o microscopio per reazioni reazioni debolideboli!! Si può usare solo con anticorpi Si può usare solo con anticorpi IgMIgM
Score di reazione in provetta
Microplate 96 pozzetti U
Meno reagenti e materiale biologico
Maggior produttività
Possibilità di automazione (semina e lettura)
Maggior risparmio di tempo ed economico
Sistema Sistema miniaturizzato di miniaturizzato di tante piccole tante piccole provetteprovette
Automatizzazione microplate
Olympus PK 7300
Biotest TANGO
La fase solida: Capture®
LISS(MEZZO POTENZIANTE)
PLASMAO
SIERO
La reazione tra plasma (o siero) e gli stromi La reazione tra plasma (o siero) e gli stromi adesiadesi in fase solida in fase solida èèevidenziata da evidenziata da antianti‐‐IgGIgG umane legate sulla superficie di umane legate sulla superficie di emazieemazie
indicatrici.indicatrici.
Da “Tecnologie e protocolli diagnostici” dott.ssa R.M. Lorenti
Campionepositivo
Campionenegativo
Lettura dei risultati
Da “Tecnologie e protocolli diagnostici” dott.ssa R.M. Lorenti
Automatizzazione Capture®
SIERO/ANTISIERO
Eritrosedimentazione su colonna
BLISS
EMAZIE
Matrice con gel (destrano, poliacrilamide, …) o microsfere di vetro
PeG, antisiero o AHG
Camera di reazione (q.tà ridotte)
Lasciare la bolla dLasciare la bolla d’’aria!!!aria!!!
Eritrosedimentazione su colonna
Le emazie agglutinate vengono intrappolate lungo la colonna, mentre quelle non agglutinate cadono sul fondo.
Non serve il lavaggio (non si perdono deboli anticorpi)
Score di reazione in CAT
Leggere la reazione da un lato e dall’altroGraduare il lato con intensità
maggiore per ogni pozzetto
Automatizzazione CAT
E.M.T.: Erythrocyte‐MagnetizedTechnology
Non richiede lavaggi (non si perdono deboli anticorpi)
Non richiede centrifugazione delle piastre (risparmio di tempo)
NOVITA’
Automatizzazione EMT
Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico�sede di RoveretoTimetableEsameCosa impareremoBackgroundAttività di laboratorioDove studiareNon dovete avere paura di…Il buon tecnico di laboratorioUn Servizio… tanti utenti!What is a blood group?Antigeni eritrocitariQuale linfocita? La selezione clonaleIsotipi anticorpaliSvantaggi anticorpi monoclonaliEtichettatura dei reagentiAntisieri commercialiL’agglutinazioneVariabili della reazione Ag-Ab[Ag] e [Ab]: effetto prozona