Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Alumno: García Márquez Reynaldo

Profesora: Carolina Acuña González

Grupo: 4IM2 Sección: 1

Práctica 2: Determinación de proteínas por el método de Bradford y el método de Lowry

Fecha de entrega: Jueves 20 de Febrero

Objetivos:

1.-Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico

2.-Determinar si hay diferencia estadística significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry

3.-Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de color

4.-Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas

Fundamento:

La determinación de proteínas se realiza principalmente por tres métodos: el de Lowry, el de Bradford y el de Biuret. Para análisis clínicos, por ejemplo, el método de Biuret es ampliamente usado a nivel comercial, aunque los métodos de Bradford y Lowry son también de gran eficacia. El método de Lowry se basa en una reacción entre las proteínas que han formado un complejo de coordinación con el cobre, con un reactivo de ácido fosfomolibdotúngstico en medio ácido; el reactivo se ve reducido por los grupos R de los aminoácidos tirosina, cisteína y triptófano.

El método de Bradford usa una reacción entre las proteínas y un colorante llamado azul de Coomassie G-250. El método es muy rápido, ya que la reacción está completa a los 2 minutos de haber comenzado.

Para evaluar la eficacia de un método respecto a otro, se deben hacer pruebas que deben ser realizadas en condiciones iguales: mismo analista, mismo día, mismos aparatos, etc. Los parámetros de comparación son la precisión y la exactitud, que podrían apreciarse con una simple mirada a los datos, aunque esto no sería objetivo. Mediante los análisis estadísticos posteriores de los resultados obtenidos, se obtienen los parámetros de comparación objetivos. La prueba F se realiza con las desviaciones estándar de dos métodos, uno considerado de referencia y otro de prueba; al comparar con valores establecidos en tablas, se evalúa la precisión de un método de prueba. La prueba t de student usa una fórmula similar a la de la desviación estándar de un método, sólo que involucra las diferencias entre los datos experimentales de los métodos a comparar; los resultados de la prueba t sirven para evaluar la exactitud de una prueba con respecto a otra.

Datos experimentales e informe:

Curva de calibración de Lowry y Bradford

Lowry

Tubo No.

Cantidad de proteina (µg)

A 590 nm

Serie a Serie b

1 25 0.138 0.1272 50 0.203 0.183 75 0.256 0.2344 100 0.331 0.3465 125 0.389 0.401

Bradford

Tubo No.

Cantidad de

proteina (µg)

Serie a Serie b

1 25 0.27 0.1982 50 0.346 0.3493 75 0.38 0.44 100 0.519 0.5195 125 0.522 0.534

20 40 60 80 100 120 1400

0.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.45

f(x) = 0.002856 x + 0.0434R² = 0.980128121323049f(x) = 0.00252 x + 0.0743999999999999R² = 0.997908139148975

Curvas de calibración Lowry

Curva ALinear (Curva A)Curva B

Proteína(microgramo)

Abso

rban

cia

20 40 60 80 100 120 1400

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6f(x) = 0.003368 x + 0.1474R² = 0.938751622043908f(x) = 0.002708 x + 0.2043R² = 0.935609710291668

Curvas de Calibración de Bradford

Curva A

Proteína(microgramos)

Abso

rban

cia

a) La ordenada al origen corresponde a un valor de absorbancia que correspondería a la concentración de proteínas 0, o que equivaldría al valor del blanco; el valor de la pendiente indica el cambio en la absorbancia con respecto a la cantidad de proteína, y puede ser usada para comparar la sensibilidad de uno con otro método, en lo cual a mayor valor de la pendiente mayor sensibilidad; el coeficiente de correlación r nos indica si las variables graficadas se relacionan entre sí, y que tanto se ajustan a un modelo lineal, el coeficiente r al cuadrado indica que tan intensamente se relacionan estas variables entre sí, el máximo valor para r es 1, si el valor es -1 indica una perfecta correlación pero con una pendiente negativa.

b)Sí cumplen la ley de Bouger y Beer ambas curvas, ya que observamos un alto valor de r en ambos métodos, lo que indica linealidad. Los parámetros donde se cumple van de 25 microgramos a 125.

c) La fórmula en general para ello es: y−bm

=x , o sea la diferencia de las ordenadas entre

la pendiente encontrada.

Análisis estadístico

Lowry

Tubo No.

A Cantidad de proteina (µg)

1 0.31 91.762 0.324 97.043 0.272 97.414 0.31 91.765 0.295 86.096 0.328 98.557 0.284 81.948 0.217 56.659 0.28 80.43

10 0.271 77.03

Bradford

Tubo No.

A Cantidad de proteina (µg)

1 0.454 96.462 0.4 74.943 0.445 92.94 0.436 89.315 0.456 97.296 0.415 80.927 0.441 91.38 0.458 98.099 0.46 98.88

10 0.411 79.33

Lowry Bradford

Xmed=83.86

Xmed=90.258

s= 12.308 s= 8.83s²= 151.48 s²= 78%C.V.= 14.67 %C.V.= 9.8µ= (75.06, 92.67) µ= (83.12, 95.76)

Prueba F: 151.48

78 = 1.94

F de tablas=4.03 (9 grados de libertad)

Ftablas˃F calculada. "No hay diferencia significativa entre los métodos"

Método t de student

Muestra Método de referencia(Lowry)

Método de prueba(Bradford)

Di Di-Dimed (Di-Dimed)2

1 91.76 96.46 -4.7 -0.624 0.3893762 97.04 74.94 22.1 26.176 685.18297

63 97.41 92.9 4.51 4.51 20.34014 91.76 89.31 2.45 2.45 6.00255 86.09 97.29 -11.2 -11.2 125.446 98.55 80.92 17.63 17.63 310.81697 81.94 91.3 -9.36 -9.36 87.60968 56.65 98.09 -41.44 -41.44 1717.27369 80.43 98.88 -18.45 -18.45 340.4025

10 77.03 79.33 -2.3 -2.3 5.29Dimed= -4.076 Σ(Di-Dimed)2= 3298.7475

5

SD=√ Σ(Di−Dimed)2n−1

=19.1449

Fórmula t=DimedSD √n= ⎸-0.67 =0.67⎹

t tablas=2.262(95% confianza y 9 grados de libertad)t tablas˃t calculada "No hay diferencia significativa"

Interferencias por sustancias no proteicas en las determinaciones

La proteína sobre la cual se realizaron las pruebas de interferencia es la hemoglobina

-Lowry

Tubo No.

Sustancia A595 Cantidad de

proteina (µg)

Tipo de interferencia

generada

1 Tris 1M, pH7.0

0.2 50.75 negativa

2 Glicerol al 1% (v/v)

0.286 83.33 No es inter.

3 Detergente comercial al

1%

0.269 76.89 No es inter.

4 Docecilfato de sodio (SDS) al

1%

0.286 83..3 No es inter.

5 Acido tricloroacético

(TCA) al 5%

0.276 79.54 No es inter.

-Bradford

Tubo No.

Sustancia A595 Cantidad de

proteina (µg)

Tipo de interferencia

generada

1 Tris 1M, pH7.0

0.512 119.64 positiva

2 Glicerol al 1% (v/v)

0.527 125.62 positiva

3 Detergente comercial al

1%

0.187 0 negativo

4 Docecilfato de sodio (SDS) al

1%

0.206 0 negativo

5 Acido tricloroacético

(TCA) al 5%

0.487 109.66 negativo

*Nota: Por falta de datos de uno de los equipos, sólo se presentan las interferencias realizadas por este equipo.

La explicación sobre las interferencias se encuentra en la discusión de resultados.

Comparación de los métodos:

-Biuret: Las características más importantes de la reacción son: La reacción del Biuret se aplica a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas; su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml; no depende de la composición de aminoácidos; algunos compuestos (NH4+, Tris)dan la reacción generando interferencia; el rango usando 1 mL final es de 0.1 a 1 mg de proteína.

-Lowry: El tiempo de reacción es lento, aproximadamente 40 min; requiere un medio alcalino; necesita al menos un tetrapéptido como sustrato; es proporcional al contenido de tirosina, triptófano y cisteína en la muestra; presenta interferencias como el Tris, el fenol, la urea, el TCA, el mercaptoetanol y el sulfato de amonio; el rango más adecuado de trabajo es de 5 a 100 microgramos de proteina.

-Bradford: Ensayo muy rápido (aprox. 2 min); depende de la cantidad de aminoácidos aromáticos y básicos en la proteína; medio ácido; presenta pocas interferencias significativas como detergentes y agentes fuertemente alcalinos; estabilidad de una hora; el rango preferible de trabajo está entre 20 y 140 microgramos.

A la absorbancia de 280 nm, además de que las proteínas presentan su máxima absorción, los ácidos nucleicos tienen su pico de absorción en esta longitud. Para los 3 ensayos, es recomendable realizarla a los 595 nm, donde también se presenta un valor considerable de absorción para las proteínas.

Cuadro comparativo Lowry-Bradford

Lowry BradfordPendiente=0.0025 Pendiente=0.0034Tiempo de reacción= 40 minutos Tiempo de reacción= 2 minutosMedio alcalino Medio ácido

2 reactivos Sólo un reactivoVarias interferencias(reductores, quelantes de Cobre, fenol, etc)

Interfieren principalmente detergentes detergentes

Depende de la cantidad de tirosina y triptófano en la proteína

Depende de la cantidad de aminoácidos básicos y aromáticos en la proteína

Estabilidad de 2 horas Estabilidad de una horaDiscusión:

La curva de calibración se realizó correctamente, y con ella se comprobó que estas reacciones seguian la ley de Bouger y Beer. Los coeficientes de correlación encontrados mediante la regresión lineal apoyan esta aseveración. Los valores de las pendientes son indicativos de la sensibilidad del método, en lo que observamos que el método de Bradford es más sensible que el de Lowry, con una pendiente de 0.0034 para la curva con mayor R contra la pendiente de 0.0025 obtenida para Lowry en su mayor valor de R. Respecto al análisis estadístico, los parámetros de comparación más importantes son el coeficiente de variación, y las pruebas estadísticas de t y F; el coeficiente de variación es mayor para Lowry, lo que podría sugerir que el método de Bradford es más fiable, sin embargo, las pruebas F( precisión) y t(exactitud) no muestran que exista una diferencia significativa entre ambos métodos, por lo que podemos decir que los resultados que arrojen estos métodos son confiables.

Los agentes que acidifican las soluciones como el TCA, los quelantes de Cu (por ej. EDTA) que evitan que el cobre forme el complejo con la proteína o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, fenoles) serán interferentes de la reacción de Lowry, como se observó en las pruebas realizadas. Para el método de Bradford, las soluciones iónicas y los carbohidratos interfieren mínimamente, y los agentes que presentan gran interferencia son los detergentes como el SDS o reactivos alcalinizantes.

Conclusiones:

1.-El método de Lowry tiene un tiempo de reacción de 40 minutos

2.-Los agentes acidificantes, quelantes y reductores interfieren en la reacción del método de Lowry.

3.-El color del método de Lowry es estable por 2 horas

4.-El método de Bradford tiene un tiempo de reacción de 2 minutos

5.-Los detergentes son una gran interferencia al método de Bradford

6.-El color del método de Bradford es estable por 1 hora

7.- Ambos métodos son determinaciones confiables con una buena sensibilidad.

Bibliografía:

http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2009/QuiBiol/tp01.pdf

Skoog, D. A. ; Holler, F. J. ; Crouch, S. R. ; "Principios de análisis instrumental"; Editorial Cengage Learning, 6ta edición, México 2008