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Métodos aplicados para -caroteno
Dra. Paz Robert C.
Universidad de ChileFacultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología QuímicaQuímica de Alimentos y Materias Grasas
Taller FAO, 2008
Estructura básica
• Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5 C unidas de manera tal que el orden se invierte en el centro.
• Amplio sistema de doble enlace conjugado.
Análisis de Carotenoides
-carotenoProvitamina A
Provitamina ACarotenos principales
Composición completa
Dependiendo del grado de información deseado
Características espectrales
Caroteno Solvente max1%A1 cm
-caroteno Acetona (429) 452 478 -
cloroformo (435) 461 485 2396
etanol (425) 450 478 2620
hexano (425) 450 477 2592
Espectro de absorción de carotenoides son dependientes del solvente
1%A1cm usado en el cálculo de la concentración también varía marcadamente con el solvente
Carotenoides en solución obedecen la Ley de Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente proporcional a la concentración.Britton, 1995; Rodriguez-Amaya. 2001
TRANS CAROTENO
EPOXICAROTENOSAPOCAROTENOS
COMPUESTOS DEBAJO PESO MOLECULAR
CIS-CAROTENOS
oxidaciónisomerización
oxidación
POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS
Pérdida de color
Pérdida valor nutritivo
Pérdida de sabor
Moléculas altamente insaturadas
... Isomerización cis• causa leve pérdida de color, disminución
de 2 a 6 nm en la , aparición de un pick en la región UV
15-cis
13-cis
transLicopeno
Procedimiento Analítico
• Muestreo y preparación de la muestra• Extracción con acetona en frio• Transferencia (partición) a éter de petróleo,
hexano, eter etílico• Saponificación y lavado• Concentración en evaporador rotatorio
(<35°C)• Separación cromatográfica• Identificación y cuantificación.
Muestreo y preparación de la muestra.
1. Homogenización de la materia prima
2. Extracción con acetona en frío
Partición a éter de petróleo
Separación OCC FM: porcentajes crecientes de acetona en éter de petróleo
MgO : Celite (1:1)
Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de elución cromatográfica reacciones específicas.
Fases Estacionarias-OCC
• Alúmina• Sílica• CaCO3
• Ca(OH)2
• MgO• ZnCO3
• Tierras silíceas (tierra de diatomeas, kieselguhr, hyflosupercel)
• Celulosa, almidón, dextran cross-linked (sephadex), Polietilen
• Mezclas de ellos
Rodriguea-Amaya, 2001
Criterios de identificación OCC
Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido
Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Orden de salida OCC y Rf(TLC).
•Estructura fina del espectro (%III / II)*100
Britton, 1995
Espectro de absorción max
• zeinoxantina 421 445 474 • -criptoxantina 421 445 475
• Luteina 421 445 475
-criptoxantina (425) 449 476
zeaxantina (424) 449 476
Espectro de absorción max
Métodos Oficiales AOAC
• Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15) /método espectrofotométrico.
• Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método espectrofotométrico
• Carotenos y carotenoides en productos de macaroni Ch-32 (938.04)
• Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)
Carotenos en plantas frescas
• Pigmentos solubles en grasa, extraídos y cromatografiados para remover clorofilas e hidroxicarotenos, los cuales son determinados espectrofotométricamente y expresados como beta-caroteno
MUESTRA
• Extracción• Acetona
/hexano (40+60)
COLUMNA
• Elución• acetona:hex
ano (1+9)
MgO:hyflosupersel (1:1)
Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados
Muestra aguaHexano-acetona-etanol
absoluto-tolueno (10+7+6+7)
Saponificación en caliente
Saponificación en frío
Silica gel G+hyflosupersel (1:1)
Carotenos •Hexano:acetona (96+4), 436 nm
MHC•Hexano:acetona (90+10) 474 nm•Zeinoxantina, criptoxantina
DHC•Hexano:acetona (80+20) 474 nm•Luteina, zeaxantina
xantofilas •Hexano;acetona:metanol (80:10:10)•Violaxantina, neoxantina, otros
MgO:hyflosupersel (1:1)
Carotenos
• Hexano:acetona (90+10)
Total xantofilas
• Hexano;acetona:metanol (80:10:10)
Separación-HPLC
Fase inversa-Fases enlazadas RP-18 ó C18
RP-8 ó C8
C-30
Ntrilo, amino
Fase Inversa-HPLCColumnas enlazadas RP-18: Aplicable a carotenoides de todos los niveles de polaridad.Materiales RP son inertes, formación de artefactos es mínima.Se puede trabajar en elusión con gradiente
Separación-HPLC
Fase Normal• Sílice
compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad, útil para separación de xantofilas, los carotenos son pobremente resueltos• Alúmina, Ca(OH)2
Para algunas separaciones especiales. Presentan dificultades prácticas: tienen una vida corta y necesitan un control riguroso de humedad
Fase NormalCa(OH)2
AlúminaSílice
Criterios de identificación-HPLC
Tiempos de retención tr
Tiempo de retención relativo TRR = tr,i / tr,st
Adición a la muestra del componente supuesto: normalmente se agrega a la muestra, el supuesto componente i y se ve cual pico crece.
Correlaciones gráficas de estructura -retención
Criterios de identificación HPLC
Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido
Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes.
Espectro de masas que confirme por lo menos la masa molecular.
CuantificaciónCurva de calibración
Comparación con muestras de concentración conocida
Cs/Cst = As/Ast
Standard Interno
Fi (Ci/Cst) = (Ast/Ai)
Características espectrales de carotenoides identificados
Fracción Fase movil Identificación Rf**
1 5% acetona (426) 448 476 B-Caroteno 0,98 (425) 450 4772 10% acetona (422) 444 472 Zeinoxantina 0,43 421 445 4753 20%acetona 450 Apocarotenal prob. 0,984 30-40% acetona (424) 442 468 Anteroxantina prob 0,19 (422) 445 4725 60% acetona (422) 442 472 Luteína 0,19 (421) 445 474
zeaxantina (424) 449 4766 100% acetona 432 458 488 Rubixantina 0,52 434 460 4907 10% agua-acetona 442 468 500 Licopeno 0,98 444 470 502
* Davies, 1976; Rodriguez-Amaya, 1999
** Placa de sílice, FM metanol 5% en benceno
Máx long de onda Máx long de ondaLiteratura*
Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa)
HPLC (Rosa Mosqueta)
Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mmFase móvil: acetonitrilo: metanol: acetato de etilo (65: 20: 15)Flujo: 1ml/min
-caroteno
Licopeno
Rubixantina
Tomate Zanahoria
Identificación por Trr con patrones extraídos.