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Métodos de Estudio
en
Biología Celular
Microscopía Óptica
Microscopía Electrónica
Técnicas Cito-histológicas
Cultivo in vitro de células y tejidos
Citoquímica-Histoquímica
Inmunohistoquímica
Autorradiografía
Fraccionamiento Celular
Ultracentrifugación
Citometría de Flujo
Cromatografía
Electroforesis
A. INFORMACIÓN MORFOLÓGICA
B. ORIENTACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA
C. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES
D. INFORMACIÓN ANALÍTICA A NIVEL MOLECULAR
Estructura Unidad de
Medida
Valor
(mm)
Método de
estudio
Organos, Tejidos
y Células
grandes
Milímetro
(mm)
1 Simple Vista
Lupa
Células y
Organelos
grandes
Micrómetro
(µm)
1 x 10-3 Microscopio
Optico
Componentes
Celulares,
Macromoléculas
Nanómetro
(nm)
1 x 10-6 Microscopio
Electrónico
Estructuras
MolecularesAngström
(Ä)
1 x 10-7 Microscopio
Electrónico
Microscopio
Óptico
Partes de un Microscopio
Sistema óptico
comprende un conjunto de lentes dispuestas de
tal manera que producen el aumento de las
imágenes que se ven a través de ellas
Sistema mecánico
está constituido por una serie de piezas en las
que van instaladas las lentes que permiten el
movimiento para el enfoque.
Brazo o Columna
Cabezal
Pie o Base
Platina
Revolver
Tornillos de enfoque
Condensador
Diafragma
Fuente de Luz
Oculares
Objetivos
Oculares
Tienen la función de ampliar la imagen.
Están formados por dos lentes dispuestos en un tubo corto.
Los más utilizados son los de: 1OX, 12,5X y 15X.
Objetivos
Permiten ampliar la imagen del objeto.
El número varía con el tipo de microscopio y el uso.
Objetivos
Secos 5X, 10X, 20X, 40X y 60X Inmersión: 100X
Condensador
Está formado por un sistema de lentes que concentran los rayos
luminosos sobre el plano de la preparación.
Se halla debajo de la platina y presenta un sistema de cremallera
que permite su movimiento.
Diafragma
Tiene la función de regular la cantidad de luz que entra
en el condensador.
Fuente de iluminación
Dirige los rayos luminosos hacia el condensador
Pie o Base
Constituye el soporte sobre el cual se apoya el microscopio.
Puede tener forma rectangular o bien de Y.
Brazo o Columna
Es una pieza colocada en la parte posterior del aparato
Sostiene el cabezal en su porción superior y por el extremo inferior
se une al pie.
Es una pieza plana donde se coloca la preparación.
Presenta un orificio que permite el paso de la luz.
Tiene tornillos laterales que permiten recorrer la preparación.
Platina
Cabezal
Contiene los sistemas de lentes oculares.
Puede ser monocular o binocular.
Revolver
Es una pieza giratoria que sostiene los objetivos.
Permite cambiar los objetivos y observar una muestra en diferentes
aumentos.
Tornillos de enfoque
El macrométrico aproxima el enfoque
El micrométrico consigue el enfoque correcto
Tipos
de
Microscopios
Contraste de Fases
• Permite ver células y tejidos sin
teñir, o sea vivos
• Los materiales producen un
retraso de fases en los rayos que
los atraviesan
• Los cambios son ampliados y
convertidos en cambios en la
intensidad de luz
• Las células se observan en
diferentes tonos de gris
Interferencia
• Permite ver células y tejidos sin teñir
• Se basa en los mismos principios
que el contraste de fases
• Proporciona resultados cuantitativos
e información sobre propiedades
físicas de los materiales
• Detecta cambios en el índice de
refracción de la luz, además de
revelar las discontinuidades de fase
Fluorescencia
• Permite observar sustancias
fluorescentes naturales o materiales
teñidos
• Tiene alta sensibilidad, detecta la
mínima cantidad de fluorescencia
• Las sustancias fluorescentes
absorben luz de una longitud de onda
y emiten luz de mayor longitud de
onda
• Si se iluminan con luz azul o violeta
(onda corta) emiten luz amarilla o
verde (onda larga)
luz intensa
(onda corta)
filtro excitador
material
filtro supresor
(pasa long. onda
mayores)
fondo oscuro y
materiales brillantes
Microscopio Invertido
• Es una variante del microscopio
común que tiene invertida la
posición de los objetivos
• La luz de la fuente de iluminación
llega desde encima de la platina
• Facilita el trabajo botellas o tubos de
cultivo.
• Es usado en laboratorios de
microbiología
Microscopio Confocal
• Utiliza iluminación láser y permite ver material grueso como
secciones o cortes
• La imagen es captada por un detector que la transfiere a PC
con un analizador de imágenes
Microscopio Confocal
Microscopio Confocal
Microscopio Confocal
1. Constituye una herramienta ideal para
examinar estructuras y funciones celulares.
2. Pueden observarse tejidos intactos o
secciones gruesas sin necesidad de hacer
cortes histológicos
3. Se obtiene un aumento notable en la
resolución, con respecto a otros MO.
4. Permite hacer reconstrucciones en 3
dimensiones más precisas que con otros
métodos.
Microscopio de Campo Oscuro
• Es un microscopio común cuyo sistema condensador está modificado
para dirigir la luz desde los lados
• Sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible.
• La muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
Microscopio de Campo Oscuro
• Permite ver partículas y células
vivas que están debajo de la
resolución del microscopio común
• Es usada en el estudio de
pequeñas células móviles, que
son invisibles con la microscopía
óptica común.
Microscopio de Polarización
• similar al MO pero difiere en el agregado de dos filtros polarizadores de luz
• estos hacen que el fondo de la imagen sea oscuro y las estructuras
observada aparezcan brillantes
• solamente se pueden ver las estructuras que son refringentes
Microscopio de Polarización
Figura 6-16.-Micrografía de cartílago hialino
visto con luz polarizada en donde se aprecia la
birrefringencia del colágeno que forma parte
del pericondrio, correspondiendo a las
estructuras rosadas brillantes.
Campo Claro
Adecuado para analizar células y tejidos
previamente fijados y coloreados
Contraste de Fases
Células y tejidos transparentes e incoloros
de hasta 10 µm de espesor, que no pueden ser teñidos o no se desea teñir
Interferencia
Células y tejidos transparentes de algunos
cientos de µm de espesor
Campo Oscuro
Materiales transparentes e incoloros que muestran poco contraste en campo claro
(células, plancton, bacterias, cristales, esporas, polen, etc...)
Fluorescencia
Estudio de células o tejidos con
fluorescencia propia o tratados con fluorocromos
Polarización
Materiales refringentes tales como
colágeno, microtúbulos, quitina, celulosa, cristales, etc...
Microscopio
Electrónico
Microscopio Electrónico
• permite observar la ultraestructura de las células
• tiene un poder de resolución de 0,3 nm
• se basa en la propiedad de los haces electrones de ser
desviados en un campo electromagnético
• la imagen se forma por la dispersión de los electrones que son
desviados por el objeto observado
• la dispersión depende del espesor del objeto y del número
atómico de los átomos que lo componen
• a mayor número atómico ocurre una mayor dispersión de
electrones
Microscopio de Transmisión (MET)
Microscopio de Transmisión (MET)
Microscopio Electrónico de Barrido
• a diferencia del MET, el MEB permite obtener imágenes
tridimensionales de los objetos.
• en este caso un haz fino de electrones recorre la superficie del
material.
• los electrones dispersados por el material son recogidos por
una pantalla de video.
• para aumentar el poder dispersante de los electrones, suelen
utilizarse sustancias químicas para revestir los materiales.
Microscopio de Barrido (MEB)
Leucoplastos Escherichia coli
Breve historia de la Microscopía
• 1608 Janssen construye un
microscopio con dos lentes
convergentes (microscopio
compuesto).
• 1665 Hooke utiliza un
microscopio compuesto para
estudiar cortes de corcho y
describe las células.
• 1674 Leeuwenhoek descubre
los protozoarios.• 1828 W. Nicol desarrolla el
microscopio con luz polarizada.
• 1833 Brown describe el núcleo de la célula.
• 1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría celular.
• 1857 Kolliker describe las mitocondrias en células musculares.
• 1879 Flemming describe el comportamiento de los cromosomas
durante la mitosis en células animales.
• 1881 Retzius describe la mayoría de los tejidos animales con un
microscopio de luz.
• 1882 Koch usa anilina para teñir e identifica las bacterias que
causan la tuberculosis y el cólera.
• 1886 Zeiss fabrica lentes que permiten resolver estructuras en los
límites teóricos de la luz visible.
• 1898 Golgi describe por primera vez el aparato de Golgi tiñendo
células con nitrato de plata.
Breve historia de la Microscopía
• 1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de
fluorescencia.
• 1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de
interferencia.
• 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
• 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, diseñan el
primer microscopio electrónico.
• 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de
interferencia diferencial para el microscopio de luz.
• 1981 Aparece el microscopio de efecto túnel (MET).
Breve historia de la Microscopía
Técnicas
Cito-histológicas
“son todos los procedimientos a
través de los cuales una muestra se
transforma en una preparación
adecuada para estudio microscópico”
Pasos de las Técnicas Citohistológicas
1. Obtención de la muestra
2. Fijación
3. Deshidratación
4. Inclusión
5. Cortes histológicos
6. Tinción
7. Montaje
1. Obtención de la muestra
• Para muestras obtenidas a partir de animales, este debe
estar vivo y anestesiado.
• Los fragmentos deben ser pequeños, no mayores a 5
mm de espesor.
• Se deben cortar con un instrumento muy afilado.
• Luego de extraída, la muestra debe ser sumergida
inmediatamente en fijador.
2. Fijación
• Es un método que permite conservar la morfología y
composición de células y tejidos evitando la autolisis
• Consiste en matar a las células para que mantengan la
estructura que poseían en vida
• Se debe realizar inmediatamente después de extraer la
muestra para evitar el deterioro
• Los fragmentos de tejido deben ser lo más pequeño
posible, para que el fijador penetre rápidamente.
• Tiene además la finalidad de endurecer los tejidos,
volviéndolos resistentes para las etapas siguientes.
3. Deshidratación
• las piezas al ser retiradas del fijador están embebidas en
agua
• ello impide que sean penetradas por la parafina
• en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos
sumergiéndolos en líquidos sin agua
• generalmente se utiliza una serie creciente de alcohol
etílico
4. Inclusión
• Sirve para obtener cortes finos de tejido porque cuanto más firme más
delgado será el corte.
• Lo más común es la inclusión en parafina, previo tratamiento con
benceno o tolueno.
• Se emplean moldes de papel o de metal, dónde se coloca la muestra y
se vierte la parafina a 60ºC.
• Se recortan los bloques en forma de pirámide cuadrangular y se adhieren
a un taquito de madera
5. Cortes Histológicos
• Para observar tejidos en MO, se deben obtener láminas delgadas.
• En casi todos los casos el elemento utilizado para los cortes es el
micrótomo.
• Son instrumentos de gran precisión que proporcionan cortes
delgados parejos y de espesor graduable.
• Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
• Los cortes se extienden en agua tibia y se introduce el portaobjetos
cubierto adhesivo.
6. Coloración o Tinción
1. Para obtener contraste y realizar observaciones morfológicas o
estructurales.
2. Para identificar sustancias, moléculas o estructuras específicas.
Colorantes
Naturales
Animales (carmín)
Vegetales (hematoxilina, orceína)
Artificiales
o
Sintéticos
Ácidos: sales con base incolora y ácido coloreado
(eosina).
Básicos: sales con base coloreada y ácido incoloro
(azul de metileno).
Neutros: sales en que el ácido y la base son
coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el
citoplasma de otro.
Indiferentes: no forman sales, tiñen sustancias que
tienen poder mayor disolvente que el líquido en que
están disueltas (Sudán lll, rojo escarlata).
7. Montaje
• Permite conservar las estructuras durante muchos años.
• Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se
procede a la aclaración y montaje definitivo.
• La deshidratación se realiza con alcoholes crecientes y
la aclaración con xilol o alcohol.
• Lo más común es efectuar la aclaración con xilol y luego
montar la preparación en Bálsamo de Canadá.
• También es frecuente la aclaración en alcohol absoluto y
el montaje en Euparal.
