Metody detekcji i identyfikacji bakterii

Dorota ŻabickaZakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków Warszawa

Budowa komórki bakteryjnej

Badanie mikrobiologiczne Cel:

identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki

Tok badania mikrobiologicznego Pobranie materiału Badanie materiału:

Metody klasyczne Badanie mikroskopowe Hodowla i identyfikacja drobnoustroju Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki Metody immunologiczne

Metody molekularne

Pobieranie i przesyłanie materiału

Rodzaj podłoża transportowego i rodzaj pojemników są dostosowywane do rodzaju materiału i kierunku badania (bakterie, wirusy, obecność przeciwciał)

Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny Preparaty barwione

metoda Grama metody specjalne np.

barwienie na obecność zarodników

Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na końcu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza

Ściana komórkowa bakteriiBakterie Gram-dodatnie

Bakterie Gram-ujemne

Badanie mikroskopowe

Neisseria meningitidisPreparat z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego barwiony metodą Grama

Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego

Badanie mikroskopowe

Preparat z ciemnym polem widzenia (Treponema pallidum)

Mikroskop fluorescencyjny

Badanie mikroskopowe

Mikroskop kontrastowo-fazowy grzyby z rodzaju Candida

Badanie mikroskopowe

Mikroskop elektronowy

Hodowla bakterii

Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i stałe

Hodowla prowadzona w warunkach najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych drobnoustrojów

Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium tuberculosis)

Wymagania wzrostowe bakterii Zapotrzebowanie na tlen

Tlenowe – O2

Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2

Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2, 85% N2

Źródło węgla Autotroficzne – CO2 Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry, lipidy

Pozostałe związki niezbędne do wzrostu Sole nieorganiczne Witaminy

Czynniki fizykochemiczne

Temperatura Psychrofile – optimum 0-10C Mezofile – optimum 20-40C Termofile – optimum 50-60C

pH Większość bakterii preferuje neutralne wartości

pH ~ 7.0 Ciśnienie osmotyczne

Wiekszość preferuje aw ~ 0,99

Wzrost hodowli bakterii w podłożu płynnym

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów

Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa hemolizy dookoła kolonii

Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów

Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne

MacConkey agar

CPS

Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenne

MRSAESBL

VRE

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów

Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów wykonywanych na płytkach

wrażliwość na bacytracynę test CAMP

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów

Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem

zestawów probówkowych gotowych testów identyfikacyjnych

Systemy automatyczne

Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów

Phoenix BD Diagnostic SystemsVITEK 2 Compact BioMerieux

System VITEK 2 Compact

System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych

Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów

Oznaczanie metodą rozcieńczeniową Gotowe testy

diagnostyczne do odczytu manualnego

Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych

Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów oporności na antybiotyki

Szczep gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oporny na wszystkie antybiotyki -laktamowe (MRSA)

Dyfuzja z krążka

Dyfuzja z paska

Podłoże z antybiotykiem

Metody immunologiczne

Testy lateksowe, ELISA, immunofluorescencyjne wykrywające całe komórki lub antygeny bakterii (białka powierzchniowe, wielocukry otoczkowe, toksyny)

Pozwalają wykryć bakterie w materiale pobranym od chorego lub pomagają w identyfikacji wyhodowanych bakterii

Stosowane gotowe testy manualne lub automatyczne

Aglutynacja lateksowa

Metody immunologiczne - EIA

Metody immunologiczne – systemy automatyczne

System VIDAS

Nowe metody oparte o metody immunologiczne

Spektrometria MALDI-TOF

Spektrometria MALDI-TOF

Spektrometria MALDI-TOF

Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub real-

time PCR Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch

wariantach Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w

dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR Zestawy odczynników lub zamknięte systemy

diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy

Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych

Genom bakteryjny

Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)

Metoda PCR

Metoda PCR

6018

/9967

58/99

ATCC

4330

0 AT

C C 29

213

Rule r

1 00

Rule r

1 00

DNA

mecAok. 550 kb

mecA gen występujący u MRSA

Real-time PCR

Krzywe reakcji real-time PCR

Szybkie testy molekularne np. GeneXpert

Sondy typu Scorpion

rysunki: źródło Cepheid

Dwa rodzaje sond typu Scorpion stosowane w testach z serii GeneXpert

Zintegrowana kontrola wewnętrzna w mieszaninie reakcyjnej

Mg2+

dCTP

dGTP

dUTP

dATP

Taq DNA Polymerase

Internal Control (IC)

IC scorpiontarget scorpion

rysunki źródło Cepheid

Mikromacierze

Bakteriofagi – wirusy bakteryjne

Bakteriofagi - morfologia

Bakteriofagi – cykle życiowe

Bakteriofagi – zastosowanie w diagnostyce

Typowanie bakterii w celu określenia pokrewieństwa izolowanych szczepów

łysinka

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Dziękuję za uwagę