MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG CÂY BÁCH XANH (CALOCEDRUS MACROLEPIS) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR

Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phòng

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Lê Anh Tuấn, Phí Hồng Hải

Trung tâm NC Giống cây rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

I. MỞ ĐẦU

Bách xanh (Calocedrus macrolepis) là loài cây thân gỗ, thân thẳng, phân cành sớm và phân tán rộng. Bách xanh phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc và vùng núi đất phía Nam, trong các cánh rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp và ở độ cao 800-1500m trên mặt biển.

Bách xanh là loài cây có khả năng cho nhựa giống như các loài cây cho tinh dầu khác, do vỏ có nhiều ống dẫn nhựa lớn, nhựa có mùi tinh dầu xá xị rất thơm, gỗ màu vàng nhạt, vân có màu vàng nâu, gỗ rất cứng và chứa nhiều tinh dầu có giá trị cao trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và gia dụng.

Cũng giống như hầu hết các loài cây đặc hữu khác, việc đánh giá đa dạng quần thể di truyền mới chỉ tập trung vào một số đặc điểm hình thái, đặc biệt là cơ quan sinh sản. Nhận dạng bằng hình thái đôi khi bị hạn chế vì phụ thuộc vào trạng thái mẫu thu nhận được. Trong vài năm trở lại đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phân tích RFLP, AFLP, RAPD, SSR,…để đánh giá mức độ di truyền đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam (Kim et al., 2006; Mace et al., 1999; Powell et al., 1996, Đinh thị Phòng et al., 2004, Nguyễn Thị Hạnh, 2005). Trong đó, kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) hay được sử dụng vì kỹ thuật này tương đối đơn giản, dễ thực hiện mà có hiệu quả (Ferreira et al., 1997; William et al., 1990), còn chỉ thị genome lục lạp mang tính bảo thủ di truyền cao nên thường sử dụng để nhận dạng các loài mới.

Công trình này đề cập đến kết quả “Phân tích mối quan hệ di truyền tập đoàn giống cây bách xanh bằng chỉ thị RAPD và genome lục lạp”, giúp cho công tác bảo tồn và tái tạo nguồn gen quý hiếm của Việt Nam.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu: gồm 20 mẫu lá bách xanh do Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp có ký hiệu và nơi thu thập như bảng 1.

Bảng 1. Nguồn gốc và ký hiệu 20 mẫu bách xanh dùng trong nghiên cứu

TT Ký hiệu mẫu

Nguồn gốc TT Ký hiệu mẫu

Nguồn gốc

1 HT1 Mẫu 68 – Hà Nội 11 LD4 Mẫu cây 7, 8 – Lâm Đồng

2 HT2 Mẫu 76 - Hà Nội 12 LD5 Mẫu cây 22 – Lâm Đồng

3 HT3 Mẫu 102 - Hà Nội 13 LD6 Mẫu cây 20, 21 – Lâm Đồng

4 HT4 Mẫu 124 - Hà Nội 14 LD7 Mẫu cây 23, 24 – Lâm Đồng

5 HT5 Mẫu 128 - Hà Nội 15 QB1 Quảng Bình 1

6 HT6 Mẫu 159 - Hà Nội 16 QB2 Quảng Bình 2

7 HT7 Mẫu 176 - Hà Nội 17 QB3 Quảng Bình 3

8 LD1 Mẫu cây 1, 5 và 6 – Lâm Đồng 18 QB4 Quảng Bình 4

9 LD2 Mẫu cây 15, 16 – Lâm Đồng 19 QB5 Quảng Bình 5

10 LD3 Mẫu cây 9, 14 – Lâm Đồng 20 QB6 Quảng Bình 6

Các mồi sử dụng trong nghiên cứu gồm: 15 mồi RAPD (bảng 2) và 06 cặp mồi phân tích genome lục lạp với kích thước lý thuyết tương ứng (bảng 3).

Bảng 2. Trình tự các nucleotide 15 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

TT Mồi Trình tự nucleotide TT Mồi Trình tự nucleotide

1 OPE14 5' TGC GGC TGAG 3' 9 RA143 5' TCGGCGATAG 3'

2 RA159 5’GTCCACACGG 3’ 10 RA46 5’CCAGACCCTG 3’

3 RA142 5’CAATCGCCGT 3’ 11 OPP19 5’GGG AAG GAC 3’

4 RA40 5’GGCGGACTGT 3’ 12 OPB18 5'CCACAGCAGT 3'

5 OPP15 5'GGAAGCCAAC 3' 13 OPH08 5'GAAACACCCC 3'

6 OPN05 5'ACT GAA CGCC 3' 14 OPH03 5'AGA CGT CCAC 3'

7 OPA04 5'AATCGGGCTG 3' 15 UBC23 5'CCCGCCTTCC 3'

8 UBC3 5'CCT GGG CTTA 3'

Bảng 3. Trình tự các nucleotide của 06 cặp mồi phân tích genome lục lạp

TT Tên mồi Trình tự các nucleotide Kích thước lý thuyết (bp)

1 Dal 1-F

Dal 1-R

5’CGAAATCGGTAGACGCTACG 3’

5’GGGGATAGAGGGACTTGAAC 3’

577

2 psaA-F

trnS-R

5’ ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA 3’

5’ AACCACTCGGCCATCTCTCCTA 3’

3681

3 trnS-F

trnfM-R

5’GAGAGAGAGGGATTCGAACC 3’

5’CATAACCTTGAGTCACGG G 3’

1254

4 rbcL1-F

rbcL2-R

5’ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGCAAGT 3’

5’CTTCACAAGCAGCAGCTAGTTCAGGACTCC 3’

1381

5 rps14-F

cob-R

5’CACGGGTCGCCCTCGTTCCG 3’

5’GTG TGG AGG ATA TAG GTT GT 3’

1396

6 trnH-F

trnK-R

5’ ACGGGAATTGAACCCGCGCA 3’

5’ CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 3’

1831

Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết ADN tổng số từ lá: theo phương pháp CTAB của (Doyle and Doyle, 1987) có cải tiến. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 0,8%.

Phản ứng PCR – RAPD: một phản ứng PCR có thể tích 25µl: bao gồm dung dịch đệm PCR 1X; 2,5mM MgCl2; 2mM dNTPs; 200nM đoạn mồi; 0,5 đơn vị Taq polymerase và 10ng ADN khuôn. Phản ứng PCR – RAPD thực hiên trong máy PCR – Thermal Cycler theo chu trình nhiệt: 940C trong 1 phút; 45 chu kỳ (920C trong 1 phút; 350C trong 1 phút; 720C trong 1 phút); 720C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở 40C. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.

Phản ứng PCR lục lạp: một phản ứng PCR lục lạp có tổng thể tích là 25µl chứa: 1X dung dịch đệm PCR; 2,5mMgCl2; 2mM dNTPs; 0,5pmol mồi xuôi; 0,5pmol mồi ngược; 50ng ADN khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Chu trình nhiệt của phản ứng là: 940C trong 2 phút; 35 chu kỳ (940C trong 1 phút; 500C - 600C trong 1 phút; 720C trong 1 phút); 720C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở 40C. Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.

Phản ứng cắt enzyme hạn chế: sản phẩm PCR của các cặp mồi lục lạp được cắt bằng các enzyme hạn chế thành phần gồm: 10µl sản phẩm PCR, 2µl 10X buffer, 2µl enzyme và 6µl H2O deion. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong vòng 12h đến 16h.

Phân tích số liệu: theo quy ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện, khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xác định hệ số di truyền giống nhau, giá trị PIC, giá trị trương quan kiểu hình (r),... để lập ra biểu đồ so sánh hệ số tương đồng di truyền giữa 20 mẫu Bách xanh ở mức độ phân tử như trong công trình nghiên cứu của Đinh Thị Phòng et al., (2004). Số liệu được xử lý bằng chương trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998).

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống cây Bách xanh

ADN của 20 mẫu Bách xanh được phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên RAPD. Kết quả phân tích sản phẩm PCR - RAPD điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy, có 9/15 mồi chỉ ra tính đa hình với giá trị PIC dao động từ 0,08 (mồi RA40) đến 0,31 (mồi RA46). Số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi xê dịch từ 2 đến 11 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 200bp đến 1800bp. Tổng số phân đoạn ADN nhân bản được của 20 mẫu bách xanh với 15 mồi RAPD là 854. Số phân đoạn ADN nhân bản được nhiều nhất là 104 phân đoạn (mồi RA40) và ít nhất là 20 phân đoạn (mồi UBC23) (bảng 4).

Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn ADN khi so sánh giữa các mẫu với nhau. Tổng số phân đoạn ADN khi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên là 56 phân đoạn. Trong đó có 22 phân đoạn là đa hình (chiếm 39,29%) và 34 phân đoạn đơn hình (chiếm 60,71%).

Bảng 4. Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 20 mẫu Bách xanh

phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên RAPD

TT

Mồi PIC Phân đoạn đa hình

Phân đoạn đồng hình

Tổng số phân đoạn

% phân đoạn đa hình

1 OPE14 0 0 3 3 0,00

2 RA159 0,46 6 0 6 100,00

3 RA142 0 0 3 3 0,00

4 RA40 0,08 1 5 6 16,67

5 OPP15 0 0 3 3 0,00

6 OPN05 0 0 2 2 0,00

7 OPA04 0,16 2 1 3 66,67

8 UBC3 0,08 1 1 2 50,00

9 RA143 0 0 2 2 0,00

10 RA46 0,31 4 1 5 80,00

11 OPP19 0,08 1 4 5 20,00

12 OPB18 0,20 2 3 5 40,00

13 OPH08 0,13 2 3 5 40,00

14 OPH03 0,13 3 2 5 60,00

15 UB23 0 0 1 1 0,00

Tổng 22 34 56 39,29

Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi RAPD của 20 mẫu Bbách xanh với mồi RA46 được trình bày ở hình 1A. Trong số 5 phân đoạn ADN được nhân bản thì có 4 phân đoạn đa hình (chiếm 80%). Các phân đoạn có kích thước khoảng từ 0,3kb đến 1,0kb. Tính đa hình ADN của các mẫu được thể hiện tương đối rõ. Ví dụ ở vị trí khoảng 0,7 kb (mũi tên: ←) 6 mẫu Bách xanh QB1, QB2, QB3, QB4, QB5 và QB6 (giếng 15, 16, 17, 18, 19 và 20 tương ứng) đã xuất hiện phân đoạn ADN mới khi phân tích với mồi RA46. Trong cùng một địa phương thu mẫu cũng có sự khác biệt tại vị trí khoảng 0,8kb, mẫu HT1, HT2 và HT3 (giếng 1, 2 và 3 tương ứng) xuất hiện phân đoạn ADN, mẫu HT4, HT5, HT6 và HT7 (giếng 4, 5, 6 và 7 tương ứng) (mũi tên →) đã không xuất hiện phân đoạn ADN. Kết quả phân tích trên cho thấy trong tập đoàn 20 mẫu bách xanh nghiên cứu đã có sự sai khác trong ADN genome.

Tuy nhiên, khi phân tích với mồi OPP15 có 3 phân đoạn ADN được nhân bản, nhưng lại không chỉ ra tính đa hình giữa 20 mẫu bách xanh (hình 1B).

Hình 1. Điện di sản phẩm PCR – RAPD trên gel 1,5 % agarose (A: Mồi RA46 và B: Mồi OPP15; M: marker phân tử 1kb; Giếng 1-20: tên của 20 mẫu Bách xanh như trong bảng 1).

Mối quan hệ di truyền của 20 mẫu cây bách xanh với 15 mồi RAPD Mối quan hệ di truyền của 20 mẫu Bách xanh thu được ở ba địa phương Hà Tây, Lâm Đồng và Quảng

Bình được thể hiện trên sơ đồ hình cây và biểu đồ tọa độ (hình 2) đã phân ra làm 3 nhánh rõ ràng (nhánh I, nhánh II và nhánh II). Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu Bách xanh dao động từ 0,75 đến 1. Điều đáng lưu ý ở đây, hầu hết các mẫu có cùng vùng địa lý thu mẫu đều lập thành một nhánh trên cây phân loại:

1kb 0,5kb 1kb

0,5kb

A B

+ Nhánh I gồm 7 mẫu Bách xanh thu được tại Hà Tây (kí hiệu HT1, HT2…HT7) có mức độ tương đồng di truyền trong khoảng từ 0,882 đến 0,98;

+ Nhánh II gồm 7 mẫu thu được tại Lâm Đồng (kí hiệu LD1, LD2…LD7) có mức độ tương đồng di truyền trong khoảng 0,853 đến 0,954;

+ Nhánh III gồm 6 mẫu thu được tại Quảng Bình (kí hiệu QB1, QB2…QB6) và có mức độ tương đồng di truyền khoảng từ 0,88 đến 1. Trong đó hai giống QB5 và QB6 giống nhau hoàn toàn nên có hệ số tương đồng di truyền là 1;

Hình 2. Biểu đồ hình cây và biểu đồ toạ độ của 20 mẫu Bách xanh tính theo hệ số di truyền của

Jaccard và kiểu phân nhóm UPGM

Phân tích đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu Bách xanh bằng chỉ thị lục lạp

Song song với việc đánh giá đa dạng genome nhân bằng các chỉ thị RAPD, trong nghiên cứu này, các cặp mồi lục lạp cũng đã được sử dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền của ADN lục lạp, chúng tôi sử dụng 06 cặp mồi lục lạp để đánh giá đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu bách xanh, nhưng chỉ có 4/6 cặp mồi là nhân được sản phẩm. Kích thước nhân bản được của các cặp mồi Dal1R-Dal1F, trnS–trnfM, rbcL1- rbcL2 và rpS14-cob có độ dài khoảng 500bp (hình 3 A), 950bp (hình 3 B), 900bp (hình 3 C) và 1kb (hình 3D), tương ứng. Tuy nhiên, điều đáng quan tâm ở đây là sản phẩm PCR của 4 cặp mồi lục lạp khi phân tích với 20 mẫu bách xanh đã không chỉ ra tính đa hình (các mẫu bách xanh đều nhân được các phân đoạn ADN có kích thước bằng nhau). Kết quả này cũng đồng nghĩa là không có tính đa hình AND genome lục lạp giữa các mẫu bách xanh.

Hình 3. Điện di sản phẩm PCR lục lạp của các cặp mồi Dal1F - Dal1R (A), trnS - trnfM (B); rbcL1 -

rbcL2 (C); rps14-cob (D); M: thang phân tử chuẩn 1kb, giếng 1-20: thứ tự sắp xếp của các mẫu bách xanh như trong bảng 1.

Để có cơ sở đánh giá thêm về tính đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu bách xanh, chúng tôi đã sử dụng 09 enzyme hạn chế để cắt sản phẩm PCR lục lạp của một số mẫu Bách xanh điển hình của mỗi địa phương khi phân tích với 4 cặp mồi nêu trên. Enzyme hạn chế chỉ có thể nhận biết các vị trí các trình tự nucleotide nhất định để cắt, vì thế mà có thể nhận được sự đa hình các vùng cpDNA giữa các mẫu nghiên cứu.

I

II

III

1k

1k

1kb

1k

0,5kb

0,5kb

0,5kb

0,5kb

A B

C D

Phương pháp này đã được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phát sinh loài khi phân tích mức độ đa dạng của các trình tự nucleotide genome lục lạp (Mason-Gamer et al., 1995; Chung et al., 2003; Nicolosi et al., 2000; Mohanty et al., 2001, Devos et al., 2003; McMillan et al., 2004; Nguyễn Đức Thành et al., 2005).

Kết quả cắt enzyme hạn chế: sản phẩm PCR lục lạp nhân được từ các cặp mồi trên đã được xử lý với 09 enzyme hạn chế EcoRI, NdeI, XhoI, SacI, KpnI, PstI, X-baI, BamHI, HindIII không chỉ ra các đoạn cắt đa hình.

Từ kết quả phân tích ADN genome lục lap có thể cho phép chúng tôi nhận xét sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ genome lục lạp ở cây Bách xanh.

IV. KẾT LUẬN

- 15 mồi ngẫu nhiên dùng đề phân tích tính đa hình ADN genome của 20 mẫu Bách xanh thì có 9 mồi chỉ ra tính đa hình. Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạn ADN được nhân bản, số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi xê dịch từ 2 đến 11 phân đoạn. Kích thước phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 200bp đến 1800bp.

- Hệ số sai khác di truyền của 20 mẫu Bách xanh dao động từ 0,75 đến 1 và được phân làm 3 nhánh chính: nhánh I gồm 7 mẫu Hà Tây, nhánh II gồm 7 mẫu Lâm Đồng và nhánh III gồm 6 mẫu Quảng Bình

- 04/06 cặp mồi lục lạp đã nhân được sản phẩm và 09 enzyme cắt hạn chế sử dụng cho phân tích đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu Bách xanh đã không chỉ ra tính đa hình. Kết quả nhận được cho phép nhận xét thêm sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở thực vật bậc cao cây bách xanh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chung SM., Jack ES., 2003. The development and evaluation of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequence regions in a diverse array of plant taxa. Theor Appl Genet (2003) 107: 757-767.

2. Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Nguyễn Thị Hải Hà, Lê Duy Thành, Nguyễn Văn Viết, 2004. Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống định hướng nông lâm nghiệp miền núi. Thái Nguyên 23/9/2004: 571-574.

3. Devos N., Tyteca D., Raspe O., Wesselingh RA., and Jacquemart AL., 2003 Patterns of chloroplast diversity among western European Dactylorhiza species (Orchidaceae). Plant Syst Evol 243: 85-97.

4. Doyle JJ and Doyle, 1987.Rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11-15.

5. Ferreira AR., Keim P, 1997. Genetic Mapping of Soybean [Glycine max (L.) Merr.] Using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Plant Mol Biol Rep, 15(4): 335- 354.

6. Kim MK, Park MJ, Jeong WH, Nam KC, Chung J,2006. SSR marker tightly linked to the Ti locus in Soybean [Glycine max (L.) Merr.]. Euphytica 152(3): 361-366.

7. Mace ES., Lester RN., Gebhardt CG.,1999. AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae), Theor. Appl. Genet. 99: 626 - 633.

8. McMillan E., Sun G., 2004. Genetic relationships of tetraploid Elymus speciess and their genomic donor speciess inferred from polymerase chain reaction – restriction length polymorphism analysis of chloroplast gene regions. Theor Appl Gent 108: 535-542.

9. Mohanty A., Martin JP., Aguinagalde I., 2001.Chloroplast DNA study in wild populations and some cultivars of Prunu avium L. Theor Appl Genet 103: 112-117.

10. Powell W, Morgante M, Andre C, Hanafey M, Vogel J, Tingey S, Rafalski A, 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2(3): 225 - 238.

11. Nguyễn Thuý Hạnh, 2005. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số chi và loài cây họ dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD và AND lục lạp. Luận án cao học.

12. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV, 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 18: 6531-6535.