Microarray-basierte Transkriptomanalysen bei Infektionskrankheiten

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  • SchwerpunktherausgeberW. Seeger, GieenA. Althoff, Gieen

    Internist 2006 Suppl 1 47:S6S13DOI 10.1007/s00108-006-1627-6Online publiziert: 17. Mai 2006 Springer Medizin Verlag 2006

    H. Hossain T. ChakrabortyInstitut fr Medizinische Mikrobiologie, Gieen

    Microarray-basierte Transkriptomanalysen bei InfektionskrankheitenEin neuer diagnostischer Weg

    Individualisierte Therapie ein Paradigmenwechsel?

    Fortschritte in der DNA-Sequenzie-rung haben zur Vervollstndigung des humanen Genomprojektes und zu einer steigenden Zahl von voll-stndig bekannten Genomen von Krankheitserregern gefhrt. Diese Er-rungenschaften bieten neue Mglich-keiten, die Pathogenese von Infekti-onskrankheiten zu untersuchen. Fr das Verstndnis dieser Krankheiten ist das Wissen um die komplexen In-teraktionen zwischen Erreger und Wirt von unschtzbarem Wert. Die Microarray-Technologie ist ein ideales Werkzeug, diese Interaktionen zu un-tersuchen. Sie erlaubt die simultane Analyse tausender Gene, und ihre An-wendung in klinischer Forschung ver-spricht eine revolutionre Verbesse-rung der Diagnose, Therapie und Vor-beugung dieser Krankheiten.

    Grundlegendes zur Microarray-Technologie

    Im Verlauf einer Infektion kommt es beim infizierten Wirt zu dramatischen nderungen der Genexpression mit Be-teiligung einer Vielzahl von Genen unter-schiedlicher Funktionen [8]. Die Erfas-sung dieser nderungen erweitert nicht nur das Wissen um die Pathogenese ei-ner Infektion durch neue Einblicke in die Wirtsantwort, sondern kann auch dia-gnostisch genutzt werden und ist eine zu-kunftstrchtige Alternative zur herkmm-lichen Infektionsdiagnostik.

    E Die Microarray-Technologie ist ein ideales Werkzeug, um die vernderten Genaktivitten als Antwort des Wirtes auf eine Infektion zu erfassen.

    Ein Microarray ist eine spezifische An-ordnung von immobilisierten Nuklein-suren mit definierten Basensequenzen, sog. Gensonden (Probes), auf einer fes-ten Oberflche. Die Anlagerung (Hybridi-sierung) von fluoreszenzmarkierten Nu-kleinsuren aus einer zu untersuchenden Probe, sog. Targets, an diesen Genson-den erlaubt die parallele Messung der rela-tiven Konzentrationen einer Vielzahl ver-schiedener mRNA- oder DNA-Sequenzen in der Probe ([24], . Abb. 1).

    Microarrays ermglichen so die Ana-lyse von Expressionsmustern tausen-der Gene (20.00040.000) in einem ein-zigen Experiment, wodurch Zeitaufwand und Ressourcen enorm eingespart werden knnen. Sie erlauben den Nachweis von kleinsten Mengenunterschieden von Nu-kleinsuren und zeichnen sich durch eine sehr hohe Sensitivitt aus.

    Der Vorteil der Microarrays liegt in dem genomweiten Ansatz, wodurch nicht hypothesengenerierte Fragestellungen ohne Vorwissen ber beteiligte Gene und deren Interaktionen bis ins Detail bear-beitet werden knnen. Dies ermglicht v. a. die Untersuchung der gesamten be-kannten und unbekannten biologischen Stoffwechselwege (Pathways). Gerade bei Infektionskrankheiten ist die koordinierte Interaktion mehrerer funktionaler Stoff-

    wechselwege noch vllig unverstanden, aber von zentraler Bedeutung fr das Zu-sammenspiel von Wirt und Erreger [7].

    Anwendungsmglichkeiten

    In der Infektiologie finden Microarrays hauptschlich Anwendung bei Genoty-pisierungs- und Genexpressionsstudien. Die Genotypisierungsstudien umfassen die Analyse des Genoms ber die Mes-sung der DNA und werden zur Identifi-zierung und Charakterisierung des Erre-gers bzw. Wirtes eingesetzt. Genexpressi-onsstudien dagegen umfassen die Analy-se des Transkriptoms (Gesamtheit aller mRNA in der Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt) ber die Messung von mRNA und werden zur Untersuchung der Regu-lation von Genen eingesetzt. Daher eig-nen sich Genexpressionsstudien, um bei-de Seiten der Erreger-Wirt-Beziehung auf transkriptioneller Ebene zu untersuchen (. Abb. 2).

    Erregerassoziierte Anwendungen

    DiagnostikMikroorganismen knnen ber die DNA-Sequenz ihres Genoms identifiziert wer-den. Die groe Zahl der Sonden mit un-terschiedlichen DNA-Sequenzen auf den Microarrays, verbunden mit einer hohen Bindungsspezifitt gegenber den hybri-disierten Proben, erlaubt den Nachweis ei-ner Vielzahl von Krankheitserregern mit hoher Sensitivitt und Spezifitt.

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  • > Microarrays knnen nicht nur speziesbergreifend, sondern sogar familien- bzw. klassenbergreifend eingesetzt werden

    Um beispielsweise Durchfallerreger und deren krank machende Eigenschaften zu bestimmen, knnen verschiedene anti-gene Determinanten und Virulenzfak-toren von bekannten Durchfallerregern mittels der Microarrays in einem ein-zigen Ansatz untersucht werden [12]. So-mit kann nicht nur der Keim identifi-ziert werden, sondern auch eine Aussage

    ber z. B. Toxin produzierende Gene ge-macht werden. Wang et al. [38] entwickel-ten einen Array, der 140 verschiedene Vi-ren nachweisen konnte, und zeigten, dass Microarrays hervorragend geeignet sind, um verschiedene Spezies einer Gattung, Ordnung oder Familie simultan nachzu-weisen. Bei der Fokussuche in einem In-fektionsgeschehen knnten Microarrays nicht nur speziesbergreifend, sondern sogar familien- bzw. klassenbergreifend eingesetzt werden. Beispielsweise knnte bei konnatalen Infektionen der Nachweis von Viren (Herpes simplex, Zytomega-lie, Rubella), Bakterien (Treponema pal-

    lidum) und Protozoen (Toxoplasma gon-dii) mittels Microarrays in einem einzigen Ansatz erbracht werden.

    Die Microarray-Technologie eignet sich nicht nur fr den Nachweis von be-kannten Erregern, sondern auch bisher unbekannte Keime knnen ber eine Hy-bridisierung mit Universal-Arrays, die weite Teile von konservierten DNA-Se-quenzbereichen abdecken, nachgewiesen werden [30].

    Epidemiologie und EvolutionEine der hufigsten Anwendungsgebiete von Microarrays sind epidemiologische Untersuchungen von Infektionskrank-heiten. ber die Wahl der Gensonden erlauben Microarrays sowohl den Nach-weis groer als auch kleiner Variationen im Genom und eignen sich daher zur Dif-ferenzierung von Stmmen bei epidemi-ologischen Fragestellungen, wie z. B. bei Ausbrchen mit Rotaviren [13] oder Cam-pylobacter jejuni [23]. An mehreren, zeit-lich versetzten Ausbrchen von rheuma-tischem Fieber konnten Smoot et al. [32] durch den Genomvergleich von 36 Patien-tenisolaten von Streptokokken der Grup-pe A Serotyp M18 zeigen, dass Ausbrche in Salt Lake City, die 12 Jahre auseinan-der lagen, durch einen nahezu genetisch

    Abb. 1 9 berblick ber die einzelnen Schritte eines Microarray-Experimentes

    Abb. 2 9 Anwendung von Microarrays bei Infektions-krankheiten

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    Individualisierte Therapie ein Paradigmenwechsel?

  • identischen Stamm ausgelst wurden. Di-ese Erkenntnisse wren nicht mglich ge-wesen ohne den Einsatz einer Technolo-gie, die die globale Analyse von bakteri-ellen Genomen erlaubt. Vor diesem Hin-tergrund knnen auch evolutionsgene-tische Fragestellungen beantwortet wer-den, indem evolutionr konservierte und divergente Gene bei verschiedenen Orga-nismen untersucht werden und Assoziati-onen zwischen diesen Organismen erlau-ben. So konnten Dobrindt et al. [18] bei einem Vergleich von 36 extraintestinalen und intestinalen, pathogenen und nicht-pathogenen E. coli zeigen, dass die Akqui-rierung von Genen durch Bakteriophagen und Deletionen von Genen als globale evolutionre Prozesse involviert waren.

    PathogenittDer Einsatz von Microarrays ermglich-te in einer Vielzahl von Studien, die mo-lekularen Mechanismen der Wirtsinvasi-on und Umgehung der Wirtsabwehr so-wie die berlebensstrategien von Erre-gern zu erkennen.

    Auf der Suche nach den Faktoren, die zur Infektiositt und bertragung von Vi-brio cholerae beitragen, konnten Merrell et al. [25] zeigen, dass die Genexpression des Choleratoxins kurz vor der Ausschei-dung ausgeschaltet wird, dafr aber Gene fr die Motilitt und Nhrstoffaufnahme aktiviert werden.

    Ben Mamoun et al. [3] untersuchten den Malariaerreger Plasmodium falci-parum in 5 unterschiedlichen Stadien der Parasitenentwicklung und zeigten, dass bei der Infektion zeitlich zunchst Gene der Proteinbiosynthese involviert waren, dann metabolische Gene (vornehmlich der Glykolyse) und schlielich Gene fr die Adhsion und Invasion aktiviert wur-den. Listeria monocytogenes (Lm), der Erreger der Listeriose, ist eines der weni-gen Bakterien, die ihre Aufnahme in die Wirtszelle selbst induzieren und sich im Zytosol der Wirtszelle vermehren knnen. Chatterjee et al. [10] untersuchten die Ge-nexpression von Lm im Phagosom und Zytosol von Makrophagen und konnten zeigen, dass Lm gleich nach der Aufnah-me im Phagosom die Transkription hin-sichtlich einer Stressantwort remodelliert und nach Austritt ins Zytosol zahlreiche

    Virulenzgene einschaltet, um die Ausbrei-tung einzuleiten.

    Diese Array-Ergebnisse zeigen deut-lich, dass eine koordinierte Genexpressi-on beteiligter bekannter und bisher unbe-kannter Faktoren essenziell fr die erfolg-reiche Invasion eines Wirtes ist.

    Umgehung oder Neutralisierung der Abwehrmechanismen des Wirtes sind von zentraler Bedeutung fr die Patho-genitt eines Erregers. Staudinger et al. [34] konnten zeigen, dass die Phagozyto-se von E. coli durch neutrophile Granulo-zyten bei E. coli zu einer starken Expressi-on von Genen fhrte, die durch den Oxi-dase-sensing Transkriptionsfaktor OxyR reguliert wurden. OxyR-defiziente E. co-li dagegen waren hypersensitiv gegenber einer neutrophilen Phagozytose, sodass angenommen werden kann, dass OxyR E. coli vor oxidativen antimikrobiellen Faktoren schtzt.

    Wirtassoziierte Anwendungen

    Ein umfassendes Wissen ber das Im-munsystem des Wirtes ist essenziell fr das Verstndnis von Infektionskrank-heiten. Globale Genexpressionsanalysen sollen helfen, die komplexen Sachverhalte der Immunologie aufzuklren. Untersu-chungen an Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems zu unter-schiedlichen Stadien der Differenzierung, Reifung un