Microbiologie Lp

1.Norme de protecţie a muncii în laboratorul de

microbiologie. Exemple de echipamente care pot fi

utilizate în laborator

1. 1. Cuvinte cheie

· Laborator de microbiologie

· Norme de protecţie

· Accident de lucru

· Mănuşi

· Microscop

· Hote microbiologice (cabinete de siguranță biologică)

1. 2. Introducere

Laboratorul de microbiologie are ca scop furnizarea unor rezultate corecte şi de calitate care să poată

fi utilizate de clinician pentru a diagnostica şi trata pacientul. Primul pas este recoltarea corectă a

produsului patologic (p.p.); şi p.p. ulterior se poate face identificarea agentului patogen responsabil de

îmbolnăvire.

Laboratorul de microbiologie poate fi organizat diferit in funcţie de localizare şi de complexitatea

testelor pe care le poate realiza: laborator al unui spital public, laborator al unui cabinet medical,

laborator particular, laborator independent, laborator de cercetare, etc.). În general în laboratorul

standard de microbiologie întâlnim şapte secţii:

Bacteriologie aerobă şi anaerobă

Micologie

Micobacteriologie (sau bacteriologia tuberculozei)

Virusologie

Serologie

Diagnostic molecular (tehnologia amplificării genice prin PCR)

Rezultatele obţinute in cadrul laboratorului de microbiologie trebuie sa fie reproductibile şi să respecte

normele de calitate stabilite de Asociaţia de Acreditare din România (RENAR).

În cursul lucrărilor practice (L.P.) de microbiologie, studenţii vor avea posibilitatea să realizeze unele

etape din algoritmul de diagnostic de laborator bacteriologic sau serologic pentru diferitele

microorganisme studiate, conform programei universitare. Toate aceste manevre trebuie

efectuate corect şi în siguranţă în vederea prevenirii unor infecţii, iar întreaga activitate va fi

supravegheată de asistentul de grupă. Este obligatoriu ca studenţii să îşi însuşească normele de

protecţie a muncii !

1. 3. Norme de protecţie a muncii

Diagnosticul microbiologic porneşte de la recoltarea produsului patologic (prescurtat p.p.) care poate

conţine microorganisme patogene şi potenţial periculoase. Exemple de produse patologice: Exsudat

nazal/faringian, sânge, urină, materii fecale, spută, puroi, LCR, diferite alte secreţii, etc. Pentru a

identifica agentul patogen, de exemplu o bacterie, acesta va fi izolat în cultura pură, ceea ce

echivalează cu o concentrare a agentului patogen. Pentru prevenirea infecţiilor, regulile următoare

trebuie aplicate, strict.

1. Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator. Pentru a putea intra studenţii trebuie

mai întâi să îşi însuşească aceste informații şi să semneze un proces verbal privitor la această primă

activitate de la L.P.

2. Toate produsele patologice recoltate în vederea stabilirii unui diagnostic sunt considerate potenţial

infecţioase.

3. Este obligatorie purtarea halatului în laborator. Echipamentul de protecţie cum ar fi: mănusile de

latex, ochelarii, masca, cotierele sau chiar lucrul în incinte speciale, vor fi stabilite în funcţie de situaţie

de către asistentul responsabil de grupă.

4. În laborator nu se aleargă, se merge atent. Părul lung trebuie purtat strâns în coadă.

5. Este interzis să se mănânce sau să se bea în laborator şi în sala de lucrări practice; de asemenea

este interzisă mestecarea gumei de mestecat.

6. Pipetarea se realizează cu pipete speciale, nu cu gura, iar în cazul pipetelor de unică folosinţă, de

plastic sau sticlă, se utilizează dispozitivele de pipetare,(Figura nr. 1). Este interzisă introducerea în gură

a oricărui tip de obiect.

7. În cazul contaminării trebuie anunţat asistentul de grupă care hotărăşte cum trebuie procedat.

8. Toate activităţile de prelucrare a microorganismelor se realizează în vecinătatea becului de gaz

aprins.

9. Însămânţările se efectuează “la flacără”; nu se poartă mănuşi de latex in apropierea flacării care nu

trebuie lăsată nesupravegheată.

10.Ansa bacteriologică se sterilizează până la incandescenţă, “la roşu”, atât bucla cât şi firul ansei (iar

portansa se flambează) înainte şi după folosire; ansa trebuie să se răcească înainte de utilizare.

11.Înainte de începerea oricărui experiment sau înainte de începerea oricărei manevre, trebuie studiate

toate etapele; nimic nu se execută fară aprobarea asistentului de grupă.

12.Materialele de lucru refolosibile, lame de microscop, pipete, etc., contaminate nu se

decontaminează „la roşu”; trebuie introduse în containerul cu substanţe dezinfectante pregătit special

de personalul catedrei (care este pus pe masa de lucru înainte de începerea lucrării practice).

13.Se vor verifica etichetele tuturor reactivilor ce urmează a fi utilizaţi pentru a evita amestecarea unor

substanţe ce pot exploda, nu se priveşte în tuburi al căror conţinut a fost încălzit.

14.În cazul unui accident de lucru (de ex. contaminarea accidentală a suprafeţei de lucru cu substanţe

diverse, cu reactivi, cu produse patologice sau culturi) trebuie anunţat imediat asistentul de grupă;

acesta va îndruma studenţii în procesul de decontaminare, după caz.

15.Se recomandă punctualitate la lucrarea practică. Majoritatea indicaţiilor se dau la începutul

experimentelor şi sunt importante pentru evitarea accidentelor.

16.În timpul experimentelor este obligatoriu să se noteze observaţiile, pentru a putea fi utilizate

ulterior.

17.La sfârşitului lucrului în laborator sau oricând este necesar mâinile se vor spăla cu apă şi săpun.

Respectarea acestor norme de protecţie este obligatorie şi strict necesară.

1. 4. Echipamente care se utilizează în laboratorul de microbiologie

Echipamente fixe:

Dulapuri de laborator, trepiede, stelaje, hote microbiologice (Figura nr. 2), frigidere, congelatoare,

termostate, băi de apă sau de nisip, centrifugi, balanţe, agitatoare mecanice, dispozitive de triturare a

ţesuturilor, aparate pentru distilarea sau demineralizarea apei, spectrofotometre, aparatură de

sterilizare, containere pentru deşeuri, microscoape, pH-metre, arzătoare Bunsen (Figura nr. 3) etc.

Echipamente mobile si consumabile:

Truse de coloranţi (Figura nr. 4), sticlărie (eprubete, lame şi lamele pentru microscopie), anse

bacteriologice, pipete, lupe, inventar de material plastic şi cauciuc (plăci Petri, vârfuri, pipete de unică

folosinţă, tuburi eppendorf, diferite tampoane, etc), site de azbest (Figura nr. 5).

În laboratorul de microbiologie se efectuează diagnosticul de laborator în cazul multor infecţii iar paşii

care alcătuiesc acest algoritm se efectuează în hote microbiologice (cabinete de siguranţă biologică,

incinte, boxe, nişe), clasificate după cum urmează:

- Hota microbiologică de clasă I (Figura nr. 2); este o incintă aseptică cu flux de aer vertical care foloseste

un filtru pentru a curăta aerosolii produşi dinspre persoana care lucrează şi care se află în laborator

către mediul exterior asigurând un mediu de lucru steril. În plus, fluxul de aer creat previne

pătrunderea în spațiul de lucru a impuritătilor din mediul inconjurător.

- Hota microbiologică de clasă II, (Figura nr. 6), foloseşte două filtre. Unul dintre filtre asigură un curent

de aer steril în spațiul de lucru şi cel de al doilea filtru purifică aerul evacuat din hotă. Această hotă

asigură protecţia totală împotriva particulelor străine si a contaminării biologice.

- Hota microbiologică de clasă III, (Figura nr. 7), oferă protecţie maximă personalului din laborator și

mediului deoarece toate materialele periculoase sunt conţinute într-o incintă închisă total şi

ventilată. Înzona de lucru sunt prevăzute două mănuşi prin care utilizatorul poate manipula produsele

patologice şi aparatura de laborator în siguranţă realizând o izolare totală faţă de agenţii patogeni și

de materiale toxice infecţioase utilizate.

1. 5. Direcții de cercetare

Chiar dacă nu toate noțiunile prezentate în manualele de specialitate trebuie învățate ca atare, în

dezvoltarea pe parcursul activităților universitare considerăm că este necesar ca cititorii să citească mai

mult, pentru o cât mai bună informare. Ca atare, recomandăm câteva link-uri corespunzătoare unor

articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.

1. 1.http://www.microbiologyonline.org.uk/teachers/safety-information/safety-guidelines

2. http://d.umn.edu/~rhicks/genmicro/Microbiology20Lab20Safety.pdf

3. http://www.mbio.ncsu.edu/mb452/safety/safety.html

4. http://dmcampus.webs.com/documents/lab20equipment20study.pdf

5. http://www.homeworkassignmenthelp.com/MicrobiologyOnline.aspx

6. http://microeguide.com/equipment/index.asp

1. 6. Povestire adevărată

Laboratoarele de microbiologie pot fi considerate și ”locuri periculoase”. Cele mai multe dintre ele sunt

aprovizionate cu substanțe de tot felul, de la acizi sau alte chimicale cu potențiale efecte negative

asupra celuleui vii, la neurotoxine. În fiecare laborator de microbiologie există becuri Bunsen ce

utilizează gaz natural şi aparate care sterilizează la temperaturi înalte și presiune (autoclave).

Sunt multe povestiri privind aspecte în laborator. Un astfel de exemplu este cel al laborantei care nu a

calibrat corect centrifuga atunci când a centrifugat sânge infectat HIV şi tuburile centrifugate s-au

spart, trebuind să o cureţe (dar dacă se mai și tăia cu cioburile !?). Sau, un alt exemplu, cel al studentei

care nu a respectat normele de protecţie şi nu şi-a legat părul şi s-a ars la arzătorul Bunsen. Şi să nu-l

uităm pe doctorul neatent ce a facut impetigo pentru că nu a manipulat corect o cultură

de Streptococcus pyogenes. Din fericire, toate acestea au fost accidente minore.

Iată însă și unul dintre cele mai grave accidente de laborator, din istorie.

În data de 2 aprilie 1979 , un focar de antrax a izbucnit lângă orașul sovietic Sverdlovsk; a condus la

decesul a cel puțin 64 de persoane. La momentul respectiv s-a dat vina pe un transport de carne

contaminată. Adevărul a fost dezvăluit 13 ani mai târziu, când președintele în funcție a recunoscut

căepidemia a avut ca sursă un laborator de microbiologie din apropierea orașului. La un interviu dat

presei, fostul șef adjunct al departamentului ”Biopreparate” care a mărturisit că sursa reală a

contaminării populaţiei a fost laboratorul de microbiologie. Se pare că în cadrul unor manevre, nu au

fost respectate normele de protecţie şi nu a fost schimbat la timp un filtru de la sistemul de ventilaţie.

Deşi greșeala a fost observată rapid, o mică cantitate despori de antrax a fost eliberață şi a infectat

populaţia. Medicul a spus de asemenea că "în cazul în care vântul ar fi bătut în direcție opusă în acea zi

- spre orașul Sverdlovsk - rata de deces ar fi putut fi cu mult mai mare.

1. 7. De reținut

Normele de protecţie sunt importante şi trebuie respectate de toată lumea.

1. 8. Verificați-vă cunoștințele

1. Urmatoarele afirmaţii sunt adevărate:

A. În laboratorul de microbiologie se poate mânca

B. Dacă o lamă este spartă nu o folosţi

C. Nu vă uitaţi direct în tuburile încălzite

D. Părul poate fi purtat despletit

E. În laboratorul de microbiologie se poate mesteca gumă.

2. Următoarele afirmaţii sunt false:

A. Experimentele nu trebuie studiate înainte de începerea lucrului

B. Nu puneţi etichete pe tuburi

C. Langă arzător nu se lucrează cu mănuşi

D. Este interzisă introducerea în gură a oricărui tip de obiect

E. Este interzis să alergi in laborator.

3. Următoarele echipamente sunt consumabile:

A. Hota microbiologică

B. Sticlăria

C. Tuburile Eppendorf

D. Centrifugile

E. Lupele.

4. Următoarele echipamente sunt fixe:

A. Aparatele pentru distilarea sau demineralizarea apei

B. Spectrofotometrele

C. Aparatura de sterilizare

D. Sitele de azbest

E. Trusele de coloraţii

5. Hota microbiologică de clasă I:

A. Este o incintă aseptică cu flux de aer vertical

B. Folosește un filtru

C. Foloseşte două filtre

D. Este o incintă aseptică cu flux de aer orizontal

E. Foloseşte trei filtre

1. 9. ”Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Un microorganism atenuat nu poate determina niciodată boli severe.

2. Recomandările de biosiguranţă trebuie respectate întotdeauna.

3. Laboranţii cu experienţă îndelungată nu pot păţi nimic chiar dacă nu respectă regulile.

4. Orice boală survenită la un membru al personalului de laborator trebuie raportată conducerii şi

medicului curant.

5. Mirosirea culturilor microbiene nu implică nici un risc.

2. Sterilizare şi dezinfecţie. (Gabriela-Loredana Popa,

Loredana-Sabina Manolescu) 2. 1. Cuvinte cheie

· Sterilizare

· Dezinfecţie

· Căldură umedă

· Căldura uscată

· Dezinfecție chimică

2. 2. Introducere (definiții)

Curățarea reprezintă îndepărtarea materiei organice de pe instrumente sau

echipamente. Sanitarizarea reprezintă reducerea numărului de agenţi patogeni din locurile publice

(restaurante, toalete publice, etc.) în vederea prevenirii transmiterii bolilor.

Septic = contaminat cu agenţi patogeni. Aseptic = lipsit de agenţi patogeni şi nepatogeni.

Prin asepsie se evită contaminarea mediului cu microorganisme și se menţine “sterilitatea” ţesuturilor,

mediilor de cultură, medicamentelor etc.

Antisepsie = îndepărtarea / distrugerea formelor vegetative bacteriene de pe țesuturi vii. Se realizează

cu ajutorul substanţelor antiseptice (substanțe chimice).

Bacteriostatic = inhibă creşterea bacteriilor fară a le distruge. Bactericid = distruge bacteriile (fără a

distruge întotdeauna și sporii). Sporicid = agent capabil să distrugă sporii. Fungicid = agent chimic

capabil să distrugă fungii.Virucid = agent chimic capabil să distrugă virusurile.

2. 3. Sterilizarea

Prin sterilizare se distrug toți agenţii (patogeni, nepatogeni, forme vegetative sau spori) de pe o

suprafaţă sau din orice tip de mediu.

2. 3. 1. Sterilizarea prin căldură

Căldura este o metodă fizică prin care se distrug agenţii patogeni.

2. 3. 1. 1. Sterilizarea prin căldură uscată

Mecanism = oxidarea, denaturarea proteinelor sau carbonizarea structurilor bacteriene.

Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă (“la roşu”) reprezintă menţinerea în flacăra becului

Bunsen, până la înroşire, a obiectului care urmează a fi sterilizat. În acest mod se sterilizează ansa

bacteriologică (cu buclă sau fir); exersăm la LP.

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de 2-3 ori) a unui obiect, fără a se atinge temperatura de

incandescenţă. În acest mod se procedăm în cazul portansei, lamelor, gâtului unui recipient de sticlă

(eprubetă, etc). Nu reprezintă sterilizare !

Incinerarea reprezintă arderea completă, la temperaturi între 870-980ºC a unor materiale de unică

folosinţă, unor materiale infectate (infectele), reziduuri organice solide, gunoi. Incinerarea se realizează

în crematorii (incineratoare).

Cuptorul cu aer cald (pupinel, etuvă, cuptor Pasteur) este o cutie metalică cu pereţi dubli în care se

obţine şi se menţine o temperatură constantă şi uniformă pentru sterilizare. Este necesar și un sistem

de ventilaţie pentru uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului. Temperatura este de 180ºC, iar

durata o oră. Acest tip de sterilizare este recomandat pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan,

pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (preferabil sterilizat în autoclav)

etc. Pupinelul nu trebuie supraîncărcat; aerul trebuie să poată circula printre obiectele puse la sterilizat.

Sticlăria şi obiectele de porţelan trebuie spălate şi uscate complet înainte de sterilizare şi învelite în

hârtie specială. Nu se vor steriliza în pupinel soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc,

alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.

2. 3. 1. 2. Sterilizarea prin căldură umedă

Mecanism = coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se consideră a fi cea mai eficientă

metodă de sterilizare.

Fierberea se realizează la 100ºC, 30 minute; distruge formele vegetative bacteriene dar nu şi sporii.

Tindalizarea (sterilizare intermitentă) se realizează la la 100ºC, câte 30 minute, 3 zile consecutiv. Se pot

steriliza medii de cultură şi mediile care conţin zaharuri şi gelatină. În prima zi sunt omorâte formele

vegetative bacteriene iar în a doua şi a treiazisunt omorâţi sporii care germinează.

Pasteurizarea se realizează la trei nivele: înalt, mediu şi jos. Este o metodă de conservare a alimentelor

fără a distruge calitatea acestora. Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi

sporii. Pasteurizarea joasă se realizează la 63ºC, 30 secunde. Pasteurizarea înaltă (ultra-high-

temperature / UHT), se realizează la 140ºC, 3 secunde. Se utilizează frecvent pentruprodusele lactate.

Autoclavarea este cea mai folosită metodă de sterilizare. Foloseşte aburul sub presiune (de ex. la o

temperatură de 121ºC, 15 minute). Autoclavul este un cazan metalic de presiune care se închide etanş

cu un capac. Capacul este prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul lui vaporii de apă

sunt comprimaţi la presiunea necesară sterilizării. Vaporii de apă ajung la 121ºC, la 1 atmosferă.

Prin autoclavare se sterilizează medii de cultură, obiecte de cauciuc, bumbac, diferite substanţe în

soluţie, unele obiecte de sticlărie, materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical

(metalic), aparate de filtrat etc.

Controlul sterilizării prin autoclavare se poate realize prin metode biologice (hârtii de filtru ce conţin o

cantitate de 106 spori de Bacillus stearothermophilus; hârtiile sunt puse in autoclav odata cu materialele

ce urmează a fi sterilizate şi ulterior sunt puse la incubat pe medii de cultură; dacă bacteria se dezvoltă

în urma incubării înseamnă că sterilizarea nu a fost eficientă).

2. 3. 2. Sterilizarea prin filtrare

Reprezintă o metodă fizică de sterilizare. Bacteriile pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui

filtru. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest

impregnat cu caolin, pământ de infuzori). Acum se folosesc mai frecvent membrane filtrante din esteri

de celuloză sau alţi polimeri precum acetatul de celuloză (pori între 8 şi 0,025mm). Unele dintre cele

mai bune filtre de sterilizare sunt filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters), filtre care se

utilizează pentru sterilizarea aerului în hotele microbiologice. Sterilizarea prin filtrare este utilizată

pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a

unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.

2. 3. 3. Sterilizarea prin intermediul radiaţiilor

Se realizează prin doua tipuri de radiaţii: neionizante (UV) sau ionizante (X etc). Mecanism = ruperea

legăturilor de hidrogen sau oxidarea legăturilor duble.

2. 3. 3. 1. Radiaţiile neionizante

Acest tip de sterilizare este similar cu sterilizarea cu aer cald; poate fi utilizat pentru a steriliza seringi

preambalate sau catetere. Se pot utiliza şi microundele.

Un alt exemplu sunt radiaţiile ultraviolete, UV. Ele au lungimi de undă diferite. Cele de 250-260 nm

sunt utile în sterilizarea suprafeţelor de lucru, a aerului, (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte

manevre aseptice etc) în cazul în care nu există hote microbiologice cu flux laminar. Distrug bacteriile

dar nu pot penetra sticla, apa sau unele substanţe. Pot ”arde” pielea şi ochii. Lămpile cu UV sunt

numite lămpi germicide. Radiaţiile UV cu lungimi de undă de 200-390 nm sunt cele mai eficiente.

2. 3. 3. 2. Radiaţiile ionizante

Sunt un tip de radiaţii cu putere mare de penetrare (ex. razele X, gamma şi razele cosmic). Este o

sterilizare similară sterilizării la rece. Radiaţiile gamma cu sursă Co60

sunt mai eficiente decât radiaţiile

UV. Radiaţiile ionizante se utilizează în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente, mănuşi,

recoltoare, plăci Petri, etc).

2. 4. Antiseptice şi dezinfectante

Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative bacteriene (uneori şi a sporilor) din anumite

medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici sau cu ajutorul

substanţelor dezinfectante. Este importantă atât concentrația, durata aplicării, cât și remanența

dezinfectantului.

2. 4. 1. Hipocloriţii

· clorinarea descoperită in Suedia (1744), din 1890 se folosește în dezinfectare;

· soluţiile de hipoclorit se prepară proaspăt (în fiecare zi de lucru);

· concentraţia în clor activ este poate să difere în funcţie de scopul urmărit;

· au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor (100

ppm, în o oră), virusurilor (200 ppm, în 10 minute);

· se pot utiliza pentru purificarea apei;

· efectul este diminuat în prezenţa substanţelor organice (ex. proteine).

2. 4. 2. Derivaţii fenolici

· distrug membrana plasmatică, inactivează enzimele, denaturează proteinele;

· se folosesc sub formă de derivaţi fenolici;

· soluţiile fenolice se prepară proaspăt (în fiecare zi de lucru); efectul nu este diminuat în prezenţa

substanţelor organice;

· au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex. HIV inactivat

de soluţia 0,5%).

2. 4. 3. Glutaraldehida

· cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2% la un pH alcalin (efect asupra bacteriilor în formă

vegetativă, endosporilor, fungilor, virusurilor);

· efectul nu este diminuat în prezenţa substanţelor organice;

· se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;

· nu poate fi folosită pentru suprafeţe (este nevoie de un timp mare de expunere pentru a fi

eficientă); ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate în containere menţinute

închise (ex. endoscoape etc).

2. 4. 4. Iodoforii

· sunt substanţe care eliberează iodul în soluţii apoase;

· inhibă sinteza proteică;

· au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor, unor

virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);

· sunt inactivaţi de substanţe organice (ex. proteice), mase plastice, detergenţi;

· pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.

2. 4. 5. Dezinfectarea cu etilenoxid

· distruge bacteriile, nu şi sporii (ex. sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi);

· se utilizează pentru materiale puţin rezistente la temperaturi ridicate sau radiaţii (ex. materiale din

cauciuc, plastic, echipament electronic etc);

· este exploziv (pentru evitarea exploziei, de ex. utilizăm etilenoxidului în camere speciale, cu

presiune negativă);

· pentru siguranţă trebuie respectate toate recomandările producătorului;

· există inconveniente (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc);

· sterilizarea este influenţată de concentraţie, temperatură, umiditatea relativă şi timpul de expunere

(o dublare a concentraţiei reduce la jumătate timpul necesar).






1. http://www.microrao.com/micronotes/sterilization.pdf

2. http://www.cdc.gov/hicpac/disinfection_sterilization/13_10othersterilizationmethods.html

3. http://www.ific.narod.ru/Manual/Clean.htm

4. http://www.health.qld.gov.au/endoscopereprocessing/module_2/2_1.asp

5. http://generalbacteriology.weebly.com/sterilization-and-disinfection.html

6. http://www.diffen.com/difference/Disinfect_vs_Sterilize


În urma infectării unei plăgi abdominale cu Mycobacterium chelonae (după o liposucţie), a fost

declanşată o investigaţie. Liposucţia a fost realizată în ambulatoriu (realizată sub anestezie locală).

Investigaţiei a încercat să determine dacă au avut loc şi alte cazuri de infecţii cu mycobaterii ”atipice”,

anterior liposucţiei, în respectivul cabinet medical.

M. chelonae este răspândit în sol și apă, inclusiv în apa de la robinet. În literatură au mai fost raportate

infecții ale pielii și țesuturilor moi, inclusiv infecţii după intervenţii chirurgicale cosmetice. Sursa posibilă

a infecţiei raportate putea fi contaminarea echipamentelor şi/sau dezinfectarea sau sterilizarea lor

inadecvată. S-a descoperit că în acest caz canulele de liposucţie au fost clătite cu apă de la robinet şi

unele echipamente au fost dezinfectate cu soluție cuaternară de amoniu. Investigaţia a arătat că în acel

cabinet medical existau nereguli în curățarea corespunzătoare, dezinfecția și sterilizarea

echipamentelor de liposucţie. Cu excepția medicului, întreg personalul din cabinet lucra fară licență.

Atât asistenții medicali cât şi restul personalului fuseseră instruiţi pentru curățarea și sterilizarea

echipamentelor de liposuctie dar nu existau protocoale scrise pentru sterilizarea în autoclav a

materialelor reutilizabile şi nici nu era ţinută evidenţa utilizării acestuia. În plus, nu se foloseau

controale biologice pentru verificarea bunei funcţionări a autoclavului aşa cum stipulau instrucţiunile

producătorului. Cabinetul nu avea protocoale scrise de dezinfecţie şi sterilizare. Asistentele amestecau

ce rămânea în sticluţe mici de povidonă iodată şi apoi foloseau amestecul pus într-o sticlă mare. De

asemenea foloseau tampoane de vată înmuiate în alcool şi ţinute într-un recipient în loc de tampoane

ambalate individual. O altă neregulă identificată a fost utilizarea soluției de alcool izopropilic 70%

dintr-o sticlă nesterilă deschisă, în locul unei soluții sterile de irigare, pentru a curăţa canula de

liposucţie, mai exact pentru a disloca ţesutul de pe ea în timpul liposucţiei.

Ancheta epidemiologică nu a mai descoperit şi alte cazuri de infecţii cu micobacterii ”atipice” în acest

cabinet. Testele de laborator efectuate pe probe de apă de la robinet şi aer din sistemul de ventilaţie

au fost negative pentru M. chelonae. În acestă situaţie cabinetul nu a putut fi incriminat pentru

îmbolnăvirea pacientei.

S-a recomandat implementarea unor protocoale corecte pentru curăţare, sterilizare şi dezinfecţie,

conform indicaţiilor producătorilor. S-a recomandat utilizarea unor controale biologice pentru

verificarea bunei funcţionări a autoclavului. Cadrelelor medicale fară licență le-a fost suspendat dreptul

de practică. Cabinetul a fost închis până la remedierea neregulilor.

2. 7. De reținut

În orice laborator trebuie să existe protocoale scrise ale procedurilor de sterilizare şi dezinfecţie.

Laboratoarele trebuie să fie afiliate la un sistem de control şi management al bolilor infecţioase şi toţi

care lucrează în laborator trebuie să cunoască modul de funcţionare al sistemelor de sterilizare, al

autoclavului şi a substanţelor dezinfectante.


1. Sterilizarea distruge:

A. Agenţii patogeni

B. Agenţii nepatogeni

C. Formele vegetative

D. Sporii

E. Endosporii

2. Dezinfecţia:

A. Reprezintă distrugerea formelor vegetative bacteriene

B. Reprezintă distrugerea tuturor sporilor

C. Este eficientă independent de cantitate

D. Se realizează cu ajutorul substanţelor dezinfectante

E. Este eficientă independent de timp

3. Prin autoclavare se sterilizează:

A. Articole de cauciuc

B. Medii de cultură

C. Diferite substanţe în soluţie

D. Pipete şi lame

E. Materiale contaminate din laborator

4. Iodoforii:

A. Sunt substanţe care eliberează iodul în soluţii apoase

B. Nu inhibă sinteza proteică

C. Au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă

D. Au efect asupra unor spori bacterieni

E. Nu pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor

5. Următoarele afirmaţii sunt corecte:

A. Autoclavarea se realizează la otemperatură de 121°C timp de 15 minute

B. Tindalizarea se realizează la 100°C, 30 minute, 3 zile consecutive

C. Septic înseamnă neinfectat

D. Aseptic înseamnă infectat cu agenţi nepatogeni

E. Agentul bacteriostatic este un agent care distruge bacteriile


1. Argintul are proprieţi antimicrobiene. O monedă de argint pusă în mediu de cultură inoculat va

inhiba creşterea bacteriană.

2. Clorura de mercur este bactericidă dar este inactivată de materia organică.

3. Afumarea este o metodă de sterilizare foarte eficientă.

4. Fierberea timp de 10 minute distruge sporii.

5. Radiaţiile ultraviolete pot produce leziuni la nivel ocular.

3. Schema generală a diagnosticului de laborator

microbiologic. (Gabriela-Loredana Popa, Loredana-

Sabina Manolescu) 3. 1. Cuvinte cheie

· Recoltare și Transport

· Produse patologice

· Antibiogramă

· Diagnostic direct

· Diagnostic indirect

3. 2. Introducere

Diagnosticul de laborator în microbiologie este un diagnostic complex și este diferit funcție de agentul

patogen ce trebuie identificat. Astfel diagnosticul de laborator în microbiologie poate

fi direct (urmărește identificarea agentului patogen direct din produsul patologic), bacteriologic,

micologic, parazitologic, virusologic; poate fi indirect (urmărește evidenţierea răspunsului imun la

acțiunea agentului patogen), sau poate fi o ”combinaţie” între cele două (direct şi indirect).

Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respectă un algoritm general, logic, aplicat pentru

fiecare microorganism în parte. Înainte de a începe aceste etape este necesară o suspiciune de

diagnostic bazată pe examenul clinic obiectiv și anamneză. Coroborarea acestor informații obiective și

subiective primite de la pacient cu informații concrete provenite din cunoașterea patologiei infecțiilor

bacteriene pot direcționa tipul de diagnostic de laborator ce trebuie efectuat.

3. 3. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic

Acest tip de diagnostic cuprinde 5 etape, există însă și excepții (de exemplu în cazul diagnosticului

bacteriologic al infecțiilor cu Treponema pallidum se realizează numai primele două etape). Iată care

sunt cele 5 etape.

3. 3. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (p.p.) urmează câteva reguli pe care este

foarte bine să le rețineți în această succesiune:

· Se recoltează p.p. în care avem cele mai mari șanse să decelăm agentul etiologic (ex. urină într-o

infecție urinară, LCR în meningită etc);

· Recoltarea se realizează rapid și cât mai aproape de debutul simptomatologiei, înainte de a administra

antibiotice, prin manevre aseptice bine determinate, corecte (vezi capitolul 4);

· După recoltare se va eticheta corespunzător recipientul care conține p.p.;

· Transportul p.p. se realizează cât mai rapid posibil, uneori este indicat să se folosească și mediu de

transport (dacă se depășește un anumit timp); temperatura de transport se stabiliște în funcție de tipul

produsului patologic (vezi capitolul 4) și este în cele mai multe cazuri scăzută (container izoterm 0-

4ºC); poate fi și o temperatură crescută (ex. 37°C);

· La recoltarea p.p. se va completa un formular specific care să conțină următoarele informații: numele,

prenumele, vârsta pacientului, data şi locul recoltării (+ ora recoltării), diagnosticul prezumtiv, natura

p.p., analiza solicitată, data debutului bolii, ce medicaţie antimicrobiană a fost administrată

respectivului pacient, cine şi cum a făcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.

Nerespectarea tuturor acestor reguli poate justifica respingerea p.p.

3. 3. 2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologicrămâne o etapă foarte

importantă, chiar și după apariția tehnicilor moderne.

3. 3. 2. 1. Examinarea macroscopică a p.p. poate orienta etapele ce urmează dar există şi situaţii în

care nu aduce informaţii importante.

3. 3. 2. 2. Examinarea microscopică a p.p. reprezintă uneori o etapă orientativă, utilă dar există

situaţii în care reprezintă o etapă esenţială (ex. în gonoree sau în meningita cu meningococ).

Recomandăm realizarea a minim 2 frotiuri din p.p. Un frotiu va fi colorat cu albastru de metilen (AM) şi

al doilea prin metoda Gram. În cazul în care p.p. se recoltează mai dificil se recomandă realizarea a 3

frotiuri. în suspiciunea de tuberculoză (TB) se realizează minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram şi Ziehl-

Neelsen. Iniţial frotiul se examinează cu obiectivul 40x pentru o analiză mai generală şi pentru

stabilirea câmpului microscopic sau al zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se vor evidenţia

celulele din ţesutul respectiv (normale sau patologice), celulele inflamatorii (ex. PMN) şi prezenţa

microorganismelor (interpretarea poate fi realizată în funcţie de experienţă). (Figurile nr. 1-3)

Există şi situaţii în care din p.p. se realizează preparate native (între lamă şi lamelă) în loc de frotiuri

fixate şi colorate, de exemplu când p.p. este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale. În cazul în

care p.p. este reprezentat de materii fecale, se realizează coprocitograma (se caută leucocite şi alte

structuri sugestive). În cazul în care p.p. este reprezentat de urină, se va realiza sedimentul urinar (după

centrifugare), şi se va examina între lamă şi lamelă pentru evaluarea prezenţei şi numărului de

PMN/câmp, prezenţei unor celule normale sau patologice, prezenței altor structuri (ex. cristale de

oxalat, citrat, cilindrii leucocitari etc. (Figurile nr. 4-5)

În infecţiile micotice se realizează de asemenea preparate proaspete (ex. preparatul în soluţie de KOH-

glicerol 10-20%, KOH poate dizolva keratina care mascheză prezenţa fungilor), precum şi frotiurile

colorate. (Figurile nr. 6-7)

3. 3. 3. Cultivarea pe medii de cultură a p.p. se face în funcţie de situaţie (agent etiologic presupus)

respectând condiţiile de creştere ale bacteriei respective (ex. aerobioză sau anaerobioză, o anumită

temperatură, un anumit mediu de cultură).

Cultivarea se realizează prin punerea (însămânțarea) p.p. în care se presupune existenţa bacteriei, pe

un mediu de cultură adecvat, într-un incubator, la o temperatură de 35-37ºC. Pentru fungi trebuie

utilizate mediile potrivite creşterii fungilor şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul

bacteriilor (28ºC). Scopul cultivării este obţinerea unor colonii izolate (prin „însămânţare în

poligon”,(Figura nr. 8) în care să crească doar agentul etiologic incriminat în afecţiunea studiată şi

respectiv obţinerea unei culturi pure, pentru identificare.

3. 3. 4. Identificarea agentului etiologic se realizează numai pornind de la colonii izolate , în baza

caracterelor specifice fiecărei bacterii, după cum urmează.

3. 3. 4. 1. Caractere morfologice

Din colonia izolată se va realiza un frotiu; acesta va fi colorat Gram sau Ziehl-Neelsen (după caz);

examenul microscopic va evidenţia forma, dimensiunile şi tinctorialitatea (culoarea) bacteriilor din

colonie. De obicei bacteriile studiate la microscop sunt similare şi au caracteristici comune pe frotiul

examinat dar există situaţii în care pe frotiu se pot observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte

cocobacilare până la forme filamentoase (ex. bacterii cu polimorfism, cum ar fi Proteus spp.). În cazul

levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, de dimensiuni mai mari. (Figura nr. 9-11)

3. 3. 4. 2. Caractere de cultură

Sunt caracterele în urma cărora se poate realiza identificarea preeliminară. Se vor examina coloniile

izolate apărute pe mediile de cultură şi se va caracteriza aspectul morfologic (forma, dimensiunea,

marginile, culoarea coloniei). Coloniile pot fi de tip S pentru levuri și majoritatea bacteriilor studiate, de

tip R (ex. Mycobacterium tuberculosis şi Bacillus anthracis) sau de tip M (la bacterii capsulate,

ex. Klebsiella pneumoniae) şi respectiv un aspect pufos în cazul mucegaiurilor. Pentru mediile lichide se

va examina tipul de creştere, modul în care tulbură mediul sau se sedimentează. (Figurile nr. 12-16)

3. 3. 4. 3. Caractere biochimice (sau metabolice)

Aceste caractere sunt foarte utile în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a

„mediilor multi-test” permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, citrat, etc)

şi pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta. (Figura nr. 13) De asemenea se pot evidenţia

producerea de pigment endogen sau exogen sau producerea de hemolizine pe agar sânge şi tipul de

hemoliză. (Figurile nr. 14-15)

În cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.

3. 3. 4. 4. Caractere antigenice

Caracterele antigenice pot fi evidenţiate datorită structurii antigenice a bacteriilor + capacităţii Ag de a

cupla anticorpi (Ac) specifici pereche (reacţiile Ag-Ac) (vezi cap. 9). Se utilizează Ac cunoscuţi pentru a

identifica Ag necunoscute. Reacţiile Ag-Ac folosesc principii simple în care una din componente e

cunoscută şi cealaltă necunoscută. Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea directă pe lamă, aglutinarea

indirectă, coaglutinarea, etc. Sunt tehnici comerciale accesibile şi eficiente, sau tehnici in house. De

exemplu, prin reacţii de aglutinare directă se pot identifica Ag din genul Shigella, Salmonella, iar prin

reacţii de aglutinare indirectă se pot detecta în p.p. streptococii de grup A sau B etc. Aceste teste se

folosesc și pentru detectarea unor Ag fungice (ex. Cryptococcus neoformans, Candida

albicans, Aspergillus spp).

3. 3. 4. 5. Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentru S. aureus)

Caracterele de patogenitate evidenţiază capacitatea bacteriilor de a declanşa în organismul gazdă

fenomene morbide. Patogenitatea este un atribut de specie şi este determinată genetic. De exemplu

bacteriile pot elabora anumite substanţe cum ar fi coagulaza (o enzimă produsă de Staphylococcus

aureus) care produc fenomene patogene (in acest caz coagulaza produce coagularea plasmei). (Figura

nr. 16)

Prin inocularea unei bacterii patogene la animalul de laborator se poate declanşa infecţia

experimentală evidenţiind caracterul de patogenitate al respectivei bacterii.

3. 3. 4. 6. Lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specifici)

Bacteriofagii (fagii) sunt virusuri care parazitează bacteriile. Au fost descoperiţi în 1915. Lizotipia

reprezintă stabilirea sensibilităţii la un anumit bacteriofag şi este una dintre cele mai fine metode de

identificare (inclusiv din rațiuni epidemiologice, ex. pentru determinarea originii unei epidemii).

3. 3. 5. Antibiograma (respectiv antifungigrama) reprezintă testarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice anti-bacteriene / respectiv anti-fungice, în vederea alegerii tratamentului etiologic

corect. Se realizează cel mai frecvent prin metode difuzimetrice. În anumite situaţii (ex. în infecţii grave,

la pacienți care au o capacitate de apărare redusă, în infecții cu bacterii care au potențial ridicat de

rezistență la antibiotice și chimioterapice) se vor efectua şi alte determinări, de ex. determinarea

concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi concentraţiei minime bactericide (CMB).

În infecţii cu potenţial fatal este necesară determinarea eficienţei antibioticului utilizat, respectiv

stabilirea nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB).

3. 4. Diagnosticul de laborator imunologic (serologic şi / sau imunobiologic)

3. 4. 1. Diagnosticul serologic urmăreşte determinarea prezenţei Ac necunoscuţi, din serul

pacientului, utilizând Ag cunoscute. Se bazează pe specificitatea reacţiilor Ag-Ac. În vederea

identificării unei infecţii acute, se determină anticorpii specifici de tip IgM. În vederea identificării unei

foste infecţii sau unei infecții cronice se determină (de regulă) Ac specifici de tip IgG. În unele situaţii

este necesar doar un test calitativ, ce va determina prezenţa sau absenţa tipului de anticorpi dar în alte

situaţii este necesară testarea cantitativă pentru a determina titrul (”concentraţia”) de Ac din serul

pacientului. Tot cu ajutorul acestor teste cantitative vom analiza evoluţia titrului de anticorpi în

dinamică. În acest sens se vor realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10 zile; astfel

putem să diferenţiem o afecţiune acută (titrul Ac este mai crescut la a doua determinare, în mod clasic

de 4 ori), de o afecţiune în covalescenţă (titrul Ac la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de o

afecţiune cronică (titrul Ac va fi asemănător sau foarte apropiat la cele două determinări succesive).

(Figura nr. 17)

3. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic evidenţiază răspunsul imun celular, de exemplu reactivitatea

pacientului faţă de un anumit Ag. Intradermoreacţia la tuberculină (IDR cu PPD/derivat proteic

purificat), reprezintă un exemplu în acest sens. (vezi cap. 11)






1. http://www.idsociety.org/uploadedFiles/IDSA/Guidelines-

Patient_Care/PDF_Library/Laboratory%20Diagnosis%20of%20Infectious%20Diseases%20Guideline.pdf

2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8014/

3. http://www.chop.edu/service/laboratories/explore-chop-labs/labs-microbiology/home.html

4. http://www.cdc.gov/meningitis/lab-manual/chpt05-collect-transport-specimens.pdf

5. https://www.boundless.com/microbiology/immunology-applications/preparation-for-diagnosing-

infections/specimen-collection/

6. http://www.atousante.com/risques-professionnels/risques-infectieux/tuberculose/intradermo-reaction-

idr/


Începând cu 30 decembrie 2012, în 19 state din America a fost raportat un total de 35 pacienţi infectaţi

cu o tulpină de Escherichia coli producătoare de toxină Shiga (STEC O:121 ). 82 % din pacienţi aveau în

jur de 21 de ani sau mai puţin şi 31 % au fost spitalizaţi. Doi din cei 35 pacienţi au dezvoltat

un sindrom hemolitic uremic (SHU) şi insuficienţă renală (IR) dar nu au fost raportate

decese. Sursa acestei epidemii a fost un lot de produse alimentare congelate. Firma producătoare a

retras de pe piaţă toate produsele care puteau fi contaminate, adică produse alimentare congelate

produse în perioada 1 iulie 2011 si 29 martie 2013, din cauza unei posibile contaminări cu E.

coli O:121.Produsele retrase aveau date de expirare cuprinse între 1 ianuarie 2013 şi 29 septembrie

2014. Datorită acestui fapt, deşi epidemia a fost stopată, există oricând posibilitatea unei recurenţe,

deoarece unele produse ar putea fi încă în congelatoarele populaţiei. S-a recomandat consumatorilor

să verifice congelatoarele și nu mănânce produsele din loturile retrase. Recomandarea vizează în

special copii sub 5 ani, adulții peste 60 de ani și persoanele cu imunodeficienţă, deoarece aceste

persoane sunt mult mai susceptibile să dezvolte o complicaţie. E. coli încă reprezintă o cauză

importantă de îmbolnăvire în Statele Unite ale Americii.

Inițial pacienţii infectaţi cu această tulpină au prezentat crampe abdominale şi diaree hemoragică la

aproximativ 3 sau 4 zile după ingestia produselor contaminate. Perioada de stare a fost în jur de o

săptămâmă pentru cazurile uşoare sau mai mult pentru cele complicate cu IR. Persoanele cu risc

crescut pentru SHU şi IR sunt copii sub 5 ani, adulții peste 60 de ani și persoanele cu imunodeficienţă.

Simptomele de SHU includ febră, dureri abdominale, paloare, oboseală şi iritabilitate, vânătăi mici,

sângerări inexplicabile din nas si gură și disurie. Toate persoanele care prezintă aceste simptome

trebuie să solicite imediat asistență medicală de urgență.

Diagnosticul de laborator microbiologic a pornit de la recoltarea produsului patologic cel mai

potrivit şi cu şansele cele mai mari de a conţine bacteria incriminată în simptomatologia descrisă şi

anume un eșantion de materii fecale, însă nu toate laboratoarele pot efectua acest tip de diagnostic,

mai ales dacă se urmăreşte identificarea E. coli O:121. Pentru a dovedi că pacienţii au fost contaminaţi

cu STEC O:121 din produse alimentare congelate, au fost testate şi produsele alimentare consumate de

cei ce prezentau simptomatologia aferentă. De asemenea pacienţii au fost intervievaţi de către

persoane abilitate pentru a obține informații cu privire la alimentele pe care le-ar fi mâncat și alte

expuneri în săptămâna de dinainte de boală. 24 pacienţi au raportat consumul produselor alimentare

congelate iar tulpina epidemică STEC O:121 a fost identificată în două produse congelate colectate din

congelatoarele a doi pacienţi din New York și Texas. Identificarea tulpinii epidemice STEC O:121 a fost

posibilă numai datorită coroborării analizelor efectuate de mai multe organisme epidemiologice şi

laboratoare: CDC (Centre for Disease Control and prevention), oficiali din domeniul sanătăţii publice

din mai multe state americane, Departamentul Agriculturii pentru Siguranța Alimentară din SUA și de

Serviciul de Control al alimentelor şi medicamentelor (Food and Drug Administration / FDA).

Investigatorii au folosit teste de biologie moleculară. Au fost folosite de asemenea date provenite de la

PulseNet, o rețea internațională (care efectuează supravegherea moleculara a infecţiilor alimentare).

3. 7. De reținut

Colaborarea între departamente este esenţială pentru succesul dignosticului de laborator microbiologic.

Corelarea noțiunilor învățate în capitolele 1-8 și respectiv 9-11 au utilitate nu doar pe parcursul pregătirii

academice de microbiologie, dar și în viața de zi cu zi.


1. Care din următoarele sunt etape ale diagnosticului de laborator microbiologic:

A. Recoltarea şi transportul p.p.

B. Examinarea macro şi microscopică a p.p.

C. Cultivarea p.p.

D. Identificarea agentului etiologic

E. Antibiograma

2. Din următoarele p.p. se realizează preparate native și nu frotiuri colorate:

A. Sânge

B. Urină

C. Materii fecale

D. Puroi

E. Spută

3. Caracterele de patogenitate evidenţiază:

A. Capacitatea bacteriilor de a declanşa fenomene morbide

B. Capacitatea bacteriilor de a declanşa incapacitatea funcțională

C. Un atribut de specie

D. Determism genetic

E. Virulenţa.

4. Antibiograma

A. Reprezintă testarea sensibilităţii la antibiotice

B. Se realizează prin metode difuzimetrice

C. Evidenţiază CMB

D. Evidenţiază CMI

E. Evidenţiază NEI

5. Diagnosticul imunobiologic

A. Evidenţiază răspunsul imun celular

B. Evidenţiază reactivitatea pacientului faţă de un anumit Ag

C. Reprezintă intradermoreacţia la tuberculină

D. Urmăreşte determinarea prezenţei anticorpilor (Ac) necunoscuţi

E. Se bazează pe specificitatea reacţiilor Ag-Ac


1. După spălare pe mâini cu săpun obişnuit sau săpun antibacterian vom obţine prin cultivare pe medii de cultură

un număr similar de colonii bacteriene

2. Fixarea frotiurilor ne protejază deoarece omoară bacteriile.

3. Toate bacteriile cresc iniţial sub formă de colonii de tip S.

4. Un test IDR cu PPD negativ exclude un diagnostic pozitiv de TB.

5. Prezenţa anticorpilor de tip IgG semnifică întotdeauna cronicizare.

4. Prelevarea şi transportul produselor patologice. (MI

Popa, Violeta Cristea, Gabriela-Loredana Popa) 4. 1. Introducere și cuvinte cheie

· Recoltare

· Transport

· Produs patologic (p.p.)

· Stabilitate

· Medii de transport

Recoltarea (prelevarea) şi transportul p.p. este o etapă esenţială. Personalul din laborator îşi

concentrează atenţia asupra prelucrării corespunzătoare a probelor primite la laborator dar ceea ce se

întâmplă înainte ca proba să ajungă la laborator este cel puţin la fel de important în obţinerea unui

rezultat corect.

Există o serie de reguli care, respectate riguros, permit obţinerea rezultatelor dg. şi vindecarea

pacientului.

4. 2. Condiţii generale legate de recoltarea şi transportul p.p.

· Instrucţiunile de recoltare şi condiţiile de transport ale p.p.trebuie întocmite de catre medicşi

transmise ulterior persoanelor implicate - asistentelor de recoltare, respectiv pacienţilor în cazul

probelor recoltate la domiciliu. Recoltarea p.p. prin mijloace invazive (LCR, aspiratul bronho-alveolar,

aspirat medular) este efectuată strict de către medic.

· Prelevarea p.p. trebuie să aibă loc înainte ca pacientul să primească antibiotice sau chimioterapice

(nerespectarea acestei reguli, foarte frecventă din păcate, constituie o problemă semnificativă în

diagnostic şi permite selecţia de microorganisme rezistente; chiar şi în cazul unei boli grave,

ameninţătoare de viaţă, este suficient timp pentru recoltarea p.p. înainte de administrarea

medicamentului). În cazul pacienţilor transferaţi între diferite unităţi spitaliceşti (pacienți care au primit

antibiotice) recoltarea p.p. se face înaintea dozei următoare în aşa fel încât în momentul recoltării

cantitatea de antibiotic din organism să fie cât mai mică.

· Recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze cât mai rapid, în momentul optim (ex. frisonul

şi accesul febril „dictează” recoltarea sângelui pentru hemocultură).

· Produsul patologic din care am putea izola agentul etiologic poate fi reprezentat de o secreţie de

la nivelul porţii de intrare (ex. secreţie nazală/faringiană în difterie sau secreție din plagă în infecţii

stafilococice), un produs de la nivelul căilor de eliminare din organism (ex. urină în infecţiile tractului

urinar/ITU) etc.

· Din p.p. se vor preleva fragmentele sau părţile reprezentative, din care avem cea mai mare şansă

de izolare a germenilor (ex. zonele cu mucus şi puroi, din materiile fecale).

· Trebuie să recoltăm o cantitate de p.p. suficientă pentru efectuarea diagnosticului, în condiţii de

asepsie (nu trebuie infectat pacientul, nu trebuie să ne infectăm, nu trebuie să contaminăm p.p.)

respectând precauţiunile universale.

Aceste reguli este bine să fie cunoscute de toţi cei care formează comunitatea din sistemul sanitar, dar,

unele dintre recomandări sunt uşor de înţeles şi de aplicat chiar şi de persoanele fără o pregătire

medicală. Mai trebuie subliniat că:

· Instrumentele pentru recoltare trebuie să fie sterile şi adecvate tipului de recoltare efectuată (ex.

tampon cu alginat de calciu şi nu cu vată pentru recoltarea de secreţii în care se presupune

prezenţaBordetella pertussis).

· Recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie marcate corespunzător, iar datele de

identificare să fie riguros consemnate în registre/sistem „electronic”, formulare şi buletine de analiză

pentru a evita erori care pot fi dramatice (este cunoscut exemplul unui transplant de organe de la un

pacient HIV pozitiv, în Italia, 2007, situaţie care a fost identificată numai după ce transplantul a avut loc

la trei receptori, pentru că pe buletinul de analiză a apărut „HIV negativ”, printr-o eroare de notificare).

· Proba se trimite la laborator însoţită de o trimitere pe care se notează datele de identificare ale

pacientului, diagnosticul prezumtiv, tip de produs patologic şi determinările solicitate.

Produsele patologice trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt timp posibil. Dacă în anumite

situaţii (microorganismului nu rezistă în mediul exterior) recomandăm recoltarea şi prelucrarea p.p. “la

patul bolnavului”.Probele recoltate pe recipiente fără mediu de transport au o stabilitate de 1-2 ore de

la recoltare iar folosirea recipientelor adecvate cu mediu de transport creşte această stabilitate la 24-48

de ore. Mediile de transport cel mai frecvent folosite în bacteriologie sunt Amies, Cary Blair şi Stuart.

Pentru urină există o posibilitate de „conservare”, la rece, prin menţinerea la temperatura de +4ºC.

4. 3. Exemple de recoltare şi transport pentru principalelep.p.

4. 3. 1. Exsudatele otice, conjunctivale sau nazale

· pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină (preferabil lumina naturală);

· utilizăm tampoane cu vată sterile (1 tampon pentru frotiu, 1 tampon pentru însămânţare);

· tamponul se încarcă bine cu p.p. iar prelucrarea trebuie făcută imediat; dacă nu este posibil,

folosim un mediu de transport.

4. 3. 2. Exsudatul faringian

· se recoltează preferabil dimineaţa (pacientul nu mănâncă, nu bea, nu se clăteşte, nu se spală pe

dinţi); stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină şi gâtul în uşoară extensie;

· ne aşezăm puţin lateral faţă de pacient (ca să nu fim infectaţi şi chiar şi în aceste condiţii trebuie să

purtăm mască şi ochelari);

· apăsăm baza limbii, examinăm faringele posterior, pilierii, amigdalele şi recoltăm secreţia (fără a

atinge baza limbii sau palatul moale), în special din zonele cu puroi; utilizăm tampoane cu vată

obişnuite (folosim 1 tampon pentru frotiu şi 1 tampon pentru cultivare);

· cel mai bine utilizăm p.p. imediat, în cel mult 1-2 ore (sau folosim mediu de transport).

4. 3. 3. Sputa

· sputa, recoltată „pe căi naturale”, după tuse şi expectoraţie, este un p.p. contaminat;

· p.p. care permit evitarea contaminării orofaringiane sunt aspiratul transtraheal, transtoracic şi

bronhoscopic (prin cateter protejat, lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronşică, biopsie pulmonară pe

torace deschis etc); se pot face şi hemoculturi;

· sputa rămâne un p.p. frecvent recoltat; pacientul trebuie să înţeleagă diferenţa dintre "a

expectora" şi "a tuşi şi scuipa"; înaintea recoltării se recomandă periajul dinţilor, clătirea gurii şi gargara

cu soluţie salină fiziologică;

· dacă proba este în principal din salivă, trebuie să solicităm imediat prelevarea unei noi probe (ex.

mucopurulentă, în cantitate de 2-3 ml, cel puţin);p.p. ar trebui prelucrat în maxim 1-2 ore (nu se

recomandă utilizarea mediilor de transport).

4. 3. 4. Puroiul

· puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologică, pipeta Pasteur, cu o spatulă, prin biopsiere etc.,

sau, prin puncţie şi aspirare (folosim tampoane cu mediu de transport doar când transportul către

laborator depăşeşte 1-2 ore);

· când suspicionăm o infecţie cu microorganisme anaerobe recoltăm şi transportăm cel puţin în

seringa care se “închide” cu dop prin care nu trece oxigenul sau transportul către laborator se va

realiza utilizând medii de transport sau containere specialepentru asigurarea condiţiilor

de anaerobioză(Figura nr. 1).

4. 3. 5. Materiile fecale

· în multe dintre infecţiile însoțite de sindrom diareic, utilizăm coprocultura;

· se pot recolta scaunul emis spontan (m. f. sunt eliminate într-un recipient de carton sau într-un

container din material plastic de unică întrebuinţare; utilizăm pentru prelevare linguriţa recoltorului

alegând fragmente mucopurulente, porţiuni cu sânge etc., în cantitate de circa 1 gram, suspensionat în

mediul de transport), tamponul rectal (în cazul unei infecţii cronice cu Shigella spp., atunci când

suspicionăm portajul deShigella spp. sau Salmonella spp.) sau putem utiliza sonda Nelaton (când

urmărim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid);

· în cazul în care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau în maxim 1 oră, utilizăm mediul de transport

(Cary-Blair) sau transportul la rece (+4ºC); se asigură supravieţuirea enterobacteriilor patogene timp de

24-48 de ore, inhibând în acelaşi timp multiplicarea florei de asociaţie; în suspicionareaV. cholerae, apa

peptonată alcalină este în acelaşi timp mediu de transport şi mediu de îmbogăţire.

4. 3. 6. Urina

· colonizarea microbiană a uretrei distale explică motivul pentru care de regulă realizăm urocultura

cantitativă; atunci când demonstrăm prezenţa a 105 bacterii/ml, este o infecţie a tractului urinar (ITU)

în aproximativ 80% dintre cazuri;

· dacă nu putem recolta prima urină de dimineaţă, aşteptăm 3-4 ore după micţiune;

· recoltarea se realizează după igiena organelor genitale şi a perineului, într-un recipient steril (Figura nr.

2) atunci când proba poate fi dusă către laborator în mai puţin de 2 ore sau într-un recipient special ce

conţine acid boric şi menţine stabilitatea probei 24 ore la temperatura camerei (Figura nr. 3). Erorile de

recoltare şi nerespectarea timpului de transport vorconduce la rezultate eronate);

· recoltăm urina “din mijlocul jetului” (prin micţiune se elimină circa 100 ml urină, îndepărtând o parte a

germenilor de la nivelul uretrei distale, apoi se recoltează 20-50 ml urină în recipient steril, după care

micţiunea continuă;

· există şi alte tehnici de recoltare (ex. puncţie şi aspiraţie suprapubiană);

· după recoltare pe recipientul fără conservant, în cazul în care urina nu este prelucrată imediat p.p.

trebuie menţinut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4°C.

4. 3. 7. Sângele

· se recomandă recoltarea a minim 2, preferabil 3 probe de sânge, în momente diferite, pe parcursul a

24 de ore;

· deoarece numărul de unităţi formatoare de colonii (UFC)/ml de sânge este redus, trebuie să recoltăm

un volum de sânge adecvat (circa 20 ml de sânge la adulţi şi 1-5 ml de sânge la nou-născuţi, sugari şi

copii mici);

· în sânge pot exista factori antimicrobieni (diminuăm impactul acestora prin diluarea 1/10 a sângelui

cultivat în raport cu volumul mediului de cultură);

· folosim medii de cultură lichide, îmbogăţite, în condiţii de incubare potrivite.

4. 3. 8. Lichidul cefalo-rahidian

· se recoltează în cazul suspicionării unui sindrom meningean; suspiciunea poate fi ridicată şi de un

student bine pregătit sau de un tânăr medic, dar examenul clinic trebuie executat şi de medicul de

specialitate (boli infecţioase, neurologie etc); recoltarea se face la patul bolnavului de exemplu prin

puncţie lombară în condiţii de strictă asepsie;

· recoltăm 5-10 ml LCR în 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi supuse centrifugării iar din al 3-lea tub

realizăm teste biochimice);

· LCR trebuie prelucrat imediat, prelucrarea p.p. trebuie să înceapă “la patul bolnavului”;

· dacă transportul nu poate fi evitat, trebuie să se facă foarte rapid, la o temperatură apropiată de

temperatura corpului uman (nu la +4ºC).

4. 3. 9. Secreţiile recoltate de la nivelul aparatului genital

În cazul secreţiei uretrale, la bărbat

· recoltarea p.p. trebuie să se facă dimineaţa, înainte de micţiune, sau la cel puţin 2 ore după

aceasta; sunt necesare tampoane de vată sterile (un tampon pentru examenul microscopic şi al doilea

pentru cultivare); se observă penisul şi meatul urinar precum şi dacă există secreţie uretrală; dacă există

secreţie uretrală, aceasta este recoltată cu tamponul;

· în cazul în care nu se evidenţiază spontan secreţia uretrală în mod, cu mâna protejată de o

mănuşă, exprimăm uretra utilizând degetul mare şi indexul şi recoltăm secreţia care apare;

· dacă nici aşa nu putem obţine p.p. recurgem la recoltarea intrauretrală; sunt necesare tampoane

de dimensiuni mai mici (din alginat de calciu sau dacron); după introducerea blândă (circa 2 centimetri,

cu rotire intrauretral) a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ 1 centimetru mai

profund;

În cazul secreţiilor cervicale, la femei recoltarea se face preferabil în primele 10 zile după ciclu, pe masa

ginecologică, după introducerea valvelor şi examinarea vizuală a vaginului şi colului uterin; dacă se

remarcă o secreţie purulentă, cu ajutorul unor comprese sterile se îndepărtează secreţia de la nivelui

colului extern; folosim 3 tampoane sterile introduse şi rotite uşor 1-2 centimetri, în colul uterin (2

dintre tampoane le transferăm pe frotiuri, al treilea pentru cultivare);

· în suspiciunea de gonoree se recomandă cultivarea imediat după recoltare pe mediul de cultură

încălzit la 37ºC; în cazul în care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi transmis

laboratorului în mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante

pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.)

4. 3. 10. Diferite p.p. recoltate în suspiciunea unor infecţii fungice

· în cazul leziunilor umede şi inflamate de la nivelul mucoaselor sau din zonele pliurilor (axilar,

mamar, crural) recoltarea se face cu ajutorul tampoanelor 1 tampon pentru frotiu şi 1 tampon pentru

cultivare);

· în micozele cutanate superficiale, raclăm tegumentul şi utilizăm pentru examinare scuamele

produse; în cazul leziunilor multiple se alege pentru recoltare un element recent, scuamele vechi în

curs de detaşare fiind de cele mai multe ori improprii pentru diagnostic;

· împachetăm scuamele în hârtie sterilă care se introduce într-o cutie Petri şi se trimite pentru

prelucrare şi examinare în laborator (în maxim 48 de ore);

· în micozele profunde, în funcţie de localizare, recoltăm p.p. şi îl transmitem către laborator având

grijă să prevenim deshidratarea produsului;

· se recomandă prelucrarea şi examinarea imediată (unii fungi sunt fragili); dacă recomandarea nu

poate fi respectată, adăugăm penicilină, streptomicină şi cloramfenicol pentru inhibarea multiplicării

bacteriene şi menţinem p.p. la +4ºC.






1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3892603/

2. http://cid.oxfordjournals.org/content/54/suppl_2/S140.full

3. http://www.ijmm.org/article.asp?issn=02550857;year=2006;volume=24;issue=4;spage=249;epage=2

51;aulast=Marais


5. http://vdi.sagepub.com/content/23/1/95.long


Un bărbat în vârstă de 69 de ani se prezintă la medic (în serviciul ambulatory). El prezintă de 10

zile stare generală alterată, debut brusc cu febră, durere la nivel faringian și artralgii la nivelul

genunchiului drept.Antecedentele personale arată un istoric de lobectomie pulmonară dreaptă (s-a

extirpat lobul superiordatorită unui carcinom pulmonarcu celule scuamoase; cu un an mai devreme).

Pacientul declară că în urmă cu doua săptămâni a avut un contact sexual neprotejat şi că a folosit

(automedicaţie) de 5 zile Levofloxacindar starea generală nu s-a ameliorat.

La examenul clinic pacientul a prezentat TA = 149/83 mmHg, AV = 98 de bătăi /

min.puls regulat, saturația în oxigen 96% şi temperatură de 37,9ºC.

Examenul clinic al genunchiului pune în evidenţă o articulaţie mărită în volum cu semne de inflamaţie

prezente.

Examenele de laborator: leucocitoză de (8.080/mm3), proteina C reactivă (1,07 mg/dL). Alte teste

biochimice de rutină şi sumarul urinar au fost în limite normale.

S-a decis prelevarea de probe pentru hemocultură şi culturi din lichidul articular. În 30 de minute de la

recoltarea lichidului s-a primit rezultatul de laborator preliminar care evidenţia prezenţa unor coci

Gram negativi intra şi extra leucocitari pe frotiu.

Culturile din lichidul articular precum şi hemoculturile au ramas negative diagnosticul stabilindu-se

strict pe baza examenului microscopic pe frotiu.

Diagnosticul de internare al pacientului a fost: infecţie gonococică diseminată. Tratamentul a fost

schimbat cu ceftriaxon 1g pe zi i.v.

După 3 zile de tratament simptomele pacientului inclusiv febra, faringitaşiartralgiaau diminuat şi a fost

externat, fără sechele, în ziua a 7-a.

La externare pacientul a fost informat de necesitatea testării ulterioare pentru alte afecţiuni

transmisibile pe cale sexuală.

4. 6. De reținut

Probele recoltate după administrarea de antibiotic pot fi negative în cultură deşi la examenul

microscopic pe frotiu microorganismele se pot vizualiza. Datele prezentate în anamneză de pacient

împreună cu aspectul morfologic şi tinctorial al microorganismelor observate pot fi de folos în

stabilirea diagnosticului.

Mai mult de 60% dintre tulpinile de Neisseria gonorrhoeae sunt rezistente la quinolone.


1. Pentru care din următoarele microorganisme este obligatorie recoltarea p.p. pe tampon cu alginat

de calciu?

A. Propionibacterium acnes

B. Haemophilus influenzae

C. Salmonella spp.

D. Bordetella pertussis

E. Shigella spp.

2. Care din următoarele p. p. sunt considerate ”invazive”?

A. Secreţia uretrală

B. LCR

C. Aspiratul bronho-alveolar

D. Scuamele tegumentare

E. Aspiratul medular

3. În cazul suspiciunii unei infecții cu Neisseria gonorrhoeae (p.p. de la nivel genital) mediul de

transport recomandat este:

A. Cary-Blair

B. Apa peptonată

C. Chapman

D. Stuart

E. nici un răspuns nu este corect.

4. Recoltarea sângelui pentru hemocultură se recomandă a fi facută:

A. În cantitate corespunzătoare vârstei

B. La pacienţi spitalizaţi

C. În timpul frisonului

D. În convalescenţă

E. După o dezinfecţie riguroasă a tegumentelor

5. Transportul anaerobilor în laborator se poate face cu:

A. Tamponul cu mediu de transport

B. Seringă cu acul îndoit

C. Ser fiziologic încălzit

D. Containere speciale

E. 1-2 ore de la recoltare fără mediu


1. Urina este un p.p. care poate fi conservat la frigider dacă se întârzie procesarea.

2. Niciodată nu se recoltează probe bacteriologice după administrarea de antibiotice.

3. Probele patologice neetichetate întotdeauna sunt respinse de către laborator.

4. Urocultura este o metodă care foloseşte de rutină o tehnică semicantitativă.

5. Mediul de transport recomandat pentru cultivarea materiilor fecale este Cary-Blair.

5. Preparate microscopice, frotiuri și principalele colorații

utilizate în microbiologie. Examenul microscopic.

(Gabriela-Loredana Popa, Andrei-Alexandru Muntean) 5. 1. Cuvinte cheie

· preparat microscopic nativ

· frotiu

· colorații

· Albastru de metilen

· Gram

· Ziehl-Neelsen

· fluorescență

5. 2. Introducere

Pentru a putea vizualiza microorganismele, avem nevoie de o putere de mărire de cel puțin 900-1000X,

întrucât acestea au dimensiuni de ordinul micronilor. În mod practic, nu este suficient să vizualizăm

simpla prezență a microorganismelor la locul de infecție (unele făcând parte din flora normală), ci să

încercăm să demonstrăm implicarea lor în boala suspectată. Astfel, avem nevoie să evidențiem atât

microoganismele cât și răspunsul pacientului față de acestea (ex. prezența celulelor inflamatorii),

pregătind diferite preparate microscopice.

5. 3. Preparate microscopice proaspete (între lamă și lamelă)

Este de preferat să folosim lame și lamele noi. Pentru a îndepărta orice murdărie lamele pot fi curățate

în prealabil cu alcool și degresate suplimentar prin flambare. În mod practic, vom avea grijă să atingem

lama doar pe margini. Vom trece lama prin flacăra becului Bunsen aprins de 2-3 ori. Depunem pe lamă

o picătură din produsul care urmează a fi studiat:

· p.p. cu consistență lichidiană (ex. urină, materii fecale, LCR, etc) vor fi descărcare utilizând de ex.

ansa microbiologică sau pipeta Pasteur direct pe lamă; putem adăuga o picătură de albastru de

metilen, lugol, etc;

· p.p cu consistență solidă (ex. dintr-o colonie microbiană) - întâi folosim un pipetor pentru a pune

o picătură de soluție salină fiziologică pe lamă și apoi o ansă microbiologică pentru a descărca din

colonia respectivă.

Acoperim cu o lamelă produsul patologic descărcat și presăm ușor lamela pentru a elimina

bulele de aer.

În microscopia optică (câmp luminos) așezăm preparatul pe platina microscopului și examinăm

inițial cu obiectivul 10X, apoi cu obiectivul 40X (Figurile nr. 1-2).

5. 4. Frotiuri (preparate fixate și colorate)

Reexaminând schema generală a diagnosticului de laborator (vezi cap. 3) vom observa că

efectuăm examinarea frotiurilor în două momente; astfel, putem realiza frotiuri din p.p. sau din culturi

efectuate pe mediul solid sau lichid. Trebuie să ne asigurăm că avem la bancul de lucru toate

ustensilele necesare [p.p. sau cultură de interes, bec Bunsen, ansă microbiologică, lame și lamele,

etanol, apă distilată (AD) și/sau soluție salină fiziologică (SSF), pipetor dar și trusă pentru colorare] și le

organizăm pentru a le avea la îndemână (Figura nr. 3). Frotiul trebuie bine întins, în strat subțire

(preferabil un singur strat).

NB: Nu vom purta mănuși datorită riscului atunci când lucrăm lângă becul Bunsen.

Vom avea grijă să atingem lama doar pe margini. Dorim să subliniem faptul că tehnica prin care

fixăm frotiul depinde de tehnica de colorare pe care dorim să o aplicăm (vezi 5. 5.). Fixarea are rolul de

a inactiva germenii de pe lamă și a le crește aderența de lamă.

5. 4. 1. Frotiuri din p.p. cu consistență lichidă sau din culturi în mediu de cultură lichid (Film

nr. 1)

· flambăm lama (o trecem de 2-3 ori prin flacăra becului Bunsen și o așezăm cu partea flambată

în sus pe stativul din trusa de colorație);

· sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;

· prelevăm aseptic p.p./cultura și depunem în centrul lamei;

· întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p./cultura, în strat cât mai subțire,

fără a ne apropia de marginile lamei (scădem riscul de contaminare);

· lăsăm lama să se usuce, pe un alt stativ, lângă becul de gaz;

· fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);

· suntem gata să începem procesul de colorare.

5. 4. 2. Frotiurilor din p.p. cu consistență solidă sau din culturi în mediu de cultură solid (Film nr. 2)

· flambăm lama (ca la 4. 4. 1.);

· depunem în centrul lamei o picătură de SSF sau AD;

· sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;

· prelevăm aseptic p.p./un fragment din colonie și depunem produsul în picătura de fluid de pe

lamă;

· folosim ansa pentru a omogeniza p.p./fragmentul din colonia de interes foarte bine (în așa fel

încât să rezulte o picătură tulbure omogen);

· întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p., în strat cât mai subțire, fără a ne

apropia de marginile lamei;

· lăsăm frotiul să se usuce lângă flacără;

· fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);

· suntem gata să începem procesul de colorare.

5. 5. Colorarea frotiurilor

Există numeroase metode de colorare, dar acest capitol nu își dorește o prezentare exhaustivă a

acestora. Este necesară o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranți, AD pentru spălare, stativ

de uscare). Pentru colorareafrotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent colorațiile cu

albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram și după caz, Ziehl-Neelsen. Chiar și colorația cu A.M. se poate

realiza în mai multe variante (ex. o colorație A.M. specială pentru bacilul difteric).

5. 5. 1. Colorația cu albastru de metilen

Examenul frotiului colorat cu albastru de metilen relevă informații de bună calitate privind citologia

frotiului (se pot observa detalii privind tipul de celule eucariote surprinse pe frotiu, relația dintre

acestea, eventualele anomalii morfologice ale citoplasmei și nucleului). Este o colorație de uz general,

fiind folosită alături de colorația Gram pentru a oferi o imagine de ansamblu a frotiului.

· fixarea frotiului se face prin căldură

· acoperim frotiul cu soluție A.M., 3-4 minute; spălăm cu apă distilată;

· așezăm frotiul în stativ pentru uscare;

· examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.

Fiind o colorație simplă, în care se utilizează un singur colorant, vom putea observa celule

eucariote (epitelii pavimentoase, leucocite, limfocite, etc.) cât și microorganisme (coci, bacili) colorați în

albastru. (Figura nr. 4)

5. 5. 2. Colorația Giemsa

Este o altă colorație în care structurile celulare pot fi decelate facil, în special în ceea ce privește

celulele inflamatorii. Astfel, putem clasifica leucocitele în neutrofile, bazofile, eozinofile. Se pot observa

și microorganisme (coci, bacili) colorați în albastru-violet. (Figura nr. 5)

5. 5. 3. Colorația Gram

În primul rând, ne asigurăm că avem toate componentele necesare pentru efectuare colorației, în

special:

· fucsină diluată (1/10);

· amestec alcool-acetonă (1 parte acetonă/3 părți alcool de 96º);

Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:

· fixarea frotiului se face prin căldură, trecând lama de 3 ori prin flacăra becului Bunsen (cu partea

opusă frotiului);

· acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; scurgem colorantul;

· acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 minute; îndepărtăm lugolul;

· acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă, rapid, 7-8 secunde;

· spălăm insistent cu apă distilată;

· acoperim frotiul cu fucsina diluată pentru 1 minut; spălăm cu apă distilată;



Colorația Gram este cea care oferă informații privind structura microorganismelor. Nucleul și

citoplasma celulelor eucariote sunt colorate în roșu

· celulele cu citoplasmă bogată roșu-pal și nucleu cu dimensiuni reduse, tahicromatic sunt

epitelii pavimentoase.

· celulele cu citoplasmă relativ restrânsă, cu un nucleu de dimensiuni considerabil mai mari,

polilobate, cu multiple septuri fine, sunt leucocite.

Microorganismele sunt colorate, în funcție de structura lor:

· violet – bacterii Gram pozitive;

· roz-roșu – bacterii Gram negative. (Figura nr. 6)

5. 5. 4. Colorația Ziehl-Neelsen

Este o colorație utilă în identificarea prezenței de bacili acid-alcool rezistenți (BAAR). În primul rând, ne

asigurăm că avem toate componentele necesare pentru efectuare colorației, în special:

· fucsină bazică nediluată (filtrată proaspăt)

· amestec acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95º);

Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:

· punem frotiul uscat și fixat prin căldură pe un suport situat deasupra tăviței de colorare;

acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată;

· trecem becul de gaz aprins pe sub lamă, până la emiterea de vapori;

· pe parcursul a 10 minute repetăm de 3 ori operația de încălzire a lamei până la emiterea de vapori;

adăugăm colorant, la nevoie;

· spălăm insistent cu apă distilată;

· adaugăm amestecul decolorant acid-alcool, 2-3 minute; spălăm cu apă distilată;

· recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut; spălăm cu apă distilată;



Microorganismele BAAR sunt roșii, în timp ce cele non-AAR sunt albastre. Celulele eucariote sunt și ele

colorate în albastru. (Figura nr. 7)

5. 5. 5. Colorații fluorescente

Există mai multe variante. Spre exemplu, „colorația fluorescentă” cu auramină O (A.O.) este utilă în

vizualizarea BAAR.

· colorăm cu soluție de A.O. (A.O./alcool etilic/fenol/A.D.), 15 min.; spălăm cu A.D.;

· decolorăm cu amestec de acid-alcool, timp de 5 minute; spălăm cu apă distilată

· „contracolorăm” cu soluție de permanganat de potasiu, timp de 2 minute;

· spălăm cu apă distilată;



Microorganismele acid-alcool-rezistente au o culoare galben-roșiatică. Deși colorația cu auramină

nu este la fel de specifică pentru BAAR precum colorația Ziehl-Neelsen, aceasta este mai ieftină și

prezintă o sensibilitate mai bună, fiind utilizată ca o variantă de screening.

5. 6. Tehnica examenului microscopic

Microscopul este strict necesar în diagnostic microbiologic direct. Cel mai frecvent utilizat în

laboratorul de microbiologie este microscopul optic. Există și alte tipuri de microscoape: cu fond

negru, cu contrast de fază sau cu fluorescență, etc.

5. 6. 1. Microscopul optic; microscopia în câmp luminos(Figura nr. 8)

Microscopul optic permite formarea unor imagini virtuale, mărite și răsturnate ale obiectului cu

ajutorul unui sistem de lentile obiectiv și delentile ocular. Distanța minimă dintre două puncte ale

unui obiect care mai pot fi văzute separat unul de celalalt prin microscop respectă o formulă, în funcție

de lungimea de undă a radiației folosite, indicele de refracție al mediului străbătut de radiație între

obiect și ocular și unghiul dintre axa optică și razele cele mai îndepărtate de axă care mai pătrund

în obiectiv. Pentru a micșora această distanță (pentru a îmbunătăți performanțele microscopului)

putem utiliza radiații cu lungime de undă mai mică (ex. radiația ultravioletă) sau un mediu (între obiect

și obiectiv) cu un indice de refracție cât mai mare (ex. în cazul microscopului cu imersie).

5. 6. 1. 1. Părțile componente ale microscopului optic

Microscopul optic include:

- Piciorul microscopului (masă metalică cu rol de susținere, pe care se sprijină platina microscopului;

pe platină așezăm preparatul microscopic / lama / frotiul). Prin orificiul central al platinei trec razele

luminoase. Platina se poate deplasa pe 2 direcții perpendiculare.

- Tubul microscopuluisusține ocularul și obiectivul. La capătul superior al tubului montăm ocularele

(de ex. cu puterea de mărire 10x).

- Obiectivul se monteaza în revolver, situat la capătul inferior al tubului. Obiectivul este compus

dintr-un sistem centrat de lentile așezate într-un tub metalic care se înșurubează la revolver. Există

obiective „uscate” (ex. 10x sau 40x) și cu imersie (ex. 90x sau 100x). Dispozitivul de iluminare este

format din oglindă și condensator.

- Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic.

- Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul cărora lumina reflectată de oglindă este

concentrată asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumină care cade pe condensator devine

convergent.

- Razele de lumină, înainte de intrarea în condensator, trec printr-un suport de filtre și o diafragmă iris

(diafragmă de apertură). Condensatorul contribuie în mod esențial la luminozitatea imaginii.

5. 6. 1. 2. Examinarea folosind microscopul optic în câmp luminos

A. Examinarea unui preparat proaspăt (între lamă și lamelă)

Depunem pe lamă o picătură din produsul de examinat, acoperim cu o lamelă, așezăm pe platina

microscopului și fixăm cu ajutorul “cavalerilor”. Plasăm condensatorul la 1,5 cm sub platină, diafragmul

semi deschis și coborâm obiectivul 40x până deasupra lamelei. Privim prin oculare, rotim foarte încet

macroviza până vedem câmpul microscopic. Clarificăm imaginea cu ajutorul microvizei și sistemului

luminos. Putem examina sedimentul urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu diaree,

suspensii de bacterii care se presupune că sunt mobile, preparate umede recoltate din micoze cutanate

superficiale etc, spre exemplu:

· în sedimentul urinar vedem celule epiteliale, leucocite, hematii, cilindrii urinari, cristale urinare,

levuri etc. (Figura nr. 9)

· în preparatul montat în soluție KOH vedem levuri, blastoconidii, atroconidii etc.

· în preparatul colorat cu tuș de India vedem levuri capsulate (cu halou) etc.

· pentru a diferenția mobilitatea microorganismelor de mișcarea browniană urmărim diferite repere

din câmpul microscopic. (Film nr. 3)

B. Examinarea unui preparat fixat și colorat

Punem frotiul pe platină și fixăm cu ajutorul “cavalerilor”. Centrăm zona de examinat. Procedăm așa

cum am arătat, utilizând inițial obiectivul 40x; după ce am ales un câmp ridicăm tubul microscopului,

punem o picătură de ulei de cedru pe lamă. Ridicăm condensatorul până sub platină; diafragmul este

deschis.

Privind din lateral, folosim macroviza și coborâm (cu multă grijă) obiectivul cu imersie (90x sau 100x)

până atingem suprafața lamei realizând contactul și cu uleiul de cedru. Privim prin oculare și rotim

foarte încet macroviza ridicând foarte încet tubul microscopic; prindem imaginea; clarificăm imaginea

cu ajutorul microvizei.

Examinăm morfologia celulelor din p.p., prezența și aspectul PMN, prezența bacteriilor și dispunerea

acestora (în „grămezi”, în „lanțuri” etc), poziția față de PMN (intra sau extra-leucocitar), morfologia

microorganismelor etc., cu mici diferențe în funcție de colorație. (Figura nr. 10)

5. 6. 1. 3. Întreținerea microscopului

La pornirea microscopului, ne asigurăm că potențiometrul care controlează sursa de lumină este la

minim. Pornim sursa de lumină și o ajustăm în funcție de necesar.

După terminarea examenului microscopic:

· închidem sursa de lumină;

· ridicăm cu tubul microscopului;

· coborâm condensatorul;

· scoatem lama de pe platină.

Este obligatoriu ca după examinare produsele nefixate (preparate între lamă și lamelă) să fie puse în

flaconul cu amestec dezinfectant.

Frotiurile interesante pot fi păstrate (trecute inițial prin xilol, apoi uscate și stocate într-o cutie specială).

Ștergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie specială, pentru a o curăța de

uleiul de cedru (periodic, ștergem această lentilă cu tifon foarte curat, îmbibat în xilol). Curățăm platina

și lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat în xilol. Acoperim microscopul cu o husă (îl ferim de

praf). Ar fi recomandabil ca microscopul să fie ținut în ambalaj de polietilenă împreună cu o substanță

desicantă (ex. silicagel).

5. 6. 2. Microscopul cu fond întunecat

Folosim un microscop la care s-a adaptat o sursă de lumină cu intensitate mare și un condensator

cardioid. Condensatorul pentru câmp întunecat oprește accesul spre obiectiv al razelor de lumină

directe iar obiectul este iluminat oblic. Obiectul studiat apare luminos pe fondul întunecat al câmpului.

(Figura nr. 11)

Obiectul este imersat într-o peliculă de glicerină pentru a evita reflexia totală a razelor. Lamele trebuie

să aibă grosimea de 1 milimetru.

Tehnica de examinare

Examinăm inițial frotiul în folosind condensatorul pentru câmp luminos, uitându-ne cu obiectivul cu

mărire 10x pentru a repera structurile de interes. Înlocuim apoi cu condensatorul cardioid (cu

diafragma închisă). Ridicăm condensatorul până la nivelul platinei și punem pe lentila condensatorului

o picătură de glicerină.

Pregătim preparatul între lamă și lamelă și îl plasăm pe platină astfel încât să vină în contact cu

glicerina de pe lentila condensatorului. Fixăm preparatul cu ajutorul “cavalerilor”.

Examinăm inițial cu obiectivul 10x, apoi 40x coborât până aproape de suprafața lamelei; clarificăm

imaginea cu ajutorul microvizei. Când obținem „imaginea curgerii unui curent de lichid” știm că

suntem în câmpul microscopic. Utilizăm microviza și clarificăm detaliile.

Utilizăm acest microscop pentru examinarea morfologiei și mobilitățiiTreponema pallidum în

serozitatea din șancru sau pentru alte spirochete (p.p. sau cultură).

5. 6. 3. Microscopul cu fluorescență

Acest microscop are o sursă de radiații (ex. o lampă care emite radiații UV), setul de filtre (caloric, de

excitație, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat. Sursa de radiații emite atât radiații UV cât și

radiații calorice. Filtrele absorb radiațiile calorice emise și permit trecerea spre preparat a radiațiilor cu

lungime de undă mică (ex. UV) care sunt radiațiile de excitație. Filtre de baraj asigură protecția ochiului

celui care examinează, fără a permite trecerea radiațiilor de nocive. Alegem filtrele (de excitație și baraj)

în funcție de fluorocromul utilizat astfel încât lumina emisă de fluorocromi să poată trece. Lichidul de

imersie utilizat pentru examinare prin obiectivele speciale trebuie să nu aibă fluorescență (ex. glicerină

tamponată neutră), iar lamele folosite să aibă grosimea de 1 milimetru.

Examinarea folosind microscopul cu fluorescență

Compușii organici care prezintă proprietatea ca după iradiere cu radiații ultraviolete să absoarbă

radiația excitantă, intră în stare de excitație iar, atunci când revin în starea normală pierd energia

acumulată și emit radiații luminoase se numesc flurocromi. Există mai mulți fluorocromi, spre exemplu

auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B, tripaflavina etc. Culoarea luminii emise depinde de

fluorocromul (ex. culoarea este galbenă pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinația

de auramină O - rhodamină B etc). Pentru examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescență,

preparatele trebuie să fie tratate cu fluorocromi.

Substanțele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi. Astfel, definim:

· imunofluorescența directă, caz în care folosim anticorpi țintiți împotriva unor antigene (componente

bacteriene de interes) marcați cu fluorocromi;

· imunofluorescența indirectă, caz în care folosim o reacție ce are loc secvențial. În primă fază, folosim

un anticorp țintit către antigenele de interes. În a doua fază, folosim anticorpi marcați cu substanțe

fluorocrome împotriva primilor anticorpi.

Aceste complexe Ag-Ac pot fi foarte utile în diagnosticul microbiologic, atât în prima etapă (frotiu din

p.p.) cât și în identificare. Dacă marcajul se realizează cu izotiocianat de fluoresceină, lumina emisă va

avea culoare verde; dacă marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă va avea

culoare portocalie.

Putem utiliza microscopia cu fluorescență în diagnosticul microbiologic al tuberculozei, leprei, tusei

convulsive etc.












Prezentăm o situație în care examinarea microscopică a p.p. pune diagnosticul și ajută la urmărirea eficacității

tratamentului.

Tuberculoza (TB) este o boală infecțioasă ce are ca agent etiologic Mycobacterium tuberculosis (cauză majoră de

morbiditate și morbiditate la nivel mondial); se estimează că există aproximativ 2 miliarde de persoane infectate și

aproximativ 1,7-2 milioane de decese în fiecare an. În 2010, se estima o incidență a de TB 8,8 milioane de cazuri la

nivel global (echivalentul a 128 de cazuri la 100.000 de locuitori), și o prevalență de 12 milioane de cazuri (cca.

178o/oooo).

Orientările actuale de Organizației Mondiale a Sănătății OMS) și Uniunii Internaționale împotriva Tuberculozei și

Bolilor Pulmonare afirmă că pasul esențial în investigarea pacienților suspecți de a avea TB pulmonară ar trebui să

fie examinarea microscopică a sputei. Pentru orice pacient ar trebui să fie examinate cel puțin 2 (preferabil 3)

probe de spută. Cu toate acestea, în epoca diagnosticului molecular, care este rolul examinării microscopice

a frotiului de spută? Este important să se atribuie acestui test importanța cuvenită, în special în contextul recentei

aprobări OMS a unui test automat de amplificare ADN, Xpert MTB/RIF.

Ipotetic, ar fi necesar un test accesibil, rapid și universal care să nu fie afectat de patologii asociate (inclusiv

infecția HIV/SIDA). Ideal, pentru a putea diagnostica eficient TB, testele ar trebui să fie disponibile și în centre

rurale (cu resurse limitate). Ar trebui să nu necesite nici electricitate, nici refrigerare, sau acces la apă curentă. Ar

trebui să fie disponibile pe scară largă, ușor de utilizat, cu o cerință de pregătire minimă. Rezultatele trebuie să fie

disponibile într-o oră, și ar trebui să aibă o sensibilitate, specificitate și valori predictive pozitive și negative

ridicate. În prezent, un astfel de test diagnostic nu există.

Pentru moment, cel mai apropiat test de testul ideal = examinarea microscopică a frotiului de spută. Până la

apariția unui test mai eficient, disponibil la locul de diagnostic, diagnosticul microscopic al frotiului de spută

rămâne unul din instrumentele cele mai importante de luptă împotriva infecțiilor cu M. tuberculosis.

5. 9. De reținut

Microscopul este una dintre cele mai importante unelte (”tool”) în diagnosticul bacteriologic direct, dar nu

putem stabili un diagnostic de certitudine doar pe baza examenului microscopic.

Variantele tehnice ale microscoapelor facilitează diagnosticul în cazul diferitelor tipuri de p.p. și de infecții

suspectate. Examinarea produselor între lamă și lamelă cât și a frotiurilor colorate, atât din produs patologic cât și

din cultură pură oferă informații necesare caracterizării proceselor inflamatorii și a microorganismelor implicate.

Microscopul trebuie îngrijit periodic pentru a-l menține în perfectă stare de funcționare.


Următoarele întrebări au răspuns unic:

1. Care este obiectivul folosit pentru examinarea inițială a unui frotiu colorat Gram la microscopul optic cu fond

luminos:

A. Obiectivul 100x utilizând ulei de imersie

B. Obiectivul 100x fără a folosi ulei de imersie

C. Obiectivul de 40x utilizând ulei de imersie

D. Obiectivul de 10x

E. Obiectivul de 40x fără a folosi ulei de imersie

2. La examinarea unui frotiu colorat Gram:

A. Putem vizualiza cu acuratețe diferențele între diferitele tipuri de leucocite

B. Nucleul celulelor eucariote este colorat violet, iar citoplasma roșu-pal

C. BAAR sunt colorați roșu

D. Microorganismele Gram negative sunt roșii, iar cele Gram pozitive sunt violet

E. Microorganismele Gram pozitive sunt roșii, iar cele Gram negative sunt violet

Următoarele întrebări au răspuns multiplu la alegere:

3. În cadrul protocolului colorației Gram:

A. După fixarea chimică a frotiului, adăugăm violet de gențiană

B. Adăugăm lugol, ca fixator, pentru 1-3 minute

C. Adăugăm acid-alcool pentru 8 secunde și spălăm cu apă abundentă

D. Adăugăm fuxină bazică nediluată pentru 1-3 minute

E. Adăugăm fuxină diluată 1/9 pentru un minut

4. La examinarea unui frotiu colorat Zeihl-Neelsen:

A. Celulele eucariote sunt colorate albastru

B. Microorganismele non-AAR Gram pozitive sunt colorate roșu

C. Microorganismele non-AAR Gram negative sunt colorate roșu

D. BAAR sunt colorate roșu

E. Celulele eucariote sunt colorate roșu

5. În ceea ce privește microscopul cu fluorescență:

A. Sursa de lumină emite atât radiații calorice (nocive) cât și radiații cu undă mare (ultraviolete)

B. Se folosesc filtre speciale pentru protecția examinatorului

C. Examinarea se face folosind ulei de cedru

D. Prepararea frotiului necesită folosirea de fluorocromi

E. Colorația cu auramină O este utilă în vizualizarea BAAR


1. Examenul nativ între lamă și lamelă caută să evidențieze microorganismele prezente la nivelul unui p.p.

2. Examinarea unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen poate pune diagnosticul unei infecții urinare cu Escherichia coli.

3. Examinarea unui frotiu colorat Gram poate pune diagnosticul unei meningite acute bacteriene.

4. Examenul microscopic necesită aproximativ o zi pentru a fi efectuat.

5. Ustensilele necesare pentru a efectua un frotiu, a-l colora și a-l examina microscopic sunt disponibile doar în

laboratoarele specializate.

6. Medii de cultură. Cultivarea microorganismelor.

(Gabriela-Loredana Popa, Andreea-Georgiana Tănase) 6. 1. Cuvinte cheie

• Colonie

• Cultură

• Însămânțare

• Inoculare

6. 2. Introducere

Cultivarea microorganismelor are ca scop obținerea de colonii izolate pentru a identifica (pe baza a

diferite caractere), agentul infecțios dintr-un anumit produs patologic (p.p.) recoltat de la un pacient cu

o boală infecțioasă.

Coloniile izolate alcătuiesc cultura pură (bacteriană, fungică) (Figura nr. 1) care se obține însămânțând

p.p. pe diferite medii de cultură (solide sau lichide) ce asigură substanțele nutritive și conditiile

necesare creșterii și multiplicării microbiene.

Obţinerea coloniilor izolate mai este utilă şi pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.

6. 3. Medii de cultură

Mediile de cultură se clasifică după diferite criterii. Aşa cum am explicat şi în volumul Microbiologie

Medicală, acestea pot fi: necelulare (artificiale, medii de cultură) şi celulare (includ celule vii de ex.

animale de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule). Majoritatea bacteriilor şi fungilor

se pot cultiva pe medii de cultură (necelulare, artificiale). Există şi microorganisme (ex. virusuri,

Rickettsii, Chlamydii) care nu se pot cultiva decât pe gazde vii.

6. 3. 1. Medii celulare (vii)

Din categoria mediilor celulare (vii) (Figura nr. 2) fac parte: animalele de experiență, oul de găină

embrionat și culturile de celule.

Animalele de experienţă pot fi utilizate pentru inocularea produselor patologice care includ

microorganisme ce nu se dezvoltă în alte condiții; totodată mai pot fi utilizate în studii de patogenitate

(ex. şoarecele alb, cobaiul, şobolanul, hamsterul, iepurele etc.). Această metodă necesită un cost ridicat

deoarece e nevoie de existența unei biobaze care să respecte regulile GMP (Good Manufacturing

Practices).

Oul de găină embrionat are un cost mai scăzut (dar mult mai mare decât prețul unui ou obișnuit), este

steril (produs în condiţii de GMP), nu prezintă factori antimicrobieni în primele 6-14 zile de incubaţie.

Se examinează la ovoscop

(evaluarea stării embrionului) (Figura nr. 3) și se poate inocula intraembrionar, la nivelul membranei

chorioalantoidiene, în sacul alantoidian sau în sacul amniotic (Figura nr. 4). Se introduce în incubator

(37ºC) timp de una sau mai multe zile.

Putem utiliza şi culturi de organ sau culturi de celule (de ex. culturi primare). Culturile primare derivă

din dispersia celulelor unui organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro 3-5 pasaje.

6. 3. 2. Medii necelulare (artificiale)

Acestea sunt mai ieftine, se prepară uşor și sunt cel mai frecvent folosite (Figura nr. 5).

Ele trebuie să fie sterile, nutritive, să aibă un anumit pH (de regulă 7,2-7,6), să aibă umiditatea

favorabilă multiplicării germenilor etc.

6. 3. 2. 1. Clasificarea mediilor de cultură artificiale

Mediile de cultură artificiale se pot clasifica astfel:

• după starea de agregare [solide (agar/geloză, agar-sânge, AABTL, Bordet- Gengou, Löffler,

Löwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud etc.), lichide (apă peptonată alcalină, bulion Mueller-Hinton,

bulion-sânge etc.), semisolide (MIU, MILF etc.)];

• după compoziţie [simple (agar, bulion simplu etc.), complexe (agar-sânge, geloză-

chocolat, agar cu factori X şi V, Mueller-Hinton etc.)];

• după scopul urmărit [de transport (Cary-Blair etc.), de izolare (Bordet-Gengou, Löwenstein,

Sabouraud etc.), de identificare (TSI, MIU etc.), de conservare];

• există şi medii speciale [elective (Löffler etc.), selective (agar-sânge, BSA, Chapman, Mac Conkey,

medii cu antibiotice etc.), de îmbogăţire (apă peptonată alcalină, bulion selenit, O.C.S.T. etc.),

diferenţiale (AABTL, agar-sânge, MIU, TSI etc.).

Mediul electiv conţine substanțele care sunt cele utile pentru multiplicarea unei bacterii (de exemplu

mediul Lőffler pentru bacilul difteric). Mediul selectiv inhibă dezvoltarea unor bacterii, dar permite

multiplicarea bacteriei pe care dorim să o izolăm. Putem folosi medii în care includem antibiotice (de

ex. dacă Mycobacterium tuberculosis este rezistent la penicilină și dorim să izolăm această bacterie,

putem pune în mediu penicilina la care alți germeni sunt sensibili). Mediul de îmbogăţire favorizează

înmulţirea anumitor bacterii, în timp ce inhibă dezvoltarea altor microorganisme din p.p. Mediul de

îmbogățire este în același timp mediu selectiv şi mediu electiv. Mediul diferenţial permite diferențierea

bacteriilor/fungilor (după caz). De ex. mediul geloză-sânge permite diferențierea în funcție de tipul

hemolizei. Alte medii diferențiale conţin un substrat (ex. lactoză / glucoză etc.) care poate fi sau nu

metabolizat; mai conțin și un indicator de pH. Dacă zaharul este metabolizat va avea loc modificarea

pH-ului şi respectiv a culorii (pentru că indicatorul de pH are culori diferite la pH neutru, pH alcalin sau

la pH acid. De ex., agarul cu albastru de brom- timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor

lactoză-pozitive (ex. E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella etc.) (Figura nr. 6). Alte

exemple sunt TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree) etc.

Mediile de cultură pot fi preparate în laborator conform unor reţete, se pot cumpăra medii

deshidratate (rehidratate cu apă distilată, demineralizată etc.) dar există şi medii gata pentru utilizare,

condiţionate în plăci Petri, tuburi etc. Toate mediile sunt supuse controlului de calitate, pentru fiecare

lot în parte. Mediile pe care urmează să le folosim trebuie să fie sterile.

Mediile de cultură pot fi stocate pentru un timp la frigider (+4ºC), în folie de plastic închisă ermetic.

Mediile pentru creştere în anaerobioză (bulion tioglicolat, alte medii) se păstrează în dulapuri, la

întuneric şi la temperatura camerei.

6. 3. 2. 2. Câteva exemple de medii de cultură

Agar-sânge: mediul conţine agar care se dizolvă la temperatură în apă distilată sterilă; autoclavăm (15

minute la ) şi răcim până la . Fără a se răci în continuare, adaugăm 5% sânge defibrinat de animal.

Distribuim aseptic mediul în plăci Petri.

Agar-chocolate: până la obţinerea amestecului de agar-sânge procedăm exact ca mai sus. În

continuare avem nevoie de o baie de apă la care temperatura e stabilită la . Introducem flaconul cu

agar-sânge în baia de apă şi menţinem timp de 10 minute (eritrocitele se lizează şi eliberează factori

nutritivi). Când temperatura revine la turnăm mediul în plăci Petri.

Amies: este un mediu de transport. Conţine agar, tioglicolat de sodiu, cărbune

neutru (permite supravieţuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae) şi o soluţie

tamponată de săruri anorganice. Poate fi stocat timp de 12 luni la +4ºC.

Apă peptonată alcalină: este un mediu utilizat atunci când suspectăm prezenţa Vibrio cholerae.

Conţine peptonă şi clorură de sodiu dizolvate prin încălzire în apă distilată, cu ajustarea pH-ului la o

valoare de 8,6-9,0. Este repartizat în tuburi. Sterilizăm prin autoclavare (15 minute, ). Poate fi stocat

timp de 6 luni la +4ºC.

Cary-Blair: este un mediu de transport de ex. pentru germeni Gram negativi. Conţine agar, tioglicolat

de sodiu şi o soluţie tamponată de săruri anorganice dizolvate (prin încălzire şi agitare) în apă distilată.

Poate fi stocat mai multe luni la +4ºC.

Löwenstein-Jensen: este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.

Conţine o soluţie de săruri şi amidon, soluţia de verde malachit şi omogenizat de ouă. După filtrare

mediul se repartizează în tuburi (cu capac înşurubat). Este coagulat în pantă.

Mac Conkey: este un mediu slab selectivo-diferenţial. Componentele sunt dizolvate în apă distilată şi

autoclavate 15 minute la . Stocarea poate dura 4 săptămâni la +4ºC.

Mediul Sabouraud: este un mediu pentru fungi. Conţine glucoză, digestie pancreatică de cazeină şi

agar. Se aduce la pH 5,6 urmând fierberea, filtrarea şi repartizarea în plăci Petri. Înainte de utilizare,

plăcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului circa 2 luni. Prin adăugare de

antibiotice (ex. cloramfenicol etc.) obţinem mediul selectiv.

6. 4. Tehnici de cultivare

Prin cultivare urmărim să obţinem o populaţie microbiană necesară și suficientă pentru diagnostic. În

timpul cultivării nu este permisă contaminarea p.p. Coloniile bacteriene izolate dintr-un produs

patologic se obţin prin „epuizarea” inoculului pe medii de cultură, folosind ansa bacteriologică, pipeta

Pasteur, tamponul de vată sau alte tehnici.

6. 4. 1. Obţinerea coloniilor izolate folosind ansa bacteriologică (Film nr. 1)

Însămânţarea “în pentagon deschis” pornind de la un p.p. adus în laborator se desfăşoară lângă becul

de gaz, în următoarele etape:

• notăm pe placa cu mediu datele de identificare;

• sterilizăm ansa (bucla și firul) „la roşu” şi flambăm portansa;

• luăm eprubeta cu p.p. în mâna stângă, scoatem dopul eprubetei utilizând degetele 4-5 de la mâna

dreaptă; flambăm gura eprubetei (trecere prin flacără de 2-3 ori);

• introducem ansa în eprubetă fără să atingem partea superioară și răcim bucla pe pereţii interiori în

vecinătatea p.p., încărcăm bucla cu p.p. şi scoatem ansa încărcată, fără să atingem pereţii sau gura

eprubetei;

• flambăm gura eprubetei; punem dopul eprubetei și aşezăm eprubeta în stativ; cu mâna stângă luăm

o placă Petri pe care o aşezăm pe masă cu capacul în jos şi mediul în sus; prima latură a unui viitor

pentagon deschis; apoi închidem placa Petri;

• reluăm procedura de sterilizare, flambare şi răcire a ansei (ex. atingem mediul într-o zonă

neînsămânţată, pe interiorul plăcii Petri);

• nu mai încărcăm ansa cu p.p. şi trasăm a doua latură a pentagonului intersectând-o pe prima;

sterilizăm din nou ansa; repetăm pentru următoarele laturi şi avem grijă să nu se unească ultima latură

cu prima latură;

• punem placa Petri însămânţată în termostat, la 35- ( pentru fungi); după circa 18-24 ore de incubare,

pe prima latură rezultă o cantitate mare de cultură, în timp ce pe următoarele laturi cultura e în

cantitate din ce în ce mai mică şi pe ultimele laturi, sau cel puţin pe ultima latură a “pentagonului

deschis” vedem colonii izolate (Figura nr. 7).

6. 4. 2. Însămânţarea cu ansa calibrată

• putem utiliza anse de platină sau anse de unică folosinţă cu calibrul de 0,01 sau 0,001 ml, pentru

urocultură; urina se omogenizează prin „răsturnarea” de câteva ori a recipientului de recoltare închis

etanş; apoi înclinăm recipientul astfel încât să putem tot cu mâna stângă deschidem placa iar cu ansa

încărcată cu p.p. trasăm câteva linii ca un “zig-zag” (fără să ridicăm ansa de pe mediul de cultură);

rezultă astfel pune bucla ansei, paralel pe suprafaţa urinei şi să prelevăm p.p.;

• descărcăm p.p. în striu, pe unul dintre diametrele unei plăci Petri, epuizăm inoculul pe toată suprafaţa

plăcii în striuri perpendiculare pe primul striu (prin mişcări în zig-zag);

• după incubare, în următoarea zi numărăm coloniile apărute (şi înmulţim numărul de colonii cu 1.000

dacă am utilizat pentru însămânţare ansa de 0,001 ml).

6. 4. 3. Însămânţarea prin înţepare a mediului turnat în tuburi/eprubete

• metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale tulpinilor de colecţie sau pentru

însămânţarea unor medii multitest (TSI, MIU etc.);

• preferăm utilizarea unei anse-fir;

• spre exemplu dacă facem cultivarea pe mediul TSI:

• utilizăm tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuşor);

• însămânţăm „partea dreaptă” prin înţepare, fără a se atinge baza tubului;

• apoi însămânţăm „partea înclinată” prin realizarea unor striuri în zig-zag, atingând suprafaţa

mediului.

Studenţii vor urmări demonstrarea modului în care se execută tehnicile de însămânţare și vor executa

unele dintre aceste tehnici.



dezvoltarea pe parcursul activităților universitare considerăm că este necesar ca cei care doresc să

citească mai mult, pentru o cât mai bună informare. Ca atare, recomandăm câteva link-uri

corespunzătoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23667677




Un băiat în vârstă de 26 de ani se prezintă la un spital local pentru dureri la nivelul articulațiilor mari și

coloanei, debutate cu 2 luni în urmă. Din istoricul pacientului menționăm ca relevantă o pneumonie

însoțită de pleurezie al căror agent etiologic s- a suspectat a fi Mycobacterium tuberculosis fără a

putea fi pus în evidență prin metode directe de bacteriologie. A primit medicamente antituberculoase

iar simptomatologia s-a ameliorat, remarcându-se totuși hipogamaglobulinemia persistentă.

La internare, pacientul prezenta febră (38,2°C), dureri la nivelul articulațiilor și hipogamaglobulinemie

de cauză necunoscută. A fost eliminat diagnosticul de artrită septică întrucât în urma recoltării și

cultivării de lichid sinovial de la nivelul articulației șoldului stâng nu a crescut nicio bacterie pe mediile

de cultură folosite. Pacientul a fost transferat la alt spital unde, în urma semnelor menționate

(hipogamaglobulinemie, redoare matinală, sensibilitate la nivelul articulațiilor șoldului, genunchilor,

umerilor, mâinilor și la nivelul articulației proximale a mediusului de la mâna dreaptă fără roșeață sau

căldură locală), s-a pus diagnosticul de artrită reumatoidă. S-a început tratamentul cu prednisolon dar

după o săptămână a reapărut febra (38,5°C). S-a recoltat lichid sinovial de la nivelul articulației șoldului

drept, utilizând de data aceasta un mediu de cultură special. După mai mult de 5 zile s-a identificat

Mycoplasma hominis dar între timp pacientul a dezvoltat meningită iar diseminarea bacteriană nu a

putut fi oprită și evoluția a fost nefastă, spre deces.

Discuții

În cazul de față hipogamaglobulinemia însoțită de artită cu îngustarea spațiului articular au condus la

diagnosticul fals de artrită reumatoidă, excluzându-se (eronat) etiologiile infecțioase cel mai frecvent

întâlnite. Izolarea Mycoplasma hominis nu se realizează de rutină deoarece este nevoie de medii de

cultură speciale și un timp mai îndelungat de creștere.

Concluzii

La pacienții care prezintă hipogamaglobulinemie se impune luarea în considerare a prezenței

Mycoplasma hominis folosind medii de cultură specifice.

6. 7. De reținut

• Pentru a identifica agentul infecțios dintr-un p.p. recoltat de la pacient este necesară însămânțarea

p.p. respectiv pe o placă Petri, urmând ca după o anumită perioadă de timp, variabilă în funcție de

diferitele bacterii, să crească pe mediul respectiv culturi pure (colonii).

• Există mai multe tipuri de medii de cultură (celulare/ necelulare) la fel cum există mai multe metode

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23667677



de însămânțare a p.p. recoltat.


Citiți cu atenție urătoarele întrebări și alegeți o singură variantă de răspuns:

1. Următoarele medii de cultură fac parte din categoria mediilor necelulare, cu excepția:

A. Cary-Blair

B. Mac Conkey

C. TSI

D. oul de găină embrionat

E. agar-sânge

2. Despre mediul diferențial nu este adevărată următoarea afirmație:

A. conține un indicator de pH

B. permite diferențierea anumitor bacterii prin metabolizarea sau nu a unui substrat

C. AABTL permite diferențierea bacteriilor glucoză-pozitive de cele lactoză- pozitive

D. dacă substratul conținut în mediu se metabolizează are loc modificarea culorii

E. dacă substratul conținut în mediu se metabolizează are loc modificarea pH-ului

Pentru următoarele întrebări sunt corecte mai multe variante de răspuns:

3. Putem identifica agentul etiologic dintr-un anumit produs patologic prin:

A. testarea sensibilității coloniilor la antibiotice și chimioterapice

B. însămânțarea produsului patologic pe diferite medii de cultură

C. inocularea produsului patologic la anumite animale de laborator, după caz

D. însămânțarea p.p. pe o placă Petri, formând ”un pentagon închis”

E. cultivarea p.p. pe medii de cultură, obținând culturi pure sau parțial pure.

4. Alegeți afirmațiile adevărate:

A. mediul Löwenstein-Jensen este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis

B. mediul Cary-Blair este un mediu de transport

C. mediul agar-sânge este lichid

D. mediul geloză este folosit pentru Ricketsii

E. mediul Lőffler pentru bacilul difteric este un mediu electiv


1. Mă voi contamina dacă voi atinge un mediu de cultură însămânțat în prealabil cu un p.p. recoltat de

la un pacient.

2. Flambarea (trecere prin flacără de 2-3 ori) în scopul sterilizării este, de cele mai multe ori, ineficientă.

3. Cultivarea unui p.p. pe orice mediu de cultură va permite dezvoltarea coloniilor astfel încât vom

putea identifica agentul etiologic al bolii respective.

4. Este indicată folosirea mediilor celulare în detrimentul celor necelulare datorită sensibilității crescute

a celor dintâi.

5. Cultivarea microorganismelor este o metodă indispensabilă în practica de zi cu zi a unui laborator de

bacteriologie.

7. Examinarea caracterelor fenotipice. Teste de

identificare. (Gabriela-Loredana Popa, Mara-Mădălina

Mihai) 7. 1. Cuvinte cheie

· Colonii de tip S, R, M

· Fenomenul de invazie și linia de demarcație

· ”Cap de meduză”/ “coamă de leu”

· Pigmentogeneză și hemoliză (α, α′, β, γ)

· Teste fenotipice

· Auxanograma

7. 2. Introducere

Coloniile izolate se pot obţine prin diferite tehnici. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică şi

formează culturi în 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (ex. 35-37°C). Pentru

bacteriile care necesită 3-5% CO2, plăcile se pun în exsicator, împreună cu o lumânare aprinsă. Pentru

bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză. Fungii se dezvoltă la 28-30°C.

Examinarea coloniilor izolate este foarte utilă. Se poate realiza cu ochiul liber şi cu ajutorul unei lupe

sau a unui stereomicroscop (dacă sunt foarte mici).

7. 3. Aspectul culturilor pe medii lichide

Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se vor dezvolta în toată masa de lichid, iar mediul va deveni

tulbure. În schimb, bacteriile strict aerobe se dezvoltă la suprafaţa mediului (Figura nr. 1). Ca și idee

generică, în majoritatea cazurilor, tulpinile care pe mediile solide formează colonii de tip “S” tulbură

omogen mediul în timp ce tulpinile care formează colonii de tip “R” realizează o tulburare mai puţin

omogenă. “Variantele R” pot lăsa mediul limpede, formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la

suprafaţa mediului (ex.Mycobacterium tuberculosis) (Figura nr. 2).

Exemple de creştere pe medii de cultură lichide (Tabelul nr. 1):

· mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.);

· mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (ex. Streptococcus pyogenes);

· mediul este clar, cu văl la suprafaţă (ex. Vibrio cholerae);

· mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o membrană groasă, plisată (ex. Mycobacterium

tuberculosis).

7. 4. Aspectul culturilor pe medii solide

Aspectul coloniilor variază în funcţie de microorganismul cercetat, dar nu este atât de specific încât să

permită un diagnostic. Există un caracter orientativ.

7. 4. 1. Atunci când descriem coloniile ar trebui să notăm diferite proprietăți:

· dimensiunea

o coloniile pot fi mari (ex. Klebsiella pneumoniae sau levuri) (Figura nr. 3)

o medii (majoritatea bacteriilor studiate)

o mici, sub (ex. Streptococcus viridans)

o foarte mici (ex. Mycoplasma spp., Ureaplasma spp.);

· marginile - regulate, neregulate, circulare, zimţate, ondulate, lobate, filamentoase, acoperite cu

miceliu pufos, etc. (Figura nr. 4);

· forma - punctiformă, circulară, neregulată, filamentoasă, etc. (Figura nr. 5);

· relieful - plat, convex, ombilicat, papilat (Figura nr. 6);

· suprafaţa - netedă, lucioasă, mată, rugoasă, mucoidă, pufoasă (Figura nr. 7);

· culoarea - pigment la nivelul coloniei sau/şi al mediului (Figura nr. 8);

· opacitatea - transparente, semitransparente, opace (Figura nr. 9);

· consistenţa, aderenţa la mediu (Figura nr. 10).

7. 4. 2. Tipuri de colonii

Colonia S (smooth) are suprafaţa bombată şi netedă, iar marginile sunt circulare. Microorganismele

din colonie păstrează structura antigenică; nu aglutinează spontan cu soluţie salină fiziologică.

Germenii capsulaţi își păstrează capsula. Virulenţa este conservată. Majoritatea bacteriilor studiate

formează colonii de tip S (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, E. coli, Candida albicans etc)

(Figura nr. 11).

Colonia R (rough) este plată, mată, uscată, cu margini crenelate (zimţate) și o suprafaţă ce prezintă

rugozităţi. Structura antigenică și capsula nu sunt păstrate. Virulenţa nu este conservată

(excepţii Bacillus anthracis,Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae) (Figura nr. 12).

Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, umedă, mucoasă, cu aspect de curgere pe mediu. Este

produsă de bacteriile care prezintă capsulă (ex.Klebsiella pneumoniae) (Figura nr. 13).

7. 4. 3. Aspecte particulare

Datorită mobilității, Proteus spp. formează pe mediile solide colonii cu un aspect particular. În

funcție de tehnica de însămânțare pot fi observate

· fenomenul de “invazie”: o tulpină din genul Proteus însămânțată la periferia unei plăci cu mediu de

cultură simplu se va dezvolta în valuri concentrice pe toată suprafaţa mediului (Figura nr. 14)

· fenomenul “liniei de demarcaţie”: prin cultivarea a 2 tulpini diferite de Proteus, în 2 puncte

diametral opuse, vom observa „invazia” până în apropierea unei linii de întâlnire, denumită “linie de

demarcaţie” (Figura nr. 15)

· fenomenul de “căţărare”: cultivăm un produs patologic (în care există o tulpină de Proteus spp.) la

baza unui tub cu geloză înclinată, iar cultura se va dezvolta pe tot mediul din tubul respectiv (Figura nr.

16).

Bacillus anthracis produce colonii în “cap de meduză” sau în “coamă de leu”, de tip R: mari, culoare

alb-cenuşiu, cu prelungiri ondulate în periferie (Figura nr. 17).

7. 5. Caractere metabolice

7. 5. 1. Pigmentogeneza

Pigmentogeneza poate fi utilă în identificare. Uneori este necesar să respectăm unele condiţii speciale

de cultivare pentru a obține pigmentarea coloniilor.

Bacteriile pot produce un pigment care colorează colonia bacteriană (ex. pigmentul auriu la S. aureus);

sau pot colora și coloniile și mediul (pigmentul este difuzibil în mediu- ex. la Pseudomonas aeruginosa)

(Figura nr. 18).

Și fungii pot produce pigmenţi. Coloniile de Candida albicans au culoare albă, în schimb mucegaiurile

produc o varietate mult mai mare de pigmenţi:Aspergillus flavus - colonii galben verzui până la verde

închis, dar privite pe partea cealaltă a plăcii apar roşii-brune, A. fumigatus - colonii iniţial albe care

devin albastre-verzui sau albastre, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate brun sau în alte

culori, A. niger - colonii iniţial albe, devin brun negre, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate

în galben etc (Figura nr. 19).

7. 5. 2. Producerea de hemolizine

Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizează hematiile din mediile de cultură cu

sânge. Hemoliza poate avea aspecte diferite (Figura nr. 20):

· α hemoliză (hemoliză viridans): produc liza incompletă a hematiilor și culoarea verzuie

(ex. Streptococcus viridans,Streptococcus pneumoniae);

· β hemoliză: hematiile sunt complet lizate, zona de hemoliză fiind clară (ex. Streptococcus

pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes).

7. 5. 3. Producerea altor enzime

· catalază (ex. Staphylococcus spp.);

· gelatinază (cultura microbiană lichefiază gelatina, ex. Clostridium perfringens);

· lecitinază (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.);

· oxidază (ex. N. meningitidis, N. gonorrhoeae, P. aeruginosa, V. cholerae).

7. 5. 4. Alte caractere metabolice

· toleranţa la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplică la pH alcalin);

· toleranţa la o anumită concentraţie de NaCl (ex. Staphylococcus aureus);

· sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la bacitracină (ex. S. pyogenes).

7. 6. Caractere de patogenitate

Caracterele de patogenitate pot fi evidenţiate in vitro sau in vivo.

7. 6. 1. Teste efectuate in vitro

· Examinarea coloniilor cu rol orientativ (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene în forma

“S”; excepţie bacilii antraxului, difteric şi tuberculos);

· Efectuarea anumitor teste biochimice ori metabolice cu rol orientativ (ex. fermentarea manitei,

testul coagulazei, producerea de hemolizine);

· Evidenţierea producerii unor toxine (endotoxine, ex. prezenţa endotoxinei produce gelificarea unui

lizat de Limulus polyphemus) sau exotoxine.

7. 6. 2. Teste efectuate in vivo

Sunt utilizate animale de laborator sensibile faţă de infecţia experimentală cu diferiţi germeni sau faţă

de anumite toxine microbiene.

7. 6. 2. 1. Toxinotipia în cazul suspicionării unei toxiinfecţii alimentare (TIA) cuClostridium botulinum

Inițial, se obţine un supernatant după triturarea și centrifugarea alimentelor incriminate. În

continuare se vor utiliza 2 preparate: supernatantul rezultat şi supernatantul menținut timp de 15

minute la 100°C (toxina botulinică este termolabilă, urmărindu-se astfel obținerea unui martor negativ).

Cele 2 preparate se vor inocula în următoarele variante la 4 loturi de şoareci (0,5 ml/ şoarece) sau cobai

(1 ml/ cobai): lotul 1-supernatant ca atare, lotul 2- supernatant inactivat, lotul 3- 0,1 ml ser antitoxină

A, urmat de adăugarea supernatantului (după 30 minute), lotul 4- 0,1 ml ser antitoxină B urmat de

adăugarea supernatantului (după 30 minute). Dacă, spre exemplu, animalele din loturile 1 şi 4 mor, iar

animalele din loturile 2 şi 3 supravieţuiesc, în produsul patologic există toxină botulinică de tip A.

(Figura nr. 21)

7. 6. 2. 2. Testarea patogenităţii unor levuri (ex. pentru Candida albicans)

Pornind de la o cultură de 24 de ore în mediul Sabouraud lichid, se separă sedimentul, urmată de

realizarea unei suspensii 0,2% a acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă. Se inoculează preparatul în

venele cozii la un lot de şoareci (câte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) şi se urmărește evoluţia

animalelor timp de 4-10 zile. Dacă este implicată o tulpină de C. albicans patogenă, animalele vor muri

după circa 1 săptămână, fiind posibilă evidenţierea unor abcese miliare după disecție.

7. 7. Câteva exemple de teste de identificare

Este interesantă atât studierea exemplelor cât şi înţelegerea necesităţii controlului intern de calitate,

prin utilizarea martorilor (pozitiv şi negativ) pentru fiecare test.

7. 7. 1. Utilizarea unui carbohidrat ca unică sursă de carbon (auxanograma)

Principiu Levurile prezintă un echipament enzimatic care le permite să utilizeze un anumit carbohidrat

ca sursă unică de carbon. Dezvoltarea unei levuri pe un mediu în care este inclus un singur carbohidrat

demonstrează utilizarea acestuia. Similar se poate verifica asimilarea unor substanţe azotate, de către

levuri.

Tehnica de lucru Se efectuează o suspensie din cultura microbiană în apă distilată sterilă. Mediul de

cultură se încălzește până la topire şi apoi se răcește la 50°C pentru asimilarea carbonului. Într-un tub

steril se introduc 20 ml de mediu, 2 ml soluţie de vitamine şi 0,25 ml din suspensia levurică, iar apoi se

toarnă amestecul într-o placă Petri sterilă, aşteptându-se solidificarea.

Se depun 5 rondele din hârtie de filtru, una în centru şi 4 spre periferia fiecărui cadran al plăcii şi

imediat, utilizând o ansă cu diametrul buclei de , se depun pe fiecare dintre rondele prelevatele din

diferite (5) soluţii de carbohidraţi, cel puţin din glucoză. După incubarea la 28-30°C pentru 24-48 ore se

urmărește apariţia culturii în jurul rondelelor. (Figura nr. 22)

Interpretare Dacă testul s-a efectuat corect, ar trebui să existe multiplicare levurică (cultură prezentă)

în jurul rondelei pe care s-a depus soluţie 5% glucoză, deoarece toate levurile pot folosi glucoza drept

unică sursă de C. Apoi se notează dezvoltarea culturii în jurul celorlalte rondele, urmată de stabilirea

speciei implicate.

Control de calitate

· tulpina de referinţă de Cryptococcus laurentii

· tulpina de referinţă de Candida pseudotropicalis.

7. 7. 2. Testul sensibilităţii la bacitracină

Principiu Multiplicarea a 99% din streptococii de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic

produs de Bacillus licheniformis).

Materiale necesare colonii β-hemolitice izolate pe geloză-sânge şi microcomprimate de

bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U.

Tehnica de lucru Prelevăm 3-4 colonii β-hemolitice şi însămânţăm omogen pe o jumătate de

placă Petri cu geloză-sânge. Plasăm în centrul ariei însămânţate un microcomprimat cu bacitracină şi

incubăm pentru 18-24 ore la 35-37ºC.

Interpretare Testul este pozitiv (bacteria este sensibilă la bacitracină) în cazul în care rezultă o

inhibiţie a creşterii bacteriene (indiferent de diametru), în jurul microcomprimatului cu 0,04 U

bacitracină sau rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene cu diametrul ³ , în jurul microcomprimatului cu

0,1 U. (Figura nr. 23)

Control de calitate

· Martor pozitiv – Streptococcus pyogenes

· Martor negativ – Streptococcus agalactiae.

7. 7. 3. Testul bilolizei (Neufeld)

Principiu Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în prezenţa bilei sau

sărurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice (Figura nr. 24).

Materiale necesare Colonii izolate a-hemolitice, soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%, soluţie

salină izotonă, apă distilată.

Tehnica de lucru Se prepară în soluţie salină fiziologică o suspensie pornind de la coloniile a-

hemolitice izolate. Apoi se repartizează câte 0,5 ml din suspensie în 2 eprubete de sticlă. În primul tub

se adaugă 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar în al doilea tub 0,5 ml apă distilată. Se incubează timp de 2

ore la 35-37ºC.

Interpretare

· Test pozitiv: clarificarea suspensiei doar în tubul în care s-a adăugat dezoxicolat (bacteriile au fost

lizate, fiind S. pneumoniae);

· Test negativ: ambele tuburi au rămas opace.

Control de calitate

· Martor pozitiv – Streptococcus pneumoniae

· Martor negativ – Streptococcus viridans.

7. 7. 4. Testul producerii de catalază

Principiu Catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.

Materiale necesare Colonii izolate dezvoltate pe medii fără sânge, soluţie de peroxid de hidrogen

3%, apă distilată.

Tehnica de lucru Se realizează o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml de apă distilată la care se

adăugă 1-2 picături de soluţie de peroxid de hidrogen. Se observă imediat şi după trecerea a 5 minute

apariţia bulelor de oxigen. (Figura nr. 25).

Interpretare

· Test pozitiv: apariţia bulelor de gaz (bacteria produce catalază)

· Test negativ: absenţa bulelor de gaz.

Control de calitate:

· Martor pozitiv – Staphylococcus aureus

· Martor negativ – Streptococcus pyogenes.

7. 7. 5. Testul coagulazei

Principiu Stafilococii coagulază-pozitivi produc o enzimă care activează coagularea plasmei. Există

2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă şi coagulaza legată de peretele celular (“clumping factor”).

Stafilococii coagulază pozitivi sunt consideraţi Staphylococcus aureus.

Materiale necesare Colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmează să fie testată,

plasmă de iepure, lame, tuburi.

Tehnica de lucru este diferită în funcție de suportul utilizat.

7. 7. 5. 1. Testul coagulazei pe lamă (Figura nr. 26).

Se verifică prezenţa coagulazei legate. Pe o lamă se depune o picătură de apă distilată, urmată de

adăugarea a 1-2 colonii, de suspensionarea şi omogenizarea acestora până la obținerea unui lichid

tulbure omogen.

Dacă după aproximativ 10 secunde se observă apariţia unei eventuale ”autoaglutinări”, nu mai

putem continua și în acest caz în care se va efectua testul coagulării în tub. Dacă picătura rămâne

tulbure omogen se adaugă 1 picătură de plasmă şi se urmărește apariţia “coagulilor” timp de 10-15

secunde.

Interpretare

· Test pozitiv: apariţia “coagulilor” în 10-15 secunde

· Test negativ: absenţa “coagulilor”.

NB: 5% din S. aureus dau reacţii fals negative.

7. 7. 5. 2. Testul coagulazei în tuburi (Figura nr. 27).

Se verifică prezenţa coagulazei libere. Se pipetează 0,5 ml de plasmă într-un tub steril. Apoi se

prelevează o colonie care se descarcă în plasma din tub. Se incubează tubul timp de 4 ore la 35-37°C,

perioadă în care acesta va fi examinat prin înclinare, din 30 în 30 de minute. Dacă reacţia este negativă

la 4 ore, se reincubează până la 24 ore.

Interpretare

· Rezultat pozitiv: formarea unui cheag

· Rezultat negativ: absenţa cheagului.

Control de calitate

· Martor pozitiv – S. aureus

· Martor negativ – S. epidermidis.

7. 7. 6. Testul filamentării (pentru Candida albicans)

Principiu După cultivare în ser uman, ser bovin, ser de berbec ori altele timp de 2-4 ore, la 35-

37°C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filamente scurte (tubi germinativi) (Figura nr.

28).

Materiale necesare Colonii izolate, în scopul identificării, ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser

fetal de viţel ori serumalbumină bovină, aplicatoare de lemn sau pipete Pasteur sterile cu vârful efilat,

lame şi lamele, tuburi mici.

Tehnica de lucru Într-un tub de dimensiuni mici se introduc 0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de

ser. Cu un aplicator steril (ca un beţigaş) se atinge colonia care trebuie identificată, iar apoi aceasta se

introduce în tub. Se incubează timp de 2-4 ore, la 35-37°C și se examinează la microscopul optic

preparatul între lamă şi lamelă.

Interpretare

· Test pozitiv: prezenţa unor tubi germinativi cu un calibru mai îngust, dar cu o lungime de 3-4 ori

mai mare decât diametrul celulei de origine, care continuă direct, fără nici o strangulare sau sept

blastoconidia;

· Test negativ: absenţa aspectului menţionat mai sus sau prezenţa unor pseudotubi germinativi care

sunt delimitaţi printr-o strangulare şi un sept de blastoconidie.

Control de calitate

· Martor pozitiv – C. albicans

· Martor negativ – C. tropicalis.

7. 7. 7. Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)

Principiu: MIU conţine uree, triptofan, roşu fenol (indicator de pH) şi este condiţionat în tuburi de

dimensiuni mici. Geloza este moale permiţând mobilitatea microorganismului însămânţat; hidroliza

ureei va duce la alcalinizarea mediului cu modificarea culorii de la galben la roşu; producerea de indol

din triptofan va fi indicată de înroşirea reactivului Ehrlich (Figura nr. 29).

Materiale necesare Tuburi cu mediul MIU, hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich, colonii de

identificat (colonii izolate), ansă fir etc.

Tehnica de lucru Seutilizează pentru însămânţare ansa fir. După ce se prelevează o probă dintr-o

colonie izolată pe un mediu neselectiv, se însămânţează mediul prin înţepare, încercând să se realizeze

o însămânţare în “linie dreaptă”. Apoi, se fixează de dop hârtiuţa indicator în aşa fel încât să ajungă

deasupra coloanei de mediu, fără să o atingă. Se incubează la 35-37°C timp de 24 ore. În cazul în care

nu are loc virarea culorii mediului, se prelungește durata de incubare până la 48 de ore.

Interpretare

· Mobilitate prezentă: opacifierea este uniformă în coloana de mediu

· Mobilitate absentă: opacifierea apare numai pe traiectul de însămânţare

· Urează negativ: culoarea coloanei rămâne galbenă

· Urează pozitiv: culoarea coloanei devine roşie

· Indol pozitiv: schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet

· Indol negativ: hârtia rămâne albă.

Control de calitate

· Martor pozitiv – Proteus mirabilis M+ U+ I+

· Martor negativ – Shigella spp. M- U- I-.

7. 7. 8. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)

Principiu Mediul este agarizat şi condiţionat în două “zone” relativ distincte ale coloanei: baza şi

panta. Mediul conţine glucoză (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri), lactoză, zaharoză, citrat

feric şi un indicator de pH (roşu neutru). Partea dreaptă (coloana) nu vine în contact cu aerul şi oferă

condiţii relative de anaerobioză. Partea înclinată (panta) oferă condiţii de multiplicare în aerobioză.

Concentraţia glucozei este mai mică, pentru ca fermentarea acestui zahar să poată fi detectată

chiar dacă este singurul zahar metabolizat. Dacă o bacterie se dezvoltă în partea dreaptă vor fi eliberaţi

aminoacizi, care în zona aerobă vor fi decarboxilaţi oxidativ şi vor modifica pH-ul spre alcalin. În cazul

în care lactoza şi/sau zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produsă prin fermentarea

glucozei (toate enterobacteriile fermentează glucoza) este suficient de mică pentru ca pH-ul de la

nivelul pantei să revină rapid la neutru. În acelaşi timp, pH-ul rămâne acid (şi culoarea mediului rămâne

galbenă) la nivelul coloanei pentru că în condiţii de relativă anaerobioză nu are loc decarboxilarea

oxidativă. Dacă zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid produsă este suficient

de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel să rămână acid şi respectiv culoarea pantei să rămână

galbenă. Prezenţa citratului feric, în cazul în care bacteria produce H2S duce la apariţia unei culori

negre (se formează sulfit feros). La nivelul coloanei se înregistrează şi producerea de gaz (apariţia unor

bule pe traseul de însămânţare, fragmentarea sau “ruperea” coloanei etc) (Figura nr. 30).

Materiale necesare tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI; colonii de identificat (colonii izolate);

ansă fir etc.

Tehnica de lucru Se utilizează pentru însămânţare ansa fir. Se prelevează din colonia izolată pe

mediu neselectiv, iar apoi se însămânţează coloana prin înţepare, urmată de retragerea ansei şi de

trasarea unui “zig-zag” la suprafaţa coloanei. Se incubează la 35-37°C timp de 24 ore.

Interpretare

· Glucoză pozitiv: culoarea coloanei este galbenă

· Glucoză negativ: culoarea coloanei rămâne roşie (glucoza nu este fermentată, iar microorganismul

nu este o enterobacterie)

· Fermentarea glucozei poate fi însoţită de producere de gaz

· Lactoză/zaharoză pozitiv: culoarea pantei devine galbenă

· Lactoză/zaharoză negativ: culoarea pantei rămâne roşie

· Producere H2S: culoare neagră la nivelul coloanei.

Control de calitate

· Martor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de H2S – E. coli

· Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi producere de H2S –

Salmonella typhimurium.

7. 7. 9. Testul producerii de citocrom oxidază

Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidază (lipseşte la bacteriile strict anaerobe). Aceasta

acţionează asupra tetra-metil p-fenilendiaminei rezultând un compus de culoare purpurie. Dintre

bacteriile oxidază-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes

spp,Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) şi Micrococcus spp. (dintre germenii Gram pozitivi).

Materiale necesare Soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1% conservată în sticlă de culoare

brună (în frigider) sau fâşii de hârtie indicator impregnate în reactiv, hârtie de filtru, ansă cu fir de

platină sau pipetă Pasteur (cudată), colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge, agar Mueller Hinton etc.

Tehnica de lucru Într-o cutie Petri se așează un fragment de hârtie de filtru pe care se depun 1-2

picături de soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1%. Se prelevează dintr-o colonie izolată şi

se descarcă ansa pe hârtia de filtru prin mişcări circulare de mică amplitudine. Se urmărește apariţia

unei reacţii de culoare în primele 10 secunde.

Interpretare (Figura nr. 31)

· Test pozitiv: apariţia unei zone de culoare purpurie în 10 secunde

· Test negativ: absenţa culorii purpurie.

NB Apariţia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului (probabil este un rezultat

negativ).

Control de calitate

· Martor pozitiv – Pseudomonas aeruginosa

· Martor negativ – Escherichia coli.

7. 7. 10. Testul sensibilităţii la optochin

Principiu Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae) sunt sensibile la

concentraţii scăzute (< 5 µg/ml) de optochin (hidroclorid de etil-hidrocupreină) (Figura nr. 32).

Materiale necesare Discuri cu optochin (5 µg / disc), cu diametrul de 6 milimetri, plăci cu agar-sânge,

tampoane sterile, colonii α-hemolitice izolate, care urmează a fi testate.

Tehnica de lucru Seprelevează cu un tampon steril 2-3 colonii, urmată de însămânţarea pe jumătatea

unei plăci cu agar-sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă. Se plasează un disc cu

optochin în centrul zonei însămânţate, presându-l uşor pentru ca discul să adere uniform. Se incubează

timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5% CO2.

Interpretare

· Test pozitiv: apariţia unei zone de inhibiţie cu diametrul mai mare de 14 mm

· Test negativ: absenţa inhibiţiei în jurul discului.

Control de calitate

· Martor pozitiv – Streptococcus pneumoniae

· Martor negativ – Streptococcus viridans.

Testele prezentate reprezintă doar câteva exemple. Testele fenotipice utilizabile în diagnosticul de

laborator microbiologic sunt mult mai numeroase.

Înţelegerea principiilor şi mai ales a necesităţii controlului intern de calitate, necesar pentru orice

test şi în orice laborator, sunt foarte utile.














7. 9. Povestire adevărată (Candida spp. și hemolizinele)

Utilizarea frecventă a antibioticoterapiei și a medicației imunosupresoare, accesul facil la intervenții

chirurgicale, numărul din ce în ce mai mare al persoanelor cu tulburări metabolice și diabet zaharat

sunt doar o parte dintre factorii ce au determinat o creștere a incidenței infecțiilor cu Candida spp., fapt

asociat cu o morbiditate semnificativă și costuri ridicate de tratament. Candida albicans este specia cel









mai frecvent izolată, dar nu ar trebui neglijate infecțiile cu specii non- albicans, a căror prevalență a

crescut progresiv. La pacienții cu imunosupresie, precum aceia suferinzi de SIDA, se ridică problema

supraviețuirii unei infecții fungice diseminate sistemic.

Producerea de hemolizine reprezintă un important factor de patogenitate alCandida spp., fiind

raportate toate cele 3 tipuri dehemoliză (α, β, γ), cu o predominanță a subtipului β. Astfel,prin

degradarea hemoglobinei, microorganismele extrag fierul pentru a-l utiliza în procesele metabolice, în

creștere și invazie.La nivelul cavității bucale fierul este prezent atât intracelular, în depozitele de feritină,

cât și extracelular, în salivă, unde este legat de lactoferină.

Candida spp. fac parte din flora microbiană orală, dar prin exprimarea unor factori de virulență precum

enzimele proteolitice sau hemolizinele aceste microorganisme pot deveni patogene.

Un studiu efectuat de Rossoni și colaboratorii au evidențiat faptul că aproximativ 92% dintre speciile

de Candida izolate de la nivelul cavității bucale, la pacienți cu HIV, sunt producătoare de hemolizine,

jumătate dintre ele având o activitate hemolitică intensă. Aceste rezultate depășesc semnificativ

valorile pacienților imunocompetenți sugerând tranziția comensal/patogen în condiții de

imunosupresie. Dintre speciile non-albicans, 86% au fost producătoare de hemolizine, izolatele

de Candida glabrata prezentând într-un procent de 92% activitate hemolitică intensă, superioară

izolatelor Candida albicans.

Concluzii

Atât Candida albicans, cât și speciile non-albicans sunt producătoare de hemolizine. În condiții de

imunosupresie, speciile comensale pot exprima factori de virulență devenind patogene.

7. 10. De reținut

· Înţelegerea principiilor şi mai ales a necesităţii controlului intern de calitate, necesar pentru orice

test şi în orice laborator, sunt foarte utile.

· Hemoliza reprezintă un factor de patogenitate adesea evaluat în cazul unei infecții streptococice.

· Mediile multitest MIU și TSI permit identificarea enterobacteriilor.


1. Formează colonii de tip R urmptoarele speci bacteriene:

A. Mycobacterium tuberculosis

B. Staphylococcus aureus

C. Corynebacterium diphteriae

D. Escherichia coli

E. Bacillus anthracis

2. Alegeți răspunsurile corecte cu privire la însămânțarea pe mediul multitest MIU:

A. Mobilitate prezentă: opacifierea este uniformă în coloana de mediu

B. Mobilitate absentă: opacifierea este uniformă în coloana de mediu

C. Urează negativ: culoarea coloanei devine roşie

D. Urează pozitiv: un inel de culoare roşie la suprafaţa mediului

E. Indol pozitiv: schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet

3. Alegeți răspunsurile corecte cu privire la însămânțarea pe mediul multitest TSI:

A. Glucoză pozitiv: culoarea coloanei este galbenă

B. Glucoză pozitiv: culoarea coloanei este roşie

C. Lactoză/zaharoză pozitiv: culoarea pantei este galbenă

D. Producere H2S: culoare roșie la nivelul coloanei

E. Producere H2S: culoare negră la nivelul coloanei

4. Hemoliza determină modificarea aspectului mediilor de cultură cu sânge astfel:

A. Streptococcus pneumoniae determină α hemoliză

B. α hemoliză implică hemoliza completă, fără să se observe modificarea de nuanță a mediului

C. β hemoliza este observată în cazul Streptococcus pyogenes

D. γ hemoliza indică absenţa hemolizei

E. β hemoliza este observată în cazul Streptococcus pneumoniae.

5. Următoarele teste sunt efectuate pentru identificarea fungilor

A. Testul sensibilității la bactracină

B. Testul coagulazei

C. Auxanograma

D. Testul bilolizei

E. Testul filamentării.


1. Sucul de merișoare inhibă motilitatea și aderența Proteus spp., fiind util atât în tratamentul infecțiilor

de tract urinar, cât și în profilaxia acestora.

2. Identificarea în laborator a microorganismelor este un proces facil și ieftin. De aceea ar trebui să

recomandăm întotdeauna prelevarea de probe, indiferent de patologie și de tabloul clinic.

3. Sucul de merișoare previne aparția cariilor dentare prin inhibiția aderariiStreptococcus mutans de

smalțul dentar.

8. Testarea sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi

chimioterapice. (Gabriela-Loredana Popa, Loredana-

Sabina Manolescu) 8. 1. Cuvinte cheie

· Antibiogramă

· Antibiotice

· Chimioterapice

· Concentrația minimă inhibitorie/bactericidă

· Nivel de eficienţă inhibitorie/bactericidă

8. 2. Introducere

Testarea sensibilităţii la antibiotice și chimioterapice este necesară datorită posibilității prezenței

rezistenţei agenților patogeni la aceste medicamente. Rezistenţa poate fi naturală (determinată

genetic) sau dobândită („achiziţionată” de anumite subpopulaţii microbiene în anumite circumstanţe).

Există diferențe între efectul medicamentelor in vitro şi in vivo. Din acest motiv, metodele de testare a

sensibilităţii pot fi diferenţiate în:

1. metode de testare a sensibilităţii in vitro;

2. metode in vivo, care ţin cont de relaţia medicament-infecţie.

8. 3. Metode de testare a sensibilităţii in vitro

Antibiograma reprezintă o metodă de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a

bacteriilor după cultivare pe medii dedicate acestei analize (ex. agar Mueller-Hinton) și izolare în

cultură pură, adică după obținerea unei singure tulpini bacteriene, acea tulpină responsabilă de

îmbolnăvire. Se poate realiza prin tehnici calitative și cantitative

· Tehnici calitative (antibiograma difuzimetrică comună, antibiograma difuzimetrică comparativă,

antibiograma difuzimetrică standardizată etc) şi

· Tehnici cantitative (metoda diluţiilor în mediu lichid, metoda diluţiilor în agar, metoda microdiluţiilor în

agar, testul “E”, metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.).

8. 3. 1. Antibiograma difuzimetrică comună

Această este o metodă calitativă (răspunsul este de tip ”da” sau ”nu”). Se realizează în medii de cultură

solide (ex. agar Mueller-Hinton). Cel mai frecvent însămânţarea se realizează prin “inundarea” plăcii

urmată de aspirarea aseptică a excesului de inocul bacterian dar există şi alte variante. (Film nr. 1) Placa

însămânțată se lasă pe masa de lucru 20 minute după care se aplică discurile speciale pentru testare a

susceptibilitații (sunt produse comercial); acestea conțin medicamentul antimicrobian și sunt marcate

cu o prescurtare a numelui substanței active ce o conțin (ex. P pentru penicilină). Aplicarea discurilor se

realizează cu ajutorul unui distribuitor de discuri automat, în mod automat (antibiotic dispenser), sau cu

ajutorul unei pense. (Film nr. 2; Figura nr 1)

Într-o placă Petri de 9 cm diametru se pot pune 6 discuri cu 6 antibiotice (recomandarea este pentru 5)

diferite iar în cea de 15 cm se pot pune 12 discuri cu antibiotice. Regula este să fie dispuse la minim 3

cm distanţă între ele şi minim 1,5 cm de marginea plăcii (Figura nr. 2). Există o gamă largă de

distribuitoare de antibiotice, de la distribuitoare unice, pentru un singur antibiotic până la

distribuitoare pentru plăci pătrate, de 12 cm latura, unde pot fi puse chiar si 16 discuri de antibiotice.

Aceste discuri cu antibiotice trebuie să vină în contact perfect cu mediul de cultură (se presează uşor în

cazul aplicării manuale). După aplicare pe placa inoculată discurile se lasă în contact cu mediul de

cultură pe masa de lucru încă 20 minute ca apoi să se incubeze peste noapte în termostat [la 28º

(pentru fungi) sau la 35-37°C (pentru majoritatea bacteriilor)].

Antibioticul din disc este eliberat și difuzează în mediu realizând zone de inhibiţie în care coloniile

microbiene nu se dezvoltă (dacă populaţia bacteriană este sensibilă). Cu cât diametrul zonei de

inhibiţie este mai mare, cu atât bacteria va fi considerată mai sensibilă. (Figura nr. 3)

Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvoltă colonii

(“subpopulații rezistente”), bacteria va fi considerată rezistentă. (Figura nr. 4)

Această metodă folosită în multe dintre laboratoarelor, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor

complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active (tehnica nu este standardizată).

8. 3. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)

Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă, din

aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram pozitivi putem alege

pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la

antibioticele pe care le utilizăm (cunoaştem inclusiv concentrația minimă inhibitorie/CMI).

Se va împărți o placă pătrată în 3 zone egale și se va inocula în treimea medie tulpina de referinţă iar

în treimile exterioare 2 microorganisme diferite de testat. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să

conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente.

Discurile cu antibiotice se vor plasa pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Ulterior se va incuba peste

noapte la 35-37°C. (Figura nr. 5)

Rezultatele se exprimă cu termenii: “sensibil”, “intermediar”, “rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor

de inhibiţie a multiplicării microorganismelor de testat, faţă de acelaşi antibiotic. Putem aprecia CMI

(vezi şi 8. 3. 4). (Figura nr. 6)

8. 3. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer)

Reprezintă antibiograma difuzimetrică comună (8. 3. 1.) care a fost standardizată. Este singura metodă

difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, rezultatele sunt reproductibile şi corelabile între

laboratoare.

Elementele necesare standardizării sunt:

· Mediul. Cel mai frecvent se utilizează agar Mueller-Hinton; pH-ul mediului este frecvent între 7,2-

7,4 iar grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm.

· Inoculul. Seobține prinsuspensionarea a 2-3 colonii izolate în soluție salină fiziologică, urmărindu-se

turbiditatea suspensiei. Turbiditatea poate fi apreciată cu ajutorul unui dispozitiv portabil destinat sa

măsoare turbiditatea suspensiilor microbiene conform standardelor McFarland, (nefelometru), sau cu

tuburi etalon (Figurile nr. 6 și 7; Film nr. 3). Se ajustează la 0,5 McFarland (1,5x108UFC/ml), adică trebuie

să aibă o turbiditate corespunzătoare standardului 0,5 McFarland (circa 108 unităţi formatoare de

colonii/ml) în multe dintre cazuri.

· Incubarea. Timpul de incubare în majoritatea cazurilor este 16-18 ore la 35-37°C, în cazul germenilor

pretenţioşi până la 20-24 de ore. Atmosfera de incubare este în funcţie de specia bacteriană: în

atmosfera obişnuită sau in atmosferă de CO2 (de ex.streptococi, neisserii.)

· Concentraţia de antibiotic. Discurile cu antibiotic conțin determinate de substanță activă;

dimensiunea lor este standard (6 mm diametru).

· Alegerea antibioticelor. Se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de specia bacteriană

testată si în funcţie de localizarea infecţiei.

· Utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate.

· Interpretarea rezultatelor (Sensibilitatea sau rezistența sunt apreciate prin citirea diametrelor zonelor

de inhibiţie. Aceste diametre se compară cu diametre standard în funcţie de antibiotic, cantitatea de

antibiotic din disc, specia bacteriană testată. Rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar (I) sau

rezistent (R) la antibioticul testat. Nu se raportează diametrul citit, metoda fiind calitativă. Rezultatele

citirii pot fi influențate de lumina reflectată la citire, de apariția coloniilor izolate, de prezenţa

marginilor crenelate ale coloniilor etc.

Această metodă nu permite aprecieri cantitative (nu putem afla CMI sau CMB).

8. 3. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Se realizează pentru a determina CMI (concentraţia minimă inhibitorie) pentru fiecare antibiotic

testat (la care bacteria este sensibilă). CMI reprezintă cea mai mică concentraţie de antibiotic, în

micrograme/ml, cu acţiune bacteriostatică.

Pentru fiecare antibiotic testat se utilizează mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii

descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 64 micrograme / ml şi până la 0,125 micrograme /

ml, în total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (1 ml în fiecare tub, în final). (Figura nr. 8)

Se prepară inoculul standardizat turbidimetric şi se inoculează toate cele 11 tuburi, cu câte 1 ml de

inocul. Se agită tuburile pentru a omogeniza compoziția.

Se incubează cele 9 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub

martor se păstrează la frigider.

Pentru controlul de calitate se utilizează şi o tulpină de referinţă (pentru care trebuie să obținem

rezultate corespunzătoare datelor oferite de producător).

Citirea și interpretarea se fac a doua zi. Deoarece se utilizează o cantitate de inocul egală cu cantitatea

de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost

de 64 mg / ml, diluţia finală va fi 32 mg / ml). În tubul martor menţinut la +4°C nu trebuie să existe

creştere în timp ce în tubul martor la 35-37°C creşterea trebuie să fie evidenţiabilă. (Figura nr. 9)

În tuburile de testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului reprezintă CMI. Se

consideră (cu diferenţe între specii diferite) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 2 mg/ml

pot fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.

8. 3. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)

Se bazează pe cunoașterea CMI. Se folosesc drept sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea

microbiană a fost inhibată.

Se împarte o placă Petri (cu agar Mueller-Hinton) în sectoare, atâtea sectoare câte tuburi în care

dezvoltarea microbiană a fost inhibată (de ex. 6 sectoare dacă inhibiţia g a avut loc în ultimele 6

tuburi). Se însămânțează din fiecare tub fără creştere microbiană, sectorul de placă corespunzător.

(Figura nr. 10)

Se incubează 16-18 ore la 35-37°C.

Interpretare: CMB corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele

însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). (Figura nr. 11) Se consideră că antibioticul va fi

eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de

4-8 ori CMB.

Determinarea CMI şi CMB se face pentru aprecierea eficacităţii unui antibiotic asupra unei tulpini

bacteriene. Oferă date suplimentare privind sensibilitatea/rezistența. În tratamentul infecţiilor severe

(ex. endocardite, meningite, septicemii) şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este

indispensabilă.

8. 3. 6. Determinarea CMI prin testul E (E test)

E test reprezintă o altă metodă de testare a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite bacterii, inclusiv

pentru bacteriile pretenţioase sau anaerobe. Se aseamănă metodei diluţiei în agar; dar este mai uşor

de utilizat și permitedeterminarea valorii CMI (în schimb, are un cost mai ridicat).

Principiu

Modul de inoculare este similar. Benzile E test (langhete) conţin un gradient de antibiotic ce „acoperă”

un şir continuu de concentraţii între 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. Aceste

benzi se aplică după însămânţare și se incubează 16-18 ore la 35-37°C. Dacă bacteria este sensibilă, se

formează o zonă eliptică de inhibiţie (E vine de la epsilon). Valoarea CMI se citeşte acolo unde

creşterea bacteriană intersectează banda E test. (Figurile nr. 12 și 13)

NB. Banda trebuie să fie în contact perfect cu suprafaţa mediului; odată aplicată nu se deplasează

în altă poziţie (eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca şi în cazul discurilor cu antibiotic de

la antibiogramă).

Interpretarea rezultatelor

· Rezultatele se citesc atunci când cultura este confluentă sau aproape confluentă.

· Valoarea CMI corespunde liniuţei în care creşterea bacteriană intersectează banda E test; pe

geloză-sânge se citește zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei.

(Figurile nr. 12 și 13)

· Se raporteză rezultatul obţinut pentru tulpina testată numai după verificarea rezultatului obţinut

pentru tulpina de referinţă (control de calitate).

8. 4. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi aprecierea eficienţei terapeutice

De multe ori eficienţa terapiei cu antibiotice se apreciază clinic şi prin teste de laborator (ex.

leucogramă, sediment urinar, VSH, proteina C reactivă etc.). Dar aceasta nu este cea mai corectă

variantă.

Există două metode ce pot aprecia eficacitatea tratamentului. Acestea pot fi utilizate și pentru

evaluarea eventualei nocivităţi a antibioticelor.

1. Determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie), se realizează pentru ser, LCR (se pot utiliza și

alte umori). Se calculează asemănător CMI, doar că vom utiliza umorile pacientului pentru a

urmări care este nivelul la care (datorită antibioticului din respectivul lichid) inhibă dezvoltarea

microbiană.

2. Determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori. Puterea

bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav tratat

cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând bacteria infectantă; se determină diluţia cea mai

înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă. Se calculează asemănător CMB.

Utilizarea acestor metode este indicată în infecții grave (endocardite, osteomielite, fibroză chistică sau

sepsis) și la pacienţii cu variate grade de imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră

după administrarea unei doze şi cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de

antibiotic.






1. http://www.analimed.ro/analize-medicale/microbiologie/antibiograma/

2. http://www.webmd.com/a-to-z-guides/antibiotic-sensitivity-test-topic-overview

3. http://amrls.cvm.msu.edu/microbiology/detecting-antimicrobial-resistance/test-methods/examples-of-

antibiotic-sensitivity-tesing-methods

4. http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&func=displayarticle&art_id=135

5. http://cid.oxfordjournals.org/content/49/11/1749.full

6. http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinical-

diagnostics/dynPage?doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_22

8. 6. Povestire adevărată (enterococii vancomicino-rezistenți)

Enterococii au atras atenția cercetătorilor în anii 1980 datorită capacității lor de a infecta omul și

animalele dar și a abilității de a prelua diverse metode de eludare a sistemului imun ale altor bacterii.

Cu toate că bacteriile din genulEnterococcus nu sunt așa celebre precum cele din

genul Staphylococcus sau specia Escherichia coli, infecțiile cu acești germeni sunt printre cele mai

frecvente infecții ”achiziționate” de către pacienții spitalizați. Enterococii pot complica și prelungi

spitalizarea pacienților. Teoretic, persoanele care pot dezvolta infecții cu Enterococcus spp. sunt cele

deja bolnave (ex. persoanele aflate în secțiile ATI, persoanele în vârstă, bolnavii de diabet zaharat,

bolnavii cu insuficiență renală cronică etc).

Dar de fapt enterococii pot fi foarte periculoși mai ales pentru că sunt capabili să dezvolte rezistență la

antibiotice, inclusiv la vancomicină, antibioticul de ultimă linie în infectiile cu microorganisme

rezistente.

Infecțiile enterococice umane cu tulpini de enterococi rezistente la vancomicină (VRE) pot fi fatale. În

cursul anului 2004 CDC a raportat că una din trei infecții achizitionată în secțiile de terapie intensivă a

fost determinată de VRE.

În 1984, enterococii au fost încadrați în genul Enterococcus. În 1986 au apărut primele tulpini VRE în

Europa iar în 1989 a fost raportat primul caz de VRE în SUA. Între 1989-1993 procentul de îmbolnăviri

cu VRE a crescut de la 0,3% la 7,9%.

Cercetătorii caută noi soluții terapeutice pentru aceste infecții precum și o mai bună înțelegere a

caracteristicilor genetice a VRE și a modului în care se transmit genele de rezistență ale enterococului

către alte bacterii.

Numai în 2007 SUA au raportat șapte cazuri de infecții cu Staphylococcus aureus vancomicină rezistent.

Într- unul din cazuri, oamenii de stiință au confirmat transferul unei gene cheie de rezistentă la

antibiotice de laEnterococcus la Staphylococcus.

Riscuri ale îmbolnăvirii cu VRE

Enterococii pot supraviețui luni de zile. Habitatul lor normal este în primul rând tractul digestiv uman și

tractului genital feminin, enterococii fiind o parte semnificativă a populației bacteriene saprofite. Cu

toate acestea, colonizarea cu VRE poate progresa spre diverse infecții, în special la persoanele cu

anumiți factori de risc. Astfel se pot produce infecții ale tractului urinar, septicemii, endocardite și

meningite, precum și infecții grave ale rănilor deschise. Persoanele cu risc sunt:

•Persoanele tratate extensiv cu vancomicină și combinații de alte antibiotice;

•Persoanele spitalizate, mai ales atunci când primesc tratament cu antibiotice pentru perioade lungi de

timp;

•Persoanele cu un sistem imunitar slăbit, cum ar fi pacienții din unitățile de terapie intensivă, cancer

sau secții de transplant;

•Persoanele care au suferit proceduri chirurgicale;

•Persoanele cu dispozitive medicale neschimbate de mai bine de o lună, cum ar fi catetere urinare sau

catetere intravenoase centrale.

Infecțiile enterococice sunt mai frecvente la persoanele în vârstă, în special persoanele din centrele

pentru persoane în vârstă și căminele spital, deoarece acestea au mai multe șanse de a fi expuse

factorilor de risc.

8. 7. De reținut

Metodele de igienă sunt importante în profilaxia infecțiilor cu enterococi.

Programul de control al acestor infecții în spitale includ:

· Instruirea personalului spitalului în ceea ce privește rezistența la vancomicină;

· Depistarea precoce și raportarea promptă a rezistenței la vancomicină a enterococilor și a altor

microorganisme Gram-pozitive;

· Implementarea imediată a măsurilor adecvate de control a infecției pentru a preveni transmiterea VRE

de la persoană-la-persoană.


1. Tehnicile calitative de testare a sensibilităţii in vitro includ:

A. Antibiograma difuzimetrică comună

B. Antibiograma difuzimetrică comparativă

C. Antibiograma difuzimetrică standardizată

D. Metoda diluţiilor în mediu lichid

E. Metoda diluţiilor în agar

2. Tehnicile cantitative de testare a sensibilităţii in vitro includ:

A. Metoda microdiluţiilor în agar

B. Testul “E”

C. Metode şi sisteme comerciale, automatizate de testare

D. Antibiograma difuzimetrică comparativă

E. Antibiograma difuzimetrică standardizată

3. Determinarea CMB:

A. Se bazează pe cunoașterea CMI.

B. Corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate

C. Reprezintă cea mai mică concentraţie de antibiotic, în micrograme/ml, cu acţiune bacteriostatică

asupra microorganismului testat

D. Este o tehnică calitativă

E. Este o tehnica cantitativă

4. E test:

A. Reprezintă o metodă complexă de testare a sensibilităţii la antibiotice

B. Nu poate fi utilizat pentru bacteriile pretenţioase sau anaerobe

C. Se aseamănă metodei diluţiei în agar

D. Permite determinarea valorii CMI

E. Are un cost mai ridicat

5. Elementele necesare standardizării antibiogramei difuzimetrice standardizate sunt:

A. Mediul

B. Inoculul

C. Antibioticele

D. Utilizarea tulpinilor de referinţă

E. Interpretarea rezultatelor


1. În cursul unei infecții care nu răspunde la tratament nu mai este necesară refacerea antibiogramei.

2. Utilizarea antibioticelor fără recomandare medicală determină rezistența bacteriilor la antibiotice.

3. Antibiograma se poate realiza în anumite situații și dacă pacientul a luat o doză de antibiotic.

4. CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. Adevărat/Fals

5. Stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA) a fost identificat numai în infecții nosocomiale.

Reacții antigen-anticorp. Evaluarea RIC. Reacția dintre antigen (Ag) și anticorp (Ac) necesită interacțiunea epitopului (de pe Ag) cu paratopul

Ac. Factorii care condiționează interacțiunea Ag-Ac sunt:

-complementaritatea structurală (reacția este specifică);

-complementaritatea electrochimică, consecință a complementarității structurale (se adaugă forțe

intermoleculare, EX . legăturile de hidrogen etc.); energie de legare mai mare = complexe Ag-Ac mai

stabile (Figura nr. 1).

Interacțiunea dintre epitop și paratop este definită (și măsurabilă) de 2 parametri:

· Afinitatea (măsoară forța de legare dintre un epitop și un paratop); are ca substrat

complementaritatea structurală și electrochimică menționate mai sus; o interacțiune cu afinitate

înaltă presupune structuri perfect complementare, în timp ce complementaritatea imperfectă a

grupărilor reactante determină o afinitate scăzută,

· Aviditatea (suma de interacțiuni Ag-Ac; rezultă din multivalența Ag); cele mai multe Ag

posedă mai mult decât un epitop; energia totală de legare a epitopilor multipli ai unui Ag cu paratopii

specifici este mult superioară energiei individuale de interacțiune dintre epitop și paratop; complexele

Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificilă, deoarece este

necesară ruperea tuturor legăturilor existente.

Cu toate că didactic discutăm despre specificitate ca și cum ar fi ”absolută”, trebuie să cunoaștem că

există și reacții încrucișate (datorită faptului că anumite Ag posedă anumiți epitopi comuni; EX . Ag

care aparțin unor specii diferite de enterobacterii).

Etape în cadrul reacțiilor antigen-anticorp

· Interacțiunea primară (Figura nr. 2) reprezintă legarea Ac de Ag potrivite; depinde de

cantitatea și afinitatea Ac; poate fi pusă în evidență doarprin nefelometrie, deoarece complexele Ag-Ac

sunt de dimensiuni mici, solubile și se pot desface ușor;

· Interacțiunile secundare (Figura nr. 3) apar după 30 de minute (Ag poate avea mai mulți

epitopi iar Ac are minim 2 paratopi; complexele primare se reunesc, formează complexe secundare,

respectiv o rețea tridimensională, insolubilă, care devine vizibilă);

· Interacțiunile terțiare (Figura nr. 4) sunt efectele biologice mediate in vivo de complexele

Ag-Ac rezultate fie în urma interacțiunii primare, fie în urma interacțiunii secundare (EX . fagocitarea

complexelor de către macrofage, etc).

Formarea complexelor Ag-Ac depinde de atingerea unei unui anumitraport de echivalență dintre

Ag-Ac. Aceasta reprezintă punctul dintr-o reacție Ag-Ac realizată in vitro în care raportul dintre Ag și

Ac este practic egal cu 1, Ac și Ag libere în supernatant sunt minime, iar complexele formate au

dimensiunea cea mai mare (Figura nr. 5).

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/reac%C8%9Bii-antigen-anticorp-evaluarea-ric






9. Reacțiile de precipitare și reacțiile de aglutinare.

(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean) 9. 1. Cuvinte cheie

· antigen (Ag)

· anticorp (Ac)

· precipitare

· aglutinare

· raport de echivalență

· imunodifuzie

9. 2. Introducere

Reacțiile Ag-Ac sunt elemente esențiale atât în diagnosticul bacteriologic direct cât și în diagnosticul

serologic a infecțiilor (dar, bineînțeles și in vivo, în apărarea gazdei față de infecții!). Astfel, putem

evidenția în mod direct reacția dintre Ag-Ac (reacții de precipitare, reacții de aglutinare) sau putem

folosi sisteme indicator (reacția de fixare a complementului, reacția de seroneutralizare)

(vezi capitolul 10). În acest capitol vom prezenta reacțiile de precipitare și de aglutinare utilizate în

microbiologie, subliniind faptul că acestea formează o bază a diagnosticului serologic modern.

9. 3. Reacțiile de precipitare utilizate în microbiologie

Reacția de precipitare poate avea loc în mediu lichid sau solid. Unirea Ag cu Ac specifici conduce la

formarea de complexe Ag-Ac care devin insolubile și stabile (vizibile, cu ochiul liber). Reacția de

precipitare este sensibilă și specifică pentru evidențierea prezenței Ag. Metodele „clasice” prezentate în

cadrul acestui capitol stau la baza testelor moderne folosite în practica curentă.

NB: Pe parcursul capitolului, ne vom referi la Ag și Ac, dar cititorul este avizat că și imunoglobulinele

(de EX . anticorpii proveniți de la o altă specie) pot juca rol antigenic.

9. 3. 1. Reacții de precipitare în mediu lichid

9. 3. 1. 1. Reacții de precipitare în amestec

Reacția Ag-Ac este cuantificabilă. Permite, de EX . titrarea toxinei difterice (metoda

Ramon) punând în contact (în amestec, în tuburi), cantități egale din toxina difterică, cu cantități

variabile de Ac anti-toxină, al căror titru este cunoscut. Cantitatea maximă de precipitat se găsește în

tubul unde existăraportul de echivalență. Tubul care prezintă cantitatea cea mai importantă de

precipitat se poate observa relativ ușor (Figura nr. 6). Cunoscând titrul Ac, se află titrul toxinei (1 Lf =

1 limes floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antitoxică = 1 UA). Dacă

spre EX . precipitarea maximă apare în tubul în care titrul anticorpilor este de 15 UA, titrul toxinei este

de 15 Lf.

9. 3. 1. 2. Reacții de precipitare în inel

Punem în contact Ag și Ac astfel încât să nu se amestece. Reacția apare la limita dintre Ag și Ac (inel de

precipitare).

În activitatea de la LP exemplificăm prin reacția Ascoli utilizabilă pentru identificarea prezenței Ag

cărbunos (din Bacillus anthracis). Soluția de Ag se prepară din extract de organ (EX . splină) recoltat

de la un animal care a decedat cu suspiciunea de antrax (infecție generalizată cu Bacillus anthracis).

Reacția este una calitativă, prin care putem preciza doar prezența sau absența Ag. Utilizăm 3 tuburi (1

pentru reacție și 2 tuburi martor). În primul tub martor pipetăm 0,5 ml ser anticărbunos și 0,5 ml

soluție salină fiziologică iar în al doilea tub martor pipetăm 0,5 ml ser normal de cal și 0,5 ml soluție de

Ag. În aceste două tuburi, nu trebuie să apară precipitare, scopul acestor martori fiind verificarea

reactanților. În tubul de reacție pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluția de

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/9-reac%C8%9Biile-de-precipitare-%C8%99i-reac%C8%9Biile-de-aglutinare-gabriela








antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, pe peretele interior al tubului, în așa fel încât

cele 2 soluții să nu se amestece. În cazul reacției pozitive (prezența Ag cărbunos în soluția Ag), după

circa 2-5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un “inel” de precipitare (Figura nr. 7).

9. 3. 2. Reacții de precipitare în mediu gelifiat

Utilizarea gelozei (o anumită concentrație de agar în soluție, în care cei doi reactivi pot să migreze)

permite vizualizarea reacției Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.

9. 3. 2. 1. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini)

IDRS se bazează pe difuzia Ag din proba de cercetat, într-un gel care conține o cantitate constantă de

Ac. Difuzia în gel a Ag se face pornind de la godeul în care se pipetează soluția de cercetat, care poate

fi ser cu Ac (iar în gel sunt anti-Ac, IgG, IgM, IgA etc), sau un ser/soluție cu altă substanță pe care

dorim să o cuantificăm (fracțiunea C3 a complementului, siderofilina, alfa-1 antitripsina, un antigen

microbian în LCR etc.). Complexele Ag-Ac vor precipita. Rezultă un cerc de precipitare format din

puncte foarte apropiate (complexe Ag-Ac) cu diametrul direct proporțional cu concentrația de Ag din

probă. Metoda permite determinăricantitative. (Figura nr. 8)

Sunt necesare plăcuțe în care se toarnă gelul care include Ac anti structura pe care vrem să o

determinăm. Plăcile sunt cumpărate gata turnate și prezintă mici godeuri în care punem serurile de

cercetat și serul de referință (folosit ca un etalon, întrucât cunoaștem concentrația componentei

studiate). Diluăm serurile de cercetat (EX . ¼ pentru IgG, IgA și siderofilină), la fel și serul de referință.

În fiecare godeu introducem 5 ml din fiecare reactiv (referință și cercetat).

Ținem plăcuța pe masă 10 minute, apoi incubăm la termostat (37ºC), 48 ore pentru IgA și IgM și 24 de

ore pentru celelalte componente testate. Citim cu ajutorul unei rigle speciale, pe care o vom utiliza la

LP. Întâi măsurăm diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se află serul de referință

(rezultatul trebuie să corespundă indicațiilor producătorului). Dacă rezultatul este corespunzător, citim

direct diametrelor pentru serurile de cercetat (altfel, trebuie să facem corelarea cu rezultatul pentru

martor). Înregistrăm valorile diametrelor, comparăm cu rezultatele din tabele preformate și înmulțim

valoarea cu diluția probei. Am obținut rezultatul final. (Tabelul nr. 1)

9. 3. 2. 2. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)

În această variantă tehnică, Ag și Ac difuzează unul spre celălalt. După întâlnire complexele Ag-Ac

precipită și rezultă linii de precipitare vizibile. Prin folosirea acesteia, putem alege Ac dintr-un stoc

disponibil și nu este necesară includerea acestuia în agar.

Tehnica poate fi folosită ca o metodă de determinare calitativă sau semi-cantitativă. Astfel, ne permite

să evidențiem, de EX . prezența sau absența unei structuri proteice. Putem determina semi-cantitativ

alfa-fetoproteină, proteină C reactivă, beta-2 microglobulină, produși de degragare ai fibrinogenului

etc. În micologie putem identifica exoantigene fungice (Histoplasma capsulatum, Coccidioides

immitis etc), etc.

Pe o lamă de microscop se toarnă un gel de agar 1% (păstrată în cameră umedă, la frigider). După

întărirea gelului, perforăm 1-3 grupe de godeuri, 7 godeuri în fiecare grup (1 godeu central, 6 godeuri

periferice). De EX . pentru determinarea proteinei C reactivă (C reactive protein, CRP, reactant de fază

acută) la pacienți, utilizăm un ser cu Ac anti-CRP, seruri de la pacienți și un ser de referință cu CRP. În

godeul central pipetăm Ac anti-CRP, în godeurile 1 și 4 pipetăm ser de referință cu CRP, iar în celelalte

godeuri pipetăm serurile de cercetat. Incubăm (37ºC, 24 de ore) în cameră umedă.

Verificăm dacă între godeul central și godeurile 1 și 4 (martori pozitivi) au apărut linii (arcuri) de

precipitare. Dacă este așa, urmărim situația pentru serurile de testat. Acolo unde apare linie de

precipitare, rezultatul este pozitiv (Figura nr. 9).

9. 3. 2. 3. Dubla difuzie (Elek)

Este o metodă calitativă utilă pentru depistarea tulpinilor toxigene

deCorynebacterium diphteriae (apariția liniilor de precipitare demonstrează elaborarea toxinei) (Figura

nr. 10).

Mediul este turnat în placa Petri, așteptăm să se întărească și apoi decupăm un șanț pe unul din

diametre. În acest șanț pipetăm 0,5 ml ser antidifteric (cu Ac anti-toxină difterică, concentrația fiind

1.000 UI/ml). Ac anti-toxină difterică difuzează în mediu. După 2 ore însămânțăm perpendicular pe

acest șanț și de fiecare parte a șanțului, 1 tulpină toxigenă (martor pozitiv), 1 tulpină ne-toxigenă







(martor negativ) și câteva tulpini de cercetat. Incubăm timp de 48 de ore, la 37ºC, timp în care

tulpinile însămânțate se dezvoltă. Din striurile cu tulpină toxigenă, toxina difuzează în mediu și apare

reacția de precipitare a complexului Ag-Ac. Când examinăm placa, urmărim apariția culturii și a

precipitatului (linii de precipitare în unghiurile dintre cultură și șanțul cu Ac anti-toxină) care trebuie să

apară cel puțin la martorul pozitiv.

9. 3. 3. Reacții de precipitare în combinație cu migrarea în câmp electric

9. 3. 3. 1. Electroforeza proteică în gel

Tehnica este folosită în laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice.

Deplasarea proteinelor în gel (supus câmpului electric) se face diferențiat (în funcție de greutatea

moleculară și încărcătura electrică a fiecărei proteine, în parte).

9. 3. 3. 2. Imunoelectroforeza

Electroforeza este asociată cu imunodifuzia dublă. Proteinele sunt întâi separate prin electroforeză apoi

are loc imunodifuzia dublă. Putem utiliza un ser monovalent sau polivalent, cu Ac anti-structura a cărei

prezență dorim să o determinăm. Reacția Ag-Ac devine vizibilă sub forma unor arcuri de precipitare

(Figura nr. 11).

9. 3. 3. 3. Contraimunoelectroforeza (CIE)

Este o dublă difuzie. Deplasarea Ag și Ac este accelerată de câmpul electric. Turnăm gel de agar pe o

lamă de microscop, perforăm 1-3 grupe de perechi de godeuri, față în față (EX . Ag migrează spre

anod). Astfel, în unul din cele 1-3 grupuri de godeuri pereche opuse catodului (polul negativ) pipetăm

Ac cunoscuți iar în godeurile opuse anodului (polul pozitiv) pipetăm Ag cunoscute. Tehnica este mai

rapidă și mai sensibilă decât dubla difuzie, prin amplificarea datorată câmpului electric. Linia de

precipitare poate deveni vizibilă după 30-90 minute (Figura nr. 12). Se poate utiliza pentru identificarea

Ag K în LCR la pacienți cu meningită acută (H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae),

facilitând un diagnostic rapid.

9. 4. Reacțiile de aglutinare utilizate în microbiologie

Reacția de aglutinare sunt similare cu reacțiile de precipitare, cu mențiunea că Ag sunt de natură

corpusculară. Aglutinareaeste mai sensibilă decât precipitarea.

Există mai multe tipuri de aglutinare:

· Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale (bacterii, celule) de către Ac specifici. Se poate

utiliza în diagnosticulbacteriologic (EX . pentru identificarea enterobacteriilor), în

diagnosticul serologic al febrei tifoide etc.;

· Aglutinarea indirectă este o reacție în care diferite particule (hematii formolizate, latex, cristale de

colesterol etc) sunt “cuplate”in vitro cu Ag sau Ac și sunt astfel pregătite să participe la reacția de

aglutinare prin combinare cu Ac sau Ag corespunzătoare, din proba de cercetat (EX . determinarea

CRP);

· Inhibarea aglutinării (vezi și HAI de la LP virusologie) etc.

9. 4. 1 Reacții de aglutinare utilizate în diagnosticul microbiologic direct

Executăm această tehnică (aglutinare pe lamă) pentru identificarea tulpinii bacteriene implicate

etiologic în respectiva boală infecțioasă. Se pot face și aglutinări în tuburi, pentru confirmarea

rezultatului obținut pe lamă. Unele laboratoare își pot sintetiza in house reactivii necesari.

În cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., E. coli etc) sau a unei alte tulpini (EX

. Vibrio spp.), după cultivarea p.p. pe diferite medii (vezi capitolele 13 și 14) și după ce obținem colonii

izolate, putem face reacția de aglutinare. Așadar, avem nevoie de cultura de identificat (cultură

proaspătă, de 18-24 de ore, cu colonii de tip S), soluție salină fiziologică, Ac cunoscuți față de Ag pe

care dorim să le identificăm (Ac polivalenți, Ac monovalenți de grup, Ac monovalenți de tip, după caz),

lame de microscop, amestec dezinfectant etc.

Pe o lamă punem o picătură de soluție salină fiziologică, în care descărcăm un fragment din colonia de

identificat, amestecăm până obținem o suspensie tulbure. Dacă picătura devine limpede, cu grunji,

înseamnă că apare „autoaglutinare” și nu mai putem să identificăm tulpina prin reacție Ag-Ac (ar putea

fi, de EX . o tulpină din colonie de tip R, care și-a modificat structura). Dacă suspensia rămâne tulbure,

putem continua aplicarea tehnicii. Pe aceeași lamă, la cealaltă extremitate, punem o picătură de ser cu

Ac cunoscuți (polivalenți). Descărcăm un fragment din colonia de identificat în picătura de ser cu Ac și












amestecăm până obținem o suspensie tulbure. Prin înclinare, în mai multe direcții, favorizăm contactul

dintre Ag-Ac mici și apar complexe mici, apoi rețele de complexe Ag-Ac. Apar grunjii de aglutinare.

Citim reacția pe un fond negru. Lamele pe care am executat reacția de aglutinare conțin

microorganisme vii și trebuie să le introduce în amestecul dezinfectant, după examinarea rezultatelor

reacției.

Reacția de aglutinare indirectă se poate folosi pentru determinarea grupului streptococic, pentru

detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri

și pentru detectarea prezenței Ag în lichide biologice. Tot prin tehnici de aglutinare indirectă se pot

identifica exotoxine.

9. 4. 2. Reacții de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic

În diagnosticul serologic, în mod obișnuit, reacțiile utilizate permit detectarea prezenței Ac în serul de

cercetat dar și stabilirea titrului. Totuși există și câteva exemple de reacții de aglutinare calitative.

9. 4. 2. 1. Aglutinarea pe lamă

Reacția de aglutinare pe lamă (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat în istoria medicinei. Avem

nevoie de lame de microscop, Ag brucelos inactivat (colorat în violet) și ser de cercetat. Pe lamă

depunem o picătură din soluția de Ag brucelos și o picătură de ser de cercetat. Amestecăm și

omogenizăm cei 2 reactanți. Reacția este pozitivă în cazul în care se remarcă prezența aglutinatelor.

Reacția pozitivă pe lamă trebuie confirmată prin aglutinare în tuburi.

9. 4. 2. 2. Aglutinarea în tuburi

Tehnica poate fi folosită în diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), în diagnosticul serologic al

infecțiilor produse de Cryptococcus neoformans, în diagnosticul serologic al febrei tifoide

(reacție Widal - ca nume istoric) etc.

Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice vom folosi seruri recoltate în dinamică, la 7-10 zile

„distanță”, Ag cunoscute (Ag O și Ag H), 4 șiruri de eprubete (două șiruri pentru anti-O, două șiruri

pentru anti-H (pentru că vom lucra în cele două probe, în dinamică, pentru fiecare tip de Ac). Pentru

fiecare șir de tuburi diluăm binar serul de cercetat. În final, pentru fiecare șir avem: un tub martor

(tampon pentru diluție + Ag, fără ser) și tuburi cu serul diluat, de EX . 1/40, 1/80, 1/160 etc (un șir de

tuburi pentru serul recoltat de la pacient „astăzi” și altul „la 10 zile”, pentru titrarea Ac anti-O și încă

două șiruri pentru titrarea Ac anti-H). Incubăm cele 2 șiruri de tuburi cu Ag O timp de 20 ore la 52ºC iar

cele 2 șiruri de tuburi cu Ag H le incubăm 2 ore la 52ºC plus 10 minute la temperatura camerei.

Evaluarea o facem pentru fiecare tub în parte, începând de la diluțiile mari, prin examinare și ușoară

agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezintă aglutinare vizibilă stabilește titrul

reacției (pentru fiecare șir de tuburi, în parte). Un titru care crește de 4 ori „în dinamică” stabilește

diagnosticul în mod cert.

În cazul unor pacienți care se află în convalescență sau în cazul persoanelor care ar putea fi purtători

încercăm să stabilim titrul Ac anti-Vi.










Iată atât o situație de urgență în pediatrie cât și modul în care ar trebui condus diagnosticul și

comunicarea dintre echipa de clinicieni și medici de laborator, astfel încât diagnosticul și tratamentul

să fie obținut cât mai repede, în favoarea pacientului.

Un copil de 19 luni este adus la camera de gardă a unui spital de pediatrie în urma unei crize comițiale.

Din anamneza mamei, aflăm că în urmă cu 2-3 zile s-au instalat simptome de răceală (tuse, congestie

nazală, și febră), care s-au agravat în cursul zilei în care se prezintă la spital. Copilul a fost agitat, nu a

mâncat și a dormit cea mai mare parte a dimineții (sau cel puțin aceasta a fost impresia mamei). Au



urmat două crize comițiale (grand-mal). Copilul nu avea istoric de convulsii. Mama a afirmat că nu s-au

făcut toate vaccinările. La examenul clinic starea copilului este gravă, temperatura de 38,1ºC, alura

ventriculară 110 bătăi pe minut. Nu răspunde la vocea mamei, și nu retrage extremitățile la stimuli

dureroși. Copilul prezintă grimase atunci când se încearcă hiperflexia gâtului. Nu prezintă erupție

cutanată. Examenul ORL (nas, gât, urechi), cardiovascular, pulmonar și abdominal sunt normale.

Examenele paraclinice notează un număr mare de celule albe în sânge. Se ia decizia de a efectua o

puncție lombară.

Se recoltează 3 eprubete cu LCR (aspect intens tulbure). Examinarea a 2 frotiuri din LCR, colorate AM și

Gram, evidențiază frecvente celule PMN, rare hematii și multiple microorganisme cocobacilare roșii

(colorația Gram) dispuse intra și extracelular.

Se comunică rezultatele colegilor din clinică și este început tratamentul cu o cefalosporină de

generația a treia, administrată intravenos.

Se însămânțează pe: 1. agar-sânge (pe care se aplică și 2 microcomprimate cu factorii de creștere X și

V), 2. agar-chocolat, 3. McConkey și 4. Mueller-Hinton.

Se efectuează CIE din LCR confirmând prezența antigenelor pentru H. influenzae, tip b. Rezultatele sunt

imediat transmise colegilor din clinică. După 1 zi, rezultatele culturilor efectuate confirmă creșterea pe

mediile îmbogățite, caracteristică H. influenzae. Se efectuează o reacție de aglutinare pe lamă care

confirmă tipul b.

În ziua următoare, copilul a început să mănânce și să se joace în mod normal. Nu mai prezintă febră și

rigiditatea gâtului este mult diminuată. Tratamentul este continuat 7 zile, iar copilul este externat cu

diagnosticul de meningită acută bacteriană cu H. influenzae tip b, vindecată. La vizitele de control,

mama nu mai raportează nici un episod de criză comițială, iar copilul se dezvoltă normal.

9. 7. De reținut

Reacțiile Ag-Ac au un rol important atât in vivo cât și in vitro, pentru diagnostic și tratament. Există

multe variante tehnice prin care aceste reacții pot fi puse în evidență. Aceste reacții pot fi folosite atât

în diagnosticul bacteriologic direct (detecția Ag prezente la nivelul unei bacterii, utilă în identificarea

microorganismului) cât și în diagnosticul serologic (detecția în serul pacientului a Ac îndreptați

împotriva unui anume Ag).


1. Etapele reacției antigen-anticorp sunt:

A. Interacțiunea primară reprezintă legarea anticorpilor de antigenele specifice

B. Interacțiunea primară poate fi vizualizată sub formă de flocoane de aglutinare

C. Interacțiunea secundară implică formarea unei rețele tridimensionale vizibile

D. Interacțiunea secundară apare după circa 10 de minute

E. Interacțiunea terțiară implică activitatea in vitro a complexelor Ag-Ac

2. Reacția de precipitare Elek:

A. Este folosită pentru a determina toxigeneza unei tulpini de Clostridium botulinum

B. Se efectuează pe mediul Muller-Hinton

C. Necesită aproximativ 2 ore pentru ca Ac anti-toxină difterice să difuzeze în mediu

D. Implică însămânțarea a 2 martori (negativ și pozitiv) și a tulpinilor de investigat

E. Toxinogeneza se evidențiază prin apariția liniilor de precipitare în unghiurile dintre cultură și șanțul

cu Ac anti-toxină

3. Contraimunoelectroforeza:

A. Este o metodă mai rapidă decât imunoelectroforeza

B. Ac vor migra spre catod

C. Tehnica poate fi utilizată doar dacă Ag investigat migrează spre anod

D. Poate fi folosit în identificarea Ag K

E. Poate identifica Ag de la S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae

4. Afirmațiile FALSE despre reacții de precipitare în inel:

A. Este o reacție cantitativă

B. Reacția Ascoli este folosită pentru identificarea prezenței Ag cărbunos

C. Pentru a efectua reacția, avem nevoie de 4 tuburi (3 martori și o probă)

D. Ag și Ac se amestecă în eprubeta probă

E. După circa 5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un “inel” de precipitare

5. În reacțiile de aglutinare putem folosi:

A. Ag solubile, precum exotoxinele secretate de Corynebacterium dyphteriae

B. Ag corpusculare naturale (bacterii, celule)

C. Particule pe care s-au “cuplat” in vitro cu Ag

D. Eritrocite, în scopul determinării grupei ABO

E. Particule de latex pe care s-au alipit Ac

9. 9. ”Myth busters” (alegeți între ”Adevărat” și ”Fals”)

1. Folosind reacțiile de precipitare, putem determina cantitativ titrul unei exotoxine în serul pacientului.

2. Reacțiile de aglutinare pe lamă pot contribui la diagnosticul meningitei acute bacteriene înaintea

obținerii culturilor primare.

3. Toxinogeneza tulpinilor de Clostridium botulinum este evidențiată de testul Elek.

4. Folosind reacția de aglutinare indirectă putem determina grupul streptococic.

5. Atunci când dorim să evidențiem caracteristicile antigenice ale unei culturi bacteriene, vom lucra

mereu cu culturi proaspete deoarece microorganismele „bătrâne” nu își păstrează caracteristicile

antigenice.

10. Reacții antigen-anticorp care nu sunt vizibile, direct.

(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean) 10. 1. Cuvinte cheie

· fixare a complementului

· seroneutralizare

· ASLO

· boli poststreptococice

· radioimunoanaliza

· analiză imunoenzimatică

· Imunofluorescență

10. 2. Introducere

Există și reacții Ag-Ac care nu pot fi vizualizate direct; în această situație este necesară utilizarea unui

„artificiu tehnic” (EX . utilizarea unui sistem hemolitic, etc).

10. 3. Reacții în care folosim un sistem hemolitic indicator

10. 3. 1. Reacția de fixare a complementului (RFC)

Rezultatul reacției nu este vizibil în absența folosirii un sistem hemolitic indicator. Reacțiile Ag-Ac,

așadar și RFC, se pot folosi atât pentru identificarea Ag cât și în diagnosticul serologic (identificarea

Ac). Cu toate că RFC este o tehnică laborioasă, executată corect este foarte exactă, cu sensibilitate și

specificitate ridicată.

RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecțiilor produse de Brucella

spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.,Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., în

diagnosticul serologic al unor viroze, etc.

Vom lua ca exemplu RFC Bordet-Wassermann (RBW). Aceasta este o metodă calitativă de identificare a

Ac împotriva T. pallidum (atenție, Ag este nespecific!).

Principiu

Se inactivează C¢ endogen (cel prezent în serul pacientului) deoarece poate prezenta variații

cantitative (EX . în lupus eritematos sistemic; unele infecții duc la scăderea nivelului C¢; unele

neoplazii determină nivele crescute ale C¢). Se adaugă C¢ exogen (cantitate stabilită conform

protocolului). a.Dacă în serul de cercetat există Ac specifici, rezultă un complex Ag-Ac pe care se

fixează C¢(C¢nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul indicator hematii-Ac anti-hematii,

adăugat în a doua etapă). b.Dacă în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se formează complex

Ag-Ac și C¢ rămâne liber. După adăugarea sistemului indicator, dacă există C¢ liber, acesta se va lega

de complexele Ag-Ac ai sistemului indicator și va conduce la apariția hemolizei.

Tehnica de lucru

Utilizăm ser de cercetat, seruri de referință (martor pozitiv și negativ), Ag cunoscut, C¢, sistemul

hemolitic indicator, baie de apă pentru inactivarea serului propriu (la 56°C) etc.

În RBW folosim 2 eprubete cu diluții diferite ale serului pacientului și eprubetele martor (sigur pozitiv,

sigur negativ, martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C¢, martor pentru

sistemul hemolitic); înprima etapă punem în reacție serul de cercetat, C¢ și Ag cunoscut; în a doua

etapă se introduce în reacție sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie).

Interpretare

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/10-reac%C8%9Bii-antigen-anticorp-care-nu-sunt-vizibile-direct-gabriela




Verificăm întâi rezultatele apărute pentru martori (EX . în tubul martor sigur pozitiv nu trebuie să

apară hemoliză). (Figura nr. 1)

Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hematiile se depun

formând un “buton” în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există Ac). Pentru a stabili

diagnosticul este obligatoriu ca un rezultat pozitiv să fie confirmat prin reacții specifice (deoarece

cardiolipina este un Ag nespecific!).

10. 3. 2. Reacția de neutralizare (seroneutralizare; RSN)

Ag are o proprietate biologică (EX . toxică) care poate fi blocată/neutralizată prin cuplarea cu Ac

specific. RSN se poate utiliza în:

· diagnosticul bacteriologic (EX . identificarea Clostridium perfringensprin metoda plăcilor

semineutralizate, toxinotipia în cazul suspicionării TIA cuClostridium botulinum, pe animale de

laborator);

· diagnosticul serologic (EX . reacția ASLO, în bolile post-streptococice);

· prevenirea unor boli infecțioase prin vaccinare;

· evaluarea eficacității vaccinale (titrarea prezenței Ac anti-toxine, testarea prin

intradermoreacție a susceptibilității față de o anumită boală infecțioasă care are la bază drept

mecanism patogenic efectul unei exotoxine, EX . difterie);

· tratamentul unor boli infecțioase (seroterapie).

10. 3. 2. 1. Reacția ASLO

Se poate utiliza în diagnosticul retrospectiv al unei infecții streptococice sau pentru confirmarea

etiologiei bolilor poststreptococice; determinăm titrul Ac anti streptolizină O (SLO).

Principiu

SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dacă în serul pacientului există Ac

anti-SLO, acțiunea hemolitică a SLO este neutralizată. Prin diluții efectuate în tuburi, determinăm titrul

ASLO (cea mai bună tehnică este cea clasică!).

Tehnica de lucru (Tabelul nr. 1)

Utilizămseruri de cercetat în pereche (recoltate la interval de 7-10 zile), SLO liofilizată, sânge defibrinat

de iepure, soluție salină izotonă, soluție de rivanol 0,3%, eprubete, pipete gradate foarte curate, baie

de apă, centrifugă etc.

Respectăm cu strictețe indicațiile din protocolul de lucru (EX . omogenizăm suspensia de hematii,

diluăm serul 1/10 și repartizăm în tuburi; adăugăm o cantitate constantă de SLO). Nu putem vizualiza

rezultatul reacției în această etapă. Este necesară a doua etapă (agităm tuburile, adăugăm suspensia

de hematii, agităm pentru omogenizare; incubăm 45 minute, la 37°C, centrifugăm; ținem tuburile la

frigider, până a doua zi).

Interpretare (Figura nr. 2)

Prin respectarea protocolului, titrul potențial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333 etc.

Titrul reacției ASLO este dat de cea mai mare diluție de ser la care lipsește complet hemoliza. În țara

noastră se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unități ASLO. Există și alte teste serologice

care pot fi utilizate (EX . anti dexoribonucleotidaza B). S-a demonstrat că dinamica

serologiei (creșterea de patru ori a titrului între două determinări succesive) este mai importantă decât

valoarea absolută a titrului, înregistrându-se nivele crescute (titru de >1900 unități ASLO) în absența

simptomatologiei sau a dovezii microbiologice a unei infecții cu streptococ beta hemolitic de grup A

timp de mai mult de 2 ani. De asemenea, există și situații în care, dinamica ASLO este constantă, în

absența simptomatologiei clinice.

10. 3. 2. 2. RSN în profilaxia și tratamentul unor boli infecțioase

Vaccinarea în scopul obținerii unei protecții prin seroneutralizare

Vaccinul DTaP (celular) se face după următoarea schemă: primovaccinarea începe la vârsta de 2 luni a

nou-născutului (se administrează 3 doze la interval de 2 luni, la 2, 4, 6 luni). Pentru menținerea

imunității se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practică la

36 de luni de viață a copilului. Următoarea revaccinare are loc la intrarea în școala primară. Iar mai

departe, se recomandă rapeluri cu dT din 10 în 10 ani. (Tabelul nr. 2)

Evaluarea eficacității vaccinurilor















Este recomandată testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare. Spre EX . se titrează Ac anti-

toxină (difterică, tetanică etc) în seruri prelevate de la persoanele vaccinate. Protecția anti-difterică e

asigurată de un titru de Ac-anti toxină difterică mai mare de 0,03 UAI/ml.

Terapia sau profilaxia specifică

Se pot administra de imunoglobuline specifice omologe (de la persoane imunizate), de EX .

imunoterapia infecției cu Clostridium tetani când administrăm intramuscular 3-6.000 UAI. Se pot

administra seruri imune heterologe (obținute prin hiperimunizarea cailor) în tratamentul tetanosului,

difteriei, botulismului etc.

Seroterapia poate reprezenta o urgență medicală.

10. 4. Reacții în care componentele sunt marcate

Marcarea componentelor se poate face:

· izotopic (radio immuno assay, RIA)

· enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)

· fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)

10. 4. 1. Radioimunoanaliza (RIA) (Figura nr. 3)

Pentru marcarea Ag se poate utiliza 14

C etc. Se introduce în reacție o cantitate cunoscută de Ag marcat,

Ag nemarcat (dorim să îl dozăm) și Ac cunoscuți corespunzători Ag. Rezultă o competiție pentru

cuplarea cu Ac între Ag marcat și Ag nemarcat, care se află în proporții diferite, în funcție de cantitatea

Ag de studiat. Se pot folosi tehnici imunologice, cromatografice sau de fază solidă pentru a separa Ag

marcat liber de cel legat în complexele Ag-Ac. Urmărim protocol de lucru și în final măsurăm

radioactivitatea complexului Ag-Ac. RIA este o tehnică cu foarte mare sensibilitate dar, utilizând

radioactivitatea, este înlocuită din ce în ce mai mult cu tehnica ELISA/EIA.

10. 4. 2. Analiza imunoenzimatică (ELISA/EIA)

Tehnicile ELISA pot fi utilizate atât pentru identificarea Ag cât și pentru identificarea și / sau titrarea Ac,

existând de principiu următoarea succesiune de reacții, în cadrul protocolului: (Figurile nr. 4 și 5)

· primul reactiv (fie Ag, fie Ac, depinde de ce urmărim să determinăm) este “fixat” pe un suport

solid (EX . godeurile unei plăci speciale, cumpărate de la producător);

· adăugăm al doilea reactiv, pe care dorim să îl determinăm (Ac sau Ag);

· dacă există „potrivire” între cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea

reactivilor care nu au intrat în complex se spală (automat);

· se adaugă un reactiv marcat (EX . se poate adăuga un alt anticorp anti-Ac (anti-Fc), cuplat cu un

conjugat enzimatic); are loc o nouă spălare (automat);

· se adaugă un substrat cromogen pentru enzima marcantă; modificările enzimatice duc la o

modificare de culoare vizibilă cu ochiul liber (însă interpretarea se face automat, la fel ca și

înregistrarea rezultatelor);

· valorile înregistrate pentru “probă” se compară cu valorile înregistrate pentru martorul pozitiv și

martorul negativ, se aplică o formulă (indicată de către producător; calculul se realizează tot automat);

· interpretarea se face conform indicațiilor din protocolul care însoțește trusa ELISA.

Mai frecvent sunt utilizate fosfataza alcalină (substrat cromogen = p-nitro-fenil-fosfat) sau peroxidaza

(substrat cromogen = o-fenilen-diamina în soluție de apă oxigenată).









Specificitatea este bună sau foarte bună iar sensibilitatea este comparabilă cu cea obținută în cazul

RIA. Tehnica este automatizată, iar ansamblul de instrumente foarte flexibil, permițându-ne practic să

efectuăm orice test dorim.(Figura nr. 6, Tabelul nr. 3)

10. 4. 3. Imunofluorescența (IF/FIA)

Pentru a efectua această tehnică este necesar ca unul dintre reactivi (Ag, Ac sau anticorp anti-Ac) să fie

marcat fluorescent. Imunofluorescența poate fi utilizată atât în diagnosticul microbiologic direct (pe

p.p. recoltat de la bolnav sau pe cultura pură) cât și în diagnosticul serologic. (Figurile nr. 7 și 8)

Fluorocromii (EX . auramină O, rhodamină B, etc) sunt compuși organici care, după “iradiere” cu

radiații UV absorb radiația de o anumită lungime de undă, intră în stare de excitație; atunci când revin

în “starea normală” pierd energia acumulată emițând radiații luminoase sub forma de fotoni de o

lungime de undă inferioară. Lumina vizibilă emisă depinde de fluorocrom (EX . culoare galbenă

pentru auramină O).

10. 4. 3. 1. IF directă (Figura nr. 7)

Principiu

Folosim Ac marcați fluorescent pentru a ținti un Ag pe care îl bănuim prezent.

Tehnica de lucru

Facem un frotiu pe care îl acoperim cu serul care conține Ac marcați fluorescent, incubăm, spălăm

pentru a îndepărta Ac care nu au intrat în complexul Ag-Ac. NB. Putem adapta tehnica pentru a

”colora” diferite Ag (EX . pentru a decela și alte tipuri celulare prezente), materialul genetic (ex. pentru

a ”colora” nucleul celulelor eucariote). Așteptăm să se usuce și examinăm cu microscopul cu

fluorescență.

Interpretare

Această tehnică are avantajul de a prezenta o discriminare spațială a Ag investigate. Metoda este

rapidă și aplicabilă pentru frotiuri din p.p. sau din cultură, în anatomia patologică etc. Pentru fiecare Ag

de cercetat trebuie preparat serul care conține Ac specifici, marcați fluorescent. Putem

identificaLegionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis,Chlamydia

trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans,Histoplasma capsulatum, Pneumocystis

carinii etc.

10. 4. 3. 2. IF indirectă (Figura nr. 8)

Principiu

Ag este cunoscut și urmărim obiectivarea unui Ac. Vom folosi un al doilea anticorp anti-Ac (țintiți

împotriva porțiunii Fc a primului anticorp).

Tehnica de lucru

Facem un frotiu, îl acoperim cu serul de cercetat. După incubație spălăm pentru îndepărtarea

reactivilor care nu au intrat în reacția Ag-Ac. Punem apoi un ser cu Ac anti-Ig de om, marcați

fluorescent și incubăm. Spălăm, așteptăm uscarea frotiului, examinăm la microscopul cu fluorescență.

Interpretare

Dacă în serul de cercetat există Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului Ag-Ac iar în

etapa următoare, Ac anti-Ig de om se cuplează pe complex și în mod indirect, prin IF, identificăm Ac.

Metoda poate fi utilizată în diagnosticul serologic al legionelozei, leptospirozei, sifilisului, boreliozei,

infecțiilor produse Mycoplasma pneumoniae, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis

carinii etc.

















Cazul 1. Un băiat de 6 ani se prezintă cu edem generalizat, hipertensiune, hematurie microscopică și

proteinurie. La examenul paraclinic, prezenta disfuncție renală moderată (uree serică 48 mg/dl,

creatinină serică 0,8 mg/dl) și nivele scăzute ale complementului (CH50: 17U/ml; C3: 6mg/dl și C4:

4mg/dl). Titrul ASLO a fost normal. S-a pus diagnosticul de GlomeruloNefrită Acută (GNA). A prezentat

impetigo repetat la nivelul membrelor inferioare în lunile premergătoare Una dintre surorile sale (Cazul

3) a fost diagnosticată cu Faringită Streptococică (FS) în momentul diagnosticului de GNA în acest

pacient (Cazul 1).

Cazul 2. O fată de 13 ani, prezintă edem generalizat, la 2 săptămâni după debutul GNA în Cazul 1. La

examenul clinic, se mai notează hipertensiune. Paraclinic, prezintă hematurie microscopică, proteinurie,

disfuncție renală ușoară (uree serică 43 mg/dl, creatinină serică 1.0 mg/dl). Cu 2 săptămâni înainte de

debutul GNA, a acuzat durere faringiană, concomitent cu diagnosticul de FS a Cazului 3. La momentul

diagnosticului, prezintă dermatită atopică și impetigo a membrelor inferioare. Titrul ASLO este normal

în limite normale. S-a recoltat Exudat Faringian (EF) din care s-au izolat o tulpină de streptococ beta

hemolitic de grup A. Acesta a fost serotip 49.

Cazul 3. O fată de 9 ani, sora Cazului 1 și Cazului 2 prezintă rash maculopapular la nivelul faței și

trunchiului și limbă zmeurie. După tratamentcu antibiotice timp de 4 zile, a fost adusă la spital și s-a

pus diagnosticaticul cu FS. S-a recoltat EF dar nu s-au putut izolat tulpini de S. pyogenes. Titrul ASLO a

fost crescut (542 UI/ml). Nu s-au decelat hipertensiune sau edem. La examenul sumarului de urină se

notează hematurie microscopică.

Discuții. Nu există istoric de boli de renale în familie, iar copiii erau clinic sănătoși până în momentul

declanșării GNA și FS. Proteinuria s-a remis în 2 săptămâni de la debutul GNA în Cazul 1 și 2. Nivelul de

creatinină serică a scăzut, atingând 0.3 mg/dl (Cazul 1), respectiv 0.5 mg/dl (Cazul 2). Nivelul de

complement seric s-a normalizat la 2 luni de la debutul GNA. Hematuria microscopică s-a remis după o

lună în Cazul 3 și după 4 luni în Cazul 1 și 2. Cazul 3 a fost diagnosticat cu GNA subclinică, datorită

hematuriei microscopice tranzitorii ce au urmat FS.

NB: În aceste cazuri, titrul ASLO s-a interpretat în funcție de titrul maxim admis. Recomandarea noastră

este ca de fiecare dată, titrul de Ac să fie măsurat „în dinamică”.

10. 7. De reținut

Reacțiile antigen-anticorp care nu sunt vizibile direct folosesc artificii tehnice (sisteme indicatoare,

component marcate) pentru a pune în evidență complexe Ag-Ac de dimensiuni foarte mici, crescând

astfel sensibilitatea reacțiilor, menținând specificitatea caracteristică acestor reacții.

Majoritatea variantelor tehnice pot fi folosite atât pentru diagnosticul bacteriologic direct cât și pentru

diagnosticul serologic. Reacțiile moderne (ELISA/EIA) sunt automatizate și pot oferi rezultate rapide.


1. Reacția de fixare a complementului:

A. Folosește complementul endogen

B. Folosește complement adăugat exogen, după inactivarea complementului endogen

C. Poate fi folosită doar calitativ, precum în Reacția Bordet-Wassermann

D. Poate fi folosită atât în în diagnosticul bacteriologic direct cât și în diagnosticul serologic

E. RBW este identifică anticorpii împotriva Treponema pallidum

2. Reacția de seroneutralizare ASLO:

A. Testul este folosit pentru identificarea antigenelor SLO în serul pacientulu

B. Titrul reacției ASLO este dat de cea mai mare diluție de ser la care hemoliza este completă

C. În România, se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unități ASLO

D. Interpretarea corectă a testului se face având două seruri recoltate „în dinamică”

E. Necesită sânge integral iepure ca sistem indicator

3. În reacțiile în care componentele sunt marcate:

A. Tehnica de radioimunoanaliză implică folosirea de Ag marcate 3H,

14C

B. Vom folosi Ag marcate și Ag nemarcat

C. Vom folosi Ac cunoscuți corespunzători Ag

D. Tehnica se bazează pe formarea de complexe Ag-Ac care vor fi radioactive

E. Radioactivitatea complexelor este corespunzătoare Ag fluorescent-Ac

4. Imunofluorescența directă:

A. Poate fi folosită pentru a detecta Ag unui microorganism pe un frotiu examinat corespunzător

B. Poate folosi Ac marcați cu auramină O, caz în care complexele Ag-Ac vor fi de culoare galbenă

C. Imunofluorescența poate fi utilizată și în diagnosticul serologic

D. Fluorocromii pierd energia acumulată emițând radiații luminoase sub forma de fotoni de o

lungime de undă superioară

E. Folosim un ser cu Ac anti-Ig de om, marcat fluorescent

5. Pașii generici urmați pentru tehnica ELISA/EIA sunt:

A. primul reactiv Ag sau Ac este liber în godeurile unei plăci speciale

B. adăugăm al doilea reactiv, pe care dorim să îl determinăm (Ac sau Ag)

C. dacă există „potrivire” între cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac

D. se adaugă un fluorocrom cuplat chimicde un anticorp anti-Ac (anti-Fc)

E. Nu necesită adiția unui substrat cromogen

10. 9. ”Myth busters” (alegeți între ”Adevărat” și ”Fals”)

1. Fluorocromii excitați de o undă de radiație cu lungime de undă superioară, va pierde energia

acumulată emițând radiații luminoase sub forma de fotoni de o lungime de undă inferioară.

2. În cadrul reacției de seroneutralizare ASLO, vom folosi un sistem indicator format din eritrocite și Ac

anti-eritrocite.

3. RBW este o reacție calitativă ce va folosi diluții prespecificate ale serului pacientului pentru a detecta

Ac împotriva T. pallidum.

4. O valoare a titrului ASLO peste 250 sau peste 500, în România, este clar patologică și necesită

tratament.

5. RIA sunt foarte puțin sensibile, dar se folosesc datorită costului scăzut și a ușurinței de execuție.

11. Testarea imunităţii de tip celular. (MI Popa,

Alexandru-Andrei Muntean, Gabriela-Loredana Popa) 11. 1. Cuvinte cheie

· răspuns imun celular (RIC)

· intradermoreacție (IDR)

· purified protein derivate – derivat proteic purificat (PPD)

· Mantoux

· imunodeficiență

11. 2. Introducere

Putem folosi testele adresate RIC în cadrul diagnosticului imunobiologic sau în diagnosticul de

laborator pentru anumite boli infecțioase (EX tuberculoza produsă de Mycobacterium tuberculosis)

dar și în investigarea imunităţii de tipcelular pentru un subiect cu suspiciune clinică de imunodeficientă

(primară sau secundară).

11. 3. 1. Diagnosticul imunobiologic și imunologic de laborator al infecției cu Mycobacterium

tuberculosis

11. 3. 1. 1. IDR cu PPD

Principiu

Tuberculina reprezintă un amestec de Ag proteice mycobacteriene (întâi secultivă M. tuberculosis în

mediu lichid, EX . Sauton; după o perioadă bine stabilită de multiplicare, cultura se filtrează și apoi

prin mai multe proceduri de selectare-purificare se obține extractul proteic).

Dacă o persoană este infectată cu germeni din grupul Mycobacterium tuberculosis, urmează

sensibilizarea şi proliferarea LT. IDR cu PPD stimulează LT şi RIC (inclusiv hipersensibilitatea de tip IV).

Rezultă vasodilataţie, edem şi infiltrat cu LT, bazofile, monocite, neutrofile etc. Se cunoaşte că reacţia

maximă este la circa 48 ore. Aria induraţiei reflectă HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacţie

pozitivă.

Procedura

Ne asigurăm că dispunem de toate materialele necesare: seringi cu gradaţii la 0,1 ml, PPD în fiole cu 2

UI/doză (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doză, antiseptic etc.

Tehnica pe care o utilizăm poartă numele de IDR Mantoux (IDR cu PPD). Controlăm fiola pentru a ne

asigura că este în termen, dacă a fost păstrată corespunzător şi o agităm energic pentru omogenizarea

PPD. Se folosește o seringă nouă pentru fiecare pacient; nu se admite aspirarea de PPD într-o seringă

și schimbarea acului pentru fiecare pacient (!). Pregătim seringa, aspirăm o cantitate suficientă de

produs pentru a putea elimina bule de aer şi a fi siguri că vom injecta intradermic 0,1 ml, fix.

Antiseptizăm de EX . cu alcool medicinal (așteptăm 3 minute) o zonă situată pe faţa anterioară a

antebraţului stâng, în treimea medie. Pătrundem aproape tangent la suprafaţa antebraţului, cu bizoul

în sus, pentru a ne situa în derm (Figura nr. 1). Injectăm strict 0,1 ml. (Film nr. 1)

Dacă am injectat corect, apare o bulă uşor denivelată cu diametru de circa 5 mm (Figura nr. 2).

Interpretare

La persoanele infectate, la locul injectării poate apărea o reacţie (eritem-edem-induraţie) după circa 6

ore, fiind maximă la 48-72 ore. Totuşi, cel mai frecvent, citirea rezultatului se face la 72 ore, la lumina

naturală.

Recomandăm citirea cel puțin o dată la 24 de ore, astfel că efectuăm o primă citire la cel târziu 24 ore

(pentru a surprinde HS de tip umoral faţă de Ag inoculat, structură proteică), o a doua citire la 48 ore şi

citirea finală la 72 de ore.

Zona unde s-a injectat PPD trebuie palpată pentru a delimita zona de indurație de zona de eritem.

Măsurăm „diametrul maxim” al zonei de infiltraţie (induraţie). Citirea reacţiei este subiectivă, cu posibile

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/11-testarea-imunit%C4%83%C5%A3ii-de-tip-celular-mi-popa-alexandru-andrei-muntean






variaţii individuale, totuşi rămâne un element important, care nu trebuie neglijat. (Figura nr. 3; Film nr.

2)

Pentru investigarea infecţiei cu M. tuberculosis, în ţara noastră se consideră drept negative reacţiile

cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistică a distribuţiei valorilor pe eşantioane

reprezentative de subiecţi a arătat că plasarea limitei între valorile de 9-10 mm separă cel mai bine pe

cei neinfectaţi de cei infectaţi). O valoare mai mare de 10 mm recomandă analize suplimentare şi

investigaţii care să elimine riscul tuberculozei-boală, care necesită tratament. Interpretarea corectă, în

context clinic şi epidemiologic revine membrilor reţelei de pneumo-ftiziologie, conform algoritmului

stabilit în Programul Naţional de Prevenire, Supraveghere şi Control a TB.

11. 3. 1. 2. Testele de eliberare a Interferonului gama (TEIG; IGRA)

În prezent, există variante tehnice (de laborator) considerate de către unii autori mai sensibile și mai

specifice decât IDR cu PPD. Astfel de teste folosite pentru diagnosticul in vitro sunt testele de

eliberare a Interferonului gama(Figura nr. 4). Specificitatea crescută a testului provine din eliminarea

unor reacții fals pozitive la IDR cu PPD, prin faptul că antigenele conținute de PPD sunt prezente și în

structura Bacilului Calmette-Guerin (BCG) și a unor mycobacterii non-tuberculoase.

Principiu

TEIG investighează răspunsul față de peptide sintetice mai specifice pentru M. tuberculosis decât PPD

(early secretory antigenic target-6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-10), iar, în ultima iterație

a acestor teste, se include și părți antigenice a proteinei TB7.7). Aceste proteine se găsesc în toate

culturile izolate de M. tuberculosis și conduc la o sinteză și secreție măsurabilă a IFN-γ în majoritatea

persoanelor infectate, fiind absente din tulpina de vaccinare BCG și în majoritatea mycobacteriilor non-

tuberculoase. Totuși, trebuie notat faptul că aceste proteine se găsesc și în M. kansasii, M. szulgai,

and M. marinum. Se folosește un martor pozitiv și un martor negativ, cât și un tub de test.

Procedura

Ne asigurăm că dispunem de toate materialele necesare. Materialul biologic necesar de la pacient este

sânge proaspăt obținut prin puncție venoasă periferică. Aceste teste comerciale oferă tuburile care

sunt „preîncărcate” cu antigenele ce vor stimula populația celulară mononucleară și vor determina

secreția de Interferon-γ. Se identifică traseul al unei vene superficiale periferice, se antiseptizează zona,

de EX . cu alcool medicinal (așteptăm 3 minute) și efectuăm puncția cu un ac special ce permite

atașarea, pe rând a mai multor tuburi vidate și extragerea unei cantități exacte de sânge.

Tuburile cu sânge se incubează 16-24 de ore. Se folosește o tehnică ELISA (vezi capitolul 10) pentru

citirea cantității de Interferon-γ în martorul negativ și martorul pozitiv, apoi în proba de investigat.

Interpretare

Întâi se interpretează rezultatele obținute în tuburile folosite ca martor pozitiv și negativ.

Se efectuează pe baza diferenței dintre nivelul de bază (nivelul de Interferon-γ aflat în sângele

pacientului în absența stimulării cu antigene – martorul negativ) și nivelul de IFN-γ produs în cadrul

testului. Se ia în considerare și răspunsul din tubul martor pozitiv.

NB. Majoritatea autorilor sunt de acord cu faptul că în țările endemice pentru tuberculoză, rezultatele

TEIG nu sunt superioare rezultatelor obținute prin IDR cu PPD, însă sunt de multe ori mai scumpe).

11. 3. 2. Investigarea RIC

Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR cu PPD, împreună cu alte IDR (cu alte Ag, provenind de la

alte microorganisme cu care presupunem că respectiva gazdă a „luat deja contact”), pentru evaluarea

reactivităţii în cadrul RIC.

Imunodeficiențele primare (înnăscute) se întâlnesc în aproximativ 1 din 2.000 de născuți vii, având

un spectru clinic foarte larg. Imunodeficiențele primare au multe similarități cu imunodeficiențele

secundare care pot surveni în cursul vieții, în urma infecțiilor virale, după administrarea de

imunosupresoare pentru a preveni rejetul de grefă, în cursul tratamentului bolilor autoimune sistemice

sau după administrarea de chimioterapie antineoplazică.

Principiu

Investigarea RIC la oricare pacient include:

· discuţia cu pacientul şi anamneza (medicaţie primită, momentul debutului suferinţei, vaccinări

efectuate, infecţii în antecedente etc.),



· examenul clinic,

· examenul de laborator

· numărul elementelor figurate, formula leucocitară, frotiul din sângele periferic,

· VSH, alţi reactanţi de fază acută (proteina C reactivă, IL-6, etc.),

· studiul subpopulaţiilor limfocitare din punct de vedere numeric şi funcţional prin citometrie de

flux, utilizând anticorpi specifici pentru a marca suprafața celulară,

· determinarea numărului de celule formatoare de Ac faţă de Ag timo-dependente,

· studiul funcţiei celulelor fagocitare, evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K,

· studiul secreţiei de citokine, etc.,

· teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimulează RIC; este recomandată o „baterie” de Ag,

patru-cinci din Ag (candidină, coccioidină, histoplasmină, Ag extras din virusul urlian,

fitohemaglutinină, lizat din cultură de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitină,

tuberculină etc).

Procedura

Instilarea Ag intradermic se face asemănător IDR cu PPD. Volumul de instilare va același, dar

trebuie să ținem cont de concentrația Ag utilizate. Este vorba de mai multe instilări, la nivelul

antebrațului, la distanțe diferite.

Interpretare

Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o „baterie” de Ag), dacă de EX . rezultatul

este „negativ” (nu apare induraţie) pentru niciuna dintre cele 4-5 Ag folosite, presupunem faptul că

subiectul respectiv este anergic în ceea ce priveşte RIC.











Femeie în vârstă de 32 de ani, nefumătoare, fără expunere profesională la noxe

respiratorii, normotensivă, nu are di abet prezintă dispnee severă cu debut subacut,

de aproximativ patru săptămâni, agravată progresiv, ce asociază tuse cu expectorație

hemoptoică. Inițial, a apelat la servicii medicale private, dar fără îmbunătățirea

simptomatologiei, astfel că s-a prezentat la spital.

La examenul clinic obiectiv, pacienta este conștientă, cooperantă, sub-febrilă (37,7°C), cianotică,

tahipneică, cu frecvență respiratorie de 34 respirații pe minut, puls de 94 bătăi pe minut și tensiune

arterială de 140/82 mmHg. Saturația în oxigen a hemoglobinei era 70%. Se decelează crepitante

pulmonare bilaterale, cu caracter gros. Restul examinării a fost normal.

Examenele paraclinice au decelat anemie ușoară, leucocitoză, cu neutrofilie, restul formulei leucocitare

fiind normală. Examinarea echilibrului acidobazic și electrolitic a arătat pH arterial de 7,34, pO2 de 40

mmHg, pCO2 de 45 mmHg, HCO3- de 22 mEq/L, sodiu și potasiu în limite normale. Pe baza acestor

analize, s-a diagnosticat insuficiență respiratorie tip I (hipoxemică, normocapnică). Pe EKG s-a observat



tahicardie sinusală. Radiografiile toracice arată imagini reticulo-nodulare alături de infiltrate fine

dispuse bilateral. Întrebată, pacienta menționează istoric de tuberculoză pulmonară în copilărie.

Datorită stării critice, s-a decis intubarea pacientei și administrarea de antibiotice cu spectru larg, fără

îmbunătățire marcată în 48 de ore.

S-a recoltat o primă serie de analize serologice, printre care serologia pentru gripă și HIV (rezultatele

fiind negative).

Hemoculturile și culturile de urină au fost sterile.

Se recoltează aspirat traheal, care este examinat în colorație albastru de metilen, Gram și Ziehl-Neelsen

și demonstrează celularitate mixtă, cu neutrofile, hematii și rară floră bacteriană polimorfă. Se

efectuează ecografie abdominală și cardiacă la patul bolnavei, care nu indică nici o anomalie. Se

efectuează un test IDR cu PPD. În paralel, se efectuează un examen computer tomografic (CT) ce arată

un aspect diseminat, „miliar” bilateral cât și infiltrate de dimensiuni mari.

Pe baza suspiciunii imagistice și clinice, pacienta începe tratament antituberculos. La 48 de ore, zona

de indurație era deja de 15 mm, susținând diagnosticul. Evoluția pacientei a fost favorabilă și, în ziua a

12-a, a fost extubată. Culturile din aspiratul traheal au fost pozitive la 14 zile, într-un sistem de detecție

rapidă. Diagnosticul a fost de tuberculoză pulmonară cu insuficiență pulmonară secundară. Datorită

faptului examenul microscopic al sputei s-a dovedit a fi negativ, pacienta a fost externată în ziua 20,

pentru a urma tratament la domiciliu.

11. 6. De reținut

Răspunsul imun celular poate fi investigat atât în cazul suspectării unei infecții cu

un microorganism care se poate multiplica intracelular cât și pentru a diagnostica o

stare de imunodeficiență (primară sau secundară). Este de notat că unele tratamente

aflate în „arsenalul” terapeutic actual pot cauza o scădere a specifică a RIC prin

alterarea lanțului de citokine care duce la activarea limfocitelor specifice. IDR este un

test important în diagnosticul tuberculozei pulmonare latente, dar există și tehnici

mai noi care pot fi folosite.


1. Este adevărat despre IDR cu PPD:

A. Tuberculina reprezintă un amestec de Ag proteice mycobacteriene specifice

pentru M. tuberculosis, ce nu se regăsesc în structura BCG

B. Injectarea corectă, intradermică a Ag conduce la apariția unei bule, uşor

denivelată cu diametru de circa 5 mm

C. În România, se consideră drept pozitive reacţiile cu diametru mai mare sau egal

cu 8 mm, citită la 24 de ore

D. Citirile ar trebui efectuate la cel mult 24 de ore, apoi la 48 și 72 de ore

E. Examenul zonei de IDR vizează apariția unei unei indurații caracteristice HS tip

IV.

2. Testele de eliberare a interferonului gama (TEIG):

A. Nu este influențat de statusul vaccinal cu BCG

B. Prezintă alte antigene față de cele găsite în tuberculină

C. Este o reacție măsurată direct spectrofotometric

D. Folosește o unică reacție martor, cea negativă

E. Prezintă sensibilitate și specificitate mai mare decât IDR cu PPD.

3. Privind testarea RIC, următoarele afirmații sunt FALSE:

A. Este suficient să efectuăm TEIG cu Ag anti-mycobacteriene

B. Se folosesc multiple antigene injectate intradermic

C. Prezența unei reacții locale indică anergia RIC

D. Tratamentul medicamentos al pacientului nu prezintă importanță pentru

investigarea RIC

E. Pentru dezvoltarea RIC, trebuie ca respectiva gazdă să fi „luat deja contact” cu

Ag respective.


1. În ţara noastră, testele IDR cu PPD se consideră drept pozitive atunci când reacţiile au diametrul mai

mic sau egal cu 9 mm.

2. TEIG conțin antigene proteice purificate, ce se găsesc și în compoziția BCG.

3. IDR pentru investigarea RIC includ 4-5 Ag din următoarea listă: candidină, coccioidină,

histoplasmină, Ag extras din virusul urlian, fitohemaglutinină, lizat din cultură de Staphylococcus

aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitină, tuberculină

Microbiologie speciala

12. Diagnosticul de laborator în infecţii

produse de coci patogeni şi condiţionat

patogeni. 12. 1. Cuvinte cheie

· Testul coagulazei

· Testul catalazei

· MRSA

· Hemoliza

· Testul bilolizei

· Sensibilitatea la optochin

· Sensibilitatea la bacitracină

12. 2. Introducere

Simpla vizualizare prin microscopia optică a unor coci nu este

echivalentă cu stabilirea patogenității acestora, implicarea acestora

într-o anume patologie și nicidelimitarea în microorganisme „bune”

sau „rele”. Bacteriile observate pot fi comensale, inofensive sau pot

determina infecții de o severitate variabilă. Atunci când frotiurile sunt

colorate Gram, microorganismele care rețin violetul cristal apar

colorate violet: Staphylococcus, Streptococcus, sau pot fi colorate roz-

roșu (EX . Neisseria spp.). În funcție de dispoziție putem ridica o

anume suspiciune (EX . in diplo în cazul Streptococcus

pneumoniae și Neisseria spp., în lanţuri Streptococcus spp. sau în

grămezi Staphylococcus spp.)

12. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

genulStaphylococcus

12. 3. 1. Clasificare. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe specii

de microorganisme de interes medical, cele mai cunoscute fiind

reprezentate de:Staphylococcus aureus (prevalenţa cea mai

mare), Staphylococcus epidermidis şiStaphylococcus saprophyticus.

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/12-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3ii-produse-de-coci-patogeni-%C5%9Fi




Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili,

nesporulaţi, catalază-pozitivi. Stafilococii coagulază-pozitivi sunt

încadrati în specia S. aureus.

12. 3. 2. Cale de transmitere. Infecțiile stafilococice se transmit cel

mai adesea prin contact direct piele/piele sau piele/obiect contaminat

(pansamente folosite, prosoape, lenjerie intimă).

12. 3. 3. Tabloul clinic variază în funcție de localizarea infecției și de

mecanismul etiopatogenic. Prin multiplicare și invazivitate

locală,Staphylococcus aureus determină infecții supurative (purulente)

ale pielii, mucoaselor și ale țesuturilor subiacente, cu apariția de

pustule, furuncule ori abcese (Figura nr. 1). În absența tratamentului,

infecția poate disemina (pot apărea chiar și complicații severe, sepsis și

chiar evoluția nefastă, spre deces). Unele tulpini stafilococice

sintetizează exotoxine, provocând toxiinfecții alimentare, necroliza

toxică a epidermului (Figura nr. 2) ori sindromul de șoc

toxic. Staphylococcus saprophyticus poate determina infecții urinare, în

special la femeile tinere active sexual.

12. 3. 4. Diagnosticul de laborator

Principii generale. În cazul infecţiilor cu puroi ale tegumentelor şi

mucoaselor (EX . abces - Staphylococcus aureus) diagnosticul de

laborator este unul bacteriologic, direct, conform etapelor studiate vezi

capitolul 3.

12. 3. 4. 1. Recoltarea și transportul produsului patologic trebuie să

respecte regulile cunoscute (vezi capitolul 4) (cât mai apropape de la

debutul bolii, înainte ca pacientul să primească medicaţie antibiotică

ori chimioterapică etc). În infecţiile stafilococice, produsul patologic

poate fi reprezentat de secreţiile purulente de la nivelul lezinilor

cutanate (EX . plăgi şi arsuri suprainfectate, abcese), de exsudatul

nazal sau faringian, de spută, sânge, LCR, urină, secreţie vaginală ori

lichid de vărsătură etc. Vom discuta recoltarea puroiului.

12. 3. 4. 2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului

patologic. Se efectueaza minim 2 frotiuri: unul colorat Gram şi unul cu

albastru de metilen. Prin examinarea la microscopul optic, notam

celulele cu morfologii diferite: celulele epiteliale, celulele

inflamatorii (EX . leucocite PMN) şicocii Gram-pozitivi, cu diametrul







de 0.5-1.5 mm, dispuşi în grămezi neregulate, în lanţuri scurte,

perechi sau izolaţi, localizati intra sau extraleucocitar (Figura nr. 3).

12. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic o

facem pentru a obţine colonii izolate (cultură pură). Stafilococii sunt

germeni nepretenţioşi, motiv pentru care putem folosi medii de

cultură simple. Atunci când suspicionăm contaminarea probelor este

recomandată utilizarea un mediu selectiv, precum mediul Chapman,

fiind cunoscut faptul că aceste microorganisme se multiplică pe medii

hiperclorurate (Figura nr. 4). Coloniile sunt de tip S, cu dimensiuni de

1-3 mm, pigmentate diferit în functie de specie (Staphylococcus

aureus-auriu (Figura nr. 5), Staphylococcus epidermidis-alb

şiStaphylococcus saprophyticus-citrin).

12. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic o

facem pe baza:

· Caracterelor morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, 0.5-1.5 mm,

dispuşi în grămezi neregulate, în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi

(Figura nr. 6)

· Caracterelor de cultură: colonii de tip S, pigmentate auriu (Figura

nr. 5)

· Caracterelor biochimice: Staphylococcus spp. sunt catalază-pozitivi

si fermentează zaharuri cu producere de acid (EX . S.

aureuseste manită-pozitiv)

· Caracterelor antigenice

· Caracterelor de patogenitate: recomandăm ferm

efectuareatestului coagulazei (Figura nr. 7)

· Sensibilităţii la bacteriofagi (în centrele de referinţă)

· Altele (în centrele de referinţă, spre exemplu studiul acizilor graşi

celulari, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea

prin biologie moleculară a rezistenţei la antibiotice etc).

12. 3. 4. 5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei

prin metode difuzimetrice. În ultimul deceniu atenţia întregii

comunităţi medicale s-a concentrat asupra rezistenţei la antibiotice în

creştere a Staphylococcus spp.,fiind deja celebru microorganismul

insensibil la antibioticele beta-lactamice: stafilococul meticilină-

rezistent (MRSA- methicillin resistant Staphylococcus aureus). Acesta se

transmite prin contact direct, iar respectarea măsurilor generale de



igienă contribuie semnificativ la prevenirea apariţiei infecţiilor

stafilococice.


genulStreptococcus

12. 4. 1. Clasificare. Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care

formează perechi sau lanţuri în cursul diviziunii celulare. Dintre speciile

cu importanţă medicală amintim: Streptococcus pyogenes (grup

A), Streptococcus agalactiae(grup B) și Streptococcus

pneumoniae (pneumococul). Deși nu a fost stabilită o clasificare

standard a Streptococcus spp., au fost propuse mai multe variante.

Astfel, pornind de la compozitia polizaharică a peretelui bacterian, a

rezultat clasificarea Lancefield, ce împarte streptococii în grupele

serologice A-H și K-U. Mai mult, Streptococcus pyogenes, conform

factorului de virulență-proteina M și a antigenului T, a fost subîmpărțit

în alte 100, respectiv 20 serotipuri. Cumulând variate caractere

microscopice (prezența capsulei) și biochimice, precum hemoliza,

sensibilitatea la optochin ori la bacitracină vom obține o clasificarea

prezentată în Figura nr. 8.

În continuare vom discuta despre diagnosticul de laborator al

infecţiilor produse de Streptococcus pyogenes.

12. 4. 2. Cale de transmitere. Este estimat că un procent cuprins între

5 și 15% din populație este ”purtătoare” de S. pyogenes la nivel

faringian (prima localizare ca frecvență), la nivel cutanat, anal ori

vaginal, fără ca aceste persoane să manifeste semne de boală. Infecția

se transmite de la om la om prin contactul direct al unui tegument

traumatizat ori al unei mucoase cu o secreție contaminată, dar și prin

inhalarea unor aerosoli ori prin ingerarea unor alimente contaminate.

12. 4. 3. Tablou clinic. Streptococii piogeni pot produce afecțiuni

foarte variate:

· Cu afectarea mucoaselor: faringită, angină streptococică (Figura nr. 9)

· Patologii ale tegumentelor și ale țesuturilor subcutanate: impetigo,

erizipel (Figura nr. 10), celulită, fasceită necrozantă, gangrenă gazeoasă

· Afecțiuni dezvoltate prin mecanism toxigen: scarlatina, sindromul de

șoc toxic

· Afecțiuni mediate imunitar prin reacții de hipersensibilitate,

poststreptococice: reumatismul articular acut, glomerulonefrita acută.

Alegem pentru discuţie diagnosticul în faringita streptococică.

12. 4. 3. 1 Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.

12. 4. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic. Vom

recolta în condiții de asepsie exsudatul faringian (secreţia purulentă

de la nivelul faringelui), conform regulilor generale, dar respectând

suplimentar următoarele condiții: înainte ca pacientul să se fi spălat pe

dinţi, să fi mâncat, să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii. Dacă

aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face după minim

4 ore. Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în

nici un caz nu trebuie să treacă mai mult de 2-3 ore de la recoltare

până la cultivare (preferabil 1-2 ore, sau mai repede). Dacă această

recomandare nu poate fi respectată, produsul va fi însămânțat pe un

mediu de transport.

12. 4. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic va

ține cont de caracterul plurimicrobian al acestuia. Se vor colora 2

frotiuri, Gram și albastru de metilen, etapă urmată de notarea

prezenţei următoarelor elemente:celule epiteliale, celule

inflamatorii (EX . leucocite) şi a diferitelor microorganisme printre

care și coci Gram-pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri etc.

12. 4. 3. 1. 3. Cultivarea se realizează pe mediul agar-sânge, urmată,

după aproximativ 18-48 ore, de interpretarea rezultatului. În cazul unei

infecții cu streptococ urmează să vedem colonii de tip S, de mici

dimensiuni, înconjurate de o zonă deb-hemoliză (clară, cu diametrul

mai mare decât diametrul coloniei) (Figura nr. 11).

12. 4. 3. 1. 4. Identificarea se face pe baza următoarelor caractere:

· morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri (Figura nr.

12);

· de cultură (mediul agar sânge): colonii de tip S, cu diametrul de

0.5-1 mm, înconjurate deb-hemoliză (Figura nr. 11);

· biochimice: hemoliză de tip beta, inhibiția multiplicării

streptococilor de grup A de bacitracină (Figura nr. 13), rezistenţa la

trimetoprim-sulfametoxazol;



· antigenice: determinarea polizaharidului specific de grup,

determinarea tipurilor M etc.

12. 4. 3. 1. 5. Antibiograma. Streptococii beta-hemolitici de grup

Asunt sensibili la penicilină. Doar dacă pacienţii sunt ”alergici” la

medicamentele din clasa beta-lactaminelor se va efectua

antibiograma.

NB: Mai mult de 80% dintre episoadele de faringoamigdalită sunt de

etiologie virală și nu necesită antibioticoterapie.

12. 4. 3. 2. Diagnosticul de laborator serologic

Dacă există suspiciunea ca pacientul să sufere de o boală

poststreptococică sau se dorește confirmarea unei infecţii invazive este

recomandată efectuarea diagnosticului serologic prin reacţia ASLO

(vezi şi capitolul 10). Acest test este util și în evaluarea evoluţiei

pacientului sub tratament medicamentos (Figura nr. 14).

Reacţia ASLO identifică titrul anticorpilor anti-streptolizină O, o enzimă

hemolitică produsă de S. pyogenes. Repetarea testării la un interval de

7-10 zile permite interpretarea serologică în dinamică și observarea

evoluției pacientului sub tratament. Pentru zona noastră geografică se

acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Este strict

necesară realizarea controlului intern şi extern de

calitate. N.B. Metoda cea mai corectă este metoda clasică de

determinare.

12. 5. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse

de Streptococcus pneumoniae

12. 5. 1. Clasificare. Streptococcus pneumoniae se prezintă

sub forma unor coci Gram-pozitivi, alungiţi, dispuşi în diplo,

încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ

anaerobi, multiplicarea microorganismelor fiind favorizată într-o

atmosferă cu 5% CO2. Pe mediul geloză-sânge determinăa-hemoliză.

12. 5. 2. Cale de transmitere. Streptococcus pneumoniae este

condiţionat patogen, putând face parte din flora microbiană normală a

tractului respirator superior. Infecția se transmite prin contactul

apropiat cu o persoană purtătoare sau bolnavă, ori prin inhalarea

picăturilor contaminate, eliberate prin tuse ori strănut. Există anumite

categorii de persoane predispuse spre a dezvolta boala: cei cu vârste

extreme (copiii foarte mici și adulții cu mai mult de 65 de ani),

persoane cu patologii asociate care determină imunodepresie (diabet

zaharat, afecțiuni cardio-vasculare, HIV/SIDA) ori cu patologii

pulmonare (astm, defecte anatomice, mari fumători).

12. 5. 3. Tablou clinic. Infecția pneumococică este principala cauză a

pneumoniilor comunitare (Figura nr. 15) și reprezintă una dintre cele

mai frecvente etiologii ale meningitelor la copii și vârstnici. Poate

produce și infecţii ale tractului respirator superior, ale urechii medii și

sinusurilor sau, prin diseminare sistemică, endocardită, septicemie.

Vom discuta diagnosticul microbiologic în pneumonia

pneumococică.

12. 5. 4. Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic

şi bacteriologic(direct).

12. 5. 4. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic,

reprezentat despută respectă regulile generale, dar și condiții speciale

precum: educarea pacientului în vederea obținerii expectorației și nu a

unei probe salivare, necesitatea efectuării igienei cavității bucale

anterior recoltării.

12. 5. 4. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic impune

realizarea a două frotiuri, colorate cu albastru de metilen, respectiv

Gram. Se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (spre

exemplu macrofage), acelulelor inflamatorii (spre exemplu

leucocitele polimorfonucleare) şi acocilor Gram-pozitivi, alungiți,

lanceolați, dispuși în diplo, cu o capsulă comună (Figura nr. 16).

12. 5. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură. Pneumococii sunt

germeni pretențioși, care nu se dezvoltă pe medii simple. Astfel,

însămânțarea se realizează pe mediul geloză-sânge, cu incubarea într-

o atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 35-37°C, condiții care

favorizează multiplicare germenilor. Se vor observa colonii de tip S sau

de tip M, cu a-hemoliză (Figura nr. 17).

12. 5. 4. 4. Identificarea se realizează pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, în diplo,

capsulaţi (Figura nr. 16)

· de cultură: colonii de tip S sau M, înconjurate de o zonă de a-

hemoliză

· biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerată a sărurilor biliare

(testul bilolizei), sensibilitatea la optochin (etil-hidrocupreină) (Figura

nr. 18)

· antigenice: folosim seruri specifice polivalente şi monovalente ce

țintesc antigenul K, în reacţia de umflare a capsulei

· de patogenitate: inocularea la şoarecele alb.


prin metode difuzimetrice. Pentru verificarea sensibilităţii la penicilină

se utilizează microcomprimate cu oxacilină.


genul Neisseria

12. 5. 1. Clasificare. Familia Neisseriaceae include mai multe genuri,

dar vom discuta în cele ce urmează numai despre diagnosticul de

laborator în infecţiile produse de meningococ (Neisseria meningitidis)

şi gonococ(Neisseria gonorrhoeae). Aceștia sunt coci Gram-negativi,

dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară

comună. În funcţie de structura capsulei există mai multe serogrupuri.

12. 5. 2. Neisseria meningitidis

12. 5. 2. 1. Cale de transmitere. Infecția meningococică se transmite

prin contactul apropiat cu o persoană purtătoare sau bolnavă

(utilizarea în comun a obiectelor de igienă personală, sărut, tuse).

Microorganismul a fost izolat de la nivel nazo-faringian, la persoane

sănătoase (purtător de N. meningitidis).

12. 5. 2. 2. Tablou clinic. N. meningitidis reprezintă una dintre cele mai

frecvente etiologii ale meningitei bacteriene, alături de Haemophilus

influenzaeși Streptococcus pneumoniae. Dacă la adulți redoarea cefei,

fotosensibilitatea, vărsăturile fără senzație de greață, febra pot sugera

afecțiunea, la copii și la bebeluși suspiciunea de meningită poate fi cu

greu intuită, aceștia prezentând adeseori un tablou clinic atipic (EX .

iritabilitate, vomă, reflexe modificate). Meningita meningococică este o

afecțiune cu risc vital, reprezentând o urgență medicală.

12. 5. 2. 3. Diagnosticul în meningita meningococică

Diagnosticul include elemente clinice, într-un context epidemiologic.

Pentru stabilirea etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct)

şi urgent. Este recomandat ca primele etape să fie efectuate la patul

bolnavului.



12. 5. 2. 3. 1. Recoltarea produsului patologic (LCR, puncţie după

realizarea examenului „fundului de ochi”) ar trebui realizată la patul

bolnavului, unde repartizăm o cantitate de LCR pentru examenul

citologic şi biochimic, iar restul pentru frotiuri şi culturi (Figura nr. 19).

Dacă transportul este inevitabil, trebuie efectuat fără întârziere şi nu la

temperaturi scăzute, ci aproape de temperatura corpului.

Meningococul poate fi izolat şi prin hemocultură, din exsudatul nazal

ori faringian.

12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic

permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) şi a cocilor Gram-

negativi, dispuşi în diplo, capsulaţi, situaţi intra sau extraleucocitar

(Figura nr. 20).

12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea o facem pe medii complexe, în atmosferă de

3-5% CO2, la 37°C.

12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:

· morfotinctoriale (coci Gram-negativi, în diplo, reniformi);

· de cultură: colonii de tip S sau M, cu o dimensiune de aproximativ

1-2 mm;

· biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi (EX . glucoza şi

maltoza) şi produc citocrom-oxidază (testul oxidazei este test cheie în

identificare) (Figura nr. 21);

· antigenice: putem realiza serogruparea (spre exemplu pot aparţine

grupului A, B, C, Y sau W-135) (Figura nr. 22).

12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandată şi se realizează de

obicei prin metode difuzimetrice. Sub un tratament antibiotic adecvat,

instituit prompt, majoritatea pacienților cu meningită meningococică

se refac complet (a nu se uita că în anumite patologii este necesară

efectuarea CMI/CMB și eventual și NEI/NEB).

12. 5. 3. Neisseria gonorrhoeae

12. 5. 3. 1. Cale de transmitere. N. gonorrhoeae se transmite prin

contact sexual sau de la mamă la făt în timpul nașterii pe cale naturală.

Nu arareori pacienții prezintă multiple infecții transmise pe cale

sexuală, fiind obligatorie investigarea completă. Gonoreea se asociază

frecvent cu infecția cu Chlamydia trachomatis, schemele terapeutice

recomandate putând să ”acopere” ambele patologii.



12. 5. 3. 2. Tablou clinic. La bărbaţi apare uretrita gonococică, iar la

femei, gonoreea se localizează endocervical. La nou-născutul care se

naşte pe cale naturală din mamă cu gonoree, poate apărea oftalmia

gonococică. Gonococul poate disemina cu apariţia unor leziuni la

distanţă. Important de specificat este faptul că aproximativ 80% din

femeile infectate și 10% din bărbați sunt asimptomatici, reprezentând

o cauză de infertilitate.

12. 5. 3. 3. Diagnosticul de laborator în gonoree

Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).

12. 5. 3. 3. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic respectă

regulile cunoscute. La bărbat recoltăm secreţia uretrală, iar la femeie

recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la nivelul

colului uterin. Secreţiile au de obicei un aspect purulent. Este de

preferat cultivarea cât mai rapidă, pemedii de cultură complexe (în

atmosferă de CO2). Transportul trebuie realizat foarte rapid în medii de

transport (EX . Amies plus cărbune activat).

12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic poate

pune diagnosticul. Notăm prezenţa celulelor epiteliale, a celulelor

inflamatorii (EX . leucocite) şi a cocilor Gram-negativi (în diplo,

situaţi intra sau extraleucocitar) (Figura nr. 23).

12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea se face pe medii selective (spre exemplu

medii cu vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) dacă produsul

patologic este contaminat. Recomandăm cultivarea atât pe medii

selective, cât şi pe medii neselective, în atmosferă de 3-10% CO2, la

35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. Sunt colonii de tip S, de 0,5-1

mm, sau colonii de tip M.

12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:

· morfotinctoriale: coci Gram-negativi, în diplo, eventual înconjuraţi

de o structură capsulară comună;

· de cultură: coloniile sunt de tip S sau M (pot exista până la 5 tipuri

de colonii diferite, ceea ce poate deruta examinatorul neavizat);

· biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi (EX . glucoza) şi

produc citocrom-oxidază (testul oxidazei este test cheie în identificare)

(Figura nr. 24); testul catalazei este intens pozitiv;

· antigenice;







· Altor caractere (de EX . studiate prin metode ale biologiei

moleculare).

12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandată şi se realizează de

obicei prin metode difuzimetrice. Este necesară testarea producerii

de b-lactamază. Este necesară testarea prin tehnica diluției (cel puțin

determinarea CMI).


Chiar dacă nu toate noțiunile prezentate în manualele de specialitate

trebuie învățate ca atare, în dezvoltarea pe parcursul activităților

universitare considerăm că este necesar ca cititorii să citească mai

mult, pentru o cât mai bună informare. Ca atare, recomandăm câteva

link-uri corespunzătoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se

resursele World Wide Web.














O pacientă în vârstă de 27 de ani, aflată în săptămâna a 32-a de

sarcină, se prezintă la medicul stomatolog pentru o durere intensă la

nivelul molarului 2 inferior, drept, amplificată la masticație și la

percuția de ax, debutată în urmă cu aproximativ 2 zile. Mai mult, afirmă

sângerare recurentă și eliminarea unui lichid purulent de la nivelul

rădăcinii dentare. Medicul decelează palpatoriu un nodul ferm

submandibular, mobil pe planurile profunde. Decide intervenția

imediată, dar pacienta refuză tratamentul, deoarece se teme că

anestezicul administrat local ar putea avea efecte nocive asupra














dezvoltării fătului. Decide consultarea medicului ginecolog, peste 5 zile

atunci când are programată o evaluare. Medicul îi prescrie un

medicament antiinflamator și îi recomandă să revină de urgență dacă

starea ei se înrăutățește.

Pacienta se prezintă a doua zi acuzând agravarea afecțiunii, cu apariția

febrei (37,8°C) în urmă cu 3 ore și a unui edem submandibular

bilateral, predominant drept. Medicul se alarmează și, cu suspiciunea

de angină Ludwig, îndrumă pacienta la camera de gardă a celui mai

apropiat spital.

La camera de gardă starea pacientei se agravează prin disfagie, cu

imposibilitatea înghițirii secreției salivare și prin apariția unui placard

dur sublingual. Se decide internarea de urgență, iar la evaluarea

semnelor vitale se decelează: febră 38,9°C, hipotensiune arterială

90/50mmHg, tahicardie 120/min și o frecvență respiratorie de

20/minut. La o saturație în oxigen de 97% i se recomandă

oxigenoterapie, fiind cunoscut faptul că pacienții suferinzi de angină

Ludwig se pot desatura rapid. Trusa de traheostomie se află la patul

pacientei pentru intervenție cât mai rapidă în caz de necesitate.

După consultarea unui medic obstetrician se decide intervenția

chirurgicală oro-maxilo-facială. Operația decurge favorabil, pacienta

este echilibrată, iar ecografia Doppler fetală nu prezintă anomalii. Pe

durata intervenției s-a prelevat puroi din abcesul mandibular, iar

ulterior examenul bacteriologic a evidențiat infecția cu Staphylococcus

aureus. Sub tratament antibiotic, inițial empiric, ulterior conform

rezultatelor antibiogramei, pacienta prezintă o evoluție favorabilă cu

vindecarea afecțiunii. Peste 10 săptămâni naște un băiat sănătos.

Discuții

Pe durata sarcinii, răspunsul imunitar al mamei este semnificativ

diminuat. Din această cauză, infecțiile progresează mai rapid punând în

pericol atât viața pacientei, cât și a fătului. Mai mult, modificările

hormonale alterează fiziologia țesuturilor gingivale, care devin mai

sensibile și predispuse spre infecție.

Angina Ludwig este o celulită necrozantă, rapid progresivă a planșeului

cavității bucale, cauzată de microorganisme aerobe sau anaerobe,

incluzându-le pe acelea care fac parte din flora microbana orală,

precum: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacteroides spp.

Afecțiunea are risc vital, complicațiile majore fiind septicemia și

insuficiența respiratorie. În sarcină, atât afecțiunea, cât și potențialele

terapii pot pune în pericol starea de sănătate a fătului.12. 8. De

reținut

· În absența tratamentului, infecțiile pot disemina sistemic, cu apariția

complicațiilor severe precum sepsisul și chiar decesul pacientului.

· Stafilococii sunt germeni nepretenţioşi, motiv pentru care folosim

medii de cultură simple, spre deosebire de streptococci și de neisserii

care sunt microorganisme pretențioase.

· Meningita meningococică este o afecțiune cu risc vital,

reprezentând ourgență medicală.


1. Alegeți echivalența corectă:

A. Gram pozitiv- Neisseria meningitidis

B. Gram negativ- Streptococcus pneumoniae

C. Gram pozitiv- Streptococcus aureus

D. Gram pozitiv- Staphylococcus epidermidis

E. Gram negativ- Neisseria gonorrhoeae

2. Testul catalazei este pozitiv în cazul:

A. Neisseria meningitidis

B. Staphylococcus aureus

C. Streptococcus pneumoniae

D. Staphylococcus epidermidis

E. Streptococcus aureus

3. Sunt caractere biochimice ale Stapylococcus spp.:

A. Beta-hemoliză în mediul agar sânge

B. Inhibiția multiplicării la Bacitracină

C. Testul catalazei pozitiv

D. Rezistenţă la trimetoprim-sulfametoxazol

E. Testul bilolizei pozitiv

4. Reprezintă urgențe medicale:

A. faringita streptococică

B. meningita meningogocică

C. furunculoza recidivantă

D. angina Ludwig

E. fasceita necrozantă

5. Sunt adevărate următoarele afirmații despre reacția ASLO:

A. Semnifică Asociația Studenților Liberi și Optimisti

B. Semnifică Anti-StreptoLizina O

C. Este utilizată în diagnosticul bacteriologic al infecției streptococice

D. Este utilizată în diagnosticul serologic al infecției streptococice

E. Un titru antigenic


1. Infecțiile cu MRSA sunt noi și rare.

2. Te poți contamina cu MRSA dacă stai aproape de o persoană

infectată pentru că respirați același aer.

3. Infecția cu MRSA poate fi prevenită eficient prin igiena corectă a

mâinilor.

4. Tratamentul de elecție al faringitelor este antibioticoterapia,

deoarece acestea sunt întotdeauna cauzate de streptococul beta

hemolitic de grup A.

5. Voi recomanda mereu tratamentul cu antibiotice unui pacient cu

faringită, cât mai aproape de debutul afecțiunii, deoarece acesta are un

risc înalt de a dezvolta reumatism articular acut.

6. Pot contacta infecția cu Neisseria gonorrhoeae dacă întru în contact

cu suprafețe/obiecte contaminate( prosop, scaun, lenjerie de pat).

7. Netratată gonoreea poate determina infertilitate atât la femei, cât și

la bărbați.

13. Diagnosticul de laborator în

infecţiile produse de enterobacterii.

(Gabriela-Loredana Popa, Alexandra

Limbău) 13. 1. Cuvinte cheie

Bacili Gram-negativi

Oxidază-negativi

Catalază-pozitivi

Boală diareică acută

Febra tifoidă

Dizenterie

Pesta bubonică

13. 2. Introducere

13. 2. 1. Clasificare

Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de

genuri şi specii, de microorganisme importante în medicină. Această

familie include atât agenţi patogeni (EX . Salmonella spp., Shigella

spp.) cât și condiţionat patogeni (EX . E. coli) implicaţi

în patologia infecţioasă. Multe bacterii ale acestei familii fac parte din

flora intestinului uman sau animal, altele sunt prezente în apă, pe sol,

pe plante etc.

13. 2. 2. Calea de transmitere

13. 2. 2. 1. Genul Escherichia

E. coli face parte din flora intestinală normală. Este implicat (de

regulă) în patologie atunci când îşi modifică habitatul (de EX . ajunge

la nivelul tractului urinar). Eliminat în mediul extern cu materiile fecale,

contaminează apa, solul, alimentele etc.

13. 2. 2. 2. Genul Klebsiella

Klebsiella pneumoniae este răspândită în natură; face parte din flora

normală a tractului gastrointestinal, a tractului respirator superior.

După terapia prelungită cu antibiotice (mai ales cu spectrul larg), în

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/13-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3iile-produse-de-enterobacterii






mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot coloniza

tractul urinar sau respirator la adult şi la copil.

13. 2. 2. 3. Genul Proteus

Germenii din genul Proteus sunt răspandiţi ubicuitar. Se pot găsi pe

sol, în ape reziduale, ape de suprafaţă, în materiale organice în

putrefacţie, în alimente şi în produse patologice. Fac parte din flora

intestinală umană.

13. 2. 2. 4 Genul Salmonella

Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al

oamenilor şi al animalelor. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor.

Sursele majore, omul şi animalele vor determina poluarea solului, a

apelor reziduale, a apelor de suprafaţă, în care vor supravieţui de la

cateva zile la câteva luni, daca condiţiile sunt favorabile.

13. 2. 2. 5 Genul Shigella

Bacteriile sunt întâlnite în intestinul şi materiile fecale ale bolnavilor

precum şi la purtătorii aparent sănătoşi. Se pot izola din apă, alimente

sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul muştelor şi a

mâinilor murdare,

13. 2. 2. 6 Genul Yersinia

Speciile din genul Yersinia (specia cea mai patogenă) au ca rezervor

rozătoarele, păsările, mamiferele domestice. Se pot transmite prin

plăgi muşcate de la o rozătoare la alta sau ocazional prin intermediul

puricilor (puricele de şobolan, puricele de om).

13. 2. 3 Tabloul clinic

13. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecţiile produse de E. coli

Genul Escherichia cuprinde în bună parte germeni comensali. Specia

tip este reprezentată de E. coli. Membrii acestui gen pot determina

infecţii intestinale şi extraintestinale. În condiţiile în care părăseşte

habitatul natural, colonizează epiteliul urinar, fiind implicat în primul

rând în infecţii ale tractului urinar. Infecţiile intestinale sau

enterocolitele infecţioase sunt determinate de patotipuri (EAEC, EHEC,

EIEC, EPEC, ETEC etc.), fiecare având grupe serologice şi determinând

manifestări clinice distincte.

13. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecţiile produse de genul Klebsiella

Klebsiella pneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de

boli precum toxiinfecţii alimentare de tip infecţios, infecţii ale tractului

respirator superior, infecţii urinare etc. Este un microorganism

condiţionat patogen. Pneumoniile cauzate de K. pneumoniae sunt rare

dar foarte grave; cel mai des survin la pacienţii cu boli debilitante ca

diabet, afecţiuni pulmonare cronice, pacienţi alcoolici şi la cei cu un

sistem de apărare deficitar.

13. 2. 3. 3. Tabloul clinic în infecţiile produse de Proteus

Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate şi

poate declanșa infecţii la diferite nivele ale organismului gazdă. Sunt

implicaţi patogenic în afecţiuni ce apar în afara tractului digestiv, dar

există şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care aceşti germeni au

reprezentat agenţii cauzali. Infecţiile tractului respirator inferior,

pneumoniile, sunt de cele mai multe ori nosocomiale. Pot suprainfecta

plăgile chirurgicale sau pe cele arse, ducând la apariţia abceselor. Sunt

frecvent implicaţi în infecţii la nivelul tractului urinar,

capacitatea Proteus spp. de a descompune ureea joacă un rol foarte

important în inducerea litiazei urinare.

13. 2. 3. 4. Tabloul clinic în infecţiile produse de Salmonella

Principalele infectii produse de salmonele se pot împărţi în

salmoneloze minore (enterocolite) şi salmoneloze majore (febra

tifoidă). Sunt patogene prin multiplicare şi invazivitate. Pacienţii

imunocompromişi şi cei cu boli hematologice sunt mai susceptibili la

infecţii cu Salmonella decât adulţii sănătoşi.

În caz de enterocolită (gastroenterită, toxiinfecţia alimentară de tip

infecţios, salmoneloză), germenii pătrund pe cale digestivă iar boala

apare după ingestia a 105-10

8 salmonele. Incubaţia durează de la

câteva ore până la câteva zile, microorganismul multiplicându-se în

epiteliul intestinal, în regiunea ileocecală, provocând un sindrom

inflamator intestinal cu diaree mucopurulentă şi nesangvinolentă. La

debut diareea este însoţită de greţuri şi vărsături, iar în perioada de

stare a bolii simptomele frecvent întâlnite sunt reprezentate de febră,

colici abdominale, mialgii şi cefalee. La nou născut deshidratarea poate

duce la o stare de toxicoză gravă. Persoana infectată poate fi

contagioasă timp de circa 3 luni.

Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a 103 S.

typhi. Calea de pătrundere este digestivă, transmiterea fiind realizată

de la persoană la persoană. După ingestie, urmează o perioadă de

incubare de aproximativ 1-3 săptămâni, în care microorganismul

traversează mucoasa intestinală, urmată de multiplicarea în

submucoasă şi fagocitarea de catre macrofage. De aici, bacilii trec în

circulaţia limfatică, apoi în cea sangvină determinând etapa

bacteriemică a bolii. Simptomele generale se caracterizează prin febră

crescută, stare generală alterată, stare de şoc, însoţită de o

simptomatologie digestivă reprezentată de anorexie, colici

abdominale, constipaţie sau diaree. Simptomatologia este cauzată atât

de endotoxina, care activează diferitele cascade inflamatorii şi

producerea de citokine, cât şi consecinţa agresiunii intestinale,

hepatice şi asupra vezicii biliare. La sfârşitul primei săptămâni de boală,

salmonele se elimină în materiile fecale, dar excreţia se poate prelungi

mult timp în convalescenţă.

13. 2. 3. 5. Tabloul clinic în infectiile produse de Shigella

Infectiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului

intestinal, pot produce și toxiinfecții alimentare de tip infecțios.

Shigeloza este o boală diareică acută, cu evoluție autolimitantă, apare

dupa 2-5 zile de la ingestia a 10-1000 de bacterii. Debutul este brusc,

cu febră, diaree apoasă, dureri abdominale intense. În perioada de

stare, pacientul are 30-40 de scaune nefecaloide, cu mucus, puroi și

sânge, însoțite de tenesme rectale și stare generală alterată. În cazul

unei infecții produse de Shigella shiga, starea generală se înrăutățește,

pierderile hidro-electrolitice și instalarea unui sindrom de deshidratare

acută reprezintă, ca și în cazul altor diarei, principala problemă.

Evoluția poate fi fatală în lipsa tratamentului corespunzător.

13. 2. 3. 6. Tabloul clinic în infecțiile produse de Yersinia

Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru

om: Y. pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica.

Y. pestis este un microorganism patogen al rozătoarelor, oamenii

fiind gazde accidentale infectate prin muşcătura puricilor de şobolan.

Microorganismul inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica

atât intra cât și extracelular. Infecţia rezultată se răspândeşte rapid

către nodulii limfatici regionali. La nivelul nodulilor limfatici determină

leziuni caracteristice, ganglionii devin tumefiaţi, hemoragici, se

hipertrofiază, suferă o necroză şi devin fluctuenţi (aspect

caracteristic bubon negru). În cursul invaziei, Y. pestispoate ajunge în

torentul sanguin şi infecţia se poate generaliza. Pesta bubonică poate

produce leziuni hemoragice şi necrotice în toate organele; în lipsa

tratamentului, letalitatea este de 50%.

Propagarea infecţiei în cazul pestei pneumonice primare (forma

pulmonară) se face rapid, de la om la om, prin inhalarea particulelor

încărcate cu germeni, fără să se mai treacă prin stadiul de bubon. Se

manifestă prin pneumonie hemoragică, septicemie, decesul survine în

mai putin de 24 de ore după instalarea simptomelor clinice, la 90%

dintre pacienții netrataţi.

Y. pseudotuberculosis include cel puţin 6 serotipuri, dar cel mai

frecvent implicat în infecţiile umane este serotipul 1. În organismul

uman pătrunde pe cale digestivă, originea contaminării fiind probabil

alimentară. Microorganismele penetrează epiteliul porţiunii terminale a

ileonului, ajung în ganglionii limfatici ai regiunii ileo-cecale, unde

produc o adenită reticulară, însoţită de leziuni asemănătoare

tuberculozei intestinale. Foarte rar, se întâlneşte septicemie la pacienţii

imunocompromişi (cirotici si diabetici).

Y. enterocolitica cuprinde mai mult de 50 de serotipuri, cele mai

multe izolate la oameni bolnavi. Infecţia orală cu serotipurile patogene

pentru om ale speciei Y. enterocolitica se poate manifesta clinic prin

mai multe tipuri de patologie; transmiterea are loc probabil prin

contaminarea apei şi a alimentelor. Enteritele provocate de această

specie se manifestă cu diaree, frecvent acompaniată de subfebrilitate şi

dureri abdominale. Poate determina infecţii cu caracter invaziv

localizate pe ileonul terminal cu „prinderea” ganglionilor mezenterici şi

apariţia unui sindrom al fosei iliace drepte, în paralel cu o adenită

mezenterică asemănătoare celei provocate de Y. pseudotuberculosis. La

copii, simptomatologia poate conduce la punerea eronată a

diagnosticului de apendicită acută. La adulţi s-a întâlnit în declanşarea

unor artrite reactive sau a unui eritem nodos cu dificultăţi în ceea ce

priveşte diagnosticul diferenţial.

13. 3. Diagnosticul de laborator

Familia Enterobacteriaceae cuprinde un mare număr de genuri şi

numeroase specii (peste 2400, dacă sunt luate în considerare și speciile

din genul Salmonella). Familia include germeni care se pot multiplica

pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizează glucoza cu sau

fără producere de gaz, oxidază-negativi, catalază-pozitivi. Formează

colonii de tip S (R în cazul culturilor “vechi”) sau M (pentru speciile

capsulate), pot fermenta lactoza (EX .Escherichia coli, Klebsiella spp.)

sau sunt lactoză negativi (EX . Salmonella spp.,Shigella spp.). Pentru

izolare putem folosi medii selective şi selectivo-diferenţiale. Există

medii cu selectivitate mai redusă (EX . Mac Conkey), medii cu

selectivitate medie (EX . ADCL) şi medii cu selectivitate înaltă (ex.

Wilson-Blair). Caracterele biochimice sunt esenţiale pentru

identificare. Studiul caracterelor Ag (prin reacţii Ag-Ac) este de

asemenea foarte util (toate enterobacteriile au AgO, cele mobile au

AgH, enterobacteriile capsulate au AgK, Salmonella typhi prezintă în

plus AgVi etc.).

Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct (exceptând

febrele enterale în care există și diagnostic serologic).

13. 3. 1. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse

de Escherichia coli

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare

digestivă

1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute; recoltăm

materii fecale, lichid de vărsătură etc. După examinarea macroscopică,

continuă examenul de laborator. Spre ex., dacă infecţia ar fi produsă

de E. colienterohemoragic (EHEC), am putea vizualiza cele ce urmează.

Materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoasă

epitelială.

2. Nu facem frotiu. Examinăm între lamă şi lamelă şi am putea vedea

hematiilor şi PMN.

3. Cultivăm pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermentează

sorbitolul, sau îl fermentează tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip S,

1-, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz) (Figura nr.

1).

4. Identificarea se face pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale: bacili Gram-negativi;

· de cultură: colonii de tip S,cu caracterele menţionate mai sus;

· biochimice (se examinează numai acolo unde sunt condiţii de

biosiguranţă, conform unei Directive Europene): fermentează glucoza

(cu producere de gaz), lactoză-pozitivi, nu fermentează (sau









fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt

urează-pozitivi, mobili (există şi tulpini imobile) etc.;

· antigenice: prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri

monovalente anti O157 şi anti H7).

5. Antibiograma este recomandată pentru supravegherea apariţiei

fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează

prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul în infecţiile urinare

În principal se recoltează urină. În funcţie de forma clinică se poate

recolta şi sânge (EX . în pielonefrita acută). Pe lângă regulile

cunoscute, trebuie subliniat că iniţial se realizează toaleta locală. Atunci

când nu se poate recolta prima urină de dimineaţă, trebuie aşteptat

pentru recoltare 3-4 ore după micţiune. Dacă p.p. nu este prelucrat

imediat (în maxim 30 de minute după recoltare), trebuie menţinut la

temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +. Se

recoltează urina “din mijlocul jetului”. Există şi alte tehnici de recoltare,

neinvazive sau invazive (puncţie şi aspiraţie suprapubiană, cateterizare

uretrală, cu riscurile respective).

După examenul macroscopic (EX . urina poate fi tulbure) pregătim un

„sediment urinar”. Examinăm preparatul între lamă şi lamelă; încercăm

să stabilim numărul de bacterii pe câmp şi respectiv numărul de PMN

pe câmp (dacă există leucociturie).

Pentru cultivare putem utiliza mai multe medii diferite. Este de reţinut

că facem o urocultură cantitativă (trebuie să determinăm numărul de

bacterii/ml de urină). De EX ., dacă însămânţăm 0,1 mililitri de urină

diluată (ex. 1/1.000), incubăm şi după apariţia coloniilor calculăm

numărul de bacterii/ml înmulţind nr. de colonii cu 10 şi cu 1.000. Asta

înseamnă că, în condiţiile de mai sus, prezenţa a 7 colonii înseamnă

70.000 bacterii/ml. (Figura nr. 2)

Ce înseamnă urocultură cantitativă? Având în vedere cele de mai sus,

dacă numărul de bacterii/ml este mai mare de 100.000, considerăm

urocultura ca fiind pozitivă. Lipsa coloniilor sau un număr de maxim

10.000 bacterii/ml, semnifică o urocultură negativă. Între 10-100.000

bacterii/ml eventual repetăm analiza.







Dacă urocultura este pozitivă, bacteria izolată se identifică pe baza

caracterelor prezentate anterior şi se tratează conform

antibiogramei.

13. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

genul Klebsiella

Sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradează glucoza este

degradată cu producere de gaz şi fermentează lactoza. Specia tip

este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulaţi). Este un

microb condiţionat patogen. Poate produce TIA de tip infecţios,

infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare etc, inclusiv

infecţii nosocomiale.

Pentru diagnostic, luăm drept exemplu situaţia în cazul pneumoniei

produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul integral include

elemente clinice, paraclinice şi de laborator;

diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei şi tratamentului

corespunzător.

1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute

(recoltăm spută). Macroscopic, poate avea un aspect mucoid, de

culoare roşu închis, “în jeleu de coacăze”.

2. Examinăm microscopic p.p. şi notăm prezenţa celulelor (EX .

macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN) şi a bacililor Gram

negativi, de dimensiuni relativ mari, cu capsulă (halou, vizibil).

3. Cultivăm pe medii de cultură obişnuite (18-24 ore, 35-37°C) şi

examinăm coloniile izolate, pentru a începe identificarea. Utilizăm

medii slab selective (EX . MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se

dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele

moderat selective. K. pneumoniaeformează colonii lactoză-pozitive,

mari, de tip M, cu aspect de “curgere” pe suprafaţa mediului de

cultură (tendinţă de confluare).

4. Identificarea microorganismului se face urmărind caracterele:

· morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, dimensiuni mari, capsulaţi,

dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi; (Figura nr. 3)

· de cultură: colonii lactoză pozitive, de tip M, mari (2- la 24 de ore,

peste la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în “picătură de miere”,

care dau aspectul de “curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu

tendinţă la confluare(Figura nr. 4);





· biochimice: glucoză pozitiv (cu producere de gaz), lactoză pozitiv,

nu produce H2S, imobil, urează pozitiv, indol negativ, se dezvoltă

folosind citratul ca unică sursă de C. (Figura nr. 5)

· antigenice: utilizăm seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea

tulpinilor deKlebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare

(în laboratoare de referinţă);

· testarea sensibilităţii la bacteriofagi etc.

5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin

metode difuzimetrice (determinarea CMI este indicată).


genul Proteus

Genul Proteus este format din germeni foarte pleomorfi, foarte mobili,

Gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, nu fermentează lactoza,

produc urează. Există 2 specii principale, Proteus

mirabilis şi Proteus vulgaris. Sunt germeni condiţionat patogeni.

Pot produce TIA de tip infecţios, infecţii ale tractului urinar (ITU), dar

chiar şi alte infecţii (tegumentare, genitale, infecţii nosocomiale etc).

Discutăm diagnosticul de laborator al ITU.

Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct.

1. Recoltarea şi transportul p.p. se realizează aşa cum am discutat

anterior. Urina poate fi tulbure, purulentă. Transportul trebuie realizat

în maxim 30 minute, iar dacă nu e posibil, p.p. trebuie transportat “la

rece” (+4ºC). (Figura nr. 6)

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea

preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, din sedimentul urinar. Acest

tip de examinare este foarte important (uşor de realizat, ieftin, permite

observarea unor elemente utile, care orientează

diagnosticul). Mobilitatea poate fi evaluată. Urmărim numărul de

leucocite/câmp. (Film nr. 1)

3. Cultivăm pe medii de cultură simple. Trebuie să demonstrăm

prezenţa a peste 100.000 bacterii/ml de urină. Pe mediile simple

uzuale, nu se pot obţine colonii izolate; apare fenomenul de

invazie.

4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor

caractere:

· morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, cu polimorfism (bacili,

cocobacili, forme filamentoase de peste 30 µm); (Figura nr. 7)

· de cultură:

· Fenomenul de invazie (dacă însămânţăm o tulpină la periferia unei

plăci Petri cu mediu simplu, cultura se “dezvoltă în valuri concentrice”,

pe toată suprafaţa mediului) (Figura nr. 8),

· Pe anumite medii selective (cu săruri biliare), invazia este inhibată şi

se obţin colonii izolate, de tip S, lactoză negative,

· Fenomenul “liniei de demarcaţie” (dacă pe o placă cu mediu solid

cultivăm 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta

invadând până în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o “linie

de demarcaţie” între cele 2 tulpini) (Figura nr. 9);

· Fenomenul de “căţărare”;

· Caractere biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte

caractere biochimice se pot studia pe mediile multi test, TSI, MIU etc.),

glucoză pozitive, produc H2S, mobile, urează pozitive, se pot dezvolta

folosind citratul ca unică sursă de carbon; (Figura nr. 10)

· Caractere antigenice;

5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin

metode difuzimetrice.


genulSalmonella.

Genul Salmonella include bacili Gram negativi, mobili cu cili peritrichi,

necapsulaţi, nesporulaţi, nu fermentează lactoza, produc H2S, utilizează

citratul ca unică sursă de carbon.

Pot produce salmoneloze minore (EX . TIA) şi salmoneloze majore (ex.

febra tifoidă). În cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator

estebacteriologic, direct. În cazul afecţiunilor sistemice, diagnosticul

poate fibacteriologic şi serologic.

13. 3. 4. 1. Diagnosticul de laborator în infecţiile cu localizare digestivă

1. Recoltarea şi transportul p.p. (EX . materii fecale) respectă regulile

cunoscute.

2. Examinăm microscopic p.p., între lamă şi lamelă (remarcăm prezenţa

granulocitelor). (Figura nr. 11)

3. Cultivăm pe următoarele medii de cultură: un mediu lichid de

îmbogăţire (bulion selenit) şi două medii selectivo-diferenţiale





(MacConkey şi ADCL). După 18-24 ore la 35-37ºC, pe mediile solide

pot apărea colonii bacteriene suspecte (lactoză-negative) din care

obţinem cultura pură. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit o

repicăm pe medii solide. (Figura nr. 12)

4. Identificăm microorganismului pe baza mai multor caractere:

· morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;

· de cultură: produc colonii de tip S, lactoză-negative (necolorate pe

MacConkey; necolorate, cu centrul negru pe ADCL) (Figura nr. 13);

· biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt

lactoză-negativi, produc H2S şi utilizează citratul ca unică sursă de

carbon; (Figura nr. 14)

· antigenice: utilizăm seruri imune cu Ac anti-O şi ulterior Ac anti-H

(reacţii de aglutinare pe lamă, respectând protocolul de lucru);

· sensibilitatea la bacteriofagi.

5. Antibiograma este recomandată în cazul pacienţilor foarte în vârstă,

sau în cazul copiilor foarte mici, prematuri, cu alte boli adăugate şi

pentru supravegherea apariţiei fenomenului de rezistenţă la antibiotice

şi chimioterapice.

13. 3. 4. 2. Diagnosticul de laborator în febrele enterale (EX . febra

tifoidă)

Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea şi identificarea S.

typhi din p.p.

Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele prezentate

anterior.

În prima săptămână de boală, p.p. e reprezentat de sânge; ulterior

putem recolta materii fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă

etc. Dacă p.p. este reprezentat de materii fecale, respectăm ceea ce

am prezentat mai sus (există şi particularităţi). Coloniile de S. typhi pot

să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL. S. typhi nu produce

gaz din glucoză iar H2S este în cantitate mică. Nu foloseşte citratul ca

unică sursă de carbon. Pentru identificarea AgO este necesară o

inactivare prealabilă (termică). Prezenţa AgVi poate crea probleme în

identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utilă. Testarea sensibilităţii la

antibiotice şi chimioterapice este indicată în toate infecţiile produse

de S. typhi.



Diagnosticul serologic: se realizează respectând principiile generale.

Serodiagnosticul ”Widal” (folosind culturi vii) nu se mai practică astăzi.

Tehnica actuală poartă numele de analiză serică

cantitativă (aglutinare în tuburi). Utilizăm serii de tuburi (câte o serie

pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Utilizăm 6 serii de tuburi pentru a

evidenţia Ac anti-O (TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S.

paratyphi B), şi anti-H (d - S. typhi, a - S. paratyphi A, b - S.

paratyphi B). Pregătim diluţiile, incubăm pentru Ac anti-O timp de 18-

20 ore la 52ºC şi 10 minute la temperatura camerei iar pentru Ac anti-

H timp de 2 ore la 52º C şi 10 minute la temperatura camerei. Apoi

citim reacţia. Un titru de 1/250 în cazul Ac anti-O şi respectiv 1/2.500 în

cazul Ac anti-H este sugestiv. Creşterea de 4 ori a titrului, la 2

determinări succesive confirmă diagnosticul.

În cazul convalescenţilor şi purtătorilor este recomandată reacţia de

aglutinare în tuburi pentru identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi

(titru mai mare de 1/40).


genul Shigella

În genul Shigella există 4 subgrupe: A. Shigella dysenteriae (13

serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) şi D. S.

sonnei (1 serotip cu 2 faze, R şi S). Sunt bacili gram negativi, imobili,

nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi facultativ anaerobi, glucoză pozitivi

(fără producere de gaz), oxidază negativi, lactoză negativi. Subgrupele

se pot diferenţia, de EX . pe baza fermentării manitei (subgrupul A

este manită negativ).

Produc infecţii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate apărea

după ingestia a numai 10-100 bacterii. Shigella spp. poate produce şi

toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) şi trebuie

pus rapid.

1. Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale) respectă regulile

cunoscute. Macroscopic, m.f. pot fi în cantitate mică (mucus, puroi,

sânge). Transportul trebuie să fie realizat rapid (recomand

însămânţarea la patul bolnavului; altfel, trebuie să folosim mediul de

transport, EX . Cary-Blair). Recoltarea se poate face şi cu ajutorul

sondei Nelaton, din colonul sigmoid.





2. Examinarea microscopică a p.p. este foarte importantă. Poate oferi

un răspuns concret, rapid, util. Examinăm preparatul între lamă şi

lamelă, iniţial cu obiectivul 40´. Dacă evidenţiem numeroase PMN,

mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dacă remarcăm un

procent de peste 75% PMN, alături de hematii, acest aspect este

sugestiv pentru dizenteria bacteriană. (Figura nr. 15)

3. Cultivăm pe medii slab şi moderat selective. Dacă apar colonii

lactoză negative, repicăm pe medii multitest (TSI, MIU, MILF).

4. Identificarea microorganismului se realizează pe baza mai multor

caractere:

· Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;

· Caractere de cultură: produc colonii de tip S, lactoză negative, 1-

(Figura nr. 16);

· Caractere biochimice: sunt glucoză pozitivi, fără producere de gaz,

lactoză negativi, nu produc H2S, imobili, urează negativi, indol

negativi; (Figura nr. 17)

· Caractere antigenice: utilizăm seruri imune polivalente anti-subgrup

sau seruri imune specifice de tip (reacţii de aglutinare pe lamă,

conform schemelor de lucru);

· Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizată în

scop epidemiologic.

5. Antibiograma este recomandată. Se realizează prin metoda

difuzimetrică standardizată atât în special în scopul supravegherii

apariţiei unor tulpini rezistente cât şi pentru stabilirea tratamentului

antimicrobian corespunzător.


genul Yersinia

Genul Yersinia include mai multe specii. Infecţii umane pot

produce Yersinia pestis (ciumă), Y. pseudotuberculosis şi Y.

enterocolitica. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, coloraţi bipolar.

Prezintă pleomorfism. Cresc pe medii simple.

Yersiniozele cu poartă de intrare digestivă pot avea drept agenţi

etiologici Y. enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Diagnosticul de

laborator în yersiniozele cu poartă de intrare digestivă

este bacteriologic, direct. Pentru manifestări extra-digestive se poate

face şi diagnostic serologic.

Diagnosticul bacteriologic

1. Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale), se face conform

regulilor prezentate anterior. Se poate folosi mediul de transport Cary-

Blair.

2. Examinarea microscopică a p.p. include realizarea unui preparat

între lamă şi lamelă. Vom evidenţia prezenţa celulelor inflamatorii.

3. Cultivăm pe medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul

CIN (cefsulodină, irgasan, novobiocină). Incubăm şi la temperatura

camerei (20-30ºC).

4. Identificăm pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale: cocobacili sau bacili Gram-negativi,

pleomorfi (Figura nr. 18);

· de cultură: produc colonii de tip S, 1-1,5 mm (2-3 mm după 48 ore);

· biochimice: fermentează glucoza fără producere de gaz, nu

fermentează lactoza, nu produc H2S, sunt imobile la 37ºC şi mobile la

22º C, nu produc indol, produc urează;

· antigenice: utilizăm seruri specifice anti-Yersinia (reacţii de

aglutinare pe lamă).

5. Se recomandă realizarea antibiogramei, prin metoda

difuzimetrică standardizată.

Diagnosticul serologic

Diagnosticul serologic poate fi util în determinarea etiologiei artritelor

reactive, eritemului nodos sau în cazul altor manifestări extra-

intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii, ating

valoarea maximă după circa 14 zile şi persistă câteva luni. Se pot

practica diferite tehnici, de EX . reacţia de aglutinare în tuburi.

Un titru mai mare de 1/160 poate avea semnificaţie. Se recomandă

testarea în dinamică.

Trebuie să fie luată în considerare posibilitatea apariţia unor reacţii

încrucişate, datorită existenţei unor Ag asemănătoare la

microorganisme din genurileBrucella sau Salmonella.

13. 4. Direcţii de cercetare

















Copil în vârstă de 4 ani, de sex masculin, din mediul urban se

internează într-o secţie de pediatrie cu febră, tuse seacă, fatigabilitate,

inapetenţă, disfagie, dureri abdominale. În urmă cu 10 zile, prezintă

semnele unei angine acute eritematoase, cu febră , care nu se remite în

următoarele zile sub tratament antipiretic. Pe parcursul internării

primeşte tratament antibiotic şi simptomatic, durerea abdomnială

devine mai accentuată, apar scaune apoase, fetide. Se efectuează

coprocultură.

Se decide transferul pacientului într-o secţie de boli infecţioase. Starea

generală rămâne deteriorată, facies palid, încercănat, tegumente

palide, limbă saburală cu descuamare la vârf, adenopatie

laterocervicală, subangulo-mandibulară; sistemul muscular hipoton,

hipokinetic; abdomen sensibil la palpare periombilical şi în hipogastru;

tranzit intestinal accelerat. Din analize se evidenţiază ușoară anemie,

iar ecografia abdominală arată hepatomegalie. Se comunică şi

rezultatul coproculturii recoltate: Salmonella gr. B, rezistentă la

ampicilină, sensibilă la cotrimoxazol, acid nalidixic, ciprofloxacin.

Diagnostic pozitiv: gastroenterită acută cu Salmonella gr. B, formă

clinică medie; angina acută eritematoasă, tulburări hidrice şi

hidroelectrolitice. S-a instituit tratament cu ciprofloxacină; starea

pacientului s-a ameliorat.

Discuţii

În cazul unei enterocolite la copiii sub 10 ani, simptomele sunt mai

severe. Astfel, chiar dacă enterocolitele salmonelozice sunt de obicei

autolimitante şi nu se tratează cu antibiotice (existând riscul de a

prelungi portajul şi perioada în care pacientul va continua să excrete








salmonele), în această situaţie (avându-se în vedere și starea clinică) s-

au administrat pentru a evita apariţia unor complicaţii.

13. 6. De reţinut

Familia Enterobacteriaceae reprezintă cea mai larg reprezentată

grupare taxonomonică, cuprinzând specii patogene pentru om,

cât şi specii saprofite sau condiţionat patogene

Sunt bacili Gram-negativi ce nu se pot diferenția prin microscopie

optică

În anumite situaţii reechilibrarea hidroelectrolitică este suficientă

ca şi tratament, antibioterapia poate prelungi portajul bacteriei

responsabile de infecţie

Măsurile profilactice se referă în primul rând la respectarea

măsurilor igienice atât în unităţile sanitare, cât şi în unităţile

administraţiei publice.

13. 7. Verificaţi-vă cunoştinţele

1. Pacient de sex masculin, în vârstă de 35 de ani, se prezintă la spital

pentru disurie, polakiurie, durere lombară, febră. Hemoleucograma

evidenţiază leucocitoză cu neutrofilie, VSH, PCR, fibrinogen crescute.

Sumar de urină: hematii, leucocite, floră microbiană, cilindrii leucocitari

prezenţi. S-a efectuat urocultura. Care este cel mai probabil agent

patogen implicat în această patologie urinară?

A. E.coli

B. Yersinia pestis

C. Yersinia enterocolitica

D. Klebsiella pneumoniae

E. Shigella shiga

2. Despre enterobacterii sunt adevărate următoarele afirmaţii:

A. Sunt bacili Gram-negativi, cu capete rotunjite, nesporulaţi

B. Sunt germeni pretenţioşi oxidază-pozitivi, catalază-negativi

C. Prezintă ca şi structură antigenică lipopolizaharidul (LPZ)

D. Unele enterobacterii elaborează exotoxine

E. Pot coloniza în mod normal intestinul omului

3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Salmonella cu

localizare digestivă cuprinde:

A. Diagnosticul serologic

B. Examinarea microscopică a produsului patologic cu

realizarea preparatului nativ, între lamă și lamelă

C. Analiza serică cantitativă, realizată prin tehnica aglutinării în

tuburi

D. Identificarea microorganismului patogen, izolat în cultură

pură

E. Utilizarea mediilor convenţionale (TSI, MIU, MILF) sau a

galeriilor multi test

4. Despre Y. enterocolitica şi Y. pseudotuberculosis sunt adevărate

următoarele afirmații:

A. Microorganismele sunt lactoză-negative, catalază pozitive şi

oxidază negative

B. În timpul incubaţiei se multiplică la nivelul mucoasei

intestinale

C. Manifestările clinice pot conduce la punerea eronată a

diagnosticului de apendicită acută

D. Prin inhalarea de nuclei de picătură pot determina apariţia

pestei pneumonice primare

E. Se recomandă vaccinarea anti-pestă pentru călătorii care se

deplasează în zonele endemice

5. Între caracterele de cultură şi cele biochimice întâlnite la Proteus spp.

se numără:

A. fenomenul liniei de demarcaţie

B. se poate dezvolta folosind citratul ca unică sursă de carbon

C. pe medii multitest este glucoză pozitiv, lactoză negativ

D. nu produce H2S

E. pe medii de cultură formează colonii de tip S

13. 8. „Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Respectarea regulilor generale de igienă reprezintă principala

modalitate profilactică.

2. Se recomandă în scop profilactic administrarea de antibiotice.

3. Au fost dezvoltate o serie de vaccinuri pentru combaterea acestor

infecţii, dar acestea conferă o protecţie ce variază între 50-80%.

4. Ciuma este eradicată, deci nu trebuie instituite măsuri preventive

specifice.

5. După infecţie, există imunitate postinfecţioasă pe viaţă.


infecţii produse de microorganisme

din genurile Vibrio și Pseudomonas.

(Gabriela-Loredana Popa, Alexandra

Limbău) 14. 1. Cuvinte cheie

· Bacilul piocianic

· Vibrion holeric

· Ecthyma gangrenosum

· Scaune riziforme

· Oxidază pozitivi

· Pigmentogeneză

14. 2. Introducere


Bacilii Gram negativi studiați în acest capitol sunt incluși în

genurilePseudomonas și Vibrio. Cea mai importantă specie a

genului Pseudomonas estePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic,

“bacilul puroiului albastru”) una dinprincipalele bacterii oportuniste.

Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae și cuprinde mai multe

specii cu patogenitate variabilă pentru om.

14. 2. 2. Cale de transmitere

14. 2. 2. 1. Genul Vibrio

Vibrio cholerae se găsește în intestinul și în materiile fecale ale omului

bolnav de holeră. Supraviețuiește timp îndelungat în apele poluate și

pe obiectele contaminate. În mediul extern, prezența vibrionului

holeric este explicată prin contaminarea fecală, existând și posibilitatea

unui ciclul de viață extraintestinal. Vibrionii sunt introdusi în organism

pe cale digestivă fie prin alimente, fie pe calea mâinilor murdare.

14. 2. 2. 2. Genul Pseudomonas

Pseudomonas aeruginosa este un bacil comensal al tubului digestiv,

foarte răspândit în natură (agent de putrefacție a materiei organice

animale și vegetale). Este o bacterie căreia îi place apa. A fost izolat din

apa de râu, de piscină, termală etc. Este o bacterie rezistentă în mediul

extern, supraviețuind mai multe luni de zile și chiar multiplicându-se în

apă la temperatura mediului ambiant. Contaminează obiectele din

grupurile sanitare, produsele alimentare, chiuvetele. Este din ce în ce

mai frecvent izolat din mediul de spital, de pe diferite suprafețe și

dispozitive medicale. Elaborează o piocină (bacteriocina) cu efect

inhibitor asupra unor tulpini din aceiasi specie.

14. 2. 3. Tablou clinic

14. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecțiile produse de Vibrio cholerae

Holera este o toxiinfecție alimentară (TIA) acută, caracteristică omului.

Nu este o infecție invazivă, vibrionii nu difuzează în sânge, ci rămân

cantonați la nivelul intestinului. Aderă la epiteliul celular (adezine/pili),

se atașeză de microvilii de la nivelul epiteliului ciliat, apoi colonizează

și invadează mucoasa. La acest nivel se multiplică și eliberează variate

substanțe active biologic, incluzând enzime extracelulare, enterotoxine,

citotoxine, hemolizine (este vorba în special de enterotoxina holerică).

După o perioadă de incubație de 1-4 zile, boala debutează brutal cu

grețuri, vărsături, diaree abundentă (10-30 litri/zi) însoțite de crampe

abdominale. Scaunele sunt apoase, riziforme (“apă de orez”), conțin

mucus, celule epiteliale și numeroși vibrioni. Pierderile masive de apă și

electroliți prin scaune diareice și prin vărsături conduc la deshidratarea

organismului, acidoză, hemoconcentratie marcată, colaps circulator și

decesul bolnavului. Rata mortalității în lipsa tratamentului adecvat este

de aproximativ 25-50%.

14. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecțiile produse de Pseudomonas

aeruginosa

Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt patogene prin virulență și

toxinogeneză. Este putin virulent pentru organismul sănătos, dar

devine agresiv pentru cei imunodeprimați. Dintre factorii de virulență

ai bacilului piocianic se pot aminti prezența pililor (asigură adeziunea

de substratul specific), producerea unor proteaze (cu efecte

histotoxice), a unor lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exotoxina

A, de natură proteică, sintetizată în cantități variabile în funcție de

tulpină mult mai toxică decât endotoxina) și a lipopolizaharidului din

peretele bacterian cu rol de endotoxină. Pseudomonas

aeruginosa poate produce infecții foarte variate, de la infecții

tegumentare superficiale până la septicemii fulminante. În urma

contaminării cu diferite soluții apoase sau după înot în piscină, la

persoanele cu reactivitate normală, infecțiile sunt de obicei localizate

(foliculite, otite, infecții oculare etc.). Ar putea semnala prezența

piocianicului, culoarea albastră verzuie a pansamentelor, ca urmare a

proprietății de pigmentogeneză prin producerea de piocianină

(albastru) și pioverdină (galben verzui fluorescent). Poate cauza o

varietate de infecții ale pielii, atât localizate cât și difuze, poate avea o

evoluție gravă, cu apariția de vezicule, care se sparg, apărând o bază

necrotică și poate progresa în profunzime (ecthyma

gangrenosum) (Figura nr. 1). Pseudomonas a fost de asemenea implicat

în foliculită și forme greu de gestionat de acnee vulgară. Poate

determina apariția bacteriemiei în principal la pacienții

imunodeprimați. Condiții predispozante includ afecțiuni maligne

hematologice, imunodeficiența în SIDA, neutropenie, diabet zaharat și

arsuri severe. Infecțiile respiratorii cauzate apar aproape exclusiv la

persoanele cu un tract respirator inferior și un mecanism de apărare

sistemic compromise. Colonizarea tractului respirator inferior la

pacienții cu fibroză chistică (mucoviscidoză) este dificil de eradicat fiind

produsă de un fenotip particular al speciei de Pseudomonas

aeruginosa. În lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită rezistenței la

antibiotice), evoluția procesului infecțios poate fi gravă (80% din

septicemiile cu piocianic au evoluție letală).

14. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de

microorganisme din genurile Vibrio și Pseudomonas

14. 3. 1. Diagnosticul de laborator în holeră (Vibrio cholerae)

Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscută specie

esteVibrio cholerae (vibrionul holeric), mobil, aerob facultativ anaerob,

oxidază pozitiv, rezistent la pH alcalin şi săruri biliare. Produce toxina

holerică şi respectiv holera.

Diagnosticul este bacteriologic, direct. Trebuie realizat cât mai urgent.

14. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile prezentate

anterior (vezi capitolul 4). Recoltăm materii fecale sau/şi lichid de

vărsătură. Materiile fecale sunt apoase, riziforme (ca “apa de orez”), au

culoare verzuie, miros fetid, conţin mucus. Cel mai bine însămânţăm

rapid. Dacă nu putem ajunge la laborator 1-3 ore folosim mediul de

transport Cary-Blair. Apa peptonată alcalină (pH 9-9,5) poate fi

utilizată ca mediu de transport dar şi ca mediu de îmbogăţire.

14. 3. 1. 2. Examinăm microscopic p.p., în preparatul între lamă şi

lamelă (nu frotiuri) (Figura nr. 2). Utilizăm obiectivul 40. Nu se

evidenţiază PMN. Există vibrioni care prezintă mişcări active.

14. 3. 1. 3. Cultivăm (direct sau după transport) în apă peptonată

alcalină (APA). După 6-8 ore la 35-37º, trecem pe un mediu selectiv, cu

săruri biliare (TCBS şi/sau BSA), prelevând de la suprafaţa mediului

lichid (unde ar putea să apară un „văl”). Dacă examinăm microscopic

(între lamă şi lamelă) conţinutul „vălului” am putea grăbi diagnosticul.

14. 3. 1. 4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza

caracterelor

· morfotinctoriale: bacili Gram-negativi; (Figura nr. 3)

· de cultură: produc colonii de tip S(galbene, mari, 2-4 mm, pe TCBS)

sau colonii de tip S (rotunde, strălucitoare, transparente ca picăturile

de rouă, pe BSA);

· biochimice: V. cholerae este oxidază pozitiv; alte teste biochimice se

pot efectua în laboratorul de referinţă;

· antigenice: utilizăm ser anti-holeric O:1 (reacţii de aglutinare pe

lamă); în centrul de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se identifică

serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima); dacă rezultatele sunt negative

se foloseşte şi serul anti-holeric O:139;

· testarea sensibilităţii la bacteriofagi se poate utiliza în studii

epidemiologice sau în scop de cercetare (în laboratorul de referinţă).

14. 3. 1. 5. Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică

standardizată, pentru supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la

medicamentele antimicrobiene (vezi capitolul 8).

14. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul

Pseudomonas

Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind

reprezentată dePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic/“bacilul

puroiului albastru”). Sunt bacili Gram-negativi, aerobi,oxidază pozitivi,

nesporulaţi, mobili (unul sau mai mulţi cili polari).

Discutăm diagnosticul de laborator în infecţiile tegumentelor. Este un

diagnostic bacteriologic, direct, etapele fiind similare celor discutate

anterior.

14. 3. 2. 1. Recoltarea şi transportul p.p. (puroi) respectă recomandările

cunoscute. Macroscopic, p.p. poate avea un aspect sugestiv (culoare

albastră/galben-verzui fluorescentă).

14. 3. 2. 2. Examinăm microscopică după realizarea a cel puţin 2 frotiuri

(colorate cu A.M. şi Gram). Notăm prezenţa celulelor,

prezenţa celulelor inflamatorii (EX . PMN) şi a bacililor gram-

negativi, 1-5/0,5-1µm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau

izolaţi. (Figura nr. 4)

14. 3. 2. 3. Cultivăm pe medii de cultură obişnuite, timp de 18-24 ore.

Bacilul piocianic se poate multiplica la temperaturi care variază între 5-

42ºC, însă dezvoltarea optimă este la 30-37ºC. Recomandăm utilizarea

unor medii de cultură selective (p.p. contaminat). Formează coloniide

tip S care se pigmentează, însoţindu-se de pigmentarea

mediului (EX . albastru sau galben-verde fluorescent) (Figura nr. 5).

Cultura poate avea un miros ca al florilor de tei.

14. 3. 2. 4. Identificăm microorganismului pe baza caracterelor

· morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispuşi în lanţuri scurte,

perechi, izolaţi, relativ polimorfi. În culturi mai vechi pot apărea diferite

forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe

preparatul proaspăt, între lamă şi lamelă. (Figura nr. 6) (Film nr. 1)

· de cultură: produc colonii de tip S pigmentate (se remarcă

şipigmentarea mediului, albastru sau galben-verde fluorescent).

Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Pe mediile cu

sânge produc hemoliză. (Figura nr. 7)

· biochimice: produce diferiţi pigmenţi (de EX . piocianina/albastră şi

pioverdina sau fluoresceina/galben-verzui fluorescentă); degradează

oxidativ glucoza, nu fermentează lactoza; este oxidază pozitiv. (Figura

nr. 8)


prin metode difuzimetrice. Este bine ca testarea difuzimetrică să se

însoțească de determinarea CMI.


http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/14-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3ii-produse-de-microorganisme-din



















O pacientă în vârstă de 26 de ani se internează într-o secție de ORL,

având în antecedente un traumatism cranian (hematom epidural

temporal stang). În secția de terapie intensivă a necesitat intubație

oro-traheală, ventilație mecanică prelungită, apoi traheostomie ca

urmare a unei stenoze traheale apărute. La 24 de ore post intervenție

chirurgicală pentru stenoză, s-a instalat șocul septic cu punct de

plecare pulmonar. S-a institutit terapie antibiotică cu spectru larg

(carbapenem + aminoglicozid + levofloxacin + vancomicina). Timp de

10 zile s-au susținut funcțiile vitale prin ventilație mecanică și suport

vasopresor. Pe parcurs au apărut tulburari de ritm ventricular.

Disfuncția respiratorie s-a corectat la cateva zile, șocul septic s-a remis

treptat. Parametrii clinici și paraclinici s-au normalizat după încheierea

tratamentului antibiotic (aproximativ 14 zile).

Discuții

Tinând cont de rapiditatea cunoscută a dobândirii rezistenței la

monoterapie antibiotică a bacilului piocianic, se utilizează în general

în tratament, asocierea mai multor antibiotice. Șocul septic produs

de Pseudomonas aeruginosa se manifestă cu o gravitate deosebită și

este dificil de controlat, chiar cu resursele terapeutice moderne ale

terapiei intensive.

14. 6. De reținut

l Prezența anticorpilor în sângele pacienților nu conferă o eficacitate

protectivă.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3863721/






l În orice infecție, atunci când s-a dovedit agentul etiologic implicat,

antibiograma este obligatorie.

l Educația sanitară, îmbunătățirea gradului de sanitație, al apei și al hranei

reprezintă metode profilactice.


1. Un bărbat de 35 de ani cu infecție HIV dezvoltă sepsis cu apariția

unei leziuni necrotice cu margini eritematoase la nivelul coapsei. Care

este cel mai probabil agent patogen responsabil de această leziune?

A. Clostridium perfringens

B. Bacillus anthracis

C. Enterococcus faecalis

D. Pseudomonas aeruginosa

E. Staphylococcus aureus

2. Apariția infecției cu Vibrio cholerae poate fi prevenită prin:

A. Îmbunătățirea gradului de sanitație

B. Educație sanitară

C. Chimioprofilaxie cu agenți antimicrobieni

D. Vaccinare cu DTP

E. Utilizarea Ig antitoxice

3. Diagnosticul de laborator în holeră cuprinde:

A. Diagnosticul bacteriologic, direct

B. Recoltarea produsului patologic (materii fecale în general)

C. Identificarea microorganismului pe baza caracterelor

morfotinctoriale

D. Antifungigrama

E. Testul de hemaglutinare

4. Factorii de virulență ai bacilului piocianic sunt următorii, cu excepția:

A. Pilii

B. Producerea unor proteaze

C. Exotoxina A

D. Endotoxina

E. Listeriolizina O

5. Principalele afecțiuni produse de bacilul piocianic sunt următoarele:

A. Foliculite

B. Apariția de vezicule la nivel dermic

C. Ecthyma gangrenosum

D. Diaree sangvinolentă

E. Ascita produsă brusc

14. 8. “Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Vaccinul reprezintă doar o măsură adițională pe lângă educația

sanitară.

2. Nu este nevoie de vaccinare deoarece holera este o infecție

eradicată, deci nu reprezintă o amenințare.

3. Holera este o simplă toxiinfecție alimentară care se remite

spontan.

4. Colonizarea cu piocianic apare doar la pacienții spitalizați.

5. Răspândirea de Pseudomonas aeruginosa poate fi cel mai bine

controlată prin respectarea procedurilor adecvate de izolare și a

diverselor tehnici de asepsie.


infecţii produse de bacili Gram

pozitivi. (Gabriela-Loredana Popa,

Alexandra Limbău) 15. 1. Cuvinte cheie

· Germen anaerob

· Exototină

· Falsă membrană

· Pustulă malignă

· Risus sardonicus

· Toxiinfecție alimentară de tip toxic

15. 2. Introducere


Bacilii Gram pozitivi studiați se pot clasifica în bacili nesporulați

(ex.Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) și respectiv bacili Gram

pozitivi sporulați (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Există și alți

bacili Gram-pozitivi.


15. 2. 2. 1 Bacili Gram-pozitivi nesporulați

Specia tip a genului Corynebacterium este C. diphteriae, agentul

etiologic al diferiei. Genul cuprinde și alte specii, care în anumite

condiții, pot genera infecții umane. Corynebacterium diphteriae poate

fi identificat în leziuni dermice (la nivel tegumentar), precum și în

tractul respirator superior. Transmiterea bacteriei se realizează pe cale

respiratorie sau prin contact direct, cu zonele contaminate.

Listeria monocytogenes este un microorganism patogen, capabil să se

multiplice în macrofage, celule epiteliale, fibroblaste. Sunt bacterii

răspândite în natură (la nivelul solului, plantelor). Pot fi izolate din

alimente (ex. brânzeturi) și identificate în lapte și produse lactate, carne

crudă sau insuficient prelucrată. Se transmite omului prin consumul de

alimente contaminate. Listerioza este o zoo-antroponoză. Infecția la

om evoluează de multe ori inaparent și deseori apare în mod

accidental.

15. 2. 2. 2 Bacili Gram-pozitivi sporulați

Bacillus anthracis este un germen ubicuitar, sporii îi conferă rezistență.

Este agentul etiologic al unei zoo-antroponoze care afectează

ierbivorele. Se găsește în țesuturile și umorile animalelor bolnave. Este

eliminat prin dejecții și contaminează mediul extern. Germenul

sporulează pe sol și supraviețuiește zeci de ani.

Clostridium tetani, germen anaerob, specie patogenă prin toxinele

neurotrope elaborate, produce tetanosul. Sporii pătrund în organism

prin intermediul unor plăgi “tetanigene” (asigură condiții de

anaerobioză necesare multiplicării germenului).

Clostridium botulinium nu se multiplică în organism ci în alimente

unde produce o exotoxină. Infecția (botulismul) apare prin ingestia de

alimente care conțin toxina botulinică preformată. Există și unele

excepții.

Clostridiile gangrenei gazoase cresc pe medii simple, în condiții de

strictă anaerobioză. Sunt ubicuitare, prezente în mod normal în tractul

digestiv al omului sau al animalelor ca forme vegetative. Eliminate pe

sol prin dejecte, sporulează. Sursa principală pentru contaminare este

reprezentată de sol.


15. 2. 3. 1 Tabloul clinic în difterie

Frecvent infecția este localizată la poarta de intrare (în general la

nivelul amigdalelor) determinând o angină. La nivelul tractului

respirator (laringe, faringe, nas) se produce o laringită cu obstrucția

căilor respiratorii. Nu are capacitate invazivă, se multiplică la poarta de

intrare; determină un proces inflamator cu necroză și exsudat. Toxina

elaborată local induce și apariția unei structuri compusă din fibrină,

leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii distruse și bacterii,

denumită “falsa membrană” (Figura nr. 1), foarte aderentă de țesutul

subiacent; smulgerea ei determină sângerare. Din cauza prezenței

acestor membrane la nivelul căilor respiratorii, există pericol de asfixie.

La distanță, toxina circulă prin sânge și se fixează pe miocard,

suprarenale, sistem nervos sau la nivel renal. Cu cât diagnosticul este

mai tardiv, cu atât rata mortalitații prin difterie crește.

15. 2. 3. 2 Tabloul clinic în infecțiile produse de Listeria spp.

Listerioza este o zoo-antroponoză. Infecția umană apare accidental și

evoluează inaparent, în foarte multe cazuri. În mod normal, sistemul

imunitar elimină infecția. Dacă sistemul imun este deficitar sau

compromis, manifestările sistemice ale infecției se pot dezvolta. La

nou-născut contaminarea se produce transplacentar. După naștere, în

primele ore, poate exista septicemie cu multiple localizări secundare și

afectare neuro-meningeană. La gravidă, infecția este frecvent

inaparentă cu manifestări nespecifice, de tip ”gripal”, febră,

simptomatologie în sfera urinară, digestivă. La adult, listerioza se poate

manifesta ca meningoencefalită. Calea gastrointestinală este

considerată cea mai importantă cale de pătrundere asociată

consumului de alimente contaminate (EX . brânză din lapte

nepasteurizat).

15. 2. 3. 3 Tabloul clinic în infecțiile produse de Bacillul anthracis

Simptomatologia depinde de localizarea infecției și poate exista o

perioadă de 1 zi sau mai mult de 2 luni până la apariția manifestărilor.

La om în funcție de localizarea manifestărilor clinice putem vorbi

despre:

a. Antraxul cutanat,cunoscută sub numele de “pustulă malignă”, apare

după contactul direct cu solul contaminat cu spori (cel mai frecvent).

La locul pătrunderii sporilor (EX . leziune/traumatism), dupa o

perioada de 4-5 zile, apare o papulă, care ulterior se transformă în

veziculă. Dupa ce vezicula se sparge, la baza ei se observă o crustă de

culoare neagră, inconjurată de o zonă de edem (Figura nr. 2).

Netratată, infecția poate disemina, ducând la generalizarea procesului

infecțios (septicemie).

b. Antraxul pulmonar, apare ca urmare a inhalării sporilor; aceștia se

cantonează la nivelul alveolelor pulmonare, se transformă în bacili care

eliberează exotoxina. Inițial simptomele sunt ușoare și nespecifice,

similare unei afecțiuni respiratorii virale. Ulterior, după 1-3 zile, apar

semne de insuficiență respiratorie acută (febră, dispnee, hipoxie,

hipotensiune). Pneumopatia acută are adesea o evoluție gravă.

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/15-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3ii-produse-de-bacili-gram




c. Antraxul gastrointestinal apare prin ingerarea cărnii provenită de la

un animal infectat. Manifestările clinice includ febră, greață, vărsaturi,

dureri abdominale, diaree sanguinolentă, deshidratare. Este rară la om,

dar insoțită de o mortalitate mare.

15. 2. 3. 4 Tabloul clinic în infecțiile produse de genul Clostridium

Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin

multiplicare la poarta de intrare și toxinogeneză. Elaborează o

exotoxină neurotropă ce ajunge în sistemul nervos pe calea nervilor

periferici și secundar pe cale sanguină sau limfatică. Acționează la

nivelul centrilor motori blocând eliberarea mediatorilor de glicină și

acid gamma amino butiric (care au rol inhibitor). Apare paralizia

spastică (spasme severe, dureroase, ale musculaturii striate, inițial în

zona contaminată). Contractura musculaturii feței are un aspect

caracteristic “risus sardonicus” (fruntea încrețită, pleoapele închise pe

jumătate, colțurile gurii trase în jos) și a mușchilor masticatori

manifestată prin trismus(gura nu se mai deschide) (Figura nr. 3). Pe

fondul contracturii tonice, orice stimul extern determină apariția de

crize de contracturi musculare paroxistice foarte dureroase. Starea de

conștiență este păstrată. Moartea se produce prin asfixie ca urmare a

spasmului mușchilor respiratori.

Botulismul apare prin ingestia de alimente care conțin toxina

(toxiinfecție alimentară de tip toxic / toxină preformată în aliment).

Toxina botulinică este substanța biologică cea mai toxică cunoscută.

Doza letală pentru om este de circa 1-2 µg. După ingestie, se resoarbe

la nivel intestinal și ajunge în circulație. Acționează la nivelul joncțiunii

neuromusculare blocând eliberarea de acetilcolină. Apare paralizia

flască, cu o evoluție descendentă. Începe la extremitatea cefalică,

afectând mușchii globilor oculari, cu diplopie, hipersecreție lacrimală și

ajunge pană la paralizia musculaturii respiratorii. Decesul survine prin

asfixie. În primele 6 luni de viață poate apărea botulismul infantil, ca o

consecință a formării toxinei botulinice prin germinarea la nivel

intestinal a sporilor ingerați (EX prin consum de miere). La persoanele

care folosesc droguri injectate intravenos sau prezintă leziuni

contaminate cu pământ, poate apărea botulismul plăgilor.

Gangrena gazoasă este produsă de două sau mai multe dintre

următoarele specii: C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum,



C. sporogenes etc. Poarta de intrare pentru spor este tegumentul

contaminat (leziuni/traume). Anaerobioza determină germinarea

sporilor, formele vegetative se multiplică, fermentează zaharuri și se

formează gaz. Leziunea este însoțită de un edem dur, crepitant

(datorită prezenței de gaz) și necroza țesuturilor. Diseminarea infecției

este favorizată de distensia tisulară cu obstrucția mecanică a

structurilor vasculare în conjuncție cu sinteza de toxine. Evoluția în 20-

80 % din cazuri este fatală.

15. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de bacili Gram

pozitivi

15.3.1. Diagnosticul de laborator în difterie

Genul Corynebacterium include mai multe specii.

Grupul Corynebacterium diphtheriae cuprinde speciile C. diphtheriae, C.

pseudotuberculosis şi C. ulcerans. Tulpinile lizogene (infectate cu

bacteriofagi tox+) sintetizează toxina difterică; aceasta are efecte

importante la nivel cardiac (miocardită), nervos (demielinizare), renal

(necroză tubulară), suprarenalian, muscular şi hepatic.

Diagnosticul de laborator în difterie este bacteriologic (direct) şi

trebuie realizaturgent; fixarea toxinei pe celule țintă este ireversibilă,

astfel încât decizia trebuie luată foarte rapid (acesta este și motivul

pentru care cel mai bine este ca vaccinarea să se realizeze

corespunzător și să existe prevenirea infecției).

Se porneşte de la un diagnostic de suspiciune (clinic) şi se realizează

diagnosticul de laborator. Examinarea frotiurilor din p.p. în contextul

clinic poate conduce la recomandarea de instituire a tratamentului

(administrare de Ac antitoxină), imediat, fără a aștepta finalizarea

diagnosticului bacteriologic.

1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă recomandările

obişnuite (vezi cap. 4), dar există și anumite lucruri de atenție. Trebuie

să recoltăm secreţii de la nivelul faringelui şi secreţii nazale. Dacă

există o „falsă membrană” se recomandă detaşarea cu grijă a acesteia

şi recoltarea secreţiei. Se vor utiliza cel puțin 4 tampoane, 3 pentru

recoltarea secreţiilor faringiene şi al 4-lea pentru recoltarea secreţiilor

nazale. Un tampon va fi utilizat pentru realizarea frotiurilor, al doilea se

va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultură solide, selective

şi neselective (EX . geloză sânge, Loeffler şi medii cu telurit de



potasiu). Al treilea şi al patrulea tampon sunt introduse într-un mediu

de îmbogăţire (OST, ou-ser-telurit). (Figura nr. 4)

2. Examenul microscopic este foarte important. Atunci când contextul

clinic este sugestiv, în baza acestui examen se poate începe

tratamentul (leucocite, bacili Gram-pozitivi, cu capetele mai umflate,

aşezaţi în V, L) (Figura nr. 5).

3. Cultivarea a avut loc și continuăm diagnosticul, chiar dacă

tratamentul a fost început. Trebuie să obţinem colonii izolate,

respectiv o cultură pură, să le identificăm şi să punem în evidenţă

capacitatea toxigenă. Coloniile caracteristice apar la 24-28 h pe mediul

cu telurit de potasiu (colonii de tip R pentru biotipul gravis).

4. Identificarea microorganismului se realizează pe baza mai multor

caractere:

· Caractere morfotinctoriale:bacili Gram-pozitivi, polimorfi, cu capete

umflate, aşezaţi în V, L sau sub formă de „litere chinezeşti”;

· Caractere de cultură: produc colonii de tip Ssau R, în funcţie de

biotip (R pentru gravis); pe mediul Loeffler (electiv) coloniile apar în 18

ore (albe, lucioase, bombate, semicremoase);

· Caractere biochimice: diferenţierea biotipurilor se realizează prin testul

catalazei (pozitiv), ureazei (negativ), reducerea nitraţilor şi fermentarea

unor zaharuri;

· Caractere antigenice: utilizăm ser cu Ac anti-toxină difterică pentru

identificarea producerii toxinei (testul ELEK); (Figura nr. 6)

· Caractere de patogenitate: testarea producerii de toxină pe celule

Vero sau prin alte metode (EX . PCR pentru subunităţi ale

genei tox+etc.).

5. Antibiograma se poate realiza prin metoda difuzimetrică

standardizată (vezi cap. 8), în special în scopul supravegherii apariţiei

unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene sau în scop de

cercetare. De regulă, tulpinile deC. diphtheriae sunt sensibile la

penicilină sau eritromicină.

15. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Listeria

spp.

Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai importantă specie

esteListeria monocytogenes (poate produce infecţii variate animale și

umane). Sunt bacili fini, Gram pozitivi (Figura nr. 7), aerobi facultativ



anaerobi, mobili la 25ºC; se dezvoltă mai bine la 20-30ºC sau chiar la

temperatura frigiderului („îmbogăţire la rece”).

Diagnosticul de laborator în infecţiile cu L.

monocytogenes este bacteriologic, direct.

1. Recoltarea şi transportul p.p. (sânge, lichid amniotic, placentă, ţesut

fetal etc.) se face conform regulilor discutate anterior (vezi capitolul 4).

2. Examinarea microscopică a p.p. permite evidenţierea unor bacili sau

cocobacili Gram pozitivi, dispuşi izolat, în perechi sau în lanţuri scurte,

intra sau extracelular.

3. Cultivarea se face pe medii complexe. L. monocytogenes se poate

multiplică la temperaturi ce variază între 2-45°C (cel mai bine la 20-

30°C). Sunt necesare medii selective atunci când p.p. este potenţial

contaminat.

4. Identificăm microorganismul pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale: bacili fini Gram-pozitivi, dispuşi separat sau

grupaţi în palisade, în perechi sau “în formă de litere” (asemănător

corynebacteriilor);

· de cultură: formează colonii de tip S, cu aspect de picături de rouă;

pe agar-sânge, coloniile sunt înconjurate de b-hemoliză; (Figura nr. 8)

· biochimice: produce b-hemoliză; fermentează diferiţi carbohidraţi;

· antigenice: folosim seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea

tulpinilor de Listeria monocytogenes; serotiparea este utilă în scop

epidemiologic.

5. Antibiograma poate fi necesară şi se realizează de obicei prin

metode difuzimetrice. În cazul infecţiilor grave se vor determina CMI şi

CMB (vezi cap. 8).

15. 3. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Bacillus

anthracis

Din genul Bacillus mai frecvent implicate în patologia umană sunt B.

anthracis,B. cereus şi B. subtilis. B. anthracis se prezintă sub formă de

bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari, imobili, sporulaţi, cu sau fără

capsulă, aerobi facultativ anaerobi.

15. 3. 3. 1. Diagnosticul de antrax porneşte de la datele clinice şi

epidemiologice. Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct şi

trebuie realizat cât mai rapid.

1. Produsul patologic recoltat şi transportat este reprezentat cel mai

frecvent de secreţii de la nivelul leziunilor cutanate (în funcţie de forma

clinică - cutanată/viscerală). Dacă transportul va dura peste o oră,

asigurăm temperatura de transport (2-8ºC). Trebuie luate măsuri de

biosecuritate !

2. Examinăm microscopic frotiurile din p.p. (colorăm 2 frotiuri şi unul îl

reţinem, ca rezervă) şi putem remarca structuri de ţesut, PMN (relativ

rare) şi bacili Gram pozitivi, cu capetele „tăiate drept”, de dimensiuni

mari (1,5mm/10mm), capsulaţi, dispuşi izolat, în perechi sau lanţuri

scurte, incluşi într-o capsulă comună. (Figura nr. 9)

3. Cultivăm pe geloză nutritivă sau geloză sânge, în condiţii de

aerobioză, la de 37ºC (se poate multiplica şi la 15-42ºC). Pot fi

necesare medii selective.

4. Identificăm microorganismului pe baza mai multor caractere:

· Caractere morfotinctoriale: bacili Gram-pozitivicu dimensiuni mari,

dispuşi în lanţuri; poate începe procesul de sporogeneză (spor oval,

situat central, mai mic decât bacilul);

· Caractere de cultură: produc colonii de tip R, mari, de 2-5 mm

(marginile neregulate, cu prelungiri laterale au dus la asemănarea cu

„capul de meduză” sau „coama de leu”); (Figura nr. 10)

· Caractere biochimice: Bacillus anthracis este catalază pozitiv,

produce lecitinază şi este sensibil la penicilină;

· Caractere de patogenitate: testarea patogenităţii la şoarecele alb.

5. Antibiograma nu este necesară. Bacillus anthracis este sensibil la

penicilină, eritromicină, tetraciclină, cloramfenicol, ciprofloxacină etc

(atenție în atac bioterorist).

15. 3. 3. 2. Diagnosticul imunobiologic (IDR cu antraxină)

Este importantă punerea diagnosticului de antrax la animale (în special

ierbivore).

15. 3. 4. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de

genul Clostridium

Genul Clostridium include mai multe specii care se găsesc în intestinul

animalelor; se elimină în mediul extern şi sporulează. Sunt bacili Gram

pozitivi, de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau lanţuri, mobili cu cili

peritrichi (C. perfringens este capsulat). (Figurile nr. 11 și 12)

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cu germeni anaerobi este destul

de dificil, este costisitor şi sunt necesare atât dotări speciale cât şi un

personal medical experimentat. Ca o particularizare a acestui

diagnostic, în legătură cu infecţiile clostridiente, prezentăm

succesiunea etapelor.

1. Prima etapă este esenţială. Dacă nu sunt menţinute condiţiile

deanaerobioză, nu avem cum să realizăm diagnosticul de laborator.

2. Produsul patologic poate să aibă un miros putrid. Constatăm

prezenţa unor fragmente de ţesut necrotic, a unor secreţii de culoare

închisă, existenţa de sânge şi puroi în plagă etc.

Examenul microscopic are rol orientativ (cu toate acestea, este un

examen care poate fi realizat în orice laborator; multe dintre

laboratoare nu pot face decât acest examen). C. tetani are 0,5-2mm/2-

18mm (dacă sporulează, sporul este rotund, localizat terminal),

C. botulinum are 0,5-1,5mm/3-20mm (dacă sporulează, sporul este

oval, localizat central sau subterminal) în timp ce C. perfringens are 0,5-

1,5mm/1,5-19mm (dacă sporulează, sporul este oval, localizat

subterminal). Examenul microscopic poate servi la alegerea terapiei

antimicrobiene.

3. Pentru cultivarea p.p. pregătim minim 3 medii de cultură (bulion VF,

geloză-sânge plus neomicină incubat în anaerobioză şi geloză-sânge

incubat în aerobioză). Incubarea în condiţii de anaerobioză durează

24-48 de ore la 35-37ºC. Pentru că am incubat în aerobioză şi

anaerobioză, putem evalua în funcţie de apariţia coloniilor dacă sunt

germeni aerobi sau anaerobi.

4. Identificarea se realizează pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale:baciliGram-pozitivi;am putea observa fenomenul

de sporogeneză;

· de cultură: speciile mobile (majoritatea) formează colonii de tip S,

cu margini ondulate şi tendinţă de invadare a mediului; dacă a avut loc

inocularea şi în profunzimea mediului, coloniile au aspect

pufos;Clostridium perfringens (imobil) formează colonii de dimensiuni

mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea şi

aspect R);

· biochimice: testăm producerea de lecitinază; (Figura nr. 13) pentru

tulpinile lecitinază-pozitive se pot verifica mobilitatea, fermentarea

lactozei, producerea de lipază, urează, hidroliza gelatinei, digestia

cărnii etc.; clostridiile sunt sensibilie la vancomicină şi rezistente la

colistin;

· antigenice:

· demonstrarea prezenţei tetanospasminei prin seroneutralizare la

şoareci,

· testarea prezenţei anti-toxinei tetanice (titrul protectiv³0,01UAI/ml),

· demonstrarea prezenţei toxinei botulinice în alimente, materii

fecale, ser sau în medii de cultură [prelevăm cultură din bulion VF,

centrifugăm şi supernatantul îl împărţim în 2 tuburi; un tub îl încălzim

la 100ºC; răcim; inoculăm intraperitoneal la două loturi de şoareci;

dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de

toxina botulinică (pentru că toxina botulinică este termosensibilă);

prezenţa toxinei botulinice poate fi confirmată prin seroneutralizare

(protejăm un şoarece cu anti-toxină de tip A şi un alt şoarece cu anti-

toxină de tip B, apoi îi injectăm cu p.p.; dacă animalul seroprotejat cu

anti-toxina de tip A supravieţuieşte iar celălalt animal moare cu semne

caracteristice pentru botulism, în mediul de cultură a existat C.

botulinum de tip A).

5. Antibiograma nu se recomandă, în infecţiile cu bacili Gram-pozitivi

sporulaţi (lucrurile diferă în cazul germenilor anaerobi Gram-negativi).

Clostridiile sunt sensibile la penicilină, cefalosporine, vancomicină,

tetracicline, metronidazol etc, însă tratamentul este mai complex.











4. http://www.cdc.gov/tetanus/about/causes-transmission.html


6. http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/botulism/




http://www.cdc.gov/tetanus/about/causes-transmission.html


http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/botulism/



Copil în vârstă de 1 an și jumătate, nevaccinat, este adus de mamă la

spital cu edem generalizat (de aproximativ 6 zile). Mama relatează că

în urmă cu 15 zile a avut un episod febril, dureri în gât și convulsii

tonico clonice generalizate. A fost suspectat ca având difterie și i s-a

administrat ser antidifteric. A primit tratament intravenos cu antibiotice

și steroizi, cu ameliorarea simptomatologiei.

La acel moment s-au efectuat investigații imagistice. Radiografia a

arătat prezența unei cardiomegalii cu infiltrate bilaterale, iar ecografia

abdominală a identificat o ușoară hepatomegalie cu lichid de ascită.

Paraclinic, hepatic, în limite normale.

În sfera urinară, analizele au arătat proteinurie cu hematurie

microscopică și o ușoară creștere a creatininei. Examinarea sistemului

nervos a fost normală.

Diagnostic: miocardită și glomerulonefrită post difterică. A urmat

tratament cu furosemid, enalapril, imunoglobuline intravenos, suport

inotrop și restricție de lichide. Simptomatologia s-a remis sub

tratament.

La 4 săptămâni copilul prezintă slabiciune în membrele superioare și

inferioare, cu acumularea de secreții bucal. Examinarea EMG

evidențiază o neuropatie demielinizantă. Primește suport ventilator.

Diagnostic: polineuropatie difterică.

Treptat, slabiciunea diminuează, glomerulonefrita și miocardita

răspund bine la tratament. Primește BCG, DTP, HVB, iar mama este

sfătuită în privința respectării schemei complete de vaccinare.

Discuții

Prevenirea poate fi mai eficientă decât tratarea. Vaccinarea ar fi

impiedicat apariția acestor complicații și ar fi protejat copilul de o

suferință îndelungată.

15. 6 De reținut

· Imunizarea activă a copiilor (vaccinarea și revaccinarea) permite

obtinerea unor nivele protective de anticorpi

· Semnele și simptomele sunt foarte variate și depind de localizarea

infecției


· Cu cât diagnosticul de certitudine este mai tardiv, cu atât rata

mortalitații crește.

15. 7 Verificați- vă cunoștințele

1. Despre Corynebacterium diphteriae următoarele afirmații sunt

adevărate:

A. Este un bacil Gram- pozitiv nesporulat

B. Se găsește în țesuturile și umorile animalelor bolnave

C. Poarta de intrare poate fi reprezentată de tractul respirator (faringe,

nas)

D. Diagnosticul în difterie este un diagnostic serologic

E. Tulpinile sunt sensibile la antibiotice folosite uzual în tratament (EX .

penicilină)

2. Listerioza:

A. Este o zoo-antroponoză

B. Infecția umană apare accidental și foarte frecvent evoluează

inaparent

C. Este frecvent asociată cu consumul de alimente contaminate

D. Calea respiratorie reprezintă cea mai importantă cale de pătrundere

E. La adulți poate apărea meningoencefalita

3. Manifestările clinice ale infecției determinate de bacilul antraxului

sunt reprezentate de:

A. Pustula malignă ce apare la nivelul unui traumatism cutanat

B. Prezența unei cruste de culoare neagră înconjurată de o zona de

edem

C. “Falsa membrană” de culoare gri-maronie

D. Paralizie respiratorie

E. Insuficiența respiratorie acută ( febră, dispnee, hipoxie, hipotensiune)

4. Botulismul:

A. Este o toxiinfecție alimentară de tip toxic

B. Se caracterizează prin paralizie spastică

C. Se realizează diagnostic bacteriologic pentru identificarea agentului

patogen

D. Poate afecta persoanele care folosesc droguri injectate intravenos

E. Decesul poate surveni prin asfixie

5. Toxina tetanică elaborată în infecția cu Clostridium tetani are

următoarele caracteristici:



A. Blochează eliberarea mediatorilor (glicină și acid gama aminobutiric)

B. Nu depășește bariera hematoencefalică, nu pătrunde în SNC

C. Generează spasme ale musculaturii din zona contaminată

D. Este cea mai puternica otravă cunoscută

E. Titrul protectiv este ≥ 0,01UAl/ml

15. 8 “Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Vaccinurile nu au efect și este numai o coincidența faptul că

incidența anumitor boli a scăzut dupa începerea campanilor de

vaccinare.

2. Ratele scăzute de vaccinare duc la rate mărite ale bolii.

3. Sunt părinți care gândesc: copilul meu nu are nevoie de vaccinare

deoarece bolile pe care le previn vaccinurile au fost eradicate.

4. Este mai bine să faci boala decât să te vaccinezi.

5. Sistemul imun poate fi “copleșit” de vaccinuri.


infecţii produse de Mycobacterium

tuberculosis. (Gabriela-Loredana

Popa, Cristina-Iulia Mitran, Mădălina-

Irina Mitran, MI Popa) 16. 1. Cuvinte cheie

• BAAR

• Ziehl Neelsen

• Löwenstein Jensen

• Ritm lent de multiplicare

• TB activă/ TB latentă

• IDR cu PPD

16. 2. Introducere


Genul MYCOBACTERIUM include peste 140 de specii şi subspecii

diferite. Cei mai cunoscuți reprezentanţi sunt M. tuberculosis şi M.

leprae. În afara acestor specii definite înainte de 1900 există

numeroase specii de mycobacterii netuberculoase (considerate iniţial

drept saprofite). De fapt sunt microorganisme condiţionat patogene; în

condiția în care apar deficienţe ale sistemului imun pot fi implicate în

patologia umană.

16. 2. 2. Calea de transmitere

Principala sursă de infecţie este reprezentată de pacienţii cu

tuberculoză (TB)pulmonară. Nucleii de picătură expectoraţi sunt

particule de 1-3 µm, care poartă bacili acid-alcool rezistenţi (BAAR).

Fiind de dimensiuni foarte mici pot traversa barierele de apărare ale

organismului şi pot ajunge la nivel alveolar. Intraalveolar bacilii sunt

fagocitaţi de macrofage şi celule dendritice, dar unii dintre ei

supravieţuiesc şi se multiplică la acest nivel. Înaintea dezvoltării

imunităţii specifice, mycobacteriile pot disemina la nivelul ganglionilor

limfatici şi pot ajunge în majoritatea organelor. De obicei nu are loc o

multiplicare necontrolată la niveul ficatului, splinei sau măduvei

hematogene. Cei mai mulţi dintre indivizi dezvoltă un răspuns

imun celular eficient care împiedică multiplicarea suplimentară a

bacililor şi leziunile se vindecă. Deşi o treime din populaţie este

infectată cu M. tuberculosis (TB latentă) doar 10% dezvoltă boala. În 5%

din cazuri TB activă apare în primul an de la infecţie şi în 5% la un

moment dat în cursul vieţii. Un rol important îl deţine imunitatea

gazdei. Pacienţii cu TB latentă nu reprezintă o sursă de infecţie.


Cea mai frecventă formă de TB este cea pulmonară, dar majoritatea

organelor pot fi afectate. Manifestările clinice sunt nespecifice, depind

de gazdă, de microorganism şi interacţiunea dintre acestea. Debutul

bolii adeseori este insidios. Se caracterizează prin tuse, dispnee,

subfebră, scădere ponderală şi transpiraţii nocturne. Cel mai frevent

tusea este productivă, uneori poate fi însoţită de hemoptizie. Pacienţii

cu TB latentă sunt asimptomatici.


16. 3. 1. Principii generale

Discutăm aspectele legate de diagnosticul de laborator (microbiologic)

în infecţiile produse de M. tuberculosis, varianta hominis. Tuberculoza

(TB) poate avea diferite localizări. Cea mai frecventă formă este TB

pulmonară. Epidemiologic, pacienţii cu TB pulmonară (elimină prin

spută BAAR) reprezintă principala sursă de

infecţie. Diagnosticul, tratamentul corect şi complet al acestor

pacienţi este esenţial.

Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (EX . radiologic), de alte

elemente de laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea şi

identificarea M. tuberculosis. O primă etapă în diagnostic este

examinarea frotiului din p.p. (cel mai adesea spută) folosind coloraţia

Ziehl Neelsen. Trebuie avut în vedere căM. tuberculosis este un

microorganism, care se dezvoltă lent pe medii complexe. Actual prin

utilizarea metodelor de cultură rapide şi a tehnicilor moleculare

diagnosticul este realizat într-un timp mult mai scurt.

16. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/16-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3ii-produse-de-mycobacterium


Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Datele obţinute în

cadrul diagnosticului imunobiologic şi serologic pot completa

informaţiile şi pot fi utile.

16. 3. 2. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic

Recoltarea şi transportul p.p. se realizează respectând o serie de reguli,

discutate anterior cu mare atenţie şi respectând toate normele

privindprotecţia personalului medical (vezi capitolul 4). Principalul

p.p. este sputa; se pot recolta şi lichid de spălătură bronşică, LCR,

urină, lichide recoltate prin puncţie articulară, probe obţinute prin

biopsie, puroi etc. Sputa trebuie decontaminată (de EX . prin tratare

cu NaOH 4%) şi neutralizată (cu acid) în vederea realizării etapelor 2 şi

3. Este important ca pacientul să fie instruit de personalul medical

pentru ca p.p. să fie recoltat într-un mod corespunzător.

16. 3. 2. 2. Examinarea microscopică

Examinarea microscopică a p.p. include minim 3 frotiuri (colorate A.M.,

Gram şi Ziehl Neelsen). Examinăm şi notăm prezenţa celulelor de la

nivelul tractului respirator inferior (EX . macrofage alveolare),

prezenţa celulelor inflamatorii(PMN) şi prezenţa BAAR. În coloraţia

Ziehl Neelsen mycobacteriile tuberculoase apar ca bacili subţiri, drepţi,

de 0,4/3µm, roşii pe fond albastru (celelalte structuri au culoare

albastră) (Figura nr. 1). O altă modalitate de examinare a frotiului este

utilizând coloraţia fluorescentă (IF). În acest caz se observă bacilii de

culoare galben fluorescent pe un fond galben pal (dacă se foloseşte

permanganat de potasiu) (Figura nr. 2).

Rezultatele examenului microscopic (IF/Z-N) trebuie să fie cuantificate

prin numărul de BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-

30 câmpuri în cazul IF, 100-300 în cazul Z-N). De EX . înregistrarea a 1-

9 BAAR/10 câmpuri (în IF) sau 1-9 BAAR/100 de câmpuri (Z-N) ne

permite să notăm în buletinul de analiză 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9

BAAR/1 câmp/Z-N). Acest mod de notare permite să comparăm

rezultatele între laboratoare diferite sau rezultatele unui bolnav în

cursul tratamentului. Examenul microscopic negativnu

exclude diagnosticul de TB.

16. 3. 2. 3. Cultivarea

Cultivarea se poate face pe diferite medii de cultură (lichide,

semisolide şi solide, pe bază de ou, de EX . mediul Löwenstein-









Jensen sau agar, tip Middlebrook ). La compoziţia mediului L-J se

adaugă verde malachit (inhibă multiplicarea unor microorganisme).

Pentru izolare este necesară o atmosferă de 8-10% CO2. Incubarea se

face la 35-. Este foarte important să examinăm mediile în fiecare zi (în

prima săptămână după inoculare), ulterior săptămânal până la

împlinirea a 6-12 săptămâni (M. tuberculosis are o rată de diviziune de

12-27 ore). Există şi metode de cultură „rapide”. Cu ajutorul unor astfel

de sisteme se poate detecta creşterea M. tuberculosis mult mai rapid

decât pe mediile tradiţionale (în 4-25 zile).

16. 3. 2. 4. Identificarea

Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:

· morfotinctoriale: BAAR (Figura nr. 3);

· de cultură: M. tuberculosis şi M. bovis-BCG formează colonii de tip R,

rugoase, grunjoase, nepigmentate (Figura nr. 4);

· biochimice: testul producerii de niacină, testul reducerii nitraţilor şi

testul catalazei la şi după încălzire la ;

· antigenice (se pot examina în centre de referinţă);

· de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai;

· alte teste:

o teste care au la bază analiza caracterelor fenotipice moleculare,

de EX . studiul cromatografic al acizilor graşi din peretele celular, sau

genotipice (PCR, sonde nucleotidice);

o tehnicile de amplificare a acizilor nucleici au ca principiu amplificarea

unor regiuni specifice; se poate folosi atât cultura cât şi produsul

patologic;

o detectarea antigenelor mycobacteriene în urină. Se poate detecta în

urină lipoarabinomananul (LAM) prin tehnica ELISA. Metoda s-a

dovedit a fi utilă mai ales la pacienţii coinfectaţi HIV-TB;

o teste ce utilizează anumiţi mycobacteriofagi.

16. 3. 2. 5. Testarea sensibilității la antibiotice și chimioterapice

Testarea sensibilității la medicamentele anti-TB este necesară; se

realizează conform recomandărilor Programului Naţional de Prevenire,

Supraveghere și Control a TB. Se pot utiliza metoda proporţiilor,

metoda rapoartelor de rezistenţă etc. S-au dezvoltat tehnici

moleculare prin care sunt identificate mutațiile specifice responsabile

de apariția rezistenței (EX . Genotype MTBDRplus, Xpert MTB/RIF,





etc). Alte tehnici au ca principiu metode colorimetrice, folosirea

mycobacteriofagilor.

16. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic

Diagnosticul imunobiologic presupune evaluarea răspunsului imun

de tip celular. Se utilizează IDR cu PPD. În anumite situaţii se poate

utiliza IGRA (IFN γ Release Assay) (vezi capitolul 11). Nici IDR cu PPD,

nici IGRA nu deosebesc TB latentă de TB activă.

16. 3. 4. Diagnosticul serologic

Diagnosticul serologic are la bază detectarea răspunsul imun de tip

umoral exprimat prin prezenţa de Ac anti-mycobacterieni ce pot fi

evidenţiaţi prin tehnica ELISA. Testele nu sunt standardizate şi nu au

intrat în practica de rutină.De reţinut: în diagnosticul TB nici un

element nu este lipsit de importanţă într-un context clinic, paraclinic şi

epidemiologic.
















O pacientă în vârstă de 28 de ani se prezintă la medic pentru tuse

productivă care a debutat în urmă cu 3 săptămâni. Pacienta era

însărcinată în 26 de săptămâni. La examenul fizic pulmonar nu s-a

detectat nimic patologic. A primit tratament antibiotic. Tusea nu s-a

ameliorat şi după 2 săptămâni pacienta s-a prezentat din nou la medic.

Cu toate că pacienta era însărcinată s-a luat decizia realizării unei

radiografii pulmonare, care a pus în evidenţă infiltrat pulmonar








paracardiac. Medicul a suspicionat diagnosticul de TB şi pacienta a fost

îndreptată către centrul regional de TB. Având în vedere că era gravidă

şi centrul se afla la o distanţă mare a fost internată în spitalul local. La

momentul internării examenul clinic era normal. Imaginea radiologică

decelată anterior persista. S-a recoltat spută, frotiul a fost negativ

pentru BAAR. Pacienta a primit din nou tratament antibiotic.

După o săptămână a fost externată. Evoluţia a fost nefavorabilă, 2

săptămâni mai târziu prezentând acasă hemoptizie. S-a prezentat din

nou la spitalul local, de unde a fost transportată la centrul regional de

TB. Fiind coroborate simptomatologia, istoricul şi aspectul radiografiei

toracice s-a pus diagnosticul de TB şi s-a recoltat spută. S-a iniţiat

tratament cu medicamente anti-TB. Culturile au fost pozitive

pentru Mycobacterium tuberculosis.

Evoluţia a fost favorabilă. A fost externată. Pacienta a născut acasă.

Nou născutul a primit tratament profilactic cu izoniazidă pentru

posibilă TB latentă timp de 6 luni. Având în vedere că a născut acasă

placenta nu a putut fi examinată.

Discuţii

În managementul TB este foarte importantă investigarea contacţilor.

Pacienta era căsătorită şi avea 2 copii. În urma anchetei

epidemiologice s-a descoperit că toţi trei aveau IDR la PPD intens

pozitivă. Radiografia toracică a fiicei în vârstă de 7 ani prezenta

revărsat pleural şi adenopatii mediastinale, dar culturile din spută au

fost negative. În cazul fiicei de 4 ani s-a observat pe radiografie infiltrat

pulmonar. Culturile din spută au fost pozitive. Ambii copii au primit

tratament cu medicamente anti-TB. Soţul nu prezenta nimic patologic

şi s-a administrat doar tratament profilactic cu izoniazidă (HIN). După

un timp tratamentul a fost oprit în urma apariţiei unei afectăr hepatice

ca reacții adversă la administrarea HIN. Pacientul nu a mai reluat

tratamentul. Doi ani mai târziu a prezentat dureri abdominale, ascită şi

febră. A fost diagnosticat cu TB abdominală.

Analizele moleculare au dovedit că în cele trei cazuri (pacienta

însărcinată, fiica de 4 ani şi soţul, în cazul fiicei de 7 ani culturile fiind

negative) a fost implicată aceeaşi tulpină de M. tuberculosis.

Este important de reţinut că un frotiu negativ pentru BAAR din spută

nu elimină diagnosticul de TB. În plus se recomandă recoltarea a trei

probe de spută. Trebuie avut în vedere că şi persoanele cu ”frotiu

negativ” pot transmite infecţia. În cazul copiilor diagnosticul este mai

dificil. Unele din motive sunt că TB este paucibacilară şi produsul

patologic este mai greu de obţinut.

Chimioprofilaxia reprezintă o parte importantă în managmentul TB.

16. 6. De reţinut

· Principala sursă de infecţie este reprezentată de pacienţii cu TB

pulmonară.

· Tabloul clinic este nespecific. Un frotiu din spută pe care se

vizualizează BAAR orientează diagnosticul, dar un frotiu negativ nu-l

exclude. Diagnosticul de certitudine presupune izolarea M. tuberculosis.

· În diagnosticul TB orice element este important, inclusiv elemente de

diagnostic imunobiologic şi serologic.

16. 7. Verificaţi-vă cunoştinţele

1. Alegeţi afirmaţiile adevărate despre infecţia cu M. tuberculosis:

A. TB se transmite cel mai frecvent pe cale aeriană

B. Cea mai frecventă formă de TB este cea pleurală

C. Imunitatea specifică nu reuşeşte de cele mai multe ori să controleze

infecţia

D. Bacilii diseminează pe cale limfatică

E. Pacienţii cu TB latentă sunt asimptomatici

2. Alegeţi afirmaţiile false despre cultivarea M. tuberculosis:

A. Mediul de cultură trebuie suplimentat cu NaCl

B. Se dezvoltă pe medii solide şi lichide

C. Este un microorganism anaerob

D. Tulpinile rezistente la HIN formează colonii de tip S

E. Creşterea este inhibată de verde malachit

3. Alegeţi afirmaţiile adevărate despre diagnosticul în TB:

A. Sputa trebuie decontaminată şi neutralizată

B. Examenul microscopic presupune realizarea unui singur frotiu în

coloraţia Z-N

C. Pentru izolare este necesară o atmosferă de 8-10% CO2

D. Incubarea se realizează la 35-37ºC

E. Culturile se obţin în 24-48 h pe mediul L-J

4. Alegeţi afirmaţiile adevărate_despre M. tuberculosis:

A. Formează colonii de tip R

B. Coloniile sunt pigmentate în galben

C. Testul producerii de niacină este negativ

D. Testul reducerii nitraţilor şi testul catalazei la 22ºC sunt pozitive

E. Rata de diviziune este de 12-27 minute

5. Alegeţi afirmaţiile false:

A. Examenul microscopic negativ pentru BAAR exclude diagnosticul de

TB

B. Antibiograma este rareori necesară

C. Se poate detecta LAM, în urină, în special la pacienţii coinfectaţi

HIV-TB

D. M. tuberculosis este patogen pentru cobai

E. Pentru diagnostic se recomandă recoltarea a trei probe din spută

16. 8. „Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Oricine se infectează cu M. tuberculosis va dezvolta boala.

2. TB se transmite prin sărut.

3. Malnutriţia şi stresul reprezintă factori de risc pentru TB.

4. Dacă o persoană a avut TB, nu se va mai îmbolnăvi de TB.

5. Orice persoană vaccinată cu BCG la naştere nu va face TB.


infecţiile produse de microorganisme

din genul Treponema. (Gabriela-

Loredana Popa, Mara-Mădălina Mihai)

17. 1. Cuvinte cheie

· Spirochetă

· Infecție transmisă pe cale sexuală

· Șancru dur

· Microscopie pe fond întunecat

· Teste treponemice și nontreponemice

· Bordet-Wasserman

· VDRL

· TPHA

17. 2. Introducere


Bacteriile spiralate studiate fac parte din ordinul Spirochaetales,

subîmpărțit în familia Spirochaetaceae (genurile Treponema și Borrelia)

și familiaLeptospiraceae (genul Leptospira). Specia Treponema

pallidum, cu alte patru subspecii care pot produce infecții la om, este

clasificată în cadrul genuluiTreponema.


Infecția cu Treponema pallidum subspecia pallidum determină

afecțiunea denumită sifilis (lues); este transmisă în aproximativ 90% din

cazuri pe cale sexuală. Din acest motiv, atunci când consultăm un

pacient suferind de sifilis, este esențial să efectuăm o anamneză

detaliată cu privire la contactele sexuale neprotejate, în vederea

depistării partenerilor potențial infectați. Nu arareori, la aceste

persoane sunt decelate simultan multiple infecții transmise pe cale

sexual (ITS), un caz aparte fiind acela al asocierii infecției HIV, care prin

imunosupresie poate determina o evoluție nefavorabilă a luesului.

Sifilisul dobândit poate evolua în mai multe stadii clinico-biologice:

primar, secundar, latent și terțiar, cu afectarea mucoaselor, a țesutului

cutanat, iar în formele mai severe cu afectarea organelor interne, a

sistemului osteoarticular, nervos, cardiac.

Atunci când o femeie însărcinată suferă de lues, bacteria poate să

depășească bariera placentară determinând avort spontan sau sifilis

congenital, cu posibilitatea unor malformații fetale invalidante.


După aproximativ 3 săptămâni de la contactul sexual infectant (uneori

fiind posibilă totuși o perioadă de latență prelungită, de până la 10

săptămâni), la locul inoculării se formează şancrul dur, o ulcerație cu

centrul și marginile de consistență fermă, ce exsudează un lichid clar,

foarte bogat în treponeme (Figura nr. 1). Această leziune este însoțită

de adenopatie regională. N.B.: orice ulcerație a mucoaselor bucală,

faringiană, genitală sau anorectală obligă la testarea serologică pentru

sifilis.

După alte 6 săptămâni apar leziunile secundare sub forma unei

erupții maculopapulare roșiatice, localizate la orice nivel (Figura nr. 2),

dar şi condiloame mai frecvent în regiunea anogenitală (Figura nr. 3).

În stadiile primar și secundar leziunile sunt foarte contagioase, fiind

bogate în spirochete.

În sifilisul terțiar (nu foarte des întâlnit în practica actuală datorită

tratamentului curativ larg răspândit cu penicilină - terapie de elecție),

pacientul poate să dezvolte complicații neurologice, cardio-vasculare,

osteo-articulare etc.

N.B.: sifilisul este considerat “marele imitator”, tabloul clinic putând fi

adeseori atipic, similar diferitor afecțiuni dermatologice.


17. 3. 1. Principii generale

Diagnosticul infecției cu T. pallidum pornește de la elemente clinice și

epidemiologice. Confirmarea prin metode de laborator este

obligatorie (cu atât mai mult cu cât manifestările cutanate sau

mucoase pot fi înșelătoare).

Diagnosticul de certitudine se stabilește prin vizualizarea spirochetelor

în secrețiile prelevate, prin microscopia în câmp întunecat sau prin

imunofluorescență directă. Totuși, aceste tehnici sunt laborioase și

necesită un examinator experimentat, motive pentru care nu sunt

utilizate de rutină în practica medicală. De ce nu folosim microscopia

clasică? Datorită dimensiunii reduse a bacteriilor, care nu permite

vizualizarea acestora. Treponema pallidumnu poate fi cultivată pe

medii artificiale, diagnosticul bacteriologic cuprinzând doar 2 etape:

recoltarea și transportul produsului patologic și examinarea

microscopică.

Diagnosticul serologic al probelor sanguine este cel mai frecvent

utilizat pentru a confirma suspiciunea clinică, existând două tipuri de

teste disponibile: nontreponemice (VDRL, RPR etc.) și treponemice

(TPHA, FTA-abs etc.).

17. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic

Acesta poate fi realizat atât în sifilisul primar, cât şi în sifilisul secundar.

17. 3. 2. 1. Recoltarea si transportul produsului patologic

Recoltarea și transportul probelor prelevate trebuie să respecte

regulile cunoscute (vezi capitolul 3), dar există şi aspecte particulare

infecției sifilitice. Cel mai adesea produsul patologic este reprezentat

de exsudatul clar de la nivelul leziunilor primare, dar poate fi prelevat

și de la nivelul leziunilor secundare ori din ganglionii limfatici regionali.

După îndepărtarea crustelor superficiale, care nu conțin

microorganisme viabile, se recoltează cu grijă, fără să provocăm

sângerare locală. Preparatele nu trebuie să conţină hematii, leucocite,

fragmente de țesut sau bule de aer. Ulterior, preparatele microscopice

între lamă şi lamelă sunt examinate rapid, în maxim 20 de minute de la

recoltare.

17. 3. 2. 2. Examinarea microscopică

17. 3. 2. 2. 1. Examenul microscopic pe fond întunecat

Pentru fiecare leziune se pregătesc cel puțin două preparate

lamă/lamelă. Preparatele nu trebuie să se usuce. În acest scop, pentru

menținerea într-o atmosferă umedă, le vom pune într-o cutie Petri în

care punem și puțină vată îmbibată cu apă distilată. Preparatele nu pot

fi examinate în vederea detectării treponemelor cu ajutorul

microscopului optic, cu imersie. Vom utiliza microscopul pe fond

întunecat, vom examina insistent, cel puțin 10 minute în cazul unui

rezultat aparent negativ (Figura nr. 4).

Experiența examinatorului își spune cuvântul, fiindu-i dificil unui medic

neantrenat să diferențieze pe baza caracterelor microscopice

treponemele patogene de acelea nonpatogene. Pledează în favoarea

diagnosticului de infecție cu Treponema pallidum subspecia

pallidum vizualizarea unor microorganisme foarte subţiri şi lungi,

spiralate, luminoase pe fondul negru al câmpului, mobile, dar cu o

deplasare lentă, ce seamănă cu o mişcare de înşurubare (Film nr. 1).

Rezultatul pozitiv poate pune diagnosticul de sifilis primar (Figura nr.

5) și poate decide tratamentul.

17. 3. 2. 2. 2. Imunofluorescența directă

Am discutat deja despre dificultatea diferențierii treponemelor

patogene de acelea saprofite, iar imunofluorescența directă vine în

ajutorul diagnosticianului permițând marcarea cu anticorpi fluorescenți

monoclonali (o singură subspecieTreponema țintită) sau policlonali a

microrganismelor de cercetat (reactie antigen-anticorp) (Figura nr. 6).

Reactivul este obținut de la pacienți cu sifilis sau de la animale de

laborator infectate, serul acestora fiind tratat cu o tulpină Reiter,

nepatogenă, în scopul creșterii specificității, urmată de marcarea

anticorpilor cu izotiocianat de fluoresceină.

17. 3. 2. 3. Alte elemente utile în diagnosticul bacteriologic

În laboratoarele de referință sunt utilizate și alte metode diagnostice,

spre exemplu testul infectivității la iepure (RIT). Produsul prelevat

este inoculat animalului de experiență intratesticular sau cutanat, etapă

urmată de observarea modificărilor clinico-biologice. Aceasta este cea

mai sensibilă metodă existentă pentru detectarea Treponema pallidum.

La pacientele însărcinate este posibilă prelevarea lichidului amniotic, în

vederea diagnosticării prin tehnici de biologie moleculară,

precum Polymerase Chain Reaction (infecția sifilitică depășind bariera

materno-fetală).

17. 3. 3. Diagnosticul serologic

Testarea serologică este considerată metoda standard de detectare a

infecției sifilitice, în toate stadiile evolutive. Cel mai adesea serul

pacientului este produsul testat, dar în situații aparte și alte probe pot

fi utilizate; spre exemplu într-o suspiciune de neurosifilis lichidul

cefalo-rahidian (LCR) poate fi supus examinării. Există două tipuri de

teste disponibile, clasificate în funcție de specificitatea antigenului

utilizat: nespecifice sau nontreponemice și specifice sau treponemice.

Diagnosticul pozitiv se stabilește prin îmbinarea acestora, putând

utiliza, spre exemplu VDRL sau RPR din prima categorie, urmată de

confirmarea prin TPHA sau FTA-abs din a doua categorie. Pentru

monitorizarea evoluției sub tratament sunt repetate periodic testele

nontreponemice (Figura nr. 7; algoritm de diagnostic).

17. 3. 3. 1. Reacţii serologice care utilizează antigene

nontreponemice

Infecția cu Treponema pallidum conduce la apariția în serul pacientului,

după aproximativ 2 săptămâni de la debut, a unor anticorpi protectori,

denumiți istoric “reagine”. Aceștia reacționează cu antigenul

(cardiolipina), un difosfatidil-glicerol prezent în structura celulelor

cardiace umane și animale, dar și în aceea a membranei mitocondriale

bacteriene. Această reacție antigen-anticorp stă la baza testelor

nontreponemice sau nespecifice: reacția de fixare a complementului

Bordet-Wasserman (RBW, cu cea mai mare vechime, din 1906) și

reacțiile de floculare Veneral Disease Research Laboratories (VDRL, cel

mai frecvent utilizat) și Rapid Plasma Reagin (RPR).

17. 3. 3. 1. 1. Reacţia de fixare a complementului Bordet

Wasserman

Această metodă este discutată în detaliu în ”Diagnosticul de laborator

în microbiologie”.

17. 3. 3. 1. 2. Reacţia de precipitare VDRL

Principiu. VDRL este o reacție antigen-anticorp nespecifică,

observându-se flocularea la punerea în contact a serului pacientului cu

antigenul cardiolipină.

Procedura. În scopul efectuării microreacţiei VDRL sunt necesare

următoarele materiale: plăcile cu godeuri, antigenul de tip VDRL

(preparat COMERCIAL ), serul de cercetat (clarificat prin centrifugare și

inactivat timp de 30 minute la 56ºC) și probele martor (seruri cu

reactivitate cunoscută, martor pentru antigen).

În continuare, vom introduce în fiecare godeu 0,05 ml ser (în godeul

pentru martor antigenic punem soluţie salină fiziologică) și câte o

picătură de suspensie antigenică (1/60 ml). După acoperirea plăcii, o

vom plasa pe un agitator timp de 4 minute, la 180 turații pe minut

(Film nr. 2).

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/17-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3iile-produse-de-microorganisme


Interpretarea o vom face imediat, așezând placa pe un fond

întunecat și observând, cu ajutorul unei lupe, fiecare godeu, începând

cu martorii și continuând cu serurile de testat.

Interpretare. Este posibil să obținem un rezultat negativ atunci

când lichidul nu prezintă flocoane, un rezultat slab pozitiv dacă

observăm flocoane fine într-un lichid uşor tulbure sau un rezultat

intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de dimensiuni mari

într-un lichid clar (Figura nr. 8).

Testul VDRL se pozitivează la aproximativ săptămâni de la apariția

șancrului și la 4-8 săptămâni de la contactul sexual infectant.

Așa cum am învățat, diagnosticul serologic este realizat în etape,

fiind necesară repetarea testării. Din acest motiv, un rezultat negativ nu

elimină diagnosticul de sifilis, fiind recomandată, în special cazul unui

pacient suspect, repetarea testării după 1 săptămână, 1 lună şi la 3 luni.

Prin cumularea informațiilor epidemiologice, clinice și paraclinice,

completate de un rezultat VDRL pozitiv se stabilește suspiciunea de

sifilis, a cărui confirmare se face obligatoriu prin efectuarea unui test

treponemic/specific. Nu trebuie să omitem posibilitatea apariției unui

rezultat fals pozitiv în următoarele situații: a.pacienți cu diferite

patologii infecțioase asociate (pneumonii de etiologie virală, rujeolă,

hepatite virale acute, mononucleoză infecţioasă sau alte infecţii virale,

malarie), b.pacienți cu afecțiuni imunitare asociate (boli ale țesutului de

colagen), c.administrarea unor produse biologice de uz uman ce pot

declanșa reacții imunitare (EX . vaccinare recentă). Fiziologic, la

persoanele în vârstă sau pe parcursul sarcinii pot sa apară rezultate fals

pozitive.

17. 3. 3. 2. Reacţii serologice care utilizează antigene treponemice

Antigenele treponemice sunt extrase din tulpinile Reiter sau Nichols

deTreponema pallidum, cu o mare specificitate. Teste treponemice

sunt următoarele: reacția de hemaglutinare TPHA, testul imobilizării

treponemelor și testul de imunofluorescență indirectă FTA-Abs.

17. 3. 3. 2. 1. Reacția de hemaglutinare TPHA (T.

pallidumHemagglutination Test)

În această reactive antigenele specifice, extrase din tulpina Nichols,

sunt adsorbite pe membrana unor hematii fixate. În cazul în care în

serul de cercetat sunt prezenţi anticorpi anti-Treponema pallidum,



hematiile sensibilizate aglutinează în reţele caracteristice formate din

complexe imune.

17. 3. 3. 2. 2. Testul imobilizării treponemelor (TPI) nu mai este

utilizat în prezent, dar pentru o lungă perioadă de timp a fost

considerat tehnica standard de diagnostic. Serul de cercetat era diluat

și amestecat cu treponeme vii, mobile (obținute din testicul de iepure)

și complement. La microscopul pe fond întunecat era observată

mobilitatea bacteriilor. Dacă pacientul suferea de sifilis, anticorpii din

serul acestuia reacționau cu treponemele din probă, imobilizându-le.

17. 3. 3. 2. 3. Testul de imunofluorescenţă indirectă FTA

Abs(Fluorescent Treponemal Antibody)

Principiu.Serul pacientului este pus în contact cu antigene

treponemice, formându-se complexe antigen-anticorp. La adăugarea

în proba de cercetat a anticorpilor anti-imunoglobuline umane marcați

fluorescent, complexele pot fi vizualizate prin microscopia cu

fluorescență.

Procedura. Serul care va fi utilizat în reacție este obținut prin

prelucrarea serului pacientului (într-o diluție de 1/5 este pus în contact

cu un extract antigenic nespecific- comun treponemelor patogene și

comensale- din tulpină Reiter, în scopul îndepărtarii anticorpilor care

nu sunt specifici pentru T. pallidum). Ulterior, serul obținut este pus în

contact cu antigenele specifice ale tulpinii Nichols de T. pallidum. În

acest moment, în cazul în care pacienții suferă de sifilis, se formează

complexe antigen-anticorp. La adăugarea în proba de cercetat a Ac

anti-imunoglobuline umane marcați fluorescent, complexele pot fi

vizualizate prin microscopia cu fluorescență. În cazul în care serul de

cercetat este pozitiv, treponemele apar galben-verzui (Figura nr. 9).

17. 3. 3. 2. 4. Tehnica ELISA (EX . detectarea anticorpilor de tip Ig

M anti-T. pallidum) este utilă pentru diagnosticul sifilisului congenital.

Interpretarea rezultatelor se face în context clinic, epidemiologic şi de

laborator. Dacă, spre exemplu, atât VDRL, cât şi TPHA dau un rezultat

negativ, infecţia este de obicei exclusă. Însă, în cazul în care pacientul

se află la debutul bolii, iar anticorpii nu sunt nedectabili (suspiciunea

clinică sau epidemiologică persistă), repetăm testele după 3 săptămâni.

Nu intrăm în amănunte privind strategia diagnostică şi terapeutică, dar

este foarte important de știut că algoritmul este elaborat de către



comisiile de specialitate ale ministerului sănătății și trebuie respectate

ca atare.









2. http://www2a.cdc.gov/stdtraining/self-study/syphilis/default.htm


4. http://www.cdc.gov/std/syphilis/stdfact-syphilis.htm







O pacientă în vârstă de 50 de ani, fără antecedente personale

patologice semnificative se prezintă în cabinetul medicului său

stomatolog acuzând apariția în urmă cu aproximativ 3 săptămâni a

unei PAPULE roșiatice lucioase, dure, nedureroase, la nivelul

mucoasei linguale. Aceasta a crescut progresiv în dimensiuni, având la

momentul prezentării la medic un diametru aproximativ de 8 mm.

Examinând cu atenție leziunea, medicul observă în centrul său o

eroziune de 1-2 mm. Întrebată dacă a suferit un traumatism local,

pacienta mărturisește că a băut multe ceaiuri fierbinți pentru că avea o

senzație de usturime în gât, în special la înghițit (odinofagie) și a crezut

că a răcit.

Medicul a presupus că leziunea a fost cel mai probabil determinată de

ingestia lichidelor la o temperatură prea înaltă și a recomandat



pacientei soluții bucale antiseptice și medicație sistemică

antiinflamatorie.

După circa 2 săptămâni pacienta revine în cabinetul medicului.

Leziunea linguală scăzuse în dimensiune, nu mai acuza odinofagie, în

schimb la nivelul feței și palmo-plantar se puteau observa multiple

macule și PAPULE roșiatice, acoperite de scuame fine, care nu o

deranjau deocamdată pe pacientă, fiind nepruriginoase și nedureroase.

Medicul stomatolog consultase în cei 30 de ani de practică și alți

pacienți cu modificări asemănătoare. Cu tact, acesta îi recomandă

examinarea de către un medic infecționist și efectuarea analizelor

uzuale, printre care include și testarea VDRL.

Pacienta își face analizele și se prezintă îngrijorată la un medic

specialist în boli infecțioase pentru a afla care este cauza erupției sale

cutanate. Medicul ascultă întreaga istorisire și observă valori în limite

normale ale probelor hematologice și biochimice uzuale, dar un

rezultat VDRL intens pozitiv. Îi explică pacientei posibilitatea unei

infecții cuTreponema pallidum și îi recomandă efectuarea testului de

confirmare TPHA, alături de alte analize precum: serologia HIV,

testarea serologică pentru infecțiile hepatitice B și C.

Întrebată de medic, pacienta relatează faptul că în urmă cu aproximativ

6 săptămâni a avut un contact sexual neprotejat cu un partener

ocazional.

Testarea TPHA are un rezultat pozitiv; nu sunt depistate alte ITS.

Partenerul respectiv a fost invitat la rândul său pentru consult și i s-a

recomandat același tratament: Penicilină G, 2 mil. UI injectate

intramuscular într-o singură administrare.

Sub tratament cu penicilină pacienta a prezentat remisiunea tuturor

leziunilor.

Discuții

Deși infecția cu Treponema pallidum apare cel mai frecvent la vârste

cuprinse între 20-40 de ani, o ulcerație mucoasă ar trebui să ridice

întotdeauna această suspiciune, indiferent de vârsta pacientului.

Screening-ul partenerilor este întotdeauna recomandat.

Toți pacienții diagnosticați cu sifilis trebuie să fie testați suplimentar

pentru alte afeciuni transmisibile pe cale sexuală. Co-infecția HIV nu

modifică doar evoluția stării generale a pacientului și a infecției



sifilitice, dar și tratamentul acesteia, schema terapeutică în acest caz

fiind diferită.

Nediagnosticat, sifilisul poate persista în stadiul latent zeci de ani,

prezentând atât un important risc epidemiologic, cât și un impact

semnificativ asupra pacientului prin morbiditatea cardio-vasculară și

neurologică.

17. 6. De reținut

La un pacient diagnosticat cu sifilis este obligatorie testarea

prezenței altor infecții transmise pe cale sexuală (HIV, virusuri

hepatitice B, C, alte virusuri, fungi, paraziți, alte bacterii);

Urmărirea răspunsului sub tratament se face prin repetarea VDRL

cantitativ, test ale cărui valori ar trebui să se reducă progresiv în

timp, până la dispariție.


1. Bifați testele diagnostice nontreponemice:

A. Testul infectivității la iepure

B. Reacția de fixare a complementului Bordet Wasserman

C. VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)

D. TPHA (Treponema pallidum Hemaglutination Assay)

E. PCR (Polymerase Chain Reaction)

2. Alegeți ordinea corectă cronologică a următoarelor manifestări

clinice:

A. Șancru dur genital, rozeolă sifilitică, anevrism aortic

B. Erupție generalizată maculo-papulara roșiatică, șancru dur

genital, neurosifilis

C. Ulcerație genitală, ulcerație conjunctivală, necroza septică de

cap femural

D. Pneumonie luetică, neurosifilis, șancru dur labial

E. Ulcerație faringiană, erupție generalizată maculo-papulară

roșiatică, neurosifilis

3. Un pacient în vârstă de 23 de ani, fumător, se prezintă la medicul

stomatolog cu o ulcerație la nivel lingual, cu dimensiunea aproximativă

de 8 mm, dură la palpare, netedă, nedureroasă. Relatează apariția

leziunii în urmă cu 1 săptămâna, urmată de creșterea lentă în

dimensiuni. Întrebat de medic mărturisește faptul că în urmă cu 1 lună

a avut un contact sexual neprotejat cu o parteneră nouă. Rezultatele

analizelor de laborator evidențiază: probe hematologice în limite

normale, VDRL intens pozitiv, TPHA pozitiv. Diagnosticul medicului

este:

A. Traumatism lingual

B. Sifilis primar

C. Sifilis secundar

D. Neoplazie linguală

E. Sifilis latent

4. Pacientă în vârstă de 25 de ani, se prezintă la camera de gardă,

îngrijorată fiind de faptul că în urmă cu aproximativ 3 zile a avut un

contact sexual neprotejat cu un partener nou, la care a observat după

încheierea actului o ulcerație la nivelul glandului. Medicul a

recomandat efectuarea screening-ului infecțiilor cu transmitere

sexuală, rechemând pacienta la control peste 1 săptămână cu

rezultatul analizelor. Acestea au fost: serologie HIV pozitivă, VDRL

negativ, TPHA negativ, markeri virali hepatitici negativi. Alegeți

răspunsurile corecte:

A. Pacienta s-a infectat cu HIV în urma contactului sexual

neprotejat

B. Este necesară retestarea VDRL, TPHA peste 2 săptămâni; în doar 3

zile de la contactul infectant nu apare un răspuns umoral susținut,

evidențiat prin metodele standard de laborator

C. Este posibil că pacienta să fi transmis infecția HIV partenerului

D. Recomandăm atât pacientei, cât și partenerului, consultarea

unui medic specialist infecționist

E. Nu este cazul să luăm măsuri suplimentare. Este doar o infecție

HIV

5. Alegeți afirmația adevărată:

A. Examinarea microscopică în câmp întunecat este o metodă

“antică”. Nu ne mai intereseaza acest subiect

B. Rezultatul VDRL este intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane

de dimensiuni mari, iar lichidul este clar

C. Rezultatul TPHA este intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane

de dimensiuni mari, iar lichidul este clar

D. Pot apărea rezultate VDRL fals + la persoane cu boli ale ţesutului de

colagen

E. Pot apărea rezultate VDRL fals pozitive la persoane cu amigdalită.


1. Dacă ai suferit de sifilis la un moment dat în viața ta, nu te vei mai

îmbolnăvi niciodată.

2. Aș fi observat dacă aș suferi de sifilis. Sunt perfect sănătos!

3. Nu toate infecțiile transmisibile sexual sunt curabile.

4. Sifilisul și gonoreea țin de trecut. Medicina modernă le-a eliminat.

5. Anual merg la medic pentru a efectua testul Papanicolau. Medicul

ginecolog nu mi-a spus niciodată că aș suferi de o infecție transmisă

sexual. Nu am vreun motiv să mă îngrijorez.


infecţii produse de microorganisme

din genurile Chlamydia și

Mycoplasma. (Gabriela-Loredana

Popa, Alexandru-Andrei Muntean) 18. 1. Cuvinte cheie

Corpusculi elementari și corpusculi reticulați

Trahom

Conjunctivită

Pneumonie interstițială

Limfogranulomatoză

Traheobronșită

18. 2. Introducere


Bacilii Gram negativi studiați în acest capitol sunt incluși în

genurile Chlamydiași Mycoplasma. Speciile cu cea mai mare

importanță a genului Chlamydia suntChlamydia trachomatic, C.

psittaci și C. pneumoniae; acestea cauzează infecții variate – fiind

implicate în infecții cu transmitere sexuală și pneumonii atipice, dar și

alte forme de patologie. Unii autori clasifică C. psittaci şi C.

pneumoniaeîn genul Chlamydophila.

În genul Mycoplasma întâlnim speciile M. pneumoniae, M.

genitalium și M. hominis. Aceste microorganisme cauzează, la rândul

lor, infecții variate – fiind implicate în infecții cu transmitere sexuală

(uretrite non-gonococice), pneumonii atipice, dar și pielonefrită, febră

post-partum sau infecții sistemice (în special la pacienții

imunodeprimați).

18. 2. 2. Fiziologie și cale de transmitere

18. 2. 2. 1. Genul Chlamydia

Microorganismele din genul Chlamydophila prezintă un ciclu de

dezvoltare particular. Aceste microorganisme sunt „parazite”, folosind

ATP din celulelei eucariote infectate. Astfel, replicarea lor are lor doar

intracelular. În mediul extracelular, aceste bacterii există sub forme

numite corpusculi elementari (CE), asemănătoare cu sporii bacterieni,

inactive metabolic, dar cu infecțiozitate păstrată. CE sunt endocitați de

celulele eucariote și se reorganizează sub formele metabolic-active,

non-infecțioase, capabile de replicare, numite corpusculi reticulați

(CR).

C. pneumoniae și C. psittaci se transmit aerogen, fiind o cauză de

pneumonie bacteriană interstițilă (numită și „atipică”). C.

trachomatis este responsabilă de boli oftalmologice și boli cu

transmitere sexuală. Acestea sunt transmise princontact direct, prin

fluide biologice sau prin vectori.

Pe baza proteinelor din structura sa, microorganismul se poate împărți

în multiple serogrupuri.

18. 2. 2. 2. Genul Mycoplasma

Microorganismele din genul Mycoplasma sunt cele mai mici

organisme carepot să supraviețuiască de sine stătătoare în natură, fără

nevoia de a parazita o celulă gazdă. Spre deosebire de celelalte

microorganisme, acestea nu au perete celular și prezintă steroli în

membrană. Sunt microorganisme pleomorfe ce prezintă forme

cocoidale sau bacilare (dimensiuni de la 0.1 – 0.2 µm la 1 – 2 µm).

Timpul de generație a acestor microorganisme este de 6 ore, așa încât

culturile se dezvoltă greu, necesitând tehnici speciale de examinare și o

compoziție specială a mediilor de cultură.

Calea de transmitere a M. pneumoniae este aerogenă, în cursul

episoadelor de tuse. M. genitalium și M. hominis, sunt transmise prin

contact direct.


18. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecțiile produse de Chlamydia spp.

Trahomul este o infecție difuză, cronică, a conjunctivei. Apare o

importantă fibroză a conjunctivei, însoțită de eversiunea pleoapei, care

contribuie la leziunile oculare. Rezultatul este diminuarea acuității

vizuale, uneori până la orbire (Figura nr. 1).

Conjunctivita neonatală apare atunci când nou-născutul este

contaminat în cursul nașterii naturale. După o perioadă de incubare de

5-12 zile, apare inflamarea pleoapelor și secreția purulentă (Figura nr.

2). Tratamentul trebuie să fie sistemic, întrucât poate să apară și auto-

inocularea cu evoluție spre pneumonie interstițială.

Lymphogranuloma Venereum este o boală cu transmitere sexuală (ITS)

ce prezintă la debut o leziune primară la locul de inoculare – aceasta

este o papulă sau o leziune ulceroasă, nedureroasă și care se vindecă

repede. Inflamația progresează, în a doua fază, implicând lanțul

ganglionar inghinal, cu apariția adenopatiilor dureroase, fluctuante, ce

pot fistuliza.

Infecțiile urogenitale sunt de multe ori greu de diagnosticat datorită

faptului că infecțiile sunt asimptomatice la aproximativ 80% din

persoanele de sex feminin. Acestea reprezintă un rezervor natural

pentru infecție. Aceste infecții pot duce la sterilitate dacă nu sunt

detectate și diagnosticate corespunzător. Infecțiile la bărbați sunt cel

mai adesea simptomatice, dar 25% din infecții rămân asimptomatice.

18. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecțiile produse de Mycoplasma

pneumoniae

Traheobronșita este forma clinică cea mai frecvent întâlnită.

Aceasta se caracterizează prin tuse neproductivă, febră, cefalee și

subfebră. De multe ori, simptomatologia asociază și faringită.

Pneumonia atipică reprezintă o altă formă de prezentare. Spre

deosebire de pneumoniile cu S. pneumoniae, simptomatologia este

mai subtilă. Examenul radiologic contrastează cu simptomatologia,

arătând infiltrate bronhopneumonice diseminate (Figura nr. 3).

18. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de

microorganisme din genurile Chlamydia și Mycoplasma

Ne vom referi în continuare la diagnosticul infecţiilor produse de C.

trachomatis și M. pneumoniae.

18. 3. 1. Diagnosticul bacteriologic în trahom (Chlamydia

trachomatis)

18. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se

realizeze respectând regulile cunoscute (vezi capitolul 4), în special

recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea

antibioterapiei şi respectând măsurile de precauţie. Produsul patologic

poate fi reprezentat de raclat conjunctival sau de la nivelul altor

mucoase (EX . cervivală), urină, spermă, secreţie purulentă uretrală,



secreţii nazale, secreţii faringiene, spută, aspirat ganglionar, puroi din

fistulă etc. În cazul în care secreţia uretrală nu este evidentă, putem

utiliza un tampon subţire pe care îl introducem cu blândeţe 3-5 cm în

uretră, rotindu-l uşor. Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele trebuie să

fie din Dacron. Produsul trebuie să fie prelucrat imediat. Dacă acest

lucru nu este posibil, transportul se va face în medii speciale de

transport sau la cel puţin -20º C (preferabil -70ºC).

18. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include

realizarea unor frotiuri pe care le „colorăm” prin imunoflorescență.

Aceasta pune în evidenţă incluziile intracitoplasmatice sau corpusculii

elementari (Figura nr. 4). Frotiul este uscat, fixat chimic (cu acetonă, la -

20ºC) şi „colorat” imunofluorescent (metoda directă sau indirectă).

Urmărim prezenţa celulelor inflamatorii (PMN) şi a celulelor

caracteristice ţesutului de la nivelul căruia am realizat recoltarea.

Incluziile apar ca o masă bine definită, cu fluorescenţă de EX . galben-

verzui, în interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puţin 3

minute în cazul în care pare să fie negativ. Celelalte frotiuri vor putea fi

colorate prin metoda Gimenez (corpusculii elementari apar aglomeraţi

şi de culoare roşie pe fondul verde al frotiului) sau cu lugol (incluziile

de C. trachomatis conţin glicogen și apar ca o masă de culoare brună).

Unii autori menţionează că examenul citologic, cu punerea în evidenţă

a unor limfocite „transparente” şi a unui număr crescut de histiocite

este sugestiv pentru infecţia cu C. trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA

se pot pune în evidenţă antigene în p.p. Există şi tehnici ale biologiei

moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR

etc).

18. 3. 1. 3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul

de găină embrionat (inoculare la nivelul sacului vitelin) dar de regulă

se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia trachomatis se pot

utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229. Înainte de inocularea pe

culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000´g, timp de 60 minute). Se

pot utiliza culturile de celule în sistemul clasic sau micrometoda de

cultivare pe culturi de celule în godeuri. Incubarea durează 48-72 de

ore. Tehnica incubării este destul de complexă (incubări repetate, în

condiţii diferite) şi trebuie să respecte strict protocolul de lucru.



18. 3. 1. 4. Identificarea se va realiza diferenţiat. În cazul în care s-a

utilizat micrometoda, godeurile se examinează microscopic după

colorare cu lugol sau prin imunofluorescenţă. În cazul cultivării prin

metoda clasică, realizăm frotiuri pe care le fixăm chimic (de EX . cu

metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C.

trachomatis conţin glicogen) iar altul cu Ac monoclonali marcaţi

fluorescent. Se pot aplica şi tehnici de biologie moleculară.

18. 3. 1. 5. Nu există tehnici standardizate de stabilire a sensibilităţii la

antibiotice şi chimioterapice a tulpinilor de Chlamydia spp.

În tratament se pot folosi eritromicina (sau alte macrolide),

tetraciclinele sau fluorochinolonele.

18. 3. 2. Diagnosticul serologic în trahom (Chlamydia trachomatis)

Diagnosticul serologic implică utilizarea reacţiei de fixare a

complementului, reacţiei de microimunofluorescenţă şi a tehnicilor de

tip ELISA. Se consideră că un titru 1/64 este sugestiv în timp ce o

creştere de 4 ori a titrului în dinamică permite diagnosticul pozitiv.

Identificarea prezenţei Ac de tip IgM la nou născuţi permite

diagnosticul de pneumonie cu C. trachomatis. Tehnicile imunologice

sunt frecvent utilizate în scop epidemiologic (studii de seroprevalenţă).

18. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic în infecțiile cu C. trachomatis

Utilizarea intradermoreacţiei (IDR Frei) a intrat în istoria medicinii.

18. 3. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse

de Mycoplasma pneumoniae

18. 3. 4. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se

realizeze respectând regulile cunoscute (vezi capitolul nr. 6), în special

recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea

antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat

faringian, secreţii nazale, spută, secreţii genitale, urină etc. În

continuare vom discuta numai diagnosticul de laborator în infecţiile

respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4ºC) cât mai rapid

posibil, fără a depăşi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativă

este reprezentată de utilizare mediilor speciale de transport care pot

asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de ore. Utilizarea azotului

lichid (-70ºC) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar

nu este încă accesibilă (cu foarte puţine excepţii) sistemului sanitar

românesc.



18. 3. 4. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu permite

obţinerea unor rezultate utile, M. pneumoniae ca şi celelalte specii ale

ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii autori recomandă

realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar

putea realiza amplificarea genetică (PCR) cu o sensibilitate foarte bună.

Prin tehnici de tip ELISA pot fi puse în evidenţă Ag de M.

pneumoniae în spută.

18. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se

poate realiza utilizând tehnici şi medii speciale. Unul dintre mediile de

cultură cunoscut este mediul îmbogăţit, pe bază de infuzie de cord

bovin numit generic PPLO. Acest mediu include atât substanţe

nutritive, surse de energie, indicator de pH cât şi substanţe care îi

asigură selectivitatea. Cei mai mulţi autori recomandă însămânţarea

p.p. atât pe un mediu de cultură solid cât şi pe un mediu de cultură

lichid (EX . bulion PPLO). Vom realiza o incubare la 37ºC în atmosferă

de 5% CO2 şi urmărim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza cât mai

rapid (dar nu mai devreme de 48-72 ore de incubare) modificările de

culoare care trădează virajul pH-ului. Mediul devine acid prin

fermentarea glucozei în cel mult 3-4 săptămâni. Este recomandat să

realizăm repicări pe medii solide şi lichide cât mai curând după ce am

observat virajul pH-ului (Figura nr. 5).

18. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va

realiza pe baza mai multor caractere:

· morfotinctoriale nu sunt utile în identificarea M. pneumoniae

· de cultură:

· Se pot examina la stereomicroscop (cu mărire de minim 25x). În scopul

identificării trebuie să „citim” placa cu mediu agarizat de cel puţin 2 ori

pe săptămână. Pot apărea colonii de dimensiuni foarte mici (cu

diametru de la 10 până la 200 µm), cu aspect muriform. (Figura nr.

6)Sunt descrise şi colonii cu aspect de „ou-ochi”, cu centrul dens, opac,

înconjurat de o zonă periferică mai clară pe care unii autori le

consideră drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de colonii ar mai

putea fi produse de bacterii în formă L şi necesită realizarea

diagnosticului diferenţial).

· Se poate realiza şi cultivarea pe oul de găină embrionat (inoculare

intravitelină) sau în culturi de celule.



· biochimice: Fermentează glucoza, nu metabolizează arginina, nu

hidrolizează ureea dar reduce (în aerobioză) tetrazoliul. Acesta este un

compus incolor, iar în cazul în care este redus la formazan, culoarea

devine roşie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care

presupunem prezenţa coloniilor de M. pneumoniae.

· Alte caractere care ar putea fi utilizate în identificare sunt:

· Fenomenul adsorbţiei hematiilor de cobai

· Colorarea imunofluorescentă a coloniilor cu seruri specifice marcate cu

fluorocromi

· Inhibarea dezvoltării coloniilor în jurul unor discuri impregnate cu

anticorpi specifici

· Tehnici de biologie moleculară (sonde nucleotidice, PCR) etc.

18. 3. 4. 5. Nu există o standardizare a tehnicilor pentru determinarea

sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. Tratamentul pneumoniei

cu M. pneumoniae se poate face cu eritromicină sau alte macrolide sau

cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3 săptămâni.

18. 3. 5. Diagnosticul serologic al infecțiilor cu M. pneumoniae

În cursul infecţiei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru

neutralizarea M. pneumoniae în timp ce alţii acţionează ca auto-Ac

(determinabili prin reacția Coombs). Dintre aceştia, aglutininele „la

rece” (crioglobuline) sunt Ac de tip IgM oligoclonali care reacţionează

cu un Ag de la suprafaţa hematiilor pacienţilor infectaţi cu M.

pneumoniae. Cu toate că există şi alte maladii în care apar aglutinine la

rece, iar pe de altă parte aceştia nu se pot identifica la toţi pacienţii

infectaţi cu M. pneumoniae, demonstrarea aglutininelor la rece

continuă să fie utilă în diagnosticul serologic. Utilizăm serul pacientului

pe care îl amestecăm cu eritrocite provenite de la pacienţi de grup O,

incubăm la 0ºC câteva minute şi urmărim apariţia aglutinării. Dacă

apare aglutinarea repetăm testul realizând diluţii de ser pentru a

determina titrul. Un titru 1/32 este sugestiv pentru infecţia cu M.

pneumoniae.

Se poate utiliza şi RFC, dar pentru că Ac fixatori de complement apar

tardiv (3-4 săptămâni) este utilă în studii epidemiologice. Tehnica de

tip ELISA poate determina Ac de tip IgM (anti adezina P1) şi este utilă

în infecţia acută.








1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3148448







În 2007 s-a descris un caz de M. Pneumoniae, fatal, la o tânără de 18

ani fără patologie subiacentă. Înainte de a fi internată în spital, ea s-a

adresat medicului de familie care a efectuat o radiografie ce a pus

diagnosticul de pneumonie. S-a început tratamentul cu un

medicament din clasa fluorochinolonelor, fără remisiunea

simptomatologiei. La examenul clinic obiectiv efectuat la internare s-a

constat febră de 40°C și tuse productivă. Tratamentul antibiotic a fost

schimbat cu o asociere dintre o beta-lactamină (cefalosporină) și

macrolid; chiar și așa, evoluția a fost nefavorabilă, cu progresie a

infiltratelor pulmonare, apariția revărsatelor pleurale bilaterale și

insuficiență hepatică. Deși s-a instituit un regim antibiotic agresiv și

suport respirator, a dezvoltat pneumonie hemoragică, disfuncție

multiplă de organ și a decedat în ziua 35. Diagnosticul de M.

pneumoniae s-a efectuat prin serologie. Deși diagnosticul bazat pe

cultivarea celulelor și PCR ar fi fost mai convingător, cazul

demonstrează susceptibilitatea adulților față de infecțiile cu M.

pneumoniae și complicațiile grave care pot urma.


1. Microorganismele din genul Mycoplasma:

A. Au structură asemănătoare cu cea a microorganismelor Gram

pozitive

B. Pot cauza infecții pulmonare și uro-genitale

C. Nu se dezvoltă pe medii acelulare


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3754237





D.Cauzează pneumonie francă lobară

E. Mediul de cultură se poate examina la stereomicroscop

2. Privind patologia cauzată de microorganismele din

genul Chlamydia:

A. Trahomul este o infecție a aparatului uro-genital

B. Conjunctivita nou-născutului apare la aproximativ o lună

după naștere

C. Infecțiile uro-genitale cu Chlamydia spp. sunt mai des

asimptomatice la pacienții de sex masculin

D. Pentru infecțiile uro-genitale există un vaccin eficient

E. Diagnosticul se face doar prin examen bacteriologic direct

3. Diagnosticul de laborator al Chlamydia trachomatis cuprinde:

A. Diagnosticul bacteriologic, direct

B. Recoltarea produsului patologic (secreții uro-genitale)

C. Identificarea microorganismului pe baza caracterelor

morfotinctoriale

D. Antifungigrama

E. Testul de hemaglutinare

4. Diagnosticul infecțiilor cu Mycoplasma pneumoniae se poate face

prin:

A. Microscopie optică directă a p.p.

B. Microscopie cu fluorescență a p.p.

C. Izolarea pe mediile de cultură lichide, apoi solide

D. Identificarea de crioglobuline

E. Inocularea în sacul vitelin al oului embrionat

5. Următoarele afirmații despre genul Mycoplasma sunt false:

A. Sunt microorganisme obligatoriu ”parazite” intracellular

B. Au perete celular caracteristic microorgasnimelor Gram

negative

C. Conțin steroli în membrana citoplasmatică

D. Au dezvoltare înceată, având timpul de generație de

aproximativ 12 ore

E. Se pot dezvolta pe medii de cultură selective, ce conțin

indicatori pentru dezvoltarea microbiană

18. 7. “Myth busters” (ALEGEȚI între ”adevărat și fals”)

1. Recoltarea p.p. în infecțiile genitale cu microorganisme din

genul Chlamydiase face cu un tampon de vată.

2. Sputa se poate recolta atât în infecții cu Chlamydia spp.

și Mycoplasma spp.

3. Tratamentul pentru conjunctivita nou-născutului cu Chlamydia

trachomatistrebuie să fie sistemic.

4. Crioglobulinele sunt Auto-Ac de tip IgM îndreptați împotriva

eritrocitelor ce apar în urma infecțiilor cu Chlamydia spp.

5. „Colorarea” imunofluorescentă duce la identificarea corpusculilor

elementari, corpusculilor reticulați (caracteristice pentru Chlamydia

spp.) și a Mycoplasma pneumoniae.


infecţii cu Candida albicans. (Gabriela-

Loredana Popa, Violeta-Corina

Cristea) 19. 1. Cuvinte cheie

· Levuri

· Pseudomicelii

· Candidoză

· Mediu Sabouraud

· Antifungigramă

19. 2. Introducere

Fungii sunt microorganisme eucariote, larg răspândite în natură. Au

fost descrise peste 250.000 de specii dar dintre acestea doar circa 200

pot fi implicate în patologia umană. În micologia medicală fungii sunt

clasificați în: levuri, fungi dimorfi și fungi filamentoși. Levurile sunt

reprezentate de elemente unicelulare rotund ovalare care se înmulțesc

prin înmugurire, fungii filamentoși cresc sub formă de hife iar fungii

dimorfi pot prezenta ambele aspecte, putând trece din forma de

levură în cea filamentoasă în funcție de condițiile de mediu (levuri in

vivo, hife in vitro).

Genul Candida cuprinde peste 150 de specii, cele mai frecvent întâlnite

în patologia umană fiind reprezentate în ordinea frecvenței

de: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei. C.

albicans face parte din flora saprofită a cavității bucale, tubului digestiv

și tractului genital feminin. Sunt microorganisme condiționat patogene

și determină infecții doar la pacienții ce prezintă factori de risc atât

intrinseci (EX . vârste extreme, endocrinopatii, hemopatii maligne,

SIDA) cât și extrinseci (EX . leziuni la nivel

tegumentar,tratament abuziv cu antibiotice şi chimioterapice, terapie

imunosupresivă, diferite manevre medico-chirurgicale). În funcție de

localizare, infecțiile fungice pot fi superficiale atunci când afectează

pielea, fanerele și mucoasele (bucale şi peribucale, genitale) și infecții

http://www.microbiologie.ro/microbiologie-lp-md-fmam-2014/19-diagnosticul-de-laborator-%C3%AEn-infec%C5%A3ii-cu-candida-albicans-gabriela




invazive sau sistemice caracterizate prin invazia țesuturilor profunde, a

organelor sau diseminare sangvină (fungemie sau candidemie). Infecția

sistemică frecvent are ca punct de plecare colonizarea cuCandida,

aceasta reprezentând un factor de risc important în dezvoltarea

sepsisului.

19. 3. Diagnosticul de laborator poate fi micologic (direct)

sau imunologic(indirect).

19. 3. 1. Diagnosticul micologic

Fiecare laborator clinic trebuie să aibă personal instruit și posibilități

materiale pentru realizarea examenului micologic, sau măcar o parte

din acesta (recoltare, examinare microscopică, evidenţierea levurilor -

structurilor miceliene - structurilor pseudo-miceliene, testul

filamentării, zimograma, auxanograma și antifungigrama).

19. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul p.p. se fac respectând aceleaşi

reguli, discutate în cazul infecţiilor bacteriene.

Spre ex. într-o candidoză superficială tegumentară, antiseptizăm, după

care recoltăm p.p. prin ștergerea zonei afectate cu un tampon steril

care este imersat ulterior într-un recipient cu mediu de transport. În

același mod mai recoltăm un tampon din care vom efectua examinarea

microscopică. În cazul infecțiilor de la nivelul unghiilor (onicomicoze),

raclăm şi colectăm fragmentele de unghie într-un recipient sterilcu

capac etanș. Timpul de transport nu trebuie să depăşească 48 de ore

(iar p.p. nu trebuie să se usuce). Pentru prevenirea multiplicării

bacteriene în cazul acestor produse patologice se adaugă antibiotice în

mediul folosit pentru însămânțare (frecvent se folosește mediul

Sabouraud cu cloramfenicol și gentamicină).

În cazul suspiciunii de fungemie se recoltează hemoculturi de preferat

în recipiente special destinate acestui scop (BACTEC Mycosis-IC/F

Culture Vials) și transportate către laborator imediat sau la 37°C

(Figura nr. 1). Este suficientă o singură hemocultură pozitivă pentru a

pune diagnosticul de fungemie iar tratamentul antifungic se începe

imediat.

19. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a p.p. are câteva particularităţi

· Dacă examinăm un p.p. sub formă de scuame sau fragmente

unghiale, facem întâi un preparat între lamă şi lamelă, folosind o

soluţie 10-30% KOH-glicerol care are rol de dilacerare a stratului

cornos. Dacă utilizăm şi calcofluor alb (fluorocrom), levurile se

vădovoide, cu dimensiuni relativ mari,

iarpseudomiceliile şi miceliile se văd galben-verzui sau alb-albăstrui.

(Figura nr. 2) Aceste aspecte ne fac să suspicionăm prezenţa Candida

spp. (cultivarea este însă strict necesară).

· Dacă examinăm un p. p. recoltat de la nivelul mucoaselor, pregătim

şi preparate între lamă-lamelă şi frotiuri (colorate A.M. şi Gram). În

cazul preparatelor proaspete folosim şi calcofluor alb. Dacă vedem

levuri şi pseudomicelii, suspicionăm prezenţa Candida spp. (Figura nr.

3)

19. 3. 1. 3. Cultivarea p. p. o facem pe mediul Sabouraud (putem

adăuga, pentru selectivitate, cloramfenicol, gentamicină,

cicloheximidă). Un p. p. necontaminat îl cultivăm pe Sabouraud

neselectiv. Un p. p. contaminat îl cultivăm şi pe Sabouraud neselectiv

dar şi selectiv. Potrivim termostatul la 28-30ºC, pentru incubare şi

aşteptăm 24-96 ore.

19. 3. 1. 4. Identificarea o facem prin examinarea caracterelor

· morfotinctoriale: Examinăm preparate proaspete colorate cu

lactofenol şi frotiuri fixate şi colorate, remarcând prezenţa levurilor

(rotunde, ovoide sau puţin mai alungite, Gram pozitive); dovedim şi

puritatea coloniei. (Figura nr. 4) În particular, dacă repicăm din colonie

pe un mediu cu agar şi făină de porumb (slab nutritiv) şi apoi facem un

preparat între lamă şi lamelă, vom vedea apariţia de chlamidospori (la

extremitatea pseudomiceliilor). (Figura nr. 5)

· de cultură: Produc în 24-96 ore colonii de tip S (rotunde, bombate,

netede, albe, care seamănă cu coloniile bacteriene dar sunt mai mari).

(Figura nr. 6)

· biochimice: Facem spre EX . auxanograma (levurile au un

echipament enzimatic şi pot să utilizeze un anumit carbohidrat ca

unică sursă de carbon; C. albicans asimilează glucoză, maltoză,

trehaloză, galactoză etc.). (Figura nr. 7)Testarea fermentării unor

carbohidraţi poartă numele de zimogramă. (Figura nr. 8)

· antigenice: Putem folosi diferite tehnici (aglutinare pe lamă, latex-

aglutinare, ELISA).

· alte teste care ar putea fi utile în identificare



· Testul filamentării - verificăm capacitatea blastoconidiilor de a

produce, în anumite condiţii, tubi germinativi [repicăm tulpina pe

medii care conţin ser de iepure; din 60 în 60 de minute pregătim

preparate între lamă şi lamelă şi examinăm microscopic pentru a

detecta prezenţa tubilor germinativi; C. albicans produce în maxim 4

ore pseudofilamente/tubi germinativi relativ (scurte, fără stricturi, cu

un calibru similar)]; (Figura nr. 9)

· Detectarea unor metaboliţi prin tehnici cromatografice;

· Identificarea se mai poate obține prin utilizarea unor kit-uri

comerciale precum Candifast, Auxacolor, API 20C, API 32C etc.

19. 3. 1. 5. Antifungigrama a fost pusă la punct (standardizată) relativ

recent.

Există sisteme comerciale care efectuează antifungigrama pe o diluție

a unor antifungice (Candifast) sau pe două diluții (Fungitest).

Standardele EUCAST și CLSI recomandă metoda diluţiilor în bulion sau

E-test. (Figura nr. 10)

19. 3. 2. Diagnosticul imunologic

Diagnosticul imunologic poate fi serologic şi imunobiologic.

19. 3. 2. 1. Diagnosticul serologic

Există studii care arată că identificarea şi titrarea Ac anti-C.

albicans poate fi utilă în diagnosticul candidozelor profunde. Iniţial au

fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea prezenţei Ac anti-

manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea

prezenţei Ac faţă de Ag localizate în citoplasma C. albicans. Detectarea

de antigen C. albicans în ser este înalt sugestivă pentru o candidoză

sistemică sau generalizată.

19. 3. 2. 2. Diagnosticul imunobiologic

Intradermoreacţia cu candidină este pozitivă la majoritatea

persoanelor adulte, fiind astfel utilă în aprecierea existenţei RIC. Se mai

poate utiliza testul transformării blastice a limfocitelor în prezenţa unor

Ag de C. albicans.








1. http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6831-14-14.pdf



4. http://www.e-jmii.com/article/S1684-1182(13)00206-5/fulltext


6. http://www.revistanefrologia.com/modules.php?name=articulos&i

darticulo=11790&idlangart=ES

7. https://www.landesbioscience.com/journals/virulence/2013VIRULE

NCE0008R.pdf




O pacientă în vârstă de 79 de ani, cu antecedente de urolitiază, se

prezintă la camera de gardă a unui spital pentru durere acută în flancul

drept și febră. Imagistica relevă prezența unei mase hiperecogene,

neomogenă, situată în pelvisul renal drept, cu hidronefroză

concomitentă. Urografia cu substanță de contrast a relevat un defect

extins de umplere cu pelvis renal mărit ca urmare a prezenței unei

mase amorfe cu bule de gaz pe alocuri. Constatările radiologice au fost

extrem de sugestive pentru urolitiază. S-a intervenit chirurgical și s-a

prelevat într-o cantitate considerabilă un amestec de cheaguri de

sânge și mici calculi. Aspectul intraoperator însă, a fost sugestiv pentru

o infecție fungică. Cultura pe Sabouraud din p.p. extirpat a confirmat

prezența de C. albicans. S-a administrat tratament antifungic cu

fluconazol 400 mg pe zi și datorită evoluției favorabile pacienta a fost

externată a 6-a zi postoperator. Tratamentul s-a continuat 30 de zile la

domiciliu iar la uroculturile de control efectuate la 3 luni și 1 an de la

intervenție nu s-a observat recădere.

Discuții

Mai mult de jumătate din cazurile de infecții fungice ale tractului urinar

sunt cauzate de specii de Candida însă foarte rar acestea determină

uropatii obstructive. Diabetul zaharat, imunosupresia, bolile cronice și

bolile maligne sunt cunoscute ca situații predispozante pentru infecții

http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6831-14-14.pdf



http://www.e-jmii.com/article/S1684-1182(13)00206-5/fulltext


http://www.revistanefrologia.com/modules.php?name=articulos&idarticulo=11790&idlangart=ES

http://www.revistanefrologia.com/modules.php?name=articulos&idarticulo=11790&idlangart=ES

https://www.landesbioscience.com/journals/virulence/2013VIRULENCE0008R.pdf

https://www.landesbioscience.com/journals/virulence/2013VIRULENCE0008R.pdf



fungice. Dar, în cazul de față, pacienta nu prezenta nici una în

antecedentele personale. Acest aspect a condus diagnosticul către o

pistă greșită, motiv pentru care nu s-au efectuat culturi bacteriene și

fungice anteoperator.

19. 6. De reținut

În cazul unei obstrucții de tract urinar superior cu caracteristici

preoperatorii imagistice de zone calcifiate intercalate cu bule de gaz ar

trebui să fie luată în considerare etiologia fungică, chiar și la pacienții

imunocompetenți. Astfel, recoltarea de urină pentru culturi dirijează și

confirmă diagnosticul, respectiv strategia terapeutică ce trebuie

efectuată: terapie antifungică urmată eventual de acces minim invaziv

la nivelul sistemului pielocaliceal pentru evacuare.


1. Levurile au caracteristic:

A. Creșterea la 37°C

B. Creșterea la 25°C

C. Determină onicomicoze

D. Formează colonii cu aspect pufos

E. Colonizează mucoasele

2. Care din următoarele caracterizeaza fungii dimorfi?

A. Sunt levuri in vitro

B. Sunt fungi filamentoși in vivo

C. Pot prezenta ambele aspecte

D. Au ambele aspecte in vitro

E. Sunt doar levuri in vivo

3. C. albicans face parte din flora saprofită de la nivelul

A. Mucoasei orală

B. Vezicii urinare

C. Tubului digestiv

D. Corneei

E. Tractului genital feminin

4. Care din următorii reprezintă factori de risc pentru o infecție

fungică?

A. Hemopatiile maligne

B. Adolescența

C. SIDA

D. Oboseala

E. Implanturile

5. Soluţia 10-30% KOH-glicerol este folosită pentru

A. Dilacerare strat cornos

B. Prinderea p.p. de lamă

C. Colorarea fungilor

D. Mordant

E. Nu are un rol deosebit.


1. Din genul Candida doar specia C. albicans este patogenă pentru om.

2. Diagnosticul de fungemie poate fi pus prin pozitivarea unei singure

hemoculturi care relevă fungi.

3. Transportul flacoanelor de hemocultură pentru fungi trebuie făcut la

temperatura de 37°C.

4. Antigenul de C. albicans în ser nu are valoare diagnostică.

5. Intradermoreacţia cu candidină este negativă la majoritatea

persoanelor adulte.

Documents

Microbiologie Lp