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Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo de Fin de Grado
MicroMundo: Diversidad
microbiana en suelos y
detección de antibióticos
por “crowdsourcing”
mediante una estrategia de
aprendizaje-servicio
Alumno: Esperanza Pérez Garrido
Jaén Mayo, 2020
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Trabajo de Fin de Grado
Grado en Ciencias Ambientales
MicroMundo: Diversidad
microbiana en suelos y
detección de antibióticos
por “crowdsourcing”
mediante una estrategia de
aprendizaje-servicio
Alumno: Esperanza Pérez Garrido
Jaén Mayo, 2020
UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
3
4
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 6
1.1. LOS ANTIBIÓTICOS Y SU RESISTENCIA ........................................................... 7
1.2. CLASIFICACIÓN BACTERIANA .............................................................................. 9
1.3. BACTERIAS MÁS RESISTENTES ........................................................................ 13
1.4. MICROBIOLOGÍA DEL SUELO ............................................................................. 14
1.4.1. Actinomicetos .................................................................................................... 16
1.4.2. Cianobacterias .................................................................................................. 17
1.5. BACTERIAS PRODUCTORAS DE ANTIBIÓTICOS. ......................................... 17
1.6. ACTUALIDAD DE ANTIBIÓTICOS Y SU RESISTENCIA.................................. 20
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 22
3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................ 23
3.1. MATERIALES ........................................................................................................... 23
3.1.1. “Aislamiento de microorganismos del suelo” ............................................... 23
3.1.2. “Detección de cepas productoras de antibióticos” ...................................... 23
3.1.3. “Aislamiento de cepas productoras de antibióticos” en el laboratorio ...... 23
3.1.4. “Tinción de Gram en cepas productoras de antibióticos” ........................... 24
3.2. MÉTODOS ................................................................................................................. 24
3.2.1. “Formación de SWITAs (Small World Initiative Teaching Assistants)” .... 24
3.2.2. “Descripción de los talleres en los centros educativos”.............................. 24
3.2.3. “Aislamiento de microorganismos del suelo” ............................................... 25
3.2.4. “Detección de cepas productoras de antibióticos” ...................................... 26
3.2.5. “Aislamiento las cepas productoras de antibióticos en el laboratorio” ..... 29
3.2.6. “Tinción de Gram en cepas productoras de antibióticos” ........................... 31
4. RESULTADOS .................................................................................................................. 34
5. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 42
6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 45
7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 45
5
RESUMEN
En este documento se muestran los resultados obtenidos en el programa SWI
(Small World Initiative) impartido por la Universidad de Jaén en alumnos de
Grado (SWITAs) junto a estudiantes de secundaria. Este programa pretende
fomentar la curiosidad por la cultura científica y la investigación a los
preuniversitarios. Para ello se llevarán a cabo actividades enfocadas al
descubrimiento de nuevos antibióticos por “crowdsourcing”.
ABSTRACT
This document shows the results obtained in the SWI (Small World Initiative)
taught by the University of Jaén to Undergraduate students (SWITAs) together
with high school students. This program aims to foster pre-university students’
curiosity about scientific culture and research by carriying out activities that are
focused on the discovery of new antibiotics by “crowdsourcing”.
6
1. INTRODUCCIÓN
En esta memoria vamos a analizar los resultados obtenidos en un estudio de
muestras de suelo obtenidas con la estrategia de “crowdsourcing” en la
provincia de Jaén con alumnos de centros de secundaria.
Se trata de un proyecto a nivel mundial llamado SWI (Small World Initiative).
Este es un proyecto para el descubrimiento de nuevos antibióticos, dada la
problemática que establece la OMS (Organización Mundial de la Salud): “la
resistencia microbiana a los antibióticos es potencialmente el desafío médico
más importante al que se enfrenta la Humanidad en el siglo XXI. Si no se
toman iniciativas al respecto, entre hoy y el año 2050 el coste de la resistencia
a antibióticos podría superar los 100.000 millones de dólares y suponer la
muerte prematura de 300 millones de personas” (Unidad de Cultura Cientíca de
la Universidad de Jaén, 2018).
La idea surgió en la Universidad de Yale (EEUU) con la Dra. Jo Handelsman en
2012, expandiéndose en la actualidad a más de 10 países. En el curso 2016-
2017 se impartió por primera vez a España y actualmente participan 20
universidades del país en este proyecto, entre ellas la Universidad de Jaén. La
rama española de este proyecto es MicroMundo.
Este proyecto consiste en formar a alumnos universitarios mediante el nuevo
modelo de aprendizaje servicio (ApS), el cual está teniendo muy buena eficacia
para impartir talleres de búsqueda de microorganismos con actividad
antimicrobiana a partir de suelos locales en centros de educación secundaria.
De este modo, se participa en el proyecto de ámbito nacional anteriormente
descrito (Lucas, y otros, 2018).
Los objetivos de este proyecto son los siguientes:
- Que los estudiantes de ESO y bachillerato se interesen tanto en las
Ciencias Experimentales como en la Investigación en Biomedicina.
- Divulgar cultura científica y que la sociedad sea consciente de la
problemática existente con el abuso de los antibióticos y la resistencia
bacteriana de los microorganismos.
7
- Colaborar en la búsqueda de microorganismos del suelo productores de
sustancias antimicrobianas que pueden dar lugar al descubrimiento de
nuevos antibióticos.
1.1. LOS ANTIBIÓTICOS Y SU RESISTENCIA
Antibióticos, definición: sustancias producidas por varias especies de
microorganismos (bacterias, hongos, actinomices), que suprimen el crecimiento
de otros microorganismos y eventualmente pueden destruirlos (Camacho
Assef, 2005).
Tipos de resistencia bacteriana:
a) Natural: locus natural permanente en el ADN bacteriano. Ejemplo: el 100%
de resistencia de Pseudomonas a las penicilinas naturales.
b) Primaria: locus del ADN que aparece al azar (Mutación).
c) Secundaria: mutaciones espontáneas y selección natural.
d) Transferible: intercambio de plásmidos de resistencia (transformación,
transducción, conjugación) (Camacho Assef, 2005).
Mecanismos de resistencia bacteriana:
Las bacterias actualmente han desarrollado numerosos mecanismos de
resistencia. Esto es debido al uso indiscriminado de antibióticos o haber hecho
uso de ellos cuando la patología no los requería necesarios. A continuación, se
van a exponer los diferentes mecanismos que estas presentan para sobrevivir
a estos antibióticos.
El primero de ellos es mediante un sistema de expulsión activa del
antimicrobiano, una especie de bomba expulsora que utilizan las bacterias para
la excreción de productos residuales o tóxicos, con la que puede eliminar
además muchos de estos agentes antibacterianos (Figura 1.A).El segundo, se
realiza mediante la disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana, con
la pérdida o modificación de los canales de entrada (porinas) (Figura 1.B).La
8
producción de enzimas inactivantes de los antibióticos constituye el tercer
mecanismo (Figura 1.C). Por último, algunos antibióticos ejercen su acción
contra las bacterias uniéndose a una proteína esencial para la supervivencia de
estas. La resistencia bacteriana se produce cuando el microorganismo modifica
la proteína diana, y cambia su función o produce enzimas distintas (Figura 1.D)
(Soto, 2003).
Figura 1.- Mecanismos de resistencia bacteriana (Soto, 2003)
9
1.2. CLASIFICACIÓN BACTERIANA
La ciencia de la Microbiología estudia los microorganismos y cómo funcionan,
especialmente las bacterias, que es un grupo muy grande de células así como
un amplio grupo de células pequeñas y que tienen una importancia básica y
práctica enorme. La microbiología también abarca la ecología microbiana, de
manera que estudia en qué lugares del planeta viven, como se asocian y
cooperan los microorganismos entre sí, y qué influencia tienen en el mundo en
general, en los suelos y las aguas, así como en los animales y plantas.
A lo largo de los años, los microbiólogos han hecho grandes progresos en el
descubrimiento de formas de vida de los microorganismos, y la aplicación de
este conocimiento ha mejorado muchísimo la salud y bienestar humanos.
La microbiología y la medicina se han unido para vencer a las enfermedades
infecciosas, ya que a principios del siglo pasado era una de las principales
causas de muerte (Madigan, Martinko, Bender, Buckley y Stahl, 2009).
A continuación en la Figura 2, vamos a ver una agrupación de bacterias
patógenas para el ser humano:
10
Figura 2.- Agrupación de las bacterias patógenas para el ser humano de acuerdo a su forma y tinción de Gram (Elaboración propia a partir de Macedo & Vola, 2008 y Torres M. , 2008)
Las bacterias pueden adoptar formas diferentes (Figura 3) y según esto se
dividen en dos grandes grupos:
- Cocos: la morfología de este grupo es redonda y según su agrupación
reciben diferentes nombres.
Diplococos, cuando se agrupan de dos en dos.
Estreptococos, cuando se agrupan en cadenas largas.
Estafilococos, cuando se agrupan en racimos.
Tétradas, cuando se agrupan de cuatro en cuatro.
Sarcinas, cuando se agrupan un par de tétradas (8 cocos).
- Bacilos: la morfología de estos es alargada; dentro de este grupo
también están los cocobacilos que son bacilos cortos y redondeados, los
vibrios que tienen forma de coma y los espirilos que son en forma de
muelle. Según se agrupan estas:
Empalizada, cuando se agrupan como si fuera un paquete de
cigarrillos, debido a giros de 180º (Iáñez, 2004).
11
Diplobacilos, cuando se agrupan de dos en dos.
Estreptobacilos, cuando se agrupan formando grandes cadenas.
Figura 3.- Morfología y agrupación bacteriana (Quesada, 2010)
La morfología y agrupación bacteriana se ponen de manifiesto por la
observación microscópica de frotis teñidos. El método de coloración más
utilizado en bacteriología es la coloración de Gram.
Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos teniendo en cuenta el
comportamiento de las mismas frente al procedimiento de coloración de Gram
(Quesada, 2010):
- Gram-positivas: se tiñe de color violeta.
- Gram-negativas: se tiñen de color rojo o fucsia.
12
Figura 4.- Tinción de Gram (Albarracín & Moreno, 2012)
Las características de las Gram-positivas y Gram–negativas quedan resumidas
en un cuadro (Tabla 1):
Tabla 1.- Características de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Elaboración propia a partir de Mora, 2012)
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
No tienen membrana externa Tienen membrana externa
Pared celular gruesa Pared celular delgada
No tiene liposacáridos Tiene liposacáridos
No tiene endotoxina Tiene endotoxinas
Presenta a menudo ácido No tiene ácido
Presenta esporulación en algunas
cepas
No presenta esporulación
A veces presenta cápsula A veces presenta cápsula
Sensible a lisozima Resistente a lisozima
Más susceptible a la Penicilina Más resistente a la Penicilina
Algunas cepas producen exotoxinas Algunas cepas producen exotoxinas
13
1.3. BACTERIAS MÁS RESISTENTES
Debido a la evolución y al uso indebido y abusivo de antibióticos, las bacterias
se han vuelto cada vez más resistentes a los antibióticos. En la Figura 5
aparecen los microorganismos que presentan más resistencia.
Figura 5.- Principales bacterias que presentan mayor resistencia a los antibióticos (Calderón Rojas, 2016)
14
1.4. MICROBIOLOGÍA DEL SUELO
La litosfera comprende tipos de hábitat como las masas de tierra constituidas
por rocas y suelo.
Las rocas en su superficie proporcionan un hábitat adecuado para un número
limitado de microorganismos, bacterias y hongos entre ellos.
El suelo se forma a partir de las rocas mediante un proceso complejo en el que
intervienen fuerzas físicas, químicas y biológicas. El suelo contiene unas
comunidades microbianas de gran diversidad, estas contribuyen de gran
manera a la fertilidad del suelo, es decir, a su capacidad para sostener el
crecimiento vegetal (Atlas, 2002).
Los microorganismos en el suelo son numerosos, pero solo representan menos
de la mitad de la biomasa microbiana total.
Las bacterias del suelo pueden clasificarse en:
- Autóctonas: están presentes en el suelo y su número se mantiene
aproximadamente constante, con excepción de las bacterias nativas
llamadas zimógenas que crecen ante el agregado de un sustrato
específico.
- Alóctonas: estas no participan en las funciones bioquímicas de la
comunidad. Llegan al suelo por las precipitaciones, tejidos enfermos,
aguas negras.
También se pueden agrupar por grupos funcionales, que es la que mayor
relevancia tiene desde el punto agronómico.
- Bacterias amonificadoras: descomponen las sustancias orgánicas
nitrogenadas y las transforman en amonio o en sales amoniacales
(Benintende, 2010). Actualmente más del 60% de las emisiones globales
provienen de los suelos agrícolas debido principalmente por el uso de
fertilizantes que contienen mucho nitrógeno. Por lo tanto las bacterias
amonificadoras tienen un papel muy importante ya que reducen los
nitratos a amonio para que esté a disposición de las plantas que lo
15
necesitan, contribuyendo así en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno en
el suelo (Torres, y otros, 2016).
- Bacterias nitrificadoras: oxidan el amoníaco hasta nitrato (Benintende,
2010). Este proceso de oxidar el amonio a nitrito y luego a nitratos es
aeróbico, este proceso se lleva a cabo por organismos procariotas
quimiolitótrofos como son las bacterias amonio oxidantes (AOB) y
bacterias nitrito oxidantes (NOB). Este proceso es clave en el
ecosistema del suelo ya que regula directa o indirectamente el balance
del nitrógeno inorgánico en los suelos (Zornoza, 2017)
- Bacterias fijadoras de nitrógeno: toman el nitrógeno atmosférico y lo
transforman en compuestos que pueden ser aprovechados por los
vegetales (Benintende, 2010). Estas bacterias están en simbiosis con las
leguminosas formando nódulos donde se lleva a cabo la fijación del
nitrógeno, el principal género con el que están en simbiosis es
Rhizobium. (Masson-Boivin & Sachs, 2018)
Figura 6 .- Simbiosis de Rhizobium (Masson-Boivin & Sachs, 2018)
- Bacterias celulolíticas: degradan la celulosa. Este es el grupo más
abundante ya que este compuesto es el que está en mayor cantidad
debido a los residuos vegetales (Benintende, 2010). El metabolismo del
carbono en las bacterias celulolíticas anaerobias es muy importante ya
16
que se encargan de degradar la celulosa, que es una fuente de carbono
insoluble y, si no se descompone en sustancias asimilables por las
plantas no podrán aprovecharla éstas, además de acidificar el medio
donde crecen las bacterias del suelo, perjudicando así la microbiota del
mismo (Desvaux, 2006).
- Bacterias pectinolíticas: degradan la pectina y sus derivados. El género
más abundante es Arthrobacter (Benintende, 2010). Estas bacterias
hidrolizan los compuestos de carbohidratos estructurales y compuestos
orgánicos mediante actividad enzimática; Por ejemplo la celulosa, xilano,
pectina, almidón, lípidos y ésteres (Briones-Roblero, Rodriguez-Díaz,
Santiago-Cruz, Zúñiga, & Rivera-Orduña, 2017).
1.4.1. Actinomicetos
Son bacterias que se parecen a los hongos porque tienen un micelio aéreo
ramificado, las colonias de éstas pueden ser pulverulentas o consistentes y
se encuentran en diversos hábitats como pueden ser los fangos y el
estiércol entre otros. Se encuentran a distintas profundidades y son casi tan
abundantes como el resto de bacterias. Estos microorganismos son
aeróbicos y menos sensibles a la sequedad, son heterótrofos y suelen
utilizar como fuente de carbono la quitina. En general, son saprófitos y los
suelos ricos en materia orgánica los beneficia por el carbono aprovechable.
No tienen gran capacidad competitiva, por lo que en las etapas iniciales de
descomposición vegetal son muy escasas, su densidad y actividad
incrementan en la etapa final de la degradación cuando después de actuar
los hongos y otras bacterias los nutrientes son limitantes y la competencia
disminuye.
El género más abundante es Streptomyces. Producen metabolitos
antimicrobianos entre ellos 50 antibióticos de uso común.
Streptomyces es un género de bacterias Gram-positivas que crece en
varios ambientes, y su forma se asemeja a los hongos filamentosos. La
diferenciación morfológica de Streptomyces implica la formación de una
17
capa de hifas que pueden diferenciarse en una cadena de esporas. La
propiedad más interesante es la capacidad de producir metabolitos
secundarios bioactivos, como antifúngicos, antivirales, antitumorales,
antihipertensivos, inmunosupresores y especialmente antibióticos. La
producción de la mayoría de los antibióticos es específica de la especie, y
estos metabolitos secundarios son importantes para las especies de
Streptomyces para competir con otros microorganismos que entran en
contacto, incluso dentro del mismo género (de Lima Procópio, Reis da Silva,
Martins, de Azevedo, & de Araújo, 2012).
1.4.2. Cianobacterias
Estas bacterias fotosintetizan y fijan nitrógeno, estas características les
permiten ser colonizadoras en materiales originales y tienen una gran
importancia en los arrozales, generalmente aparecen los géneros
Anabaena, Nostoc, Oscillatoria y Calothrix, ya que estos microorganismos
aportan oxígeno y nitrógeno al arrozal, también aportan estimulantes de
crecimiento, algunas de las especies anteriores utilizan el nitrógeno
molecular, siendo estas fijadoras libres de nitrógeno. El aporte de oxígeno
que proviene de la fotosíntesis es muy importante ya que las raíces
requieren de éste para que el vegetal pueda desarrollarse (Benintende,
2010).
1.5. BACTERIAS PRODUCTORAS DE ANTIBIÓTICOS.
Existen microorganismos que producen antibióticos, como son las bacterias de
género Streptomyces de donde se obtienen la tetraciclina, estreptomicina y
eritromicina.
Los microorganismos han proporcionado abundantes fuentes de productos
naturales que se han desarrollado como productos comerciales para la
medicina humana, la salud animal y la protección de cultivos vegetales. En los
primeros años del descubrimiento de productos naturales a partir de
microorganismos, se encontraron nuevos antibióticos con relativa facilidad
gracias a la fermentación de bajo rendimiento y los métodos de detección de
células completas. Más tarde, se aplicaron enfoques de química molecular
18
genética y medicinal para modificar y mejorar las actividades de los andamios
químicos importantes, y los métodos de detección más sofisticados se
dirigieron a los estados de enfermedad objetivo. La industria farmacéutica pasó
a la detección de alto rendimiento de bibliotecas químicas sintñeticas contra
muchos objetivos terapéuticos potenciales, incluidos los nuevos objetivos
identificados a partir del proyecto de secuenciación del genoma humano, en
gran medida a la exclusión de productos naturales, y las tasas de
descubrimiento cayeron dramáticamente. No obstante, los productos naturales
continuaron proporcionando andamios clave para el desarrollo de fármacos. En
la actualidad a partir de la secuenciación del genoma se producen diez veces
más metabolitos secundarios de lo que se producía anteriormente. Los
actinomicetos más dotados tienen la capacidad de producir alrededor de 30 a
50 metabolitos secundarios (Katz & Baltz, 2016).
En la Tabla 2 se resume los microorganismos productores de antibióticos.
Tabla 2.- Microorganismos productores de antibióticos. (Elaboración propia a partir de Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de la Biotecnología, 2019)
Antibiótico
Organismo
productor
Organismos
blanco
Sitio o
modo de
acción
Penicilina
Penicillium
chrysogenum
Bacterias Gram-
positivas
Síntesis de
la pared
Cefalosporina
Cephalosporium
acremonium
Bacterias Gram-
positivas y Gram-
negativas
Síntesis de
la pared
Bacitracina Bacillus subtilis
Bacterias Gram-
positivas
Síntesis de
la pared
Polimixina B
Bacillus
polymyxa
Bacterias Gram-
positivas
Membrana
celular
19
Anfotericina B
Streptomyces
nodosus Hongos
Membrana
celular
Eritromicina
Streptomyces
erythreus
Bacterias Gram-
positivas
Síntesis
proteica
Neomicina
Streptomyces
fradiae
Bacterias Gram-
positivas y Gram-
negativas
Síntesis
proteica
Streptomycin
Streptomyces
griseus
Bacterias Gram-
negativas
Síntesis
proteica
Tetraciclina
Streptomyces
rimosus
Bacterias Gram-
positivas y Gram-
negativas
Síntesis
proteica
Vancomicina
Streptomyces
orientalis
Bacterias Gram-
positivas
Síntesis
proteica
Gentamicina
Micromonospora
purpurea
Bacterias Gram-
positivas y Gram-
negativas
Síntesis
proteica
Rifampicina
Streptomyces
mediterranei M. tuberculosis
Síntesis
proteica
Griseofulvina
Penicillium
griseofulvum
Hongos
dermatófitos Microtúbulos
20
1.6. ACTUALIDAD DE ANTIBIÓTICOS Y SU RESISTENCIA
Como hemos ido viendo durante la introducción, el mayor problema en la
actualidad es la resistencia que presentan ciertas bacterias. Como afirma el
Grupo de Investigación de Farmacoepedemiología y Farmacovigilancia en la
“Revista Médica de Risaralda” en 2015, la resistencia a antibióticos es una
crisis global que sigue aumentando cada día más, aumentando el número de
muertes cada año y el pronóstico dice que se alcanzarán millones para 2050.
Para paliar esta situación, son urgentes los llamados para que los encargados
de la prescripción de antibióticos asuman una doble responsabilidad. Por un
lado, ofrecer el tratamiento óptimo para cada paciente y por otro, un
compromiso con la salud pública para preservar su eficacia y reducir al mínimo
el desarrollo de resistencia. Su uso prudente es la única opción (Grupo de
Investigación en Farmacoepedemiología y Farmacovigilancia, 2015).
El panorama clínico es preocupante, actualmente, más del 90% de las cepas
de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina. Entre los Gram-
positivos la variedad del Enterococcus faecium resistente a vancomicina
representa uno de los principales obstáculos, pues antibióticos como
quinupristina-dalfopristina y linezolide no son mejores que vancomicina en su
control y la resistencia a ellos ha surgido recientemente.
Algunos organismos adquiridos típicamente en la comunidad como Neisseria
gonorrhoeae también han aumentado la resistencia; alguna vez sensible a
penicilinas, tetraciclinas y fluoroquinolonas, actualmente la ceftriaxona parece
ser la única opción viable en muchas regiones, aunque algunas cepas ya han
desarrollado resistencia a esta y a cefixima.
El caso de las bacterias Gram-negativas resistentes es aún más alarmante. Los
organismos productores de beta-lactamasas de amplio espectro (BLEE) han
aumentado su prevalencia. Por otra parte, la aparición y rápida propagación de
Gram-negativos productores de carbapenemasas, como Acinetobacter spp.,
enterobacteriacae, Klebsiella pneumoniae, han agotado las opciones de
tratamiento disponibles.
21
En conjunto, los organismos resistentes “altamente problemáticos” son
denominados patógenos BLEE (Enterobacter, E. coli) y ESKAPE
(Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y enterobacterias),
convirtiéndose en los responsables de la crisis de resistencia antibiótica en
diferentes partes del mundo (Grupo de Investigación en
Farmacoepedemiología y Farmacovigilancia, 2015).
La OMS ha emitido una clasificación de microorganismos (Figura 7) donde se
establece la prioridad de investigación y desarrollo para nuevos antibióticos
ante esta crisis global:
Figura 7.- Lista de patógenos prioritarios para la I+D de nuevos antibióticos (OMS, 2017) (ESBL: Extended Spectrum Beta-Lactamase).
22
2. OBJETIVOS
Los objetivos de este TFG experimental vienen descritos en el Reglamento de
la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad de Jaén, donde se
cita lo siguiente:
Art.7. “El TFG supone la realización por parte del/la estudiante de un proyecto,
memoria o estudio en el que se integran y desarrollan contenidos formativos
recibidos, y debe estar orientado a la aplicación de competencias asociadas al
título de Grado.”
Los resultados de aprendizaje son:
- Capacidad de integrar creativamente sus conocimientos para resolver un
problema ambiental real.
- Capacidad para estructurar una defensa sólida de los puntos de vista
personales apoyándose en conocimientos científicos bien fundados.
- Destreza en la elaboración de informes científicos complejos, bien
estructurados y bien redactados.
Con lo cual, al alumno se le ha instruido en el manejo, desarrollo y
entendimiento de todo lo relacionado con el trabajo dentro del laboratorio de
microbiología. Para ello se ha realizado el cultivo de las muestras obtenidas en
la exploración microbiana de suelo, con todos sus procesos.
Por tanto, los objetivos específicos son:
1. Acercar la cultura científica y la investigación a niveles educativos
preuniversitarios para fomentar la vocación científica
2. Utilizar una estrategia de “crowdsourcing” dirigida al descubrimiento de
nuevos antibióticos.
3. Elaborar una colección de cepas bacterianas productoras de antibiosis a
partir de las muestras estudiadas en el programa.
23
4. Caracterizar preliminarmente las cepas productoras así como el tipo de
antibiosis detectada.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. “Aislamiento de microorganismos del suelo”
- Tubos con solución de cloruro sódico
- Muestras de suelo
- Placas de Petri con medio TSA Panreac
- Espátula de Drigalsky estéril
- Estufa
3.1.2. “Detección de cepas productoras de antibióticos”
- Placas de Petri con medio TSA Panreac
- Solución ESKAPE like (Gram-negativas y Gram-positivas)
- Hisopo estéril
- Colonias aisladas de microorganismos del suelo
- Palitos estériles
- Estufa
3.1.3. “Aislamiento de cepas productoras de antibióticos” en el laboratorio
- Placas de Petri con medio BHAT Panreac
- Cepas Gram-positivas y Gram-negativas (ESKAPE)
- Hisopo estéril
- Colonias aisladas de microorganismos del suelo
- Palitos estériles
- Estufa
24
3.1.4. “Tinción de Gram en cepas productoras de antibióticos”
- Cepas productoras de antibióticos
- Portaobjetos
- Agua destilada
- Mechero bunsen
- Cristal violeta
- Lugol
- Alcohol
- Safranina
- Aceite de inmersión
- Microscopio
3.2. MÉTODOS
3.2.1. “Formación de SWITAs (Small World Initiative Teaching Assistants)”
En primer lugar, los alumnos de la Universidad de Jaén durante un cuatrimestre
en la asignatura optativa de microbiología aplicada al medio ambiente nos
hemos formado como SWITAs; Es decir seremos los profesores de los
alumnos del centro que participa en este programa, en este caso fue el I.E.S
Virgen del Carmen (Jaén).
3.2.2. “Descripción de los talleres en los centros educativos”
La primera clase impartida en el centro a los alumnos fue una introducción al
programa, en la cual se les explica qué es el SWI, cual es la problemática
actual con los antibióticos y cómo van a ayudar ellos en este programa. Para
ello se les dota por parejas de un kit en el que se incluye un tubo Falcon, una
espátula, unos guantes y una ficha que tienen que rellenar con los datos que se
piden (localización, profundidad del suelo, características del lugar,
coordenadas, etc.), así como las instrucciones bien redactadas y claras de
cómo se tiene que recoger la muestra de suelo. También a cada pareja se les
dota de una clave de identificación para las muestras y que es la que vamos a
usar para la trazabilidad de las cepas encontradas en un futuro.
25
3.2.3. “Aislamiento de microorganismos del suelo”
En la segunda visita al centro, los alumnos trajeron sus muestras de suelo, nos
aseguramos de que todos hubieran cogido la muestra adecuadamente y se
pasó a hacer las diluciones pertinentes para plaquear la muestra y ver cuantas
colonias hay.
Para hacer las diluciones en primer lugar se coge el gramo de suelo y se diluye
en solución salina, la proporción de dichas diluciones son tal como se muestra
en la Figura 8.
Una vez hechas las diluciones, se coge 100 µL de cada una de las diluciones y
se plaquean en medio TSA, en este caso hicieron diluciones a 10-1, 10-2, 10-3 y
10-4 y por último se llevan a incubar durante 24h a 37ºC.
Figura 8.- Diluciones de suelo (Barrios, 2011)
26
3.2.4. “Detección de cepas productoras de antibióticos”
En la tercera visita al centro educativo los alumnos seleccionaron 20 cepas
crecidas en las placas y las plaquearon en una placa con medio TSA, que será
una placa madre, y en una placa con medio TSA sembrado anteriormente con
bacterias indicadoras ESKAPE like Gram-positivas, para ver cuáles son las
cepas que producen halos e inhiben el crecimiento de dichas bacterias. En esta
ocasión sólo se hizo con Gram-positivas por que se producen más halos en
estas que en las Gram-negativas y así no propiciar el descontento de los
alumnos.
A continuación, vamos a ver algunas figuras (Figura 9 - Figura 11) donde se
muestra el trabajo de los alumnos:
Figura 9.- Placa madre y placa ESKAPE alumnos
27
Figura 10.- Placa madre alumnos Figura 11.- Placa ESKAPE alumnos
Una vez en el laboratorio, las colonias que vienen del centro se pasan a otras
placas de Petri con medio TSA sobre césped de bacterias indicadoras Gram-
negativas, se realiza con palillos esterilizados con los que picamos la colonia
obtenida por los estudiantes y la colocamos en nuestra nueva placa de Petri.
Se introducen en la cámara de incubación durante 24-48h a 37ºC. (Figura 12 y
Figura 13)
28
Figura 12.- Placa ESKAPE Gram-negativa
Figura 13.- Placas ESKAPE Gram-negativa
29
3.2.5. “Aislamiento las cepas productoras de antibióticos en el laboratorio”
Debido a esta nueva situación del COVID-19 no se ha podido acabar la parte
experimental, pero se procedería de la misma manera a años anteriores, por lo
que a continuación se va a explicar lo que se haría.
Una vez tenemos la placa madre (control) y las placas donde las colonias han
reaccionado y se ha producido un halo frente a la Gram-positiva o negativa se
pican esas colonias siempre desde la madre, que no está contaminada, a
placas con medio BHAT, las cuales están tamponadas a un pH de 7, para ver
si los halos que se han producido son de carácter antibiótico o las colonias eran
sólo productoras de ácidos. Pero antes se van a inocular estas placas con otras
cepas bacterianas para crecer un césped al igual que se ha hecho en las
placas con medio TSA, también vamos a tener placas madre en medio BHAT
(control) (Figura 14 – Figura 16).
Las cepas bacterianas que se van a usar son siempre de nivel de seguridad 1 y
son las siguientes:
Gram positivas:
- S. aureus
- Listeria
- Bacillus cereus
Gram negativas:
- Proteus
- Klebsiella
- E. coli
30
Figura 14.- Placas con medio BHAT (Guillén Molina, 2019)
Figura 15.- Placas con césped y colonias inoculadas (Guillén Molina, 2019)
31
3.2.6. “Tinción de Gram en cepas productoras de antibióticos”
Una vez que hemos obtenido los halos en las placas con medio TSA y BHAT,
se cogen muestras de esas colonias y se les hace una tinción de Gram para
determinar su morfología y ver si son bacterias Gram-positivas o Gram-
negativas.
En el caso del año anterior, quedaron pendientes algunas de ellas por lo que
he tenido que tomar las muestras del año anterior que estaban congeladas en
glicerol, tomando 0.6 ml se ha puesto en un tubo de semilla con medio TSB
para crecerlas y se han llevado a incubar 24h a 37ºC (Figura 17).
Una vez que han crecido éstas en los tubos de semilla se pasan a otros tubos
de semilla con medio TSA y se inoculan para obtener las colonias y poder
hacer la tinción correctamente, se llevan a incubar durante 24h a 37ºC (Figura
18).
Una vez tenemos las colonias cogemos con un asa de siembra bien
esterilizada y se pone una pequeña muestra de la colonia en un portaobjetos
sobre una gota de agua y se extiende. Se deja secar, una vez seco se fija con
el calor de la llama del mechero bunsen. A continuación se cubre toda la
muestra con cristal violeta durante 2 minutos, pasado ese tiempo se lava con
Figura 16.- Placa BHAT con Listeria inoculada y con halo (Guillén Molina, 2019)
32
abundante agua destilada y se le añade lugol (Figura 19) y se vuelve a dejar 2
minutos, cuando éstos pasen se retira el exceso y se añade alcohol y, sin parar
de mover el portaobjetos se deja unos 10 ó 15 segundos y después se lava con
abundante agua y por último se le añade safranina durante 1 minuto, pasado
éste se lava con agua y se seca para pasar a observar la muestra al
microscopio óptico.
Figura 17.- Tubos de semilla con medio TSB
33
Figura 18.- Tubos de semilla TSA crecidos
Figura 19.- Tinción de Gram (Lugol)
34
Este año debido a que no se ha podido acabar la experiencia no se han podido
hacer las tinciones necesarias. Por ello, las que no se han podido completar
quedan pendientes para el próximo curso académico, así como la inoculación
de las cepas en BHAT.
Por último, tomamos todos los datos que hemos ido obteniendo durante toda la
experiencia y pasamos a realizar los cálculos y resultados de la misma.
4. RESULTADOS
A continuación, vamos a mostrar las tablas con los resultados obtenidos en
nuestra experiencia (Tabla 3 y Tabla 4), donde se muestran las cepas que han
producido halo frente a bacterias Gram-positivas y frente a Gram-negativas.
También aparecen las cepas que quedaban pendientes de tinción del año
anterior donde se puede observar si son bacterias Gram-positivas o Gram-
negativas así como su morfología (Figura 20 – Figura 33).
Tabla 3.- Resultados I.E.S. Hermanos Maristas
35
Figura 20.- Tinción Gram UJA-HM- 21-01
Tabla 4.- Resultados I.E.S Virgen del Carmen
36
Figura 21.- Tinción Gram UJA-HM-02-03
Figura 22.- Tinción Gram UJA-HM-02-06
37
Figura 23- Tinción Gram UJA-HM-09-03
Figura 24.- Tinción Gram UJA-HM-15-13
38
Figura 25.- Tinción Gram UJA-HM-24-06
Figura 26.- Tinción Gram UJA-HM-26-08
39
Figura 27.- Tinción Gram UJA-VC- 56-13
Figura 28.- Tinción Gram UJA-VC-21-18
40
Figura 29.- Tinción Gram UJA-VC-22-02
Figura 30.- Tinción Gram UJA-VC-58-13
41
Figura 31.- Tinción Gram UJA-VC-58-14
Figura 32.- Tinción Gram UJA-VC-65-13
42
Figura 33.- Tinción Gram UJA-VC-66-17
5. DISCUSIÓN
Según se muestra en la Tabla 3 desde la cepa UJA-69-17 hasta la cepa UJA-
VC-76-12, son los datos que hemos obtenido este año en la experiencia. Todas
estas cepas han producido halo en bacterias Gram-positivas en medio TSA.
En la cepa UJA- VC-76-12 (Tabla 3) se produjo el halo en la placa madre y ello
se hizo visible gracias a una contaminación al inocularla.
En cuanto a los resultados en medio TSA frente a bacterias indicadoras Gram-
negativas ninguna de las cepas ha producido halo.
El total del número de muestras en medio TSA son 8, como he indicado
anteriormente el 100% ha presentado halo en Gram-positivas.
En medio BHAT se podrían esperar resultados similares a los del año anterior,
si tomamos los porcentajes de halos obtenidos en este medio del año anterior:
- Listeria: 27%
- Bacillus: 23%
- Proteus: 1%
- Klebsiella: 0%
43
- E. coli: 4%
Esto quiere decir que del total de las muestras obtenidas sólo una o dos cepas
tendrán actividad antibiótica frente a Gram-positivas y Gram-negativas, por lo
cual hay que tenerlas en consideración.
También se observa que la diversidad bacteriana disminuye en los lugares
donde el ser humano ha intervenido tales como los suelos de cultivos o
jardines; es decir, los lugares donde no haya cultivo: como por ejemplo, un
terreno abandonado tendrá más biodiversidad microbiana que otras zonas
(Cobo, y otros, 2018). En las zonas donde hay mayor aporte de materia
orgánica crecen las bacterias alóctonas con mayor rapidez y van
desapareciendo conforme la cantidad de materia orgánica va disminuyendo.
Sin embargo, en este caso no llegan a desaparecer ya que el aporte orgánico
es continuo por eso hay menos diversidad en este ambiente antrópico que en
las que el hombre no ha intervenido.
En cuanto a la Tabla 3 y la Tabla 4 (UJA-VC-06-14 hasta UJA-VC-66-17) nos
muestran los resultados de las tinciones. En el apartado de “Resultados” se
pueden observar las imágenes de cada una de las tinciones. (Figura 20 –
Figura 33)
Los campos de las tablas que aparecen en blanco es debido a que las
muestras no se encontraron en la colección de muestras guardadas en glicerol
y, por tanto, no disponemos de ellas. Estas son UJA-HM-07-08 (Tabla 3) y
UJA-VC-06-14 (Tabla 4); por otro lado la muestra UJA-HM-04-05 (Tabla 3) no
creció en medio TSB. Después de varios intentos se llegó a la conclusión de
que hay muy pocas bacterias vivas en el glicerol y eso hace que no crezcan en
TSB; la muestra UJA-HM-07-14 (Tabla 3) se encuentra muerta en el tubo de
glicerol y por último la muestra UJA-VC-34-10 (Tabla 4) sólo contiene glicerol.
A continuación, se van a detallar cada una de las tinciones indicando coloración
y morfología.
UJA-HM-02-03: la coloración que se observa es de color púrpura, lo cual indica
que son bacterias Gram-positivas. La morfología de dichas bacterias es en
44
bacilos con posición en cadenas y con acumulo de sustancias del suelo (Figura
21).
UJA-HM-02-06: la coloración observada es de color púrpura, por lo tanto son
bacterias Gram positivas y su morfología estreptobacilos (Figura 22).
UJA-HM-09-03: la coloración que se observa es color púrpura y por tanto son
bacterias Gram positivas. En cuanto a la morfología son bacilos cortos con
esporas refringentes (Figura 23).
UJA-HM-15-13: la coloración es púrpura, por lo tanto estamos ante unas
bacterias Gram positivas y con morfología de bacilos (Figura 24).
UJA-HM-21-01: la coloración que se observa es de color rojo y por tanto estas
bacterias son Gram negativas con morfología en forma de estreptobacilos
(Figura 20).
UJA-HM-24-06: la coloración observada es de color rojo, por lo tanto estamos
ante bacterias Gram negativas cuya morfología es de bacilos (Figura 25).
UJA-HM-26-08: la coloración es de color púrpura, por lo tanto son Gram
positivas y su morfología es bacilar y además presentan esporas refringentes
(Figura 26).
UJA-VC-21-18: la coloración es de color púrpura, por lo tanto son bacterias
Gram positivas, cuya morfología son bacilos y presentan acúmulos en el
citoplasma (Figura 28).
UJA-VC-22-02: la coloración es color púrpura, Gram positivas y su morfología
es de bacilos cortos (Figura 29).
UJA-VC-56-13: la coloración es púrpura, lo cual nos indica que son Gram
positivas, su morfología es de cocos y se agrupan de dos en dos formando
diplococos (Figura 27).
UJA-VC-58-13: la coloración observada es de color púrpura, por lo tanto son
Gram positivas, la morfología es en forma de bacilos y éstos tienen esporas
refringentes (Figura 30).
45
UJA-VC-58-14: la coloración es color rojo, lo que nos indica que estamos ante
Gram negativos con morfología de bacilos (Figura 31).
UJA-VC-65-13: la coloración es púrpura, Gram positivas cuya morfología es de
bacilos (Figura 32).
UJA-VC-66-17: la coloración es rojo, por lo tanto son Gram negativas, la
morfología es en forma de bacilos cortos y presentan esporas refringentes
(Figura 33).
6. CONCLUSIONES
A partir de los datos obtenidos se pueden realizar las siguientes conclusiones:
- Durante el curso 2019-2020 se han encontrado cepas productoras de
antibióticos, aunque en poca cantidad, en total siete cepas productoras.
- Las cepas obtenidas han sido catalogadas como productoras de
antibióticos frente a Gram positivas y negativas.
- Se ha realizado por el método de “Crowdsourcing”, haciendo que los
alumnos preuniversitarios se interesen por este campo, contribuyendo
así al trabajo de los investigadores.
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