PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIK SECARA MIKROBIOLOGI
PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIK SECARA MIKROBIOLOGISANDRA
ASWARIOKO1110-096-140-329Kadar Vs PotensiKadar jumlah per satuan
berat/volume
Potensi ukuran kekuatan/ daya hambat atau daya bunuh zat aktif
terhadap mikroorganisme tertentuPengertian Antibiotik Antibiotik
Adalah senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh mikroorganisme bisa
membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainMerupakan
suatu metabolit sekunder dari yeast & beberapa mikrobaMerupakan
senyawa non protein dengan BM rendah
Spektrum Aksi AntibiotikMenunjukkan range bakteri dan
mikroorganisme lain yang bisa dipengaruhi oleh aksi antibiotik
tertentuMacamnya:Spektrum luas : efektif terhadap bakteri gram
positif dan bakteri gram negatifSpektrum sempit : efektif terhadap
bakteri gram positif saja atau bakteri gram negatif sajaSpektrum
terbatas : hanya efektif terhadap satu spesies sajaPENETAPAN
POTENSI ANTIBIOTIK SECARA MIKROBIOLOGI (Farmakope Indonesia edisi
IV)Prinsip : estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan
langsung antara antibiotik uji dengan antibiotik standar yang telah
disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umum
digunakan sebagai rujukanTujuan Uji Sebagai standar untuk mengatasi
keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi)
antibiotik terhadap efek daya hambatnya terhadap mikrobaRespon yang
diamatiEfek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang
ditunjukkan daerah bening di sekeliling zat uji (cara difusi)
Kekeruhan (turbiditas) yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba
dalam medium cairMetode UmumPenetapan dengan lempeng-silinder atau
lempengPenetapan dengan cara tabung atau turbidimetri
Metode Lempeng SilinderDifusi antibiotik dari silinder yang
dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau
lempengmikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah
berupa lingkaran di sekeliling silinder (atau kertas
cakram)Diameter hambat yang terbentuk dibandingkan dengan diameter
baku standarWaktu inukbasi 18-24 jam
Metode TurbidimetriHambatan pertumbuhan mikroba uji diukur
dengan menentukan kekeruhan dengan alat spektrofotometerWaktu
inkubasi kurang dari 4 jam
Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotikMikroba ujiBerasal dari galur murniMemberikan respon yang
bertingkat antara peningkatan konsentrasi dan daerah hambatDifusi :
daerah hambat yang terbentuk jelasdan mudah diukurTabung :
perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat
jelasBeberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotikBaku pembanding biologiAntibiotik yang telah diketahui
kemurnian dan potensinyaDirekomendasikan oleh badan Kesehatan Dunia
(WHO) dan badan POM RIMedia perbenihanSesuai dengan pertumbuhan
mikroba ujiTdk mengandung zat antagonis atau mempengaruhi akt
antimikroba dari antibiotik yang diperiksa
Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotikBaku pembanding biologiAntibiotik yang telah diketahui
kemurnian dan potensinyaDirekomendasikan oleh badan Kesehatan Dunia
(WHO) dan badan POM RIMedia pertumbuhanSesuai dengan pertumbuhan
mikroba ujiTdk mengandung zat antagonis atau mempengaruhi akt
antimikroba dari antibiotik yang diperiksa
Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotikLarutan daparDigunakan untuk melarutkan antibiotik yang
diperiksa baik baku pembanding atau sampel ujiPemilihan dapar yang
dipilih disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yang akan
diujiBeberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotikPengaruh pHAktivitas antibiotika golongan aminoglikosida
diperkuat dalam suasana asam, dan tetrasiklin dalam basaUkuran
inokulumLuas daerah hambat akan semakin kecil jika inokulum semakin
besar kandungan mikroorganismenya
Stabilitas mikroorganismeResistensi Regenerasi mikroorganisme
secara periodik dan sewaktu-waktu perlu uji kemurnian dan
kepekaannya
PeralatanDicuci bersih sebelum dan sesudah digunakanDisterilkan
dengan pemanasan kering atau dengan uap air
Wadah1. Wadah untuk metode lempengCawan petri kaca atau plastik
(20x100mmSilinder besi tahan karat atau porselen (diameter luar
8mm, diameter dalam 6 mm, tinggi 10 mm) Cetak lobang (punched
holes)Bersihkan dengan asam nitrat 2 N bila perlu2. Wadah untuk
metode turbidimetriTabung reaksi kaca atau plastik dengan ukuran
seragamTabung spektrofotometer harus bersih dan
sterilSpektrofotometerPenyiapan inokula : 580 nmPengukuran serapan
pada pengujian dengan cara tabungUnit dan Baku PembandingPotensi
antibiotika dinyatakan dalam unit atau g aktivitas antibiotika.
Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasi terhadap
baku primer antibiotika yang bersangkutan. Antibiotika BPFI dibuat
dan diedarkan oleh instansi yang berwenang.Mikroba dan
InokulaMikroba uji yang digunakan untuk tiap antibiotik tertera
pada tabel2Pelihara media pada agar miring dengan kondisi inkubasi
seperti tertera pada tabel 3 dan pindahkan setiap agar miring yang
baruDesain PenetapanDianjurkan menggunakan desain penetapan satu
aras dosis dengan suatu kurva bakuMetode Lempeng Silinder21 ml
media dituang ke dalam cawan petriTambahkan 4,0 ml lapisan
inokulaJatuhkan 6 buah silinder dalam radius 2,8 cmIsi silinder
selang seling dengan dosis tengah baku (S3)Inkubasi 32-35C, 16-18
jamUkur diameter hambatan yang terjadiMetode Turbidimetri1 ml
larutan uji dan larutan baku tiap dosis pada 3 tabung
reaksiTambahkan 9,0 ml inokula ke dalam tabungLetakkan tabung dalam
tangas air atau inkubator (suhu 36-37,5C, 2 jam)Setelah inkubasi,
tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encerUkur transmitan pada 530
nmDesain pengujianDipilih berdasarkan hasil akhir yang diinginkan,
presisi tinggi atau tidak. Desain yang digunakan :2+2 : satu baku
pembanding dan satu sampel, masing2 dengan 2 tingkat dosis3+3 :
satu baku pembanding dan satu sampel, masing2 dengan tiga tingkat
dosis yang diperlakukan dalam satu lempeng5+1 : satu baku
pembanding dengan 5 tingkat dosis dan satu sampel dengan satu
tingkat dosis yang setara dengan dosis menengah (dosis acuan) baku
pembandingDesain Pengujian 3+3Dibuat larutan baku induk 1000
g/mLDiencerkan menjadi 3 tingkat dosis (S1=rendah, S2=menengah dan
S3=tinggi)Larutan uji dibuat menjadi 3 tingkat dosis dengan potensi
sebanding dengan larutan standar rendah, menengah dan tinggi
Masukan standar dan uji ke dalam silinder pencadang atau kertas
cakram 100 LInkubasi 35-37 C, 18-24 jamUkur zona hambat
S1S2S3U3U1U2Desain Pengujian 5+1Dibuat larutan baku induk 1000
g/mLDiencerkan menjadi 5 tingkat dosis (S1, S2,S3,S4 dan S5)
perbandingan 1,25Larutan uji dibuat menjadi 1 tingkat dosis dengan
potensi sebanding dengan S3Masukan standar dan uji ke dalam
silinder pencadang atau kertas cakram 100 LPreinkubasi 1
jamInkubasi 35-37 C, 18-24 jamUkur zona hambat
S2S3S3S1S4S3S3S5S3UCara Penghitungan Desain 5+1Koreksi diameter
hambat S1,S2,S3,S4 dan S5Hitung diameter rata-rata S3 pada semua
cawan (Y3T)Hitung diameter rata-rata S3 pada masing-masing cawan
(Y31, Y32,Y34,Y35)Hitung diameter S1,S2,S4,S5 (Y1,Y2,Y4,Y5)
Diameter terkoreksiS1(a) = Y1+(Y3T-Y31)S2(b) = Y2+(Y3T-Y32)S3(c)
= Y3TS4(d) = Y4+(Y3T-Y34)S5(e) = Y5+(Y3T-Y35)Dibuat Kurva baku (log
dosis vs diameter dosis terendah (YR) dan tertinggi (YT)
Log dosisdiamaterPenghitungan Potensi Interpolasikan diameter
lar uji terkoreksi (Yu koreksi)Yu koreksi = Ys +(Yu-Y3u)Y3u =
diameter rata-rata S3 pada cawan larutan UYu= diameter rata-rata U
pada cawan larutan UYs= Hasil interpolasi S3 pada kurva baku
Interpolasikan Yu pada kurva baku
Dosis U = Xu/S3 x dosis S3Potensi U = dosis U X faktor
pengenceran
Log dosisdiamaterPerbandingan Penetapan potensi antibiotik
menurut FI ed IV dan USP 30FI ed IVUSP 30Media1517 ( media no 40
dan 41)Antibiotik Ada di FI dan tidak ada di USP ( Ampisilin,
Rifampisin, Sefaleksin, Minomisin, dll)Ada di USP dan tidak ada di
FI (Kandisidin, Novobiosin, Sikloserin, Metasiklin,
Nafsilin,dll)Mikroba uji1214 ( S. aureus 9144, Enterococcus
hirrae)Uji kepekaan mikroba terhadap antibiotik Kirby-Bauer Test
disk diffusion testUntuk melihat resistensi atau sensitivitas dari
bakteri aerob, atau bakteri anaerob terhadap senyawa antibakteriAda
atau tidaknya zona inhibisi disekitar cakram disebutkan bakteri
sensitif terhadap bakteriMedia Mueler-Hinton agar
E-TestUntuk melihat sensitivitas atau resistensi
antibiotikMenggunakan strip Kirbi-Bauer test zona hambat yang
terbentuk ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan.
Ukuran zona standar NCCLS didefinisikan resistan, sensitif atau
intermediet
MIC (minimum Inhibitory Concentration) konsentrasi minimal dari
antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba
36Sifat kerja antibiotika MIC ( MINIMAL INHIBITORY
CONCENTRATION)Konsentrasi minimum yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteriKonsentrasi maks 200 g/mLMenggunakan metode tabung dengan
serial konsentrasi
MBC (MINIMAL BACTERICIDAL CONCENTRATION)Konsentrasi minimum yang
dapat membunuh bakteri
37Zona bening pertumbuhan bakteri
