Mikroba

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Visualisasi mikroorganisme yang masih hidup tidaklah mudah, tidak hanya karena

ukurannya yang sangat kecil tetapi karena transparan dan pada umumnya tidak berwarna jika

disuspensikan dalam medium cair. Untuk mempelajari sifat mereka dan untuk

mendiferensiasikan mikroorganisme dalam grup yang spesifik untuk kepentingan diagnostik,

pewarnaan bologis dan prosedur pewarnaan dengan bantuan mikroskop cahaya menjadihal

utama dalam mikrobiologi (Jawetz, 1995).

Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri rata-

rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10-3 mm). Itu

berarti pula bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya pada

mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk melihat bakteri

dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan

bakteri (Irianto, 2006).

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik

pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana maupun pengecatan gram

dan pengecatan spora serta mengetahui morfologi mikroorganisme.

B. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mengetahui antara gram positif dan

gram negatif melalui beberapa macam pengecatan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang

khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan

air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel

bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.

Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Yulneriwanti, 2013).

Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni, warna,

tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi

sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop dan

melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram, dan kemampuan membentuk spora dari bakteri

tersebut (Pelczar dan Chan, 2006).

Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan

di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya.

Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan

mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna

yang biasa digunakan untuk pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu:

pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk

menguji adanya komponen tertentu di dalam sel (Junaidi, 2013).

Uji pewarnaan bakteri yang menggunakan pewarnaan gram yang dilakukan dengan

menggunakan spesimen yang didapat dari rektal, feses, atau muntahan yang dikeluarkan oleh

hewan atau ternak yang terserang infeksi dari suatu bakteri. Pewarnaan diferensial yang sangat

berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran

sel bakteri (Kurnia, 2013).

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian

karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri

telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka

akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan

dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dan

sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Mega, 2013).

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini

disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan

terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan

oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya

perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna

yang sesuai dapat menembusendospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar

untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan

untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Mega, 2013).

Untuk memberi ciri pada berbagai kelompok bakteri perlu dipahami bahwa

semua ciri tidak sama pentingnya bagi semua kelompok. Sebagai contoh, pereaksi

pewarnaan gram penting bagi bakteri batang dan kokus tetapi bukanlah ciri pembeda bagi

Spiroketa. Ada tidaknya flagella serta penataannya penting bagi beberapa kelompok sedang bagi

yang lain tidak. Untuk beberapa kelompok , sifat-sifat biokimia lebih berarti daripada sifat

morfologi. Karena itu, untuk mencirikan

kelompok bakteri, janganlah mengharapkan adanya sifat-sifat yang sama (Yulneriwanti, 2013).

Menurut Irianto (2006) menyatakan bahwa ciri-ciri khas dari bakteri gram positif dan garam

negatif pada fenomena pengecatan adalah sebagai berikut :

a. Bakteri gram positif : sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan, sensitif terhadap

penisilin, resisten terhadap alkali; tidak larut oleh 1% KHO, biasanya kokus atau batang

pembentuk spora (kecuali Lactobacillus, Corynebacterium) dan dapat bersifat tahan asam (acid

tast).

b. Bakteri gram negatif : kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan, sensitif terhadap

streptomisin, sensitive terhadap alkali; larut oleh 1% KHO, biasanya batang tidak membentuk

spora (kecuali Neisseria yang berbentuk kokus) dan tampaknya tidak pernah tahan panas.

Bentuk bakteri bermacam-macam. Ada yang bulat (tipe kokus) dengan garis tengah 0,15-

1mikorn. Ada yang berbentuk batang atau slindris panjang atau pendek (tipe basil) dan ada yang

berbentuk slindris, spiral panjang atau pendek (spirillum) yang garis tengahnya 0,3-3 mikron,

sedangkan panjangnya 1 sampai lebih dari 6 mikron. Umumnya bakteri bersel tunggal tidak

mempunyai klorofil serta berkembang biak dengan cara membelah dan spora. Tiap sel dikelilingi

oleh dinding sel atau membrane yang menyerupai lendir. Jika berkelompok, wujudnya seperti

lendir yang kental dan berbentuktidak teratur, ada yang panjang, bulat, atau lapisan tipis seperti

buih. Bakteri itu ada yang inaktif atau tidak dapat bergerak. Ada pula bakteri yang bisa berenang

atau bergerak akibat adanya bulu-bulu yang bisa bergetar (Rizki,2013).

Bakteri gram positif lebih peka terhadap fenol, penisilin, dan resisten terhadap streptomisin.

Ciri khas ini dipergunakan dalam penggolongan bakteri (Dwidjoseputro, 2005).

Bakteri gram positif mengandung peptidoglikan kira-kira 90% dari bobot kering dinding

selnya. Namun biasanya terdiri dari selapis sel yang sangat tebal (10-50 nm). Selain

peptidoglikan dijumpai pula berbagai polimer polisakarida serta poliposfat yang dikenal sebagai

asam teitkoat (Hafsan, 2011).

Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai susunan kimiawi yang lebih kompleks

dibandingkan dengan dinding sel bakteri gram positif. Dinding sel bakteri gram negatif

mengandung peptidoglikan yang terhitung rendah, jarang melebihi 10% dari bobot kering

dindingnya (Hafsan, 2011).

Kuman-kuman diklasifikasikan sebagai gram positif atau negatif berdasarkan responnya

terhadap pewarnaan gram. Prosedur pewarnaan ini, dinamakan menurut penemunya,

dikembangkan dalam suatu usaha untuk mewarnai kuman secara selektif dalam jaringan-jaringan

yang terkena infeksi. Sel-sel mula-mula diwarnai dengan kristal ungu dan iodium dan kemudian

dicuci dengan aseton atau alkohol. Langkah terakhir akan menghilangkan warna kuman-kuman

gram negatif tetapi tidak dari kuman-kuman gram positif (Jawetz, 1995).

Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan

di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya.

Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan

mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna

yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu:

pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk

menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Yulneriwanti, 2013).

Pengecatan sederhana merupakan pengecatan yang menggunakan suatu jenis zat

warna. Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu

tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara

keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada

dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai

dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri

terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora

dan butiran (Kurnia, 2013).

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang

khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan

air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel

bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.

Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Junaidi, 2013).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Adapun waktu dan tempat dillaksanakannya praktikum ini adalah:

Hari/ Tanggal : Senin/ 27 Mei 2013

Pukul : 08.30-12.00 Wita

Tempat : Laboratorium Kesehatan Hewan STPP Gowa

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu bunsen, cawan petri, gegep,

kaca preparat, mikroskop, pipet dan ose.

2. Bahan

Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu air, alcohol 70%, biakan Eserchia

coli dan Bacillus subtilis, korek api, larutan crystal violet, larutan lugols iodium, larutan

methylen blue, larutan safranin, spiritus, tissue dan oil imersi.

C. Prosedur Kerja

1.Pengecatan Sederhana

a) Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70% agar bebas lemak.

b) Mengambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas

objek seluas 1 cm2.

c) Biarkan mengering diudara, lalu fiksasi diatas api spiritus.

d) Mentetesi dengan Methylen Blue dan Crystal Violet 1 – 2 tetes.

e) Biarkan selama 2 menit, lalu cuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa

cat tercuci seluruhnya.

f) Mengeringkan diudara dan mengamati hasilnya dengan pembesaran kecil

hingga besar dan menggambar preparatnya.

2.Pengecatan Gram



objek seluas 1 cm2.

c) Biarkan mengering diudara,lalu fiksasi diatas api spritus.

d) Meneteskan larutan Gram A sebanyak 2 – 3 tetes dan biarkan selama 2 menit.

e) Mencuci dengan air mengalir, mengeringkan dengan kertas isap secara hati-hati.

f) Meneteskan larutan Gram B, biarkan selama 1-2 menit,

g) Mencuci dengan air mengalir, mengeringkan.

h) Meneteskan larutan Gram C, biarkan selama 30 detik.

i) Mencuci dengan air mengalir dan biarkan mongering.

j) Meneteskan larutan Gram D sebanyak 2-3 tetes, biarkan selama 1

menit, lalu cuci sengan air mengalir.

k) Mengamati dan mencatat hasilnya.

3.Pengecatan Spora



Objek seluas 1 cm².

c) Membiarkan mongering diudara, lalu fiksasi diatas api spiritus.

d) Meneteskan Malacyt green berlebih dan membiarkan 15 menit tanpa

Pemanasan atau selama 5 menit diatas penanggang air. Juga agar cat warna

tidak mengering dengan meneteskan secara terus menerus bila cat mulai

mengering.

e) Mencuci dan mengeringkannya.

f) Meneteskan larutan safranin 1-2 tetes menunggu sampai 1-2 menit.

g) Mencuci dan mengeringkannya kemudian mengamatinya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini adalah :

1. Pengecatan sederhana

Laboratorium Keswan STPP Gowa Keterangan

Spesimen : Bacillus subtilis

1. Warna latar : Biru

2. Bentuk koloni : Stereptobacillus

3. Warna bakteri : Biru

Spesimen : Eserchia coli

1. Warna latar : Biru

2. Bentuk koloni : Sterepcocus

3. Warna bakteri : Biru

2.Pengecatan Gram



Gram positif

1. Warna latar : Ungu

2. Bentuk koloni :

Monobacillus

Diplobacillus

Stereptobacillus

3. Warna bakteri : Ungu

Spesimen : Eserchia coli

Gram Negatif

1. Warna latar : Merah

2. Bentuk koloni :

Monococus

Diplococus

Stapilococus

Streptococus

Sarcina

3. Warna bakteri : Merah

3.Pengecatan spora



1. Warna latar : Hijau

2. Bentuk koloni : Monococus

3. Warna bakteri :

Merah (sel negative)

Hijau (spora)

B. Pembahasan

1. Pengecatan Sederhana

Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau untuk memperjelas kontras

antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu

sendiri. Dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna.

Pada pengamatan ini, sel pewarna yang digunakan untuk melihat bakteri yang akan diamati

adalah Methylen Blue. Pewarna tersebut bekerja baik dalam mewarnai bakteri karena zat warna

tersebut mengandung fungsional yang membentuk warna. Pada pengamatan ini,

bakteri Escerchia Coli terlibat bentuk koloninya, yaitu stereptococus. warna latar biru dan warna

bakteri biru. Hal ini sesuai dengan pendapat Zubaidah (2006), menyatakan bahwa

bakteriEserchia coli termasuk bakteri gram negatif dengan warna merah. Sedangkan

untuk bakteri Bacillus subtilis, berwarna biru dan bentuk koloninya Stereptobacillus. Hal ini

sesuai dengan pendapat

Sri Mulyani (2010) menyatakan bahwa zat-zat warna yang digunakan pada pengecatan

sederhana biasanya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Pewarna yang

biasa dipakai dalam pewarna umum adalah biru metilen. Biru metilen memberi warna biru cerah

yang bisa bergradasi (biru muda sampai biru agak tua).

2.Pengecatan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar yakni gram positif dan gram negatif berdasarkan sifat kimia

dan fisik dinding sel mereka. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokkan

menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan gram negatif.

a) Pengecatan Gram Positif

Pada pengecatan ini bakteri yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis. Pengecatan ini

menggunakan 4 (empat) jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, alcohol asam untuk

pencucian dan safranin sebagai zat penutup dan larutan iodium. Berdasarkan pecobaan Bacillus

subtilis bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan erat cat utama krystal

violet berwarna ungu, pada saat bakteri gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya

pada dinding sel dengan pemberian lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel,

pemberian alcohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan

didalam dinding sel disebabkan oleh rendahnya komponen lipid. Pada pengamatan dengan

menggunakan bakteri Bacillus subtilis menghasilkan warna bakteri ungu dan warna latar ungu

dengan bentuk koloni monobacillus, diplobacillus dan stereptobacillus. Hal ini sesuai dengan

pendapat Tryana, S.T (2008) menyatakan bahwa Ilmuwan dari Denmark bernama Hans Christian

Gram pada tahun 1884 mengemukakan bahwa bakteri gram positif akan mempertahankan zat

pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop dan

hal ini sama dengan hasil pengamatan yang telah diamati dibawah mikroskop.

b) Pengecatan Gram Negatif

Pada pengecatan ini digunakan bakteri Escerhia coli, pengecatan ini juga menggunakan 4

(empat) jenis larutan yaitu Kristal violet, sebagai cat utama, larutan iodium sebagai

pengintensifan, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan

percobaan diperoleh Escerchia coli bersifat gram negatif karena tidak dapat mengikat kuat cat

utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Hal ini sesuai

dengan pendapat Zubaidah (2006) menyatakan bahwa bakteri gram negatif akan kehilangan zat

pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna

tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah.

Dengan demikian hasil pengamatan dengan literatur sama hasil warnanya yaitu berwarna

merah. Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif

dan berbentuk batang yang fermentatif.

3.Pengecatan spora

Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik terhadap bahan kimia

sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dipanskan. Pemanasan

dimaksudkan agar lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk. Zat warna

yang digunakan yaitu larutan Malacyt green dan larutan safranin. Dalam hal ini safranin bukan

pewarna tandingan. Safranin mewarnai sel vegetatif dari bakteri. Sebaiknya dalam percobaan

malakit green digunakan dalam jumlah yang cukup banyak

Pada pengecatan ini digunakan bakteri Bacillus subtilis dengan menggunakan larutan

Malacyt green dan safranin untuk mengetahui sel negatif dan warna sporanya. Untuk melihat

sporanya terlebih dahulu dilakukan fiksasi diatas api spiritus kemudian diteteskan Malacyt green

selama beberapa menit. Setelah itu ditetesi larutan safranin kemudian diamati dengan

menggunakan mikroskop. Pada pengecatan spora dengan menggunakan bakteri Bacillus

subtilisdengan bentuk koloninya monococus dengan warna bakteri merah (sel negatif) dan warna

hijau menunjukan sporanya.

Hal ini sesuai pendapat Kurniawan (2010), menyatakan bahwa prinsip dari pengecatan spora

yaitu pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga warna utama dapat masuk ke

dalam spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di

dalam spora dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas

sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan berwarna merah.

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh dapat diketahui untuk membedakan bakteri

gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif yaitu Bacillus subtilis karena bakteri

tersebut mampu mempertahankan cat utamanya sedangkan untuk bakteri gram negatif yaitu

bakteri Escercia coli karena tidak mampu mempertahankan cat utamanya ketika diberi peluntur.

Bakteri tersebut diamati melalui beberapa pengecatan yaitu pengecatan sederhana, pengecatan

gram dan pengecatan spora.

B.Saran

Adapun saran yang dapat saya sampaikan pada praktikum ini yaitu sampel yang diteliti

dilakukan dengan baik dan benar pada preparat agar memperjelas hasil pengamatan

serta mikroba yang hendak diamati diambil sedikit mungkin agar mikroba tidak bergerombol

sehingga morfologi mikroba tersebut lebih mudah untuk diamati.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.2005.

Hafsan.Mikrobiologi Umum. Makassar : Alauddin University Press.2011.

Irianto, Koes.Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : CV. Yrama Widya.2006.Jawetz, E, JL. Menick, EA. Adelberg. Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan Edisi 16. Jakarta : EGC.1995.

Junaidi.2013.Pengecatan Gram pada Bakteri.http://wawan-junaidi.blogspot.com /2009/07/pengecatan-gram-pada-bakteri.html .(28 Mei 2013).

Kurnia. 2010. Gram staining. http ://www. kurnia.blogspot.com. 28 Mei 2013.

Mega.2013.Pengecatan Marfologi Mikroba.http://megabohari.blogspot .com/2011/12/laporan-mikrobiologi-pengecatan.html.(28 Mei 2013).

Pelczar, Michael J. Dan E.C.S Chan. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit

Universitas Indonesia. Jakarta.2006.Rizki.2013..http://ngecatbakterimakul-rizki.blogspot.com//materi-kuliah.html.(28 Mei 2013).

Yulneriwanti.2013.Mikrobiologi Dasar.BlogYulneriwanti.http://01-bakteri.html. (28 Mei 2013).

.

Documents

Mikroba