Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés tézisei

Mikrogyöngy alapú multiplex immunoassay rendszer fejlesztése

multi-mikotoxin vizsgálatra: Túl a XX.

századi alkalmazásokon

Czéh Árpád

Soft Flow Hungary Kft.

K+F Laboratórium

Témavezető:

Dr. Lustyik György

Doktori Iskola: Interdiszciplináris Orvostudományok Doktori Iskola D93

Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Sümegi Balázs

Program: B-130; Funkcionális fehérje dinamika vizsgálata

biofizikai módszerekkel

Programvezető: Prof. Dr. Nyitrai Miklós

Pécsi Tudományegyetem,

Általános Orvostudományi Kar,

Biofizikai Intézet

Soft Flow Hungary

Kutató Fejlesztő Kft.

Pécs, 2014

1

TARTALOMJEGYZÉK

1. BEVEZETÉS ................................................................................................................................... 1

2. FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ MEGKÖZELÍTÉSE ................. 4

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................................... 7

4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................ 8

5. ÚJ EREDMÉNYEK ...................................................................................................................... 16

6. EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA ............................................................................................ 18

7. REFERENCIÁK ........................................................................................................................... 19

8. KÖZLEMÉNYEK ......................................................................................................................... 21

1. BEVEZETÉS

A mikotoxinokat termelő penészgombák, a mezőgazdasági termények széles skáláját

fertőzhetik meg a betakarítás előtti és utáni időszakban. 1960 fontos dátum a

mikotoxikológiában; ekkor érkezett ugyanis az Egyesült Királyságba egy szállítmány

földimogyoró, mely a szállítás során gombás fertőzést szenvedett. Ez a földimogyoró végül

állati takarmányként került felhasználásra, később ugyanez a földimogyoró okozta 100.000

pulyka pusztulását. A mintában egy, gombák által termelt toxikus anyagot, az aflatoxint

sikerült kimutatni. Az aflatoxinok felfedezésével kezdetét vette a mikotoxinok körültekintő,

alapos és szervezett kutatása. Ennek köszönhetően mostanra több mint 300 eltérő szerkezetű

mikotoxint azonosítottak, melyek a világ minden táján kiemelt figyelmet kapnak, mint az

emberi és állati egészségre veszélyt jelentő ágensek. A legkülönbözőbb penészgombafajok

által megfertőzött gabonák gyakran jelentős mennyiségű mikotoxint tartalmaznak. A

mikotoxinok különböző mikroszkópikus gombák alacsony-móltömegű, másodlagos

anyagcseretermékei, melyek az egyszerű terményekből kiindulva a táplálékláncon

keresztüljutva jelentős veszélyt jelenthetnek az álatokra, és az emberre is, hiszen bizonyítottan

számos súlyos akut, valamint krónikus megbetegedés kialakulásához vezethetnek. A Food

and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), felmérése szerint a világ

élelmiszertermelésének 2050-ig meg kell kétszereződnie. Az élelmiszer-termelés, ilyen

drámai növekedéséhez a következő 35 évében innovatív megoldásokra lesz szükség, melyek

segítségével elérhetjük, illetve megőrizhetjük az állati és/vagy emberi fogyasztásra kerülő

gabonák toxinmentességét világszerte.

A legfontosabb világszerte előforduló mikotoxinok: aflatoxinok, ochratoxin A, fumonizinek,

deoxinivalenol, zearalenon, és a T-2. Mikotoxinok széleskörű megjelenésével, elterjedésével a

2

számukra optimális pára- és a hőmérsékletviszonyok mellett kell számolni (Rahmani et al.,

2009). A mikotoxinok okozta kóros elváltozások az azonnali emésztési problémáktól, az

endokrin rendellenességeken és a csökkent immunitáson keresztül, egészen a

karcinogén/teratogén hatásokig terjedhetnek (Liu és a Wu, 2010; Reddy and Bhoola, 2010). A

bizonyítottan mikotoxinok okozta egészségügyi problémák, kockázatok és a társadalmi-

gazdasági jellegű tényezők indokolták a szabályozások és a mikotoxinokra vonatkozó

határértékek megalkotását, és bevezetését. Időközben az Európai Közösség és a Food and Drug

Administration (FDA, USA) meghatározta a mikotoxinok megengedhető maximális szintjét a

hat, legfontosabb mikotoxinra élelmiszer és takarmányminták esetén. Határértékkel

szabályozott mikotoxinok köre időről időre bővül. 2003 végére mintegy 100 országban került

kialakításra monitoring rendszer, az élelmiszerekben és takarmányokban fellelhető;

határértéket meghaladó mennyiségű mikotoxinok kimutatására (FAO, 2004).

A takarmányok és az élelmiszerek mikotoxin tartalmának meghatározáshoz, valamint a

kapcsolódó kockázatértékeléshez alkalmas analitikai módszerekre van szükség. Az

immunoassay technológia az 1950-es évek közepén született, és már az 1980-as évekre széles

körben alkalmazott módszerré vált. Az ELISA módszer a mikotoxin vizsgálatok terén is

gyorsan közkedveltté vált, ennek köszönhetően már az 1990-es évek közepe óta a legtöbb

fejlett országban alkalmaznak - erre akkreditált analitikai laboratóriumokban - kompetitív

ELISA módszert a mikotoxinok kimutatására (Barna-Vetro et al., 1994). Az Analitikai

Vegyészek Szövetsége (Association of Official Analytical Chemists (AOAC)) és az Európai

Szabványügyi Bizottság (European Standardization Committee (CEN)) számos

szabványosított mikotoxin analitikai módszert tett közzé. Módszereiket laborközi

összehasonlító vizsgálatok keretében validálták. A módszerek elfogadottsága, így az

összehasonlító vizsgálatokban résztvevő laborok száma évről évre egyre nő. Az AOAC által

elismert, hivatalos módszereket leíró tanulmányának (Horwitz, 2000) legújabb kiadása

körülbelül 40 validált mikotoxin analtikai módszert tartalmaz. A felhasználók a módszerek

részleteiről, előnyeiről és alkalmazásáról a megjelent; összefoglaló tanulmányokból is

tájékozódhatnak (FAO, 2004; Gilbert and Anklam, 2002). A hat legfontosabb mikotoxinra

kellően pontos és érzékeny; kromatográfiás, vagy immunkémiai technikákon alapuló

analitikai módszerek állnak rendelkezésre. Ezen túlmenően, azonban a közelmúltban számos

új analitikai módszer is megjelent: fluoreszcencia-polarizációs próba, MIP (molecular

imprinted polymers) használata, infravörös spektroszkópia, kapilláris elektroforézis, felszíni

plazmon-rezonancia bioszenzorok, vékonyréteg-kromatográfia (TLC), HPLC, és

gázkromatográfia (GC).

3

A mikotoxin analitika területén jelenleg elérhető ELISA kitek mindegyike egy időben csupán

egyetlen mikotoxint képes kimutatni (Magan and Olsen, 2004). Ugyanakkor a legutóbbi öt

évben a mikotoxin co-infekciókat leíró publikációk tanúsága alapján, a multiplex vizsgálatok

iránti igény nyilvánvalóan növekszik (Sulyok et al., 2007). A multi-mikotoxinos (több

mikotoxin egyidejű megjelenése) környezet súlyosabb és komplexebb egészségügyi

kockázatot és kihívást jelent, ezért a multi-mikotoxin szennyezések szélesebb körű és

alaposabb megfigyelése vált szükségessé. Az elmúlt évtizedben LC-MS/MS technológia

gyors fejlődésének köszönhetően a több mikotoxin egyidejű azonosítása felgyorsult. A

műszeres háttér fejlődése természetesen magával vonta a mintaelőkészítés javulását,

egyszerűsödését is (Berthiller et al., 2014). Született egy rövidítés a; QuEChERS; amely a

LC-MS/MS-hez kapcsolódó; gyors, egyszerű, olcsó, hatékony, robusztus és biztonságos minta

előkészítés rövidítése (Berthiller et al., 2014). Jelenleg a multi-mikotoxin analízisre alkalmas

tesztek leginkább a növényi termékekre koncentrálnak.

A vizsgálatok elvégzésére a jövőben az egyik legmegfelelőbb módszer a több mikotoxin

egyidejű analízisére alkalmas, kompetitív multiplex mikrogyöngy rendszer lehet. Az első, öt

mikotoxin szimultán analízisére képes áramlási citometriás mikotoxin esszé 2008-ban a

Budapesten rendezett sejtanalitikai világkongresszuson (ISAC; Czeh et al.; 2008) került

bemutatásra. Hasonló, kompetitív mikrogyöngy esszét, közölt Anderson 2010-ben, amely két

mikotoxin párhuzamos vizsgálatát tette lehetővé (Anderson et al., 2010). Ezek után 2011-ben

Peters és kollégái is bemutatták az általuk kidolgozott közvetett gátláson alapuló, hat

mikotoxint vizsgáló rendszert, amely a Luminex (Austin, TX, USA) áramlási citométerére lett

kidolgozva (Peters et al., 2011). Peters rendszerében karboxil funkciós csoporttal rendelkező

mágneses mikrogyöngyöket alkalmaz (x-MAP MultiAnalyte platform), ezzel könnyítve meg

a mosási lépések elvégzését. Az igazi válasz a világméretű multi-mikotoxin kihívásra 2011-

ben érkezett meg; amikor az előzetesen már publikációkban ismertetett, hat mikotoxin

szimultán analízisére alkalmas mikrogyöngy alapú multiplex esszé, kereskedelmi

forgalomban elérhetővé vált (Czeh et al., 2012).

A mikotoxikológia eltökélten küzd azért, hogy „kiszorítsa” az emberi egészségre veszélyt

jelentő mikotoxinokat az élelmiszer-lánc egészéből, hiszen a széles körben elterjedt

szántóföldi hatást gyakran követi a mikotoxinok táplálékláncban történő megjelenése (bio-

transzfer), eljutva egészen az emberig (Fink-Gremmels, 1999; Peraica et al., 1999; Plestina et

al., 1990; Wild and Gong, 2010). A mikotoxinok eljuthatnak (bio-transzfer) az emberhez

közvetlenül, szennyezett gabona termékek fogyasztásával, vagy közvetett módon, olyan állati

eredetű élelmiszer fogyasztásával, melyekben előzetesen mikotoxin halmozódott fel. Az

4

emlős, és emberi minták vizsgálatára jelenleg rendelkezésre álló ELISA módszer - a

gabonavizsgálatokban alkalmazott kitekhez hasonlóan - egyidejűleg egyetlen mikotoxin

kimutatására alkalmas (Magan and Olsen, 2004).

A mikotoxinok mennyiségének csökkentésére jelenleg az alábbi négy módszer mutatja a

legbiztatóbb eredményeket: (1) a mikotoxinok bontására környezetbarát enzimekkel (2) a

mikotoxinokat irreverzibilisen kötő ágensek kifejlesztése, melyek a maszkolt mikotoxinok

keletkezését segítik elő, vagy blokkolják a toxinok felszívódását, (3) mikotoxin rezisztens

vetőmagok nemesítése (4) a betakarítás/szállítási/tárolás technológiájának fejlesztése annak

érdekében, hogy megakadályozzuk a gombák elszaporodását a terményekben.

A kompetitív fluoreszcens immunoassay (CFIA) multiplex rendszer kiválóan alkalmas a

mikotoxikológiában legutóbb felmerült két kihívás megválaszolásában; az egy azonos gomba

által termelt (1) több különféle mikotoxin gyakori együttes detektálásában és a (2) nagyszámú

maszkolt mikotoxin változat elkülönítésében. A végső cél, a MycoEpi elnevezésű; megelőző

stratégián alapuló, mikotoxin-orientált epidemiológiai megközelítés bevezetése. A MycoEpi a

jövőben alkalmas lehet a globális kockázati zónák előrejelzésére, a mikotoxinnal szennyezett

gabonák kiszűrésére és megsemmisítésre, még azok élelmiszerláncba történő bekerülése előtt,

illetve a bio-transzfer folyamatok detektálására.

2. FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ

MEGKÖZELÍTÉSE

2012-ben, a világ népessége több mint 7 milliárd fő volt (Worldometers, 2012). Ugyanakkor a

FAO 2009-es jelentése szerint, a népesség 2050-re, elérheti a 9,3 milliárd főt. Ezért az

emberiségnek az elkövetkező 35 évben 70 %-kal több élelmiszert kell előállítani ahhoz, hogy

élelmezni tudja a föld lakosságát (FAO - Economic and Social Development Department.,

2008). Ezen tény a mennyiségi növekedés mellett ráirányítja a figyelmet a mikotoxinmentes

élelmiszerek előállítására. Problémát jelent továbbá, hogy jelenleg a világ gabonatermesztése

erősen központosított, kevesebb, mint 10 régió rendelkezik jelentős nemzetközi szállítási és

kereskedelmi kapacitásokkal.

A dolgozat egyik célja a több mikotoxin egyidejű vizsgálatra alkalmas módszer

kidolgozásával hozzájárulni ahhoz, hogy a szennyezett élelmiszerek miatt, kialakuló

potenciális katasztrófák elkerülhetőek legyenek. Ennek egyik lehetséges útja a minták

szűrése, a szennyezett tételek megsemmisítése; elkerülve ezzel a szennyezett élelmiszer

fogyasztásából adódó toxikózist. A szállítási problémák tovább súlyosbíthatják a fennálló

problémát, hiszen a szállítás során újabb mikotoxinok jelenhetnek meg, multi-mikotoxin

5

szennyezést idézve elő a szállított gabonákon, vagy egyéb terményeken. A CFIA multiplex

rendszer lehetővé teszi az egészségügyi kockázatok beazonosítását, és segít megakadályozni a

fertőzött gabonák bejutását a globális élelmiszerláncba. A tervezett módszer alkalmas a

szennyezett tételek kiszűrésére keletkezzen a toxikózis akár a szántóföldön, akár a

szállítás/raktározás során.

Jelen tézis kettő fontosabb hipotézis alapú megközelítés köré szerveződött. Az alább

ismertetett elemek mögött álló egyszerű megoldások célja, együtt erősíteni a mikotoxin

monitoring rendszert. A tervezés és a tesztelés során arra összpontosítottunk, hogy a XXI.

század elvárásainak megfelelő, kellően robosztus rendszert dolgozzunk ki multi-mikotoxinos

minták analízisére.

2.1. A probléma hipotézis alapú megközelítése

(a) A mikrogyöngy esszé kiváló kötési kinetikai adottságainak kiaknázása egy gyors és

költséghatékony multiplex mikrogyöngy rendszer fejlesztésére; a CFIA illesztése az analitkai

rendszerbe.

(b) Műszer-független kersztkalibrációs eljárás (IICC) fejlesztése az esszé rendszer, különböző

áramlási citométereken történő teljes kompatibilitásának biztosítására.

A jövőben a két fent említett elem összekapcsolása révén egy komplex mikotoxin monitoring

rendszert, a myco-epidemiológia (MycoEpi) válik elérhetővé. A MycoEpi egy integrált,

átfogó kockázatkezelési megközelítés a globális élelmiszer-lánc védelmére, mely a

hagyományos empirikus epidemiológia alapelvein nyugszik, ugyanakkor integrálja XXI.

századi biotechnológiát és telemetriát.

Jelen megközelítés a kockázatértékelés támogatásán keresztül jelentősen növelheti a

kapcsolódó egészségpolitikai döntések hatékonyságát. Hiszen a javasolt rendszer komplex

élelmiszer biztonsági kockázatelemzést kínál; számszerűsíthető kockázatot jósolt, amely nagy

jelentőséggel bír az egyének vagy a társadalom szintjén is; mindenütt ahol megjelennek multi-

mikotoxin szennyezések (European Commission, 2002; Merrill, 1997).

Elsőszámú cél, egy robosztus analitikai módszer kifejlesztése és globális hozzáférés

biztosítása a több toxinnal szennyezett minták méréséhez megfizethető áron. A második

célkitűzés, jól alkalmazható, egységes protokoll kidolgozása a különböző áramlási

citométerek fluoreszcens kalibrálására, amely lehetővé teszi, hogy a mérések során kapott

eredmények összevethetőek legyenek.

6

Az "egy penész – egy mikotoxin" hipotézis megdöntése jelentős hatással volt az addig széles

körben elismert, egyetlen mikotoxin egyidejű mérésére alkalmas ELISA módszer

megítélésére. Ugyanis a több mikotoxinnal szennyezet, vagy maszkolt mikotoxin tartalmú

minták ELISA-val történő vizsgálatánál előfordulhatnak hamis, vagy nem megfelelő

eredmények. 2012 óta több olyan eredményt leíró publikáció jelent meg, melyben a kötött

mikotoxinok mellett másodlagos metabolitok is megtalálhatóak (Streit et al., 2013). Sajnos

több jelenlegi ELISA kit ilyen körülmények között az összes mikotoxin koncentrációt

“alulméri”, hiszen nem képes detektálni a mintában lévő maszkolt toxin mennyiségét. Új

vizsgálati módszerekre van szükség, mely képes a gabonák multi-mikotoxin

szennyeződésének azonosítására. Az általunk tervezett CFIA multi-mikotoxin esszé

lehetőséget teremt arra, hogy a maszkolt toxinok ellen kifejlesztett antitestek segítségével

kibővítsük a rendszert a maszkolt mikotoxinok mérésével. A terveink között szerepel egy

integrált kockázatértékelő stratégia kidolgozása (IRAS), ami magába foglalja az első két

célkitűzés eredményeit.

2.2. Alkalmazott stratégiák

A felmerült tudományos probléma megoldása, az alábbi ötlépéses stratégiával történt:

1. Mikrogyöngy alapú kompetitív fluoreszcens immunoassay fejlesztése nagy affinitású

monoklonális antitestek alkalmazásával. A mikrogyöngyök kínálta speciális kötési

kinetika kihasználása az ELISA analitikai paraméterit meghaladó immunoasssay

fejlesztésében.

2. A CFIA rendszerhez illeszkedő, egységes egy lépéses extrakciós eljárás kidolgozása,

amely lehetővé teszi a kiválasztott hat mikotoxin együttes kezelését/analízisét.

3. Spike-olt minták alkalmazásával (mivel nem létezik mind a hat vizsgálandó mikotoxint

egyidejűleg tartalmazó referencia minta) kidolgozni az esszé minősítéséhez szükséges

validációs protokollt, amivel bizonyítani lehet a párhuzamos minták statisztikai

azonosságát/megfelelőségét. Az alacsony méréstartományban szükséges érzékenység

biztosítása érdekében alapvető fontosságú a keresztreakciókból és a minta

extrahálásából adódó mátrixhatások csökkentése.

4. Kidolgozni a műszer-független keresztkalibrálási (IICC) protokollt, ami a CFIA

rendszer kompatibilitását hivatott biztosítani, a különböző áramlási citométereken. A

műszer-független minőségellenőrzés az analízis szoftver integráns részévé tehető.

7

5. Az FCAP Array szoftver hozzáigazítása a CFIA analitikai eljáráshoz. A

továbbfejlesztett szoftver kritikus elem, amely támogatja az analitikai platform

adatkezelését a MycoEpi és a bio-átviteli vizsgálatok egésze során.

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A fejlesztése során felhasznált anyagok és módszerek mindegyike azt a célt szolgálta, hogy

több mikotoxin egyidejű mérésére tervezett CFIA eljárás, a legkülönbözőbb mintaféleségek

(mátrixok) mikotoxin tartamának meghatározására alkalmas lehessen. A vizsgálati rendszer

végül az alábbi – egy, vagy több mikotoxint tartalmazó - mikotoxinforrásokra került

kidolgozásra: (1) a gabona, (2) az elsődleges biológiai testfolyadékok, mint a vér, vizelet és

nyál, (3) a testnedvek, szövetek és szervek; elsődleges vagy másodlagos bio-transzfer

források.

Multi-mikotoxin szennyezések detektálása CFIA módszerrel

Mivel a munka középpontjában módszerfejlesztés állt; a méréseket a kidolgozott reagensekkel

és protokollok alkalmazásával folytattuk el. Az összehasonlító vizsgálatokat különböző

gyártóktól származó, hét eltérő készüléken végeztük. Az adatgyűjtés minden esetben az

áramlási citométerek saját szoftverével történt. Az alkalmazott multiplex CFIA protokoll

részletei előzetesen publikálásra kerültek (Czeh et al., 2012). Az analízis szoftver módosításra

került oly módon, hogy a felhasználó az eredményeket egyszerű és átlátható módon tudja

értékelni. Az alkalmazott áramlási citométerek különbözőségei ellenére, az eredmények

egységes formátumban jönnek létre (Czeh et al., 2013).

Extrakciós protokoll növényi és állati mintákhoz

Egy kellően hatékony, robosztus, egylépéses extrakciós eljárás elengedhetetlen a sikeres

multi-mikotoxin rendszer kidolgozásában. A gabonára vonatkozó minta előkészítési protokoll

részletei korábban közlésre kerültek (Czeh et al., 2012). Az egységes extrakciós eljárásnak

kellően hatékonynak kell lennie ahhoz, hogy a mikrogyöngy rendszer a hat mikotoxin

mindegyéket megfelelő pontossággal, reprodukálható módón tudja meghatározni a

határértéket jelentő koncentrációnál. A táplálékláncba került mikotoxin minden esetben a bio-

transzfer folyamatok keretében haladnak a növényektől az állatok felé. Minden a dolgozatban

leírt állatkísérletnél, figyelembe vettük az Európai Bizottság ajánlásait (86/609 EEC)

(European Commission, 1986), ugyanakkor valamennyi kísérletet jóváhagyta a Kísérleti

Orvostudományi Kutatóintézet állatjóléti bizottsága.

8

A kifejlesztett módszerek ellenőrzése, validálási módszer kidolgozása, validálás

A CFIA mikotoxin vizsgálati módszer validálása során minden eljárást különböző

koncentrációtartományokban végrehajtottuk, a mintákat hat párhuzamosban vizsgáltuk, három

független ismétlésben. A vizsgálatok során alkalmazott minták toxinmentes extraktumok

spike-olásával készültek, így különbség tehető a kinyerési hatékonyság és a mátrix okozta

jelerősítés, jelcsökkentés között. A vizsgálatok során többek között az ISO standard 5725‐

5:1998 irányelv ajánlásai kerültek alkalmazásra (Gilbert és Anklam, 2002; Sulyok et al.,

2007; ISO, 1998)

Flow citometriás kereszt-kalibrálási protokoll kidolgozása

A hét áramlási citométer által képviselt funkcionális sokszínűség kezelésére egy átfogó és

univerzális multiplex platform protokollra volt szükség. Cél volt bebizonyítani; hogy nincsen

jelentős eltérés a vizsgálatba bevont készülékek között; nincsen akadálya a multi-mikotoxin

eredmények összehasonlításának (Czeh et al., 2013).

Analízis szoftver

Az analízis szoftver lehetővé teszi a különböző áramlási citométeren elvégzett mikotoxin

mérések kiértékelését. A szoftver módosítások célja az volt, hogy váljon a hat toxin

mindegyike egy időben mérhetővé/kezelhetővé. A CFIA analízishez szükséges valamennyi

algoritmus beépítésre került (ezek közül néhány az eredmények szakaszban részletezésre

kerül).

4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

CFIA felfogható az ELISA rendszereket leváltó multiplex mikrogyöngy rendszerként.

Szisztematikus fejlesztőmunka eredménye ez az analitikai rendszer, amely alkalmazza a XXI.

századi biotechnológia vívmányait a mikotoxinok vizsgálatára.

4.1. Továbbfejlesztett multiplex immunoassay

A 2000-es évek elején, az elérhető mikotoxin ellenes monoklonális antitestek megfelelőek

voltak ugyan az ELISA módszerekben történő alkalmazáshoz; azonban a multiplex esszé

elvárásainak nem feleltek meg.

9

1. ábra: A T-2 toxin kalibrációs görbéje a kompetitív rendszerekre jellemző, szigmoid görbe.

A kompetitív immunoassay-re jellemző kalibrációs görbe alakja szigmoid (lásd. 6. ábra). A

nagyobb affinitású reagensek alkalmazásával lehetőség nyílt a kalibrációs görbe lineáris

szakaszának kiszélesítésére (Barna-Vetro et al., 1994). A továbbfejlesztett multiplex

immunoassay több előnyös tulajdonsággal rendelkezik: (1) a multiplex rendszerekre jellemző,

aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatás lecsökkenthető (lásd. 2. ábra), és (2) elérhető, hogy

a hat mikotoxinra az EU által előírt határértékek a kalibrációs görbe középső, lineáris

szakaszára essenek (lásd. 2. ábra)

10

2. ábra: A nagy affinitású monoklonális antitestek alkalmazásával kidolgozott multiplex mikrogyöngy

rendszer hét standardpont alapján felvett kalibrációs görbéi Az EU által előírt határérték minden

esetben a görbe középső szakaszára esik

4.2. Egylépéses extrakciós eljárás

Az egylépéses extrakciós eljárás kidolgozásában jelentős know-how tapasztalat áll

rendelkezésre, amely elősegítette a cél elérését, hogy a kifejlesztett extrakciós eljárás váljék

kompatibilissá a multiplex esszé platformmal. Alapvető elvárás, az extrakciós eljárással

szemben, hogy legyen reprodukálható, függetlenül attól, hogy egyetlen, vagy akár hat

mikotoxin egyidejű kinyerése a cél.

11

3. ábra: Alflatoxin B1-től mentes termények jellemző fluoreszcens intenzitása.

1 = búza; 2 = kukorica; 3 = mungó bab; 4 = fehér csillagfürt; 5 = tavaszi árpa; 6 = csicseriborsó; 7

= kevert takarmány. Az első oszlop (0g/ml) mutatja a toxinmentes, míg az utolsó (2g/kg) az

élelmiszer alapanyagokra vonatkozó EU határértéket. Valamennyi termény jellemző MFI értéke a

határértéket jelentő “B” színt felett van.

Hét különböző, akkreditált laboratóriumban, referencia módszerrel előzetesen bevizsgált,

toxinmentes gabonamátrix került előkészítésre, és extrahálásra. Valamennyi mintát a hat

mikotoxin együttes vizsgálatára alkalmas CFIA rendszerrel vizsgáltuk (lásd, 3. ábra).

Figyelembe véve az EU által meghatározott határértékeket; a mintákkal párhuzamosan egy

toxinmentes és egy (élelmiszer alapanyagokra vonatkozó) határértéknek megfelelő aflatoxin

B1-et tartalmazó standard is mérésre került. A két standard mérésével kapott MFI értékeket

szaggatott vonal jelöli (A és B) a 3. ábrán. Az A és B vonal által határolt rész adja meg a

toxinmentes mintákra jellemző MFI tartományt. Analitikai szempontból a 6 vizsgált toxin

közül az aflatoxin B1 tekinthető a legproblematikusabbnak, ezért az erre vonatkozó

eredmények kerülnek itt bemutatásra. Az aflatoxin B1 határértéke a legalacsonyabb a vizsgált

mikotoxinok közül, így itt szükséges a legnagyobb érzékenység, itt lehet kritikus a minta

mátrixhatása is.

A 4. ábra tanúsága szerint a kidolgozott egylépéses eljárás a hét vizsgált növényi minta

egyikében sem szabadít fel olyan anyagokat a mátrixból, amelyek a mérés során fals pozitív

eredményeket okoznának a negatív mintákban. Hiszen mind a hét gabona esetében a kapott

MFI érték a toxinmentes és a határértéknek megfelelő standard MFI értéke között helyezkedik

el. A kidolgozott CFIA rendszerbe tartozó egyéb mikotoxinokra vonatkozó, hasonló

vizsgálatokat eredményei itt nem kerülnek közlésre.

12

4.3. Validációs eljárások spike-olt mintákkal; a módszer minősítése és statisztikai

értékelésére

A vizsgálandó hat mikotoxint egyidejűleg tartalmazó, minősített referencia anyag (CRM) nem

kapható, ezért a módszer érzékenységének bizonyítására más módszerre van szükség. Cél volt

demonstrálni, hogy a CFIA rendszer érzékenysége, valamennyi toxin esetében meghaladja a

hasonló ELISA-k érzékenységét. Szisztematikus munkával sikerült megszüntetni a multiplex

immunoassay-re jellemző, aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatást. A CFIA és az ELISA

rendszerek összehasonlításának eredményeit az 1. táblázat tartalmazza.

Mycotoxin MFI CV

%

LOD (µg/kg) ∆ (x)

Határérték

(µg/kg) CFIA ELISA

Aflatoxin B1 4177 1.7 0.12 1.00 8.3 2

Ochratoxin A 3866 1.6 1.63 5.00 3.1 5

Fumonisin B1 2278 2.0 45.85 222.00 4.8 2000

T-2 toxin 4511 2.4 32.50 35.00 1.1 300

Zearalenone 5113 2.3 1.89 10.00 5.3 100

DON 4598 2.2 87.80 200.00 2.3 1750

1. táblázat: A CFIA és ELISA rendszerek detektációs limit (LOD) értékeinek összehasonlítása.

Összehasonlítva CFIA teszt detektációs értékeit, az eredmények azt mutatják, hogy azok 1.1-

8.3-szor alacsonyabbak, mint a megfelelő ELISA rendszer jellemző értékei (1. táblázat). A

kidolgozott CFIA rendszer, összehasonlítva az ELISA módszerrel, két fontos előnnyel bír; az

egyik előny a lehetőség a hat mikotoxin párhuzamos mérésére; a másik a megnövekedett

érzékenység.

4.4. Műszer-független keresztkalibrálás - a CFIA platform alkalmazása különböző

áramlási citométereken

A műszer-független keresztkalibráláshoz (IICC) QuantiBRITE kalibrációs

mikrogyöngyrendszer került alkalmazásra, mellyel a vizsgált hét áramlási citométer mérési

paraméterei egymáshoz igazíthatóak. A hipotézis alapján a keresztkalibrálást követően egy

áramlási citométerektől független analízis szoftver alkalmas lehet a minőségbiztosítási

feladatok ellátására és a mérések kvantitatív értékelésre. A keresztkalibrálás eredményeit az 4.

ábra illusztrálja. A QuantiBRITE mikrogyöngyök segítségével elvégzett műszer-független

keresztkalibrálással két készülék szinkronizálása nem sikerült; az Accuri és a Luminex

melynek oka, hogy ezen két készüléknél nincsen lehetőség a PE jelerősítés módosítására.

13

Továbbá az Accuri felbontása 7 dekád, szemben a többi készülék jellemzően, 3-4 dekádos

felbontásával.

4 ábra: A QuantiBRITE mikrogyönggyel elvégzett műszer-független keresztkalibrálás eredményei.

4.5. A mikrogyöngy alapú rendszer dinamikájának jellemzése

Az itt bemutatott eredmények a CFIA rendszer előnyösebb kötési kinetikai tulajdonságaival

magyarázhatóak, ezért fontos az ELISA és CFIA módszerek kötési kinetikájának

összehasonlítása. Cél volt, mérni és összehasonlítani az antigén-PE konjugátum kötési

kinetikáját a mikrogyöngyök felületén található antitesttel, illetve az antitestek és az antigén-

enzim konjugátum jellemző kötési kinetikáját ELISA rendszerben. A vizsgálat során időről

időre megmértük a fehérje kötődéséből adódó átlagos fluoreszcencia-intenzitást (MFI)/optikai

denzitást (OD), ebből következtettünk a reakciókinetikára.

A két rendszerben mérhető jelek (OD az ELISA és MFI a CFIA esetén) összehasonlításához

egységes optikai skála kialakítása vált szükségessé, lásd 5. ábra. Az 5. ábra y-tengelyén ez az

egységesített optikai skála (EORU; equivalent optical reading units) került ábrázolásra. Az

EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális jelintenzitás értékét tekintjük 1 egységnek. Az

5. ábrán látható két görbe illusztrálja a különbséget a kompetitív immuntesztek kötési

kinetikái között. Jól látható, hogy a 45 percnél rövidebb inkubáció esetén jelentős

különbségeket mértünk. Tisztán látszik az is, hogy a CFIA rendszer esetében rövidebb

inkubációs idő alkalmazásával is értékelhető jelet kapunk. Feltételezésünk szerint, a gyorsabb

reakció egyik lehetséges oka hogy a CFIA estén az antitest/antigén kötések kialakulása

50

100

150

200

250

2,5 3 3,5 4 4,5 5

Csa

torn

asz

ám

(P

E c

sato

rná

ba

n)

A mikrogyöngyök felületén lévő átlagos PE molekulaszám (LOG)

Calibur

Array

Partec

Accuri

Guava

FC500

Luminex

14

gyorsabb, hiszen míg az ELISA esetében a reakció csupán a mikrotiter plate falára

korlátozódik, addig a CFIA esetében (a folyadékfázisban) ilyen jellegű gátlás nincsen.

Az ELISA és CFIA rendszerek kötési kinetikáját az alábbi egyenletek írják le: CFIA estén y =

0.1887ln(x) + 0.2367, R2=0.998 és ELISA estén y = 0.2677ln(x) - 0.1518, R

2=0.954. Az

egyenletek három független mérés eredményei alapján kerültek megállapításra. Minden

időpontnál ábrázoltuk a jellemző szórásértékeket is, melyekről megállapítható, hogy jelentős

eltéréseket nem tapasztaltunk; lásd 5. ábra.

5. ábra: A CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának összehasonlítása. Az y-tengelyen az EORU

(egységesített optikai skála) került ábrázolásra. Az EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális

jelintenzitást értékét tekintjük 1 egységnek.

y = 0.2677ln(x) - 0.1518

R² = 0.954

y = 0.1887ln(x) + 0.2367

R² = 0.9979

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0 10 20 30 40 50 60

EO

RU

Inkubációs idő (perc)

CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának

összehasonlítása

ELISA CFIA

15

6. ábra: A CFIA jellemző kötési kinetikája 15, 20 és 60 perces inkubáció után. Kör szimbólum jelöli a

tényleges, 12 időpont alapján kapott görbét. A négyzet és háromszög szimbólummal jelzett görbe a 4

és 5 pont alapján 45 percre jósolt MFI értékeket mutatja.

A hat lehetséges mikotoxin közül a DON kerül itt bemutatásra (lásd. 6. ábra). Az utolsó

fázisban a kiválasztott toxint inkubálva az MFI értékek kerültek rögzítésre 2, 5, 10 és 15

percnél. Ezt követően a kapott MFI értékekre a korábban számított egyenlet segítségével

görbét illesztettünk. A fenti protokollt kiegészítésre került a 20 percnél mért MFI-t is

rögzítésével. Ez estben a görbeillesztés 5 időpont alapján történt meg. Összevetve a teljes

mérési sorral, jól látszik, hogy mind a 4, mind az 5 pont alapján jósolt görbe jól közelít a

tényleges görbéhez.

4.6. A CFIA analitikai rendszer alkalmazása emlős minták vizsgálatára

A CFIA rendszer adaptálása állati minták multi-mikotoxin tartalmának meghatározásához

folyamatban van. Laboratóriumi modellállaton (patkány) elvégzett zearalenon (ZEA) etetési

kísérletek után a begyűjtött vérplazma mikotoxin tartalmát vizsgáltuk (lásd 7. ábra).

1800

2300

2800

3300

3800

4300

4800

5300

5800

0 10 20 30 40 50 60

MF

I

Inkubációs idő (perc)

CFIA rendszer kötési kinetikája

4 időpont

5 időpont

Mért érték

16

7. ábra: Vérplazma ZEA koncentrációk. A mikotoxin koncentrációt 3 napos ZEA etetési kísérletben

kezelt, ivarérés előtti nőstény patkányok vérplazmájában mértük CFIA rendszerrel. A vérben a mért

ZEA koncentráció dózisfüggő növekedést mutatott, követve az orálisan bevitt mennyiségeket.

Az eredmények arra utalnak, hogy a kidolgozott vizsgálati eljárás alkalmas lehet az állati

minták mikotoxin tartalmának meghatározására. A testreszabott FCAP Array analízis szoftver

rendelkezik azokkal az algoritmusokkal, amelyek alkalmassá teszik mind a növényi és állati

eredetű minták multiplex méréseinek kezelésére (lásd 2. táblázat).

Szoftver jellemzők Vizsgált mikotoxinok

AB1 OTA FB1 T-2 ZEA DON

1 EU határértékek (g/kg) 2 5 1400 300 100 1250

2 Nemzeti, vagy regionális határok

kiválasztása megvalósítható

3 Gyermek/felnőtt/állati felhasználás

4 Görbe standardjainak száma 6 6 6 6 6 6

5 Mikotoxinok számának korlátozása nem nem nem nem nem nem

6 Logaritmikus skála alkalmazása igen igen igen igen igen igen

Table 2: Speciális analízis szoftver multi-mikotoxinos minták CFIA vizsgálatára

5. ÚJ EREDMÉNYEK

A kutatás célja több mikotoxin egyidejű analízisére alkalmas analitikai módszer fejlesztése

volt, mellyel a szennyezett gabonák kiszűrhetőek az élelmiszerláncból továbbá az élelmiszer

és/vagy takarmányminták mikotoxin vizsgálatának költsége csökkenthető. Munkánk során

17

igyekeztünk ötvözni a múlt innovatív megoldásait és a XXI. század biotechnológiájának

forradalmi újdonságait.

(1) Elsőként fejlesztettünk ki és publikáltunk a mikotoxinok mérésére szolgáló,

mikrogyöngy alapú multiplex mikroanalitikai eljárást. Kompetitív fluoreszcens

mikrogyöngy (CFIA) alapú áramlás citometriás analitikai módszert fejlesztettünk ki hat

mikotoxin gabonamintákból történő egyidejű kvantitatív analízisére. A kidolgozott

rendszert kereskedelmi forgalomba hozható termékké fejlesztettük.

A korábban publikált eljárások módosításával kidolgoztuk a CFIA módszerhez

szükséges fluoreszcens (PE) konjugátumok, és antitesttel jelölt mikrogyöngyök

előállítását. Optimalizáltuk a kifejlesztett rendszert, bizonyítottuk, hogy a kidolgozott

PE/antitest kötési módszer nem befolyásolja az antitestek antigén felismerő/kötő

képességét. Igazoltuk hipotézisünket, miszerint a CFIA és ELISA rendszerek elérő

kötési kinetikával rendelkeznek, melynek eredményét reakciósebességben és

érzékenységben láthatjuk. Bizonyítottuk, hogy a kifejlesztett mikrogyöngy alapú CFIA

érzékenysége, jelentősen meghaladja a mikotoxikológiában eddig alkalmazott ELISA

módszerek jellemző adatait. Igazoltuk, hogy a kidolgozott CFIA rendszer minden

alkotórésze több hónapon keresztül megőrzi minőségét.

(2) Műszer-független kereszt-kalibrálási (IICC) eljárás került kidolgozásra hét különböző

áramlási citométerre; a kifejlesztett fluoreszcencia alapú CFIA mennyiségi analízis

segítésére. Bizonyítottuk, hogy az új IICC eljárás alkalmazásával a különböző

készülékeken végzett multi-mikotoxin mérések eredményei megegyeznek.

(3) Kidolgoztunk egy egységes egylépéses extrakciós eljárást, mellyel a hat mikotoxin

együttes extrakciója elvégezhető. Az új extrakciós eljárás kombinálva az IICC

eljárással; lehetőséget teremtett az új analitikai vizsgálati platform kidolgozására.

(4) A már létező analitikai szoftvert speciális funkciókkal egészítettük ki, ami kompenzálja

a különböző készülékek közötti eltéréseket; mintakezelést, lézereket. Az új szoftver

megkönnyíti a multi-mikotoxin mérések elvégzését, kiértékelését azzal, hogy

tartalmazza az alkalmazandó vizsgálati protokoll részleteit, a standard pontok

koncentrációját és a különböző régiókra vonatkozó határértékeket.

(5) CFIA rendszer alkalmassá tettük állati minták mikotoxin tartalmának analízisére, és

ezzel együtt a bio-transzfer nyomon követésére is a teljes élelmiszerláncban. A

zearalenon mikotoxin állati mintákból történő mennyiségi méréséhez az irodalomban

elsőként alakítottunk ki mérési protokollt

18

(6) A kidolgozott, klinikai potenciállal is rendelkező analitikai rendszer (MycoEpi) jövőbeli

bevezetését javasoljuk. MycoEpi stratégia alkalmas lehet az átfogó egészségügyi

kockázatbecslésre, kezelésre. Segítségével a mikotoxin szennyezések nyomon

követhetőek a szántóföldtől, a mikotoxin élelmiszerláncon keresztüli mozgásán át,

egészen ez emberig.

6. EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA

Napjainkban a fejlett országok élelmiszer kínálata mikotoxikológiai szempontból sokkal

biztonságosabbnak tekinthető, mint amilyen a XX. század végén volt. Azonban továbbra is

jelentős kihívások és teendők várnak ránk az élelmiszerlánc egészét illetően. Mostanra

bebizonyosodott, hogy a jövőben csak a multidiszciplináris megközelítés szavatolhatja a

globális élelmiszer-ellátás biztonságát. MycoEpi segítségével nagy lépést tehetünk a globális

mikotoxin toxikózisok kialakulása ellen. A multi-mikotoxin szennyezések nyomon

követésére, vizsgálatára az egyik legalkalmasabb módszer lehet az általunk kidolgozott CFIA

rendszer. Amely ugyanakkor – a MycoEpi-vel kombinálva - alkalmas a növénytermesztési

technikák, a mikotoxin kötési és bontási módszerek hatékonyságának nyomon követésére is.

19

7. REFERENCIÁK

1. Anderson,G.P., Kowtha,V.A. and Taitt,C.R., 2010. Detection of fumonisin b1 and ochratoxin a

in grain products using microsphere-based fluid array immunoassays. Toxins. (Basel) 2, 297.

2. Barna-Vetro,I., Gyongyosi,A. and Solti,L., 1994. Monoclonal antibody-based enzyme-linked

immunosorbent assay of Fusarium T-2 and zearalenone toxins in cereals. Appl. Environ.

Microbiol. 60, 729.

3. Berthiller,F., Burdaspal,P.A., Crews,C., Iha,M.H., Krska,R., Lattanzio,V.M.T., MacDonald,S.,

Malone,R.J., Maragos,C.M., Solfrizzo,M., Stroka,J. and Whitaker,T.B., 2014. Developments in

mycotoxin analysis: An update for 2012-2013. World Mycotoxin Journal 7, 3.

4. Czeh,A., Torok,L., Torok,T., Siklodi,B., Lustyik,G. Development of competitive multiplexed

microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food and feed

products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008. - Oral Presentation

5. Czeh,A., Mandy,F., Feher-Toth,S., Torok,L., Mike,Z., Koszegi,B. and Lustyik,G., 2012. A flow

cytometry based competitive fluorescent microsphere immunoassay (CFIA) system for detecting

up to six mycotoxins. J. Immunol. Methods 384, 71.

6. Czeh,A., Schwartz,A., Mandy,F., Szoke,Z., Koszegi,B., Feher-Toth,S., Nagyeri,G., Jakso,P.,

Katona,R.L., Kemeny,A., Woth,G. and Lustyik,G., 2013. Comparison and evaluation of seven

different bench-top flow cytometers with a modified six-plexed mycotoxin kit. Cytometry A 83,

1073.

7. European Commission. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the

approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States

regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes . L 358,

0001-0028. 12-18-1986. Official Journal .

Ref Type: Report

8. European Commission. Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the

Council of 28 January2002 laying down the general principles and requirements of food law,

establishing the European Food SafetyAuthorityand laying down procedures in matters of food

safety. L31. 2-1-2002. Official Journal of the European Communities.

Ref Type: Report

9. FAO, 2004. Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. FAO, Food and

Nutrition Paper No. 81.

10. FAO - Economic and Social Development Department., 2008. The State of Food Insecurity in

the World, 2008: High food prices and food security - threats and opportunities". Food and

Agriculture Organization of the United Nations.

11. Fink-Gremmels,J., 1999. Mycotoxins: their implications for human and animal health. Vet. Q.

21, 115.

12. Gilbert,J. and Anklam,E., 2002. Validation of analytical methods for determining mycotoxins in

foodstuffs. Trends Anal. Chem. 21.

20

13. Horwitz,W., 2000. Natural Toxins. In: Official Methods of Analysis of AOAC International.

[AOAC International., Gaithersburg, USA].

14. ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Alternative

methods for the determination of the precision of a standard measurement method. 1998.

Ref Type: Report

15. Liu,Y. and Wu,F., 2010. Global burden of aflatoxin-induced hepatocellular carcinoma: a risk

assessment. Environ. Health Perspect. 118, 818.

16. Magan,N. and Olsen,M., 2004. Mycotoxins in Food: Detection and Control. Woodhead Pub..

17. Merrill,R.A., 1997. Food safety regulation: reforming the Delaney Clause. Annu. Rev. Public

Health 18, 313.

18. Peraica,M., Radic,B., Lucic,A. and Pavlovic,M., 1999. Toxic effects of mycotoxins in humans.

Bull. World Health Organ 77, 754.

19. Peters,J., Bienenmann-Ploum,M., de,R.T. and Haasnoot,W., 2011. Development of a multiplex

flow cytometric microsphere immunoassay for mycotoxins and evaluation of its application in

feed. Mycotoxin. Res 27, 63.

20. Plestina,R., Ceovic,S., Gatenbeck,S., Habazin-Novak,V., Hult,K., Hokby,E., Krogh,P. and

Radic,B., 1990. Human exposure to ochratoxin A in areas of Yugoslavia with endemic

nephropathy. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 10, 145.

21. Rahmani,A., Jinap,S. and Soleimany,F., 2009. Qualitative and Quantitative Analysis of

Mycotoxins. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 8, 202.

22. Reddy,L. and Bhoola,K., 2010. Ochratoxins-food contaminants: impact on human health.

Toxins. (Basel) 2, 771.

23. Streit,E., Schwab,C., Sulyok,M., Naehrer,K., Krska,R. and Schatzmayr,G., 2013. Multi-

mycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and

feed ingredients. Toxins. (Basel) 5, 504.

24. Sulyok,M., Berthiller,F., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2006. Development and validation of a

liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39

mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649.

25. Sulyok,M., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2007. Application of a liquid chromatography-

tandem mass spectrometric method to multi-mycotoxin determination in raw cereals and

evaluation of matrix effects. Food Addit. Contam 24, 1184.

26. Wild,C.P. and Gong,Y.Y., 2010. Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health

issue. Carcinogenesis 31, 71.

27. Worldometers. Worldometers.info. Retrieved . 4-12-2012.

Ref Type: Electronic Citation

21

8. KÖZLEMÉNYEK

Értekezés alapjául szolgáló közlemények

1. Czeh A, Schwartz A, Mandy F, Szoke Zs, Koszegi B, Feher-Toth S, Nagyeri Gy, Jakso P,

Katona LR, Kemeny A, et al. Comparison and Evaluation of Seven Different Bench-Top

Flow Cytometers With a Modified Six-Plexed Mycotoxin Kit. Cytometry: Part A 2013.

IF: 3.711; Citations: 0

2. Czeh A, Mandy F, Feher-Toth S, Torok L, Mike Z, Koszegi B, Lustyik G. A Flow

Cytometry Based Competitive Fluorescent Microsphere Immunoassay (CFIA) System for

Detecting Up to Six Mycotoxins. J Immunol Methods 2012;384:71-80.

IF: 2.203; Citations: 9

3. Kriszt R, Krifaton C, Szoboszlay S, Cserhati M, Kriszt B, Kukolya J, Czeh A, Feher-Toth

S, Torok L, Szoke Z, et al. A New Zearalenone Biodegradation Strategy Using Non

Pathogenic Rhodococcus Pyridinivorans K408 Strain. PLoS One 2012;7:e43608.

IF: 4.092; Citations: 7

Értekezés témájában megtartott előadások

1. Czeh A, Torok L, Torok T, Siklodi B, Lustyik Gy. Development of competitive

multiplexed microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food

and feed products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008.

Értekezés témájában bemutatott poszterek

1. Czeh A, Torok L, Gorombey P, Torok T, LantosE, Lustyik Gy. Development of Flow

Cytometric Multiplexed Microbead Assay for Detection of Mycotoxin Contamination.

Regional Biophysics Conference, Balatonfüred, Hungary, 2007.

2. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy. Development and validation of

Multiplexed Microbead Assay for Detection of six different Mycotoxins in feed. CYTO

Congress, Seattle, Washington, USA, 2010.

3. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy. Side by side Comparison Between the

Traditional ELISA and the New Fungi-Plex6 Microbead Assay (MA) for Detection of six

Mycotoxins. World Mycotoxin Forum, Amsterdam, Holland, 2010.

22

4. Czeh A, Toth Sz, Mike Z, Koszegi B, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry is Reaching

New Horizons In Disease Prevention: An Illustration How A Multiplexed Mycotoxin Kit

Performs Using Several Types of Instrument with Either Analog or Digital Signal

Processing. CYTO Congress, Baltimore, Maryland, USA, 2011.

5. Czeh A, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry Based Myco-Epidemiology has Potential

Impact on Mycotoxin outbreaks and Health: A Largely Ignored Global Concern A

Harmonized Approach to Preventive Medicine. ESCCA Congress, Dublin, Ireland, 2011.

6. Székács A, Bánáti H, Czéh Á, Tóth Sz, Juracsek J, Darvas B, Székács I, Lustyik Gy.

Detection of environmental and food contaminant mycotoxins with polymeric bead-based

immune-detection in a multiplexed flow cytometry assay format. The 4th

Annual NanoScience Technology Symposium, Miami, Florida, USA, 2011.

7. Czeh A, Feher-Toth Sz, Szoke Zs, Ferenczi Sz, Kriszt, R, Nagyeri Gy, Mandy F, Kovacs

KJ, Lustyik Gy, A Microbead Assay Platform for the Detection of Zearalenone from rat

blood and brain tissue. CYTO Congress, Leipzig, Germany, 2012.

8. Fehér-Tóth Sz, Kukolya J, Czéh Á, Török L, Lustyik Gy. A new fluorescent microsphere

based assay for studying Aflatoxin B1 biodegradation by flow cytometry CYTO Congress,

Leipzig, Germany, 2012.

Egyéb közlemények

1. Beres A, Lelovics Z, Antal P, Hajós G, Gézsi A, Czeh A, Lantos E, Major T. "Does

happiness help healing?" Immune response of hospitalized children may change during

visits of the Smiling Hospital Foundation's Artists. Orv Hetil. Oct 23; 152(43):1739-

44.2011.

Összesített impakt faktor: 9,7 Független hivatkozások száma: 13