Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Mikrogyöngy alapú multiplex immunoassay rendszer fejlesztése
multi-mikotoxin vizsgálatra: Túl a XX.
századi alkalmazásokon
Czéh Árpád
Soft Flow Hungary Kft.
K+F Laboratórium
Témavezető:
Dr. Lustyik György
Doktori Iskola: Interdiszciplináris Orvostudományok Doktori Iskola D93
Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Sümegi Balázs
Program: B-130; Funkcionális fehérje dinamika vizsgálata
biofizikai módszerekkel
Programvezető: Prof. Dr. Nyitrai Miklós
Pécsi Tudományegyetem,
Általános Orvostudományi Kar,
Biofizikai Intézet
Soft Flow Hungary
Kutató Fejlesztő Kft.
Pécs, 2014
1
TARTALOMJEGYZÉK
1. BEVEZETÉS ................................................................................................................................... 1
2. FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ MEGKÖZELÍTÉSE ................. 4
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................................... 7
4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................ 8
5. ÚJ EREDMÉNYEK ...................................................................................................................... 16
6. EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA ............................................................................................ 18
7. REFERENCIÁK ........................................................................................................................... 19
8. KÖZLEMÉNYEK ......................................................................................................................... 21
1. BEVEZETÉS
A mikotoxinokat termelő penészgombák, a mezőgazdasági termények széles skáláját
fertőzhetik meg a betakarítás előtti és utáni időszakban. 1960 fontos dátum a
mikotoxikológiában; ekkor érkezett ugyanis az Egyesült Királyságba egy szállítmány
földimogyoró, mely a szállítás során gombás fertőzést szenvedett. Ez a földimogyoró végül
állati takarmányként került felhasználásra, később ugyanez a földimogyoró okozta 100.000
pulyka pusztulását. A mintában egy, gombák által termelt toxikus anyagot, az aflatoxint
sikerült kimutatni. Az aflatoxinok felfedezésével kezdetét vette a mikotoxinok körültekintő,
alapos és szervezett kutatása. Ennek köszönhetően mostanra több mint 300 eltérő szerkezetű
mikotoxint azonosítottak, melyek a világ minden táján kiemelt figyelmet kapnak, mint az
emberi és állati egészségre veszélyt jelentő ágensek. A legkülönbözőbb penészgombafajok
által megfertőzött gabonák gyakran jelentős mennyiségű mikotoxint tartalmaznak. A
mikotoxinok különböző mikroszkópikus gombák alacsony-móltömegű, másodlagos
anyagcseretermékei, melyek az egyszerű terményekből kiindulva a táplálékláncon
keresztüljutva jelentős veszélyt jelenthetnek az álatokra, és az emberre is, hiszen bizonyítottan
számos súlyos akut, valamint krónikus megbetegedés kialakulásához vezethetnek. A Food
and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), felmérése szerint a világ
élelmiszertermelésének 2050-ig meg kell kétszereződnie. Az élelmiszer-termelés, ilyen
drámai növekedéséhez a következő 35 évében innovatív megoldásokra lesz szükség, melyek
segítségével elérhetjük, illetve megőrizhetjük az állati és/vagy emberi fogyasztásra kerülő
gabonák toxinmentességét világszerte.
A legfontosabb világszerte előforduló mikotoxinok: aflatoxinok, ochratoxin A, fumonizinek,
deoxinivalenol, zearalenon, és a T-2. Mikotoxinok széleskörű megjelenésével, elterjedésével a
2
számukra optimális pára- és a hőmérsékletviszonyok mellett kell számolni (Rahmani et al.,
2009). A mikotoxinok okozta kóros elváltozások az azonnali emésztési problémáktól, az
endokrin rendellenességeken és a csökkent immunitáson keresztül, egészen a
karcinogén/teratogén hatásokig terjedhetnek (Liu és a Wu, 2010; Reddy and Bhoola, 2010). A
bizonyítottan mikotoxinok okozta egészségügyi problémák, kockázatok és a társadalmi-
gazdasági jellegű tényezők indokolták a szabályozások és a mikotoxinokra vonatkozó
határértékek megalkotását, és bevezetését. Időközben az Európai Közösség és a Food and Drug
Administration (FDA, USA) meghatározta a mikotoxinok megengedhető maximális szintjét a
hat, legfontosabb mikotoxinra élelmiszer és takarmányminták esetén. Határértékkel
szabályozott mikotoxinok köre időről időre bővül. 2003 végére mintegy 100 országban került
kialakításra monitoring rendszer, az élelmiszerekben és takarmányokban fellelhető;
határértéket meghaladó mennyiségű mikotoxinok kimutatására (FAO, 2004).
A takarmányok és az élelmiszerek mikotoxin tartalmának meghatározáshoz, valamint a
kapcsolódó kockázatértékeléshez alkalmas analitikai módszerekre van szükség. Az
immunoassay technológia az 1950-es évek közepén született, és már az 1980-as évekre széles
körben alkalmazott módszerré vált. Az ELISA módszer a mikotoxin vizsgálatok terén is
gyorsan közkedveltté vált, ennek köszönhetően már az 1990-es évek közepe óta a legtöbb
fejlett országban alkalmaznak - erre akkreditált analitikai laboratóriumokban - kompetitív
ELISA módszert a mikotoxinok kimutatására (Barna-Vetro et al., 1994). Az Analitikai
Vegyészek Szövetsége (Association of Official Analytical Chemists (AOAC)) és az Európai
Szabványügyi Bizottság (European Standardization Committee (CEN)) számos
szabványosított mikotoxin analitikai módszert tett közzé. Módszereiket laborközi
összehasonlító vizsgálatok keretében validálták. A módszerek elfogadottsága, így az
összehasonlító vizsgálatokban résztvevő laborok száma évről évre egyre nő. Az AOAC által
elismert, hivatalos módszereket leíró tanulmányának (Horwitz, 2000) legújabb kiadása
körülbelül 40 validált mikotoxin analtikai módszert tartalmaz. A felhasználók a módszerek
részleteiről, előnyeiről és alkalmazásáról a megjelent; összefoglaló tanulmányokból is
tájékozódhatnak (FAO, 2004; Gilbert and Anklam, 2002). A hat legfontosabb mikotoxinra
kellően pontos és érzékeny; kromatográfiás, vagy immunkémiai technikákon alapuló
analitikai módszerek állnak rendelkezésre. Ezen túlmenően, azonban a közelmúltban számos
új analitikai módszer is megjelent: fluoreszcencia-polarizációs próba, MIP (molecular
imprinted polymers) használata, infravörös spektroszkópia, kapilláris elektroforézis, felszíni
plazmon-rezonancia bioszenzorok, vékonyréteg-kromatográfia (TLC), HPLC, és
gázkromatográfia (GC).
3
A mikotoxin analitika területén jelenleg elérhető ELISA kitek mindegyike egy időben csupán
egyetlen mikotoxint képes kimutatni (Magan and Olsen, 2004). Ugyanakkor a legutóbbi öt
évben a mikotoxin co-infekciókat leíró publikációk tanúsága alapján, a multiplex vizsgálatok
iránti igény nyilvánvalóan növekszik (Sulyok et al., 2007). A multi-mikotoxinos (több
mikotoxin egyidejű megjelenése) környezet súlyosabb és komplexebb egészségügyi
kockázatot és kihívást jelent, ezért a multi-mikotoxin szennyezések szélesebb körű és
alaposabb megfigyelése vált szükségessé. Az elmúlt évtizedben LC-MS/MS technológia
gyors fejlődésének köszönhetően a több mikotoxin egyidejű azonosítása felgyorsult. A
műszeres háttér fejlődése természetesen magával vonta a mintaelőkészítés javulását,
egyszerűsödését is (Berthiller et al., 2014). Született egy rövidítés a; QuEChERS; amely a
LC-MS/MS-hez kapcsolódó; gyors, egyszerű, olcsó, hatékony, robusztus és biztonságos minta
előkészítés rövidítése (Berthiller et al., 2014). Jelenleg a multi-mikotoxin analízisre alkalmas
tesztek leginkább a növényi termékekre koncentrálnak.
A vizsgálatok elvégzésére a jövőben az egyik legmegfelelőbb módszer a több mikotoxin
egyidejű analízisére alkalmas, kompetitív multiplex mikrogyöngy rendszer lehet. Az első, öt
mikotoxin szimultán analízisére képes áramlási citometriás mikotoxin esszé 2008-ban a
Budapesten rendezett sejtanalitikai világkongresszuson (ISAC; Czeh et al.; 2008) került
bemutatásra. Hasonló, kompetitív mikrogyöngy esszét, közölt Anderson 2010-ben, amely két
mikotoxin párhuzamos vizsgálatát tette lehetővé (Anderson et al., 2010). Ezek után 2011-ben
Peters és kollégái is bemutatták az általuk kidolgozott közvetett gátláson alapuló, hat
mikotoxint vizsgáló rendszert, amely a Luminex (Austin, TX, USA) áramlási citométerére lett
kidolgozva (Peters et al., 2011). Peters rendszerében karboxil funkciós csoporttal rendelkező
mágneses mikrogyöngyöket alkalmaz (x-MAP MultiAnalyte platform), ezzel könnyítve meg
a mosási lépések elvégzését. Az igazi válasz a világméretű multi-mikotoxin kihívásra 2011-
ben érkezett meg; amikor az előzetesen már publikációkban ismertetett, hat mikotoxin
szimultán analízisére alkalmas mikrogyöngy alapú multiplex esszé, kereskedelmi
forgalomban elérhetővé vált (Czeh et al., 2012).
A mikotoxikológia eltökélten küzd azért, hogy „kiszorítsa” az emberi egészségre veszélyt
jelentő mikotoxinokat az élelmiszer-lánc egészéből, hiszen a széles körben elterjedt
szántóföldi hatást gyakran követi a mikotoxinok táplálékláncban történő megjelenése (bio-
transzfer), eljutva egészen az emberig (Fink-Gremmels, 1999; Peraica et al., 1999; Plestina et
al., 1990; Wild and Gong, 2010). A mikotoxinok eljuthatnak (bio-transzfer) az emberhez
közvetlenül, szennyezett gabona termékek fogyasztásával, vagy közvetett módon, olyan állati
eredetű élelmiszer fogyasztásával, melyekben előzetesen mikotoxin halmozódott fel. Az
4
emlős, és emberi minták vizsgálatára jelenleg rendelkezésre álló ELISA módszer - a
gabonavizsgálatokban alkalmazott kitekhez hasonlóan - egyidejűleg egyetlen mikotoxin
kimutatására alkalmas (Magan and Olsen, 2004).
A mikotoxinok mennyiségének csökkentésére jelenleg az alábbi négy módszer mutatja a
legbiztatóbb eredményeket: (1) a mikotoxinok bontására környezetbarát enzimekkel (2) a
mikotoxinokat irreverzibilisen kötő ágensek kifejlesztése, melyek a maszkolt mikotoxinok
keletkezését segítik elő, vagy blokkolják a toxinok felszívódását, (3) mikotoxin rezisztens
vetőmagok nemesítése (4) a betakarítás/szállítási/tárolás technológiájának fejlesztése annak
érdekében, hogy megakadályozzuk a gombák elszaporodását a terményekben.
A kompetitív fluoreszcens immunoassay (CFIA) multiplex rendszer kiválóan alkalmas a
mikotoxikológiában legutóbb felmerült két kihívás megválaszolásában; az egy azonos gomba
által termelt (1) több különféle mikotoxin gyakori együttes detektálásában és a (2) nagyszámú
maszkolt mikotoxin változat elkülönítésében. A végső cél, a MycoEpi elnevezésű; megelőző
stratégián alapuló, mikotoxin-orientált epidemiológiai megközelítés bevezetése. A MycoEpi a
jövőben alkalmas lehet a globális kockázati zónák előrejelzésére, a mikotoxinnal szennyezett
gabonák kiszűrésére és megsemmisítésre, még azok élelmiszerláncba történő bekerülése előtt,
illetve a bio-transzfer folyamatok detektálására.
2. FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ
MEGKÖZELÍTÉSE
2012-ben, a világ népessége több mint 7 milliárd fő volt (Worldometers, 2012). Ugyanakkor a
FAO 2009-es jelentése szerint, a népesség 2050-re, elérheti a 9,3 milliárd főt. Ezért az
emberiségnek az elkövetkező 35 évben 70 %-kal több élelmiszert kell előállítani ahhoz, hogy
élelmezni tudja a föld lakosságát (FAO - Economic and Social Development Department.,
2008). Ezen tény a mennyiségi növekedés mellett ráirányítja a figyelmet a mikotoxinmentes
élelmiszerek előállítására. Problémát jelent továbbá, hogy jelenleg a világ gabonatermesztése
erősen központosított, kevesebb, mint 10 régió rendelkezik jelentős nemzetközi szállítási és
kereskedelmi kapacitásokkal.
A dolgozat egyik célja a több mikotoxin egyidejű vizsgálatra alkalmas módszer
kidolgozásával hozzájárulni ahhoz, hogy a szennyezett élelmiszerek miatt, kialakuló
potenciális katasztrófák elkerülhetőek legyenek. Ennek egyik lehetséges útja a minták
szűrése, a szennyezett tételek megsemmisítése; elkerülve ezzel a szennyezett élelmiszer
fogyasztásából adódó toxikózist. A szállítási problémák tovább súlyosbíthatják a fennálló
problémát, hiszen a szállítás során újabb mikotoxinok jelenhetnek meg, multi-mikotoxin
5
szennyezést idézve elő a szállított gabonákon, vagy egyéb terményeken. A CFIA multiplex
rendszer lehetővé teszi az egészségügyi kockázatok beazonosítását, és segít megakadályozni a
fertőzött gabonák bejutását a globális élelmiszerláncba. A tervezett módszer alkalmas a
szennyezett tételek kiszűrésére keletkezzen a toxikózis akár a szántóföldön, akár a
szállítás/raktározás során.
Jelen tézis kettő fontosabb hipotézis alapú megközelítés köré szerveződött. Az alább
ismertetett elemek mögött álló egyszerű megoldások célja, együtt erősíteni a mikotoxin
monitoring rendszert. A tervezés és a tesztelés során arra összpontosítottunk, hogy a XXI.
század elvárásainak megfelelő, kellően robosztus rendszert dolgozzunk ki multi-mikotoxinos
minták analízisére.
2.1. A probléma hipotézis alapú megközelítése
(a) A mikrogyöngy esszé kiváló kötési kinetikai adottságainak kiaknázása egy gyors és
költséghatékony multiplex mikrogyöngy rendszer fejlesztésére; a CFIA illesztése az analitkai
rendszerbe.
(b) Műszer-független kersztkalibrációs eljárás (IICC) fejlesztése az esszé rendszer, különböző
áramlási citométereken történő teljes kompatibilitásának biztosítására.
A jövőben a két fent említett elem összekapcsolása révén egy komplex mikotoxin monitoring
rendszert, a myco-epidemiológia (MycoEpi) válik elérhetővé. A MycoEpi egy integrált,
átfogó kockázatkezelési megközelítés a globális élelmiszer-lánc védelmére, mely a
hagyományos empirikus epidemiológia alapelvein nyugszik, ugyanakkor integrálja XXI.
századi biotechnológiát és telemetriát.
Jelen megközelítés a kockázatértékelés támogatásán keresztül jelentősen növelheti a
kapcsolódó egészségpolitikai döntések hatékonyságát. Hiszen a javasolt rendszer komplex
élelmiszer biztonsági kockázatelemzést kínál; számszerűsíthető kockázatot jósolt, amely nagy
jelentőséggel bír az egyének vagy a társadalom szintjén is; mindenütt ahol megjelennek multi-
mikotoxin szennyezések (European Commission, 2002; Merrill, 1997).
Elsőszámú cél, egy robosztus analitikai módszer kifejlesztése és globális hozzáférés
biztosítása a több toxinnal szennyezett minták méréséhez megfizethető áron. A második
célkitűzés, jól alkalmazható, egységes protokoll kidolgozása a különböző áramlási
citométerek fluoreszcens kalibrálására, amely lehetővé teszi, hogy a mérések során kapott
eredmények összevethetőek legyenek.
6
Az "egy penész – egy mikotoxin" hipotézis megdöntése jelentős hatással volt az addig széles
körben elismert, egyetlen mikotoxin egyidejű mérésére alkalmas ELISA módszer
megítélésére. Ugyanis a több mikotoxinnal szennyezet, vagy maszkolt mikotoxin tartalmú
minták ELISA-val történő vizsgálatánál előfordulhatnak hamis, vagy nem megfelelő
eredmények. 2012 óta több olyan eredményt leíró publikáció jelent meg, melyben a kötött
mikotoxinok mellett másodlagos metabolitok is megtalálhatóak (Streit et al., 2013). Sajnos
több jelenlegi ELISA kit ilyen körülmények között az összes mikotoxin koncentrációt
“alulméri”, hiszen nem képes detektálni a mintában lévő maszkolt toxin mennyiségét. Új
vizsgálati módszerekre van szükség, mely képes a gabonák multi-mikotoxin
szennyeződésének azonosítására. Az általunk tervezett CFIA multi-mikotoxin esszé
lehetőséget teremt arra, hogy a maszkolt toxinok ellen kifejlesztett antitestek segítségével
kibővítsük a rendszert a maszkolt mikotoxinok mérésével. A terveink között szerepel egy
integrált kockázatértékelő stratégia kidolgozása (IRAS), ami magába foglalja az első két
célkitűzés eredményeit.
2.2. Alkalmazott stratégiák
A felmerült tudományos probléma megoldása, az alábbi ötlépéses stratégiával történt:
1. Mikrogyöngy alapú kompetitív fluoreszcens immunoassay fejlesztése nagy affinitású
monoklonális antitestek alkalmazásával. A mikrogyöngyök kínálta speciális kötési
kinetika kihasználása az ELISA analitikai paraméterit meghaladó immunoasssay
fejlesztésében.
2. A CFIA rendszerhez illeszkedő, egységes egy lépéses extrakciós eljárás kidolgozása,
amely lehetővé teszi a kiválasztott hat mikotoxin együttes kezelését/analízisét.
3. Spike-olt minták alkalmazásával (mivel nem létezik mind a hat vizsgálandó mikotoxint
egyidejűleg tartalmazó referencia minta) kidolgozni az esszé minősítéséhez szükséges
validációs protokollt, amivel bizonyítani lehet a párhuzamos minták statisztikai
azonosságát/megfelelőségét. Az alacsony méréstartományban szükséges érzékenység
biztosítása érdekében alapvető fontosságú a keresztreakciókból és a minta
extrahálásából adódó mátrixhatások csökkentése.
4. Kidolgozni a műszer-független keresztkalibrálási (IICC) protokollt, ami a CFIA
rendszer kompatibilitását hivatott biztosítani, a különböző áramlási citométereken. A
műszer-független minőségellenőrzés az analízis szoftver integráns részévé tehető.
7
5. Az FCAP Array szoftver hozzáigazítása a CFIA analitikai eljáráshoz. A
továbbfejlesztett szoftver kritikus elem, amely támogatja az analitikai platform
adatkezelését a MycoEpi és a bio-átviteli vizsgálatok egésze során.
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
A fejlesztése során felhasznált anyagok és módszerek mindegyike azt a célt szolgálta, hogy
több mikotoxin egyidejű mérésére tervezett CFIA eljárás, a legkülönbözőbb mintaféleségek
(mátrixok) mikotoxin tartamának meghatározására alkalmas lehessen. A vizsgálati rendszer
végül az alábbi – egy, vagy több mikotoxint tartalmazó - mikotoxinforrásokra került
kidolgozásra: (1) a gabona, (2) az elsődleges biológiai testfolyadékok, mint a vér, vizelet és
nyál, (3) a testnedvek, szövetek és szervek; elsődleges vagy másodlagos bio-transzfer
források.
Multi-mikotoxin szennyezések detektálása CFIA módszerrel
Mivel a munka középpontjában módszerfejlesztés állt; a méréseket a kidolgozott reagensekkel
és protokollok alkalmazásával folytattuk el. Az összehasonlító vizsgálatokat különböző
gyártóktól származó, hét eltérő készüléken végeztük. Az adatgyűjtés minden esetben az
áramlási citométerek saját szoftverével történt. Az alkalmazott multiplex CFIA protokoll
részletei előzetesen publikálásra kerültek (Czeh et al., 2012). Az analízis szoftver módosításra
került oly módon, hogy a felhasználó az eredményeket egyszerű és átlátható módon tudja
értékelni. Az alkalmazott áramlási citométerek különbözőségei ellenére, az eredmények
egységes formátumban jönnek létre (Czeh et al., 2013).
Extrakciós protokoll növényi és állati mintákhoz
Egy kellően hatékony, robosztus, egylépéses extrakciós eljárás elengedhetetlen a sikeres
multi-mikotoxin rendszer kidolgozásában. A gabonára vonatkozó minta előkészítési protokoll
részletei korábban közlésre kerültek (Czeh et al., 2012). Az egységes extrakciós eljárásnak
kellően hatékonynak kell lennie ahhoz, hogy a mikrogyöngy rendszer a hat mikotoxin
mindegyéket megfelelő pontossággal, reprodukálható módón tudja meghatározni a
határértéket jelentő koncentrációnál. A táplálékláncba került mikotoxin minden esetben a bio-
transzfer folyamatok keretében haladnak a növényektől az állatok felé. Minden a dolgozatban
leírt állatkísérletnél, figyelembe vettük az Európai Bizottság ajánlásait (86/609 EEC)
(European Commission, 1986), ugyanakkor valamennyi kísérletet jóváhagyta a Kísérleti
Orvostudományi Kutatóintézet állatjóléti bizottsága.
8
A kifejlesztett módszerek ellenőrzése, validálási módszer kidolgozása, validálás
A CFIA mikotoxin vizsgálati módszer validálása során minden eljárást különböző
koncentrációtartományokban végrehajtottuk, a mintákat hat párhuzamosban vizsgáltuk, három
független ismétlésben. A vizsgálatok során alkalmazott minták toxinmentes extraktumok
spike-olásával készültek, így különbség tehető a kinyerési hatékonyság és a mátrix okozta
jelerősítés, jelcsökkentés között. A vizsgálatok során többek között az ISO standard 5725‐
5:1998 irányelv ajánlásai kerültek alkalmazásra (Gilbert és Anklam, 2002; Sulyok et al.,
2007; ISO, 1998)
Flow citometriás kereszt-kalibrálási protokoll kidolgozása
A hét áramlási citométer által képviselt funkcionális sokszínűség kezelésére egy átfogó és
univerzális multiplex platform protokollra volt szükség. Cél volt bebizonyítani; hogy nincsen
jelentős eltérés a vizsgálatba bevont készülékek között; nincsen akadálya a multi-mikotoxin
eredmények összehasonlításának (Czeh et al., 2013).
Analízis szoftver
Az analízis szoftver lehetővé teszi a különböző áramlási citométeren elvégzett mikotoxin
mérések kiértékelését. A szoftver módosítások célja az volt, hogy váljon a hat toxin
mindegyike egy időben mérhetővé/kezelhetővé. A CFIA analízishez szükséges valamennyi
algoritmus beépítésre került (ezek közül néhány az eredmények szakaszban részletezésre
kerül).
4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
CFIA felfogható az ELISA rendszereket leváltó multiplex mikrogyöngy rendszerként.
Szisztematikus fejlesztőmunka eredménye ez az analitikai rendszer, amely alkalmazza a XXI.
századi biotechnológia vívmányait a mikotoxinok vizsgálatára.
4.1. Továbbfejlesztett multiplex immunoassay
A 2000-es évek elején, az elérhető mikotoxin ellenes monoklonális antitestek megfelelőek
voltak ugyan az ELISA módszerekben történő alkalmazáshoz; azonban a multiplex esszé
elvárásainak nem feleltek meg.
9
1. ábra: A T-2 toxin kalibrációs görbéje a kompetitív rendszerekre jellemző, szigmoid görbe.
A kompetitív immunoassay-re jellemző kalibrációs görbe alakja szigmoid (lásd. 6. ábra). A
nagyobb affinitású reagensek alkalmazásával lehetőség nyílt a kalibrációs görbe lineáris
szakaszának kiszélesítésére (Barna-Vetro et al., 1994). A továbbfejlesztett multiplex
immunoassay több előnyös tulajdonsággal rendelkezik: (1) a multiplex rendszerekre jellemző,
aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatás lecsökkenthető (lásd. 2. ábra), és (2) elérhető, hogy
a hat mikotoxinra az EU által előírt határértékek a kalibrációs görbe középső, lineáris
szakaszára essenek (lásd. 2. ábra)
10
2. ábra: A nagy affinitású monoklonális antitestek alkalmazásával kidolgozott multiplex mikrogyöngy
rendszer hét standardpont alapján felvett kalibrációs görbéi Az EU által előírt határérték minden
esetben a görbe középső szakaszára esik
4.2. Egylépéses extrakciós eljárás
Az egylépéses extrakciós eljárás kidolgozásában jelentős know-how tapasztalat áll
rendelkezésre, amely elősegítette a cél elérését, hogy a kifejlesztett extrakciós eljárás váljék
kompatibilissá a multiplex esszé platformmal. Alapvető elvárás, az extrakciós eljárással
szemben, hogy legyen reprodukálható, függetlenül attól, hogy egyetlen, vagy akár hat
mikotoxin egyidejű kinyerése a cél.
11
3. ábra: Alflatoxin B1-től mentes termények jellemző fluoreszcens intenzitása.
1 = búza; 2 = kukorica; 3 = mungó bab; 4 = fehér csillagfürt; 5 = tavaszi árpa; 6 = csicseriborsó; 7
= kevert takarmány. Az első oszlop (0g/ml) mutatja a toxinmentes, míg az utolsó (2g/kg) az
élelmiszer alapanyagokra vonatkozó EU határértéket. Valamennyi termény jellemző MFI értéke a
határértéket jelentő “B” színt felett van.
Hét különböző, akkreditált laboratóriumban, referencia módszerrel előzetesen bevizsgált,
toxinmentes gabonamátrix került előkészítésre, és extrahálásra. Valamennyi mintát a hat
mikotoxin együttes vizsgálatára alkalmas CFIA rendszerrel vizsgáltuk (lásd, 3. ábra).
Figyelembe véve az EU által meghatározott határértékeket; a mintákkal párhuzamosan egy
toxinmentes és egy (élelmiszer alapanyagokra vonatkozó) határértéknek megfelelő aflatoxin
B1-et tartalmazó standard is mérésre került. A két standard mérésével kapott MFI értékeket
szaggatott vonal jelöli (A és B) a 3. ábrán. Az A és B vonal által határolt rész adja meg a
toxinmentes mintákra jellemző MFI tartományt. Analitikai szempontból a 6 vizsgált toxin
közül az aflatoxin B1 tekinthető a legproblematikusabbnak, ezért az erre vonatkozó
eredmények kerülnek itt bemutatásra. Az aflatoxin B1 határértéke a legalacsonyabb a vizsgált
mikotoxinok közül, így itt szükséges a legnagyobb érzékenység, itt lehet kritikus a minta
mátrixhatása is.
A 4. ábra tanúsága szerint a kidolgozott egylépéses eljárás a hét vizsgált növényi minta
egyikében sem szabadít fel olyan anyagokat a mátrixból, amelyek a mérés során fals pozitív
eredményeket okoznának a negatív mintákban. Hiszen mind a hét gabona esetében a kapott
MFI érték a toxinmentes és a határértéknek megfelelő standard MFI értéke között helyezkedik
el. A kidolgozott CFIA rendszerbe tartozó egyéb mikotoxinokra vonatkozó, hasonló
vizsgálatokat eredményei itt nem kerülnek közlésre.
12
4.3. Validációs eljárások spike-olt mintákkal; a módszer minősítése és statisztikai
értékelésére
A vizsgálandó hat mikotoxint egyidejűleg tartalmazó, minősített referencia anyag (CRM) nem
kapható, ezért a módszer érzékenységének bizonyítására más módszerre van szükség. Cél volt
demonstrálni, hogy a CFIA rendszer érzékenysége, valamennyi toxin esetében meghaladja a
hasonló ELISA-k érzékenységét. Szisztematikus munkával sikerült megszüntetni a multiplex
immunoassay-re jellemző, aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatást. A CFIA és az ELISA
rendszerek összehasonlításának eredményeit az 1. táblázat tartalmazza.
Mycotoxin MFI CV
%
LOD (µg/kg) ∆ (x)
Határérték
(µg/kg) CFIA ELISA
Aflatoxin B1 4177 1.7 0.12 1.00 8.3 2
Ochratoxin A 3866 1.6 1.63 5.00 3.1 5
Fumonisin B1 2278 2.0 45.85 222.00 4.8 2000
T-2 toxin 4511 2.4 32.50 35.00 1.1 300
Zearalenone 5113 2.3 1.89 10.00 5.3 100
DON 4598 2.2 87.80 200.00 2.3 1750
1. táblázat: A CFIA és ELISA rendszerek detektációs limit (LOD) értékeinek összehasonlítása.
Összehasonlítva CFIA teszt detektációs értékeit, az eredmények azt mutatják, hogy azok 1.1-
8.3-szor alacsonyabbak, mint a megfelelő ELISA rendszer jellemző értékei (1. táblázat). A
kidolgozott CFIA rendszer, összehasonlítva az ELISA módszerrel, két fontos előnnyel bír; az
egyik előny a lehetőség a hat mikotoxin párhuzamos mérésére; a másik a megnövekedett
érzékenység.
4.4. Műszer-független keresztkalibrálás - a CFIA platform alkalmazása különböző
áramlási citométereken
A műszer-független keresztkalibráláshoz (IICC) QuantiBRITE kalibrációs
mikrogyöngyrendszer került alkalmazásra, mellyel a vizsgált hét áramlási citométer mérési
paraméterei egymáshoz igazíthatóak. A hipotézis alapján a keresztkalibrálást követően egy
áramlási citométerektől független analízis szoftver alkalmas lehet a minőségbiztosítási
feladatok ellátására és a mérések kvantitatív értékelésre. A keresztkalibrálás eredményeit az 4.
ábra illusztrálja. A QuantiBRITE mikrogyöngyök segítségével elvégzett műszer-független
keresztkalibrálással két készülék szinkronizálása nem sikerült; az Accuri és a Luminex
melynek oka, hogy ezen két készüléknél nincsen lehetőség a PE jelerősítés módosítására.
13
Továbbá az Accuri felbontása 7 dekád, szemben a többi készülék jellemzően, 3-4 dekádos
felbontásával.
4 ábra: A QuantiBRITE mikrogyönggyel elvégzett műszer-független keresztkalibrálás eredményei.
4.5. A mikrogyöngy alapú rendszer dinamikájának jellemzése
Az itt bemutatott eredmények a CFIA rendszer előnyösebb kötési kinetikai tulajdonságaival
magyarázhatóak, ezért fontos az ELISA és CFIA módszerek kötési kinetikájának
összehasonlítása. Cél volt, mérni és összehasonlítani az antigén-PE konjugátum kötési
kinetikáját a mikrogyöngyök felületén található antitesttel, illetve az antitestek és az antigén-
enzim konjugátum jellemző kötési kinetikáját ELISA rendszerben. A vizsgálat során időről
időre megmértük a fehérje kötődéséből adódó átlagos fluoreszcencia-intenzitást (MFI)/optikai
denzitást (OD), ebből következtettünk a reakciókinetikára.
A két rendszerben mérhető jelek (OD az ELISA és MFI a CFIA esetén) összehasonlításához
egységes optikai skála kialakítása vált szükségessé, lásd 5. ábra. Az 5. ábra y-tengelyén ez az
egységesített optikai skála (EORU; equivalent optical reading units) került ábrázolásra. Az
EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális jelintenzitás értékét tekintjük 1 egységnek. Az
5. ábrán látható két görbe illusztrálja a különbséget a kompetitív immuntesztek kötési
kinetikái között. Jól látható, hogy a 45 percnél rövidebb inkubáció esetén jelentős
különbségeket mértünk. Tisztán látszik az is, hogy a CFIA rendszer esetében rövidebb
inkubációs idő alkalmazásával is értékelhető jelet kapunk. Feltételezésünk szerint, a gyorsabb
reakció egyik lehetséges oka hogy a CFIA estén az antitest/antigén kötések kialakulása
50
100
150
200
250
2,5 3 3,5 4 4,5 5
Csa
torn
asz
ám
(P
E c
sato
rná
ba
n)
A mikrogyöngyök felületén lévő átlagos PE molekulaszám (LOG)
Calibur
Array
Partec
Accuri
Guava
FC500
Luminex
14
gyorsabb, hiszen míg az ELISA esetében a reakció csupán a mikrotiter plate falára
korlátozódik, addig a CFIA esetében (a folyadékfázisban) ilyen jellegű gátlás nincsen.
Az ELISA és CFIA rendszerek kötési kinetikáját az alábbi egyenletek írják le: CFIA estén y =
0.1887ln(x) + 0.2367, R2=0.998 és ELISA estén y = 0.2677ln(x) - 0.1518, R
2=0.954. Az
egyenletek három független mérés eredményei alapján kerültek megállapításra. Minden
időpontnál ábrázoltuk a jellemző szórásértékeket is, melyekről megállapítható, hogy jelentős
eltéréseket nem tapasztaltunk; lásd 5. ábra.
5. ábra: A CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának összehasonlítása. Az y-tengelyen az EORU
(egységesített optikai skála) került ábrázolásra. Az EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális
jelintenzitást értékét tekintjük 1 egységnek.
y = 0.2677ln(x) - 0.1518
R² = 0.954
y = 0.1887ln(x) + 0.2367
R² = 0.9979
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 10 20 30 40 50 60
EO
RU
Inkubációs idő (perc)
CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának
összehasonlítása
ELISA CFIA
15
6. ábra: A CFIA jellemző kötési kinetikája 15, 20 és 60 perces inkubáció után. Kör szimbólum jelöli a
tényleges, 12 időpont alapján kapott görbét. A négyzet és háromszög szimbólummal jelzett görbe a 4
és 5 pont alapján 45 percre jósolt MFI értékeket mutatja.
A hat lehetséges mikotoxin közül a DON kerül itt bemutatásra (lásd. 6. ábra). Az utolsó
fázisban a kiválasztott toxint inkubálva az MFI értékek kerültek rögzítésre 2, 5, 10 és 15
percnél. Ezt követően a kapott MFI értékekre a korábban számított egyenlet segítségével
görbét illesztettünk. A fenti protokollt kiegészítésre került a 20 percnél mért MFI-t is
rögzítésével. Ez estben a görbeillesztés 5 időpont alapján történt meg. Összevetve a teljes
mérési sorral, jól látszik, hogy mind a 4, mind az 5 pont alapján jósolt görbe jól közelít a
tényleges görbéhez.
4.6. A CFIA analitikai rendszer alkalmazása emlős minták vizsgálatára
A CFIA rendszer adaptálása állati minták multi-mikotoxin tartalmának meghatározásához
folyamatban van. Laboratóriumi modellállaton (patkány) elvégzett zearalenon (ZEA) etetési
kísérletek után a begyűjtött vérplazma mikotoxin tartalmát vizsgáltuk (lásd 7. ábra).
1800
2300
2800
3300
3800
4300
4800
5300
5800
0 10 20 30 40 50 60
MF
I
Inkubációs idő (perc)
CFIA rendszer kötési kinetikája
4 időpont
5 időpont
Mért érték
16
7. ábra: Vérplazma ZEA koncentrációk. A mikotoxin koncentrációt 3 napos ZEA etetési kísérletben
kezelt, ivarérés előtti nőstény patkányok vérplazmájában mértük CFIA rendszerrel. A vérben a mért
ZEA koncentráció dózisfüggő növekedést mutatott, követve az orálisan bevitt mennyiségeket.
Az eredmények arra utalnak, hogy a kidolgozott vizsgálati eljárás alkalmas lehet az állati
minták mikotoxin tartalmának meghatározására. A testreszabott FCAP Array analízis szoftver
rendelkezik azokkal az algoritmusokkal, amelyek alkalmassá teszik mind a növényi és állati
eredetű minták multiplex méréseinek kezelésére (lásd 2. táblázat).
Szoftver jellemzők Vizsgált mikotoxinok
AB1 OTA FB1 T-2 ZEA DON
1 EU határértékek (g/kg) 2 5 1400 300 100 1250
2 Nemzeti, vagy regionális határok
kiválasztása megvalósítható
3 Gyermek/felnőtt/állati felhasználás
4 Görbe standardjainak száma 6 6 6 6 6 6
5 Mikotoxinok számának korlátozása nem nem nem nem nem nem
6 Logaritmikus skála alkalmazása igen igen igen igen igen igen
Table 2: Speciális analízis szoftver multi-mikotoxinos minták CFIA vizsgálatára
5. ÚJ EREDMÉNYEK
A kutatás célja több mikotoxin egyidejű analízisére alkalmas analitikai módszer fejlesztése
volt, mellyel a szennyezett gabonák kiszűrhetőek az élelmiszerláncból továbbá az élelmiszer
és/vagy takarmányminták mikotoxin vizsgálatának költsége csökkenthető. Munkánk során
17
igyekeztünk ötvözni a múlt innovatív megoldásait és a XXI. század biotechnológiájának
forradalmi újdonságait.
(1) Elsőként fejlesztettünk ki és publikáltunk a mikotoxinok mérésére szolgáló,
mikrogyöngy alapú multiplex mikroanalitikai eljárást. Kompetitív fluoreszcens
mikrogyöngy (CFIA) alapú áramlás citometriás analitikai módszert fejlesztettünk ki hat
mikotoxin gabonamintákból történő egyidejű kvantitatív analízisére. A kidolgozott
rendszert kereskedelmi forgalomba hozható termékké fejlesztettük.
A korábban publikált eljárások módosításával kidolgoztuk a CFIA módszerhez
szükséges fluoreszcens (PE) konjugátumok, és antitesttel jelölt mikrogyöngyök
előállítását. Optimalizáltuk a kifejlesztett rendszert, bizonyítottuk, hogy a kidolgozott
PE/antitest kötési módszer nem befolyásolja az antitestek antigén felismerő/kötő
képességét. Igazoltuk hipotézisünket, miszerint a CFIA és ELISA rendszerek elérő
kötési kinetikával rendelkeznek, melynek eredményét reakciósebességben és
érzékenységben láthatjuk. Bizonyítottuk, hogy a kifejlesztett mikrogyöngy alapú CFIA
érzékenysége, jelentősen meghaladja a mikotoxikológiában eddig alkalmazott ELISA
módszerek jellemző adatait. Igazoltuk, hogy a kidolgozott CFIA rendszer minden
alkotórésze több hónapon keresztül megőrzi minőségét.
(2) Műszer-független kereszt-kalibrálási (IICC) eljárás került kidolgozásra hét különböző
áramlási citométerre; a kifejlesztett fluoreszcencia alapú CFIA mennyiségi analízis
segítésére. Bizonyítottuk, hogy az új IICC eljárás alkalmazásával a különböző
készülékeken végzett multi-mikotoxin mérések eredményei megegyeznek.
(3) Kidolgoztunk egy egységes egylépéses extrakciós eljárást, mellyel a hat mikotoxin
együttes extrakciója elvégezhető. Az új extrakciós eljárás kombinálva az IICC
eljárással; lehetőséget teremtett az új analitikai vizsgálati platform kidolgozására.
(4) A már létező analitikai szoftvert speciális funkciókkal egészítettük ki, ami kompenzálja
a különböző készülékek közötti eltéréseket; mintakezelést, lézereket. Az új szoftver
megkönnyíti a multi-mikotoxin mérések elvégzését, kiértékelését azzal, hogy
tartalmazza az alkalmazandó vizsgálati protokoll részleteit, a standard pontok
koncentrációját és a különböző régiókra vonatkozó határértékeket.
(5) CFIA rendszer alkalmassá tettük állati minták mikotoxin tartalmának analízisére, és
ezzel együtt a bio-transzfer nyomon követésére is a teljes élelmiszerláncban. A
zearalenon mikotoxin állati mintákból történő mennyiségi méréséhez az irodalomban
elsőként alakítottunk ki mérési protokollt
18
(6) A kidolgozott, klinikai potenciállal is rendelkező analitikai rendszer (MycoEpi) jövőbeli
bevezetését javasoljuk. MycoEpi stratégia alkalmas lehet az átfogó egészségügyi
kockázatbecslésre, kezelésre. Segítségével a mikotoxin szennyezések nyomon
követhetőek a szántóföldtől, a mikotoxin élelmiszerláncon keresztüli mozgásán át,
egészen ez emberig.
6. EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA
Napjainkban a fejlett országok élelmiszer kínálata mikotoxikológiai szempontból sokkal
biztonságosabbnak tekinthető, mint amilyen a XX. század végén volt. Azonban továbbra is
jelentős kihívások és teendők várnak ránk az élelmiszerlánc egészét illetően. Mostanra
bebizonyosodott, hogy a jövőben csak a multidiszciplináris megközelítés szavatolhatja a
globális élelmiszer-ellátás biztonságát. MycoEpi segítségével nagy lépést tehetünk a globális
mikotoxin toxikózisok kialakulása ellen. A multi-mikotoxin szennyezések nyomon
követésére, vizsgálatára az egyik legalkalmasabb módszer lehet az általunk kidolgozott CFIA
rendszer. Amely ugyanakkor – a MycoEpi-vel kombinálva - alkalmas a növénytermesztési
technikák, a mikotoxin kötési és bontási módszerek hatékonyságának nyomon követésére is.
19
7. REFERENCIÁK
1. Anderson,G.P., Kowtha,V.A. and Taitt,C.R., 2010. Detection of fumonisin b1 and ochratoxin a
in grain products using microsphere-based fluid array immunoassays. Toxins. (Basel) 2, 297.
2. Barna-Vetro,I., Gyongyosi,A. and Solti,L., 1994. Monoclonal antibody-based enzyme-linked
immunosorbent assay of Fusarium T-2 and zearalenone toxins in cereals. Appl. Environ.
Microbiol. 60, 729.
3. Berthiller,F., Burdaspal,P.A., Crews,C., Iha,M.H., Krska,R., Lattanzio,V.M.T., MacDonald,S.,
Malone,R.J., Maragos,C.M., Solfrizzo,M., Stroka,J. and Whitaker,T.B., 2014. Developments in
mycotoxin analysis: An update for 2012-2013. World Mycotoxin Journal 7, 3.
4. Czeh,A., Torok,L., Torok,T., Siklodi,B., Lustyik,G. Development of competitive multiplexed
microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food and feed
products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008. - Oral Presentation
5. Czeh,A., Mandy,F., Feher-Toth,S., Torok,L., Mike,Z., Koszegi,B. and Lustyik,G., 2012. A flow
cytometry based competitive fluorescent microsphere immunoassay (CFIA) system for detecting
up to six mycotoxins. J. Immunol. Methods 384, 71.
6. Czeh,A., Schwartz,A., Mandy,F., Szoke,Z., Koszegi,B., Feher-Toth,S., Nagyeri,G., Jakso,P.,
Katona,R.L., Kemeny,A., Woth,G. and Lustyik,G., 2013. Comparison and evaluation of seven
different bench-top flow cytometers with a modified six-plexed mycotoxin kit. Cytometry A 83,
1073.
7. European Commission. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the
approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States
regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes . L 358,
0001-0028. 12-18-1986. Official Journal .
Ref Type: Report
8. European Commission. Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the
Council of 28 January2002 laying down the general principles and requirements of food law,
establishing the European Food SafetyAuthorityand laying down procedures in matters of food
safety. L31. 2-1-2002. Official Journal of the European Communities.
Ref Type: Report
9. FAO, 2004. Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. FAO, Food and
Nutrition Paper No. 81.
10. FAO - Economic and Social Development Department., 2008. The State of Food Insecurity in
the World, 2008: High food prices and food security - threats and opportunities". Food and
Agriculture Organization of the United Nations.
11. Fink-Gremmels,J., 1999. Mycotoxins: their implications for human and animal health. Vet. Q.
21, 115.
12. Gilbert,J. and Anklam,E., 2002. Validation of analytical methods for determining mycotoxins in
foodstuffs. Trends Anal. Chem. 21.
20
13. Horwitz,W., 2000. Natural Toxins. In: Official Methods of Analysis of AOAC International.
[AOAC International., Gaithersburg, USA].
14. ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Alternative
methods for the determination of the precision of a standard measurement method. 1998.
Ref Type: Report
15. Liu,Y. and Wu,F., 2010. Global burden of aflatoxin-induced hepatocellular carcinoma: a risk
assessment. Environ. Health Perspect. 118, 818.
16. Magan,N. and Olsen,M., 2004. Mycotoxins in Food: Detection and Control. Woodhead Pub..
17. Merrill,R.A., 1997. Food safety regulation: reforming the Delaney Clause. Annu. Rev. Public
Health 18, 313.
18. Peraica,M., Radic,B., Lucic,A. and Pavlovic,M., 1999. Toxic effects of mycotoxins in humans.
Bull. World Health Organ 77, 754.
19. Peters,J., Bienenmann-Ploum,M., de,R.T. and Haasnoot,W., 2011. Development of a multiplex
flow cytometric microsphere immunoassay for mycotoxins and evaluation of its application in
feed. Mycotoxin. Res 27, 63.
20. Plestina,R., Ceovic,S., Gatenbeck,S., Habazin-Novak,V., Hult,K., Hokby,E., Krogh,P. and
Radic,B., 1990. Human exposure to ochratoxin A in areas of Yugoslavia with endemic
nephropathy. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 10, 145.
21. Rahmani,A., Jinap,S. and Soleimany,F., 2009. Qualitative and Quantitative Analysis of
Mycotoxins. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 8, 202.
22. Reddy,L. and Bhoola,K., 2010. Ochratoxins-food contaminants: impact on human health.
Toxins. (Basel) 2, 771.
23. Streit,E., Schwab,C., Sulyok,M., Naehrer,K., Krska,R. and Schatzmayr,G., 2013. Multi-
mycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and
feed ingredients. Toxins. (Basel) 5, 504.
24. Sulyok,M., Berthiller,F., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2006. Development and validation of a
liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39
mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649.
25. Sulyok,M., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2007. Application of a liquid chromatography-
tandem mass spectrometric method to multi-mycotoxin determination in raw cereals and
evaluation of matrix effects. Food Addit. Contam 24, 1184.
26. Wild,C.P. and Gong,Y.Y., 2010. Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health
issue. Carcinogenesis 31, 71.
27. Worldometers. Worldometers.info. Retrieved . 4-12-2012.
Ref Type: Electronic Citation
21
8. KÖZLEMÉNYEK
Értekezés alapjául szolgáló közlemények
1. Czeh A, Schwartz A, Mandy F, Szoke Zs, Koszegi B, Feher-Toth S, Nagyeri Gy, Jakso P,
Katona LR, Kemeny A, et al. Comparison and Evaluation of Seven Different Bench-Top
Flow Cytometers With a Modified Six-Plexed Mycotoxin Kit. Cytometry: Part A 2013.
IF: 3.711; Citations: 0
2. Czeh A, Mandy F, Feher-Toth S, Torok L, Mike Z, Koszegi B, Lustyik G. A Flow
Cytometry Based Competitive Fluorescent Microsphere Immunoassay (CFIA) System for
Detecting Up to Six Mycotoxins. J Immunol Methods 2012;384:71-80.
IF: 2.203; Citations: 9
3. Kriszt R, Krifaton C, Szoboszlay S, Cserhati M, Kriszt B, Kukolya J, Czeh A, Feher-Toth
S, Torok L, Szoke Z, et al. A New Zearalenone Biodegradation Strategy Using Non
Pathogenic Rhodococcus Pyridinivorans K408 Strain. PLoS One 2012;7:e43608.
IF: 4.092; Citations: 7
Értekezés témájában megtartott előadások
1. Czeh A, Torok L, Torok T, Siklodi B, Lustyik Gy. Development of competitive
multiplexed microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food
and feed products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008.
Értekezés témájában bemutatott poszterek
1. Czeh A, Torok L, Gorombey P, Torok T, LantosE, Lustyik Gy. Development of Flow
Cytometric Multiplexed Microbead Assay for Detection of Mycotoxin Contamination.
Regional Biophysics Conference, Balatonfüred, Hungary, 2007.
2. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy. Development and validation of
Multiplexed Microbead Assay for Detection of six different Mycotoxins in feed. CYTO
Congress, Seattle, Washington, USA, 2010.
3. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy. Side by side Comparison Between the
Traditional ELISA and the New Fungi-Plex6 Microbead Assay (MA) for Detection of six
Mycotoxins. World Mycotoxin Forum, Amsterdam, Holland, 2010.
22
4. Czeh A, Toth Sz, Mike Z, Koszegi B, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry is Reaching
New Horizons In Disease Prevention: An Illustration How A Multiplexed Mycotoxin Kit
Performs Using Several Types of Instrument with Either Analog or Digital Signal
Processing. CYTO Congress, Baltimore, Maryland, USA, 2011.
5. Czeh A, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry Based Myco-Epidemiology has Potential
Impact on Mycotoxin outbreaks and Health: A Largely Ignored Global Concern A
Harmonized Approach to Preventive Medicine. ESCCA Congress, Dublin, Ireland, 2011.
6. Székács A, Bánáti H, Czéh Á, Tóth Sz, Juracsek J, Darvas B, Székács I, Lustyik Gy.
Detection of environmental and food contaminant mycotoxins with polymeric bead-based
immune-detection in a multiplexed flow cytometry assay format. The 4th
Annual NanoScience Technology Symposium, Miami, Florida, USA, 2011.
7. Czeh A, Feher-Toth Sz, Szoke Zs, Ferenczi Sz, Kriszt, R, Nagyeri Gy, Mandy F, Kovacs
KJ, Lustyik Gy, A Microbead Assay Platform for the Detection of Zearalenone from rat
blood and brain tissue. CYTO Congress, Leipzig, Germany, 2012.
8. Fehér-Tóth Sz, Kukolya J, Czéh Á, Török L, Lustyik Gy. A new fluorescent microsphere
based assay for studying Aflatoxin B1 biodegradation by flow cytometry CYTO Congress,
Leipzig, Germany, 2012.
Egyéb közlemények
1. Beres A, Lelovics Z, Antal P, Hajós G, Gézsi A, Czeh A, Lantos E, Major T. "Does
happiness help healing?" Immune response of hospitalized children may change during
visits of the Smiling Hospital Foundation's Artists. Orv Hetil. Oct 23; 152(43):1739-
44.2011.
Összesített impakt faktor: 9,7 Független hivatkozások száma: 13