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Ministério da Educação
Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
PATRÍCIA CAIXETA CASTRO SOUZA BRAGA
PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TIPO
ANSIOLÍTICAS E DO PERFIL ANTIOXIDANTE DO CANDIDATO A PROTÓTIPO
DO FÁRMACO LQFM180
Goiânia
2016
Ministério da Educação
Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
PATRÍCIA CAIXETA CASTRO SOUZA BRAGA
PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TIPO
ANSIOLÍTICAS E DO PERFIL ANTIOXIDANTE DO CANDIDATO A PROTÓTIPO
DO FÁRMACO LQFM180
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal de Goiás como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa
Goiânia
2016
Ministério da Educação
Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Membros da Comissão Julgadora de Dissertação de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás
pela discente Patrícia Caixeta Castro Souza Braga em 26/08/2016.
Comissão julgadora:
_________________________________________
Prof. Dr. Elson Alves Costa (ICB-UFG) (Presidente)
_________________________________________
Prof. Dr. Luciano Morais Lião (IQ-UFG)
_________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Menegatti (FF-UFG)
_________________________________________
Dr. Flávio Silva de Carvalho (IQ-UFG)
Goiânia
2016
“Estamos ainda no início do que poderá ser
uma era de exploração cerebral, com a grande
promessa de compreender mais sobre como
cada um de nós pensa, sonha e ama. Mas
talvez o maior trunfo desta época seja ajudar
as pessoas com todo e qualquer tipo de
transtorno mental.”
Tom Insel, M.D.
Diretor do Instituto Nacional de Saúde Mental
dos EUA
AGRADECIMENTOS
A Deus, com quem sempre possuí uma relação de confiança e amizade mais que
íntima. Foi Ele, é Ele e sempre será Ele quem guiará meus passos no caminho da retidão e
quem sempre abençoará todos os meus projetos pessoais e profissionais.
Ao Prof. Dr. Elson Alves Costa do Laboratório de Farmacologia de Produtos
Naturais e Sintéticos do Instituto de Ciências Biológicas – UFG, pela aceitação de um projeto
pioneiro como o meu. Meu MUITO obrigada pela paciência e compreensão durante toda a
execução deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Ricardo Menegatti do Laboratório de Química Farmacêutica
Medicinal da Faculdade de Farmácia – UFG, por ser, desde a graduação, meu querido
orientador na vida acadêmica. Com ele, aprendi, literalmente, o verdadeiro significado da
expressão “iniciação científica” e também foi ele quem me tirou da estagnação de
conhecimentos típica do funcionalismo público e me recebeu, de portas e braços abertos, com
um projeto que selará o caráter de Instituição de Pesquisa da Polícia Científica de Goiás.
Ao Prof. Dr. Luciano Morais Lião e sua Equipe do Laboratório de RMN do
Instituto de Química – UFG, pela realização dos espectros de ressonância magnética nuclear
de hidrogênio unidimensional e bidimensional.
À colega de graduação Msc. Adriane Ferreira de Brito, pela realização da
avaliação farmacológica da tão sonhada molécula.
Ao meu amado marido, Rilmo Braga Cruz Júnior, por me incentivar, apoiar,
entender e aguentar durante os meses nos quais tive que me desdobrar em três papéis (noiva,
perita criminal e mestranda). Os três juntos botaram minha sanidade em cheque e mesmo
assim ele quis se casar comigo!
Ao meu precioso pai, Dr. Rui da Paixão e Souza, por me ensinar desde criança o
valor de uma educação de primeira, sempre me “PAItrocinando” em TUDO no que diz
respeito a estudos e qualificação.
Aos meus queridos colegas do Laboratório Químico Forense e da Seção de
Drogas e Substâncias Correlatas (SEDROG) da Polícia Científica de Goiás, que sempre se
dispuseram a me ajudar no trabalho pericial do dia a dia. Essa parceria foi ainda mais valorosa
durante a minha pós-graduação, pois sem o apoio deles eu não teria conseguido trabalhar e
estudar ao mesmo tempo e com tanto empenho.
À minha boa família e aos meus valorosos amigos. As duas turmas juntas se
tornaram uma base mais que sólida para o meu crescimento pessoal. Sempre me deram apoio,
e de uma forma ou de outra, tornaram minha vida mais doce e mais fácil de ser vivida.
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
E, desde já, à banca examinadora por aceitar o convite, pelas críticas e quaisquer
contribuições que possam prestar.
RESUMO
Palavras-chave: síntese orgânica medicinal, derivado piperazínico, fármacos antioxidantes,
avaliação farmacológica, tratamento de ansiedade patológica, LQFM180 (8).
Diante do elevado e crescente número de pessoas que sofrem com algum tipo de doença
mental no mundo, faz-se necessário o desenvolvimento de opções terapêuticas adicionais para
pacientes não ajudados por tratamentos já existentes e também para abordar necessidades
médico/famacológicas não satisfeitas. Diante deste panorama, este trabalho propõe o
planejamento, síntese e avaliação das atividades farmacológicas tipo ansiolíticas e do perfil
antioxidante de um novo candidato a protótipo de fármaco 4-(3,5-di-terc-butil-4-
hidroxibenzil)piperazina-1-carboxilato de etila (LQFM180 (8)). O novo protótipo foi
planejado através da estratégia de hibridação molecular a partir dos protótipos 4-((1-fenil-1H-
pirazol-4-il)metil)piperazina-1 carboxilato de etila (LQFM008 (5)) e do 2,6-di-tert-butil-fenol
(BHT (9)). O composto LQFM180 (8) foi sintetizada através da reação de Mannich, em 92%
de rendimento, o qual foi caracterizado quimicamente por espectroscopia no infravermelho
(IV) e ressonância magnética nuclear unidimensional e bidimensional (1H, HMBC e HSQC).
A avaliação do perfil antioxidante foi realizada através de voltametria cíclica, a qual
confirmou que o composto apresenta atividade antioxidante. Para avaliação de atividade
farmacológica central do composto foram trabalhados quatro modelos comportamentais em
animais, com tratamento com LQFM180 (8) nas doses de 25, 50 e 100 µmol/kg v.o. No teste
do sono induzido por pentobarbital sódico, o LQFM 180 (8) reduziu o tempo de latência e
aumentou o tempo de duração do sono barbitúrico, indicando uma atividade depressora
central. O tratamento com LQFM180 (8), nas diferentes doses, não alterou o número de
autolimpeza, bolos fecais, cruzamentos totais e levantadas, parâmetros comportamentais
observados no teste do campo aberto; não havendo comprometimento da atividade
exploratória. Também no teste do campo aberto, o composto LQFM180 (8) indicou atividade
tipo ansiolítica, demonstrado pelo aumento no tempo de permanência, e na entrada no centro
do campo. O tratamento com LQFM180 (8) não alterou a atividade motora do animal quando
avaliado no teste da chaminé, o que foi evidenciado pelo não alteração no tempo de escalada
do animal. O composto LQFM180 (8), avaliado pelo teste de labirinto em cruz elevado,
possui atividade tipo ansiolítica; evidenciado pelo aumento no tempo e na entrada nos braços
abertos, e pela redução do tempo na plataforma central. Ao término deste trabalho podemos
observar que a rota sintética proposta para a obtenção do composto LQFM180 (8) se mostrou
eficaz, face ao alto rendimento obtido, etapas pouco laboriosas e de baixo custo. Por fim,
podemos concluir que o planejamento estrutural empregado foi ratificado, diante do êxito na
caracterização estrutural do composto e dos resultados obtidos da avaliação farmacológica
central realizada em modelos animais. Como perspectivas, há que se estabelecer o mecanismo
de ação da molécula, bem como a continuação das avaliações in vivo.
ABSTRACT
Keywords: medicinal organic synthesis, derived piperazine, antioxidants drugs,
pharmacological evaluation, treatment of pathological anxiety, LQFM180 (8).
Faced with the high and increasing number of people suffering from some form of mental
illness in the world, it is necessary to develop additional therapeutic options for patients not
helped by existing treatments and also to address medical / famacológicas unmet needs. Given
this panorama, this paper proposes the design, synthesis and evaluation of pharmacological
type anxiolytic activity and antioxidant profile of a new drug candidate prototype 4- (3,5-di-
tert-butyl-4-hydroxybenzyl) piperazine-1 carboxylate acetate (LQFM180 (8)). The new
prototype was designed by molecular hybridisation strategy of prototypes from 4 - ((1-phenyl-
1H-pyrazol-4-yl) methyl) piperazine-1-carboxylate Ethyl (LQFM008 (5)) and 2,6-di- tert-
butyl-phenol (BHT (9)). LQFM180 (8) The compound was synthesized by the Mannich
reaction, in 92% yield, which was chemically characterized by infrared spectroscopy (IR) and
nuclear magnetic resonance dimensional and two-dimensional (1H, HSQC and HMBC).
Evaluation of antioxidant status was carried out by cyclic voltammetry, which confirmed that
the compound has antioxidant activity. For evaluation central pharmacological activity of the
compound were worked four behavioral models in animals, with treatment with LQFM180 at
doses of 25, 50 and 100 mmol / kg V.O. In the test of sleep induced by sodium pentobarbital,
the LQFM180 (8) reduced latency and increased barbiturate sleep duration, indicating a
central depressant activity. Treatment with LQFM180 (8) in different doses did not alter the
number of self-cleaning, dung, total and raised intersections, behavioral parameters observed
in the open field test; there is no impairment of exploratory activity. Also in the open field
test, the compound LQFM180 (8) indicated anxiolytic type activity, demonstrated by the
increase in length of stay, and the entrance in the center of the field. LQFM180 (8) treatment
did not alter the motor activity test in the chimney, which was evidenced by the animal
climbing time. The compound LQFM180 (8) evaluated the maze test in high cross, possess
anxiolytic activity type; evidenced by the increase in time and entering the open arms and the
time reduction in the central platform. At the end of this work we can see that the synthetic
route proposed for obtaining LQFM180 (8) compound was effective, given the high yields
obtained, little laborious steps and cost. Finally, we conclude that the employee structural
planning was ratified before the success of the structural characterization of the compound
and the results obtained from the central pharmacological evaluation in animal models. As
perspective, it is necessary to establish the mechanism of action of the molecule as well as the
continuation of in vivo evaluations.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2006-2014, adaptado de
Global 2015. ............................................................................................................................. 15 Figura 2 – As vinte classes terapêuticas que mais movimentaram o mercado em 2014,
adaptado de TOP 2014. ............................................................................................................ 15 Figura 3– Ansiedade Patológica: Transtornos de Ansiedade (DSM-IV-TRTM 5ª edição, 2013).
.................................................................................................................................................. 17 Figura 4– Sistema límbico e estruturas cerebrais. .................................................................... 21 Figura 5 – Diazepam (1) Figura 6 – Flumazenil (2) ...................... 25
Figura 7 - Cloridrato de Fluoxetina (3) Figura 8 - Citalopram (4) .................. 26
Figura 9 - LQFM008 (5) ........................................................................................................... 27
Figura 10 - Metodologia de síntese do composto LQFM 180 (8) ............................................ 32 Figura 11- Planejamento do composto LQFM180 (8) através da estratégia de hibridação
molecular, a partir dos protótipos LQFM008 (5) e BHT (9). ................................................... 37 Figura 12 – Mecanismo de reação de formação do composto LQFM 180 (8). ........................ 39 Figura 13 - Espectro de RMN 1H unidimensional e expansões do composto LQFM180 (8) .. 42
Figura 14 – Mapa de correlações de 1H -13C HSQC do composto LQFM 180 (8) .................. 43 Figura 15 – Mapa de Correlações de 1H -13C HBMC do composto LQFM 180 (8) ................ 43 Figura 16 – Espectro na região do Infravermelho - LQFM 180 (8) ......................................... 45 Figura 17 - Voltamograma cíclico do composto LQFM 180 (8) ............................................. 46
Figura 18 - Alterações no sono induzido por pentobarbital sódico em animais tratados com
veículo (Tween 80 2,0%, 10 mL/kg v.o.), LQFM180 (8) (25, 50 ou 100 µmol/kg, v.o.) ou
Diazepam (1) 17,6 µmol/kg v.o., A - latência ao sono barbitúrico, em segundos e B - duração
do sono, em min. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=9). *p≤0,05,
**p≤ 0,01 ***p≤0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA
seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................................... 47 Figura 19 – Parâmetros observados no teste do labirinto em cruz elevado (A - número de
entradas nos braços abertos (EBA), B - tempo de permanência nos braços abertos (TBA) e C -
tempo de permanência na plataforma central (TPC) ................................................................ 50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - 1H RMN e 13C RMN deslocamentos químicos do 4-(3,5-di-terc-butil-4-
hidroxibenzil)piperazina-1-carboxilato de etila (LQFM180) em CDCl3 ................................ 41 Tabela 2 - Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto e da chaminé
.................................................................................................................................................. 48
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 15
1.1 Mercado farmacêutico global ................................................................................................................15
1.2 Novos candidatos a protótipos de fármacos para tratamento de desordens do SNC .............................16
1.3 Ansiedade ..............................................................................................................................................16 1.3.1 IMPACTO SÓCIO-ECONÔMICO DA ANSIEDADE ................................................................................. 19 1.3.2 TRANSTORNOS DE ANSIEDADE .............................................................. Erro! Indicador não definido. 1.3.2 SINTOMAS E SINAIS RELACIONADOS E BASES NEURAIS DA ANSIEDADE ........................................... 20
1.4 Tratamento Farmacológico nos Transtornos de Ansiedade ...................................................................24 1.4.1 BENZODIAZEPÍNICOS ............................................................................................................................... 25 1.4.2 INIBIDORES SELETIVOS DA RECAPTAÇÃO DA SEROTONINA .................................................................... 25
1.5 Prototipo neuroativo desenvolvido no Laboratório de Química Farmacêutica medicinal da UFG ..........26
1.4 Fármacos Antioxidantes ........................................................................................................................27
2 JUSTIFICATIVA ........................................................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 28
2.1 Objetivo Geral: ......................................................................................................................................28
2.2 Objetivos Específicos: ............................................................................................................................28
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 30
3.1 Reagentes e Solventes ...........................................................................................................................30
3.2 Procedimentos Experimentais ...............................................................................................................30 3.2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) .............................................................................. 30 3.2.2 MEDIDA DE PONTO DE FUSÃO ........................................................................................................... 30 3.2.3 MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS ......................................................................................................... 31 3.2.4 ESTUDO DO POTENCIAL REDOX POR VOLTAMETRIA CÍCLICA ............................................................ 31
3.3 Metodologia Sintética ...........................................................................................................................32 3.3.1 SÍNTESE DO 4-(3,5-DI-TERC-BUTIL-4-HIDROXIBENZIL) PIPERAZINA-1-CARBOXILATO DE ETILA (8) - LQFM180 (MANNICH, 1912). ............................................................................................................................ 32
3.4 Avaliação Farmacológica .......................................................................................................................33 3.4.1 FÁRMACOS E SOLUÇÕES .................................................................................................................... 33 3.4.2 ANIMAIS ............................................................................................................................................. 34 3.4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS TESTES FARMACOLÓGICOS ..................................................................... 34 3.4.4 MODELOS FARMACOLÓGICOS ......................................................................................................... 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 37
4.1 Planejamento estrutural de novo protótipo de fármaco ansiolítico .......................................................37
4.2 Metodologia sintética empregada para obtenção do composto LQFM 180 (8) ......................................38
4.3 Caracterização estrutural do composto LQFM 180 (8) ...........................................................................39 4.3.1 ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 1H UNIDIMENSIONAL E 1H-13C BIDIMENSIONAL................................................................................................................................................ 39 4.3.2 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO .................................................................... 44
4.4 Avaliação do Potencial Redox através de Voltametria Cíclica ................................................................46
4.5 Avaliação Farmacológica .......................................................................................................................47 4.5.1 TESTE DO SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SÓDICO ............................................................... 47 4.5.2 TESTE DO CAMPO ABERTO E DA CHAMINÉ ........................................................................................ 48 4.5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TIPO ANSIOLÍTICA DO COMPOSTO LQFM180 (8) – TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO ........................................................................................................................................... 50
5 CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 54
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Mercado farmacêutico global
O mercado farmacêutico global movimentou em 2014 1.057,0 bilhões de dólares
(Figura 1), sendo a América do Norte responsável por 38% deste montante, o que corresponde
a 406,7 bilhões de dólares (GLOBAL, 2015).
Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2006-2014, adaptado de
Global 2015.
Dentre as vinte classes terapêuticas (Figura 2) que mais faturaram em 2014, a classe
dos fármacos aplicados na saúde mental aparece em 6º lugar com faturamento de 39,4 bilhões
de dólares e a classe dos fármacos aplicados em desordens do sistema nervoso central (SNC)
aparece na 16ª posição com um faturamento de 20,1 bilhões de dólares. Estes números
traduzem o quanto a sociedade ainda sofre com doenças que afetam a saúde mental e
ratificam a busca de novos candidatos a protótipos de fármacos destinados ao tratamento de
diversas desordens do SNC, dentre elas a ansiedade (TOP, 2014).
Figura 2 – As vinte classes terapêuticas que mais movimentaram o mercado em 2014, adaptado
de TOP 2014.
16
1.2 Novos candidatos a protótipos de fármacos para tratamento de desordens do
SNC
No ano de 2016 a “Pharmaceutical Research and Manufacturers of America”
(PHRMA) publicou uma lista com 119 candidatos a protótipos de fármacos destinados à
manutenção da saúde mental, dentre os quais 15 vem sendo desenvolvidos especificamente
para tratamento de ansiedade.
Trata-se de fármacos que atuam nos mais diversos alvos relacionados ao
desenvolvimento da ansiedade, sendo um dos alvos mais trabalhados o receptor de serotonina.
São exemplos dessa categoria os protótipos: AVN 101, classificado como antagonista de
receptor de serotonina - 5HT6; TGFK08AA, classificado como modulador de recepetor
serotonina - 5HT1A e TGWOOAA, agonista de receptor de serotonina).
Estes protótipos se encontram em fase clínica ou em curso de aprovação pelo “Food
and Drug Administration (FDA)” para entrarem no mercado farmacêutico (PHRMA, 2016).
1.3 Ansiedade
A ansiedade e o medo são condições psicológicas naturais e essenciais à vida e
responsáveis por preparar o indivíduo psicologicamente e fisicamente para situações de
ameaça e perigo. Essas condições envolvem fatores cognitivos, comportamentais, afetivos,
fisiológicos e neurológicos que, em conjunto, modulam a percepção do indivíduo ao
ambiente, provocando respostas específicas e direcionando para algum tipo de ação
(CLARCK & BECK, 2012). A ansiedade pode ser definida como uma condição caracterizada
por apreensão relativa à percepção de não poder controlar ou prever eventos potencialmente
aversivos e sintomas fisiológicos de tensão física. Já o medo pode ser definido como uma
reação de alarme imediato em resposta a um evento aversivo presente, caracterizada por forte
excitação e tendência à ação, em geral de luta ou fuga (BARLOW & DURAND, 2008).
A ansiedade e o medo passam a ser reconhecidos como patológicos quando um
indivíduo passa a apresentá-los de maneira exagerada, desproporcional à situação que os
originaram, muitas vezes se mantendo de modo persistente e levando a prejuízos no seu
funcionamento, caracterizando então os denominados Transtornos de Ansiedade, fazendo-se
17
necessário então uma intervenção farmacológica e/ou psicológica (BARLOW & DURAND,
2008; CRASKE et al., 2009).
1.3.1 TRANSTORNOS DE ANSIEDADE
A ansiedade patológica inclui transtornos que compartilham características de medo e
ansiedade excessivos, além de perturbações comportamentais relacionadas. O mais recente
DSM-IV-TRTM (“Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”, 5ª edição, 2013)
da Associação Americana de Psiquiatras (APA), traz um conjunto de oito transtornos de
ansiedade, categorizados a partir de um grupo de sintomas específico a cada transtorno.
Subdividem-se em: ansiedade de separação, mutismo seletivo, fobia específica, transtorno de
ansiedade social (fobia social), transtorno de pânico, agorafobia, ansiedade generalizada e
ansiedade induzida por substância ou medicamento (Figura 3).
Figura 3– Ansiedade Patológica: Transtornos de Ansiedade (DSM-IV-TRTM 5ª edição, 2013).
O transtorno de ansiedade de separação caracteriza-se por apreensão ou medo
demasiados de uma possível separação de figuras de apego. Existe medo ou ansiedade
persistente quanto a ocorrência de dano a essas figuras ou em relação a eventos que poderiam
levar a perda ou separação delas. Existe também uma relutância em se afastar de tais figuras,
além de pesadelos e sintomas físicos de sofrimento.
18
O mutismo seletivo é caracterizado por fracasso consistente em falar em determinadas
ocasiões sociais nas quais existe a expectativa para que se fale (p. ex., na escola). O fracasso
para falar acarreta consequências significativas em contextos de conquistas ou profissionais
ou interfere em outros aspectos na comunicação social normal.
Os indivíduos portadores de fobia especifica são acometidos por um medo persistente
e irracional de um objeto ou situação específica, não considerada perigosa, que resulta na
necessidade incontrolável de se esquivar ou de evitar tal estímulo. Se isso não é possível o
contato é realizado com grande sofrimento e comprometimento do desempenho do indivíduo.
Uma ideação cognitiva especifica não está caracterizada nesse transtorno como está em outros
transtornos de ansiedade. Existem vários tipos de fobias especificas: a animais, ambiente
natural, sangue-injeção-ferimentos, situacional e outros.
No transtorno de ansiedade social (fobia social), o indivíduo é temeroso, ansioso ou
se esquiva de interações e situações sociais que envolvem a possibilidade de ser avaliado.
Estão inclusas situações sociais como encontrar-se com pessoas que não são familiares,
situações em que o indivíduo pode ser observado comendo ou bebendo e situações de
desempenho diante de outras pessoas. A ideação cognitiva associada é a de ser avaliado
negativamente pelos demais, ficar embaraçado, ser humilhado ou rejeitado ou ofender os
outros.
No transtorno de pânico, o indivíduo experimenta ataques de pânico inesperados e
recorrentes e está persistentemente apreensivo ou preocupado com a possibilidade de sofrer
novos ataques de pânico ou alterações desadaptativas em seu comportamento devido aos
ataques de pânico (p. ex., esquiva de exercícios ou de locais que não são familiares). Os
ataques de pânico são ataques abruptos de medo intenso ou desconforto intenso que atingem
um pico em poucos minutos, acompanhados de sintomas físicos e/ou cognitivos.
Os indivíduos com agorafobia são apreensivos e ansiosos acerca de duas ou mais das
seguintes situações: usar transporte público; estar em espaços abertos; estar em lugares
fechados; ficar em uma fila ou estar no meio de uma multidão; ou estar fora de casa sozinho
em outras situações. O indivíduo teme essas situações devido a pensamentos de que pode ser
difícil “escapar” ou de que pode não haver auxílio disponível caso desenvolva sintomas do
tipo pânico ou outros incapacitantes e/ou constrangedores.
A ansiedade generalizada é definida como um estado duradouro ansiedade e
preocupação persistentes e excessivas acerca de vários domínios, incluindo desempenho no
19
trabalho e escolar. Além disso, são experimentados sintomas físicos, incluindo inquietação ou
sensação de “nervos a flor da pele"; fadigabilidade; dificuldade de concentração ou "ter
brancos"; irritabilidade; tensão muscular e perturbação do sono.
O transtorno de ansiedade induzido por substância/medicamento envolve ansiedade
devido a intoxicação ou abstinência de substância ou a um tratamento medicamentoso (DSM-
IV-TRTM, 2013).
1.3.2 IMPACTO SÓCIO-ECONÔMICO DA ANSIEDADE
O número de pessoas que sofrem com algum tipo de doença mental é elevado e
crescente no mundo todo. Distúrbios como esquizofrenia, ansiedade, hiperatividade e déficit
de atenção, bipolaridade, depressão, transtornos alimentares ou abuso de drogas acometem
grande parcela da população mundial, custando aos cofres públicos cerca de 1 trilhão por ano.
Um estudo recente conduzido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) comprovou que
investir em tratamentos para doenças mentais fornece retorno econômico ao país, através de
melhoria da saúde e da capacidade de trabalho do indivíduo acometido pelo transtorno (OMS,
2016).
Dados do Núcleo de Epidemiologia Psiquiátrica do Instituto de Psiquiatria do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina de São Paulo, revelam que, aproximadamente 23%
dos brasileiros terão distúrbios relacionados à ansiedade ao longo de suas vidas. A Pesquisa
intitulada “São Paulo Megacity”, integrou um estudo da OMS realizado concomitantemente
em vários países. Por exemplo, segundo estes mesmo dados da Organização Mundial de
Saúde (OMS), o Brasil é um dos países que apresentam um alto índice de pessoas com
transtornos de ansiedade (23%). Colômbia (24%) e Estados Unidos (25%) têm maior
proporção de pessoas com esses transtornos, e China (19%) e Holanda (20%) têm menor
proporção de habitantes ansiosos (OMS, 2014).
A qualidade de vida de pessoas acometidas pelos diferentes tipos de transtorno de
ansiedade é bastante prejudicada. Em pacientes com transtorno de pânico, por exemplo, há
evidências de dificuldades de relacionamentos conjugais e financeiros; pacientes que sofrem
com fobia social têm deficiência na educação e relações sociais. Pacientes com agorafobia
possuem extrema dificuldade de desempenhar papéis básicos para se viver em sociedade, tais
20
como fazer uso de transportes, hospitais e outros órgãos públicos. Pacientes com ansiedade
generalizada têm altas taxas de divórcio, comprometimento escolar e incapacidade
profissional (OLATUNJI, CISLER e TOLIN, 2007).
Os transtornos de ansiedade interferem significativamente na vida do indivíduo
acometido e daqueles com quem ele convive, comprometendo suas atividades cotidianas e
seus relacionamentos sociais. Além disso, apresentam baixos índices de remissão espontânea
e tendem a se cronificar ou mesmo se desdobrar em outros transtornos psiquiátricos quando
não tratados (VIANNA, CAMPOS, & LANDEIRA-FERNANDEZ, 2009).
Dessa maneira, quanto mais cedo diagnosticados, avaliados e devidamente tratados,
melhores os prognósticos e menores os prejuízos para o indivíduo com transtornos de
ansiedade.
1.3.3 SINTOMAS E SINAIS RELACIONADOS E BASES NEURAIS DA ANSIEDADE
Embora a ansiedade seja considerada um transtorno mental, muitas vezes ela vem
acompanhada de sintomas físicos que comprometem o desempenho e o bem-estar da pessoa
por ela acometida. Os sinais e sintomas da ansiedade podem ser divididos em (FILHO et al.,
1995; ANDRADE et al.,1994):
Autonômicos: taquicardia, vasoconstrição, sudorese, aumento de peristaltismo,
taquipnéia, piloereção, midríase;
Musculares: dores, contraturas, tremores, dificuldades para relaxar, dores diversas e
inespecíficas;
Cenestésicas: parestesias, calafrios, adormecimentos;
Respiratórias: sensação de afogamento ou sufocação, dor ou pressão no peito;
Comportamentais: inquietação, esquiva, reage de forma assustada a pequenos
estímulos, insônia e irritação;
Psíquicos: tensão, nervosismo, apreensão, mal-estar indefinido, insegurança e
dificuldade de concentração.
Devido à complexidade e diversidade de sintomas e sinais, a etiologia da ansiedade é
complexa e envolve vários neurotransmissores e vias cerebrais distintas.
Os diversos neurotransmissores envolvidos estão correlacionados, uma vez que
participam, em maior ou menor grau, da modulação e regulação dos comportamentos
21
defensivos que originam a ansiedade. Destacam-se as aminas biogênicas i.e. noradrenalina,
serotonina e dopamina; aminoácidos, como ácido aminobutírico (GABA) e glicina; peptídeos,
como fator de liberação de corticotropina, corticotropina, colecistocinina; além de esteroides,
como corticosterona; dentre outros (CLEMENT e CHAPOUTHIER, 1998; GRAEFF, 2007;
SULLIVAN et al., 1999).
O sistema límbico (Figura 4) é constituído de diversas estruturas cerebrais dispostas de
maneira interconectada. É considerado o substrato anatômico das emoções, da memória e do
comportamento e se divide em Sistema Cerebral de Defesa (SCD) e o Sistema de Inibição
Comportamental (SIC) (GRAEFF & HETEM, 2004).
Figura 4– Sistema límbico e estruturas cerebrais.
O SCD é formado por um conjunto de estruturas nervosas: Amígdala, Hipotálamo
Medial (HM) e Matéria Cinzenta Periaquedutal (MCP). A amígdala é responsável pela
expressão do medo e consecutiva resposta de agressão, ou seja, é a base cerebral essencial
para o comportamento defensivo, desempenhando um papel importante na formação e
recuperação de memórias emocionais e respectivos medos relacionados. É constituída por um
conjunto de núcleos cerebrais densos denominados de núcleo central, lateral e basolateral da
amígdala. O núcleo central da amígdala possui conexões nervosas com estruturas límbicas
mais profundas e funciona como interface sensório-emocional entre elas, avaliando e
classificando o tipo e grau do estímulo. O resultado é transmitido através de projeções ao
Locus coeruleus (LC), na substância cinza periaquedutal e no hipotálamo (GRAEFF,
22
HETEM, 2004; SILVA, 2001; KIM e GORMAN, 2005; MARTIN et al., 2010).
O Hipotalámo Medial tem o controle tônico inibitório sobre o sistema de resposta ao
estresse hipotalâmico, além de desempenhar um papel no feedback negativo no eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (MARTIN et al., 2010).
O SIC tem como principal substrato neural o sistema septohipocampal. A ativação
deste sistema por sinais condicionados de punição ou frustração, estímulos ameaçadores ou
situações novas provoca inibição de qualquer movimento que o animal esteja realizando,
aumento no nível de vigilância, de atenção e preparo para ação vigorosa (GRAEFF e
HETEM, 2004).
Neurônios noradrenérgicos localizados no LC, bem como em outros núcleos na
medula e na ponte, são ativados durante o estresse e a ansiedade, sendo importantes na
mediação de respostas de medo. O sistema mediado pelos neurônios noradrenérgicos
pertencentes ao LC é denominado sistema LC-NE, que tem o papel de enviar projeções ao
córtex pré-frontal, amígdala, núcleo da estria terminal, hipocampo, substância cinza
periaquedutal, hipotálamo, tálamo e o núcleo do trato solitário. O LC está posicionado no
cérebro de maneira a integrar sensações e alterações viscerais internas com as estruturas
neuronais como a amígdala e o núcleo do trato solitário (SULLIVAN et al., 1999).
A ativação do sistema nervoso autônomo simpático pelo LC atua em múltiplos órgãos,
incluindo os sistemas cardiovascular, pulmonar, urogenital e gastrointestinal responsáveis
pelos sinais e sintomas somáticos da ansiedade (SULLIVAN et al., 1999).
Dentre as diversas mecanismos e regiões cerebrais envolvidos no desenvolvimento da
ansiedade pode-se explicitar 4 principais eixos: Hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA),
GABAérgico, Serotoninérgico e Noradrenérgico.
A presença de um estímulo ameaçador leva à ativação cortical da amígdala do
indivíduo ameaçado. A mensagem é então transmitida aos neurônios do núcleo
paraventricular do hipotálamo, órgão regulador do funcionamento da hipófise que, através da
secreção do hormônio adrenocorticoprópico (ACTH) estimula as glândulas suprarrenais a
secretar glicocorticóides, como cortisol, norepinefrina e epinefrina. Como as situações de
ameaça geralmente necessitam de atividade vigorosa i.e. luta ou fuga, a ativação do córtex
adrenal, bem como do ramo do sistema nervoso autônomo, ao levarem a liberação de
glicocorticóides, cujas ações nos tecidos-alvos são catabólicas, ajudarão a promover a
mobilização de fontes de energia do corpo para enfrentamento da situação ameaçadora
23
(GRAEFF, HETEM, 2004; SILVA, 2001).
Além das ativações do eixo HPA e do sistema simpático, transtornos de ansiedade
também são caracterizados por alterações no sistema GABAérgico. O GABA é um
neurotransmissor encontrado em todo o sistema nervoso central e exerce uma ação inibitória
sobre neurônios serotoninérgicos. Com uma distribuição abrangente estes neurônios
inibitórios funcionam como controladores, e garantem uma ação moderada do sistema
nervoso (GORENSTEIN, POMPÉIA, 1999). A participação do sistema GABAérgico na
ansiedade foi sustentada em decorrência do estudo dos mecanismos de ação dos
benzodiazepínicos, no final dos anos 1960 (SILVA, 2001). A modulação do sistema
GABAérgico pelos benzodiazapínicos pode funcionar de duas maneiras: através da
intensificação das ações do GABA no SNC em nível pós-sináptico, aumentando a afinidade
dos receptores GABA pelo neurotransmissor, gerando um efeito ansiolítico e
anticonvulsivante; ou em sentido contrário, através da redução da afinidade do GABA pelo
receptor GABA, constituindo então um agonismo inverso gerando um efeito ansiogênico e
convulsivante (RIBEIRO, BUSNELO, KAPCZINSKI, 1999). Em pacientes que não tinham
nenhum transtorno de ansiedade foi observada a presença de agonistas endógenos do sítio
benzodiazepínico, e em pacientes ansiosos os tônus destes agonistas está diminuído ou são
menos eficazes e há ainda a presença de agonistas inversos (CLEMENT e CHAPOUTHIER,
1998; KIM e GORMAN, 2005).
A serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) desempenha um papel complexo na
neurotransmissão ocorrida na ansiedade. Envolvendo mecanismos pré e pós-sinápticos e
diferentes tipos de receptores serotoninérgicos, o papel deste neurotransmissor na regulação
do comportamento de defesa e consequentemente na ansiedade parece ser duplo: os sinais de
perigo estimulariam o sistema de defesa e ativariam neurônios serotoninérgicos que inervam a
amígdala e a matéria cinzenta periaquedutal, facilitando a defesa na primeira e inibindo nesta
última. (CLEMENT e CHAPOUTHIER, 1998; RESSLER e NEMEROFF, 2000).
A noradrenalina é uma monoamina comumente implicada na defesa e na ansiedade.
No SNC, neurônios que sintetizam noradrenalina estão situados nas regiões bulbar e pontina,
sendo que o grupo mais importante situa-se no LC. A ativação do LC por estímulos
estressantes, ameaçadores, produzem uma reação comportamental cardiovascular
característica de medo. Acredita-se que o Locus Ceruleus funcione como um “sistema de
alarme”, ou seja, exerce a função de atenção, monitorando continuamente o ambiente e
24
preparando o organismo para situações de emergência. Essa maior ativação do sistema
nervoso autônomo que é o responsável pelos principais sintomas somáticos da ansiedade, por
exemplo, hiperventilação, palpitações e transpirações. Antagonistas α2-adrenérgicos, como a
ioimbina, aumentam a disponibilidade de noradrenalina na fenda sináptica simpática e
possuem efeito ansiogênico em modelos animais de ansiedade, sendo que os agonistas α2-
adrenérgicos, como a clonidina, diminuem a atividade simpática, atuando como ansiolítico.
(RESSLER e NEMEROFF, 2000; SULLIVAN et al., 1999).
1.4 Tratamento Farmacológico nos Transtornos de Ansiedade
Os transtornos de ansiedades são condições clínicas de curso crônico e flutuante,
caracterizados por preocupação excessiva persistente associada a sintomas físicos e psíquicos
de ansiedade, como cefaleia, dores musculares, palpitações, fadiga, irritabilidade, insônia e
dificuldade de concentração. A etiopatogenia destes transtornos é complexa e pouco estudada,
sendo atribuída a fatores genéticos, ambientais e epigenéticos que promovem disfunções no
circuito amígdala-córtex cingulado-córtex pré-frontal (BANDELOW, B. et. al., 2014). Já foi
visto acima que os principais sistemas de neurotransmissores que desempenham papel
etiopatogênico ou de modulação nas manifestações dos transtornos de ansiedade são os
sistemas monoaminérgicos. Devido a esta gama de múltiplos fatores que desencadeiam e
influenciam a ansiedade, o tratamento farmacológico desta doença pode ser feito por
diferentes classes de medicamentos.
Primeiramente, são utilizados aqueles que, em sua maioria, têm propriedades
calmantes, incluindo barbitúricos, opiáceos, beta-bloqueadores e benzodiazepínicos. Destes,
os benzodiazepínicos são os mais específicos e eficazes, e são, portanto, amplamente usado
para tratar tanto a normal quanto a ansiedade patológica. No entanto, nas últimas décadas,
uma outra classe de fármacos, os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS),
substituíram os benzodiazepínicos como tratamento de primeira linha para a ansiedade,
principalmente porque eles não têm as propriedades viciantes dos benzodiazepínicos. ISRSs,
tais como cloridrato de fluoxetina (Prozac; Eli Lilly), sertralina (Zoloft, Pfizer), citalopram
(Celexa; Floresta Pharmaceuticals) e cloridrato de paroxetina (Paxil, GlaxoSmithKline), são
utilizados de forma eficaz para tratar a maioria dos transtornos de ansiedade (GROSS, C.,
HENR, R., 2004; BANDELOW, B. et. al., 2014).
25
1.4.1 BENZODIAZEPÍNICOS
Os benzodiazepínicos, classe que tem como principal representante o diazepam
(Figura 5), aumentam a potência do principal neurotransmissor inibidor no cérebro, o GABA
(ácido γ-aminobutírico), através da modulação da função de receptores GABA. Eles se ligam
a receptores próprios (receptores BZD ou ômega) localizados no complexo receptor
BZD/receptor GABAA/canal de cloreto. A ligação dos benzodiazepínicos ao receptor GABAA
é uma ligação alósterica que modifica o receptor facilitando a ligação do GABA ao seu
respectivo receptor. Dessa maneira há um aumento da frequência de abertura do canal de
cloreto e, consequentemente, aumenta também o influxo de cloreto, levando a
hiperpolarização celular. A eficácia de fármacos que melhoram o GABA, tem sido trabalhada
já que a neurotransmissão excitatória excessiva é uma característica fisiológica importante nos
transtornos de ansiedade. O flumazenil (Figura 6) se liga ao sítio receptor dos
benzodiazepínicos bloqueando a ligação dos agonistas benzodiazepínicos, atuando como
antagonista competitivo benzodiazepínico. (GROSS, C., HENR, R., 2004, CLEMENT e
CHAPOUTHIER, 1998; YU, LEE e JANG, 2007).
Figura 5 – Diazepam (1) Figura 6 – Flumazenil (2)
1.4.2 INIBIDORES SELETIVOS DA RECAPTAÇÃO DA SEROTONINA
Os ISRS como a fluoxetina (Figura 7) e o citalopram (Figura 8) agem bloqueando
seletivamente a recaptação de serotonina (5-HT), pós-sináptica, aumentando assim a potência
de 5-HT no cérebro. Embora as consequências fisiológicas dessa potência aumentada ainda
26
não são bem compreendidos, estudos de imagem funcional mostram que o tratamento com
ISRS pode diminuir a excitabilidade no cérebro. Uma diferença importante entre os modos de
ação dos benzodiazepínicos e ISRSs é a cinética no cérebro. Benzodiazepínicos agem
rapidamente, em poucos minutos de administração, enquanto que ISRSs agem de maneira
muito mais lenta. Os efeitos terapêuticos dos ISRSs só se tornam aparente de duas e quatro
semanas após o início do tratamento.
Figura 7 - Cloridrato de Fluoxetina (3) Figura 8 - Citalopram (4)
1.5 Prototipo neuroativo desenvolvido no Laboratório de Química Farmacêutica
medicinal da UFG
No ano de 2011 foi desenvolvido no Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (UFG), pela então Mestranda em
Ciências Farmacêuticas Adriane Ferreira de Brito, sob orientação do Prof. Dr. Ricardo
Menegatti, um novo derivado piperazínico denominado LQFM008 - etil 4-((1-fenil-1H-
pirazol-4-il)metil)piperazina-1 carboxilato (Figura 9).
27
Figura 9 - LQFM008 (5)
NN
N NO
O
Avaliado farmacologicamente no Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais e
Sintéticos também da UFG, o novo composto apresentou um perfil de atividade tipo
ansiolítica em diferentes modelos animais, sem comprometimento da atividade motora,
parecendo envolver a participação de receptores 5HT1A (receptor de serotonina do Tipo 1A)
(BRITO et. al., 2011). O LQFM008 também exibiu uma atividade tipo antidepressiva a qual
parece envolver ambos os sistemas serotoninérgico e catecolaminérgico, sem inibição da
enzima MAO (monoamino oxidase) (GALDINO et. al., 2015).
1.4 Fármacos Antioxidantes
Radicais livres não causam somente envelhecimento precoce no ser humano, mas são
também as causas primárias do desenvolvimento de câncer e outras doenças crônicas do
Sistema Nervoso Central (SNC) (YEHYE, W. A. et al., 2015).
Ansiedade e Depressão são as formas mais comuns de desordens do SNC relacionadas
ao desequilíbrio entre o estresse oxidativo e sistema biológico antioxidante. Para combater as
mudanças bioquímicas decorrentes de estresses oxidativos, o corpo humano conta com um
sistema biológico de defesa antioxidante. Estudos recentes realizados com pacientes
portadores de ansiedade generalizada mostraram que a terapia antioxidante suplementar como
adjuvante terapêutico é muito útil e promissora (GAUTAM, M. et al., 2012).
A fosforilação oxidativa ocorre nas mitocôndrias das células e é a principal fonte de
energia em organismos aeróbicos. A desvantagem deste processo vital é a produção de
radicais livres, geralmente resultando em níveis elevados de espécies reativas de oxigênio e de
28
nitrogênio (ERO e ERN). Em concentrações baixas ou moderadas, eles são neutralizados em
processos fisiológicos normais, dentro de uma série de mecanismos de proteção, enzimáticos
e não enzimáticos. Componentes do sistema enzimático incluem a superóxido dismutase,
catalase e glutationa. No sistema não enzimático, ressaltam-se os compostos alfa-tocoferol
(vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), flavonóides, compostos polifenólicos e minerais
(por exemplo, zinco, cobre e selênio). Em condições normais, as ERO e ERN são reguladas
por um fluxo de orquestra de todas estas espécies antioxidantes citadas. Por outro lado, um
estresse oxidativo prolongado ou elevado não é controlado pelas espécies antioxidantes a
contento e ocorre então danos às principais macromoléculas (proteínas, lípidos, carboidratos,
e ácidos nucleicos), que, em última instância resultam em apoptose. Levando-se em
consideração que o cérebro tem uma das mais altas taxas de consumo de oxigênio em massa
no corpo, mesmo os mais pequenos desequilíbrios entre os mecanismos de defesa
antioxidantes e o estresse oxidativo pode ser prejudicial para os neurônios. É bem
documentado cientificamente que os antioxidantes podem remover as ERO e ERN,
esperando-se então a redução de sintomas de ansiedade e depressão. A compreensão funcional
da relação entre estresse oxidativo e depressão e ansiedade pode abrir o caminho para a
descoberta de novos alvos para o tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos (XU, Y., et al
2014).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Pesquisa e desenvolvimento de um novo candidato a protótipo de fármaco ansiolítico
dotado de propriedades antioxidantes.
2.2 Objetivos Específicos:
a) Planejar e sintetizar o composto objeto de estudo;
b) Caracterizar estruturalmente o composto sintetizado, através do emprego de espectroscopia
de Ressonância Magnética Nuclear e na região do Infravermelho;
c) Avaliar a atividade antioxidante do composto, através de Voltametria Cíclica.
29
d) Avaliar a atividade farmacológica central do composto através dos seguintes parâmetros:
Atividade depressora ou estimulante de LQFM180 através do teste do sono induzido
por pentobarbital sódico;
Alterações comportamentais de exploração ambiental induzida pelo tratamento com
LQFM180, no teste do campo aberto;
Alterações na coordenação motora induzidas pelo tratamento com LQFM180
utilizando o teste da chaminé.
A relação dose-efeito e a influência do tempo de tratamento no efeito de LQFM180
em modelos de ansiedade, com o teste de labirinto em cruz elevado.
30
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes e Solventes
Os reagentes utilizados foram: hexano (C6H14), acetato de etila (AcOEt), clorofórmio
(CHCl3), acetona ((CH3)2CO), acetonitrila (CH3CN), álcool etílico 95% (EtOH), álcool
metílico (MeOH) e cloreto de metileno (CH2Cl2), todos grau P.A.; bicarbonato de sódio
(NaHCO3), carbonato de sódio (Na2CO3) e sulfato de sódio anidro (Na2SO4), todos da marca
Vetec Química Fina Ltda; ácido acético glacial (CH3COOH) da marca Dinâmica; clorofórmio
deuterado (CDCl3) da marca Cambridge Isotope Laboratories Inc (CIL).
As fases orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro e o solvente removido à pressão
reduzida.
As reações ocorreram em sistema de refluxo, com auxílio de aquecedores, utilizando
vidrarias convencionais.
3.2 Procedimentos Experimentais
3.2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Para monitoramento das reações foram utilizadas placas de alumínio Whatman 20x20
cm revestidas com sílica gel 60 F254 e espessura de 0,25mm, empregando-se como fase
móvel hexano:acetato de etila (70:30), diclorometano:metanol (95:5), e visualização e
detecção por lâmpada ultravioleta (254 e 365 nm).
3.2.2 MEDIDA DE PONTO DE FUSÃO
Os pontos de fusão, em graus Celsius (ºC) foram determinados em aparelho Marte, no
Laboratório de Química Farmacêutica (LQFM), também da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Goiás.
31
3.2.3 MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
3.2.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de H Unidimensional e H-C
Bidimensional
Os compostos sintetizados foram caracterizados através da técnica de RMN. Os
espectros de 1H Unidimensional e 1H-13C Bidimensionais (HSQC e HMBC) foram obtidos no
Laboratório de RMN do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás (IQ/UFG)
num espectrômetro BRUKER – AVANCE III 500 de 11,75 Tesla, operando a 500 MHz
(frequência do hidrogênio) e equipado com os seguintes acessórios:
Sonda multinuclear para tubo de 5 mm de diâmetro com detecção inversa e
gradiente de campo no eixo z;
Unidade de temperatura variável.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm e foram adquiridos
utilizados CDCl3 e Tetrametilsilano (TMS), como referência interna o sinal do TMS. Os
espectros foram tabulados na ordem dos números de núcleos, mutiplicidade (s, singleto; d,
dubleto; dd, duplo dubleto; q, quarteto; t, tripleto) e a constante de acoplamento (J) em Hz.
3.2.3.2 Espectroscopia na região do Infravermelho (IV)
Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos no Laboratório Químico
Forense do Instituto de Criminalística Leonardo Rodrigues, em um espectrômetro de
infravermelho Perkin Elmer Frontier – Universal ATR Sampling, com as frequências de
absorção expressas em cm-1.
3.2.4 ESTUDO DO POTENCIAL REDOX POR VOLTAMETRIA CÍCLICA
Para as medidas voltamétricas foram usados três eletrodos: (i) de trabalho, sendo
eletrodos de pasta de carbono modificados com as amostras do composto LQFM 180 (60 mg
grafite, 5 mg da amostra e 20 mg de óleo mineral), em cuja superfície ocorrem processos
redox envolvendo os constituintes do analito; (ii) de referência de Ag/AgCl/KCl 3M, cujo
potencial é mantido, à medida que o potencial aplicado sobre o eletrodo de trabalho varia; (iii)
32
e o eletrodo auxiliar de espiral de platina, o qual, sendo um material condutor, possibilita que
o fluxo da carga ao longo do tempo seja apenas entre este eletrodo e o de trabalho. Isto
contribui para que o potencial do eletrodo de referência se mantenha constante, evitando a
ocorrência de processos com os constituintes do eletrodo de referência.
Todas as medidas eletroquímicas foram realizadas em um
Potenciostato/Galvanostato µAUTOLAB® da Eco Chemie (Holanda) acoplado ao software
GPES 4.9®, conectado a uma célula eletroquímica com sistema de três eletrodos pertencente
ao Laboratório de Desenvolvimento de Métodos Alternativos para Análise Farmacêutica da
Faculdade de Farmácia - UFG.
As medidas eletroquímicas foram feitas através de voltametria cíclica, utilizando-se
como eletrólito suporte solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0; velocidade de varredura 10
mV s-1; amplitude de pulso de 50 mV e largura de puso de 0.5s.
Para ajuste do pH da solução tampão fosfato utilizou-se pHmetro da marca Logen
modelo LSPHS 25CW com eletrodo de vidro universal da marca Eltex.
3.3 Metodologia Sintética
3.3.1 SÍNTESE DO 4-(3,5-DI-TERC-BUTIL-4-HIDROXIBENZIL) PIPERAZINA-1-
CARBOXILATO DE ETILA (?) - LQFM180 (MANNICH, 1912).
Figura 10 - Metodologia de síntese do composto LQFM 180 (8)
Em um balão volumétrico de 50 mL imerso em banho de gelo foram adicionados 1,00
mmol da piperazina-carboxilato de etila (6), 0,09 mL de formaldeído e 0,2 mL de ácido
acético concentrado. Retirado o balão do banho de gelo e colocado em sistema de refluxo, foi
adicionado então 1,00 mmol de 2,6-di-terc-butilfenol (5). A mistura reacional foi mantida sob
OH N
N
H
O O
+ OH
N
N
O
O
LQFM180 (8) (6) (7)
CH2O
CH3CO
2H,
, 1 h, 92%
33
temperatura de refluxo até o completo consumo de piperazina, monitorado através de CCD.
Após o término da reação, a mistura foi extraída com 50 mL de acetonitrila, particionados
com alíquotas de 3x20 mL de hexano.
A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e concentrada em rotaevaporador.
Foram obtidos 0,346 g (92,0% de rendimento) de 4-(3,5-di-terc-butil-4-
hidroxibenzil)piperazina-1-carboxilato de etila (C22H36N2O3) (LQFM180), como cristais cor
âmbar; P.M. = 376,27 g/mol; P.F.= 113°C; R.f. = 0,21 em hexano:AcOEt (70:30 v/v).
RMN 1H (500 MHz) CDCl3/TMS (δ): 7,08 (2H, s, H-2’ e H-6’), 4,12 (2H, q, J= 7.05,
H-9), 3,49 (4H, m, H-4 e H-6), 3,45 (2H, s, H-1), 2,42 (4H, m, H-3 e H-7), 1,43 (18H, s, H-7’
e H-8’), 1,24 (3H, t, J= 7.05, H-10).
13C-NMR - HSQC e HMBC (125,76 MHz) CDCl3/TMS (δ): 155,6 (C-8), 153,2 (C-
4’), 152,9 (C-1’), 126,2 (C-2’ e C-6’), 63,8 (C-1), 61,7 (C-9), 53,1 (C-3 e C-7), 44,3 (C-4 e C-
6), 34,4 (C-9’ e C-10’), 31,2 (C-7’ e C-8’), 14,8 (C-10).
IV máx. cm-1: 3544 (O-H), 1686 (C=O) e 1432 (C=C aromático)
3.4 Avaliação Farmacológica
Após a síntese e caracterização estrutural do composto LQFM 180 (8), foram
realizados estudos farmacológicos para verificar a atividade neurofarmacológica. Os trabalhos
foram realizados no Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos da UFG,
sob a orientação do professor Dr. Elson Alves Costa. A avaliação da atividade farmacológica
foi realizada pela doutoranda Adriane Ferreira de Brito.
Todos os experimentos foram executados de acordo com os padrões internacionais de
bem-estar animal recomendados pela Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de
Laboratório (SBCAL) e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás sob o número 104/2011.
3.4.1 FÁRMACOS E SOLUÇÕES
Para realização dos testes farmacológicos foram utilizados os seguintes fármacos e
soluções:
Emulsão de LQFM 180 em Tween 80®
(Sigma - EUA) a 2 %
34
solubilizada em água destilada.
Emulsão de Tween 80®
(Sigma - EUA) a 2 % em água destilada.
Pentobarbital sódico (Abbott - Brasil) dissolvido em solução salina
(NaCl) 0,9 %.
Diazepam (Cristália - Brasil) dissolvido em solução salina 0,9 %.
Para a administração do LQFM180, foi preparada uma emulsão deste com monooleato
de polioxietileno sorbitano (Tween 80®
a 2 %), que depois foi solubilizada em água
destilada. Este emulsificante também foi utilizado no preparo da solução veículo (Tween 80®
a 2 %) administrada ao grupo controle. Para os tratamentos pela via oral foi utilizada uma
cânula intra gástrica, enquanto que para os tratamentos pela via subcutânea e intraperitoneal
foram utilizadas agulhas estéreis.
3.4.2 ANIMAIS
Foram utilizados camundongos swiss machos adultos pesando entre 25-35 g em todas
as avaliações. Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de
Goiás e mantidos no Biotério do Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais e
Sintéticos do Departamento de Farmacologia/ICB/UFG, sob condições controladas de
temperatura (23 ± 1o C) e iluminação (ciclo claro/escuro de 12 h, com as luzes ligadas às 7:00
h), com livre acesso à água e alimento por um período mínimo de uma semana até serem
utilizados nos procedimentos experimentais.
Os testes foram realizados em salas destinadas a experimentação onde nenhuma outra
atividade estava sendo realizada no momento. As sessões experimentais ocorriam sempre das
8h00min à, no máximo, 16h00.
3.4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS TESTES FARMACOLÓGICOS
Para análise estatística dos dados obtidos, foi utilizado o software GraphPadPrism
5.0®
. Foram utilizados os métodos Média ± EPM, com software Graphpad 5.0, Teste T de
Student e ANOVA + Newmans Keuls. As diferenças foram consideradas significativas
quando p < 0,05.
35
3.4.4 MODELOS FARMACOLÓGICOS
3.4.4.1 Teste do sono induzido por pentobarbital sódico
Os animais foram pré-tratados pela via oral com a solução veículo (Tween 80®
; a 2 %
10 mL/kg v.o.), LQFM180 (nas doses de 25, 50 ou 100 mol/kg v.o.) ou com diazepam (17,6
mg/kg v.o.).
Após 60 minutos dos tratamentos os animais receberam pentobarbital sódico 50
mg/kg pela via intraperitoneal. O tempo entre esta administração do fármaco até a perda do
reflexo postural foi cronometrado e identificado como latência ao sono, e o tempo entre a
perda e recuperação voluntária do reflexo postural foi cronometrado e identificado como
duração do sono (CARLINI & BURGOS, 1979).
3.4.4.2 Teste do campo aberto
Este teste consiste em colocar o animal em uma arena circular, estando o piso da
arena dividido em oito áreas iguais dispostas de maneira a formar três círculos concêntricos.
Os animais foram tratados pela via oral com a solução veículo (Tween 80®
; a 2 % 10 mL/kg
v.o.), LQFM180 (nas doses de 25, 50 ou 100 mol/kg v.o.) ou com diazepam (17,6 mg/kg
v.o.).
Após 60 min. dos tratamentos, os animais foram colocados individualmente no centro
do campo aberto, sendo o comportamento dos mesmos observado durante 5 minutos. Foi
anotado o seguinte parâmetro: atividade exploratória: indicada pelo número de cruzamentos
com as quatro patas, número de levantadas e o tempo de imobilidade (s). Também foi
observada a atividade tipo ansiolítica indicada pelo número de cruzamentos no centro do
campo e pelo tempo gasto no centro do campo (s). Também foram avaliados número de
comportamentos de autolimpeza, que indica estereotipia e o número de bolos fecais, que pode
estar relacionado ao estado de emocionalidade do animal (ARCHER, 1973; SIEGEL, 1946).
3.4.4.3 Teste da chaminé
O teste da chaminé consiste de um tubo cilíndrico de 25 cm de comprimento,
36
contendo uma delimitação a 10 cm de uma das extremidades (Figura 10). Os animais foram
tratados pela via oral com a solução veículo (Tween 80®
; a 2 % 10 mL/kg v.o.), LQFM180
(nas doses de 25, 50 ou 100 mol/kg v.o.) ou com diazepam (17,6 mg/kg v.o.).
Após 60 minutos dos tratamentos, os animais foram individualmente introduzidos
com o focinho voltado para a extremidade delimitada, estando o tubo em posição horizontal.
No momento em que os animais alcançaram a extremidade oposta, o tubo foi colocado em
posição vertical, registrando-se o tempo que o animal levou para alcançar a delimitação,
movendo-se em marcha-ré (tempo de escalada) (LAPA, et al., 2008).
3.4.4.4 Teste do labirinto em cruz elevado
O labirinto em cruz elevado consiste em uma plataforma com dois braços abertos (30
cm de comprimento, 5 cm de largura, com uma proteção lateral de 0,5 cm) perpendiculares a
dois braços fechados (30 cm de comprimento, 5 cm de largura, 25 cm de altura) formando
uma cruz grega, contendo ainda uma plataforma central (5 x 5 cm) conectando-os. O labirinto
é elevado 45 cm do nível do chão. Os animais foram tratados pela via oral com a solução
veículo (Tween 80®
; a 2 % 10 mL/kg v.o.), LQFM180 (nas doses de 25, 50 ou 100 mol/kg
v.o.) ou com diazepam (3.51 mg/kg v.o.).
Após 60 min. dos tratamentos os animais foram colocados individualmente na
plataforma central, com a cabeça voltada para um dos braços fechados, sendo o
comportamento observado durante 5 minutos. A avaliação dos parâmetros comportamentais
ocorreu em uma sala com luz vermelha. Foram registrados o número de entradas e o tempo de
permanência nos braços abertos e fechados (LISTER, 1987; PELLOW et al., 1985).
Posteriormente o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos foram
convertidos em percentual em relação ao total obtido:
37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Planejamento estrutural de novo protótipo de fármaco ansiolítico
O novo composto LQFM180 (8) foi planejado através da estratégia de hibridação
molecular a partir dos protótipos LQFM008 (5) e do BHT (9), os quais apresentam efeito
ansiolítico e antioxidante, respectivamente, visando à obtenção de um composto com perfil de
atividade dual.
Figura 11- Planejamento do composto LQFM180 (8) através da estratégia de hibridação
molecular, a partir dos protótipos LQFM008 (5) e BHT (9).
A hibridação molecular é uma ferramenta empregada pelos químicos medicinais e
busca a junção de fragmentos bioativos em uma estrutura molecular química única. É uma
estratégia clássica eficiente para o desenho de novos protótipos (BARREIRO, E. J, 2002).
O composto LQFM180 (8) contempla em sua estrutura a subunidade piperazínica (C)
e presente no protótipo composto LQFM008 (5), além de substituir subunidade N-
fenilpirazola (A+B) pela subunidade 2,6-di-terc-butil-fenol presente no BHT (9).
Além disso, os novos compostos contemplam os filtros farmacocinéticos, segundo as
regras de LIPINSKI, 2004 ou regras dos cinco. São elas: candidato a protótipos de fármacos
devem apresentar número de unidade de massa atômica menor ou igual a 500; o número de
38
sítios aceptores de ligação de hidrogênio menor ou igual a 10; o número de sítios doadores de
ligação de hidrogênio menor ou igual a 5, propriedade hidrogeniônica, pH, menor que 5, e o
coeficiente de partição inferior a 5 (LIPINSKI, 2004).
4.2 Metodologia sintética empregada para obtenção do composto LQFM 180 (8).
O mecanismo
que leva à formação do composto LQFM180 (8) se inicia com o
formaldeído sendo protonado pelo ácido acético, o que faz com que a carbonila se torne mais
eletrofílica. Na sequência, por meio de seu nitrogênio secundário, a piperazina (7) se adiciona
ao formaldeído protonado, levando à formação do intermediário de adição (10). Uma
transferência de próton para a subunidade hidroxila, torna-a melhor grupamento abandonador
(11). Na próxima etapa, através de uma assistência anquimérica do par de elétrons do
nitrogênio há a eliminação de uma molécula de água, caracterizando a etapa de eliminação e
formando o intermediário 12. Na etapa subsequente, através de uma nova assistência
anquimérica do par de elétrons da hidroxila fenólica, ocorre a formação da ligação entre o
carbono 4 aromático (6) e o carbono emínico do intermediário 12, resultando no intermediário
13. Em seguida, uma desprotonação restaura a aromaticidade da subunidade aromática,
formando o composto final LQFM180 (8) (MANNICH, 1912).
39
Figura 12 – Mecanismo de reação de formação do composto LQFM 180 (8).
4.3 Caracterização estrutural do composto LQFM 180 (8)
4.3.1 ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 1H
UNIDIMENSIONAL E 1H-13C BIDIMENSIONAL
A completa atribuição dos hidrogênios e carbonos para o composto LQFM180 (8) se
encontra na Tabela 1 e nas Figuras 13, 14 e 15. Para maior compreensão, segue abaixo a
discussão sobre como a atribuição dos mesmos foi realizada.
40
Como ilustrado na Figura 13, em 4,12 ppm, observa-se um quarteto (constante de
acoplamento (J) de 7,05 proveniente do hidrogênio do grupo metileno, estando este mais
desblindado pelo fato de se encontrar adjacente ao oxigênio do grupo éster.
No anel piperazínico, os hidrogênios 3 e 7 resultam em um multipleto em 2,42 ppm,
integrando para 4 hidrogênios. Da mesma forma, porém, mais desblindados que os primeiros,
devido à anisotropia com o oxigênio do grupo éster, os hidrogênios 4 e 6 resultam em um
sinal de 3,49 ppm, também integrando para 4 hidrogênios.
O singleto observado em 3,45 ppm integra para 2 hidrogênios, sendo correspondente
aos hidrogênios da posição 1, sugerindo que a reação ocorreu.
O singleto em 7,08 ppm (integral de 2H) corresponde aos hidrogênios aromáticos,
identificados nas posições 2’ e 6’.
Devido à simetria dos substituintes no anel aromático em questão, as metilas
identificadas com 7’ e 8’ resultam em um único singleto em 1,44 ppm, integrando para 18
hidrogênios.
41
Tabela 1 – Sinais de 1H RMN e 13C RMN do 4-(3,5-di-terc-butil-4-
hidroxibenzil)piperazina-1-carboxilato de etila (LQFM180 (8)) em CDCl3.
LQFM 180 (8)
OH
N
N
O
O
1'
2'
3'9'
7'
7'
7'
4'
5'
6'
8'
8'
8'
1
7
6
3
4
8
9
10
10'
n° 1H
(deslocamento,
integral e
multiplicidade)
13C
(deslocamento)
1 3,45 (2H, s) 63,8
3 e 7 2,42 (4H, m) 53,1
4 e 6 3,49 (4H, m) 44,3
8 - 155,6
9 4,12 (2H, q, J=
7,05)
61,7
10 1,24 (3H, t, J=
7.05)
14,8
1’ - 124,0
2’ e 6’ 7,08 (2H, s) 126,2
3’ e 5’ - -
7’ e 8’ 1,43 (18H, s) 31,2
9’ e
10’
- 34,4
4’ - 153,2
42
Figura 13 - Espectro de RMN 1H unidimensional e expansões do composto LQFM180 (8)
43
Figura 14 – Mapa de correlações de 1H -13C HSQC do composto LQFM 180 (8)
Figura 15 – Mapa de Correlações de 1H -13C HBMC do composto LQFM 180 (8)
44
4.3.2 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
Através da análise do espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 14),
foi possível observar as principais frequências de estiramento para o composto LQFM180 (8),
as quais são evidenciadas em uma em 3544 cm-1, relativa à subunidade hidroxila (ν O-H); em
1686 cm-1, relativa à subunidade carbonila (ν C=O); e uma em 1432 cm-1, relativa à ligação
carbono–carbono aromático (ν C=C aromático). Apesar do espectro de absorção na região do
infravermelho apresentar outras frequências, as mencionadas acima são representativas para o
composto LQFM180 (8).
Após a elucidação estrutural do composto LQFM180 (8) através de RMN e
infravermelho e identificado como um composto piperazínico inédito, segundo o banco de
CAS / scifinder o mesmo foi submetido às duas avaliações do seu perfil antioxidante e
avaliação farmacológica in vivo.
45
Figura 16 – Espectro na região do Infravermelho - LQFM 180 (8)
46
4.4 Avaliação do Potencial Redox através de Voltametria Cíclica
A fim de caracterizarmos o perfil antioxidante do composto LQFM180 (8) frente a
potenciais redox, o mesmo foi avaliado através da técnica de voltametria cíclica.
O perfil redox dos composto LQFM180 (8) está ilustrado na Figura 17. Ao composto
foram empregados eletrodos de pasta de carbono. Análises voltamétricas das amostras do
composto LQFM180 em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0 como eletrólito suporte,
resultaram em voltamogramas reprodutíveis.
Através do voltamograma cíclico do composto LQFM180 (8) (Figura 15), se evidencia
que o grupo fenólico livre foi oxidado eletroquimicamente no eletrodo de carbono vítreo,
exibindo um pico anódico, 1a, no potencial de pico, E p1a = 0,6 V, em PBS pH 6,0. Essa
análise é consistente com bom caráter doador de elétrons e, como consequência, bom
sequestrador de radicais livres, exibindo então atividade antioxidante.
Em face de tais evidências, é possível concluir que o composto LQFM180 (8)
apresenta perfil antioxidante, pois apresenta potenciais oxidativos e redutivos.
Figura 17 - Voltamograma cíclico do composto LQFM 180 (8)
Tampão Fosfato 0,1 M, pH 7,0. Faixa de varredura -0,25 a 1,25 V. Velocidade de varredura
100 mV s-1.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
1a0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
1a
20 mA
E / V (vs. Ag/AgCl/KClsat
)
20 mA
E / V (vs. Ag/AgCl/KClsat
)
47
4.5 Avaliação Farmacológica
4.5.1 TESTE DO SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SÓDICO
Figura 18 - Alterações no sono induzido por pentobarbital sódico em animais tratados com
veículo (Tween 80 2,0%, 10 mL/kg v.o.), LQFM180 (8) (25, 50 ou 100 µmol/kg, v.o.) ou Diazepam
(1) 17,6 µmol/kg v.o., A - latência ao sono barbitúrico, em segundos e B - duração do sono, em
min. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=9). *p≤0,05, **p≤ 0,01
***p≤0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-
teste de Student-Newman-Keuls.
Os tratamentos com LQFM180 (8), nas doses de 25, 50 ou 100 µmol/kg reduziram o
tempo de latência ao sono e aumentaram a duração do sono.
Os animais tratados com LQFM180 (8), nas diferentes doses, apresentaram redução na
latência ao sono induzido por pentobarbital sódico em 52,12%, na dose de 25 µmol/Kg,
40,10%, na dose de 50 µmol/Kg e 58,54% na dose de 100 µmol/Kg. Por outro lado, o
composto aumentou o tempo de duração do sono induzido por pentobarbital sódico em 29,27%,
na dose de 25 µmol/Kg, 29,95% na dose de 50 µmol/Kg e 87,30% na dose de 100 µmol/Kg. O
48
tratamento com diazepam 17,56 µmol/kg reduziu a latência ao sono em 75,32% e aumentou a
duração do sono em 92,59%. (Figura 16).
Planejado a partir do LQFM008 (5) e do antioxidante BHT (9), o LQFM180 (8) foi
submetido ao primeiro teste da avaliação farmacológica, essencial para verificar atividade
central: teste do sono induzido por pentobarbital sódico. Este teste permite verificar a atividade
depressora e/ou estimulante de um candidato a protótipo de fármaco, baseado no sinergismo ou
antagonismo com a atividade depressora do pentobarbital. Dessa maneira, fármacos
depressores reduzem o tempo de latência e aumentam a duração de sono, e fármacos
estimulantes atuam de forma inversa. Vale ressaltar que candidatos a protótipos de fármacos
que alterem o metabolismo ou a excreção do barbitúrico podem levar a um aumento no tempo
de sono, gerando um falso positivo (CARLINI et al., 1986). O tratamento com LQFM180 (8)
nas diferentes doses, aumentou a duração do sono induzido por pentobarbital sódico, reduzindo
a latência. De maneira similar, o tratamento com diazepam 17,56 µmol/kg também reduziu a
latência ao sono e aumentou o tempo de duração do sono. Tanto o composto LQFM180 (8),
quanto o Diazepam (1) indicam uma atividade sinérgica com o barbitúrico (FARKAS et al.,
2005).
4.5.2 TESTE DO CAMPO ABERTO E DA CHAMINÉ
Tabela 2 - Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto e da chaminé
*Resultados expressos como média ± EPM. Veículo (Tween 80 2,0%, 10 mL/kg v.o.), LQFM180
(25, 50 ou 100 µmol/kg, v.o.) ou diazepam 17,56 µmol/kg v.o..*p≤0,05, **p≤0,01 e ***p≤0,001
quando comparado ao grupo controle (veículo) utilizando ANOVA seguida do pós-teste de
Student-Newman-Keuls, para o teste do campo aberto, e *p≤0,05 quando comparado ao grupo
controle (veículo).
Campo aberto e Chaminé. Veículo LQFM180 Diazepam
10 mL/Kg 25 µmol/Kg 50 µmol/Kg 100 µmol/Kg 17,56 µmol/Kg
Teste do campo aberto
Número de autolimpeza 1,71±0,28 1,80±0,20 1,71±0,36 1,86±0,26 1,83±0,31
Número de bolos fecais 2,25±0,45 2,00±0,27 3,00±0,36 1,5±0,19 1,71±0,36
Número total de cruzamentos 108,8±9,50 95,88±7,69 106,5±2,57 115,0±3,99 112,2±8,85
Tempo de imobilidade (seg.) 5,00±1,43 8,57±1,84 5,00±0,84 20,67±3,59 b 24,17±6,44 b
Número de levantadas 69,88 ±3,87 63,71±1,60 65,25±3,07 70,67±5,45 45,71±2,08 c
%Cruzamento no Centro 40,29 ±2,62 46,76 ±1,24 a 50,74 ±1,75 b 55,55 ±1,18 c 33,63 ±2,28 a
Tempo no Centro (seg.) 63,67±5,06 89,83±2,10 b 90,20±5,70 b 97,00±6,31 c 54,33±4,99
Chaminé
Tempo de escalada (seg.) 4,88±0,67 4,71±0,47 5,00±0,78 5,00±0,58 9,40±1,50b
49
No teste do campo aberto, os tratamentos com LQFM180 (8), nas doses de 25, 50 ou
100 µmol/kg, não alteraram o número de comportamentos de autolimpeza, o número de bolos
fecais e o número de cruzamentos totais, ou seja, não alteraram as atividades locomotora e
exploratória dos animais.
O composto LQFM180 (8) quando ministrado na dose de 100 µmol/Kg aumentou o
tempo de imobilidade em 313,4%. Da mesma maneira, o Diazepam na dose de 17,51 µmol/Kg
também aumentou o tempo de imobilidade, 383,4%.
Os tratamentos com LQFM180 (8), nas doses de 25, 50 ou 100 µmol/kg, não alteraram
o paramêtro número de levantadas, o que sugere que as atividades locomotora e exploratória
dos animais (exploração vertical) também não foram alteradas.
Os cruzamentos na área central (%CrCe) do campo aberto aumentaram em 16,06;
25,94 e 37,87%, respectivamente. O tempo de permanência no centro (Tce) do campo aberto
foi aumentado em 41,09%, na dose de 25 µmol/Kg, 41,67%, na dose de 50 µmol/Kg e 52,35%,
na dose de 100 µmol/Kg (Tabela 2).
O tratamento com diazepam 17,56 µmol/kg (controle positivo) não alterou o número de
comportamentos de autolimpeza, o número de bolos fecais e o número de cruzamentos totais.
Por outro lado, reduziu o número de cruzamentos no centro em 16,53% e aumentou o tempo de
imobilidade, 383,4%, o que pode ser explicado pela atividade depressora do composto na dose
utilizada
No teste da chaminé, nenhum dos tratamentos com LQFM180 (8) alterou o tempo de
escalada do animal, ratificando que o composto não compromete a atividade locomotora. Já o
tratamento com o controle positivo 17,56 µmol/kg, por sua vez, aumentou (p≤0,05) o tempo de
escalada em 92,62%, evidenciando o comprometimento locomotor nos animais tratados com
Diazepam na dose de 17,51 µmol/Kg. (Tabela 2).
Para verificar alterações comportamentais, um dos testes mais utilizados é a observação
de camundongos em um campo aberto (GORENSTEIN e SCAVONE, 1999). Este teste
permite uma avaliação da atividade estimulante ou depressora no sistema nervoso central de
um dado composto, podendo ainda indicar atividades mais específicas como a tipo ansiolítica,
dependendo dos parâmetros avaliados (LAPA et al., 2008). A tendência natural do animal em
um ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do conflito com o medo provocado pelo
desconhecido. Tratamentos com compostos tipo ansiolíticos não aumentam a exploração do
campo aberto, mas o comportamento tigmotáxico do animal é reduzido (VILELA, SONCINI e
50
PAIVA, 2009). Outra função do teste do campo aberto é avaliar a atividade exploratória dos
animais. Os parâmetros de número de cruzamentos totais, número de levantadas e tempo de
imobilidade indicam alteração na atividade motora espontânea; o número de bolos fecais pode
indicar alteração na emocionalidade do animal (HAN et al., 2009).
Como complemento do teste de desempenho motor do animal, avaliado pelo teste do
campo aberto, foi realizado também, o teste da chaminé. Neste teste, são considerados animais
com comprometimento motor aqueles que forem incapazes de atingirem a delimitação do tubo
dentro de um período de tempo determinado (COLETA et al., 2006). Os animais tratados com
LQFM180 nas diferentes doses não tiveram alterações na atividade motora espontânea, já que
não tiveram seus tempos de escalada reduzidos.
4.5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TIPO ANSIOLÍTICA DO COMPOSTO LQFM180
(8) – TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
Figura 19 – Parâmetros observados no teste do labirinto em cruz elevado (A - número de entradas
nos braços abertos (EBA), B - tempo de permanência nos braços abertos (TBA) e C - tempo de
permanência na plataforma central (TPC)
Veículo 25 mmol/Kg 50 mmol/Kg 100 mmol/Kg 200 mmol/Kg Diazepam
0
20
40
60
80
LQFM180Tween 80 2% 3,51 mmol/Kg
***
** **
%E
BA
A
51
Veículo 25 mmol/Kg 50 mmol/Kg 100 mmol/Kg 200 mmol/Kg Diazepam
0
20
40
60
80
LQFM180Tween 80 2% 3,51 mmol/Kg
** ***** ***
***%
TB
A
Veículo 25 mmol/Kg 50 mmol/Kg 100 mmol/Kg 200 mmol/Kg Diazepam
0
10
20
30
40
LQFM180Tween 80 2% 3,51 mmol/Kg
***
****
%T
PC
No teste do Labirinto em Cruz Elevado, o tratamento com LQFM180 (8) nas doses de
25, 50, 100 ou 200 µmol/kg, aumentou o número de entradas no braço aberto (EBA) nas doses
de 50 µmol/Kg e 200 µmol/Kg, em 29,79% e 30,91%, respectivamente. O controle positivo
aumentou em 48,11% (Figura 17A). O tempo de permanência no braço aberto do labirinto, nas
doses de 25 µmol/Kg, 50 µmol/Kg, 100 µmol/Kg e 200 µmol/Kg aumentou em 32,26%,
54,90%, 37,29% e 49,90% respectivamente. O controle positivo (diazepam) aumentou em
B
C
52
47,20% (Figura 17B). O tratamento com LQFM180 (8), nas doses de 50 µmol/Kg, 100
µmol/Kg e 200 µmol/Kg, diminuiu o tempo de permanência na plataforma central (TPC) do
labirinto, em 40,46%; 27,07% e 33,20%; respectivamente. O tratamento com diazepam reduziu
em 53,88% (Figura 17C).
Este modelo animal usa estímulos naturais como o medo do desconhecido, e de espaços
abertos e elevados, além da preferência por lugares fechados. Trata-se do o modelo animal mais
utilizado para a seleção de protótipos de fármacos ansiolíticos (HAN et al., 2009; YU, LEE e
JANG, 2007)). A ansiedade animal, neste teste, surge em decorrência do conflito entre
explorar o ambiente novo e o receio de explorar este mesmo ambiente. Neste teste, animais
tratados com benzodiazepínicos, como o diazepam na dose de 3,51 µmol/kg apresentam
preferência pelos braços abertos do labirinto, demonstrado pelo aumento no número de
entradas nos braços abertos e pelo aumento no tempo de permanência nos braços abertos, em
relação aos braços fechados, além de reduzir também o tempo gasto na plataforma central.
Todas essas alterações foram observadas sem que ocorresse alteração no tempo gasto nos
braços fechados e no tempo de imobilidade, parâmetros que avaliam a atividade motora do
animal (SCHMIDT; MULLER, 2006). No teste do labirinto em cruz elevado, o tratamento com
LQFM180 (8) nas diferentes doses demonstrou atividade tipo ansiolítica. Esta atividade foi
caracterizada pelo aumento no número de entradas nos braços abertos, no tempo gasto nos
braços abertos, e pela redução no tempo gasto na plataforma central.
2 CONCLUSÕES
Pelo exposto ao longo deste trabalho, podemos observar que os transtornos de
ansiedade são doenças para as quais os tratamentos tem evoluído principalmente na última
década, o que ratifica a busca por novos protótipos de fármacos ansiolíticos que sejam mais
eficazes, seguros e que apresentem menos efeitos colaterais quando comparados aos tratamento
disponíveis.
O planejamento e a rota sintética proposta se mostraram eficazes para a obtenção do
composto LQFM180 (8), o qual foi obtido através da reação de Mannich em rendimento de
92%, devidamente caracterizado através de métodos espectroscópicos nas regiões do RMN e
IV.
53
Através da voltametria cíclica, foi possível evidenciar que o composto LQFM180 (8)
apresenta perfil antioxidante, uma vez que o mesmo apresentou potenciais oxidativos e
redutivos.
No que diz respeito à avaliação farmacológica in vivo, o composto LQFM180 (8) se
mostrou ativo no Sistema Nervoso Central. No teste do sono induzido por pentobarbital sódico,
o tratamento com o LQFM180 (8) nas doses de 25, 50 e 100 µmol/kg, reduziram a latência e
aumentaram a duração do sono, sugerindo uma atividade depressora central. No teste do campo
aberto e da chaminé, o tratamento com LQFM180 (8) nas doses de 25, 50 e 100 µmol/kg não
alterou a atividade exploratória dos animais, nem comprometeu a atividade motora. No teste do
campo aberto, o tratamento com LQFM180 (8) nas doses de 25, 50 e 100 µmol/kg mostrou
uma atividade tipo ansiolítica. Nos testes de labirinto em cruz elevado, o tratamento com o
LQFM180 (8), nas doses de 25, 50, 100 e 200 µmol/kg mostrou atividade tipo ansiolítica.
Neste sentido, podemos concluir que a estratégia de planejamento, se mostrou
adequada uma vez que a atividade tipo ansiolítica para o composto LQFM180 (8) foi
evidenciada através dos modelos farmacológicos in vivo aqui descritos. Os resultados
preliminares motivam os Laboratórios de Química Farmacêutica Medicinal e Farmacologia de
Produtos Naturais e Sintéticos a continuarem investigando os mecanismos de ação do
composto LQFM180 (8).
54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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