BtOCHIMIE, 19,76, 58, 351-357.

Mise en 6vidence de deux syst mes de transport du phosphate chez Candida tropicalis.

F r a n c i s BLASCO *, Gas.ton DUCET * et Edgar, d AZOULAY "* ~. • Laborato ire de Phys io log ic Cellulaire (LA 84)

et • * Laborato ire de S t ruc ture et F o n c t i o n des B i o m e m b r a n e s (ER 183) du C.N.R.S.,

Ddpar t emen t de Biologic ~ U.E.R. Sc ien t i [ ique de L u m i n y , 70, Route L~on L a c h a m p . . 13288 MarseilIe Cedex 2.

(22-10-1975).

Summary. ~ Candida tropicalis h.as two phosphate transport systems, one of which is constitutive and has a low affinity for its subs'~rate (Km~p, 1.2.10-3 M). The other one characterized by a high affinity for H2PO4- (Krupp, = 4.5.10-6 M) appears only under phos- phate starvation conditions. The regulation of the lat ter wolrld act on the one hand on the synthesis of bincHng protein, s for P, (repression-derepression) and on the other on the activation or inactivation of the carriers.

INTRODUCTION.

L '6 tude de l 'absorpt i ,on du p h o s p h a t e chez Ies c h a m p i g n o n s ,unicel lu la i res a por t6 essent iel le- men t ces dern ibres an n6es sur S a c c h a r o m y c e s ce- revis iae [1-4] et p lus r 6 c e m m e n t sur Neurospora crassa [7-8]. C,ette ~tude a pe rmi s d%tabl i r qu.e ce p h 6 n o m 6 n e s ' in t6gre clans le cadre d ' u n p rocessus de p e r m 6 a t i o n actif , li6 au m6tabo l i sme 6nerg6- t ique et h l ' ex i s lence de prot6i,nes affines p o u r le p h o s p h a t e ou son analogue l ' a r s6nia te . Les tra- v a u x que n o u s avion,s e n t r e p r i s sur la phys io log i c et le m6tabol i sme 6nerg6~tique de Candida tropica- lis nous ont amen6s h 6 tudier les m6can i smes de t r a n s p o r t du p h o s p h a t e chez cette levure afin de p r6c i se r le n o m b r e et la n a t u r e des sys tbmes t rans- po r t eu r s du p h o s p h a t e en nous in,teressan¢ plus pzrfi, cu l i6 rement h leuv r6gula t ion . Nous rappel~le- rons d 'a i l leurs que Candida lropical is est un mi- c roo rgau i sme qui se d6veloppe a c t i v e m e n t sur h y d r o c a r b u r e s avec un re r rdement de la crois- sance 6gal h 0,9 [9]. Cette valerur p a r t i c u l i 6 r e m e n t 61ev6e d u r e n d e m e n t , d6pen,d des co.ndifions de cu l ture et en p,art ictt l ier de Ia quan tit6 de phos- pha t e mi se h la d i spos i t ion des cellu,les.

Abbrevialions.

F.C.C.P. : Oarbonyl cyanide p-trifluorom6thoxyph6- nyl hyd, razo.ne.

C.C.C.P. : Carbon,y1 cyanide m-ehloroph~nylhydra- zone.

2',4-DNP : 2,4-~initroph~ao]. 17.9,9 : ¢ba'-bis (hcxafluoroac~tonyl,) acetone. M.C.P. : Milieu carencfi en phosphate.

MATERIEL E T METHODES.

On~ANrS~tr.

Candida tropical is souche 101 de not re collec- t ion a ins i que les con,dit ions de c ro i s sance sur l,e mil ieu nu t r i t i f de base, avec du glucose (4 g / l ) comme source de ca rbone et en p r6scnee d 'oxy- g6n, e, ont d6j~ 0 6 d6cri ts [10]. Le mi l i eu carencd en phospha te (M.C.P.) est p rdpa r6 h p a r t i r du mi- l ieu nu t r i t i f de base comme s u i t : les p h o s p h a t e s de sod ium et de po t a s s ium sont remplac6s p a r du t a m p o n Na-mal6ate (50 mM p H 5,2) et p a r du KC1 (10 raM). L ' ex t r a i t de levures qui appor t e les fac teurs de c r o i s s a n c e est r emplac6 p a r de la bio- t ine (2 t~g/1) du p a n t h o t h 6 n a t e de ca l c ium (100 ug/1) et de la t h i a m i n e (100 ttg/1).

Le d6ve loppemen t ceI lu la i re est 6valu6 pa r n6- ph61om6tr ie h 450 nm et expr im6 en mg de ma- t ibre s~che p a r r6f6rence h une courbe 6talon.

MESURES DE /.'ABSORPTION DU PHOSPHATE.

L ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e p a r les cel lules ca- renc6es est d6termin~e comme sui t : des 6chant i l - lons de la suspens ion ce l lu ia i re (0,2 h 0,5 mg de ma t i~ re s~che p a r ml d.e mi l i eu sonl pr~l,ev6s, mis a,u con tac t p e n d a n t line minuCe avec du Pi r ad io - act i f ( c o n c e n t r a t i o n f inale 10 -8 M ; r ad ioac t iv i t6 sp6ci t lque 10~ h 2,5.107 dpm/t~M), filtr6s sur Inil l i- po res (po.rosit6 1,2 ~) et r inc~s avec 15 h 20 Inl de mi l ieu carenc6 en p h o s p h a t e h 0-4°C. Les fi l tres mi l l ipo res sont s6ch6s et i r t t rodui ts dans 10 Inl de

352 F. Blasco, G. D u c e t et E. Azou l ay .

sol u i ion de sc in t i l l a t ion (5 g de 2 ,5-diph6nyl-oxa- zole et 0,3 g de 1,,4-diE2-(5-ph6nyloxazolyl),~-ben- z6n:e par l i t re de tolu6ne).

L' .absorpfion du phos,phate est 6g~al,ement n~esu- r6e sur ,d'es ce,llul,e,s non carerm6es en p h o s p h a t e qui, dans ce eas pr6cis s o n t s6par6es de l eu r mi- l ieu de cul ture ,par cen t r i fuga t ion (16 000 g ; 5 m n h 0°.C) 1.a~c6es ave, c du mi l i eu sans p h o s p h a t e puts remises en susp,e,nsio.n dans c'e m(~me mil ieu. L ' in- co rpo ra t i on du s2p est d6 te rmin6e d i r e c t e m e n t sur ces suspensions, cel lulaires selo.n la m6 thode d6er i te pou r les cel lules carenc6es .

La viles,se d ' abso rp t i on d u p h o s p h a t e est expr i - m6e en nanomoles de phos,phate incorpor6es pa r mg de m~ti6re s6che el par Inn.

DOSAGE DU PHOSPHATE INTRAEELLULAIBE.

Sur des 6chant i l lons de 1,evures (15 fi 30 mg de mat i6re sbche) min6ra l i s6es en mi l i eu p e r e h l o r i - que, le p h o s p h a t e total est do,s6 selo,n la m 6 t h o d e de Dueet et Vandewall ,e [11] ; les phospha te s orga- n iques ac ido-solubles o,u ~,ns.o,l'ubles sont d6termi- n4s s,elon cette m61n,e m6thode .

C I I O C OSMOTIQUE,

Cette t echn ique , inspir6,e 4e celles d6cr i tes par Neu et I-Ieppel ~12] el Wi ley [13~ es.t la su ivan te : les cellules re.cu,eil,lies en phase exponentiel . le de c ro i s sance sont centr i fug6es, r inc6es avec du tam- p.on Tris HC1 50 mM pH 7, puis remises en sus- pen,sio,n (50 m g de mat ibre s.6che pa r ml) pend.ar~t 10 ran. h la t e m p 6 r a t u r e a.mb~ante clans 250 ml de saecha rose fi 20 p. cent add i t i onn6 d 'EDTA h 10 -a M da,ns un tampo,n Tris HC1 (5,0 mM pH 7). Les eel lules so,nt ensui te eent r i fug6es puts r emises en s,uspension pen, dant 1,0' m n clans 150 ml d 'eau dist i l l6e it 0,°C. Une nouve l l e centri:f;ugation s6pare ]e culot du surn,ageant qui cons t i tue 1,e ¢ mi l ieu de choc ~.

Les cell,ul.es ayant subi ce t r a i t emen t so,nt remi- ses eu suspens ion d a n s dn mi l i eu M:G.P. et l eur a.,c- t ivi t6 de t r anspor t est a, lors mesur6e dan;s les con- d i f ions d6eri tes plus. haut.

RESULTATS.

Cin~tiques d'absorption du phosphate par les levures non carenc~es en phosphate.

Candida tropicalis cult ivde clans des co:nditio,ns no rma les en pr6s,ence ,de glucose absorbe le phos- pha te ; cet te ahs(~rpfion augTn, en,te l:in6aire,ment en fonc t ion du t emps d ' i n c u h a t i o n en p r6sence de cet ion. Dans 1,a figure 1A la vi tesse initial~e d 'ab-

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.

so rp t ion a ugmen te pour des con, cen t r a t ions t ro i s - sautes en p h o s p h a t e d:~ns l e mil ieu. Les repr6sen- ta t ions se,lon L i n e w ~ e v e r el Burk 1/V = f(1/S) {fig. 1B) me t t en t en 6vi~denoe l 'existerree d'u'n sys- tbme de t r anspo r t avee un Km a p p a r e n t de I ' o rd re de 1,2.10 :a M e t un Vm a p p a r e n t de 4,4 n m o l e s / m g mat. s6che/mn. Ce syst6me, de faible affinit6, est d6pend:ant du m6tabolis,me 6nerg6t ique pu i squ ' i l est inh ib6 pa r le 2,4~D,NP et pa r l ' azolure de so- dium. Les taux d ' i nh ib i t i on , pa r r a p p o r t h u n t6- moin , m,esur6s apr6s une m i n u t e de con tac t avec ces effecleurs, sont de 50 p. cent pour une concen- tra~io.n en 2,4-DNP de 7..10 -5 M e t pour une con-

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minutes

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0,5

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1__ (raN-l)

Fro. 1. - - Ai) CinStiques d'absorption du phosphate ' , . • . , , •

cenfrations en phosphates dgales d : (1) 0.5 raM, ; (~), 1 mM ; (~). 5 n,M ; (4), 10 m M ; (5) 20 raM. L ~ s ]evure,s (0~5' nxg de, mati6re s6ehe par ml: de milieu) sont in.cub6es, d-an, s'. du milieu de carenoe .en prSsence d,e phosphate, radioaefif O,5.107 dpm/#mole). Le,s quan- t.it6s de phosphate ineo.rpor4es par 1,es eellules s~ont d~termin6es selorL l,a tech, nique d'6erite darts l'e texte h partir d,e pr616vements r6alis4s h intervalles r~guliers.

B) Representation seIon Lineweaver et Burck des vitesses initiaIes d'absorption exprim~es en nmoles de phosphate absorbdes par mg de mati~re s~che et par minute.

cen t r a t i on en NaN a de 2.10 .5 M. No~as a jou te rons que la co.n.centration intr~c.etlu],aire en phos~phor,e de C. tropicalis, ,recuei.l,lie en phase exponen t i e I l e de c ro issance , est d,e l ' o r d r e .de 23 ~g de p h o s p h a t e total pa r ing de mati.6re s6che ; la quant i t6 d 'o r tho - pho,spha~e ne repr6se.nte que les 5 h 8 p. cent du p h o s p h o r e total, le res te 6taut const i tu6 pour 17 h 1'9' p. cent de eompo.s6s o rgan iques acido-solu- bles et p o u r 73 h 78 p. cen t de co.mpos6s acido- insolubles (phospho l ip ides , ac ides nucl6iques , po,lyphosphates. . . ) . L.orsqu,e ces Ievures se d6ve- l oppen t su.r un milie,u ~l.e cu l ture con,tenant du p h o s p h a t e marqu6 au asp, qa 'e l les sont pr6tev6es et remis,es en suspens ion d,ans un mi l ieu c o n t e n a n t du P~ f ro id f 1,a m6me coneen t r a t i on , 7 h 8 p. cent

T r a n s p o r t du p h o s p h a t e chez C a n d i d a t r o p i c a l i s . 353

s , eu tement d,e la r a d i o a c t i v t ~ a , ecumul6e d a n s les ce l l u l e s s ' 6 c h a n g e n t c o n t r e d u P~ f r o i d ; des t r a n s - fe r t s s u c c e s s i f s d e ees cellu~es d a n s des m i l i e u x f r o i d s n ' a u g m e m e n t p a s ce t te f r a c t i o n 6 c h a n - geable .

Cin~tiques d'absorption du phosphate par des levures carenc~es en phosphate.

P o u r des l e v u r e s c a r e n c 6 e s ,en p h o s p h a t e p a r in- c u b a t i o n d a n s u n m i l i e u d e c u l t u r e d 6 p o u r v u de ce t i o n (cf. m a t 6 r i e l et m 6 t h o d e s ) Ia v i t e s se i n i t i a l e d ' a b s o r p t i o n d u p h o s p h a t e p o u r u n e con, c e n t r a t i o n f ina le d e 10 .-3 M est p l u s force que ee l l e m e s u r 6 e a v e c des ceUules n o n c a r e n c 6 e s . Cet te v i t esse d ' ab - s o r p t i o n a u g m e n t e en fon, c t i o n d u t e m p s de ca , ren, c e e n p h o s p h a t e p o u r a t t e i n d r e u n m a x i m u m apr6s 2 h 30 m n d ' i n e u h a l i o n (fig. 2, co ,urbe 1).

2o

1 2 3 /. 5 Heures

FIe. 2. - - Augmentation des vitesses initiales d'absorption du phosphate par C. t ropical is en fonetion du temps de carence en phosphate. Les mesures d 'absorpt ion d,e phosphate sont effectu6es selon les teeh:niques exp6riment.ales d6erites dans le texte sur des 6ehantiHon.s de s,uspension de levures incu~bant s'oit dans un~ mi l ieu earenc6 (co u'rbe 1) soit darts :un mi l ieu r.iehe en. ph~)s~hate ~cottrbe ~). La concent ra t ion finale en substra t m:arqu6 au .32p est d.e 1 raM. Les unit6s sont exprim6es en nmoles d~e p,h.ospl~ate incorpor6es par mg de m ati6re s~che et par minute .

L ' e x a m e n de ce t te f igure m o n t r e que la v i t e s se m a x i m a l , e d ' a b s o r p t i o n du p h o s p h a t e p a r les ]evu- res c a r e n c 6 e s e n ee t ion , de l ' o r d r e de 33 n m o l e s de P~ p a r m g d e m a t i 6 r e s 6 c h e et p a r m i n u t e , est e n v i r o n 7,5 fats p lu s 61ev6e clue ce l l e d6 te r .min6e a v e c des l e v u r e s no.n c a r e n e 6 e s et clans des c o n - d i t i o n s de c o n c e n t r a t i o n sa tu ran t , e. Apr6s 2 h 30 m n d'in, c t rba t ion d, es ' ce l lu les d a n s I.e m i l i e u c a r e n c 6 en p h o s p h a t e , Ies v i t e s ses i n i t i a l e s d'a,b- s o r p t i o n de ce t i o n d i m i n u e n t p o u r se s t a b i l i s e r ap rbs 5 h de caren, ce. (Vi = 20 n m o l e s de P~ p a r m g de m a t i 6 r e s 6 e h e et p a r m i n u t e ) . Les p a r a - m b t r e s c i n 6 t i q u e s , K m et ¥ m a p p a r e n t s , de l ' ab- s o r p t i o n d u phosph :a t e a n t 6t6 d 6 t e r m i n 6 s pcm.r des I .evures c a r e n c 6 e s p e n d a n t des t e m p s d i f f 6 r e n t s

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.

( v a r i a n t de 1 h 30 m n h 4 h 30 ran) (fig. 3) : a i n s i Ie Kmat~v de l ' o r d r e de 4,5.10 -6 M est c o n s t a n t que,1 que soi t Ie t e m p s de ca ren .ee ; s eu l d i f f~re le Vmap p qu i d ' a i l l e u r s 6vc~lu, e c o m m e la v i t e s se i n i t i a l e d ' a b s o r p t i o n (,fig. 2) e ' e s t - h - d i r e p a s s e p a r u n max~i.mum po.ur u n t e m p s de ea~-en,ee 6:gal h 2 h

!

l/v! !

0,2-

_Off _0,1 0 01 q2 0,3 0.4 0,5 & (vM -~) [Pi]

Fro. 3. - - Cindtiques d'absorption du phosphate par C. t ropical is pour divers temps de carence en phos- phate : courbe 1 : 1 h 30 ; courbe 2 : 2 h 30 ; courbe 3 : 4 h 30. Representa t ion, selon L ineweaver et Butch, des. vitesses d 'absorpt ion de 32p mesur6es, du ran t la premi6re minu te darts des syst~mes ident iques h ceux d6crits darts lLa 16gende de la figure 1. Les vitesses d 'absorpt ion sont exprim~es en nmoles d,e phosphate incorpor6 par rrrg de mat i6re s6che et par minute .

T ~ n ~ A v I.

Param~tres cindtiques des deux syst~mes d'obsorp- tion du phosphate de C. t r o p i e a I i s .

A t [ B r a b o

VmappKmaPp 1,2.4,10"a4 M , I _ _ I [ 4,5. 2810-6 M 1 4,5. 3310"" M 4,5. 2010-6 M

(A) Levures non earenebes en phosphate : syst6me h faible affirrit~.

(B) Levures earenc6e.s err p~hosphate : 6volution des param6tres c in6t iques du second syst6me ou syst&me h forte affinit6, en f.onetion du temps 6e care nee : (a)L 1 h 30 ; (b) 2 h 30 ; (e), 4 h 30 de earenee. Les V ~ , sont exprim6s en nm, oMs de phospha te absorb6ea par mg de mati~re s~che par minute .

30 m n ( T a b l e a u I). P a r a l l b I e m e n t n o u s a v o n s cons - tat6 que le d 6 v e l o p p e m e n t c.ellu,laire se p o u r s u i v a i t p e n d a n t les s ix p r e m i 6 r e s h e u r e s de c a r e n c e a v e c u n t a u x de c r o i s s a n c e in , f6 r ieur h c e l u i des cel- Iu les eu l t iv6es d a n s des c o n d i t i o n s n o r m a l e s (0,5 au l i eu d~e 0,66). Cett,e c r o i s s a n c e se fa i r a u x d6~- p e n s des r 6 s e r v e s en p h o s p h a t e s i n t r a c e l I u l a i r e s

354 F. Blasco, G. D u c e t et E. A z o u l a g .

aeeumul6es du ran t le d 6 v e l o p p e m e n t dans des cond i t i ons normales . Nous a jou te rons que la d6ter- ru inat ion des con,centrat ions in t r aee lh f l a i r e s en p h o s p h a t e n,ous a p e r m i s d '6 tab l i r que du ran t la c a r e n e e eerie con, ce.ntr~tion dimin.ue r6gu]i6re- men.t pour attei.n,dre apr6s 8 heures d ' i ncuba t ion , une valour limi.ie ,de 2,4 ~g d,e p l m s p h a t e to.ta'l pay mg de mat i~re sbche c 'es t ,h-di re 10 fois plus faible que la val.eur ini t ia le . L ' abso rp t i on du p h o s p h a t e pa r ce type de cel lules est sens ib le aux i n h i b i t e u r s du m6taboli .sme 6ne.rg6fique (azoture de sodium) aux d6coupleu,rs de la phoslaho.rylat ion oxyda t ive (F.C.C.P., C.ff.C.P., 179'9) a ins i qu 'aux ac idcs gras (,a,ci,de h, exanoiqu,e) (tuble,au II). Ces in,hibit, eu~rs

TABLEAU II.

In[luence des inhibi tears sur la vitesse maximale apparente de transport du phosphate (concen- tration finale 10-~ M ) c h e z des levures carencdes en phosphate pendant 2 h 30.

Effecteurs

2,4-DNP

N a N 3

FCCP

CCCP

1799

Acide hexanoique

Concentration M

10-.~ 7.10 -~ 2.10 -~

5 . 1 0 -~ 2 . 1 0 -'~

10-~

10-7 10-~ 10-~

10-7 5 . 1 0 - ~ 2.10 -~

lO-S 10-~

2 , 5 . 1 0 -~

10-4 5.10 -~ 5 . 1 0 -~

P. cent activit6

92 52

5

97 47 13

88 50 16

94 41

9

89 64 10

100 51 15

Le, s r6sul'tats s,ont exprim6s en pourcentage d"activit6 r~sid~uelle par rapport h u n t~moin plac5 darts les m,8mes eonditio,ns exp6rime~nta]es sans inhibiteur.

affecten¢ s imu l t an6men t la r e s p i r a t i o n des l evures ( c o n s o m m a t i o n d % x y g b n e ) : l e t r an spo r t du phos- p h a t e et ils i:nd~is,ent un,e abso rp t ion con,eomitante de p ro tons ee qui se t r adu i t pa r un, e aleati .nisation du m i l i e u d ' abso rp t iou . ~I con,vien't de sou l igner qu:e nous nous s o m m e s prin,eipa]emen,t int6ress6s aux effets de ees in'hib,teurs sur les ~m,,pp sans nou,s p r 6 a c u p e r de .]eur e'ffet sn r ~es ]{map p. Pa r eon t r e les ex.p6rien~es d ' absorp f ion du p h o s p h a t e pa r des le,vures ca, rene6es r6alis6es en p r6senee d,e divers,es eo ,ncentra t ions en ars6nia te p e r m e t t e n t

de con,stater que AsO~ et Pi sonl co,mp6titifs vis-h- vis du m6me systbme de t ranspor t . Les vaIeurs du K i de l 'a rs6niate p o u r Ie t r a n s p o r t du p h o s p h a t e et du K i d u p h o s p h a t e polar t.e tr.anspo,rt de ]'ars6- niate, d6termin:6s s,elon ,la m6tho, de d,e D,ixo.n [14] so,nt r e s p e c t i v e m e n t d,e 9.,10 -6 M et de 5.10-6 M. Le Km.~,p du systbme de t r anspo r t de l 'ars6niate , de l ' o rd re d,e 5.10 -G M est trbs voisi,n de eelui du phos- pha le (4,5.10 --6 M). L,e Vmap p d'a~bsorption d,e Far- s6,n:iate, en moyenn, e trois lois moins 61ev6 qtte celui du phospha te , est d,e l ' o rd r e de 11 nmoles par m g de mati,~re s~che et pa r minu te .

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...... i- ~ 3 ~-

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FIG. 4. - - A ~ Action de la cycloheximide et du phos- phate sur l'dvolution des vilesses iniHales d'absorphon du phosphate par C. tropicaIis. La cycloheximide (courbe 2,); le phosphate. (courbe. 3} .o.u la cycl.ohexi- mide e,t le p,ho,s]Jhate (courbe 4) son,t aj,o.ut~s au temps t ( $)'. ~ la s*uspension cel]~laire apr6s 1 h 30 de carence e,rt phosphate. La .concentration finale en effec- tear est de 19-3 lV[. Les vitesses initial~es d'absorption d,u ph.osp,h, ate sont d6termin~e,s selon 1,a tech, nique d6jh &derite d, ans I~e texte.

B) Reprdsentation en coordonndes semi logarith- miques de la ddcroissance des vitesses initiales d'absorption en prdsence de phosphate. Les vitesses d',absorpti,on, sont exprim~es en nmoles de phosphate incorpordes par mg de mati6re s6che et par minute.

R~guIation du sgst~me d'absorption dtt phos- phate aa cours de la carence en phosphate.

Si nons consi.d6ron,s ]es r6s~.ltats d6cou.lant de t 'exp6rien,ce i-Ilustr6e pa r la f igure 4, nous consta- tons que l 'ad,di l ion de Pi ( concen t r a t i on finale 10-3 M) h des 1.evures pr6a'labl,ement car.enc6es pen- d a n l 1 h 30 m n en t r a ine une d iminut ion , des vites- s,es in i t ia les d ' a b s o r p t i o n d u p h o s p h a t e (.fig. 4A, courbe 3). (Ces vit.es,ses i ni t ia]es sont d6 te rmin6es selou le pr.otocole exp.6rimental d6,crit dans << ma- t6ri,el el m6~ho.des >> h p rop os des 1,evures non ea- renc6es) . Si ce t te dim,inu~ion d ' ~ t i v i t 6 esi repr6- sent6e en, coordorm6es semiJoga r i thmiques (fig. 4B) nous potrvo,ns cons ta te r que dans ces condit io.ns l 'act ivi t6 du sys tbme d.e t r a n s p o r t es,t dimin,u6e de moi t i6 en 5,2 ran. ,La p r6sence de cyclohexi,mi,de

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.

T r a n s p o r t d u p h o s p h a t e c h e z C a n d i d a t r o p i c a l i s . 355

ne modif ie pas, au mo ins p e n d a n t 1 h 30 ran, eet te d6cro issance qui, route,lois, se poursu i t ensui te en pr~,sence de l ' i n h i b i t e u r de la synth~se p ro t6 ique (fig. 4, courbe 4). Nous a jouterons que ra r r~ t de la synth~se p ro t6 ique pa r la c y c l o h e x i m i d e condu i I h une inh ib i t i on dc la crois,sance eeIlulaire . Paral - lb lement nous avons mont r6 que lorsque la cyclo- heximi, de est ajo,u~t6e a,u co u~rs de l.a ea renee , la vitesse ]ni t]ale de t r anspor t reste s ens ib l emen t i den t ique h la vit.esse V d6 te rmin6e au temps i (fig. 4, courbe 2) et ceci m~me apr~s 4 heures de contact avec l ' inh ib i teur . Paral.161ement si la cyclo- h e x i m i d e es,t ajout6e au d~but de la ca rence en phospha t e aucun,e 6volut ion du systbme de t rans- por t n 'est constat6e p o u r des c o n c e n t r a t i o n s en i nh ib i t eu r de l0 -3 on 10-~ M (fig. 5, courbes 2 et 3). De plus, si de telles eeilules trai t6es h la cyc lohexi - mide p e n d a n t 1 h 30 m n sont ri,ne6es et r emises en suspens ion dan,s un mi l ieu sans phospha te ,

• [ . . . . . . . . . . . . .

\ )

0 1 2 3 /, 5 6 Heures

Fro. 5. - - Effet de la e!leloheximide sur les vitesses d'absorption du phosphate par C. tropiealis. L'in.lfibi- teur est ajout6 en d6but d~e earenee h la concentration finale de 0,GI mM (eourbe 2,), d~e 1 mM (eourbe 3'). EehantiMon tgm.oin sans eyel,oheximide (eourbe ]). Apr6s 91) m,n de contact avee la eycl'oheximide h l mM ~eoneerd~ration finale) les ceHutes sont eentrifug~es ( + I rine6es et remis.es err suspension d,ans un milieu sans phosphate et sans inhibiteur. L es vitesses ]nit]ales sont exprim6es en nmol~es de phosphate absorb6 par mg de mati6re sbebe et par min,ute.

el les p r6sen ten t I,es mbmes potentia]i~6s que 1.es eellules non trai t6es par l ' i n h i b i t e u r de la synth6se prot6.ique (,fig. 5, eourJae 4). Notons e e p e n d a n t qu 'un t emps de 1,at.e,nce de 3.0 m n es,t n6cessai re avant que les vi tesses ]nit]ales n '6voluent . L ' inh i - bi t ]on exere6e pa r la e y e l o h e x i m i d e serai i don,c r6versible. ,D'autre part , l ' absorp t ion du p h o s p h a t e en fonc t ion du temps, pa r des levures caren, e6es, d o n e ayant d6jh synth6t is6 un poo l de t r anspor - teurs, n 'est pas modif i6e (au moths p e n d a n t les 30 m n .de l ' exp6r ienee) pa r la pr6sen.ce de cyeIo- h e x i m i d e ; done celle-ci agi ra i t bi.en au n iveau de la synth~se prot6iqu.e seul,ement ei n:on pas sur ]e

BIOCHIM1E, 1976, 58, n ° 3.

sys t6me de t~raJnsport h ta man.i6re d 'un i n h i b i t e u r du m6tabol i sme 6nerg6t ique [15, 16].

Chocs osmot iques .

Les chaes osmotiques , appl iqu6s 'h des levures ca renc6es en phospha te , entrai.n.ent une pe r te d 'ae- tivit6 de t r anspo r t pouvan t r ep r6sen t e r les 70 p. cent du t6,moin (fig. 6, courbes 2 et 3).

30~

2° i ~2

0 1 2 3 /. 5 6 7 Heu res

Fro. 6. - - Evolution des vitesses ]nit]ales d'absorption du phosphate par des cellules de C. tr.opicalis carencdes en phosphate pendanl 2 heures, soumises ~t des traite- ments par eh, oes osmotiques ( ~¢ ) (mat~rie.1 et m6thodes) puts remises en s~spension, d.ans du milieu sans phos-

, hate (courbe 2'). EchantiMon de eellules non trait~es ourbe 1). Un lot de eellules ayant sub] un choc os,mo-

tique est remis en suspen, sion d, ans un mitieu sans h,Osphate eontenant de la cyeloheximide (1 raM) ourbe 3). Les vitesses sprit exprimbes en nmoles de

phosphate absorb6 par mg de mati6re s6ehe et par mi nute.

Les levures choqu6es, remises en suspens ion da'ns te mi l ieu ,de cu l ture d6po,uvvu de phospha te , r e t r o u v e n t 'len~temen.t leur aetivit6 de t r anspor t . Cette r6ettp6ra.tion ne s.e mani fes te pas en p re sence de c y d o h e x i m i d e (fig. 6, courbe 3). Ceci est en faweur d 'une synth~se de pro t6 ines m e m b r a n a i r e s , affines p o u r le phospha te , lo ts de la ca rence et p o u v a n t ~tre l ih6r6es par chocs osmot iques PUiS synth~tis6es de nouveau lorsque les eet lules sont remises en suspens ion dans un mi l i eu sans phos- phate .

DISCUSSION.

Les r6s:ttltats d6cri ts dans c et ar t ic le sont indi - catifs de ] ' ex is tence de deux syst6mes de t r anspo r t du p h o s p h a l e chez Candida tropicalis. I , 'un d 'eux est eonstituti.f et earaet6ris6 par une vitesse max]- male d'a~bsorption de 4,4 n m o l e s / m g de mat. s b e h e / m n et pa r un Km,o o de 1,2.10 -3 M. Le second est syn, th6tis6 lo rsque les cel lules se d6ve loppen t clans un mi l ieu de cul ture to ta l ement d6pourvu de phos, phate. Ce systbme de l r anspor t se d i f f6renc ie

24

356 F. Blasco, G. D uc e t el E. Azou l ay .

du p r e m i e r par u~ne vi tesse m a x i m a l e d ' abso rp t ion plus grand,e et pa r une a ffin,it6 plus forte p o u r l ' ion t ranspor t6 . (Vm~v p 3'3 nnaoles/naag de mat. s b c h e / m n ; Km~p v 4,5.10 -~ M). Nous a jou te rons qu' i l esi sensibI.e aux inhibi , teurs du m6tabo l i sme 6nerg6tique. Un tel m~can l sme d '~bsorp t ion du p h o s p h a t e a 6t6 mis en 6vide,nce r6c.enanaent chez Neurospora crassa par L o w e n d o r f et coll. [81. I1 e.st di f f ic i le fi priori d 'a f f i rmer que le t r an spo r t du p h o s p h a t e par les levures carenc6.es (ou non) en p h o s p h a t e se r6alis.e con t re u n g rad ien t de concen- t ra t ion et par co ns6quen~t qu' i l es:t de type actif par suite de la r ap ide an6tabolisat ion du Pi. Par an~logie avec les r6.stdtats obtenus pou:r l 'ars6- ni~te, notes pouvons c,epen.d~ant avance r qu.e ce t r anspor t est de type ac~if. En effet, l 'arsr6niate uti- lise les m6mes systbmes de t r anspor t que I:e phos- pha te et b ien que parti, ellenaent r6dui t en ars6ni te chez 1.es chlorell, es [17] g t chez les I.evures (t~lasco, c o m m u n i c a t i o n personneHe) son absorp t ion a l ieu con~tre un g rad ien t de con.centrat ion. L 'appa.r i t ion d ' tm secon,d syst~me de trans~port dans des condi - t ions de ca rence en phospha. te p.eut s ' i n te rp r6 te r h t ravers u,n m~can i sme de d6r6press ion qui se m a n i,festerait u n i q u e m e n t en mi l i eu d6pourvu de phospha te . Cette d6r6press ion con~dui.rait pa r ail- leurs h u n , e synth~se de pro t~ ines affines pour 1.e phospha te , probab.!,ement localis6cs clans la mem- b rane pl, asmique pu isque f~c i lement lib6r6.es par choc osmot ique.

En p r6sence de cy,cloheximi, de, qui b loque tou- tes les syn theses prot6iqu.es, nous n'a,vons constat6 qu 'une faible diminutio.n de l 'act ivi t6 de ce sys- tbme en fonc t ion du temps (.fig. 4, courbe 2). Par contre , l 'addd[ion d~e p h o s p h a t e aux cel:lules d6r6- prim6.es e n t r a i n e une d&croissance r a p i d e de l 'ac- tivit6 du systbme de tran,sport h for te affinit6. Cette r ap ide d6croissan,ce des vi tesses in i t ia les peut s ' interpr6t, er pa r un.e inac t iva t ion de ]a pro- t~.ine ag.fine par son s t~bstrat c.e qui impI ique ra i t que la r6gu~Iation ,du syst~me d,e t r anspor t du phos- pha te h forte ~ffinit6 s ' exerce h d, eux n iveaux : d 'une par t au n iveau de la synthbse ( r6press ion- d6r6press ion) et d'autr.e par t a'u n iveau de I 'acti- vit6 du tra,nsport.eur (aciivation-d&sa,ctivati,on). La pr6sence de c y c I o h e x i m i d e ne naodifie pas d 'unc man ib re s ignif icat ive t'i, nac t iva t ion par le phos- pha te du systbnae d.e t r anspor t h forte affinit& (fig. 4, courbe 4). C.e d.erni,er po in t diff~re des r6sultats obtenus par Hun te r et Segel [18j qui montrbre:ni que la cyclohexina,ide inh iba i t l ' inac- t iva t iou par Ia ~eucin, e du s yst~me de iran~spor[ de cet ~cide a.min6 chez Penici l l ium chrysogenum. Nos r6sul~ats impl iquen, t doric que chez C. tropi- calis, le t r a n s p o r t e u r d~r6prim6 est trbs stable lorsqu ' i l n 'est pas au con tac t de son su.bstrat, le phospha te .

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.

Nous a jou le rons que l ' ac t ion de la cyc lobex imi - de e st r6versibIe chez C. tropicalis el qu 'apr~s u,n p r~ t r a i t emen t d,e 90 nan, une p6 r iode de la tence d ' e n v i r o n 30 na,n est n6cess,aire p o u r ces cel lules avant que n:e se naanifeste l 'act ivi t6 du syst6me de t r anspo r t /t forte affinit& Ces r6su,ltats s emblen t don!c diff~rer que lque peu d~e ceux d.e Kuznar et coll. [19J ; ces de rn i e r s on,t naontr6 quc l es 1,evu- res Saccharomyces chevalieri somnJses h un pr~- traitenaen~t h , lacy, eloheximi, de d,ans un mi l i eu de ca rence ne p r6sen ten t pas de p6r iode de la tence. D'~p.r~s ees auteurs la cye] ,oheximide i nh ibe ra i t r&versi:bl, emen t la sy,nth~se pro t6 ique chez les levures tout en perna,ettan~t l ' a ecumula t i on de naRNA. Dans le cas de C. tropicalis l ' ex i s tence de cette p~rio~de de l a tenee s ' interpr~t:e df f f ic i lement et ceci d ' au tan t plus que nous n ' avons pas pu, dans le cadre de nos exper i ences , contr61er la quanti t~ d ' i n h i b i t e u r ayant r~e l lement p~n~tr~ dans les ¢ellu]e.s.

Des exp~r iences qu, e nous nous p r o p o s o n s de d~- veh~pper nous o n:t pe rmi s d'(~tablir d 'une man i~re pr61iminai re que Je l~ransport du p h o s p h a t e par l:e syst~me h forte affinit6 s ' a ccomp~gne d'un,e ab- so rp t ion de pro tons , ce qui sembJe ~t.re en bon acco rd a v e c l a th6,ori, e d,e Mitchell [20] et sugg~re une absorp t ion du p h o s p h a t e co,ntr.e un g rad i en t : de prc4ons au n iveau de ]a m e m b r a n e p lasmique .

Remerciements.

Ce m,~moire a b ~ n d f i c i 6 d'une aide d.e l a D . G . R . S . T . eon'trats n ° 74.7.12,26 et n ° 74.7.13199.

RI~SUM~.

Candida tropicalis poss~de deux systbmes de trans- port d~t phosphate dont Fun est eonstitutitf et de faible affinit6 pour son substrat (Km ~p -- 1,2.10-3 ~). L'autre, earaet6ris~ par une forte affinit~ pour l'io.n H,~POd- (Km,vp ---- 4,5.113-6 M,) n'apparait que d.ans des eond,itions de earenee en phosphate. La r~gutation d,e ee second syst~me de transport s'exereerait d'une part au niveau d,e la synthbse de prot6ines affines pour le P~ (r6pression-d.6r6p.ression) et d.'autre part sur ]'acti- vation ou l a d6saetivation des transporteurs.

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