Upload
vanxuyen
View
240
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
MODEL SISTEMI
U MOLEKULARNOJ BIOLOGIJI
Model sistemi
• Živi organizmi nad kojima se
vrše eksperimenti
• Razne prirodne nauke razni
model sistemi
• Izbor model sistema
• Model sistem – čovek - sa
etičkog, socijalnog i moralnog
aspekta potpuno
neprihvatljivo
• Delovi tkiva i telesne tečnosti
• Ćelijske kulture
Model sistemi u molekularnoj
biologiji
• Laka eksperimentalna manipulacija
• Mogućnost brzog uzgoja velikog broja jediniki
• Danas..... Iščitan genom
• Bakteriofagi
• E. coli
• Kvasac
• C. elegans
• D. melanogaster
• M. musculus
Bakteriofagi
Bakteriofagi – virusi bakterija
• U periodu razvoja molekularne
biologije, pored bakterija, glavni
model sistem
• Obligatni intracelularni paraziti
• Otkrio ih je Frederik Tvort 1915. godine.
• TEM snimak Tom Aderson 1942. godine.
• Genom je molekul DNK ili RNK koji svoje gene eksprimiraju tek nakon infekcije ćelije domaćina
• Virusi čija je simetrija kompleksna
• Veličina od 24 nm do 200 nm.
• Glava, vrat, okovratnik, rep, bazna ploča, fibrile, repne bodlje
Svaki bakteriofag prepoznaje
specifične molekule (“receptore”)
na bakterijskom zidu i vezuju se
posredstvom svojih fibrila samo za
one bakterije koje poseduju taj
specifični molekul.
Bakteriofagi
“gajenje” u bakterijskim kulturama • Latentni period – od infekcije do umnožavanja virusne nk i
formiranja novih kapsida
• Period eksplozije u broju formiranih faga
• Formiraju plakove
Litički rast
Nekoliko hiljada kopija DNK virusa
Lizogeni rast
• Umereni fag
• Profag
Bakteriofag
• Dvolančana DNK
• 45 kb do 200 kb
• Jednolančana DNK
• Dvolančana RNK
• Jednolančana RNK
• l fag - poseduje dvolančani molekul DNK
dužine168.903 bp na kojoj se nalazi 300 gena
• M13 - filamentozni bakteriofag sa jednolančanim
molekulom DNK
Bakteriofagi – model sistem
• DNK replikacije
• Ekspresije gena
• Rekombinacija DNK
• Ko-infekcija – za analizu mutacija
• Značaj u tehnologiji rekombinovane DNK (vektori)
• Fagna terapija
Fluktuacioni test
• 1943. godine, Salvador E. Luria i
Max Delbruck
• Rad «Mutation of Bacteria from
Virus Sensitivity to Virus
Resistance»
• Prvi eksperimentalni dokaz da su
fenotipske različitosti bakterija
posledica spontanih mutacija a ne
indukovane promene nastale
dejstvom spoljašnje sredine.
• Nobelova nagrada 1969. godine.
Ispitivali prirodu rezistencije E. coli na
infekciju bakteriofagom T1
Fluktuacioni test
• Hipoteza fiziološke rezistencije - Sve ćelije E. coli
imaju vrlo malu ali podjednaku šansu da prežive infekciju
bakteriofaga T1. Tonr karakter je svrsishodna osobina
bakterija koja je indukovana samom infekcijom tj.
prisustvom bakteriofaga T1.
• Očekivana distribucija rezistentnih klonova E.coli na
osnovu hipoteze fiziološke rezistencije – RAVNOMERNA
Fluktuacioni test
• Mutaciona hipoteza - Samo mali broj E. coli već
poseduje osobinu rezistentnosti na bakteriofag T1. U
uslovima kada se takvoj kulturi prezentuje bakteriofag,
samo taj mali broj bakterija ima mogućnost
preživljavanja i formiranja bakterijskih kolonija.
• Očekivana distribucija rezistentnih klonova E.coli na
osnovu mutacione hipoteze - NERAVNOMERNA
• Za potvrdu jedne od ove dve hipoteze Luri i Delbruck su u
eksperimentu pratili vremensku korelaciju prisustva faga i
nastanka rezistentnog fenotipa bakterija E. coli.
• Posle 17 generacija, kompletan sadržaj svake bakterijske
subkulture zasadili su u Perti šolje kao i sadržaj velike kulture u
10 Petri šolja u kojima je podloga sadržavala bakteriofage.
20 subkultura
bez prisustva
bakteriofaga T1
1 kulturu
bez prisustva
bakteriofaga T1
13-26
16.7
Tonr kolonija
Rezultati
fluktuacionog testa
• Pojava mutacija u bakterijskim kulturama je spontan i slučajan događaj koji nije u vezi sa selekcionim agensom odnosno prisustvom ili odsustvom bakteriofaga.
• Da je hipoteza o fiziološkoj rezistentnosti bila prava, ne bi bilo razlika u broju Tonr kolonija u okviru subkultura i «velike» kulture već bi njihovo prisustvo bilo ravnomerno.
• Detektovan različit broj rezistentnih kolonija u analiziranim kulturama objašnjen je vremenom nastanka mutacije koja dovodi do razvoja rezistentnog karaktera bakterije.
Test otiskivanja
• Da su mutacije nezavisne od dejstva
spoljašnje sredine definitivno je
potvrđena testom otiskivanja.
• Test otiskivanja, izveo je 1952.
godine američki nobelovac Joshua
Lederberg (1925 - 2008) u saradnji
sa svojom suprugom Esther
Lederberg.
Test otiskivanja
• Eksperiment se bazirao na zasejavanju
kulture E. coli koja nije bila u kontaktu sa
bakteriofagom T1 u jednoj (glavnoj –
master) Petri šolji.
• Nakon inkubacije čitava površina master
Petri šolje bila je ispunjena spojenim
mikrokolonijama E. coli (konfluentan rast).
• Pomoću sterilnog pliša, kolonije izrasle na master šolji su
“otisnute” na Petri šolju u kojoj je nalazio veliki broj
bakteriofaga T1.
• Posle inkubacije u “drugoj” Petri šolji izraslo je svega
nekoliko kolonija E. coli koje su bile rezistentne na T1.
• Nakon analize prostornog rasporeda rezistentnih
bakterija u drugoj Petri šolji eksperiment je nastavljen
uzimanjem dva uzorka sa konfluentnog sloja bakterija u
master Petri šolji.
Test otiskivanja
• Prvi uzorak uzet je iz onog dela master Petri šolje koja se po
prostornom rasporedu (geometrijski) poklapala sa
rezistentnim kolonijama izraslim na “otisnutoj” Petri šolji.
• Drugi uzeti uzorak bio je iz regiona master Petri šolje koji na
“otisnutoj” Petri šolji nije dao rezistentne kolonije E. coli.
• Oba uzorka su otisnuta na nove Petri šolje sa velikom
količinom bakteriofaga.
Test otiskivanja
• Posle inkubacije na novim Petri šoljama analiziran je broj formiranih rezistentnih kolonija.
• U otisku prvog uzorka broj rezistentnih kolonija bio je veliki.
• U otisku drugog uzorka broj rezistentnih kolonija bio je približno jednak broju kolonija izraslih u prvom delu eksperimenta.
Test otiskivanja
• Na osnovu ovakvog rasta Lederberg-ovi su zaključili da izrasle Tonr kolonije na otiscima potiču od postojećih Tonr bakterija sa master Petri šolje koje nisu bile u kontaktu sa bakteriofagom T1.
• Na ovaj način još jednom je potvrđen rezultat Fluktuacionog testa odnosno još jednom potvrđena nezavisnost nastanka mutacija od faktora spoljašnje sredine.
Bakterije
Bakterije
• Homologa populacija ćelija – klon
• Razmnožavanje prostom deobom
• Ćelijski ciklus kratak – 20 minuta
Naslednost osobina
Mutabilnost
Bakterije – model sistem
• Escherichia coli – gram -
• Vreme generacije 20 minuta
• Prekonoćna kultura sadrži
oko 2x109 ćel/ml
• Haploidna ćelija
• Bacillus subtilis - gram +
Bakterije u laboratorijskim uslovima
• Rastu u tečnom ili čvrstom (agaroznom) medijumu u
petrijevoj šolji – laboratorija
• Golim okom vidljive kolonije
• Eksponencijalan rast do stacionarne faze
Bakterijska ćelija
• 0.2 – 60 μm
• 70S ribozomi
• citoplazmatske
vezikule i
inkluzije
• Zid
• Pili
• Flagela
Bakterijska DNK
• Deo bakterijske ćelije u kojoj se nalazi molekul DNK - nukleoid
• Jedan kružni molekul DNK
• “Bakterijski hromozom”
• Veličina prokariotskog genoma proporcionalna broju gena
• Mali nekodirajući segmenti DNK - kod E. coli 11 %
• Nema introna* • Geni organizovani u operone
• Plazmidi i transpozoni
Plazmidi
• Ekstrahromozomski molekuli DNK koji imaju sposobnost autonomne replikacije - autonomni replikoni.
• Veličina od 1 kb do 400 kb.
• Sadrže gene čiji proteinski produkti učestvuju u procesu autonomne replikacije plazmidne DNK.
• Kod mnogih plazmida registrovano je prisustvo gena čiji su proteinski produkti odgovorni za razvoj otpornosti (rezistencije) bakterijske ćelije na određene antibiotike.
Bakterijski genom 105 – 107 bp
• Procesi koji mogu imati efekta na veličinu bakterijskog genoma:
• Mutacije po tipu delecija i inverzija.
• Transpozicija (aktivnost mobilnih genetičkih elemenata u okviru genoma).
• Horizontalni transfer gena - proces prenosa genetičkog materijala - segmenta molekula DNK iz jedne bakterijske ćelije u drugu
Prenos genetičkog materijala
Horizontalni transfer gena
Donatorska ćelija
Recipijentna ćelija Fragment molekula DNK
a. inkorporiran u hromozom recipijentne ćelije
b. opstaje u ekstrahromozomskom obliku - plazmid
• Transformacija
• Transdukcija
• Konjugacija
Transformacija
• Prihvatanje slobodne DNK iz spoljašnje sredine i transport u unutrašnjost ćelije.
• Otkriće fenomena transformacije bio je prvi naučni korak u dokazivanju nosioca naslednih osobina (Frederick Griffith).
Transdukcija
• Horizontalni transfer gena posredovan bakteriofagima
• Litički i lizogeni rast bakteriofaga
Generalizovana transdukcija
• Određeni umereni bakteriofagi kod prelaska iz lizogenog u litički ciklus imaju mogućnost da “upakuju” fragment bakterijske DNK u kapsid.
• Takvi fagi nazivaju se transdukujući fagi.
• Transdukujući fagi prenose fragmente bakterijske DNK iz jedne u drugu bakterijsku ćeliju.
Restriktivna transdukcija
• Ako transdukujući fag (koji sadrži i deo DNK bakterijskog
hromozoma) nanovo pređe iz litičkog u lizogeni ciklus (u
novoj bakterijskoj ćeliji) može doći do inkorporiranja
segmenta molekula DNK jedne ćelije u molekul DNK
nove bakterijske ćelije.
Konjugacija
• Horizontalni transfer gena posredovan plazmidima
• Prenos genetičkog materijala odvija se direktnim
kontaktom dve bakterijske ćelije
Konjugacija
• F faktor
• Prvootkriveni plazmid
• Konjugativni plazmid
Sadrži gene neophodne za
odigravanje konjugacije
PROCES
a. Kontakt 2 ćelije (preko pila)
b. Replikacija plazmida
c. Transfer plazmida
preko citoplazmatskog
mostića
Mycoplasma genitalium
• Klasa: Mollicutes
• Bakterije bez ćelijskog zida
• Veličina 0.2-0.3 μm
• Izolovan iz uretralnog brisa bolesnika sa uretritisom
• Parazit respiratornog i genitalnog trakta primata
• Najmanji poznati genom
580,070 bp
• 470 protein kodirajućih gena,
3 rRNK gena, 33 tRNK gena
E. coli
• Domaćin i čovek
• 1997. godine “očitan” genom
• 4,639,221 bp
• 4.288 proteina
• Najpoznatiji plazmid – F- faktor
Bakterije
Prvi prozor molekularne biologije
• Model sistem na kome su otkriveni i/ili dokazani
fundamentalni molekularno - biološki procesi:
semikonzeravativan način replikacije DNK, osnovi
postulati regulacije ekspresije gena, i sistema za
ispravku oštećenja na molekulu DNK, priroda mutacija ...
• Tehnologija rekombinovane DNK
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
• Pivski kvasac
• Tipičan i najintezivnije istraživan eukariot
• Jednoćelijski eukariotski organizam veličine 5 mm
• 90 minuta dovoljno da dođe do deobe
• Laka eksperimentalna manipulacija
• Haploidna
• Dipolidna
• Mating
(haploidna u diploidnu)
• Sporulacija i mejoza
(diploidna u haploidnu)
Saccharomyces cerevisiae
Najmanji eukariotski genom
• 1996. godine “očitan” genom
• 16 hromozoma
• 13.000.000 bp (13 Mb)
• 6.275 gena (funkcionalno 5.885 gen)
• U 231 genu detektovano prisustvo introna
• 23% “sličnosti” sa genomom čoveka
Saccharomyces cerevisiae
• Obrada primarnog transkripta
• Regulacija ekspresije gena kod eukariota
• Rekombinacija molekula DNK
• Replikacija molekula DNK
• Translacija
• Prvi model sistem funkcionalne genomike
• Kvaščev veštački hromozom – YAC – eukariotski vektor
Arabidopsis thaliana
• “Vinska mušica” botanike
• 1873. godine – prva mutacija
• Nemendelov način nasleđivanja
• 2000. godine – prvi sekvencirani genom biljaka
• 5 hromozoma
• 157 miliona bp
• 25.500 gena
Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans
• Model sistem u molekularnoj biologiji i biologiji razvića od 1965. godine
• Prvi je u eksperimentalnom radu upotrebio Sydney Brenner (Nobelova nagrada 2002).
• Valjkasti crvi široko rasprostranjeni u prirodi
• 1 mm
• Bilateralna simetrija
• Hermafrodit
• 959 ćelija u adultnom hermafroditu
• 1031 ćelija u adultnom mužjaku
Caenorhabditis elegans
• Larva (L1-L4), Juvenilni oblici, Adult
• 131 ćelija hermafrodita odnosno 111 ćelija mužjaka
tokom embriogeneze umire procesom apoptozom
• Dauer – forma rezistentna na sredinske faktore
• Životni vek 3 dana
Caenorhabditis elegans
• 1983. godine, John Sulston načinio mapu ćelija C. elegans
• 1986. godnine, Joch White uradio TEM-snimke svih ćelija
Caenorhabditis elegans
jaja
22 epidermalne ćelije
formiraju vulvu
Adultni hemafrodit – prominentan organ - gonade
• Mutacije u ćelijama vulve dovodi do razvoja embriona unutar organizma
• Detektovano na stotine mutacija koje uzrokuju promene na vulvi
• Neke od tih mutacija “pogađaju” gene čiji su proteinski produkti uključeni u procese prenosa signala i u kontroli ćelijske proliferacije
• Mnogi sisarski analozi ovih gena su onkogeni ili tumor supresorni geni
Genom
Caenorhabditis elegans
- Sekvenciran 2002. godine
- 5 para autozoma i 2X
- 100,258,171 bp duga DNK
- 19.000 – 20,000 - protein-kodirajućih gena
- Prosečno pet egzona po genu
- Jedinke sa dva polna hromozoma su hermafroditi
- Nondisjunkcijom, retko, gubi se jedan X hromozom i takvi crvi postaju mužjaci sposobni da fertilišu jaja hermafrodita
Caenorhabditis elegans
• Robert Horovitz identifikovao je gen ced-3 “odgovoran” za proces apoptoze tokom embrionalnog razvoja ove nematode.
• Protein kodiran od strane ovog gena je cistein proteaza homologa sisarskom enzimu koji konvertuje interleukin1-b (ICE, kaspaza 1).
APOPTOZA
2002. godine - Nobelova nagrada
za fiziologiju ili medicinu
2006. godine - Nobelova nagrada
za fiziologiju ili medicinu
• Andrew Zachary Fire
• Craig Cameron Mello
• 1998. godine
• RNK interferencija
Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster
• Jedan og glavnih model sistema u biologiji
• Dostupne i lake za laboratorijsku manipulaciju
• Početak XX veka, Morgan (Columbia University)
• Istraživanje “naslednosti”
• Boje očiju voćnih mušica
Drosophila melanogaster
• Veličina do 3 mm
• Dve nedelje dug život
• Ženka polaže 400 jaja,
• Ebriogeneza 1 dan
• Metamorfoza 5 dana,
• Larva sa gigantskih hr.
• Pupa, Adult
• Seksualni dimorfizam
• Ženke veće od mužjaka
• Mužjaci “bez rekombinacije”
• Larve karakteriše prisustvo imaginalnih diskova, tkiva nastalih invaginacijom epidermisa embriona.
• Svaki od njih ima oko 100 ćelija u embrionu i narasta u formaciju od preko 10.000 ćelija u larvi.
• Od ovih parnih formacija razvijaju se organi adultnih vinskih mušica kao što su oči, antene, genitalije, itd..
• Eksperimentalna manipulacija imaginalnim diskovima predstavlja jedan od najpoznatijih načina istraživanja metamorfoze i embrionalnog razvoja uopšte.
Genom
Drosophila melanogaster
• Jedan (X ili Y) polni i tri autozomna obeležena kao 2,3 i 4.
• 1998. godine sekvenciran genom
• 122.653.977 bp DNK, 13. 379 gena
• Mitohondrijska DNK od 19.517 bp
Drosophila melanogaster
• 50% proteina D. melanogaster ima svoje sisarske homologe
• Model sistem za istraživanje
- neurodegenerativnih bolesti
- malignih bolesti
- dijabetesa
Genetička sličnost sa H. sapiens
Mus musculus
Mus musculus
• Najčešći model sistem u molekularnoj biologiji i medicini
• Težina oko 20g, dužina do 20 cm, životni vek do 2 godine
• Najmarkantnija razlika između polova je ta što mužjaci nemaju bradavice
Embriogeneza
13 ICM ćelija
Stem ćelije
Kultivacijom sa odgovarajućim faktorima rasta može se indukovati rast svih
adultnih tipova ćelija miša
Placenta
Genom
Mus musculus
• “Očitan” 2002. godine
• 40 hromozoma
• 2.267.775.209 bp
• do 23.000 gena
• 80% homologije sa čovekom
• Mini human
Mus musculus
Bazični principi
otkriveni kod
C. elegans
i
D. Melanogaster
Bolesti čoveka
link
Transgeni miševi
• Mikroinjekciona metoda
• Muški pronukleusi izolovani iz oplođene jajne ćelije
• Gen od interesa inkorporiran u vektor
• Po principu slučajnosti klonirani gen se raspoređuje po genomu
• Jajna ćelija prenosi se u jajovod “lažno” trudnih ženki
• Embrioni sa kopijama rekombinovane DNK - transgen
Invertni mikroskop ( 400x) i specijalna mikromanipulatorna
injekciona pipeta kojim se fragmenti molekula DNK insertuju u pronukleuse
Transgeni miševi
• Transgeni se ugrađuju i u
somatske i u polne ćelije
te se prenose i na
potomstvo
• Proizvodnja linija
transgenih miševa
• Model sistemi za
istraživanje različitih
aspekata funkcije gena i
njihovih produkata
“Knockout” miš
Miševi sa izbačenim genom • Za razliku od transgenih miševa kod kojih je ugrađen
novi genski materijal, mogu se “proizvesti” i životinje kod kojih neki gen nedostaje ili je nefunkcionalan.
• Proizvodnja takvih životinja zasniva se na postupku kojim se normalni gen in vitro “zamenjuje” mutiranim genom.
• Vrlo koristan model sistem – daju odgovore na pitanja kako nedostatak nekog gena utiče na različite funkcije u ćeliji, tkivu i organizmu.
“Knockout” miš
• Kultivacija embrionalnih stem
ćelija
• Homolognom rekombinacijom
“dobija se” mutirana / inaktivna
kopija željenog gena
• Selektovane embrionalne
matične ćelije koje sadrže
promenjeni gen prenose se u
novu blastocistu a ona se
unosi u matericu “lažno”
trudne ženke
Miševi sa izbačenim genom
• Homolognom rekombinacijom se u ciljnu sekvencu
inkorporira gen za rezistenciju na lek npr. antibiotik
neomicin.
• Fragmente sa normalnim alelima, kod kojih se nije
odigrala rekombinacija, ubija neomicin
• Marker nehomologne rekombinacije je gen za timidin
kinazu čiji proteinski produkt fosforiliše ganciklovir.
• Fragmenti koji su rezultat nehomologne rekombinacija
“poseduje” i gen za timidin kinazu.
• Fosforilisani ganciklovir je nukleotidni analog. Njegovo
inkorporiranje u DNK, tokom sinteze DNK, dovodi do
smrti ćelije.
• Ovi fragmenti se “anuliraju” rastom u medijumu sa
ganciklovirom.
“Knockout” miš
• Preživljavaju samo DNK fragmenti koji su rezultat rekombinacije sa genom za rezistentnost na neomycin i bez gena za timidin kinazu
Miševi sa izbačenim genom
Nezaobilazan eksperimentalan model u istraživanjima
• Razvoja čoveka
• Biologije ponašanje čoveka
• Patogeneze bolesti čoveka
neoR TK