Razmena genetičkog

materijala kod prokariota

Mehanizmi razmene gena kod prokariota

Prenošenje dela genetičkog materijala iz ćelije

donora u ćeliju recipijenta

konjugacijom

transformacijom

transdukcijom

Rekombinacijom sa hromozomom recipijenta nastaje

rekombinant

Rekombinacija

Fundamentalan ćelijski proces odgovoran za fizičku

razmenu genetičkog materijala između različitih genetičkih

elemenata.

homologa rekombinacija

mesto-specifična (“site-specific”) rekombinacija

ilegitimna rekombinacija

Homologa rekombinacija

Fundamentalni biološki proces, uključuje RecA zavisnu razmenu homologih sekvenci DNK različitog porekla.

Kod E.coli postoje dva glavna puta (RecBCD, RecF) sa najmanje 25 gena

RecA protein se polimerizuje na ssDNK (5'3' smer) i formira se nukleo-proteinski filament koji ima afinitet za homologi segment dsDNK (invazija lanca)

Prekid se formira u homologom segmentu na lancu iste polarnosti i lanci se unakrsno povezuju (Holidejeva struktura)

Holidejeva struktura migrira i formiraju se heterodupleksi

Holidejeva struktura se razdvaja na dva moguća načina

Detekcija rekombinanata Odaberemo donora i recipijenta

tako da se razlikuju po svojstvu

koje pratimo:

Donor:Trp+ (sintetiše triptofan)

Recipijent:Trp- (ne sintetiše trp)

Podloga: minimalni medijum

(ukoliko zasejemo samo

recipijente nakon transfera

DNK, rastu samo rekombinanti

koji su postali Trp+)

Konjugacija

Transfer plazmida

F plazmid (fertility factor)

Konjugacija – transfer plazmida ili čitavog

hromozoma

Konjugacija, transfer hromozoma Integracija F plazmida u

hromozom može se desiti na većem broju mesta

Kada se F plazmid integriše u hromozom formira se Hfr (High Frequency of Recombination) soj

Konjugacijom sa Hfr sojem dolazi do prelaska hromozoma u ćeliju recipijenta

Transfer kompletnog hromozoma domaćina (veoma redak) traje 100 min.

Proces se može koristiti u mapiranju gena na hromozomu

Lederberg i Tejtum, 1946 Dejvis, 1950

Kako selektovati transkonjugante (rekombinante

nastale procesom konjugacije)? Hfr donor: prototrof (thr+, leu+), koristi

laktozu (lac+), osetljiv na antibiotik (npr.

streptomicin)

Recipijent: auksotrof, ne sintetiše (thr-,

leu-), ne koristi laktozu (lac-), otporan na

antibiotik streptomicin

Selekcija rekombinanata:

1) MM +str+glukoza – rastu rekombinanti

koji su postali Thr+ i Leu+

2 ) MM+str+laktoza (nema glukoze)+

thr+leu – rastu rekombinanti koji su postali

Lac+

3) MM+str+laktoza (nema glukoze) – rastu

rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+

i Lac+

Transdukcija

Transfer gena iz donora u recipijenta pomoću virusa

Generalizovana transdukcija – prenos bilo kojeg

fragmenta DNK donora u recipijenta. Efikasnost

niska.

Specijalizovana transdukcija – prenos određenog

dela DNK donora u recipijenta. Efikasnost može biti

veoma visoka.

Generalizovana

transdukcija

(model P1 fag)

Umesto virusne DNK u

virusnu česticu se

upakuje bilo koji

fragment domaćinove

DNK odgovarajuće

veličine (virus postaje

’defektan’,

transdukujući fag)

Specijalizovana

transdukcija

(model λ fag)

DNK umerenog virusa

(profag) se pogrešno

iseca iz hromozoma

domaćina noseći deo

svoje DNK i susedne

gene domaćina

Otkriće transformacije, Grifit 1928

Streptococcus pneumoniae

S ćelije sa kapsulom (kapsula je faktor patogenosti)

R ćelije mutanti bez kapsule (nepatogene)

Hemijska priroda “transformišućeg principa” – molekul DNK

(Averi, 1944)

Transformacija

Indukcija kompetencije (prirodna - quorum sensing fenomen kod B. subtilis ili veštačka)

Com proteini (regulišu quorum sensing odgovor, učestvuju u vezivanju DNK i formiranju pore za njen prolazak)

Uzimanje slobodne DNK često uz degradaciju jednog lanca

Integracija u hromozom recipijenta homologom rekombinacijom

Kompetencija (sposobnost transformacije)

Sposobnost prihvatanja gole DNK

Prirodna: Azotobacter, Bacillus, Haemophilus,

Streptococcus, Neisseria, Thermus

Veštačka: E. coli

Indukovana elektroporacijom

Indukovana termalnim šokom i Ca2+ jonima

Lakši ulaz cirkularne DNK (plazmida)

Rasprostranjenost razmene gena kod Bacteria

Konjugacija: E. coli, enterične bakterije, Streptococcus, Staphylococcus

Transdukcija: čest proces kod Bacteria, redak kod Archaea (metanogeni)

Transformacija: Bacillus, Streptococcus, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria, Thermus (prirodno kompetentne)

Rasprostranjenost razmene gena kod Archaea

Mnogo manje proučavana, pre svega zbog teže kultivacije

(neophodnost gajenja na čvrstim podlogama i dobijanja

pojedinačnih kolonija, manje selektivnih agenasa dostupno –

antibiotici novobiocin (inhibitor DNK žiraze, deluje u oba domena

prokariota) ili neomicin (inhibitori sinteze proteina na

prokariotskim ribozomima)

Sva tri procesa dokazana i kod Archaea

Konjugacija: Sulfolobus solfataricus – slično kao kod bakterija,

jednosmerni transfer DNK; kod nekih halofila dvosmerni transfer

Transformacija: problem sticanja kompetencije: delovanjem

dvovalentnih jona metala koji destabilišu glikoproteinske zidove

Archaea

Transdukcija: retka, dokazana kod Methanobacterium thermo

autotrophicum

Transfer gena iskorišćen za eksperimente komplementacije

Parcijalni diploid – merodiploid (jedna

kopija gena na hromozomu, druga na

plazmidu ili fagnoj DNK): genetičkim

inženjerstvom može da se ciljano

konstruiše

Ispitivanje da li su mutacije koje dovode do

iste fenotipske promene na istom ili

različitim genima – exp. komplementacije

(da li mutacije mogu da se dopunjuju)

Mutacije koje se nalaze na istoj DNK – cis

forma, na različitim DNK – trans forma

Da li 2 mutacije u trans obliku mogu

međusobno da komplementiraju i daju wt

fenotip?

Cis-trans sistem – pojam cistrona

Tehnologija rekombinantne DNK -

genetičko inženjerstvo

Izučavanje gena van organizma za koji je karakterističan

Skup in vitro tehnika kojima je omogućeno stvaranje himernih

molekula DNK

Kloniranje gena:

Izolovanje gena iz organizma

Prebacivanje u manje genome - vektore za kloniranje

Ubacivanje u ćeliju domaćina

Selekcija transformisanih ćelija i identifikacija klona koji sadrži željeni

gen

Amplifikacija gena u domaćinu ili ekspresija stranog proteina u

domaćinu

Primena u istraživanju ili komercijalnoj proizvodnji korisnih produkata

Restrikcione endonukleaze tipa II

Najčešći tip kod bakterija

Dimeri, seku dvolančanu DNK asimetrično na

palindromskim sekvencama koje nisu modifikovane

Dobijaju ime prema bakteriji iz koje su izolovane

(EcoRI, HindIII, BsuRI, BamHI itd)

..G׀AATTC.. .G AATTC.. GAATTC

..C TTAA׀G.. .CTTAA G.. CTTAAG

Produkuju molekule različite dužine sa jednolančanim

komplementarnim krajevima (lepljivi krajevi, ‘sticky

ends’)

Dobijanje himernih DNK molekula

Tretiranje izolovane DNK

restrikcionom endonukleazom

Tretiranje izolovane DNK

vektora istim enzimom

Povezivanje molekula pomoću

DNK ligaze

Ubacivanje u ćeliju domaćina

transformacijom

Osobine vektora za kloniranje

Mali dobro okarakterisani DNK molekuli (po pravilu

do 10 kbp)

Autonomno se repliciraju u domaćinu i prenose u

ćerke ćelije

Imaju selektabilne genetičke markere

Imaju jedno restrikciono mesto za pojedinu

restrikcionu endonukleazu

Vektori za kloniranje

Plazmidi, derivati prirodnih plazmida

Virusi, uglavnom bakteriofagi

Kozmidi

Veštački hromozomi

Ekpresioni vektori

Šatl vektori

Plazmidni vektori Plazmid pBR322 (E. coli i S. typhimurium):

bla gen (enzim β-laktamaza) –

rezistencija na ampicilin

tet gen (membranski protein, efluks

antibiotika iz ćelije) – rezistencija na

tetraciklin

U okviru gena tet restrikciono mesto

BamH1

Domaćin je osetljiv na oba antibiotika;

uspešno kloniranje: ćelije nosioci

kloniranog gena su ampRtetS

Plazmidni vektori

pUC plazmidi

Ampicilinska rezistencija

Restrikciona mesta različitih

enzima – polilinker sekvenca

Deo lacZ gena (kodira β-

galaktozidazu) za α-fragment

(ω-fragment sintetiše ćelija), u

njemu je restrikciono mesto

Selekcija ćelija sa kloniranim

genom primenom Xgal (analog

laktoze, supstrat za β-

galaktozidazu, razgradnja daje

plave kolonije)

Plazmidni vektori Ekspresioni vektori (kontrolisana sinteza rekombinantnog proteina)

Vektori za studiranje ekspresije gena (sadrže “reporter” gene, npr. lacZ)

Kontrola transkripcije: gen se klonira iza jakog promotora, npr. lac ili trp

promotor, ili hibrid ova dva – tac i trc

Kontrola translacije: ubaciti željeni gen iza mesta koje prepoznaju

bakterijski ribozomi, rešiti problem introna eukariotskih gena (reverzna

transkriptaza katalizuje mrNK →cDNK, ona se klonira) i zameniti

kodone onima koje prepoznaju tRNK bakterijske ćelije u koju je gen

ubačen)

Ekspresioni vektor

Fagni vektori λ vektori

λ litički vektor (geni odgovorni za lizogeni ciklus su zamenjeni

kloniranim fragmentom)

λ lizogeni vektor (ubacivanje kloniranog gena u hromozom E. coli,

studiranje jedne kopije gena)

M13 vektori

ssDNK virus → lako sekvenciranje

Ima dsDNK oblik (replikativna forma) neophodan za kloniranje

Inficirane ćelije se održavaju u životu, virus ih ne lizira, tako da mogu biti kontinuirani izvor klonirane DNK

Intergenski prostor koji ne kodira proteine i koji se može zameniti stranom DNK je dovoljno veliki

DNK se pakuje prolaskom kroz membranu, veličina fagne partikule nije fiksna, zavisi od veličine upakovanog fragmenta

Kozmidi (kombinacija plazmidnog vektora i cos

mesta λ faga) – pakovanje plazmidne DNK u glavu

faga, klonirani fragmenti do 45-50 kb

Shuttle vektori (plazmidi koji sadrže ori i selektabilne

markere karakteristične za dva domaćina, npr. E. coli

i B. subtilis ili eukariotska ćelija)

“Artificial chromosome” (veštački hromozomi,

klonirani fragment do 1000 kb)

Kozmidi (na bazi λ faga)

PACs (na bazi P1 faga)

BACs (na bazi bakterijskog hromozoma)

YACs (na bazi hromozoma kvasca)

HACs (na bazi humanog hromozoma)

Ćelije domaćini za kloniranje

Genske biblioteke

Kolekcije rekombinantnih klonova koji sadrže sve

gene nekog organizma

Genska biblioteka – kompletan genom

cDNK biblioteka – kodirajuće sekvence genoma

Izolacija ukupne iRNK iz ćelije (hibridizacijom polyA repa

sa polyT fragmentima na koloni)

korišćenje reverzne transkriptaze – sinteza cDNK

Isecanje restrikcionim endonukleazama i kloniranje u

vektor

Konstrukcija probe na osnovu iRNK - cDNK

Identifikacija klona

Određivanje primarne strukture gena – sekvenciranje DNK

Metoda po Maksamu i Gilbertu (primena

nukleaza)

Sangerov metod - dideoksi metod

(primena dideoksi analoga nukleotida i

DNK polimeraze); Nobelova nagrada

Metoda Sangera

Našla primenu i u sekvenciranju RNK

molekula (isti princip, samo se koristi

reverzna transkriptaza i dideoksi

analozi ribonukleotida)

Automatski sistemi za sekvenciranje

(dideoksi metod, ali obeležavanje nije

radioaktivitetom, već je svaki

nukleotid obeležen različitom

fluorescentnom bojom

Sekvenciranje većih molekula i čitavih

genoma – strategija shotgun

sequencing ((sekvenciranje nasumično

isečenih fragmenata i rekonstrukcija

celokupne sekvence na osnovu

preklapanja sekvenci)

Konstrukcija probe na osnovu poznate

sekvence aminokiselina

Sinteza DNK fragmenta (oligonukleotida)

Sinteza probe ili prajmera za PCR

reakciju

Sinteza in vitro korišćenjem solid

phase procedure (prvi nukleotid

je vezan za čvrst nosač – silika

gel)

U zavisnosti od željene sekvence,

u reakcionu smešu se dodaje

samo jedan odgovarajući

nukleotid (hemizam reakcije

komplikovan)

Između svakog dodavanja vrši se

ispiranje nevezanih nukleotida

Umnožavanje DNK

(PCR reakcija)

Lančana reakcija polimeraze

(polymerase chain reaction)

Mulis, 1993, Nobelova nagrada

dsDNK templet, 2 in vitro

sintetisana prajmera, Taq

polimeraza (Thermus aquaticus)

Ciklus:

90-95°C razdvajanje lanaca

55°C vezivanje prajmera za

jednolančane templete

70°C ekstenzija prajmera (sinteza

DNK)

Ponavljanje ciklusa 25-35 puta

Primena kloniranja u genetici bakterija

Dirigovana (site

directed) mutageneza

Inaktivacija specifičnog gena

tehnika cassette mutagenesis)

Molekularna biotehnologija