Module BioAnalyse Les Protéines ¾ - genotoul-bioinfo

Module BioAnalyse

Les Protéines

Cécile ALBENNE

[email protected]

Maître de conférences en biochimie

Equipe Protéines pariétales et développement (E. Jamet)

Objectifs de la journée

Objectifs et plan du cours

Rappel des fondamentaux sur les protéines

Présentation des méthodes d’étude structurale des protéines

• Relations structure/fonction

• Analyse protéomique

Mise en application directe sous forme de TD

Organisation de la journéeMatinée : Relations structure / fonction

1h30 de Cours : Principes et méthodes2h de TD : Analyse de données structurales à l’aide de logiciels adaptés

Après-midi : Analyse protéomique1h30 de Cours : Stratégies et outils2h de TD : Analyse de données de masse à l’aide de logiciels adaptés

2ème partie

Analyse protéomiqueI- Définitions et généralités

II- Séparation des protéines et des peptides

IIIIII-- Identification et Identification et caractérisationcaractérisation des Protéines par Spectrométrie de des Protéines par Spectrométrie de

Masse (MS et Masse (MS et MS/MS)MS/MS)

IV- Etude des modifications post-traductionnelles

Plan du cours

Plan

I- Définitions et généralités

Protéome

• Protéines exprimées par le génome

• Post-génome

ProtéomeProtéome :: Le protéome représente l’ensemble des protéines présentes dans une cellule donnée à un temps donné ; la protéomique en est son étude (Marc Wilkins, 1994).

-- dynamique, spécifique du type et de l’état des cellulesdynamique, spécifique du type et de l’état des cellules

-- son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à leurs propriétés leurs propriétés structurales telles que les modifications poststructurales telles que les modifications post--traductionnelles ou d’identifier des protéines clés traductionnelles ou d’identifier des protéines clés impliquées dans un processus biologiqueimpliquées dans un processus biologique

Le concept un gène-une protéine n'est plus d'actualité

Bactérie1 gène 1 à 2 protéines

Levure1 gène 3 protéines

~30.000 gènes ~ 300.000 transcripts ~ 3.000.000 protéinesHumain

L’étude du génome ne suffit pas à comprendre le comportement cellulaireLe protéome sert de lien entre la séquence du génome et le comportement cellulaire


La complexité du protéome

Même génome…

Différents protéomes !!!


La complexité du protéome

• Préparation de l’échantillon (extraction, concentration, …)

• Séparation des protéines ou des peptides => simplification de l’échantillon

pour l’analyse par SM

• Spectrométrie de masse pour l’identification, la caractérisation et/ou la

quantification des protéines


Les étapes en protéomique

A l’heure actuelle, deux méthodes sont utilisées pour séparer les protéines ou peptides en amont d’une analyse protéomique :

1- L’électrophorèse (mono- ou bi-dimensionnelle

2- La chromatographie liquide mono- ou multi-dimensionnelle

II- Séparation des protéines ou peptides

Méthodes

pI

PM

Carte à 2 dimensions dans laquelle chaque protéine est séparée selon son point isoélectrique et sa taille moléculaire apparente.

Protéines pouvant être analysées par gel 2D

4.0 10.0

10

100


Séparation des protéines par électrophorèse 2D

D’après Wildburger et al.Electrophoresis 2000, 21, 2610-16

La grande majorité des protéines peuvent être analysées par gel 2DMais pb des protéines de pI extrêmes (surtout les protéines basiques de pI > 10), hydrophobes

(peu solubles – protéines membranaires) et de hauts PMDéveloppement de stratégies de séparation par association avec la chromatographie liquide

(mono ou multi dimensionnelle)

Protéines pouvant être analysées par

gel 2D


Séparation des protéines par électrophorèse 2D

a- Electrophorèse 2D

b- Chromatographie Liquide mono ou bi-dimensionnelle

• des protéines

• des peptides après hydrolyse enzymatique d’un mélangecomplexe de protéines


Méthodes

• Pour les séparer, on va combiner plusieurs séparations sur la base de propriétés physico-chimiques différentes (multiD-LC, 2D-LC) :

- Taille : filtration sur gel- Charge : échange ionique (anion, cation)- pI : chromatofocalisation- Polarité : phase normale- Hydrophobicité : phase inverse (C4, C8, C18)

Mélange de protéines Prot purifiée Peptides analyse MS et MSMS2D LC hydrolyseStratégie :

Identification / caractérisation


Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D


Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D

☺Les fractions éluées de la 1ère colonne sont automatiquement injectées dans la 2ème colonne puis les fractions issues de la 2ème colonne peuvent être déposées sur cible MALDI pour des analyses MS

évite la manipulation manuelle d’échantillons (pertes, contaminations…).

☺ Un détecteur (UV par ex.) permet d’avoir une idée de la quantité de protéines éluées dans chaque fraction à l’issue de la 1ère colonne puis de la 2ème

Obtention de carte bi-dimensionnelle

Protéine (ou mélange de protéines) dénaturé(es)

Digestion enzymatique (trypsine)

Peptides (qques centaines à plusieurs milliers)

Séparation chromatographique des peptides 1D (RPC) ou 2D (1- Echange d’ions 2- Phase inverse)

MS et MS/MS (Fragmentation des peptides) => listes de masses d’ions parents et fragments

Comparaison des listes de masses expérimentales avec les listes de masses générées par la digestion théorique des protéines contenues dans les bases de données (protéiques ou génomiques)

Technique très utilisée en

protéomique


Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D

~ 20.000 protéines


Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D : le proteome de levure

1. Les spectromètres de masse

2. Les cartographies massiques peptidiques en MS

3. L’interrogation des banques de données

4. Les fragmentations peptidiques en MS/MS

III- Identification et caractérisation des protéines

Source Analyseur DétecteurIntroduction

DirecteGC/MS

HPLC/MSCE/MS

BIA/MS

EICI

FABElectrospray (ESI)

Maldi

QuadripôleTrappe ionique

TOF (Time Of Flight)FT ICR

++

+ ++

En biologie, deux techniques d’ionisation douce sont généralement utilisées pour préserver l’intégrité des biomolécules :

- l’électrospray (ESI)- la désorption laser assistée par matrice (MALDI)

*

IonisationMise en phase gazeuse

Séparation des ions en fonction de m/z


1- Les spectromètres de masse

*III- Identification et caractérisation des protéines

1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation

• Présence d’une matrice • Echantillon solide (co-crystal avec la matrice) • Ions monochargés MH+

Effets de suppression☺ Dépôt automatisable

• Echantillon phase liquide• Ions multichargés M + nH+

Solubilité - Faible tolérance aux sels

☺ Couplage HPLC => analyse de mélanges complexes

☺ Fragmentation MS/MS

laser

ionsions

Approches complémentaires

Association avec un TOF :Cartographies massiques peptidiques

Identification de protéinesSensibilité : quelques fmol

Couplage HPLC ESI MSMS :Informations de séquences peptidiques

Caractérisation de MPTsSensibilité : quelques fmol….

MALDI ESI

*III- Identification et caractérisation des protéines

1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation

Un Nobel 2002 pour la Spectrométrie de Masseet la protéomique

John Fenn Koichi Tanaka

Electrospray Maldi

Analyseurs Résolution Gamme m/z

Quadripôle 3.000 < 4.000

Trappe ionique 5.000 < 6.000

Temps de vol (TOF) 20.000 < 500.000

Cyclotron à résonance 1.000.000 < 4.000des ions (FT-ICR)

Les analyseurs*III- Identification et caractérisation des protéines

1- Les spectromètres de masse les analyseurs

Résolution = m

Δm


2- Cartographie massique peptidique : stratégie

1 - Séparation de protéines sur gel d'électrophorèse 2D (ou 1D)

2 - Excision d'un spot protéique, décoloration

3 - Digestion enzymatique dans le gel (trypsine)

5 - Cartographie massique peptidique par MALDI TOF et interrogation des banques de données

4 - Extraction des peptides

6 - Nano électrospray MS/MS et interrogation des banques de données

microséquençage

Identification ?

Non

Oui


2- Cartographie massique peptidique : exemple (sous-unité du protéasome humain)

700.0 3000.0Mass (m/z)

% In

tens

ity

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100895.4543

2522.3050

2027.1385

1580.7607 2202.0977

2649.1113842.5305 1918.00211564.74432211.0977

822.2776 2050.14371754.92271007.50002632.1079

1516.7597 2358.20521203.3921 2090.1058 2707.4223

1478.7189

MassesMonoisotopiques

822.2776836.3775842.5305862.3546895.45431007.50001203.39211478.71891564.74431580.76071754.92271918.00212027.13852050.14372090.10582202.09772211.09772358.20522522.30502632.10792649.1132707.4223


3- Interrogation des banques de données

http://prospector.ucsf.edu/



C’est le nombre minimum de peptides d’une même protéine qui doivent être identifiés pour que cette protéine apparaissent comme résultat (« hit »)

Plus ce nombre sera grand , plus la recherche sera sélective

MS-FITSearch mode



MS-FITSearch mode

• Ecart de masse maximum toléré entre la masse du peptide expérimental et la masse du peptide qui « matche » dans la banque

• S’exprime en Da ou en ppm :1 ppm = 1 partie par million

=> 1 Da pour 106 Da => 0,001 Da pour peptide de 1000 Da

Plus la tolérance de masse sera faible , plus la recherche sera sélectiveLa tolérance de masse dépend de la qualité de la calibration

• Calibration par défaut = calibration de l’appareil (régulièrement contrôlé) :

=> tolérance de masse = 100 ppm

• Calibration interne:

– On utilise des peptides présents dans l’échantillon pour calibrer l’appareil (par ex. pics trypsiques)

⇒ tolérance de masse : 10-50 ppm

– Si la calibration échoue (moins de 2 pics identifiés), pas de liste de masse générée

• Calibration externe:

– On dépose les peptides standards à côté de l’échantillon à analyser (eg. close-external calibration). L’appareil est calibré à l’aide des standards.

=> tolérance de masse : 50-100 ppm

Tolérance de masse et CalibrationLa calibration de l’appareil est indispensable pour obtenir des résultats fiables


3- Calibration et tolérance de masse

Tolérance de masse et CalibrationLa calibration de l’appareil est indispensable pour obtenir des résultats fiables


3- Calibration et tolérance de masse : exemple

700.0 3000.0Mass (m/z)

% In

tens

ity

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100895.4543

2522.3050

2027.1385

1580.7607 2202.0977

2649.1113842.5305 1918.00211564.74432211.0977

822.2776 2050.14371754.92271007.50002632.1079

1516.7597 2358.20521203.3921 2090.1058 2707.4223

1046.5422

2466.1876

1478.7189

Calibration interne : 10-50 ppm


4- Fragmentations peptidiques : MS/MS dans l’espace

Mélange d’ions Sélection d’un ion Apport d’énergie Analyse des fragments

Source Analyseur 1 Analyseur 2Cellule decollision

Q

TOF

IT

Q

TOF

QqQ

QqTOFTOF-TOF

Q-TRAP

Association d’analyseurs(MS/MS dans l’espace)


4- Fragmentations peptidiques : MS/MS dans le temps

IT

FT-ICR

MSn

Associations d’analyseurs pour la MS/MS

MSn

dans le temps

Source Trappe d’ion1) Sélection d’un ion2) Fragmentation3) Analyse des fragments


4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : principe

y1

b2 c2

z1

a2

x1

H

R1 O

CH C NH

R2 O

CH C NH

R3 O

CH C OHNH

b1

y2

R

CHH2N+

b) Ion immonium

c) Ions caractéristiques des chaînes latérales de certains acides aminés (d, v, w)

a) Ions y, b, z, a, c, x

-28 Da (CO)

-17 Da (NH3)

+ H +



y1

b2 c2

z1

a2

x1

H

R1 O

CH C NH

R2 O

CH C NH

R3 O

CH C OHNH

b1

y2

Nature des fragments obtenus dépend de l’instrument utilisé :- fragmentation haute ou basse énergie- fragmentation de peptides mono- ou multi-chargés

a) Ions y, b, z, a, c, x

-28 Da (CO)

-17 Da (NH3)

+ H +



• Sur le groupe –NH2 libre du N-ter• Sur les chaînes latérales des résidus basiques :

Arg > His > Lys• Un H+ peut se déplacer d’une liaison peptidique à l’autre et assister à la fragmentation

En mode positif, localisation de la charge :

La localisation de la charge sur la séquence peptidiqueinfluence les fragmentations MS/MS


4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : interprétation

012345

y8y9y1y1y1y1y1y1

b7b6b5b4b3b2b1

y13 y14y12y11

y10

y9

1°) Fragmentation statistique des peptides

Différences de masse entre ions d’une même série

Série y

N-ter C-ter

2°) Déduction de la séquence d’un peptidepar analyse du spectre de fragmentation


4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : exempleSpectre MS/MS acquis avec une trappe d’ion : ion parent monochargé [M+H]+ à m/z = 637.3

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

389.0249.0

593.2491.1220.9

276.1 619.3

258.1 344.0445.7 536.2463.1

473.0

362.0Leu/Ile Glu Lys

b2

b3

b4

Leu/Ile Phe Thr

y3

y4

y2a2

T F L E Ky4 y3 y2

b2 b3 b4


4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : Leu ou Ile ?

Leucine

COOHCHNHR3

CO w2

CHCH

H ++H

COOHCHH3NR3+

y2NHCOCH

CHCH3H3C

CH2

Perte de 59

Isoleucine

COOHCHNHR3

CO w2a

CHCH

CH3++H

COOHCHH3NR3+

y2NHCOCHCH

CH2CH3H3C

+

COOHCHNHR3

CO w2b

CHCH

CH2CH3 +H

Perte de 45

Perte de 31

Masses identiques = 113,08406

Fragmentation de la chaîne latérale à haute-énergie : MALDI-TOF/TOF

Conclusion

Comprendre les fragmentations peptidiques en MS/MS peut aider à :

• Choisir les analyseurs les plus adaptés

• Valider les interprétations automatiques des logiciels• Interpréter un spectre en s’appuyant sur des ions

diagnostiques (MPT)• Utiliser des modes d’acquisition performants

Nombreux spectromètres de masse utilisés en protéomique

Choix en fonction de l’information recherchée et de la disponibilité !!!


Conclusion

ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles

Fonctions

Stabilité protéique, protection N-terminaleRégulation des interactions protéine-DNA (histones)

Régulation de l’expression des gènes (très courante sur les histones)

Ancre Glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ancrage aux enzymes et récepteurs membanaires….

Régulation des interactions protéines/protéines -/ligandsModifications chimique artéfactuelle (attention !)

Stabilité protéique, blocage de l’extrémité N-terminale

Signal de dégradation

Nature des MPT

Acétylation

Méthylation

« Ancre » GPI

Déamidation

Acide Pyroglutamique

Ubiquitine

Δ Masse (Da)

+42

+14

> 1000

+1

-17

> 1000

Stabilité

Réversible, faible abondance, Activation/inactivation d’activités enzymatiques, Modulation des interactions moléculaires, Processus de signalisation

PhosphorylationpTyrpSer, pThr

+80+80

++++/++

+++

+++

Ancrage membranaire surtoutLocalisation cellulaire, signalisation,

Interactions protéines/protéines

Acylation, acides gras farnésylemyristoylepalmitoyle…etc

+204+210+238

+++++++/++

Excrétion des protéinesReconnaissance cellulaire/signalisationO-GlcNAc, réversible, régulation fonctionnelle

GlycosylationN-glycosylationO-glycosylation

> 800203, > 800

+/+++/++

++

Stabilité des protéines. Interactions protéines-ligandsHydroxyproline +16 +++

Modulation Interactions protéine/protéine, récepteur/ligandSulfatation (sTyr) +80 +

Stabilité protéique, crosslink intra et inter moléculairePont Disulfure -2 ++

+++

+++

+/++

Nitratration des Tyrosines +45 +/++ Oxydation / processus inflammatoire et dégénératifs


Schulenger B. et al JBC 2003; 278; 29; 27251-27255

Protéines mitochondrialesDétection Pro-Q-Diamond

Protéines mitochondrialesDétection SYPRO Ruby

Détection spécifique de MPT : ex. de phosphoprotéines

Phosphoprotéines

Protéines totales


Analyse des MPT par SM

Les modifications post-traductionnelles induisent un changement de masse qui peut-être mesuré par SM

La SM permet de :- détecter des peptides ou protéines modifiées- identifier la nature de la modification- localiser la modification sur l’axe polypeptidique

Différence de masse parfois insuffisante comme preuve (ex: 80 Da, phosphorylation ou sulfatation), besoin de vérifier par d’autres approches biochimiques (immuno-, enzymo-).

La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs


Analyse des MPT par SM

Nécessité de disposer de quantités importantes : beaucoup plus que pour une simple identification !

Nécessité de maximiser la couverture de séquence : difficile

Séparation préalable des protéines et surtout de leurs isoformes (pI, PM)

La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs


Analyse des MPT par SM : problèmes et solutionsLes peptides modifiés sont le plus souvent absents du spectre en raison de :

Phénomène de suppression de signaux (ex: phosphorylation apporte charge négative d’où faible ionisation)

Ions moléculaires portant les MPTs sont souvent instablesIons moléculaires de masses élevées (glycosylation (souvent > 800), ubiquitination (>

1000)…) donc plus difficilement ionisablesMPT n’est que partielle (ex: phosphorylation : seulement 10 à 20 % des protéines)

Solutions :Mise en évidence d’une modification post-traductionnelle

Enrichissement préalable : immunopurification (AC dirigés contre PhosphoTyr, lectinespour glycosylation) ou IMAC (phosphorylation)

Déphosphorylation (phosphatase alcaline) ou déglycosylation (enz. ou chim.) préalableAssociation d’analyseurs => détection d’ions diagnostics (Balayage des ions

précurseurs / recherche de perte de neutre)Détermination du poids moléculaire de la protéine


Analyse des MPT par SM : ex. d’enrichissement sur IMAC

Avec enrichissement

700 1060 1420 1780 2140 2500m/z0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e In

tens

ity (%

)

Trypsin

2211

.14

1959

.95

1751

.57

1735

.58

989.

4910

51.5

4763.

41

1655

.62

1671

.62

852.

39

80P

Peptides phosphorylés

700 1060 1420 1780 2140 25000

20

40

60

80

100

m/z

Rel

ativ

e In

tens

ity (%

)

Trypsin

842.

51 2211

.13

Trypsin

745.

4176

3.41

852.

38 1152

.61

1130

.56

1114

.56

1217

.66

1228

.70

1380

.76

1396

.76

1959

.93

1031

.53

1475

.77

Sans enrichissement


Analyse des MPT par SM : traitement à la phosphatase

Cartographie peptidique massique d’une protéine phosphorylée avant et après traitement à la phosphatase

Limites : Faible ionisation des phosphopeptides

Développemet possible : enrichissement préalable des phosphopeptides par IMAC


Analyse des MPT par SM : ex. de glycoprotéine (peroxydase végétale)

750.0 1400.2 2050.4 2700.6 3350.8Mass (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1 MC[BP = 1362.6, 1521]

1362.6404

803.4354

959.5164

1604.8177

2575.26952212.1033

2663.12921364.6307

2866.2034842.5096

921.4671

1602.8357917.4506

799.4267 2573.28561606.8085 2868.20461346.6504 2226.11671106.5619

961.5180 1171.4930805.4390 1703.88731485.7684 2214.1167 3687.58371970.8586820.2775 986.4692 2661.17802517.12991618.8364 1770.8644 2864.23101186.5292 2198.07151391.6454 1948.0245 3689.61771587.8552 2384.9541 2594.1824 2870.2354

Peptide utilisés pour l’identification

P3 : NGNQTVLVDFDLR 1490.76 P4 : GLIQTDQELFSSPNATDTIPLVR 2515.30

P3 +

P4 +

P3 +

Analyse protéomique

TD : mise en application pratique du cours

Utilisation de Protein Prospector

http://prospector.ucsf.edu/



750 1400 2050 2700 3350 4000Mass (m/z)

0

4488.6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity


941.4915

842.5093

870.5423

2381.2597

2543.2955

1045.57651459.7883

2219.2123

943.4973856.5279 2212.0865

2383.2625844.5172 2705.34101179.6191 2545.30091461.7922877.0610 1136.6461

1606.6609 2488.22892226.09281365.66041047.5722 1791.7341 2707.3438858.5001 3802.85781194.6256 1514.7728 3640.82412403.2201982.4595 2166.15691941.9314 2566.2780 2867.40291793.7478 3800.87893478.80511584.7172 2337.2497 2727.3078

Identification d’une Protéine Riche en Prolines (PRP) At1g28290 par PMF (MALDI-TOF)

4 peptides non modifiés + 2 peptides portant des Hyp

1970 2253 2536 2819 3102Mass (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1 MC=>NR(2.00)[BP = 941.5, 4887]

2543.2920

2705.3312

2706.3315

2542.28902544.2919

2704.3249

2381.2611

2867.37682212.0925

2868.38102707.3368

2380.25622211.0882 2545.29992382.2604

2866.36702213.0905

2869.37312488.22952326.1877

2226.10832487.2252 2708.34092285.1553 2383.2627 2546.2979

2284.1585 3029.41472214.0973 2649.2840 2811.36142231.1883 2870.3960 3030.43012620.25442490.22382220.2165 2752.28232328.1906 2974.40422590.2645 2813.35532458.21642241.1344

2163.1409

P1 + 162 P1 + 2*162

P1 + 3*162 P1 + 4*162 P1 + 5*162

P2 + 162

P2 + 2*162

P2 + 3*162

P2 + 4*162

P2 + 5*162P1

P1 : APVSPPAKPPVKPPVYPPTK m/z = 2163

P2

P2 : APVKPPTKPPVKPPVYPPTK m/z = 2218

jusqu’à 10*162 trouvé pour P2 et 6*162 pour P1 : hétérogénéité naturelle

Mise en évidence d’At1g28290IV- Etude des modifications post-traductionnelles


750 1400 2050 2700 3350 4000Mass (m/z)

0

4488.6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity


941.4915

842.5093

870.5423

2381.2597

2543.2955

1045.57651459.7883

2219.2123

943.4973856.5279 2212.0865

2383.2625844.5172 2705.34101179.6191 2545.30091461.7922877.0610 1136.6461

1606.6609 2488.22892226.09281365.66041047.5722 1791.7341 2707.3438858.5001 3802.85781194.6256 1514.7728 3640.82412403.2201982.4595 2166.15691941.9314 2566.2780 2867.40291793.7478 3800.87893478.80511584.7172 2337.2497 2727.3078

Avant déglycosylation

749.0 1399.2 2049.4 2699.6 3349.8 4000.0Mass (m/z)

6578.6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity


941.4863

842.5046

856.4673

1667.85552219.2446

870.5369

1084.5920

1244.6104 2164.16671512.7992

943.48961172.6184 1459.7924

2221.24781045.5739 1669.85631156.6614850.5033

2487.3306858.4772 1246.61291086.5999 3477.84332166.18951534.7823763.4308 1118.5417 1283.6970 2381.2939963.4855 3479.84991476.7859 1941.9398 2471.34422326.2241

Après déglycosylation HF - disparition des glycopeptides(pertes de 162)

- enrichissement en peptides déglycosylés

Documents

Module BioAnalyse Les Protéines ¾ - genotoul-bioinfo