Molekulárna biológia a jej využitie v laboratórnej diagnostike na OKM

FNsP Skalica a.s.

Kos S., Kóňová L., Vašková M.,

1993

Bakteriológia – Priama diagnostika-kultivácia, mikroskopia, detekcia bakt. Ag

2006

Serológia – Nepriama diagnostika -detekcia prítomnosti protilátok

2011

Molekulárno – biolog. metódy (PCR)

Priama diagnostika-detekcia nukleovej kyseliny

Klinika

Hemokultúty

Infekcie dýchacích ciest

Infekcie urogenitálneho traktu

Črevné infekcie

Baktérie

Vírusy

Parazity

Baktérie (chlamýdie trachomatis)

Vírusy (HPV)

Parazity

Štruktúra OKM FNsP Skalica, a.s.

Štruktúra DNA2 polynukleotidové reťazce tvorené

nukleotidmi

5C monosacharid –pentóza (deoxy – ribóza)

Kys. trihydrogénfosforečná H3PO4

Báza -Purínová (A,G) alebo

Pyrimidínová (C,T)

Neamplifikačné

Amplifikačné

Dôkaz

nukleových kys.

DNA/RNA

Metódy:

Hybridizácia

Kvantitatívne:

RealTime PCR

Kvalitatívne:

PCR, microarray sys.

NEAMPLIFIKAČNÉ

Hybridizácia

Dôkaz DNA/RNA vo vzorke bez

predchádzajúcej amplifikácie

cieľovej /target/ nukleovej kys.

Využíva značené hybridizačné sondy

(DNA/RNA)

SONDA = oligonukleotid, komplementárny k špecifickej (hľadanej) sekvencii NKväzba cez H mostíky

AMPLIFIKAČNÉI. Kvalitatívne (PCR)

II. Kvantitatívne (Real-time PCR)

I. Kvalitatívne

PCR – polymerázová reťazová reakcia

- amplifikácia špecifickej sekvencie DNA (druhovo špecifický úsek)

- vyžaduje predchádzajúcu izoláciu cieľovej DNA zo vzorky

1. Izolácia DNA

2. PCR

-Denaturácia

- Anelácia primerov

- Elongácia

3. Analýza produktu

Izolácia DNA zo vzorky biolog. materiálu

Zdrojom templátovej DNA:

Krv EDTA, BAL, iné telové tekutiny, tkanivo

NEVYHNUTNOSŤ odstrániť porfyrínové zlúč. (hemoglob., hematín) – inhibujú PCR

Pozor na výtery obsahujúce krv!

Cieľ:– získať dostatočné množstvo DNA vo vyhovujúcej kvalite

– Množstvo: od ng – po μg

Reakčná zmes – Master mix

Primery- krátke oligonukleotidy, komplementárne k cieľovej

sekvencii ssDNA - Špecifita reakcie: 20-30 nukleotidov

Nukleotidy- vo forme trifosf. (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

Polymeráza- Taq

Pufor - obsahujúci Mg2+ ióny, pre optim.aktivitu Taq poly

Optimálna konc. Mg2+ 1-2 mmol/l

Princíp PCR

• uvoľnenie H mostíkov ( teplota pri počte G-C párov)

• oddelenie vlákien templátovej DNA 2 ssDNA

1. Denaturácia

teplota 90-95oC

/94oC 1 min., príp. 95oC 30s/

• naviazanie primerov ku komplementárnej sekvencii templátovej ssDNA

2. Anelácia primerov

teplota 40-72oC

/~60oC/

• syntéza nového komplementárneho vlákna od 3´OH konca primera pomocou Taq polymerázypodľa templátovej ssDNA vznikne dsDNA amplikón

3. Elongácia

teplota 60-75oC

/72oC/

1. Denaturácia

2. Anelácia primerov

3. Elongácia

1 východisková ds DNA35 cyklov 236 kópií

PCR prebieha v termocykleri – umožňuje automaticky naprogramovať teplotný režim a počet cyklov

Optimálny počet cyklov závisí od konc. jednotlivých zložiek reakcie, v rozsahu 25-35 cyklov (1-4 hod)

Analýza produktu amplifikácie

Detekcia ELFO (ds amplikóny):

Separácia fragmentov v jednosmernom elekt. poli od – k + podľa ich molekulovej hmotnosti

• Agarózový gél ( Et-Br, UV)

• Polyakrylamidový gél (PAGE) – jemná separácia, umožňuje detekovať rozdiel dĺžky 1 bp, na separáciu malých fragmentov

Fluorescencia

• Využitie v Real-time PCR

Kontaminácie PCR

Separovať priestory pre izoláciu DNA, prípravu PCR a analýzu produktu !

Každý úsek má mať sadu pipiet, ktoré sa neprenášajú

Priestory dekontaminovať UV žiarením

Používať jednorázový spotreb. materiál (rukavice, špičky, mikroskúmavky)

Reagencie deliť na alikvóty, na jedno použite

II. Kvantitatívne amplifikačné metódy

-umožňuje sledovať nárast počtu amplikónov v reálnom čase

- využíva fluorogénne farbivá

- bez potreby postamplifikačnej analýzy

- je možné využiť aj na kvalitatívnu analýzu

Real-Time PCR

OKM FNsP Skalica a.s.

- od novembra 2011 zriadenie PCR laboratória

Vyšetrujeme: od 1.11. 2011Ch. trachomatis – kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCRCh. trachomatis je intracelulárna baktéria, ktorá vyvoláva infekcie urogenitálneho

a reprodukčného systému.

Najčastejšie pohlavne prenášané ochorenie vo vyspelých

krajinách. Ak sa nelieči môže spôsobiť u žien neplodnosť.

Odber výterov – suchý dakrónový tampón

Z materiálu: - urogenitálne a rektálne výtery

- výter hrdla

- výtok z oka

- moč 1. porcia

- sekrét z prostaty

Vyšetrujeme: od 1.1. 2012

HPV – vysokorizikové genotypy

16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59Ľudský papilomavírus (HPV), jeho niektoré

genotypy zvyšujú riziko rakoviny krčka maternice.

1. Z materiálu - cervikálne a uretrálne zoškraby

2. Do transportnej pôdy - dodá laboratórium

3. Simultánna kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR

4. Detekcia produktov reakcie - fluorescenčné farbivá

Princíp:

Amplifikácia špecifického úseku DNA s použitím špecifických

primerov.

Detekcia produktov reakcie – fluorescenčné farbivá, ktoré sa

naviažu na amplifikovaný produkt.

Monitorovanie intenzity fluorescencie počas Real-time PCR

umožňuje detekciu akumulovaného produktu bez nutnosti

otvárania reakčnej skúmavky, čo výrazne znižuje možnosť

kontaminácie.

Aplikácie PCR

Diagnostika pôvodcov infekčných ochorení:

! Vírusy (HPV, HBV, HCV, CMV, HIV, HSV1/2, a.i.)

! Baktérie (Ch. trachomatis , B. burgdorferi, T. pallidum,

M. tuberculosis a.i.)

Huby (P. jiroveci), Parazity

Dôkaz mikroorganizmov v

potravinách

Kriminalistika a súdne lekárstvo(genetické odtlačky,

dôkaz paternity)

Diagnostika geneticky podmienených ochorení (fenylketonúria, cystická fibróza, kosáčikovitá anémia a.i.)

Archeológia: určovanie pohlavia, príbuzenských

vzťahov a.i.

Genetika hospodárskych zvierat a rastlín

Taxonómia

Výhody:

Rýchlosť (cca 3 hodiny)

Detekcia ťažko kultivovateľných patogénov(Ch. trachomatis, vírusy...)

Rýchla detekcia patogénov s dlhou kultivačnou dobou(M. tubeculosis...)

Detekcia patogénov, ktorých vitalita a rastové schopnosti sú obmedzené napr. prebiehajúcou ATB liečbou

Detekcia patogénov prítomných vo veľmi malom množstve

citlivosť, špecificita, spoľahlivosť, využitá ako konfirmačná metóda

Ďakujeme za pozornosť

Tešíme sa na spoluprácu