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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
NANOCÁPSULAS DE POLI--CAPROLACTONA
CONTENDO HALOFANTRINO:
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E
ESTUDO DA CARDIOTOXICIDADE.
Autora: Elaine Amaral Leite
Orientadora: Profa. Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira
Co-Orientadora: Profa. Dra. Andréa Grabe Guimarães
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para a obtenção do
Título de Mestre em Ciências Biológicas, área
de concentração Imunobiologia de Protozoários.
Ouro Preto, fevereiro de 2006
Catalogação: [email protected]
L533n Leite, Elaine Amaral
Nanocápsulas de Poli--caprolactona contendo Halofantrino:
desenvolvimento, caracterização e estudo da cardiotoxicidade
[manuscrito] / \ Elaine Amaral Leite. – 2006.
xxxiii, 140f.: il., color; graf., tabs., mapas.
Orientador: Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira.
Co-orientadora: Prof. Dra. Andréa Grabe Guimarães.
Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
1. Liberação controlada - fármacos - Teses. 2. Nanopartículas –
caracterização - Teses. 3. Malária – Teses. 4. Sistema cardiovascular – efeito
das drogas - Teses. 5. Polímeros na medicina – Teses. I.Universidade Federal
de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas
em Ciências Biológicas. II. Título.
CDU: 593.1
CDU: 669.162.16
Elaine Amaral Leite ii
Trabalho desenvolvido no Laboratório de
Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia e
no Laboratório de Farmacologia Experimental
da Escola de Farmácia da Universidade
Federal de Ouro Preto.
Elaine Amaral Leite iii
Este trabalho contou com a colaboração de:
Prof. Dr. Homero Nogueira Guimarães
Departamento de Engenharia Elétrica, UFMG
Dr. José Mário Carneiro Vilela
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG
Dra. Margareth Spangler de Andrade
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG
Prof. Dr. George Luiz Lins Machado-Coelho
Departamento de Farmácia, UFOP
Dedicatória
Elaine Amaral Leite iv
Dedico esse trabalho:
Aos meus pais, Lázaro e Diná, pelo
apoio constante e amor incondicional.
Ao meu irmão, Leonardo, pelo apoio,
respeito e compreensão em tantos momentos de
ausência.
Elaine Amaral Leite v
“A única limitação real em suas
habilidades está no nível de seus desejos.
Se desejar algo com a força suficiente,
não haverá limites para o que possa conseguir.”
(Brian Tracy)
Agradecimentos
Elaine Amaral Leite vi
AGRADECIMENTOS
Às Professoras:
Vanessa e Andréa
Orgulho-me pela oportunidade que tive de trabalhar com grandes e admiráveis
pessoas. Obrigada pela atenção e presença marcantes no decorrer desse projeto. Durante
todos esses anos de convivência sempre me incentivaram, transmitiram ensinamentos e
sobretudo, concederam-me diversas oportunidades.
Saibam que:
Com simplicidade, me ensinaram a gostar da ciência e acima de tudo a
agir com a ética, a ter senso crítico...
No dia-a-dia, aprendi com vocês a arte de planejar, de coordenar, de
desenvolver o trabalho com persistência e coragem.
Em muitos momentos, quando a falta de confiança persistia, me
incentivaram e fizeram com que eu acreditasse em meu potencial,
ensinando-me que ensinar era possível,
que arriscar muitas vezes valia a pena...
Agradeço de maneira especial pela confiança, por terem me recebido
com respeito e profissionalismo em seus laboratórios, pela amizade, companheirismo,
pelo amor “maternal”, pela compreensão nas horas difíceis, ...
Agradecimentos
Elaine Amaral Leite vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização
desse trabalho, em especial:
Ao Prof. Homero Nogueira Guimarães pela valiosa colaboração, pelas
importantes conversas e ensinamentos transmitidos no decorrer desse trabalho.
Agradeço de maneira especial, pelo desenvolvimento do sistema de aquisição e de
análise de dados.
Ao Prof. George Lins Machado-Coelho pelo grande auxílio nas análises
estatísticas.
À Margareth Spangler pela grande receptividade no Centro Tecnológico de
Minas gerais (CETEC), pela disponibilização dos equipamentos para realização das
análises de microscopia de força atômica.
Ao Vilela, pela execução dos ensaios de MFA, pela convivência e
disponibilidade em ajudar. Suas sugestões, idéias, nossas conversas, o apoio nas
“loucuras” em tentar identificar minhas partículas, muito contribuíram para o
desenvolvimento desse trabalho.
À Prof. Mônica de Oliveira por disponibilizar o laboratório de Tecnologia
Farmacêutica e o Zetasizer para realização das análises de tamanho e medidas de
potencial zeta das partículas.
Às professoras da Escola de Farmácia, pela convivência durante esses anos, pelo
incentivo, apoio e pelas palavras de otimismo em momentos necessários. Em especial, à
Profa. Célia por ter disponibilizado o laboratório de Química Farmacêutica, os
equipamentos e alguns reagentes essenciais para o desenvolvimento inicial desse
trabalho.
Agradecimentos
Elaine Amaral Leite viii
Aos professores Érica Braga e Oscar Romero da UFMG pelo fornecimento dos
parasitas, diferentes espécies de Plasmodium.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pelos
ensinamentos dispensados.
Aos técnicos administrativos da Escola de Farmácia, em especial, ao Wilson
pela responsabilidade em transportar os animais do Biotério Central para a Escola e pela
manutenção e cuidado dispensado com os animais na Escola de Fármacia.
Aos amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UFMG, em especial,
ao Guilherme, pela atenção, amizade e ajuda na execução dos ensaios no Zetasizer.
Aos amigos do Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia:
Cristina, Polly, Carina, Diego e Juliana pela ótima convivência, amizade,
companheirismo, confiança, pela colaboração em algum momento de realização desse
trabalho e pelos bons momentos vividos no dia-a-dia.
Às amigas do Laboratório de Farmacologia Experimental: Luciana, Náira,
Alessandra, Lorena, Suzana, Jóice, Mariana, Patrícia, Priscila, Francielle, Ariane,
Gabriela e Daniele pelo companheirismo, amizade, respeito, ótima convivência e pelas
valiosas contribuições em todos os momentos.
Aos colegas de Pós-graduação, pela amizade e aprendizado.
Às amigas Helen, Ju e Valéria, pela grande amizade, pelo apoio,
companheirismo, pelas horas e horas de conversas, desabafos... e acima de tudo pelos
bons e cômicos momentos vividos. Saudades...
À Cida, pela dedicação e disponibilidade em ajudar sempre que necessário.
Agradecimentos
Elaine Amaral Leite ix
À FAPEMIG, pelo auxílio dispensado para o desenvolvimento desse projeto
(Projeto CDS 217/02).
À Rede NANOBIOTEC pelo apoio financeiro e pelos encontros patrocinados.
A Deus...
Resumo
Elaine Amaral Leite xi
RESUMO
A malária é uma das infecções parasitárias mais importantes do mundo. A
malária severa é uma forma complicada de infecção pelo Plasmodium falciparum onde
administração intravenosa de agentes antimaláricos é necessária. O halofantrino (Hf)
poderia ser uma alternativa para o tratamento da malária porque é um fármaco ativo
contra cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina. Porém, é freqüentemente
associado com o prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma. No presente
trabalho, o Hf base foi associado a carreadores coloidais nanoestruturados, conhecidos
como nanocápsulas (NCs), as quais são constituídas por um núcleo oleoso envolvido
por polímero biodegradável, a poli--caprolactona. O índice de polidispersão e o
diâmetro médio das partículas foram determinados por espectroscopia de correlação de
fótons (PCS) e a medida do potencial zeta por mobilidade eletroforética. A morfologia e
a organização estrutural foram avaliadas pela técnica de microscopia de força atômica
(MFA), buscando analisar e entender possíveis alterações induzidas pela associação do
fármaco a essas nanoestruturas. O principal objetivo desse trabalho foi avaliar as
alterações eletrocardiográficas, principalmente o prolongamento do intervalo QT e as
alterações de pressão arterial, em ratos Wistar sadios ou infectados com Plasmodium
berghei, após a administração i.v. de uma dose única, especialmente alta (100 e
150 mg/kg) de halofantrino associado às nanocápsulas (NC-Hf) ou solução de cloridrato
de halofantrino (Hf.HCl). O diâmetro médio das NCs brancas obtido por MFA variou
de 222 a 550 nm, enquanto o diâmetro médio dessa mesma amostra determinado por
PCS foi de 245 nm. O diâmetro médio das NC-Hf, determinado por MFA, foi
475 153 nm e 309 97 nm para 0,1 e 1,0 mg Hf/mL de suspensão coloidal. A análise
dos dados mostrou que o diâmetro das NCs é muito maior que a altura, apresentando
uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 10. A dose aguda letal (DL100)
observada experimentalmente foi de 200 mg/kg para o grupo que recebeu Hf.HCl
enquanto a DL50 calculada foi 154 mg/kg. A DL100 para NC-Hf foi 300 mg/kg, e os
animais morreram em tempos superiores quando comparados com Hf.HC e a DL50
calculada para NC-Hf foi 249 mg/kg. Foi observado, nos experimentos de avaliação da
cardiotoxicidade a curto prazo, que o Hf induziu um prolongamento dose-dependente
Resumo
Elaine Amaral Leite xii
dos intervalos QT e PR do ECG, porém, este efeito foi significativamente reduzido
(P < 0,001) quando o Hf foi administrado associado às nanocápsulas. O Hf.HCl induziu
uma bradicardia pronunciada, seguida por uma redução contínua da freqüência cardíaca
e hipotensão severa que levaram os animais à morte. Nenhuma alteração nos parâmetros
cardiovasculares foi observada nos animais que receberam as soluções controle: veículo
do Hf livre ou excipientes das NCs em intervalos de tempo e volumes equivalentes. O
Hf associado às NCs reduziu o prolongamento do intervalo QT de 77% e 85%, 5 min
após a administração de 100 e 150 mg/kg, respectivamente. A avaliação a longo prazo
demonstrou aumentos equivalentes para o intervalo QT e QTc quando Hf foi
administrado como NC-Hf na dose de 150 mg/kg comparada com a mesma dose do Hf
livre até 30 minutos, observando uma alteração máxima somente 2 horas depois da
injeção. Entretanto, as NC-Hf induziram uma toxicidade menos pronunciada, uma vez
que todos os animais sobreviveram durante todo o período experimental. Por outro lado,
o Hf.HCl induziu morte em 83% dos animais, 30 min após a administração. Foi
observada alteração do intervalo QT, 24 horas após a administração de NC-Hf a qual
poderia ser atribuída ao Hf acumulado nas células do sistema fagocítico mononuclear. A
avaliação da cardiotoxicidade em ratos infectados com Plasmodium berghei demonstrou
que a NC-Hf induziu variações dos parâmetros cardiovasculares semelhante ao Hf.HCl,
indicando que em animais infectados, as NC estariam disponibilizando o fármaco para
interação com as células cardíacas de maneira semelhante à solução de Hf.HCl. Porém,
em todos os experimentos realizados, em animais sadios ou infectados foi observado
que, provavelmente, a encapsulação do Hf alterou sua distribuição no organismo, pois a
resposta farmacológica foi alterada.
Abstract
Elaine Amaral Leite xiv
ABSTRACT
Malaria is one of the world’s most important parasitic infections. Severe malaria is
one of complicated form of Plasmodium falciparum infection which intravenous
antimalarial drug administration is always necessary. In this case, the halofantrine (Hf)
could be a good alternative for treatment of severe malaria because it is highly active
against drug resistant P. falciparum. However, it is an antimalarial drug frequently
associated with QT interval prolongation in electrocardiogram. In this study, the more
lipophilic Hf free base was entrapped in nanostructured oil-filled colloidal carrier,
named nanocapsules (NCs), composed by biodegradable polymer such as poly--
caprolactone. The polydispersity index of the population and nanoparticles mean size
were determined by photon correlation spectroscopy (PCS) and nanoparticles zeta
potential by electrophoretic mobility. The morphology and structural organization of
NCs were evaluated by atomic force microscopy (AFM) technique, searching to
analysed and understand possible alterations induced by the drug inclusion in these
nanostructures. The main goal of the present work was to assess and evaluate
electrocardiographic and arterial blood pressure changes, particularly QT interval
prolongation, in anaesthetized Wistar rats healthy or rats infected with Plasmodium
berghei, followed by i.v. administration of a single high dose (100 and 150 mg/kg) of
halofantrine base loaded-nanocapsules (Hf-NC) or halofantrine chlorhydrate (Hf.HCl)
solution. The mean diameter for NC unloaded, obtained by AFM, was between 222 and
550 nm, however, the mean diameter of this same sample determined by PCS was
245 nm. The mean diameter of Hf-NC determined by AFM was 475 153 nm and
309 97 nm for 0.1 e 1.0 mg base Hf/mL colloidal suspension. The analysis of the data
showed that the diameter of NC is much larger than their height, with diameter/height
mean ratio around 10. The acute lethal dose (LD100) of Hf.HCl experimentally observed
was 200 mg/kg and the calculated LD50 was 154 mg/kg. In contrast, the LD100 for Hf-
NC was 300 mg/kg with a longer mean time to death than Hf.HCl and the calculated
LD50 was 249 mg/kg for Hf-NC. It was observed, in short term experiments of
cardiotoxicity studies, that Hf caused a dose-dependent prolongation of the QT and PR
intervals of the ECG, however, this effect was significantly (P < 0.001) reduced when
Abstract
Elaine Amaral Leite xv
Hf was administered entrapped in nanocapsules. The treatment with Hf.HCl induced a
pronounced bradycardia, followed by a continuous decrease of heart rate and severe
hypotension leading the animals to death. No changes in any of these parameters were
observed in animals that received Hf solution vehicle and NCs excipients at equivalent
time intervals and volume. Hf associated with NCs reduced the QT prolongation by
77% and 85% at 5 min after the injection of 100 and 150 mg/kg, respectively. The
evaluation of long term showed equivalent increases for the interval QT and QTc when
Hf was administered as Hf-NC (150 mg/kg) compared with the same dose of the free Hf
up to 30 minutes, but the maximum alteration was observed only 2 hours after the
injection. However, the toxicity induced by Hf-NC was less pronounced because all the
animals survived during all experimental period (48 h). On the other hand, the Hf.HCl
provokes death in 83% of the animals, 30 min after administration. It was observed a
alteration of QT interval in 24 hours after the administration of Hf-NC that could be
attributed to the Hf amount accumulated in the cells of mononuclear phagocytic system.
The evaluation of the cardiotoxicity in Plasmodium berghei infected rats demonstrated
that Hf-NC induced variations of the cardiovascular parameters similar to Hf.HCl,
indicating that in infected animals, the Hf associated to the NCs is available for
interaction with the heart cells of the same way that the Hf in solution. However, in all
experiments performed with healthy or parasitized animals, it was observed that
encapsulation of Hf altered its biological response, probably by modulating the
distribution of the drug in the body.
Lista de Figuras
Elaine Amaral Leite xvi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição global da Malária…………………………………………….. 4
Figura 2: Mapas de risco de transmissão da malária na Amazônia Legal…………… 5
Figura 3: Ciclo biológico do Plasmodium…………………………………………… 7
Figura 4: Fórmula estrutural do cloridrato de halofantrino…………………………..10
Figura 5: Figura 5: Registro eletrocardiográfico normal, mostrando todos os seus componentes e
suas respectivas designações (A). Potencial de ação de uma célula miocárdica
ventricular (B) registrado simultaneamente...……….…………………………….…..14
Figura 6: Diagrama mostrando o efeito induzido por um fármaco bloqueador de
canais de potássio na duração do potencial de ação e no eletrocardiograma …...........16
Figura 7: Representação esquemática de nanoesferas com presença da matriz
polimérica, e nanocápsulas, constituídas por um núcleo óleo envolvido por uma
membrana polimérica……............................................................................................20
Figura 8: Representação das condições em uma superfície negativa com uma camada
de íons positivos adsorvidos na camada de Stern.………………………….…………26
Figura 9: Esquema de funcionamento da técnica de MFA, mostrando os componentes
gerais do microscópio e suas respectivas funções…………………….........…………29
Figura 10: Preparação de Halofantrino base livre a partir de Hf.HCl………….…….34
Figura 11: Etapas de Preparação de Nanocápsulas……………………………….….35
Figura 12: Representação esquemática da metodologia para separação do Hf
encapsulado nas NCs do Hf não encapsulado...............................................................38
Figura 13: Sistema de Aquisição de ECG e PA...........................................................41
Figura 14: Espectro na região do UV apresentando o pico de absorção máxima do Hf
em acetonitrila (20 g/mL)............................................................................................52
Figura 15: Curva de Calibração do Hf em acetonitrila em comprimento de onda igual
a 258 nm........................................................................................................................53
Lista de Figuras
Elaine Amaral Leite xvii
Figura 16: Diâmetro das diferentes formulações de NCs obtido por equipamentos
distintos. A a D: Zetasizer 3000 HS; E e F: Nanosizer N4 plus....................................56
Figura 17: Nanocápsulas obtidas como suspensão coloidal de aspecto leitoso, pelo
método de nanoprecipitação..........................................................................................58
Figura 18: Imagens de nanocápsulas não carregadas obtidas por MFA......................59
Figura 19: Imagem topográfica (A) e fase (B) obtidas por MFA e perfil topográfico
(C) de nanocápsulas brancas..........................................................................................61
Figura 20: Imagem de altura (A) e fase (B) de poloxamer188 obtidas por MFA........62
Figura 21: Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de
nanocápsulas brancas de PCL........................................................................................63
Figura 22: Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanoesferas
brancas de PLA..............................................................................................................64
Figura 23: Imagens topográficas (A e B) de nanoemulsão obtidas em diferentes
campos por MFA. .........................................................................................................65
Figura 24: Esquema representativo dos possíveis fenômenos que contribuem para o
aumento do diâmetro das partículas..............................................................................66
Figura 25: Imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas
brancas mostrando diferentes formas: antes (1 e 3) e após (2 e 4) variação da força de
interação sonda-amostra (set point = 0).........................................................................68
Figura 26: Imagem tridimensional de NC contendo 0,1mg de Hf/mL de suspensão
coloidal..........................................................................................................................69
Figura 27: Imagens de nanocápsulas contendo halofantrino 0,1 mg/mL (A) e
1,0 mg/mL (B) mostrando presença de material ao redor das partículas......................71
Figura 28: Dose letal aguda (DL50) determinada após administração i.v. de
halofantrino livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar machos..............75
Figura 29: Traçado do ECG e PA de um rato Wistar, obtido durante o período
controle, apresentando os parâmetros analisados (QT, PR, RR, QRS, PAS e
PAD)..............................................................................................................................76
Lista de Figuras
Elaine Amaral Leite xviii
Figura 30: Registro do ECG e da PA, de animais representativos dos grupos que
receberam 150 mg/kg de Hf.HCl (A) e NC-Hf (B), obtidos antes e após administração
do fármaco.....................................................................................................................77
Figura 31: Cinética de variação do intervalo QT (A) do ECG e do QT corrigido pelo
intervalo RR (QTc) (B) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental sódico,
após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos
(NC branca e DMA/PEG) em volumes correspondentes à dose de 150 mg/kg............81
Figura 32: Cinética de variação do intervalo PR (A) e do complexo QRS (B) de ratos
Wistar machos anestesiados com tiopental sódico, após administração i.v. Hf.HCl e
NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos (NC branca e DMA/PEG) em
volumes correspondentes à dose de 150 mg/kg.............................................................85
Figura 33: Cinética de variação da pressão arterial sistólica (A) e diastólica (B) e da
freqüência cardíaca (C) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental sódico,
após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos
(NC branca e DMA/PEG) em volumes correspondentes à dose de
150 mg/kg......................................................................................................................88
Figura 34: Comparação da porcentagem de variação máxima dos intervalos QT, PR,
QRS e QTc (A), PAS, PAD e FC (B) até 30 min após a administração de 100 ou
150 mg/kg de halofantrino livre e encapsulado, em ratos Wistar machos anestesiados
com tiopental sódico......................................................................................................89
Figura 35: Cinética de variação do intervalo QT de ratos Wistar machos anestesiados
pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de
Hf.HCl (B).....................................................................................................................94
Figura 36: Cinética de variação do intervalo QT corrigido pelo intervalo RR (QTc) de
ratos Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de
NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B).....................................................................95
Figura 37: Cinética de variação do intervalo PR de ratos Wistar machos anestesiados
pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de
Hf.HCl (B).....................................................................................................................96
Figura 38: Cinética de variação do intervalo QRS de ratos Wistar machos
anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou
150 mg/kg de Hf.HCl (B)..............................................................................................97
Lista de Figuras
Elaine Amaral Leite xix
Figura 39: Cinética de variação da pressão arterial sistólica (I) e diastólica (II) de ratos
Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf
(A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B)..................................................................................98
Figura 40: Cinética de variação da freqüência cardíaca de ratos Wistar machos
anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou
150 mg/kg de Hf.HCl (B)............................................................................................100
Figura 41: Curva de parasitemia média (A) e acompanhamento do peso médio (B)
corporal de ratos Wistar macho após imunossupressão com ciclofosfamida e infecção
pelo P. berghei.............................................................................................................106
Figura 42: Cinética de variação do intervalo QT (A) e do QTc (B) de ratos Wistar
machos infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.................................................................................109
Figura 43: Cinética de variação do intervalo PR (A) e QRS (B) de ratos Wistar
machos infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.................................................................................111
Figura 44: Cinética de variação da PAS (A), PAD (B) e da FC (C) de ratos Wistar
machos infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.................................................................................113
Lista de Quadros e Tabelas
Elaine Amaral Leite xx
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Classe e Mecanismo de Ação dos Agentes Antimaláricos………………...8
Quadro 2: Principais antimaláricos associados a sistemas vetorizados e testados in
vivo.……………........................................................................................................... 22
Quadro 3: Padronização dos protocolos de imunossupressão......................................42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores de Absorbância utilizados para a construção da curva de calibração
da solução de Hf em acetonitrila...................................................................................52
Tabela 2: Características físico-químicas de formulações de NC contendo diferentes
concentrações de halofantrino.......................................................................................54
Tabela 3: Alterações comportamentais e morte observadas nos animais tratados com
as diferentes formulações de Halofantrino....................................................................74
Tabela 4: Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e
parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a
administração i.v. de halofantrino livre ou encapsulado...............................................79
Tabela 5: Variação percentual dos parâmetros do ECG e PA 30 min após a
administração de NC-Hf (150 mg/kg) em animais anestesiados pelo tiopental sódico
ou pelo éter etílico.........................................................................................................91
Tabela 6: Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e
parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a
administração i.v. de150 mg/kg de halofantrino encapsulado.......................................93
Tabela 7: Resultados dos protocolos de imunossupressão.........................................105
Tabela 8: Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e
parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a
administração i.v. de100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf em ratos Wistar infectados pelo
P. berghei....................................................................................................................107
Lista de Abreviaturas
Elaine Amaral Leite xxi
LISTA DE ABREVIATURAS
Potencial zeta
Da Dalton
DL100 Dose letal para 100% dos animais
DL50 Dose letal para 50% dos animais
DMA dimetilacetamida
DMT Dose Máxima Tolerada
ECG Eletrocardiograma
HDL Lipoproteína de alta densidade
HERG Human Ether a-go-go Related Gene
Hf Halofantrino base
Hf.HCl Cloridrato de Halofantrino
i.v. intravenosa
ICa Corrente de cálcio
IKr Corrente de potássio
INa Corrente de sódio
Ito Correntes transientes de potássio
LDL Lipoproteínas de baixa densidade
MFA Microscopia de força atômica
NC Nanocápsulas
NC-Hf Nanocápsulas de Halofantrino
PAD Pressão Arterial Diastólica
PAS Pressão Arterial Sistólica
PCL Poli--caprolactona
PCS Espectroscopia de Correlação de Fótons
PEG Polietilenoglicol
PLA Poli(ácido-lático)
PLG Poli(ácido-glicólico)
PLGA Poli(ácido-lático-co-glicólico)
QTc Intervalo QT corrigido pelo intervalo RR
SFM Sistema Fagocítico Mononuclear
Sumário
Elaine Amaral Leite xxii
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS E QUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS
INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
1. INTRODUÇÃO GERAL ..........................................................................................2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................4
2.1. Malária .............................................................................................................4
2.2. Halofantrino ...................................................................................................10
2.3. Eletrofisiologia Cardíaca ................................................................................12
2.4. Cardiotoxicidade de Fármacos ........................................................................17
2.5. Sistemas Nanoestruturados para a Vetorização de Fármacos ...........................19
2.6. Nanocápsulas..................................................................................................23
2.6.1. Características Físico-Químicas das Nanocápsulas.......................................24
2.6.1.1. Distribuição do Tamanho das Nanocápsulas..............................................24
2.6.1.2. Potencial Zeta () das Nanocápsulas .........................................................25
2.6.1.3. Avaliação Morfológica..............................................................................27
3. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO........................................................................30
OBJETIVOS..............................................................................................................31
1. OBJETIVO GERAL................................................................................................32
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................32
MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................33
1. METODOLOGIA DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS .................................34
1.1. Preparação do Halofantrino Base ....................................................................34
1.2. Preparação das Nanocápsulas..........................................................................34
2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOCÁPSULAS .....................36
2.1. Distribuição de Tamanho e Potencial Zeta ......................................................36
2.2. Determinação do Teor de Halofantrino por Espectrofotometria no Ultravioleta36
2.3. Teste da Porcentagem de Encapsulação ..........................................................37
2.4. Análise da Morfologia das Nanocápsulas ........................................................38
3. EXPERIMENTAÇÃO “IN VIVO” .........................................................................39
3.1. Animais Experimentais ...................................................................................39
3.2. Confecção de Cateteres para Implantação Intra-Vascular ................................39
Sumário
Elaine Amaral Leite xxiii
3.3. Procedimentos Cirúrgicos ...............................................................................39
3.4. Obtenção dos Sinais de Eletrocardiograma e Pressão Arterial .........................40
3.5. Preparo das Soluções de Halofantrino para Administração Endovenosa ..........42
3.6. Infecção dos Animais......................................................................................42
3.7. Avaliação da Parasitemia ................................................................................43
3.8. Protocolos Experimentais ...............................................................................44
3.9. Análise dos Registros .....................................................................................46
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................47
5. MATERIAIS...........................................................................................................48
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................................................49
PARTE 1: CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS .......................................50
1. Caracterização Fisico-Química ................................................................................51
2. Análise Morfológica............................................... Erro! Indicador não definido.59
PARTE 2: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A CURTO PRAZO ..............72
1. Determinação da Dose Letal Aguda (DL50) .............................................................73
2. Avaliação da Cardiotoxicidade até 30 minutos após a Administração das Formulações de
Halofantrino ..........................................................................................................75
PARTE 3: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A LONGO PRAZO..............90
PARTE 4: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE EM ANIMAIS INFECTADOS
PELO Plasmodium berghei .................................................................................103
DISCUSSÃO GERAL.............................................................................................115
CONCLUSÃO.........................................................................................................122
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................125
ANEXOS……………………………………………………………………………...136
de
INFECTADOS PELO Plasmodium berghei
..............................................................................................
....
4
3
43
Introdução
Elaine Amaral Leite 2
1. INTRODUÇÃO GERAL
A malária é a infecção parasitária que mais acomete o ser humano, sendo
considerada a segunda causa de mortalidade no mundo, principalmente em países de
clima tropical e subtropical, com índice de mortalidade superior a um milhão de pessoas
por ano (Greenwood et al., 2005). A malária humana é causada por quatro espécies do
parasita do gênero Plasmodium. Altos índices de morbi-mortalidade são detectados em
decorrência da infecção pelo Plasmodium falciparum (Guerin et al., 2002). Essa mesma
espécie é responsável pelo desenvolvimento da forma complicada da malária, conhecida
como malária severa, a qual é caracterizada por falência renal aguda, comprometimento
do sistema cardiovascular, seguida por coma e morte (Warrel et al., 1990). Na malária
severa, observa-se um quadro de anóxia cerebral, a qual é provocada pela adesão dos
eritrócitos parasitados à parede endotelial dos capilares venosos cerebrais gerando
bloqueio da circulação sanguínea nestes vasos (Deitsch & Wellems, 1996). Nesses
casos, a administração intravenosa (i.v.) de um agente antimalárico é necessária e
realizada em ambiente hospitalar.
Estudos anteriores mostraram que muitas cepas de P. falciparum têm
desenvolvido resistência a drogas antimaláricas, principalmente à cloroquina e, em
menor proporção, à quinina. Em populações com multiresistência, uma alternativa para
o tratamento de malária severa poderia ser a administração intravenosa de halofantrino
(Hf), uma vez que o mesmo apresenta ação rápida contra as formas eritrocíticas
sanguíneas do Plasmodium (Bryson & Goa, 1992). Entretanto, o Hf apresenta baixa
biodisponibilidade quando administrado por via oral e tem potencial efeito
arritmogênico, levando ao prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma (ECG),
como demonstrado em humanos (Krishna et al., 1993; Matson et al., 1996; Olivier et
al., 1999; Abernethy et al., 2001) e outros mamíferos (Batey et al., 1997; Lightbown et
al., 2001; Batey & Cooker, 2002). O prolongamento do intervalo QT é um fator preditor
de arritmias cardíacas associado a episódios de torsade de pointes e morte súbita (Tan et
al., 1995). Krishna et al. (1993) demonstraram em ensaios clínicos utilizando uma
preparação de halofantrino livre administrada por i.v em infusão lenta, o aparecimento
de efeitos tóxicos locais e alteração moderada do intervalo QT do eletrocardiograma,
em pacientes com malária aguda e em convalescência.
Introdução
Elaine Amaral Leite 3
Diante disso, estratégias que visam otimizar a ação de medicamentos, já
utilizados no tratamento da malária, tais como o aumento dos índices terapêuticos, por
meio de redução de seus efeitos adversos, precisam ser desenvolvidas. Uma delas
consiste na modificação do perfil de distribuição do fármaco, sem contudo, alterar a
estrutura química da molécula, transportando-a associada a um vetor nanométrico
capsular como, por exemplo, as nanocápsulas (Barratt, 2000). As nanocápsulas (NCs)
apresentam um núcleo oleoso, no qual drogas lipofílicas podem estar dissolvidas ou
dispersas, sendo esse envolvido por um filme de polímero biodegradável. Elas fazem
parte de uma família de dispositivos nanométricos capazes de controlar e modificar a
distribuição de uma substância ativa para locais específicos do corpo, protegendo ao
mesmo tempo, órgãos vitais de efeitos tóxicos (Lasic, 1998). Visando o tratamento da
malária severa, o Hf base livre foi anteriormente encapsulado em NCs (Mosqueira et al.,
2004). Desse modo, uma forma nanodispersa do fármaco insolúvel pode ser obtida em
um meio aquoso e isotônico, adequada para a administração in bolus por via i.v.
Estudos anteriores, utilizando uma formulação semelhante de nanocápsulas de Hf (NC-
Hf) em camundongos, demonstraram melhoria da eficácia do antimalárico com redução
concomitante da toxicidade geral (Mosqueira et al., 2004).
O principal objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar em nosso
laboratório uma formulação de nanocápsulas de poli--caprolactona contendo Hf e
avaliar o eletrocardiograma e a pressão arterial de ratos Wistar machos, normais ou
infectados pelo Plasmodium berghei, após a administração intravenosa de altas doses de
Hf em diferentes formulações: solução de halofantrino livre (Hf.HCl) ou suspensão
coloidal de halofantrino encapsulado em nanocápsulas (NC-Hf).
Introdução
Elaine Amaral Leite 4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. MALÁRIA
Entre as doenças infecciosas, a malária é a segunda causa de mortalidade,
atingindo principalmente países de clima tropical e subtropical (Figura 1). De acordo
com a Organização Mundial de Saúde (OMS, 1999), estima-se que aproximadamente
300 milhões de pessoas são afetadas por malária e o índice de mortalidade da doença
atinge cerca de um milhão de mortes a cada ano. Deste número alarmante, 90% se
concentram na África Tropical e 10% estão distribuídos no Sudeste Asiático, Oceania e
Américas Central e do Sul (OMS, 1999). Depois dos países africanos, Índia e Brasil são
as regiões de mais alta endemicidade no mundo. Nos últimos anos, vários programas de
saúde, como Roll Back Malaria, liderados pela OMS reafirmaram ser esta doença
questão prioritária no mundo, reconhecendo que a sua situação na África ao sul do
Saara deteriorou assustadoramente durante a última década (OMS, 1999).
FIGURA 1- Distribuição global da Malária. Nota do mapa: Este mapa mostra países com
malária endêmica. Em muitos desses países, o risco de malária é limitado em
determinadas áreas.
Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2003.
Ausência de Malária
Países sob risco de Malária
Introdução
Elaine Amaral Leite 5
No Brasil, segundo dados do Programa Nacional de Prevenção e Controle da
Malária (FUNASA, 2005), 99,5% dos casos ocorrem na Amazônia Legal, destacando os
estados do Amazonas, Pará, Maranhão e Rondônia. Isto reflete o declínio sócio-
econômico com conseqüente migração de trabalhadores para minas e projetos agrícolas
no norte do Brasil, expondo a população nestes locais ao maior risco de contrair a
doença. Além disso, observa-se que a migração da população da região amazônica para
outras regiões do Brasil levou ao surgimento de novos focos de transmissão, como por
exemplo, 14 novos focos foram registrados nas últimas décadas no estado de Minas
Gerais.
FIGURA 2 – Mapas de risco de transmissão da malária na Amazônia Legal em 1999 (A) e
2004 (B).
Fonte: FUNASA, 2005 <http://www.portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/bl_malaria_01_2005>.
Atualmente, são conhecidas cerca de 150 espécies causadoras de malária e
dessas, somente quatro espécies infectam o homem: Plasmodium falciparum,
Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale (Greenwood et al.,
2005), os quais apresentam padrões morfológicos distintos em esfregaços sanguíneos,
além de provocar infecções com periodicidade e patogenicidade também distintas.
Estudos sócio-epidemiológicos mostraram que a malária está relacionada à redução da
freqüência à escola e ao declínio da produtividade no trabalho, além de prejudicar o
desenvolvimento intelectual, variando qualitativa e quantitativamente de lugar para
lugar (Fernando et al., 2003).
Incidência Parasitária Anual
Por 1000 habitantes
Estados da Amazônia Legal
Ausência de casos
> 0,1 – 9,9 (baixo risco)
> 9,9 – 49,9 (médio risco)
> 49,9 (alto risco)
A B
Introdução
Elaine Amaral Leite 6
A malária é considerada uma doença sistêmica que provoca alterações na
maioria dos órgãos, variando desde formas benignas até as muito graves e fatais. De
modo geral, o predomínio de casos graves ocorre com o P. falciparum, causador da
malária severa ou cerebral (Winstanley, 2000), cujas formas complicadas são
observadas em pessoas não-imunes, principalmente em crianças menores de cinco anos.
A malária severa é caracterizada por convulsão evoluindo para um quadro de coma em
decorrência da adesão de eritrócitos parasitados na rede capilar periférica (Deitsch &
Wellems, 1996) e requer uma terapia imediata com a administração intravenosa (i.v.) de
antimaláricos com alta atividade parasiticida.
A infecção ocorre através da inoculação de esporozoítos no tecido subcutâneo e
na circulação sanguínea do homem, em decorrência da picada do inseto vetor fêmea
infectado (gênero Anopheles) durante o repasto sanguíneo. Os parasitas migram em
direção ao fígado, por mecanismos ainda não identificados (Krettli & Miller, 2001)
alcançando vários hepatócitos, onde alojam-se, multiplicam-se e transformam-se em
esquizontes teciduais (ciclo exo-eritrocítico). Os esquizontes então se rompem,
liberando milhares de merozoítos, muitos destes são fagocitados pelas células do
sistema fagocítico mononuclear (SFM), enquanto outros chegam à circulação sanguínea
e invadem os eritrócitos. Após o rompimento do esquizonte tissular, em infecções por
P. falciparum e P. malariae, nenhuma forma do parasita permanece no fígado;
entretanto, nas infecções por P. vivax alguns parasitas, chamados hipnozoítas, persistem
e podem produzir recaídas, meses ou anos após a primeira infecção. O desenvolvimento
assexuado, ciclo eritrocítico, é caracterizado pela presença do trofozoíto jovem (em
anel), passando a trofozoíto maduro e finalmente a esquizonte maduro. Os eritrócitos
contendo esquizontes se rompem liberando vários merozoítos, que invadem novas
células sanguíneas dando continuidade ao ciclo até a morte do hospedeiro ou modulação
da infecção através de fármacos ou pela imunidade adquirida. Após algumas gerações
de merozoítos sanguíneos ocorre a diferenciação em estágios sexuados, os gametócitos
masculino e feminino, os quais são ingeridos pelo inseto vetor fêmea durante o repasto
sanguíneo. No intestino do anofelino, ocorre a exflagelação dos gametócitos seguida de
gametogênese e fertilização do gameta feminino, originando o zigoto. Esse por sua vez
fixa-se na parede do intestino e inicia um processo de multiplicação dando origem ao
esporozoíto infectante (Rey, 2001). Todo o ciclo está representado na Figura 3.
Introdução
Elaine Amaral Leite 7
FIGURA 3 – Ciclo biológico do Plasmodium, agente causador da malária. Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2003.
<http://www.cdc.gov/malaria/biology/life_cycle.htm>
A parasitemia é um fator determinante da mortalidade associada à doença.
Durante o processo de invasão, fatores genéticos e idade celular têm papéis importantes
na susceptibilidade do eritrócito à invasão pelo parasita, visto que P. vivax e P. ovale
infectam apenas células jovens, P. malarie infecta apenas eritrócitos maduros, e já o
P. falciparum infecta eritrócitos de qualquer idade, sendo que nesse caso, uma alta
porcentagem de eritrócitos pode tornar-se parasitada, o que resulta em maior
patogenicidade do P. falciparum (Bryson & Goa, 1992). Esse fato implica em doenças
distintas provocadas por cada espécie, o que requer muitas vezes o estabelecimento de
diagnóstico específico e diferencial para o tratamento adequado dos pacientes
(FUNASA, 2001).
Introdução
Elaine Amaral Leite 8
Entre os agentes antimaláricos mais eficazes incluem a cloroquina (Nivaquina®),
quinina (Quinimax®), mefloquina (Lariam
®), artemisinina e seus derivados,
pirimetamina combinada com sulfadoxina (Fansidar®), primaquina e halofantrino
(Halfan®) (Winstanley, 2001), não sendo esse comercializado no Brasil. Estes podem
ser classificados de acordo com o estágio do parasita em que atuam ou com o
mecanismo de ação que apresentam (Quadro 1).
Quadro 1: Classe e Mecanismo de Ação dos Agentes Antimaláricos
Modo de
Ação Classe Sítio de Ação
Anti
met
abóli
tos
1) Sulfonamidas e Sulfonas: sulfadoxina
Esquizonticida sangüíneo de ação lenta.
Inibidores da diidropteroato sintase.
2) Diaminopiridinas: Pirimetamina
Biguanidas: proganil, clorproganil
Ação esporonticida, esquizonticida tecidual e
sangüíneo. Inibidores da diidrofolato
desidrogenase.
3) Hidroxinaftoquinonas: atovaquona
Esquizonticida sangüíneo. Freqüentemente
administrado em associação com o proguanil.
4) 8-Aminoquinoleínas: Primaquina
Ação gametocitocida, apresenta pequena
atividade sobre os outros estágios do ciclo do
parasita
Lis
oss
om
otr
ópic
os
1) Aminoálcoois: quinina,
mefloquina, halofantrino,
lumefantrine (co-artemeter®)
Esquizonticida sangüíneo. Concentram-se nos
vacúolos alimentares ácidos do Plasmodium,
inibindo a atividade enzimática.
2) 4-Aminoquinoleínas: Cloroquina, hidroxicloroquina,
amodiaquina
Esquizonticida sangüíneo de rápida ação.
Alguma esporonticida. Atuam nos vacúolos
digestivos inibindo a atividade enzimática.
3) Lactonas Sesquiterpênicas: artemisinina e derivados (artesunato,
artemeter, arteeter)
Esquizonticida sangüíneo de ação rápida. Atuam
através da liberação de radicais livres nos
vacúolos digestivos.
Fonte: Goodman & Gilman, 2001.
Introdução
Elaine Amaral Leite 9
Em função do grande impacto causado pela malária no mundo, das dificuldades
de obtenção de vacinas 100% eficazes e sendo a quimioterapia o principal meio de
reduzir rapidamente a morbi-mortalidade relacionada à doença (Kremsner & Krishna,
2004), torna-se indispensável que medicamentos adequados para o tratamento estejam
acessíveis à população atingida. No entanto, apesar do arsenal terapêutico existente
hoje, é sabido que nem todas as espécies de plasmódios são igualmente sensíveis aos
fármacos antimaláricos, já existindo relatos, para a malária falciparum, de resistência a
cloroquina, mefloquina, quinina e sulfadoxina-pirimetamina (Wongrsichanalai et al.,
2002; Hastings, 2004). Muitos dos compostos disponíveis tais como cloroquina e
pirimetamina combinada com sulfadoxina são de fácil distribuição e eficazes,
entretanto, devido ao problema da resistência, a sua utilização tem se mostrado
ineficiente (Brockman et al., 2000). O mais preocupante é que em muitas áreas
endêmicas, o P. falciparum apresenta fenótipos de resistência a dois ou mais fármacos
simultaneamente, um fenômeno conhecido como multiresistência à drogas. A
resistência parece ser ocasionada por mutações pontuais em genes codificadores de
transportadores de membrana bem como por mutações em determinadas enzimas
(Wongrsichanalai et al., 2002).
Atualmente, a ausência de um tratamento único e efetivo contra todas as
espécies de plasmódio leva à necessidade de estabelecer um medicamento ou
associações de medicamentos específicos em dosagens adequadas a cada situação em
particular (FUNASA, 2001). Muitas vezes são requeridas altas doses dos fármacos
utilizados, aumentando conseqüentemente o risco de toxicidade.
Segundo Kremsner & Krishna (2004) em função da multiresistência adquirida, a
implementação de estratégias racionais no desenvolvimento de novos fármacos e na
reestruturação de compostos já existentes é necessária, uma vez que a quimioterapia
representa atualmente a alternativa mais eficaz no controle da malária. Em regiões de
multiresistência, portanto, o Hf poderia ser uma alternativa viável para o tratamento da
doença, pois apresenta meia vida longa e alta eficácia. O Hf apresenta características
que o torna um candidato adequado à reestruturação, levando a melhoria de sua
segurança terapêutica.
Introdução
Elaine Amaral Leite 10
2.2. HALOFANTRINO
O cloridrato de halofantrino é um 9-fenantrenometanol, avaliado, na década de
60, pelo Water Reed Institute e desenvolvido comercialmente como Halfan® pela Smith
Kline Beecham (Inglaterra).
Quimicamente, o halofantrino (Figura 4) é o cloridrato de 1,3-dicloro--
[2(dibutilamino)etil]-6-(trifluorometil)-9-fenantrenometanol. Estudos prévios
demonstraram que esse composto é altamente lipofílico e apresenta um coeficiente de
partição octanol/água estimado de 8,5 (Humberstone et al., 1996). Sua solubilidade em
diferentes solventes foi determinada por Babalola et al. (2003), sendo 0,67% p/v em
metanol; 0,4% p/v em octanol e acetonitrila. A solubilidade do halofantrino em água a
50 °C foi menor que 0,02 g/mL sendo praticamente insolúvel em água à temperatura
ambiente e PBS pH 7,4.
FIGURA 4 – Fórmula Estrutural do Cloridrato de Halofantrino. O asterisco(*) determina o
centro quiral.
O halofantrino é um composto quiral, administrado como mistura racêmica e,
segundo Bryson & Goa (1992) seus enantiômeros apresentaram atividade antimalárica
in vitro equivalente contra cepas de P. falciparum multiresistentes. Entretanto, in vivo,
diferenças foram registradas em relação à atividade terapêutica dos enântiomeros devido
à estereoseletividade em concentrações plasmáticas. Em humanos, a concentração
plasmática da forma (+)-Hf é aproximadamente 2-3 vezes maior que a (-)-Hf (Brocks &
Toni, 1999).
Introdução
Elaine Amaral Leite 11
Estudos anteriores mostraram que o Hf sofre metabolização hepática
convertendo-se no produto ativo N-desbutil-halofantrino, sugerindo que parte da
atividade antimalárica ocorre por ação desse metabólito (Bryson & Goa, 1992;
Karbwang & Bangchang, 1994). O Hf atua contra formas eritrocíticas assexuadas,
porém o mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado (Karbwang &
Bangchang, 1994). Acredita-se que, assim como a quinina, a cloroquina e a mefloquina,
o halofantrino interfere no mecanismo de digestão da hemoglobina, formando
complexos tóxicos com o grupo heme (ferriprotoporfirina IX), os quais danificam a
membrana celular causando lise e morte do parasita (Karbwang & Bangchang, 1994).
Entretanto, estudo recente demonstrou que o Hf provoca distúrbios na organização das
bicamadas lipídicas, fato que poderia explicar parcialmente seu mecanismo de ação
(Lim & Go, 1999).
Três formas farmacêuticas para administração oral do Hf estão disponíveis para
uso humano em vários países do mundo: comprimidos, cápsulas e suspensão (Halfan®).
Geralmente, o Hf é bem tolerado e apresenta meia vida de eliminação longa (1,3 a 6,6
dias), possibilitando intervalos maiores de administração e doses menores. No entanto,
apresenta baixa e variável absorção por via oral, o que segundo ter-Kuile et al., (1993)
pode estar associado às falhas observadas na terapêutica após utilização do Hf. Além
disso, foi demonstrado por Brocks & Wasan (2002) que o Hf livre se associa a
lipoproteínas plasmáticas de baixa (LDL) e alta (HDL) densidade, o que pode resultar
em alteração da biodistribuição do fármaco, com conseqüente aumento da toxicidade,
uma vez que o fármaco associado à LDL seria facilmente transportado ao tecido
cardíaco via receptores de LDL.
Algumas características físico-químicas tais como alta lipofilia e baixa
solubilidade em água dificultam a preparação de formulações de Hf para uso parenteral,
necessária ao tratamento das formas severas de malária. Uma única formulação
intravenosa, testada clinicamente em humanos, é apresentada na literatura,
demonstrando vários efeitos adversos, a saber: irritação local severa com aparecimento
de eritemas, provavelmente relacionado à toxicidade dos solventes utilizados na
preparação, bem como efeito arritmogênico, levando inicialmente ao prolongamento do
intervalo QT do eletrocardiograma (ECG) (Krishna et al., 1993).
Introdução
Elaine Amaral Leite 12
Segundo Wesche et al. (2000), o mecanismo de cardiotoxicidade do halofantrino
ocorre através de bloqueio de canais de potássio, os quais são responsáveis pelo início
do processo de repolarização e determinam o intervalo QT do ECG. Esses achados estão
de acordo com resultados obtidos por Tie et al. (2000) que sugerem que o bloqueio dos
canais de potássio HERG (Human Ether a-go-go Related Gene) esteja
predominantemente relacionado à alta afinidade do halofantrino em se ligar aos canais
abertos, inativando-os, com uma pequena contribuição da ligação aos canais fechados
de potássio. O prolongamento do intervalo QT tem sido significantivamente
correlacionado aos níveis plasmáticos do fármaco livre, mais especificamente com o
(+)-Hf, mas não com seu metabólito, N-desbutil-halofantrino (Touze et al., 1996). Essa
diferença na resposta indica que o efeito eletrofisiológico do Hf é, portanto,
estereoespecífico. Além disso, se comparado a outros fármacos potencialmente capazes
de alterar o intervalo QT, o halofantrino é um inibidor pouco potente, uma vez que a
concentração de Hf ou (+)-Hf necessária para bloquear aproximadamente 40% dos
canais de potássio foi 100 vezes maior que a observada para quinidina e terfenadina
(Wesche et al., 2000). Entretanto, o Hf é considerado o mais cardiotóxico dos
antimaláricos utilizados (Touze et al., 2002).
2.3. ELETROFISIOLOGIA CARDÍACA
O eletrocardiograma é um exame importante em clínica médica, de fácil
manuseio, reprodutível e de baixo custo operacional. O ECG convencional pode ser
definido como um registro extracelular das variações do potencial elétrico do músculo
cardíaco em atividade, evento que precede a atividade mecânica cardíaca, obtido por
meio de eletrodos aplicados à superfície corporal.
O potencial de ação cardíaco, caracterizado por sua longa duração, reflete o
perfil de atividade elétrica associado às células excitáveis cardíacas. É o resultado de
correntes iônicas, distintas e ativadas sucessivamente através da passagem de íons de
Na+, Ca
++ e/ou K
+ por estruturas de membrana especializadas tais como bombas iônicas
e canais iônicos voltagem-dependente. Basicamente, o potencial de ação do músculo
cardíaco pode ser dividido em cinco fases distintas (Figura 5).
Introdução
Elaine Amaral Leite 13
A fase 0, ou limiar do potencial de ação, é gerada pelo influxo rápido de íons
Na+ para o interior dos miócitos, através de canais de Na
+ (INa). A fase 2, ou platô do
potencial de ação, é causada essencialmente pela entrada de Ca++
extracelular para o
interior das células cardíacas através de canais de Ca++
tipo L (ICa). As fases 1 e 3
descritas, respectivamente, como o início e o fim do processo de repolarização, são
mediadas pelo efluxo de íons K+ para o exterior da célula através da abertura de vários e
distintos canais de K+. A corrente transiente (Ito), presente em grande densidade no rato,
apresenta um componente ativado por despolarização e inativação dependente de
voltagem e de tempo, e contribui para o fim do limiar de ação, causando o início do
processo de repolarização (fase 1). Canais de K+ distintos contribuem para a fase 3 ou
fase final da repolarização, apresentando papel fundamental na determinação da duração
do potencial de ação, sendo IKr , corrente retardada de efluxo de ativação rápida, a
principal responsável pela condução adequada em condições de variações de freqüência
cardíaca. Por fim, os canais IK1 têm um papel predominante na etapa final do processo
de repolarização (fase 4) em muitas espécies, sendo responsáveis pela manutenção desse
estágio. Todas as correntes descritas para o potencial de ação ventricular em humanos
estão também presentes nos átrios, embora sua distribuição e amplitude sejam
características específicas para cada tecido. A forma e a duração do potencial de ação
cardíaco, também são específicas para cada espécie animal, refletindo diferenças no
tipo, estrutura e distribuição celular (Crumb & Cavero, 1999; Silva, 1999).
A ativação ou despolarização cardíaca, em condições normais, tem origem no
nódulo sinusal, região do marcapasso cardíaco, localizado no átrio direito, sendo esta a
primeira área do coração a se despolarizar. O estímulo alcança em seguida o átrio
esquerdo, o nódulo atrioventricular, o feixe de His e seus ramos, a rede de Purkinje, os
ventrículos e, por fim, se extingue. Durante o ciclo cardíaco, eventos elétricos são
originados na despolarização e repolarização, em função do potencial de ação de células
cardíacas descrito acima, e suas alterações assumem um aspecto característico,
composto de inúmeras deflexões que oscilam acima e abaixo da linha de base (nível
isoelétrico) podendo ser registradas. O estudo minucioso e a análise detalhada das
ondas, dos intervalos e dos segmentos formam a base para a interpretação do
eletrocardiograma normal, em doenças cardiovasculares e em condições extracardíacas
Introdução
Elaine Amaral Leite 14
que modificam seu traçado. A figura 5 apresenta os elementos de um eletrocardiograma
em condições de normalidade ou em ritmo sinusal.
FIGURA 5 – Registro eletrocardiográfico normal, mostrando todos os seus componentes e
suas respectivas designações (A). Potencial de ação de uma célula miocárdica
ventricular (B) registrado simultaneamente.
Fonte: Adaptação de Tan et al., 1995, p.702.
A onda P representa a ativação elétrica dos átrios ou despolarização atrial,
apresentando-se como uma onda arredondada, simétrica e de pequena amplitude. A
ausência de onda P caracteriza a ocorrência de arritmias, como, por exemplo, bloqueio
do ritmo juncional.
Fase 0
Fase 4
Fase 1 Fase 2
Fase 3
Introdução
Elaine Amaral Leite 15
O intervalo RR é o intervalo entre duas ondas R consecutivas e permite
determinar o ritmo cardíaco.
O intervalo PR representa o tempo entre o início da despolarização atrial,
passando pela condução do impulso através do nódulo atrioventricular, potencial não
detectado em derivações periféricas, e o início da despolarização ventricular. É o
intervalo de tempo entre o início da onda P e o início do complexo QRS. Em geral, esse
intervalo diminui com o aumento da freqüência cardíaca, aumentando com a diminuição
da freqüência. O prolongamento desse parâmetro sugere bloqueio atrioventricular.
O complexo QRS representa a despolarização ventricular, processo contínuo,
mas possível de ser dividido em momentos ou fases arbitrárias, de acordo com os
pontos atingidos pela seqüência de ativação ventricular: septo, ápice direito, ápice
esquerdo e paredes livres e finalmente as bases dos ventrículos. Alterações do QRS são
geralmente associadas a hipertrofias ventriculares e bloqueio de ramo.
O segmento ST é o intervalo de registro isoelétrico que acompanha a fase de
platô após o término da despolarização ventricular.
A onda T representa a repolarização ventricular.
O intervalo QT representa o tempo necessário para despolarização e
repolarização dos ventrículos. É o intervalo medido entre o início do QRS e o final da
onda T. O prolongamento do intervalo QT pode ser classificado como hereditário ou
adquirido, ambos associados a um tipo característico de taquicardia ventricular
polimórfica conhecida como torsade de pointes. A forma hereditária parece ocorrer
como conseqüência de alterações genéticas nos canais iônicos ou resultar de uma
resposta anormal à estimulação simpática ou adrenérgica; enquanto a forma adquirida
pode ser causada por vários fármacos ou condições que reduzam a atividade das
correntes de K+ no processo de repolarização ou aumentem o influxo de íons Na
+ ou
Ca++
durante o processo de despolarização (Tan et al., 1995).
O prolongamento do intervalo QT do ECG é um fator preditor de arritmias
cardíacas e morte súbita (Tan et al., 1995). Vários estudos têm sugerido que fármacos
potencialmente capazes de induzir alterações no intervalo QT do ECG podem ser
conseqüentemente pro-arrítmicos, levando à taquiarritmia ventricular fatal, conhecida
como torsade de pointes (Shah, 2002). A causa mais provável do torsade de pointes
está relacionada à ação direta dos medicamentos sobre o bloqueio de canais de potássio
Introdução
Elaine Amaral Leite 16
ou sua interação com outros fármacos (Al-Khatib et al., 2003). A figura 6 mostra o
efeito de fármacos bloqueadores de canais de K+
na duração do potencial de ação
cardíaco e no eletrocardiograma.
FIGURA 6 – Diagrama mostrando o efeito induzido por um fármaco bloqueador de canais de
potássio (B) na duração do potencial de ação e no eletrocardiograma. Este
fármaco pode produzir prolongamento do potencial de ação, prolongamento do
intervalo QT e torsades de pointes.
Fonte: Crumb & Cavero, 1999, p.273.
Alterações do intervalo QT foram inicialmente observadas como efeito adverso
da quinidina e estudos prévios relacionando os efeitos cardiotóxicos de agentes
antimaláricos consideraram medidas do intervalo QT do ECG como um importante
marcador para a avaliação de fatores e condições clínicas que predispõem à ocorrência
de toxicidade. Entre os antimaláricos que agem diretamente bloqueando os canais de
potássio encontra-se o halofantrino, objeto de estudo do nosso trabalho. Como
Bloqueador de Canais
de K+
Prolongamento da Duração do
Potencial de Ação (DPA)
Extracelular
Intracelular
Prolongamento do
Intervalo QT
Intervalo QT Intervalo QT
Torsades de pointes
Bloqueador de Canais
de K+
Prolongamento da Duração do
Potencial de Ação (DPA)
Extracelular
Intracelular
Prolongamento do
Intervalo QT
Intervalo QT Intervalo QT
Torsades de pointes
Introdução
Elaine Amaral Leite 17
mencionado anteriormente, Wesche et al. (2000) demonstraram que o Hf bloqueia
canais IK em miócitos isolados de felino, indicando que esse fármaco é similar aos
antiarrítmicos pertencentes à classe III em sua capacidade de prolongar a repolarização
de maneira dose-dependente. A freqüência de prolongamento do intervalo de QT varia
com a classe de fármacos, sendo predominantemente mais alta com os antiarrítmicos da
classe III. Entretanto, para fármacos não-cardíacos, a freqüência é desconhecida,
podendo variar de 1:100 pessoas para o halofantrino à 1:50.000 para terfenadina,
dependendo das circunstâncias clínicas (Shah, 2002).
2.4. CARDIOTOXICIDADE DE FÁRMACOS
A cardiotoxicidade pode ser caracterizada pela presença de um ou mais fatores
tais como hipertensão arterial, cardiomiopatia, bradiarritmia, além do prolongamento do
intervalo QT do ECG (Youssef & Links, 2005). Efeitos cardiotóxicos são comumente
descritos após a utilização de agentes quimioterápicos (Youssef & Links, 2005; Guerra
et al., 2005; Yeh et al., 2004), antipsicóticos (Testai et al., 2004; Brown et al., 2004,
Harrigan et al., 2004), antidepressivos (Pohl et al., 2003), antiarrítmicos (Lin et al.,
2005), antifúngicos (Owens, 2004) dentre outros. Além disso, efeitos adversos
cardíacos têm sido reportados com fármacos utilizados no tratamento de malária
falciparum tais como cloroquina (Bakshi et al., 2000), quinina (Martin et al., 1997),
mefloquina (Fonteyne et al., 1996; Cooker et al., 2000; Touze et al., 2002) e Hf
(Krishna et al., 1993). Estudos clínicos têm relatado a ocorrência de arritmia ventricular
severa e morte súbita em pacientes tratados com Hf associado à alterações do intervalo
QT (Nosten et al., 1993; Gundersen et al., 1997). Pacientes tratados com Hf após falha
terapêutica da mefloquina apresentaram alterações mais significativas do ECG
comparados àqueles que receberam o fármaco como tratamento primário (Nosten et al.,
1993).
A avaliação da cardiotoxicidade por análise de alterações do ECG está bem
documentada na literatura. Estudos pré-clínicos de fármacos foram realizados através da
análise in vivo em diferentes modelos animais incluindo cães, guinea-pig, coelhos e
ratos, dentre outros (Park et al., 2005; Batey et al., 1997; Batey & Coker, 2002;
Demirag et al., 2005). Segundo revisão feita por Crumb & Cavero (1999) tais análises
Introdução
Elaine Amaral Leite 18
incluem medidas de freqüência cardíaca, pressão arterial e análise detalhada do ECG.
Estudos in vitro utilizando fibras de Purkinje ou músculos papilares cardíacos de
espécies como, coelho, guinea-pig e cão são considerados adequados, uma vez que as
correntes iônicas responsáveis pelo potencial de ação dessas estruturas se assemelham
ao ser humano.
Dados da literatura relatam o estudo da cardiotoxicidade do halofantrino tanto
em modelos in vivo como em modelos in vitro. Batey et al. (1997) avaliaram o efeito do
halofantrino in vivo e in vitro em guinea-pigs anestesiados através de análise do ECG.
Esses autores verificaram a capacidade do Hf em prolongar o QTc in vivo sem alterar o
período refratário, sugerindo que, provavelmente, os efeitos in vivo do Hf na
repolarização cardíaca, são indiretos, uma vez que nenhuma alteração in vitro foi
observada. Batey & Coker (2002), utilizando coelhos machos, demonstraram pela
primeira vez no modelo in vivo, que o halofantrino pode causar torsade de pointes.
Segundo tais autores, há uma correlação entre os efeitos do Hf nos IKr in vivo e os
efeitos adversos cardíacos observados em humanos, sendo também verificado aumento
do intervalo QT e redução da freqüência cardíaca após administração do Hf. Além
desses, o estudo de avaliação do mecanismo de cardiotoxicidade do halofantrino
descrito por Wesche et al. (2000) foi conduzido in vitro em miócitos de felino. Os
autores utilizaram esse modelo com o objetivo de verificar se o Hf era o principal
responsável pelo prolongamento do intervalo QT ou se esse efeito poderia ser
decorrente de seu metabólito ativo. Foi demonstrado ainda que o Hf prolongou o
intervalo QT de maneira dose-dependente, quando altas concentrações do fármaco
foram avaliadas. Por outro lado, o N-desbutilhalofantrino provocou um efeito mínimo
no intervalo QT. Entretanto, a cardiotoxicidade do halofantrino avaliada no modelo rato
foi realizada pela primeira vez no presente trabalho.
Considerando-se a atividade do halofantrino no tratamento de casos de malária
resistentes à cloroquina e também objetivando-se reduzir os efeitos adversos do Hf, é
possível vislumbrar que uma formulação vetorizada capaz de reduzir a associação do
fármaco livre com o tecido cardíaco seja potencialmente interessante, visto que a
mesma poderia aumentar o tempo de residência do fármaco no compartimento
intravascular aumentando o contato com as hemácias infectadas pelo parasita.
Introdução
Elaine Amaral Leite 19
2.5. SISTEMAS NANOESTRUTURADOS PARA A VETORIZAÇÃO DE
FÁRMACOS
A pesquisa científica que busca o direcionamento de fármacos especificamente
para o seu alvo de ação é realizada há algumas décadas. Entretanto, a chamada
vetorização de fármacos que consiste na associação de moléculas a vetores sintéticos
específicos, permite que as propriedades físico-químicas da molécula sejam mascaradas
e que as propriedades do vetor sejam então predominantes na determinação da
distribuição do fármaco pelo organismo.
A utilização clínica de alguns agentes terapêuticos pode ser restrita em função de
suas propriedades físico-químicas, bem como, de seus efeitos colaterais. Sabe-se que a
resposta farmacológica está diretamente relacionada à concentração do fármaco no sítio
de ação desejado. No entanto, a distribuição dos princípios ativos no organismo é,
essencialmente, determinada por suas características físico-químicas. O fármaco livre
por sua vez é, geralmente, distribuído indistintamente, entre as diversas células, tecidos
ou órgãos do corpo, levando ao aparecimento de inúmeros efeitos adversos nos locais
outros que não o sítio de ação desejado (Couvreur et al., 2002). Isto tem incentivado o
desenvolvimento de diferentes estratégias capazes de otimizar a ação do fármaco como,
por exemplo, modificar sua distribuição, através de sua associação a sistemas
carreadores. Estes sistemas podem ser classificados em microparticulados quando
possuem diâmetro superior a 1 m ou nanoparticulados se apresentarem diâmetro na
ordem nanométrica (entre 10 a 1000 nm) (Couvreur et al., 2002). Dentre os principais
sistemas nanoestruturados encontram-se os lipossomas e as nanopartículas
(nanocápsulas e nanoesferas).
Segundo revisão feita por Schaffazick et al. (2003), as nanopartículas,
constituídas de polímeros biodegradáveis, têm atraído grande atenção dos pesquisadores
em função de suas potencialidades como vetores, por serem mais estáveis nos fluidos
biológicos e durante o armazenamento. Diferem entre si, segundo a composição e
organização estrutural (Figura 7), podendo se dividir entre matriciais dotadas de uma
matriz polimérica (nanoesfera) ou reservatórios no qual um núcleo oleoso é envolvido
por uma membrana polimérica (nanocápsula) (Kreuter, 1994), ambos suspensos
coloidalmente em meio externo aquoso.
Introdução
Elaine Amaral Leite 20
FIGURA 7 – Representação esquemática de nanoesferas com presença da matriz polimérica,
e nanocápsulas, constituídas por um núcleo óleo envolvido por uma membrana
polimérica.
O desenvolvimento dos nanossistemas poliméricos tem visado diversas
aplicações terapêuticas, sendo planejados principalmente para a administração
parenteral (intravenosa, subcutânea ou intramuscular), oral ou oftálmica. As possíveis
vantagens terapêuticas dos carreadores coloidais dependem de sua distribuição no
organismo (Barratt, 2000). De modo geral, pode-se dizer que as principais vantagens
dos sistemas nanoestruturados são: redução das dosagens empregadas, bem como da
freqüência de administração, aumento do índice terapêutico de fármacos muito tóxicos,
redução da toxicidade geral, proteção do fármaco contra inativação química ou
enzimática e direcionamento para o alvo de ação.
Os polímeros utilizados na encapsulação consistem geralmente de materiais
biocompatíveis e biodegradáveis, os quais são degradados in vivo em fragmentos
menores, facilmente excretados pelo organismo, ou mesmo em metabólitos naturais do
organismo. Podem ser de origem natural, semi-sintética ou, mais comumente, sintética,
destacando-se os poliésteres como poli--caprolactona (PCL), poli(ácido-lático) (PLA),
poli(ácido glicólico) (PLG) e seus co-polímeros (Laurencin & Elgendy, 1994).
Tensioativos de superfície
Polímeros
Tensioativos para dispersãode fases oleosas
nanoesferas nanocápsulas
Núcleo Oleoso
Tensioativos de superfície
Polímeros
Tensioativos para dispersãode fases oleosas
nanoesferas nanocápsulas
Núcleo Oleoso
Introdução
Elaine Amaral Leite 21
Estudos recentes, realizados em modelos animais, têm demonstrado a utilização
de vetores coloidais como carreadores de fármacos antimaláricos para o tratamento de
malária (Quadro 2) e de vacinas. Chimanuka et al. (2002) prepararam lipossomas
contendo arteméter, apresentando 100% de eficiência de encapsulação e 100% de
eficácia no tratamento de camundongos infectados pelo Plasmodium chabaudi
chabaudi. Mosqueira et al. (2004) avaliaram a eficácia e farmacocinética do
halofantrino encapsulado em diferentes tipos de nanocápsulas em camundongos
infectados pelo Plasmodium berghei, demonstrando que a atividade das NCs foi similar
ou maior quando comparada ao fármaco livre administrado como solução.
Um vetor escolhido deve permitir a encapsulação de altas concentrações do
fármaco como também permitir que o princípio ativo seja liberado de forma controlada
em condições fisiológicas. As nanocápsulas foram os vetores utilizados na realização do
presente estudo uma vez que as características do fármaco (alta lipofilia, log P = 8,5) e
alta solubilidade em óleos (Mosqueira, 2000a) favorecem sua encapsulação no núcleo
oleoso, objetivando-se um alto rendimento de encapsulação nas nanocápsulas. Além
disso, Mosqueira et al. (2004) demonstraram que em camundongos infectados pelo
Plasmodium berghei o perfil farmacocinético é semelhante para NC convencionais e
furtivas. Esses autores sugerem que o SFM, em animais infectados, é saturado pela
captura dos eritrócitos parasitados e provavelmente as NC convencionais e furtivas
passariam a ter um comportamento similar em termos de permanência na corrente
circulatória.
Introdução
Elaine Amaral Leite 22
Quadro 2: Principais antimaláricos associados a sistemas vetorizados e testados in vivo.
Fármaco Vetor Eficácia Referência
Sulfato de
Quinina
Microesferas Eficácia inferior ao fármaco livre, após
administração subcutânea, em
camundongos infectados pelo P. berghei.
Pimentel, 2004
Halofantrino Nanocápsulas Atividade antimalárica semelhante ou
superior ao fármaco livre. Estudo
realizado após a administração de dose
única em animais severamente infectados
pelo P. berghei.
Mosqueira et al.,
2004
Arteméter Lipossomas Eficácia superior ao fármaco livre com
100% de cura dos animais infectados
com Plasmodium chabaudi chabaudi
Chimanuka et al.,
2002
Arteeter Lipossomas Aumento da biodisponibilidade (97,91%)
do arteeter comparado com a suspensão
(31,38%) após administração oral em
coelhos. Aumento do tempo de meia vida
após administração i.v. do arteeter
encapsulado em relação aos outros
derivados de artemisinina.
Bayomi et al., 1998
Cloroquina Lipossomas
modificados
por anticorpos
anti-eritrócitos
Cura de 75-90% dos animais infectados
pelo P. berghei resistente a cloroquina,
utilizando doses baixas do fármaco
(5 mg/kg).
Owais et al., 1995
Primaquina Nanoesferas Aumento do tempo de sobrevida de
camundongos infectados pelo P. berghei
se comparado ao fármaco livre.
Mbela et al., 1992
Pirimetamina Microesferas Atividade terapêutica não foi adequada
para tratamentos por períodos
prolongados.
Tsakala et al., 1990
Cloroquina Lipossomas Aumento na eficácia terapêutica e
profilática com 100% de eficácia
avaliada em camundongos infectados
pelo P. berghei após administração de
dose única de cloroquina encapsulada.
Peeters et al., 1989
Primaquina Lipossomas Aumento do tempo de meia vida da
primaquina em lipossomas comparado ao
fármaco livre, após administração i.v
Pirson et al., 1982
Introdução
Elaine Amaral Leite 23
2.6. NANOCÁPSULAS
As nanocápsulas são nanopartículas poliméricas caracterizadas como
reservatórios vesiculares constituídos por uma parede polimérica que envolve uma
cavidade preenchida com óleo ou emulsão, na qual o princípio ativo encontra-se
disperso (Kreuter, 1994). NCs são carreadores de escolha para a administração
intravenosa de fármacos altamente lipofílicos, pois são constituídas por polímeros
estáveis, com baixa toxicidade e capacidade de degradação no organismo. Consideradas
vetores de segunda geração, as NCs possibilitam a aplicação sistêmica de injeções
intravenosas in bolus, sem diluição prévia, direcionando o fármaco de forma passiva
para células definidas do organismo.
Podem ser classificadas como convencionais ou furtivas. As NCs convencionais
concentram os fármacos encapsulados nos órgãos e células do sistema fagocítico
mononuclear (Juliano, 1988). Por outro lado, as NCs furtivas ou com a superfície
modificada, representam um tipo especial de partículas com cadeias de polietilenoglicol
(PEG) ligadas covalentemente à superfície. Essa modificação permite que as partículas,
quando injetadas por via i.v., escapem do reconhecimento e da captura rápida pelas
células do SFM, (Gref et al., 1994), prolongando assim o tempo de circulação sangüínea
e liberando lentamente, no compartimento plasmático, os princípios ativos encapsulados
no seu interior (Mosqueira et al., 1999). As NCs, em especial, as furtivas são
potencialmente capazes de restringir a captação de fármacos por certos tecidos ou
órgãos que apresentam epitélios endoteliais contínuos, como o coração e os rins,
preservando-os da toxicidade do princípio ativo.
Segundo revisão feita por Schaffazick et al. (2003), existem vários métodos para
preparação de nanopartículas poliméricas, que podem ser divididos em duas classes
principais: a primeira engloba a maioria dos métodos, os quais são baseados em reação
de polimerização, enquanto a segunda baseia-se na deposição interfacial de polímeros
pré-formados, sendo também conhecida como nanoprecipitação (Fessi et al., 1989).
As formulações do presente estudo foram preparadas pelo método de
nanoprecipitação, visto que é uma técnica de simples execução e facilmente
transponível para a escala industrial. Esse método é baseado na precipitação e formação,
cineticamente controlada, de vesículas de tamanho coloidal constituídas por uma fase
Introdução
Elaine Amaral Leite 24
oleosa na qual o fármaco encontra-se disperso e revestida por uma camada polimérica
em um ambiente externo aquoso. A técnica consiste na mistura de uma fase orgânica
(contendo um solvente orgânico, óleo, tensioativo hidrofóbico e polímeros insolúveis no
óleo e na água) miscível em uma fase aquosa (contendo tensioativos hidrofílicos). Após
a mistura da fase orgânica com a fase aquosa, o polímero precipita na interface pela
redução da sua solubilidade na mistura de solventes, sendo que a difusão mútua dos
solventes fornece uma energia favorável para formação de nanogotas de óleo que
servem como núcleo para a precipitação do polímero. Observa-se, imediatamente, o
surgimento de uma suspensão leitosa, com elevada opalescência, resultado da formação
das nanocápsulas. Em seguida, o solvente é removido sob pressão reduzida e a
suspensão concentrada através da evaporação da água (Fessi et al., 1989). Os polímeros
mais utilizados para a preparação de NCs por esse método são os poliésteres
biodegradáveis, PLA, PLGA e PCL.
2.6.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DAS NANOCÁPSULAS
Em função de sua natureza coloidal e da complexidade de constituintes que
compõem as formulações de nanocápsulas, a caracterização dessas nanoestruturas é
tecnicamente complexa de ser realizada. Geralmente, a avaliação físico-química
envolve: análise morfológica, distribuição do tamanho das partículas, determinação do
potencial zeta () ou carga superficial das partículas, determinação do pH, determinação
da concentração de fármaco associado às nanopartículas e cinética de liberação do
fármaco a partir das nanocápsulas (Legrand et al., 1999; Schaffazick et al., 2003).
2.6.1.1. DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DAS NANOCÁPSULAS
A distribuição do diâmetro das partículas é uma das mais importantes
características físico-químicas das suspensões coloidais, uma vez que a tendência à
sedimentação das partículas contendo o fármaco bem como estudos de sua estabilidade
podem ser monitorados através de mudanças na distribuição de diâmetro das partículas
(Magenheim & Benita, 1991). Além disso, essa característica é de extrema importância
para a definição do perfil de distribuição e das interações das nanoestruturas com as
células do SFM após administração i.v. (Barratt, 2000).
Introdução
Elaine Amaral Leite 25
Geralmente, o diâmetro das NCs preparadas pela técnica de nanoprecipitação
varia entre 100 e 500 nm, sendo influenciado por diversos fatores tais como: natureza e
concentração do polímero e do fármaco, concentração de surfactantes, proporção entre
solvente e água, concentração do óleo, além da velocidade de difusão da fase orgânica
na aquosa (Legrand et al., 1999; Mosqueira et al., 2000 b; Schaffazick et al., 2003).
Os métodos mais comumente utilizados para determinar a distribuição de
tamanho e o índice de polidispersão das amostras são espectroscopia de correlação de
fótons (PCS), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de
varredura (MEV), sendo que as últimas permitem analisar a morfologia das
nanoestruturas (Legrand et al., 1999). Recentemente, a microscopia de força atômica
(MFA) também vem sendo utilizada para determinação de tamanho e estudo da
morfologia das nanopartículas.
No presente trabalho, a técnica utilizada para avaliar a distribuição de tamanho
foi a PCS e a MFA. A técnica de PCS baseia-se na análise do movimento browniano
das partículas, ou seja, na capacidade de deslocamento constante das partículas
presentes num determinado sistema fazendo com que a intensidade da luz espalhada por
elas forme um padrão de movimento. Através da dispersão da luz torna-se possível
determinar o diâmetro médio das partículas. Portanto, a adsorção de tensioativos e a
camada de hidratação móvel podem afetar o diâmetro das nanopartículas, o qual é
determinado como raio hidrodinâmico.
2.6.1.2. POTENCIAL ZETA () DAS NANOCÁPSULAS
A medida de potencial zeta é o método mais utilizado para estimar a carga
superficial de nanocápsulas (Washington, 1996). O potencial pode ser definido como
o potencial existente na fronteira entre um partícula individual e seus íons associados,
ou seja, no plano de cisalhamento (Figura 8). Esse parâmetro reflete, portanto, o
potencial de superfície das partículas, o qual é influenciado por mudanças na interface
com o meio externo, decorrente da dissociação de grupos funcionais presentes na
superfície ou da adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão (Florence &
Attwood, 2003). Forças repulsivas entre as partículas são originadas devido à interação
de duplas camadas elétricas nas partículas adjacentes. Pode-se, portanto, determinar a
Introdução
Elaine Amaral Leite 26
grandeza da carga elétrica através de medidas de mobilidade eletroforética das
partículas submetidas à aplicação de um campo elétrico.
FIGURA 8 – Representação das condições em uma superfície negativa com uma camada de
íons positivos adsorvidos na camada de Stern. São apresentados o potencial de
superfície 0 e o potencial na camada de Stern .. No plano de cisalhamento é
localizado o potencial zeta, Fonte: Florence & Attwood, 2003, p.352.
As lecitinas, o poloxamer e os polímeros são os principais componentes que
podem afetar o potencial , por estarem envolvidos na formação da cápsula e adsorvidos
a ela. Enquanto polímeros e lecitinas favorecem uma carga negativa na interface, o
poloxamer, um surfactante não-iônico tende a reduzir, em valor absoluto, o potencial
(Legrand et al., 1999). Como descrito por Benita & Levy (1993) é possível modular o
Introdução
Elaine Amaral Leite 27
potencial pela escolha de lecitinas com diferentes graus de pureza, uma vez que a
carga negativa é decorrente da presença de determinados tipos de fosfolípides.
Legrand et al., (1999) afirmam que formulações constituídas por partículas com
altos valores de potencial zeta (acima de 30 mV) apresentam maior estabilidade, visto
que grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação entre as partículas. O
potencial de superfície também pode influenciar a resposta biológica do fármaco,
portanto, após a administração i.v., as partículas convencionais são rapidamente
capturadas pelas células do SFM quando o diâmetro e a carga superficial são
aumentados (Juliano, 1988).
Além disso, alterações do potencial permitem elucidar mecanismos de
associação fármaco-vetor e avaliar a influência da composição nas características físico-
químicas da nanoestrutura. Calvo et al., (1996) observaram os efeitos da composição de
diferentes carreadores nanoestruturados sobre os valores do potencial zeta e verificaram
que a fase oleosa das nanocápsulas e nanoemulsões conferiu um potencial mais negativo
(aproximadamente = -42 mV) quando comparado às nanoesferas (aproximadamente
= -16 mV). Em função da semelhança do potencial de nanocápsulas e nanoemulsões,
os autores sugeriram que a camada polimérica ao redor da gotícula de óleo seria um
filme delgado. Por outro lado, Mosqueira et al. (2000 b) sugeriram que o óleo
constituinte das nanocápsulas está completamente encapsulado pelo polímero pois
nenhuma alteração significativa no potencial de NC foi observada em formulações
preparadas com óleos de diferente natureza.
2.6.1.3. AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA
A microscopia eletrônica de transmissão é a técnica mais utilizada para
avaliação morfológica e estrutural das nanocápsulas (Schaffazick et al., 2003). A
associação dessa técnica à criofratura tem fornecido informações úteis sobre a estrutura
das NCs (Mosqueira et al., 2001 b; Rübe et al., 2005). Estudo recente realizado por
Rube et al. (2005) demonstrou que a técnica de espalhamento de nêutrons a baixo
ângulo fornece informações importantes sobre a espessura da parede polimérica, cujo
Introdução
Elaine Amaral Leite 28
valor estimado foi de 17 nm, permitindo elucidar e comprovar o modelo reservatório
proposto para as NCs.
Entretanto, nos últimos anos, a MFA tem sido uma ferramenta muito utilizada
para caracterização de nanossistemas, principalmente lipossomas (Li & Palmer, 2004) e
nanoesferas (Gref et al., 1994). A MFA fornece informações com alta resolução em três
dimensões, em escala nanométrica sendo capaz ainda de resolver detalhes de superfície
ao nível atômico (Neves et al., 1998).
A análise morfológica das nanocápsulas no presente estudo foi realizada por
MFA, cujo princípio básico envolve a força de interação entre a sonda utilizada e a
amostra, fornecendo importantes informações tais como organização estrutural,
distribuição de diâmetro, dentre outras. À medida que uma sonda extremamente fina
(~100 Å de diâmetro), montada sob a extremidade de uma alavanca, se aproxima da
superfície de uma determinada amostra, surgem forças de interação sonda-amostra as
quais fazem a alavanca defletir. Essa deflexão é detectada por um sistema laser-
fotodetector e todo o sistema monitorado digitalmente, convertendo os dados em um
mapa topográfico da superfície da amostra (Neves et al., 1998). A figura 9 apresenta os
componentes do microscópio de MFA e o esquema de funcionamento da técnica.
Forças de interação sonda-amostra, atrativas ou repulsivas, tão pequenas como
nano-Newtons (nN = 10-9
N) podem ser medidas (Birdi et al., 1997). A longas
distâncias, essa interação praticamente não existe. À medida que a sonda se aproxima da
amostra, forças atrativas (tipicamente forças de Van der Waals) passam a atuar,
aumentando com a aproximação da sonda até que a separação seja de ordem inter-
atômica. Nesse ponto, surgem forças eletrostáticas repulsivas sugerindo contato físico
entre a sonda e a superfície da amostra (Neves et al., 1998). A interação real entre sonda
e amostra tem caráter mais complexo; porém, as características básicas da interação são
as mesmas: atração à longa distância e repulsão em distâncias menores, conforme
proposto por Lennard-Jones (Jean et al., 1999).
Introdução
Elaine Amaral Leite 29
FIGURA 9 – Esquema de funcionamento da técnica de MFA, mostrando os componentes
gerais do microscópio e suas respectivas funções.
Fonte:www.web.mit.Edu/cortiz/www/afm
Baseando nessas forças interativas, pode-se definir alguns modos de operação na
técnica de MFA, a saber: 1) contato, onde a interação por forças repulsivas permite
obter imagens com alta resolução, ao nível atômico. Neste modo, o atrito sonda-amostra
pode danificar a superfície, produzindo imagem distorcida; 2) não contato, onde a
interação é atrativa, apresenta resolução limitada apesar de apresentar a vantagem de
não danificar a amostra; 3) contato intermitente, com regime alternando em atrativo e
repulsivo; reúne vantagens dos dois modos, conseguindo altas resoluções sem
deformação da amostra (Neves et al., 1998).
Além das grandes ampliações, algumas vantagens da MFA incluem: a obtenção
de informações nas três dimensões espaciais; utilização de amostras condutoras e/ou
isolantes, além da simplicidade de preparo da amostra, permitindo a análise na amostra
hidratada, sem necessidade de utilização de vácuo. Assim, amostras biológicas podem
ser preparadas, por exemplo, pela deposição de uma gota em uma lâmina ou outro
substrato, como por exemplo, a mica (Neves et al., 1998).
Introdução
Elaine Amaral Leite 30
3. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO
Em trabalhos anteriores, os carreadores coloidais do tipo NCs, da ordem de
200 nm foram obtidos a partir de derivados anfifílicos de PLA, destinadas à
administração i.v. de fármacos lipofílicos. Estes vetores permitiram um aumento da
concentração plasmática x tempo da ordem de 16 vezes do halofantrino, quando
comparado com a concentração plasmática do fármaco administrado como solução
(Mosqueira et al., 2004). Entretanto, o efeito mais surpreendente foi à redução
extremamente significativa da toxicidade em camundongos com um aumento da dose
máxima tolerada de 30 para 100mg/kg/dose do halofantrino quando administrado por
via i.v. sob forma vetorizada. O trabalho supracitado não permitiu, no entanto, verificar
se a redução da toxicidade teria como foco o sistema cardiovascular, uma vez que
diversos trabalhos na literatura descrevem efeitos cardiotóxicos em pacientes tratados
com halofantrino (Nosten et al., 1993; Malvy et al., 2000; Abernethy et al., 2001).
Os carreadores coloidais nanoparticulados, particularmente as nanocápsulas, são
potencialmente capazes de reduzir a toxicidade geral e também a dose eficaz de alguns
fármacos, por alterarem sua farmacocinética e biodistribuição, considerando que a
molécula associada ao vetor teria uma associação reduzida com órgãos vitais tais como
coração, cérebro e rins.
Diante do exposto, neste trabalho o estudo mais aprofundado das NCs de poli--
caprolactona contendo Hf foi realizado, objetivando sua caracterização e investigação
dos efeitos da nanoencapsulação sobre alguns parâmetros cardiovasculares extraídos de
registro de ECG e PA, em animais sadios e infectados pelo Plasmodium berghei.
Objetivos
Elaine Amaral Leite 32
1. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar uma formulação de
nanocápsulas contendo halofantrino base e avaliar, experimentalmente, a redução da
toxicidade geral, mais especificamente da cardiotoxicidade, obtida com o uso desse
sistema em ratos Wistar sadios e infectados.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Em âmbito mais específico este trabalho tem como objetivos principais:
o desenvolvimento farmacotécnico (formulação e caracterização) de
nanocápsulas de poli--caprolactona contendo halofantrino;
a caracterização físico-química das nanopartículas pela análise do tamanho e da
carga superficial (potencial zeta) por espectroscopia de correlação de fótons e
mobilidade eletroforética, respectivamente;
a análise da morfologia, estrutura, características de organização e da
distribuição de tamanho das nanocápsulas por microscopia de força atômica (MFA);
a análise da associação do fármaco às NC por MFA;
a determinação da dose letal aguda (DL100 e DL50) após administração
intrvaneosa do halofantrino livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar;
comparação das alterações dos intervalos QT, PR, QRS e QTc do ECG de ratos
Wistar, indicativas de cardiotoxicidade, advindas da administração intravenosa de
diferentes doses e formulações contendo halofantrino, a curto e a longo prazo;
a análise das alterações de pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos Wistar
tratados com Hf.HCl ou NC-Hf,
o estudo da contribuição da doença, no caso a malária, sobre os efeitos
cardiotóxicos do halofantrino através do uso de ratos infectados pelo P. berghei.
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 34
1. METODOLOGIA DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS
1.1. PREPARAÇÃO DO HALOFANTRINO BASE
Essa técnica consistiu em uma reação química de transformação do Hf.HCl,
utilizado na produção do medicamento HALFAN®, em sua base livre mais solúvel na
fase oleosa, posteriormente utilizada na preparação de nanocápsulas, como apresentado
na figura 10.
FIGURA 10 – Preparação de Halofantrino base livre a partir de Hf.HCl, como descrito por
Porter et al., 1996.
A reação ocorreu a partir da dissolução de 1,0 g de Hf.HCl em 50 mL de álcool
etílico, seguida pela alcalinização com hidróxido de sódio até obtenção de pH = 10.
Foram adicionados 50 mL de água para precipitação da base livre e a extração da base
livre foi feita num funil de separação com diclorometano. Foram realizadas duas
extrações com 25 mL de diclorometano cada. À solução orgânica foi acrescentado
sulfato de magnésio para remoção do restante de água, filtrada, e o solvente foi
evaporado sob pressão reduzida em um rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha)
até secura. O Hf base livre foi armazenado ao abrigo da luz em dessecador até o seu uso
posterior ou dissolvido em Miglyol 810 (40 mg/mL) para posterior utilização.
1.2. PREPARAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS
A preparação das nanocápsulas foi realizada pelo método de deposição
interfacial de um polímero pré-formado, método também conhecido como
nanoprecipitação, descrito anteriormente por Fessi et al. (1989).
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 35
Primeiramente, 6 mg/mL de polímero poli--caprolactona foram dissolvidos em
uma solução de acetona (1 mL) contendo 0,75% de lecitina (Epikuron®
170) e 2,5% de
Miglyol 810. Essa dissolução ocorreu por meio de agitação com o auxílio de um
agitador magnético e com aquecimento até 40 °C. Em seguida, a solução orgânica foi
vertida em uma solução externa aquosa (2 mL) contendo 0,75% de Poloxamer 188
(Pluronic F68), mantendo a mesma agitação por 10 min, a fim de promover a formação
das nanocápsulas. Posteriormente, essa suspensão foi levada ao rotavapor (Heidolph
Instruments, Alemanha), mantendo-se a temperatura do banho em torno de 50 °C para
evaporação do solvente à pressão reduzida. As formulações de NC contendo fármaco
foram preparadas adicionando-se halofantrino base livre em diferentes concentrações
(0,1; 1; 5; 10 e 12 mg/mL) na fase orgânica, seguindo as mesmas condições descritas
acima. As etapas do preparo da NCs estão apresentadas na figura 11.
FIGURA 11 – Etapas da Preparação de Nanocápsulas.
1) preparação das fases aquosa e oleosa,
2) preparação das nanocápsulas,
3) agitação após preparação,
4) evaporação do solvente.
1
2 3
41
2 3
4
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 36
2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOCÁPSULAS
2.1. DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO E POTENCIAL ZETA
A análise do diâmetro das partículas, o índice de polidispersão das amostras e o
potencial zeta foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons e
mobilidade eletroforética, respectivamente, utilizando um equipamento Zetasizer
3000 HS (Malvern Instruments, UK).
Para a realização dessas medidas, 20 L de suspensão coloidal de nanocápsulas
(não carregadas ou contendo Hf) foram diluídos em 4980 L de uma solução de NaCl
1 mM com o objetivo de se obter suspensões com condutividades constantes (1,2 ± 0,2
mS/cm2) e resultados comparativos em relação as modificações de carga superficial
introduzidas pelo fármaco encapsulado em diferentes concentrações. As medidas foram
efetuadas à temperatura ambiente utilizando-se um ângulo de incidência do laser em
relação à amostra de 90°. As medidas do tamanho e do potencial zeta foram realizadas
na mesma amostra. Todas as determinações foram realizadas em triplicata e os
resultados apresentados foram expressos como a média ± desvio padrão.
O índice de polidispersão, calculado pelo equipamento, reflete o perfil de
homogeneidade no diâmetro das partículas da amostra. Amostras que apresentaram
índice de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas.
A análise de tamanho de algumas amostras foi realizada seguindo o mesmo
protocolo acima, porém em um equipamento diferente, Nanosizer N4 Plus (Coulter
Electronics Inc., Hialeah, FL, USA) em colaboração com a Dra. Gillian Barratt na
Université Paris XI, França.
2.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE HALOFANTRINO POR
ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
A determinação do pico de absorção máxima do Hf foi realizada por
espectofotometria no ultravioleta, utilizando um espectofotômeto Hélios . A partir de
uma solução de 20 g/mL de Hf.HCl em acetonitrila, foi realizado uma varredura em
comprimentos de onda definidos entre 200 e 300 nm, sendo então obtido o espectro da
amostra na região do ultravioleta.
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 37
Posteriormente, a partir de uma solução estoque (200 g/mL) de Hf em
acetonitrila, foram preparadas diferentes diluições correspondentes às concentrações de
0,5 a 20,0 g de Hf/mL. Essas preparações foram utilizadas para determinação da curva
padrão do Hf. Os testes foram realizados em triplicata e o comprimento de onda
determinado para a leitura do Hf foi 258 nm.
2.3. TESTE DA PORCENTAGEM DE ENCAPSULAÇÃO
A porcentagem de encapsulação visa determinar o teor de fármaco associado
intimamente à nanopartícula em relação ao total de fármaco na preparação. Portanto,
esse índice foi calculado pela diferença entre a quantidade de fármaco na suspensão
(medida por dissolução da suspensão total em acetonitrila) e o fármaco livre no meio
externo aquoso (ultrafiltrado) obtido após a ultrafiltração da amostra em unidades
MICROCON com membrana de 100.000Da (AMICON, Millipore®). No interior do
filtro, foram adicionados 400 L, centrifugados por 15 min a 450 x g. Retirou-se 50 L
do ultrafiltrado e adicionou-se 300 L de acetonitrila. A mistura foi agitada no vórtex,
centrifugada novamente e a determinação do Hf livre foi realizada por
espectrofotometria no ultravioleta. A % de encapsulação foi calculada segundo a
seguinte fórmula:
% encapsulação = ([ ] fármaco total (400 L) - [ ] fármaco 400 L de filtrado) x 100
[ ] fármaco total (400 L)
Após a ultrafiltração dos 400 l de 1, 5 ou 10 mg/mL NC-Hf, a quantidade de
halofantrino adsorvida à membrana de ultrafiltração da unidade MICROCOM também
foi determinada. A unidade MICROCON (Millipore®) foi quebrada e a membrana
retirada foi lavada com água Milli-Q, seca em papel de filtro e imersa em 500 L de
acetonitrila. A preparação foi agitada no vórtex, centrifugada e a quantidade de Hf
determinada por espectrofotometria no ultravioleta. A quantidade de Hf retido na
membrana não excedeu 0,034% (n = 6). A metodologia para determinação do teor de Hf
livre e encapsulado ou associado à membrana de ultrafiltração está esquematizada na
figura 12.
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 38
FIGURA 12 – Representação esquemática da metodologia para separação do Hf
encapsulado nas NCs do Hf não encapsulado.
2.4. ANÁLISE DA MORFOLOGIA DAS NANOCÁPSULAS
A análise morfológica das nanocápsulas foi realizada por microscopia de
varredura por sonda mecânica, utilizando a técnica de força atômica.
Para realização destes experimentos, foram utilizados os equipamentos
Multimode e Dimension 300, ambos monitorados por controlador Nanoscope IIIa
(Digital Instruments, Santa Bárbara, EUA), da Fundação Centro Tecnológico de Minas
Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas no modo de contato intermitente
(tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de 228 m, com uma
freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m e raio de
curvatura de 5 nm a 10 nm. Aproximadamente 5 L das amostras foram depositados em
placas de mica clivadas no momento do uso. A mica foi utilizada como suporte para as
amostras, uma vez que trata-se de um mineral com plano basal e com clivagem muito
fácil apresentando superfície atomicamente plana. A superfície exposta é hidrofílica e
apresenta cargas negativas. Após a deposição das amostras na superfície da mica, essas
foram, imediatamente, secas utilizando-se jato de argônio. A varredura foi efetuada com
velocidade de 1 Hz e resolução de 512 x 512 pixels. A análise das amostras foi realizada
100000 Da
Hf base NC-Hf
Centrifugação, 15min, 450g
Extração em
acetonitrila
Diluição em
acetonitrila
Agitação, 15min
Centrifugação,
15min, 450g
Dosagem do
Sobrenadante
(258 nm)
Agitação, 15min
Centrifugação,
15min, 450g
Dosagem do
Sobrenadante
(258 nm)
100000 Da
Hf base NC-Hf
Centrifugação, 15min, 450g
Extração em
acetonitrila
Diluição em
acetonitrila
Agitação, 15min
Centrifugação,
15min, 450g
Dosagem do
Sobrenadante
(258 nm)
Agitação, 15min
Centrifugação,
15min, 450g
Dosagem do
Sobrenadante
(258 nm)
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 39
utilizando o programa de análise do sistema (Section Analysis). Um mínimo de dez
imagens de cada amostra foi analisado para assegurar reprodutibilidade dos resultados.
Os resultados foram apresentados como a média ± desvio padrão de aproximadamente
50 partículas analisadas.
3. EXPERIMENTAÇÃO “IN VIVO”
3.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados 140 ratos Wistar machos adultos (250 ± 50 g) provenientes do
Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram mantidos no
Biotério da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto até a realização
dos experimentos e tiveram livre acesso à comida e água. Todos os procedimentos
relativos à manutenção dos animais e à experimentação seguiram as normas do
Conselho Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
3.2. CONFECÇÃO DE CATETERES PARA IMPLANTAÇÃO INTRA-
VASCULAR
Os cateteres foram preparados utilizando-se 15 cm de tubo de polietileno PE50
(Sonda Hemo Técnico, Brasil) e 4,5 cm de tubo de polietileno PE10 (Intramedic
Polyethylene Tubing Clay Adams, EUA), soldados sob a ação do calor, utilizando-se
um fio de aço para impedir a oclusão da luz. Os cateteres foram preenchidos com
solução salina (NaCl 0,9%) heparinizada (10 U/mL) e ocluídos com pinos metálicos na
extremidade PE50 antes de sua implantação.
3.3. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Para os protocolos I, III e IV os animais foram anestesiados com éter etílico por
via inalatória. Para o protocolo II, os animais foram anestesiados pelo tiopental sódico
(70 mg/kg) por via intraperitoneal (i.p.).
Após a anestesia ter alcançado a profundidade adequada, os animais foram
submetidos ao procedimento cirúrgico que consistiu na implantação de cateteres
intravenoso e intra-arterial e sua posterior exteriorização no tecido subcutâneo, 24 horas
antes da realização dos experimentos (protocolos I, III, IV). Para o protocolo II, os
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 40
animais foram traqueostomizados, utilizando-se uma cânula de polietileno, para permitir
respiração espontânea adequada e em seguida, tiveram os cateteres intravasculares
implantados. Após tricotomia, assepsia e incisão na região inguinal, o feixe vásculo-
nervoso foi, então, localizado, exposto e, em seguida, a artéria e a veia femorais foram
isoladas por um fio duplo de algodão. Após pequena incisão no vaso, a extremidade
PE10 do cateter foi introduzida na artéria, ficando localizada na aorta abdominal, abaixo
das artérias renais. O mesmo procedimento foi realizado na veia, ficando a porção PE10
localizada na veia cava inferior. Os animais (protocolo I, III e IV) tiveram a parte PE50
do cateter conduzida, com a ajuda de um trocárter, através do tecido subcutâneo, até à
região cervical onde foi feita uma pequena incisão na pele para exteriorização do
mesmo, possibilitando a injeção de drogas nos animais acordados.
3.4. OBTENÇÃO DOS SINAIS DE ELETROCARDIOGRAMA E PRESSÃO
ARTERIAL
O sinal do ECG foi obtido utilizando agulhas hipodérmicas de aço inoxidável
como sensores. As agulhas foram inseridas no tecido subcutâneo do membro superior
direito e inferior esquerdo, objetivando medir a diferença de potencial relativa à
derivação DII. O sensor inserido no membro inferior direito foi ligado à blindagem do
aparelho, para minimizar o “ruído”.
O registro da pressão arterial foi realizado utilizando um transdutor de pressão
modelo P23XL (Spectramed, EUA). Esse transdutor foi conectado ao cateter
introduzido na artéria femoral do animal. Os sensores de ECG e o transdutor de pressão
arterial foram, então, conectados a um sistema condicionador de sinais (desenvolvidos
no Departamento de Engenharia Elétrica da Universidade Federal de Minas Gerais).
Para os dados da fase inicial do trabalho (referentes ao protocolo II), os sinais
obtidos foram amostrados a uma freqüência de 600 Hz por uma placa conversora
analógico-digital de 12 bits de resolução (modelo DI 200, DATAQ Instruments, EUA).
Em uma fase posterior (dados referentes aos protocolos III e IV), os sinais obtidos
foram amostrados a uma freqüência de 2000 Hz, por uma placa conversora analógico-
digital Windaq Board (modelo DI 200, USA). Os registros foram armazenados em disco
rígido e gravados em compact discs (CD).
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 41
FIGURA 13 – Sistema de Aquisição de ECG e PA. 1) Visão geral do sistema; 2) Visão de um animal com os eletrodos inseridos no tecido
subcutâneo, indicados pela seta; 3) Registro de ECG e PA obtidos a partir do animal em experimentação.
1
2 3
1
2 3
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 42
3.5. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE HALOFANTRINO PARA
ADMINISTRAÇÃO ENDOVENOSA
A solução de Hf.HCl foi preparada a partir da dissolução de 100 mg de Hf.HCl
em 0,8 mL de dimetilacetamida (DMA) e 1,2 mL de polietilenoglicol 300 (PEG 300),
adaptada de uma preparação descrita anteriormente por Krishna et al. (1993), a qual foi
administrada e testada clinicamente em humanos. Esta preparação foi diluída cinco
vezes em solução de glicose hipertônica, antes da injeção, para evitar possíveis efeitos
tóxicos do solvente. A solução de DMA e PEG 300 sem o halofantrino foi preparada
nas mesmas condições descritas acima, sendo então utilizada como controle.
A preparação da suspensão coloidal de NC com e sem Hf foi realizada como
descrito no item 1.2. Todas as preparações antes da administração foram isotonizadas
com glicose e filtradas em filtro Millipore 0,45 m para garantir a administração de
partículas inferiores a 5 m, reduzindo-se a possibilidade de formação de êmbolos.
3.6. INFECÇÃO DOS ANIMAIS
Diferentes protocolos foram utilizados para imunossupressão dos animais,
conforme descrito na tabela abaixo:
Quadro 3 – Padronização dos protocolos de imunossupressão.
N° do
Protocolo
Ciclofosfamida
Dose/dia
(mg/kg)
Regime de Dose Dose Total
(mg/kg)
Dia da
Infecçãoa,b
P 1 50 - 50 mg/kg, 4 dias consecutivos 200 D4
P 2 50 - 50 mg/kg, 4 dias consecutivos 200 D7
P 3 50
- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos
- pausa de 3 dias;
- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos
400 D13
P 4 50/40
- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos
- pausa de 3 dias;
- 40 mg/kg, 3 dias consecutivos
320 D12
P 5 100 - 100 mg/kg, dose única 100 D4
P 6 50
- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos
- pausa de 3 dias;
- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos
400 D4
P 7 50/25 - 50 mg/kg, 2 dias consecutivos
- 25 mg/kg, 2 dias consecutivos 150 D7
a após início da imunossupressão;
b Administração intraperitoneal de 2x10
7 hemácias de camundongo
Swiss parasitadas com Plasmodium berghei por animal; D0 = início da imunossupressão; Peso dos
animais = 250 + 50g.
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 43
Dos protocolos acima, o esquema que permitiu a imunossupressão associada a
infecção com 100% de sobrevida e parasitemia foi P 7. Portanto, para a obtenção de
ratos Wistar infectados pelo Plasmodium berghei foi utilizado o tratamento padronizado
com ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha) por via intraperitoneal na dose de
50 mg/kg/dia por dois dias consecutivos, seguido da dose de 25 mg/kg/dia por mais dois
dias consecutivos. No oitavo dia após o início do tratamento com ciclofosfamida, ou
seja, no quarto dia após o término do tratamento, os animais receberam por via i.p.
solução salina 0,9% contendo 2x107 hemácias de camundongos Swiss infectadas pelo
P. berghei. O inóculo foi obtido a partir de camundongos albinos infectados entre a 21 e
26ª passagens, realizadas semanalmente.
No décimo primeiro dia após a infecção e estando confirmado a presença do
parasita por esfregaço sanguíneo, os animais foram então submetidos à experimentação
para a avaliação da cardiotoxicidade.
3.7. AVALIAÇÃO DA PARASITEMIA
A parasitemia foi confirmada através de esfregaço sanguíneo confeccionados a
partir da coleta de amostras de sangue dos animais recolhidas da veia caudal. Os
esfregaços foram fixados em metanol e corados pelo Giemsa. O nível de parasitemia (%
de hemácias infectadas) foi determinado microscopicamente, utilizando-se um
microscópio óptico (Olympus, Brasil), num aumento de 1000x pela análise de 3000
células, em diferentes campos. Os esfregaços foram confeccionados no 10° dia após
infecção para confirmação da mesma e no 11° dia para avaliação da % de parasitemia
no dia experimental. Durante todo o período experimental, os animais foram pesados e
o peso registrado em uma planilha para avaliar a variação do mesmo.
3.8. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
3.8.1. PROTOCOLO I – Determinação da Dose Máxima Tolerada (DMT) e
DL50 para o Halofantrino em diferentes formulações
Esse protocolo foi realizado em animais acordados, com livre
movimentação, submetidos à cirurgia 24 horas antes. Diferentes grupos de animais
receberam por via endovenosa diferentes doses de halofantrino livre (100, 150,
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 44
200 mg/kg) ou encapsulado (100, 150, 200, 225, 250 e 300 mg/kg), e foram observados
por um período de 24 horas quanto à ocorrência de grooming, tremores, ataxia,
convulsão e morte.
3.8.2. PROTOCOLO II – Avaliação da Cardiotoxicidade até 30 minutos
após a administração de diferentes formulações de Halofantrino
Esses experimentos foram realizados em animais anestesiados pelo tiopental
sódico, mantendo-se a anestesia durante o período experimental com a administração do
anestésico i.v. sempre que necessário.
Os animais foram conectados ao sistema e deixados por 5 min para estabilização
antes do início do experimento. Foram obtidos então 10 min de registro controle após o
qual os diferentes grupos de animais receberam Hf.HCl ou NC-Hf nas doses de 100 ou
150 mg/kg ou volume de NC branca ou solvente (DMA/PEG 40:60) equivalentes à dose
de 150 mg/kg. Procedeu-se o registro dos parâmetros cardiovasculares continuamente
por 15 min, seguido por registros de aproximadamente 30 s a cada 5 min até 30 min
após a administração das soluções.
0 24 48 (horas)
Adm
inis
traçã
o d
a
Solu
ção d
e H
f
Pro
cess
o C
irúrg
ico
Período de Recuperação
Observação do animal
0 24 48 (horas)
Adm
inis
traçã
o d
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Solu
ção d
e H
f
Pro
cess
o C
irúrg
ico
Período de Recuperação
Observação do animal
0 10 25 40 (minutos)
Adm
inis
traçã
o d
a
Solu
ção d
e H
f
Registro a cada 5 minutos
Registro contínuo
Registro controle
0 10 25 40 (minutos)
Adm
inis
traçã
o d
a
Solu
ção d
e H
f
Registro a cada 5 minutos
Registro contínuo
Registro controle
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 45
3.8.3. PROTOCOLO III – Avaliação da Cardiotoxicidade 30 min, 1, 2, 4, 8,
24 ou 48 horas após a administração de Nanocápsulas contendo Halofantrino
Esses experimentos foram realizados em animais anestesiados pelo éter etílico,
submetidos à cirurgia e, logo após foram conectados ao sistema para obtenção do
registro controle durante 10 min. Posteriormente, os animais foram mantidos no
laboratório com livre movimentação e alimentação ad libitum e, após 24 horas os
animais acordados receberam NC-Hf na dose de 150 mg/kg. Foram então subdivididos
em diferentes grupos que tiveram os sinais de PA e ECG obtidos continuamente por um
período mínimo de 5 min sob a anestesia pelo éter etílico nos diferentes tempos após a
administração da formulação, a saber, 30 min, 1, 2, 4, 8, 24 ou 48 horas.
3.8.4. PROTOCOLO IV – Avaliação da Cardiotoxicidade do Halofantrino
nos animais infectados com Plasmodium berghei
Esses experimentos foram realizados em animais imunossuprimidos e,
posteriormente, infectados com P. berghei, como descrito no item 4.3.6.
No décimo primeiro dia após infecção, os animais foram anestesiados pelo éter
etílico, submetidos à cirurgia e, logo após foram conectados ao sistema para obtenção
do registro controle por 10 min. Posteriormente, os animais foram mantidos no
0 10min 24 h 10min
Ad
min
istr
açã
o d
a
So
luçã
o d
e H
f
Pro
cess
o C
irú
rgic
o
Registro contínuo por ~10min em diferentes tempos
(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)
Período de Recuperação
Registro controle
0 10min 24 h 10min
Ad
min
istr
açã
o d
a
So
luçã
o d
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f
Pro
cess
o C
irú
rgic
o
Registro contínuo por ~10min em diferentes tempos
(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)
Período de Recuperação
Registro controle
Registro contínuo por ~10min em diferentes tempos
(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)
Período de Recuperação
Registro controle
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 46
laboratório com livre movimentação e alimentação ad libitum e, após 24 horas, ou seja,
no décimo segundo dia após a infecção, os animais acordados receberam Hf.HCl ou
NC-Hf na dose de 100 mg/kg. Os sinais de PA e ECG foram obtidos continuamente por
um período mínimo de 5 min sob a anestesia pelo éter etílico nos diferentes tempos após
a administração da formulação, a saber, 10 e 30 min, 1 ou 2 h, 8 e 24 horas.
3.9. ANÁLISE DOS REGISTROS
Os experimentos foram inicialmente analisados por inspeção visual do registro
com auxílio do software Win/Daq, utilizando-se diversos fatores de compressão para os
sinais. Posteriormente foram selecionados segmentos em janelas de 120 s em instantes
pré-determinados pelos protocolos experimentais permitindo a análise de 4 a 8 ciclos
cardíacos completos, dependendo da freqüência cardíaca.
Os registros armazenados foram analisados off-line e incluíram medidas do
intervalo QT (intervalo entre o início de uma onda Q e o término de uma onda T do
ECG), do intervalo RR (intervalo entre duas ondas R do ECG), do intervalo PR
(intervalo entre o início da onda P e o término da onda R), do complexo QRS (inclui
três ondas: Q, R e S; medido do início da onda Q até o término da onda S), pressão
Ad
min
istr
açã
o d
a
So
luçã
o d
e H
f
Cirurgia e registro controle por 10 min
Inóculo de 2 x107 células parasitadas
Administração do Imunossupressor
0 4 7 8 19 20 (dias)
Registro contínuo por ~10 min em diferentes tempos
(10 e 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas)
Tempo necessário para estabelecimento da infecção
Tempo necessário para estabelecimento da
imunossupressão Ad
min
istr
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a
So
luçã
o d
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f
Cirurgia e registro controle por 10 min
Inóculo de 2 x107 células parasitadas
Administração do Imunossupressor
0 4 7 8 19 20 (dias)
Registro contínuo por ~10 min em diferentes tempos
(10 e 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas)
Tempo necessário para estabelecimento da infecção
Tempo necessário para estabelecimento da
imunossupressão
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 47
arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD). Todos os parâmetros foram analisados antes
e após a administração das formulações.
O intervalo QT foi posteriormente corrigido em função da freqüência cardíaca
usando a fórmula de Fridericia (QTc = QT/(RR)1/3
). De acordo com Abernethy et al.,
(2000), o QTc pode ser corrigido pela fórmula de Fridericia para RR<500 ms ou pela
fórmula de Bazzett para RR>500 ms. No presente trabalho sempre foram encontrados
valores de RR menores que 500 sugerindo que a fórmula de Fridericia representa
melhor os dados no modelo rato, utilizado no presente estudo.
A taxa de proteção cardíaca conferida pela encapsulação foi determinada
segundo a fórmula abaixo:
onde P representa o parâmetro do ECG analisado.
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
O diâmetro médio e o potencial zeta das NC sem e com Hf foram comparados
utilizando-se o teste t de Student através do programa de análise EpiInfo versão 6.04.
Todos os resultados de análise de cardiotoxicidade avaliada até 30 min e nos
animais infectados foram expressos como a média ± erro padrão da média (e.p.m.). Os
resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA). A diferença entre grupos
experimentais foi testada por análise de covariância, considerando o valor de cada
parâmetro antes de administração de droga como a covariável. A porcentagem de
variação observada em cada tempo foi analisada pelo teste Kruskal-Wallis, pois os
dados não apresentaram distribuição normal.
Os resultados dos experimentos de avaliação da cardiotoxicidade a longo prazo,
também foram expressos como a média ± erro padrão da média. A diferença entre o
período controle e o tempo após administração foi testada pelo teste t de Student.
Para todas as análises adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo que as
diferenças foram registradas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P ≤ 0,05).
% PNC-Hf
% PHf.HCl
% Proteção Cardíaca = 100% - x 100% PNC-Hf
% PHf.HCl
% Proteção Cardíaca = 100% - x 100
Materiais e Métodos
Elaine Amaral Leite 48
5. MATERIAIS
No presente trabalho, foram utilizados os seguintes fármacos e reagentes:
cloridrato de halofantrino (Smith Kline Beecham, UK), tiopental sódico (Cristália,
Brasil), Ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha) Poly--caprolactona (PCL),
Poloxamer 188 Mw 42.5 kDa e dimetilacetamida (DMA) (Sigma-Aldrich, USA),
Epikuron 170 (Lucas Meyer, França). Miglyol 810N (Hulls, Alemanha), PEG 300,
acetona, acetonitrila, diclorometano, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, glicose, éter
etílico (Synth, Brasil). Todos os solventes utilizados foram de grau analítico e a água foi
purificada por osmose reversa em um sistema Symplicity (Millipore, USA).
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 51
1. CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA
Embora vários sistemas coloidais tais como nanoemulsões, lipossomas e
nanoesferas possam ser utilizados como carreadores para o halofantrino, no presente
trabalho, as nanocápsulas foram os vetores de escolha, objetivando obter níveis ótimos
de estabilidade e alta taxa de encapsulação. Trabalhos anteriores, utilizando esse mesmo
sistema para veicular o Hf mostraram um teor de encapsulação de aproximadamente
99%, enquanto os lipossomas contendo Hf foram instáveis (Mosqueira, 2000 a). Além
disso, as NCs são vetores de escolha para a administração intravenosa de fármacos
altamente lipofílicos e solúveis na fase oleosa interna, característica marcante do Hf. As
NCs são também interessantes vetores em função de sua biodegradabilidade,
estabilidade em meio biológico e da baixa toxicidade dos polímeros pré-formados
utilizados, como por exemplo, o ácido polilático utilizado previamente, e a poli--
caprolactona, polímero usado no presente estudo. A escolha de um determinado vetor
bem como de seus constituintes deve ser bastante criteriosa, pois a retenção de um
fármaco dentro do carreador é amplamente determinada por sua lipofilicidade e sua
capacidade de se difundir entre o sistema e o meio biológico.
A solubilidade do Hf base livre em óleos foi descrita como sendo
consideravelmente maior que o sal Hf.HCl. Segundo Porter et al. (1996),
aproximadamente, 1 mg de Hf.HCl foi solúvel em 1 mL de óleo enquanto, a forma
amorfa da Hf base livre permitiu solubilizar 200 mg/mL no mesmo óleo.
Mosqueira, (2000 a) avaliando a solubilidade do Hf em diferentes óleos, determinou ser
esta igual a 180 mg/mL em Miglyol, um triglicerídeo de cadeia média que apresenta
como propriedades físico-químicas, baixa viscosidade e baixa tensão interfacial, que
favorecem sua utilização para a preparação de NC. Diante disso, a base livre foi
preparada, com rendimento de 93%, para se obter maior solubilidade do fármaco na fase
oleosa das NCs.
No presente trabalho, a quantificação do Hf nas preparações de nanocápsulas foi
realizada por espectofotometria no ultravioleta. Para tanto, inicialmente foi determinado
o espectro de UV do Hf em acetonitrila como apresentado na figura 14. Foi observado
um pico de absorção máxima em 258 nm, sendo esse, o comprimento de onda escolhido
para realização dos ensaios posteriores.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 52
FIGURA 14 – Espectro na região do UV apresentando o pico de absorção máxima do Hf em
acetonitrila (20 g/mL).
Além disso, foi construída uma curva de calibração do Hf em acetonitrila
(Figura 15) a partir das medidas de absorbância, realizada em 258 nm, apresentadas na
tabela 1.
Tabela 1 – Valores de Absorbância utilizados para a construção da
curva de calibração da solução de Hf em acetonitrila
a n = 3; DP = desvio padrão; CV= coeficiente de variação, dado por :(DP/média)*100
Hf (g/mL) Absorbância Média (a 258 nm)a DP
CV (%)
0,5 0,05 0,001 1,7
1,0 0,09 0,004 2,6
1,25 0,11 0,001 0,6
2,5 0,21 0,002 1,1
5,0 0,41 0,002 0,6
7,5 0,64 0,005 0,8
10,0 0,85 0,003 0,4
20,0 1,60 0,013 0,8
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 220 240 260 280 300
Comprimento de Onda (nm)
Ab
so
rbân
cia
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 53
FIGURA 15 – Curva de Calibração do Hf em acetonitrila em comprimento de onda igual a
258 nm; R2 = coeficiente de correlação.
O coeficiente de correlação (R2) demonstra que 99% dos dados estão inseridos
na curva, sugerindo, portanto, uma correlação linear entre as concentrações de Hf e as
absorbâncias obtidas. Esses resultados permitiram utilizar a curva acima nos ensaios de
determinação do teor de Hf encapsulado.
A técnica utilizada para determinar o teor de encapsulação foi a ultrafiltração-
centrifugação e indicou que 99,80 0,02% do Hf adicionado na preparação associou-se
ao sistema coloidal, ou seja, às nanocápsulas, quando concentrações altas de fármaco
(10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal) foram utilizadas. De acordo com a revisão
feita por Schaffazick et al. (2003), diversos fatores podem influenciar a quantidade de
fármaco associada aos sistemas nanoestruturados, tais como as características físico-
químicas do fármaco, o pH do meio, as características de superfície das partículas ou a
natureza do polímero, a quantidade de fármaco adicionada à formulação, a natureza do
óleo utilizado, bem como o tensioativo adsorvido à superfície polimérica.
A tabela 2 apresenta várias formulações de NCs contendo diferentes
concentrações de halofantrino e seu efeito no diâmetro médio, índice de polidispersão e
y = 0,0801x + 0,0166
R2 = 0,9987
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 5 10 15 20
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(n
m)
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 54
potencial zeta das partículas. Todas as formulações foram preparadas com a mesma
composição quali-quantitativa, exceto a concentração do Hf.
Tabela 2 – Características físico-químicas de formulações de NC contendo
diferentes concentrações de Halofantrino
Formulações de
Nanocápsulas a
Hf base
(mg/mL)
Diâmetro Médio
das Partículas +
DPb (nm)
Índice de
Polidispersãoc
Potencial +
DP (mV)d
NC-0 - 245 118,7 0,193 -26,7 0,8
NC-1 1,0 191 56,6 0,250 -25,7 3,0
NC-5 5,0 504 158,0* 0,630 -1,6 1,4*
NC-10
10,0 228 140,0 0,008 +10,9 1,2*
NC-10#
10,0 268 174,2 0,109 nd
NC-12# 12,0 365 211,5 0,457 nd
a Formulações de nanocápsulas constituídas por PCL = poly--caprolactona (6 mg de polímero/mL
de suspensão coloidal); b
Desvio Padrão (n=3) das populações definidas pelo equipamento;
cAmostras monodispersas (<0.3);
d n=3, medidas realizadas após diluição da amostra (1:250) em
NaCl 1mM (condutividade, 120 S/cm); * indica diferença significativa (P < 0,05) quando
comparada com a formulação NC-0; # Formulações caracterizadas no equipamento Nanosizer N4
Plus, Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL, USA na Université Paris XI, França; nd = não
determinado.
Como apresentado na tabela, o diâmetro médio das NCs variou de 191 a 504 nm,
e foi observado aumento gradativo no tamanho das partículas a medida que
concentrações crescentes de Hf foram associadas ao sistema. O maior diâmetro
observado nas diferentes formulações, significativamente diferente da formulação
NC-0, correspondeu a NC-5, preparada com 5 mg Hf/mL de solução coloidal. Essa
observação coincide com a redução do potencial zeta (-1,6 mV) sugerindo um estado
inicial de agregação e desestabilização do sistema, provavelmente devido à
neutralização de cargas interfaciais. O aspecto visual (turbidez) da preparação e o
aumento no índice de polidispersão (0,630), reforçam a hipótese de um possível
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 55
fenômeno de agregação entre as partículas coloidais, devido à redução da repulsão e ao
aumento das forças de Van der Waals.
As amostras NC-0, NC-1 e NC-10 apresentaram baixos índices de polidispersão
(0,008 a 0,250), caracterizando populações homogêneas de partículas, com distribuição
unimodal (Figura 16). Entretanto, NC-5 e NC-12 apresentaram-se como amostras
polidispersas, com índices de polidispersão superior a 0,3 impossibilitando sua
utilização para a administração intravenosa, devido à provável presença de agregados
com tamanho superior a 5 m.
Como apresentado na tabela 2, não existe diferença entre o tamanho das
formulações NC-10 (P = 0,57). Apesar das medidas terem sido efetuadas em
equipamentos distintos, pôde-se verificar uma reprodutibilidade dos resultados com
presença de populações homogêneas em ambas as amostras (Figura 16 D e E). Esses
resultados mostraram que existe uma boa correlação entre os diferentes equipamentos
utilizados para a realização da técnica de PCS.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 56
FIGURA 16 – Tamanho das diferentes formulações de NCs obtido por equipamentos
distintos: A a D: Zetasizer 3000 HS; E e F: Nanosizer N4 plus. A:
formulação NC-0, sem o halofantrino; B: formulação NC-1, contendo 1 mg
de Hf/mL de suspensão; C: formulação NC-5, contendo 5 mg de Hf/mL de
suspensão; D e E: formulações NC-10, contendo de 10 mg de Hf/mL de
suspensão; F: formulação NC-12, contendo 12 mg de Hf/mL de suspensão.
A B
C D
F
Diâmetro (nm)
Diâmetro (nm)
Diâmetro (nm)
Diâmetro (nm)
Inte
nsi
dad
e
Diâmetro (nm)
Inte
nsi
dad
e
Diâmetro (nm)
Size distribution(s)
5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)
5
10
15
% i
n c
lass
Size distribution(s)
5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)
5
10
15
% i
n c
lass
Size distribution(s)
5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)
10
20
% i
n c
lass
Size d istribution(s)
5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)
10
20
30
40
% i
n c
lass
E
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 57
O potencial foi utilizado com o objetivo de detectar alterações na carga
superficial das partículas devido à adição de Hf ao sistema. Foram observados valores
altamente negativos para as formulações NC-0 e NC-1, enquanto NC-10 apresentou
valor de positivo (Tabela 2). Os valores de potencial idênticos (P = 0,34), em torno
de 26 mV,para NC-0 e NC-1 sugerem que a superfície das nanocápsulas com
halofantrino (1 mg/mL) tem a mesma composição das NCs brancas, ou seja, nessa
condição parece que a maior parte do fármaco encontra-se encapsulado no núcleo
oleoso, sem influenciar a interface. Esse potencial negativo é provavelmente decorrente
da ionização de grupos carboxílicos presentes no polímero os quais se dissociam no
meio dispersante e também dos fosfolipídios utilizados. Uma variação significativa
(P = 0,000) do potencial -26,7 para + 10,9 mV, foi observada quando 10 mg/mL de
Hf foram adicionados ao sistema. Esse fato pode ser explicado por uma provável
influência do fármaco sobre a carga elétrica superficial da partícula, sugerindo que uma
parte do fármaco carregado positivamente esteja adsorvido na superfície do vetor, visto
que o Hf base apresenta um grupo amino ionizável que tenderia a aumentar a
positividade da interface. Estudos anteriores demonstraram que o Hf interage
fortemente com fosfatidilcolina (Lim & Go, 1999) e que o fármaco apresenta uma clara
influência na superfície de carreadores que contém lecitina tais como nanocápsulas e
nanoemulsões (Mosqueira, 2000 a), sugerindo que o halofantrino interage com
fosfolipídios da lecitina e que, em altas concentrações, parte do fármaco se encontra na
interface com o meio externo. Do mesmo modo, Calvo et al. (1997) analisaram a
interação entre lisozima, uma enzima carregada positivamente, com dois diferentes
sistemas carreadores, nanocápsulas e nanoesferas. Os autores observaram uma redução
significativa dos valores do potencial das NCs, sugerindo que a enzima se associa
mais a sistemas que apresentem carga superficial mais negativa.
Os dados da tabela 2 permitem ainda sugerir que as preparações contendo Hf
mais favoráveis para utilização por via i.v. seriam NC-1 e NC-10, uma vez que
apresentam populações homogêneas e monodispersas com tamanho inferior a 500 nm.
Sabe-se que o tamanho e a carga superficial são importantes fatores que influenciam na
distribuição dos sistemas carreadores no organismo, quando administrado pela via i.v..
Partículas grandes são rapidamente reconhecidas pelas células do SFM, assim como
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 58
partículas carregadas positivamente tendem a se acumular principalmente nos pulmões e
no baço, enquanto partículas negativamente carregadas concentram-se mais no fígado e
no baço (Juliano, 1988).
Todas as formulações foram obtidas como suspensões coloidais e apresentaram
um aspecto leitoso característico das nanocápsulas como pode ser observado na
Figura 17. Essas preparações apresentaram boa estabilidade e nenhuma alteração
macroscópica foi observada durante o período de 3 meses, tais como cremagem,
sedimentação ou floculação. Entretanto, no presente trabalho, não foi realizado um
estudo detalhado da estabilidade das NCs, visto que as formulações foram utilizadas, in
vivo, logo após a preparação. Além disso, estudos anteriores utilizando NC de PLA
contendo Hf demonstraram que as mesmas são estáveis por um período de 8 meses
(Mosqueira, 2000 a).
FIGURA 17 – Nanocápsulas obtidas como suspensão coloidal de aspecto leitoso, pelo
método de nanoprecipitação. A) NCs sem fármaco, B) NC contendo 1 mg de
Hf/mL de suspensão coloidal e C) NC contendo 10 mg de Hf/mL de
suspensão coloidal.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 59
2. ANÁLISE MORFOLÓGICA
A análise morfológica das NCs foi realizada por microscopia de força atômica
(MFA). Foram analisadas formulações de nanocápsulas não carregadas (brancas), NCs
contendo diferentes concentrações de Hf bem como os constituintes isolados e suas
combinações.
Diferentes amostras de NCs brancas foram analisadas em diferentes campos e
foi observado uma homogeneidade das mesmas em relação ao formato e estruturas,
apresentando partículas com estruturas esféricas e formato regular como pode ser
visualizado nas figuras 18 A e 18 B.
FIGURA 18 – Imagens de nanocápsulas não carregadas obtidas por MFA. Em A) vista do
topo e em B) visão tridimensional das partículas.
A
B
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 60
O diâmetro das NCs brancas obtido por MFA variou de 222 a 550 nm,
apresentando populações heterogêneas de partículas, enquanto, o diâmetro médio dessa
mesma amostra determinado por PCS foi de 245 nm (Tabela 2), podendo-se atribuir a
diferença entre as medidas à maneira em que as mesmas são efetuadas por MFA, ou a
uma possível agregação das NCs na superfície da mica ou ainda ao achatamento das
NCs quando depositadas sobre a superfície da mica. No entanto, resultados contrários
eram esperados, uma vez que a técnica de PCS mede o raio hidrodinâmico das
partículas, enquanto a MFA produz imagens de um sistema desidratado e também
afetadas pelo formato da sonda de varredura utilizada.
Em todos os experimentos realizados por MFA, a amostra foi submetida a um
processo de secagem com jato de argônio. Foi observado que, apesar do processo de
secagem manter a amostra recoberta com uma camada de água, a secagem levou a uma
alteração das “condições naturais” das partículas, resultando num possível fenômeno de
agregação ou ruptura. Essa hipótese foi formulada com base nas imagens topográficas
(Figura 19 A) e de fase (Figura 19 B) de formulações de NCs brancas apresentadas
abaixo. Nessas imagens é possível observar a presença de canalículos irregulares, com
altura em torno de 2 nm (indicadas em A pelas setas vermelhas), os quais parecem ser
responsáveis por um processo de fusão das partículas. É possível observar ainda a
presença de camadas finas e descontínuas de aproximadamente 6-8 nm de altura
(indicadas em B pelas setas em negrito), nas quais as NCs estão depositadas em todas as
imagens obtidas. Essas camadas provavelmente são formadas por excesso de tensioativo
não-iônico utilizado, Poloxamer 188.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 61
FIGURA 19 – Imagem topográfica (A) e fase (B) obtidas por MFA e perfil topográfico (C) de
nanocápsulas brancas. Área: 2,7m x 2,7m. As setas em negrito mostram
camadas de poloxamer com altura entre 6 e 8 nm.
O poloxamer foi então analisado separadamente, e as imagens obtidas mostram
estruturas altamente organizadas com camadas entre 5 e 7 nm, ou seja, com altura
bastante semelhante à observada na figura anterior, as quais parecem diferir apenas
morfologicamente das anteriores, uma vez que essa estrutura é mais arredondada
(Figura 20).
A B
C
A B
C
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 62
FIGURA 20 – Imagem de altura (A) e fase (B) de poloxamer188 obtidas por MFA.
Área: 40 m x 40 m.
Estudos da relação diâmetro/altura dessas partículas foi realizado, demonstrando
uma relação de 10 ± 3,2 (Figura 21). Esses dados sugerem a existência de formas mais
achatadas ou partículas em forma de disco provavelmente devido a estrutura interna das
NCs ser preenchida de óleo envolvida por uma membrana polimérica flexível. Estudos
anteriores (Montasser et al., 2002) demostraram uma relação diâmetro/altura de 12 para
as nanocápsulas preparadas com um co-polímero, dicloroftaloil-co-dietilenotriamina,
estabilizado pelo poloxamer 188. Portanto, nossos dados estão em acordo com esses
autores e mostram que as NCs apresentam uma natureza diferente podendo se deformar
quando comparadas às nanoesferas cuja estrutura é bastante rígida (Leite et al., 2005).
As nanoesferas, como apresentado na figura 22, mostraram uma relação diâmetro/altura
próxima de 1. Esta capacidade de deformação é uma importante propriedade das NCs,
visto que um dos objetivos desses sistemas é transpor espaços intercelulares, in vivo,
como endotélio vascular descontínuo no corpo humano. Além disso, essa propriedade é
uma evidência física da presença de um núcleo oleoso fluido envolvido por uma
membrana. Recentemente, Rübe et al. (2005) evidenciaram a presença de núcleo oleoso
pela técnica de espalhamento de nêutron a baixo ângulo, indicando que a membrana
A
B
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 63
polimérica possui em torno de 17 nm de espessura, utilizando-se o PLA como polímero
e composição geral do sistema praticamente idêntica ao utilizado no presente trabalho.
FIGURA 21 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanocápsulas
brancas de PCL, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas
(~10). Área: 2,5 m x 2,5m.
A
B
C
D
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 64
FIGURA 22 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanoesferas
brancas de PLA, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas (~1).
Área: 2,5 m x 2,5m.
Como exemplo da associação dos constituintes das NCs foram analisadas
também "nanocápsulas sem membrana polimérica", denominadas nanoemulsões.
Nesses experimentos foi detectada grande dificuldade na obtenção das imagens, as quais
apresentaram-se normalmente muito ruidosas (Figura 23), sugerindo que o contato com
a sonda “arrasta” as nanoestruturas sobre a mica desencadeando um processo de fusão
com formação de grandes partículas. Essas análises sugerem que a parede polimérica
das NCs confere maior estabilidade ao sistema, possuindo portanto uma estrutura mais
rígida e estável, comparada à emulsão submicrométrica, e uma organização mais
flexível e permeável comparada às nanoesferas poliméricas.
A
B
C
D
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 65
FIGURA 23 – Imagens topográficas (A e B) de nanoemulsão obtidas em diferentes campos
por MFA. Área: 20 m x 20 m.
Podemos, então sugerir algumas hipóteses que possam estar contribuindo para o
fenômeno de aumento do diâmetro médio das NCs obtido pela técnica de MFA. O
primeiro, estaria relacionado com a desidratação das partículas durante o processo de
secagem, que induziria posteriormente à agregação das mesmas. É conhecido da
literatura que o processo de desidratação das NCs pela técnica de liofilização,
geralmente leva à ruptura da membrana polimérica das NCs (Chasteigner et al., 1995).
Esse fenômeno, portanto, pode estar também ocorrendo em amostras submetidas a
análise por MFA com maior nível de desidratação. Além disso, em função da espessura
e da continuidade da parede polimérica, as NCs podem apresentar maior ou menor
estabilidade quando depositadas sobre a superfície da mica, ou seja, diferente
capacidade de achatamento em função dessas variações apresentadas pela membrana. O
esquema abaixo (Figura 24) representa os possíveis fenômenos de achatamento, que
poderiam explicar o aumento do diâmetro observado por MFA em nanoemulsão,
nanocápsula e nanoesfera.
A BA B
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 66
FIGURA 24 – Esquema representativo dos possíveis fenômenos que contribuem para o
aumento do tamanho das partículas. A: nanoemulsão (NE) que equivalem a
NC “sem membrana polimérica. Essas partículas quando depositadas sobre
a superfície da mica tendem a se agregar. B: Nanocápsulas constituídas por
um núcleo oleoso envolvido por membrana polimérica com diferentes
espessuras. B 1: parede polimérica descontínua, o que faz com que as
estruturas se comportem como NE. B 2: parede polimérica contínua porém
de espessura fina. B 3: parede polimérica contínua com membrana espessa;
Nas três situações representadas para NC as partículas se deformam,
entretanto, B 2: tendem a se achatar mais se comparada a B 3. C: nanoesfera
com presença de matriz polimérica que confere às partículas maior rigidez,
ausência de deformação e relação diâmetro/altura próxima de 1.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 67
Confirmada a presença de NCs nas preparações, uma fase posterior do estudo
consistiu na realização de experimentos que permitissem evidenciar diferenças entre o
núcleo oleoso e a parede polimérica. A figura 25 (1-4) mostra imagens topográficas (A)
e de contraste de fase (B) de nanocápsulas antes (1 e 3) e após serem submetidas à
pressão da sonda (2 e 4). As nanocápsulas foram analisadas em detalhes e foi observada
uma diferença marcante entre as duas regiões como pode ser visualizado nas figuras. As
nanocápsulas são normalmente estruturas muito estáveis quando submetidas à alta
pressão ou à variação da força de interação sonda-amostra (set point = 0). Nessas
situações, algumas partículas apenas se deformaram (Figura 25-2) curiosamente aquelas
que apresentaram parede polimérica mais espessa, enquanto outras, com parede mais
fina se romperam liberando o material oleoso para o meio externo (Figura 25-4).
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 68
1
2
3
4
FIGURA 25 - Imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas brancas
mostrando diferentes formas: antes (1 e 3) e após (2 e 4) variação da força de
interação sonda-amostra (set point = 0). Área: 1,5m x 1,5m.
A B
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 69
Experimentos realizados com nanocápsulas contendo halofantrino em diferentes
concentrações mostraram que a associação do fármaco não altera a estrutura
arredondada das partículas (Figura 26), entretanto, as amostras apresentaram populações
de partículas com maior polidispersidade se comparada às NC brancas. O diâmetro
médio obtido foi 475 ± 153 nm para as preparações contendo 0,1 mg de Hf e
309 ± 97 nm para as formulações contendo 1,0 mg de Hf/mL de suspensão coloidal. Foi
observado que quanto maior a concentração de halofantrino mais difícil se torna a
aquisição das imagens, as quais são geralmente mais ruidosas. Portanto, no presente
estudo, não foi possível obter imagens de NC contendo 5 ou 10 mg de Hf/mL de
suspensão.
FIGURA 26 - Imagem tridimensional de NC contendo 0,1 mg de Hf/mL de suspensão
coloidal.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 70
De modo geral, as formulações de NC-Hf apresentaram grandes aglomerados,
porém não foi possível afirmar se tais estruturas já estavam presentes na amostra ou se
as mesmas foram decorrentes da possível agregação induzida pelo processo de secagem.
Além disso, pode-se dizer que a natureza fluida das nanocápsulas, responsável
por sua capacidade de deformação, não foi alterada pela presença do Hf, uma vez que
NC-Hf também se achatam quando depositadas sobre a superfície da mica apresentando
uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 10. A maior diferença observada entre
NC-Hf e NC brancas foi a presença de um material ao redor das nanoestruturas,
formando camadas de aproximadamente 10 nm, o que poderia ser atribuído à formas
especiais de organização de Hf ou ao seu excesso na forma de estruturas amorfas
(Figuras 27 A e 27 B). Embora as camadas observadas ao redor das NC sejam
semelhantes àquelas formadas pelo poloxamer (6-8 nm de altura), pode-se sugerir que,
quando misturas complexas dos componentes da formulação (polímero, tensioativo,
fármaco, óleo, etc.) estão presentes, o fármaco pode se associar a elas formando
camadas com alturas variadas, o que torna a visualização ainda mais complexa. Essa
hipótese pode ser ainda suportada por algumas evidências de medidas potencial zeta
(Tabela 2) que sugerem uma provável associação do Hf à superfície de NC
( = +10,9 mV para 10,0 mg/mL) quando comparado com potencial zeta de NC branca
( = -26,7 mV), devido a contribuição de moléculas positivamente carregadas de Hf
base livre.
Resultados e Discussão: Parte 1
Elaine Amaral Leite 71
FIGURA 27 – Imagens de nanocápsulas contendo halofantrino 0,1 mg/mL (A) e 1,0 mg/mL
(B) mostrando a presença do material ao redor das partículas.
Área: 10 m x 10 m.
A
B
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 73
1. DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL AGUDA (DL50)
Inicialmente, os experimentos in vivo realizados no presente estudo foram
conduzidos para a determinação da dose máxima tolerada (DMT) por via i.v. utilizando-
se doses iniciais de 100 mg/kg de Hf livre ou encapsulado. Estudos anteriores
demonstraram que a dose letal de Hf para 50% dos animais (DL50) administrada por via
oral e intraperitoneal foi respectivamente 3,40 e 2,05 g/kg para o modelo rato e 2,80 e
2,50 g/kg para o modelo murino (Karbwang & Bangchang, 1994). Brocks & Toni
(1999) avaliando a farmacocinética do Hf em ratos verificaram que a concentração
máxima do fármaco na corrente sanguínea, após a administração oral de 14,0 mg/kg, foi
1,420 g/mL (cerca de 0,03%). Mosqueira et al. (2004) avaliando o Hf na forma
vetorizada em modelo murino, observou um aumento da DMT de 30 para
100 mg/kg/dia quando o Hf se encontra na forma encapsulada.
Nesse estudo, durante o período experimental (24 h), os efeitos avaliados foram
grooming, ataxia, alterações da freqüência respiratória, tremores, alterações de postura e
locomoção, convulsão e morte (Tabela 3). O grupo de animais que recebeu por via i.v. a
solução de Hf.HCl apresentou alteração de freqüência respiratória, ataxia intensa com
dificuldade de locomoção e, nas doses superiores a 150 mg/kg/dia, convulsão e morte.
Entretanto, no grupo que recebeu NC-Hf foi observado apenas efeitos de grooming,
movimentos de coceira e tremores pouco intensos, mesmo para as doses mais altas
avaliadas (300 mg/kg), sugerindo uma redução dos efeitos tóxicos do Hf após
encapsulação. Para os animais que receberam NC e DMA/PEG foram observados
efeitos de grooming e tremores de curta duração logo após a aplicação i.v. das soluções,
em todos os volumes administrados, sugerindo que a ocorrência de tais efeitos, de
toxicidade pouco relevante, não se deve ao Hf, mas provavelmente aos veículos
utilizados. Como grupo controle absoluto do presente estudo, foram utilizados animais
submetidos às mesmas condições, que receberam volumes de solução salina 0,9%
equivalentes àqueles administrados para as soluções de Hf. Nenhuma alteração
comportamental ou morte foi observada nesses animais.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 74
Tabela 3- Alterações comportamentais e morte observadas nos animais tratados com
as diferentes formulações de Halofantrino.
Dose
(mg/kg) Hf.HCl NC-Hf
100 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (-), † (0/6) 1 (+), 2 (+), 3 (-), 4 (-), 5 (-), † (0/6)
150 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (++), † (3/8) 1 (+), 2 (+), 3 (-), 4 (-), 5 (-), † (0/6)
200 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (+++), † (8/8) 1 (+), 2 (+), 3 (+), 4 (-), 5 (-), † (0/8)
225 nd 1 (++), 2 (++), 3 (+), 4 (-), 5 (+), † (1/6)
250 nd 1 (+), 2 (++), 3 (+), 4 (+), 5 (++), † (5/8)
300 nd 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (++), †(6/6)
1- grooming; 2- tremor/coceira; 3- freqüência respiratória; 4- ataxia; 5- convulsão; † morte; nd = não
determinado, (-) ausência de efeito; (+) efeito leve; (++) efeito moderado; (+++) efeito intenso.
No grupo de animais que recebeu Hf.HCl foi observado 100% de morte (DL100)
com a dose de 200 mg/kg e o tempo médio de morte observado foi de 30 min. A DL100
para o grupo de animais que recebeu NC-Hf foi de 300 mg/kg, com um tempo médio de
morte de 1 h e 30 min. Utilizando-se as doses administradas de Hf.HCl e de NC-Hf
(Tabela 3) versus o número de óbitos para cada dose foi construída a curva de DMT, a
partir da qual foi obtida a reta de regressão linear e a equação que permitiu calcular a
dose letal para 50% dos animais (Figura 28). A DL50 calculada para o grupo Hf.HCl foi
de 154,0 mg/kg e para o grupo NC-Hf foi de 249,0 mg/kg. Os resultados indicaram que
ocorre um aumento da taxa de mortalidade de maneira dose-dependente para todas as
formulações de Hf avaliadas. Entretanto, a encapsulação do Hf levou à redução da
toxicidade do fármaco in vivo, uma vez que a DL50 foi aumentada em mais de 60%.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 75
FIGURA 28 – Dose letal aguda (DL50) determinada após administração i.v. de halofantrino
livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar machos (n = 6 ou 8
animais, conforme identificado na tabela 3).
2. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE ATÉ 30 MINUTOS APÓS A
ADMINISTRAÇÃO DAS FORMULAÇÕES DE HALOFANTRINO
A primeira avaliação das alterações dos parâmetros cardiovasculares, indicativas
de cardiotoxicidade, foi realizada em animais anestesiados pelo tiopental sódico por um
período de 30 min após a administração i.v. do Hf em diferentes formulações. Os
parâmetros extraídos do traçado do ECG incluíram os intervalos QT, RR, PR, QRS e
foram analisados conforme apresentado na figura abaixo (Figura 29). Valores de
pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) também foram obtidos a partir do
sinal de PA.
y = 1,0417x - 209,04
R2 = 0,9665
y = x - 104,03
R2 = 0,9809
0
25
50
75
100
50 100 150 200 250 300
Dose (mg/kg)
Po
rcen
tag
em
de m
orte
em
24
ho
ra
s Hf-HCl
NC-Hf
y = 1,0417x - 209,04
R2 = 0,9665
y = x - 104,03
R2 = 0,9809
0
25
50
75
100
50 100 150 200 250 300
Dose (mg/kg)
Po
rcen
tag
em
de m
orte
em
24
ho
ra
s Hf-HCl
NC-Hf
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 76
FIGURA 29 – Traçado do ECG e PA de um rato Wistar, obtido durante o período controle,
apresentando os parâmetros analisados (QT, PR, RR, QRS, PAS e PAD).
O registro do ECG e PA, antes e após administração i.v. das formulações em um
animal representativo do grupo que recebeu 150 mg/kg de Hf livre e em um animal que
recebeu a mesma dose de Hf encapsulado está apresentado na figura 30 (A e B,
respectivamente). O fármaco livre induziu a alterações mais pronunciadas do ECG, com
bradicardia intensa, bem como alterações da PA quando comparado à mesma dose do
fármaco encapsulado. Os valores absolutos dos parâmetros analisados em todos os
tempos de observação de um animal representativo do grupo Hf.HCl submetido a
administração i.v. de 150 mg/kg do Hf, estão apresentados em anexo (no anexo I). Tais
análises foram realizadas para todos os animais de todos os grupos.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 77
FIGURA 30 – Registro do ECG e da PA, de animais representativos dos grupos que
receberam 150 mg/kg de Hf.HCl (A) e NC-Hf (B), obtidos antes e após
administração do fármaco.
Hf.HCl
Antes Depois
NC-Hf
Antes Depois
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
60
120
180
Tempo (s)
PA
(m
mH
g)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
60
120
180
Tempo (s)
PA
(m
mH
g)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
60
120
180
Tempo (s)
PA
(m
mH
g)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
60
120
180
Tempo (s)
PA
(m
mH
g)
A
B
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 78
Os resultados demonstraram que o Hf.HCl, administrado em ambas as doses
(100 e 150 mg/kg) induziu a alterações significativas dos parâmetros analisados
(Tabela 4). As respostas avaliadas estão apresentadas na Tabela 4 como a média dos
valores absolutos dos respectivos parâmetros analisados. Os intervalos QT e PR do
ECG e a freqüência cardíaca foram os parâmetros que sofreram maiores alterações
com a administração do Hf em diferentes formulações.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 79
Tabela 4 – Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e
parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a
administração i.v. de halofantrino livre ou encapsulado.
100mg/kga
150mg/kgb
Parâmetros Tempo (min)
Hf.HCl NC-Hf Hf.HCl NC-Hf
Frequência Cardíaca (bpm)
0 5 15 25
376 14,7 258 18,3 210 21,1 204 17,7
359 21,2 312 19,1** 280 17,3** 261 16,2**
289 21,3 168 8,9 107 8,7 091 5,3
247 17,0 221 19,5** 194 24,7** 174 29,1**
PA Sistólica (mmHg)
0 5 15 25
116 4,8 072 3,4 081 3,2 085 2,5
122 7,5 094 5,8* 094 3,8* 095 4,0
124 8,8 069 5,5 068 6,2 073 6,1
130 11,9 113 15,0** 099 16,0* 098 17,7
PA Diastólica (mmHg)
0 5 15 25
082 3,5 027 2,4 038 3,3 043 1,9
083 4,8 050 4,0** 051 2,8* 053 3,4*
089 8,2 018 2,0 017 3,1 018 1,3
091 7,9 068 14,2**
061 13,8**
057 13,8*
QT (ms) 0 5 15 25
072 1,7 089 2,8 090 3,1 091 3,1
073 0,9 077 1,1** 079 1,0**
080 0,9**
082 4,4 114 7,8 122 8,7 122 14,2
070 2,7 074 3,6**
075 3,6** 075 3,9**
QTc (ms) 0 5 15 25
132 2,7 144 3,4 136 3,4 135 2,6
133 2,3 134 2,8** 134 3,5 131 3,0
148 6.6 171 9.3 158 9.0 159 10.4
127 3.7 130 5.2 124 4.8 119 5.3
PR (ms) 0 5 15 25
052 2,1 072 4,3 074 4,6 074 5,5
053 3,1 060 2,7**
063 1,8** 067 4,2**
058 3,0 081 7,9 097 12,2 114 19,2
051 3,0 058 3,9** 061 4,6** 063 5,5**
QRS (ms) 0
5 15 25
030 1,1 038 1,8 036 1,2 034 1,1
028 1,8 028 1,1** 030 1,3** 030 1,2**
027 1,2 037 1,6 035 2,1 033 13,0
023 1,1 025 1,1**
025 1,1* 025 1,0**
Os valores representam a média + erro padrão da média. a (n=6) e b (n=8) indicam o número de
animais viáveis nos diferentes grupos. * e ** indicam diferenças significativas P < 0,05 e P < 0,001,
respectivamente, entre grupos de Hf livre e encapsulado nas mesmas doses.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 80
Os dados apresentados na figura 31 A mostram que ambas as doses de Hf.HCl
administradas induziram a aumentos imediatos e significativos do intervalo QT em
relação ao período controle, com alteração máxima de 28%, 10 min após injeção, para a
dose de 100 mg/kg, e de 54%, 30 min após a administração da dose de 150 mg/kg. No
entanto, nos animais que receberam NC-Hf, a alteração máxima observada para o
intervalo QT foi da ordem de 9% em ambas as doses administradas. Não foi observada
alteração significativa do intervalo QT nos grupos controle (NC branca e DMA/PEG)
após a administração, durante os 30 minutos analisados. Diante disso, pode-se dizer que
o Hf.HCl livre induziu ao prolongamento dose-dependente do intervalo QT, nas doses
estudadas, sendo observados aumentos crescentes durante o período analisado para
ambas as doses (100 e 150 mg/kg). Entretanto, este prolongamento foi
significativamente (P < 0,002) reduzido quando o Hf foi administrado como NC-Hf,
observando-se 77% e 86% de proteção cardíaca, avaliada por variação do interalo QT,
5 min após a administração do fármaco encapsulado nas doses de 100 e 150 mg/kg,
respectivamente. Dessa forma, os resultados sugerem que quanto maior a dose utilizada
maior a proteção conferida pela encapsulação. A administração de NC-Hf além de
alterar significativamente o perfil de resposta comparado ao fármaco livre, não induziu
ao prolongamento do intervalo QT de maneira dose-dependente, para as doses
estudadas. (Figura 31 A e Tabela 4).
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 81
FIGURA 31 - Cinética de variação do intervalo QT (A) do ECG e do QT corrigido pelo
intervalo RR (QTc) (B) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental
sódico, após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e
150 mg/kg (n = 8) e dos veículos (NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes
correspondentes à dose de 150 mg/kg.
-15
-5
5
15
25
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
çã
o d
o Q
Tc (
%)
Hf-HCl (100mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100mg/kg) NC-Hf (150 mg/kg) NC branca
-20
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
ção
do
In
terv
alo
QT
(%
) .
A
B
-15
-5
5
15
25
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
çã
o d
o Q
Tc (
%)
Hf-HCl (100mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100mg/kg) NC-Hf (150 mg/kg) NC branca
-20
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
ção
do
In
terv
alo
QT
(%
) .
A
B
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 82
Estudos anteriores utilizando outros modelos animais, como cobaias e coelhos,
demonstraram claramente a capacidade do Hf em induzir ao prolongamento do intervalo
QT in vivo em animais anestesiados e in vitro em coração isolado de cobaia (Batey et
al., 1997). Embora o modelo rato já tenha sido utilizado para estudos da toxicidade
geral e dos parâmetros farmacocinéticos do Hf (Karbwang & Bangchang, 1994; Brocks
& Toni, 1999; Brocks et al., 2000), a avaliação específica das alterações do intervalo
QT do ECG induzido por esse fármaco neste mesmo modelo foi apresentado pela
primeira vez no presente trabalho.
O intervalo QT do ECG é um índice bastante utilizado em clínica e representa o
tempo necessário para a despolarização e repolarização dos ventrículos. Seu
prolongamento é considerado um fator predisponente para a ocorrência de arritmias
cardíacas associadas ao risco de morte súbita (Tan et al., 1995). Desde 1993, vários
estudos têm demonstrado alterações eletrocardiográficas e arritmias ventriculares
severas em pacientes tratados com Hf (Nosten et al., 1993, Krishna et al., 1993; Matson
et al., 1996; Olivier et al., 1999; Abernethy et al., 2001; Bindschedler, et al., 2002).
Recentemente, estudos realizados em miócitos ventriculares isolados de felinos
demonstraram que o mecanismo de cardiotoxicidade do Hf é baseado na inibição dos
canais de potássio, responsáveis pelo processo de repolarização ventricular.
Provavelmente, o Hf retarda a ativação dos canais rápidos de K+ (IKr) (Wesche et al.,
2000), induzindo à arritmias ventriculares e ao prolongamento do intervalo QT. Tie et
al. (2000) também observaram que o Hf bloqueia um canal correspondente aos canais
rápidos dos felinos, os canais de K+ do tipo HERG, expresso em células de ovário de
hamster.
No presente estudo, entretanto, o principal objetivo foi estudar os efeitos
farmacológicos do Hf após encapsulação em nanocápsulas sobre o coração em geral,
presumindo-se que o mecanismo de cardiotoxicidade não tenha sido alterado, uma vez
que a molécula do Hf não foi alterada, mas apenas o perfil de distribuição do Hf tenha
sido modificado pela encapsulação. Os resultados aqui apresentados demonstraram
claramente os efeitos de Hf livre comparado ao NC-Hf em ratos, observando-se uma
redução significativa das alterações dos parâmetros do ECG, indicativos de
cardiotoxicidade, com o uso da formulação encapsulada dentro do período de
observação de 30 minutos.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 83
Segundo Jayasinghe & Kovoor (2002) vários fatores podem influenciar o
intervalo QT tais como o sexo, a idade, a freqüência cardíaca, a atividade simpática e a
derivação do ECG avaliada. No entanto, a fim de minimizar tais influências, em todos
os experimentos foram utilizados animais do sexo masculino, com idade entre 12 e 16
semanas, peso médio de 250 g e, todos os registros foram obtidos na derivação DII.
Comumente, é necessário corrigir o efeito da freqüência cardíaca para possibilitar uma
comparação desse parâmetro entre ciclos cardíacos com valores de RR diferentes. Para
isso, têm sido utilizadas equações matemáticas que permitam corrigir o intervalo QT.
Segundo Abernethy et al. (2001), o QT pode ser corrigido pela fórmula de Fridericia
(QTc = QT/RR1/3
) para RR<500 ms ou pela fórmula de Bazzett (QTc = QT/RR1/2
) para
RR>500 ms. Touze et al. (2002) afirmaram que embora a fórmula de Bazzett seja
comumente utilizada, o intervalo QT pode ser superestimado ou subestimado em ciclos
cardíacos curtos e longos, respectivamente. Portanto, como no presente trabalho, sempre
foram encontrados valores de RR menores que 500 ms utilizou-se a fórmula de
Fridericia para correção do intervalo QT.
A análise dos dados corrigidos pela fórmula de Fridericia (QTc) mostrou que o
Hf livre administrado na dose de 100 mg/kg induziu a alterações do QTc
estatisticamente significativas (P < 0,05) de 0,5 a 2 min e de 4 a 15 min após injeção,
quando comparada à mesma dose de NC-Hf (Figura 31 B). O NC-Hf não induziu a
nenhuma alteração do QTc durante os 30 min experimentais, quando comparada à
formulação controle. As alterações observadas no grupo de animais que recebeu o
fármaco livre se devem, provavelmente, à acentuada bradicardia induzida por altas
doses do Hf. O efeito de bradicardia foi anteriormente relatado em pacientes com
malária que receberam Hf por via parenteral por Krishna et al. (1993).
Em relação ao intervalo PR, parâmetro que representa o tempo necessário para a
despolarização atrial e a condução do impulso através do nódulo atrioventricular, foi
observado que o Hf.HCl induziu a alterações semelhantes às verificadas para o intervalo
QT. A análise demonstrou uma variação máxima do intervalo PR, em relação ao
período controle, de 38% em 30 min e 87% em 25 min após a administração de
100 mg/kg e de 150 mg/kg Hf.HCl, respectivamente. No grupo de animais que recebeu
NC-Hf foi observada uma redução significativa (P < 0,05) das alterações do intervalo
PR, sendo da ordem de 23% e 21%, para as doses de 100 mg/kg e 150 mg/kg,
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 84
respectivamente, ambos verificados 25 minutos após a administração do fármaco. O
grupo de animais que recebeu o fármaco encapsulado não apresentou diferença
significativa em relação ao grupo controle, cujas alterações observadas também foram
da ordem de 9% (Figura 32 A). Os resultados demonstraram que, em relação ao PR, a
proteção cardíaca conferida, 5 min após a administração de 100 e 150 mg/kg de NC-Hf
foi de 67% e 71%, respectivamente.
Batey et al. (1997) avaliando os efeitos do Hf em cobaias observou variações do
intervalo PR, 2 horas após a administração de 30 mg/kg, sugerindo bloqueio de canais
de Ca2+
. Entretanto, em um estudo realizado em coelhos com o objetivo de avaliar a
atividade pro-arrítmica do Hf, Batey & Coker (2002) não encontraram alterações
significativas do intervalo PR quando esse fármaco foi administrado nas doses de 6 a
60 mol/kg. Krishna et al. (1993), em estudo clínico de uma formulação parenteral de
Hf também não observou alterações significativas do intervalo PR do ECG. Contudo, os
resultados do presente estudo demonstraram aumentos significativos do intervalo PR
imediatamente após a administração do fármaco livre quando comparado ao veículo.
Provavelmente, esse efeito observado em nossos experimentos é decorrente das altas
doses utilizadas, muito próximas às doses letais, as quais objetivaram uma melhor
visualização dos efeitos tóxicos do fármaco e sua possível redução após associá-lo a
carreadores coloidais como as nanocápsulas.
À análise do complexo QRS, representado na figura 32 B, foi verificado um
aumento desse intervalo, imediatamente após injeção, com um pico de variação máxima
de 29% em 7 min e de 43% em 6 min nos animais submetidos à administração de
100 mg/kg e 150 mg/kg de Hf.HCl, respectivamente. Já nos animais submetidos à
administração de NC-Hf esse aumento foi significativamente diferente (P < 0,001) com
um pico de variação máxima de 10% em 30 min e de 8% em 15 min após a
administração de 100 mg/kg e 150 mg/kg, respectivamente. Não houve diferença
significativa do complexo QRS após administração de NC contendo Hf comparada com
ao grupo controle. Entretanto, o QRS do grupo que recebeu Hf.HCl quando comparado
ao veículo DMA/PEG foi significativamente diferente, sugerindo, portanto, que o
prolongamento do QRS é conseqüência do Hf e não dos solventes utilizados.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 85
Segundo Batey & Coker (2002) aumentos significativos nos intervalos PR e
QRS podem sugerir redução das correntes de Na+ e Ca
2+ através dos respectivos canais
iônicos. Pode-se inferir, portanto, que o Hf, administrado em altas doses também
induziu ao bloqueio de tais canais em ratos, uma vez que as alterações dos parâmetros
acima mencionados foram significativas.
FIGURA 32 - Cinética de variação do intervalo PR (A) e do complexo QRS (B) de ratos
Wistar machos anestesiados com tiopental sódico, após administração i.v.
Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e 150 mg/kg (n = 8) e dos veículos
(NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes correspondentes à dose de
150 mg/kg.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
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S (
%)
Hf-HCl (100 mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100 mg/kg) NC-Hf (150mg/kg) NC branca
A
B
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Tempo (min)
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Tempo (min)
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rv
alo
QR
S (
%)
Hf-HCl (100 mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100 mg/kg) NC-Hf (150mg/kg) NC branca
A
B
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 86
As duas doses de Hf livre utilizadas, induziram à redução marcante, imediata e
significativa da pressão arterial (PAS e PAD) em relação ao grupo controle, sendo
menor a redução observada com 100 mg/kg (Figura 33 A e B). Os níveis pressóricos
atingidos se mantiveram reduzidos, observando-se ligeira recuperação após 10 min,
entretanto sem a completa recuperação aos níveis basais até 30 min de observação. Não
foi observada diferença significativa desses parâmetros entre os grupos que receberam o
fármaco livre nas doses de 100 e 150 mg/kg. A administração de NC-Hf também
induziu à redução da PAS e da PAD, entretanto a redução ocorreu gradualmente,
mantendo níveis pressóricos compatíveis com a sobrevivência do animal. Ao analisar os
grupos de animais que receberam 100 mg/kg de Hf.HCl ou 100 mg/kg de NC-Hf pôde-
se observar uma alteração significativa (P < 0,01) da PAS até 8 min após a
administração do fármaco, enquanto que para a PAD houve diferença significativa até
25 min após a administração. Já os grupos que receberam 150 mg/kg de Hf.HCl ou NC-
Hf pôde-se verificar que os valores de PAS mostraram-se significativamente diferentes
até 15 min após a administração, enquanto para a PAD essa diferença (P < 0,001) se
manteve até os 30 min após injeção. A proteção conferida pela encapsulação, 5 min
após a administração de 100 e 150 mg/kg, foi cerca de 40% e 70% para a PAS e de 41%
e 68% para a PAD.
Em relação à FC, o perfil apresentado na figura 32 C demonstra que todas as
formulações de Hf induziram à bradicardia significativa, sendo essa mais intensa para o
grupo que recebeu o fármaco livre na dose de 150 mg/kg. A redução da FC foi
progressiva ao longo do período experimental de 30 min, sem retornar aos valores
basais. Comparando os grupos que receberam a mesma dose de diferentes formulações
foi observada diferença significativa (P < 0,01) em todos os pontos analisados e a
proteção conferida pelas nanocápsulas em relação à FC foi de 58% e 75% para as doses
de 100 e 150 mg/kg, respectivamente.
Nossos resultados estão em acordo com Batey et al. (1997) que também
demonstraram o aparecimento de uma bradicardia progressiva, entretanto
diferentemente dos nossos dados, tais autores não observaram nenhuma alteração na
pressão arterial sistólica e diastólica. Uma resposta diferente em relação à FC era
esperada em nossos experimentos, uma vez que a queda da pressão arterial induziria à
taquicardia reflexa, pelo menos num primeiro momento, e não bradicardia como foi
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 87
observado ao longo dos 30 min de experimentação. Esse efeito é provavelmente
causado pela toxicidade do Hf ao nível do nódulo sinoatrial, a qual pode ser reforçada
pelo efeito observado no intervalo PR. Pode-se sugerir, portanto, que essa toxicidade
esteja mascarando o efeito reflexo de taquicardia. Além disso, cabe ressaltar ainda que o
presente estudo foi conduzido utilizando-se altas doses do fármaco e sendo o Hf, um
fármaco altamente lipofílico, poderíamos supor que estaria atuando tanto no controle
periférico como ao nível central do controle da PA. Dessa forma a hipotensão e a
bradicardia observadas podem estar relacionadas às altas doses de Hf administradas.
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 88
FIGURA 33 - Cinética de variação da pressão arterial sistólica (A) e diastólica (B) e da
freqüência cardíaca (C) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental
sódico, após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e
150 mg/kg (n = 8) e dos veículos (NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes
correspondentes à dose de 150 mg/kg.
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Hf-HCl (100 mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100 mg/kg) NC-Hf (150mg/kg) NC branca
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0 5 10 15 20 25 30 35Tempo (min)
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(%)
Hf-HCl (100 mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60
NC-Hf (100 mg/kg) NC-Hf (150mg/kg) NC branca
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A
B
C
Resultados e Discussão: Parte 2
Elaine Amaral Leite 89
As alterações máximas de todos os parâmetros avaliados, induzidas pelo Hf
livre ou encapsulado, durante os 30 min de avaliação, estão representadas na figura 34.
FIGURA 34 - Comparação da porcentagem de variação máxima dos intervalos QT, PR, QRS
e QTc (A), PAS, PAD e FC (B) até 30 min após a administração de 100 ou
150 mg/kg de halofantrino livre e encapsulado, em ratos Wistar machos
anestesiados com tiopental sódico.
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QT PR QRS QTc
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PAS PAD FC
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Hf.HCl 100mg/kg NC-Hf 100mg/kg
Hf.HCl 150mg/kg NC-Hf 150mg/kg
A
B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 90
PARTE 3:
Avaliação da
Cardiotoxicidade
a longo prazo
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 91
1. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A LONGO PRAZO
Posteriormente à avaliação da cardiotoxicidade em 30 min após a administração
de Hf, conforme apresentado no capítulo anterior, foram realizados experimentos com o
objetivo de avaliar se as alterações cardiovasculares observadas para o Hf livre neste
período, seriam observadas num tempo superior a 30 min após a administração do
fármaco encapsulado, ou seja, se a encapsulação continuaria conferindo a mesma
proteção cardiovascular observada durante 30 min, mesmo porque o Hf é um fármaco
que apresenta um tempo de meia vida longo.
Para isso, os experimentos foram conduzidos em diferentes grupos
experimentais, sob anestesia pelo éter etílico. Os sinais do ECG e PA foram obtidos em
grupos de animais e em tempos distintos, a saber, 30 min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas, além
da obtenção dos mesmos sinais antes da administração da NC-Hf para todos os animais
(período controle). A análise em 30 min após a administração foi realizada novamente
com o objetivo de verificar a homogeneidade dos resultados obtidos entre os animais
que receberam diferentes anestésicos, ou seja, éter etílico ou tiopental sódico. A
comparação entre os grupos de animais que receberam 150 mg/kg de NC-Hf sob o
efeito dos diferentes anestésicos está apresentada na tabela 5.
Tabela 5: Variação percentual dos parâmetros do ECG e PA 30 min após a
administração de NC-Hf (150 mg/kg) em animais anestesiados pelo tiopental
sódico ou pelo éter etílico
% Variação
Parâmetros Tiopental sódicoa
Éter etílicob
Valor de P
QT 9,3 2,4 13,1 1,6 0,322
PR 21,1 5,9 -0,3 1,2 0,038*
QRS 9,8 1,6 18,7 5,8 0,095
QTc -6,6 4,0 -1,3 2,9 0,227
FC -40,9 7,5 -27,9 4,8 0,294
PAS -28,3 6,1 -9,9 5,6 0,150
PAD -46,4 9,0 -14,3 0,4 0,009*
Os dados estão apresentados como a média erro padrão da média. a n=8 e
b n=4. * indica
diferença significativa entre os grupos (t Student).
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 92
Os resultados demonstraram que as alterações dos parâmetros cardiovasculares
analisadas frente aos diferentes anestésicos utilizados não foram significativamente
diferentes, exceto para o intervalo PR e PAD. Considerando que o intervalo PR
representa a despolarização atrial, podemos supor que o tiopental sódico, fármaco
barbitúrico e que induz à depressão geral do sistema nervoso central (Goodman &
Gilman, 2001), induziu, quando associado ao halofantrino à depressão da atividade
marcapasso cardíaca, o que não foi observado com o éter etílico.
Tal resultado, no entanto, não compromete os resultados descritos no capítulo
anterior, visto que foram observadas diferenças significativas entre as respostas
induzidas pelas diferentes formulações de Hf administradas (Hf.HCl e NC-Hf). Além
disso, as variações dos parâmetros foram calculadas para cada animal com relação ao
período antes e após administração do fármaco, período no qual os animais se
encontravam sob a mesma anestesia. Sendo assim a influência do anestésico no cálculo
da variação pode ser excluída. Para os outros parâmetros avaliados, os resultados
apresentados na tabela acima se mostraram estatisticamente equivalentes entre os dois
grupos. Deste modo, consideramos que não houve influência do anestésico nos
resultados analisados a curto prazo e a longo prazo. Assim sendo, seguiu-se a avaliação
dos demais tempos após a administração, sob a anestesia pelo éter etílico, pois desta
maneira, foram conduzidos os experimentos sem que fosse necessário a traqueostomia
dos animais e utilizando-se da anestesia apenas nos momentos de cirurgia e de registro,
ou seja, com menor tempo de ação do anestésico. A literatura sobre os efeitos do éter
etílico é muito escassa e sua utilização é geralmente restrita à eutanásia de animais em
decorrência de ser um produto inflamável (Hedenqvist & Hellebrekers, 2003)
As respostas dos parâmetros nos diferentes grupos estão apresentadas abaixo em
valores absolutos (Tabela 6). O intervalo QT e a freqüência cardíaca foram os
parâmetros que apresentaram maiores variações no período de 48 horas.
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 93
Tabela 6 - Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e parâmetros eletrocardiográficos
avaliados, em diferentes tempos, antes e após a administração i.v. de150 mg/kg de halofantrino encapsulado.
Tempo
(horas)
QT
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
QTc
(ms)
FC
(bpm)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,5 A 80 3 60 4 40 1 143 5 343 9 126 8 84 4
B 91 3* 57 3 43 2 145 1 247 17* 114 14 72 3
1 A 80 3 60 4 40 1 143 5 343 9* 126 8 84 4
B 106 2*** 60 4 45 2* 164 6 221 28* 96 11 63 6
2 A 76 3 54 1 33 2 143 5 408 7 125 3 85 2
B 120 11* 65 2*** 39 1*** 189 18* 233 8* 109 5 68 5***
4 A 88 7 59 2 34 1 156 12 341 11 119 5 82 2
B 109 8 65 3 37 2 173 12 241 6*** 115 2 79 7
8 A 75 3 59 2 34 1 139 4 386 15 122 4 82 3
B 86 2** 54 1 34 1 156 3* 363 13 130 4 95 3*
24 A 87 7 57 1 34 1 160 10 377 18 129 4 88 4
B 110 5* 57 2 43 2 193 6 324 17 115 3 75 3
48 A 82 3 59 1 35 1*** 150 5* 370 15* 123 4* 85 4*
B 93 5 54 1* 48 4** 171 7* 387 20 117 5 78 5
Os valores estão apresentados como a média erro padrão. * (P < 0,05), ** (P < 0,01) e ***(P < 0,001) indicam diferença significativa dos valores
absolutos entre o período controle e o tempo analisado. A e B representam período controle e tempo após administração do fármaco respectivamente.
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 94
O intervalo QT apresentou aumento significativo em relação ao período controle
(P < 0,05) nos tempos 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas após a administração de 150 mg/kg de
NC-Hf (Tabela 6). O aumento observado em 4 e em 48 horas após a administração não
foi significativo, produzindo um perfil de resposta em duas fases, como pode ser
visualizado mais claramente no gráfico da variação percentual do prolongamento do
intervalo QT (Figura 35). A variação máxima observada inicialmente foi de 58%,
2 horas após a administração, enquanto na segunda fase de aumento significativo esta
foi de 28% em 24 horas. Entretanto, como apresentado na parte 2 de resultados e
discussão, a alteração máxima induzida em 30 min após a administração de Hf.HCl na
dose de 150 mg/kg foi de 54%. Os resultados demonstraram que mesmo após 2 horas,
quando foi o observado o maior aumento do intervalo QT para a administração das
NC-Hf, esse foi equivalente àquele induzido pelo fármaco livre. Os dados
demonstraram ainda que a toxicidade geral induzida pelo Hf encapsulado foi menos
pronunciada, uma vez que os animais se mantiveram vivos durante todo o período de
avaliação (48 horas), ao contrário do observado para o fármaco livre que provocou
morte em 83% dos animais até 30 min após a sua administração.
FIGURA 35 – Cinética de variação do intervalo QT de ratos Wistar machos anestesiados
pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg
de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos até 30 minutos.
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
A B
A B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 95
Resposta semelhante àquela observada para o intervalo QT foi também
verificada para o QTc, o qual apresentou aumento significativo em relação ao período
controle (P < 0,05) nos tempos 2, 8, 24 e 48 horas após a administração de NC-Hf na
dose de 150 mg/kg (Tabela 6). Entretanto, o aumento observado 4 horas após a
administração não foi significativo, produzindo, de maneira semelhante ao intervalo
QT, um perfil de resposta em duas fases, como apresentado na figura 36. O aumento
máximo do QTc induzido pelo Hf encapsulado foi superior àquele induzido pelo
fármaco livre (17%) 7 min após a administração nos animais anestesiados pelo tiopental
(dados apresentados em resultados e discussão, parte 2). Provavelmente, essa maior
variação em relação ao fármaco livre possa ser explicada pela menor bradicardia
induzida pelas NC-Hf. Sabe-se que o índice de Fridericia é inversamente proporcional
ao intervalo RR1/3
, portanto, quanto menor o intervalo RR, maior a variação do QTc. Os
resultados sugerem ainda que as alterações observadas no intervalo QT e QTc a longo
prazo, após administração do Hf encapsulado, são decorrentes da modificação
verificada no perfil de distribuição do fármaco após a encapsulação, uma vez que,
trabalhos anteriores demonstraram que as NC aumentam o tempo de residência do Hf
no compartimento sanguíneo (Mosqueira et al., 2004).
FIGURA 36 – Cinética de variação do intervalo QT corrigido pelo intervalo RR (QTc) de
ratos Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min
até 48h e B em minutos até 30 minutos.
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
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)
A B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 96
Em relação ao intervalo PR, aumentos significativos em relação ao período
controle foram observados nos tempos 2 e 48 horas (Tabela 6). Como observado na
figura 37, o perfil da curva é bastante semelhante aos anteriores (Figuras 35 e 36),
demonstrando uma resposta em duas fases. A variação máxima verificada inicialmente
foi de 20%, no tempo de 2 horas após a administração. Os resultados demonstraram que
para o intervalo PR, a alteração máxima obtida após a administração do fármaco
encapsulado foi inferior àquela induzida pelo fármaco livre, cuja variação máxima foi
de 86% em 25 min após a administração (dados apresentados em resultados e discussão,
parte 2).
FIGURA 37 – Cinética de variação do intervalo PR de ratos Wistar machos anestesiados
pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg
de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos até 30 minutos.
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
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NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
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B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 97
Por outro lado, o intervalo QRS apresentou aumento significativo (P < 0,05) em
relação ao período controle nos tempos 1, 2, 24 e 48 horas, conforme apresentado na
tabela 6. As alterações verificadas nos tempos 4 e 8 horas não foram diferentes em
relação ao período controle. A figura 38 mostra a variação do intervalo QRS durante o
período experimental, podendo ser visualizado inicialmente uma alteração máxima de
20%, 2 horas após a administração e uma segunda fase de aumento significativo, em
24 horas, com uma variação máxima de 26%, atingindo 30% de variação 48 horas após
a administração. Apesar dos aumentos observados para o intervalo QRS, eles também
foram menores quando comparados à alteração de 43% induzida pelo fármaco livre
6 min após sua administração (dados apresentados em resultados e discussão, parte 2).
FIGURA 38 – Cinética de variação do intervalo QRS de ratos Wistar machos anestesiados
pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg
de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos até 30 minutos.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
çã
o d
o I
nte
rv
alo
QR
S (
%)
0
15
30
45
60
75
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Va
ria
ção
do
In
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%)
.
0
5
10
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20
25
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35
40
45
50
-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
çã
o d
o I
nte
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%)
0
15
30
45
60
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Tempo (horas)
Va
ria
ção
do
In
terv
alo
QR
S (
%)
.
A B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 98
Em relação à pressão arterial, foi observada hipotensão inicial, entretanto,
diferenças significativas em relação ao período controle foram verificadas em 2, 8 e
24 horas para a PAD e apenas em 24 horas para PAS. A variação máxima observada foi
de 24% para PAS e 26% para PAD, 1 hora após a administração de 150 mg/kg de NC-
Hf (Figura 39 A e B). Imediatamente após, foi observado aumento gradual e, em 4
horas, os valores pressóricos já tinham se aproximado àqueles observado no período
controle, com variação da PAD de apenas 3%. Os resultados demonstraram que, mesmo
após 1 hora, tempo em que foi observada a alteração máxima, a hipotensão induzida
pelo fármaco encapsulado foi menor que àquela observada para o fármaco livre, cujo
máximo de alteração para PAS foi de 47%, imediatamente após a administração e de
83% para PAD, aproximadamente 12 min após a administração do fármaco (dados
apresentados em resultados e discussão, parte 2). Foi observado ainda que, 24 horas
após a administração de 150 mg/kg de NC-Hf ocorreu uma segunda fase de redução
significativa da PA com alteração de 10 % para PAS e de 15 % para PAD.
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 99
FIGURA 39 – Cinética de variação da pressão arterial sistólica (I) e diastólica (II) de ratos
Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg
de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B
em minutos até 30 minutos.
-30
-15
0
15
30
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Vari
açã
o d
a P
AS
(%
)
.
-100
-80
-60
-40
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0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Varia
ção d
a P
AS
(%
)
-30
-15
0
15
30
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Vari
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(%
)
.
-100
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0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
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ção d
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(%
)
-30
-15
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0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Var
iaçã
o d
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(%
)
.
-100
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Tempo (min)
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%)
0
5
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35
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45
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-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
-30
-15
0
15
30
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Var
iaçã
o d
a P
AD
(%
)
.
-100
-80
-60
-40
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0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
ção
PA
D (
%)
0
5
10
15
20
25
30
35
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45
50
-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
I
II
A B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 100
Na análise da FC foi observado bradicardia intensa e significativa em relação ao
período controle nos tempos de 30 min, 1, 2, 4, 24 e 48 horas (Tabela 6). O aumento
observado em 8 horas após a administração de NC-Hf não apresentou diferença
significativa e, um perfil de resposta em duas fases foi novamente observado
(Figura 40). Assim, a alteração máxima inicial foi de -43% em 2 horas após a
administração do fármaco, enquanto na segunda fase, redução significativa de 14% foi
observada. A alteração máxima induzida pelo Hf.HCl foi de 66%, 30 min após a
administração de 150 mg/kg do fármaco (dados apresentados em resultados e discussão,
parte 2), demonstrando que mesmo 2 horas após a administração de NC-Hf, tempo em
que foi verificado o maior aumento da FC, esse foi inferior ao induzido pelo fármaco
livre.
FIGURA 40 – Cinética de variação da freqüência cardíaca de ratos Wistar machos
anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A),
ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos
até 30 minutos.
-50
-25
0
25
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Vari
açã
o d
a F
C (
%)
.
-70
-60
-50
-40
-30
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0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
ção
da
FC
(%
)
0
5
10
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25
30
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-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
-50
-25
0
25
0 8 16 24 32 40 48
Tempo (horas)
Vari
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o d
a F
C (
%)
.
-70
-60
-50
-40
-30
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0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Va
ria
ção
da
FC
(%
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)
A
B
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 101
Apesar de ter sido verificado aumentos equivalentes para o intervalo QT e QTc
quando o Hf foi administrado como NC-Hf na dose de 150 mg/kg comparado à mesma
dose do fármaco livre até 30 min, foi observado que a alteração máxima ocorreu
somente 2 horas após a administração. No entanto, a toxicidade induzida foi menos
acentuada com o uso das nanocápsulas, uma vez que todos os animais sobreviveram
durante as 48 horas de avaliação, enquanto, os animais que receberam o fármaco livre
morreram durante os 30 min experimentais. Provavelmente, altas doses de Hf como
foram utilizadas no presente estudo, induziram ao bloqueio imediato dos canais de
potássio, o que poderia explicar a variação do intervalo QT. Porém, quando o fármaco é
administrado na forma encapsulada, uma pequena fração se encontra livre na corrente
sanguínea e disponível para associação imediata ao tecido cardíaco. Apenas 2 horas
após, uma maior parte do fármaco é liberada tornando-se disponível para essa
associação, o que resultaria no efeito de prolongamento do QT. Em relação aos outros
parâmetros foi observado que a encapsulação continuou conferindo proteção cardíaca,
uma vez que todas as alterações foram inferiores àquelas induzidas pelo fármaco livre
até 30 minutos. Esse fato poderia explicar a menor toxicidade induzida pelo Hf
encapsulado, observando menor alteração dos parâmetros hemodinâmicos avaliados, ou
seja, pressão arterial sistólica e diastólica. Possivelmente, as variações observadas para a
PAS e PAD, após administração de Hf.HCl, atingem níveis tão baixos que levam o
animal ao choque cardiovascular irreversível, enquanto o mesmo não foi observado com
o uso das NC-Hf.
Além disso, na análise do ECG e da PA foi verificado que em todos os
parâmetros há uma alteração máxima em 1 e em 2 horas e uma segunda fase de aumento
em torno de 24 horas. Esses dados sugerem que provavelmente a alteração inicial é
conseqüência do fármaco liberado das partículas logo após a administração. Essa fração
livre estaria disponível para a associação com lipoproteínas, sendo transportadas para o
tecido cardíaco via receptores de LDL. Como observado por Porter et al., (1996) a
concentração de Hf diminui biexponencialmente após administração, sendo o tempo de
meia-vida de eliminação do fármaco, em ratos, de 11,4 1,4 horas. Possivelmente, a
associação do Hf com o coração ocorre de maneira reversível e, à medida que o fármaco
é metabolizado, a toxicidade cardíaca tende a reduzir como foi observado em nossos
experimentos. Entretanto, sabe-se que as NC convencionais são rapidamente
Resultados e Discussão: Parte 3
Elaine Amaral Leite 102
fagocitadas pelas células do sistema fagocítico mononuclear (Juliano, 1988). Essas
células poderiam estar funcionando como um compartimento “reservatório” para o
fármaco. A liberação do fármaco a partir deste “depósito” poderia explicar o novo
aumento observado em 24 horas para a maioria dos parâmetros analisados. A
farmacocinética do halofantrino encapsulado sugere que o modelo de análise dos dados
seja multicompartimental, o que implica em uma análise dos dados muito complexa e
uma resposta farmacológica também bastante complexa. Na realidade, existem poucos
dados disponíveis sobre a influência da encapsulação sobre a farmacocinética e sobre a
atividade farmacológica dos fármacos para que possamos comparar. Entretanto, estudos
realizados por Mosqueira et al. (2004) para o halofantrino associado à NCs
demonstraram um aumento de aproximadamente seis vezes da área sob a curva AUC
em relação ao fármaco livre, indicando que há realmente um aumento dos níveis
plasmáticos do fármaco no sangue, seja livre ou associado às NC. Este poderia ser o
fator diferencial para a obtenção da resposta farmacológica observada em nossos
experimentos.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 103
PARTE 4:
Avaliação da
Cardiotoxicidade
em animais infectados
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 104
6.3. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE EM ANIMAIS INFECTADOS PELO
Plasmodium berghei
Após avaliar a cardiotoxicidade em animais sadios, foram realizados
experimentos com o objetivo de verificar a contribuição da doença, mais
especificamente a malária, sobre os efeitos cardiotóxicos do Hf, utilizando a mesma
espécie animal, ou seja, ratos Wistar infectados pelo P. berghei.
Dados da literatura demonstraram infecção letal em ratos Fischer de quatro
semanas de idade, quando 107 hemácias parasitadas pelo P. berghei foram inoculadas.
Entretanto, animais de 12 a 16 semanas foram menos sensíveis e desenvolveram
parasitemia primária entre o 12° e 15° dia após infecção, após os quais os níveis de
parasitemia declinaram e a infecção foi eliminada até o 23° dia, sem tratamento (Pierrot
et al., 2003). No presente trabalho, inicialmente, os experimentos foram conduzidos em
ratos Wistar machos, em idade adulta (entre 12 e 16 semanas), objetivando padronizar
um protocolo de infecção nesses animais. Diferentes grupos de animais receberam por
via i.p. diferentes inóculos (106, 10
7, 10
8 e 2 x 10
8 hemácias parasitadas pelo
P. berghei). Os animais foram avaliados por um período mínimo de 15 dias após
infecção e os resultados demonstraram ausência de parasitemia em todos os animais.
Portanto, foi necessário administrar, anteriormente ao inóculo, um agente
imunossupressor, a ciclofosfamida (Oncoly Baxter), com o objetivo de reduzir a
resposta imunológica do animal para permitir que a infecção se estabeleça.
Diferentes protocolos foram utilizados para a padronização da imunossupressão,
uma vez que o objetivo era definir um protocolo que permitisse a imunossupressão
associada à infecção com 100% de sobrevida dos animais, para a posterior realização
dos experimentos. A infecção foi confirmada por esfregaço sanguíneo verificando a
presença do parasita e os níveis de parasitemia.Os resultados dos protocolos utilizados
estão apresentados na tabela 7.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 105
Tabela 7 – Resultados dos protocolos de imunossupressão.
N° do
Protocolo
Infecção Parasitemia
Média (%)a
N° de Animais
Sobreviventes
Tempo Médio de
Sobrevida (dias)
P 1 - - 0/4 Todos mortos no
D5
P 2 - - 0/4 4 (3-5)
P 3 + (1/4) 2,5 0/4 16 (14-19)
P 4 + (2/4) 4,4 0/4 20 (15-25)
P 5 - - 4/4 >30
P 6 - - 0/4 12 (11-14)
P 7 + (4/4) 3,1 4/4 >30
a Valores de parasitemia determinado no 10° dia após infecção. n = 4 em todos os grupos
experimentais. Peso dos animais = 250 50g. O dia da infecção e as doses de ciclofosfamida
administradas estão definidos em “Materiais e métodos”, item 4.3.6.
Provavelmente, os animais dos grupos P 1, P 2 e P 6 que não apresentaram
parasitemia, morreram por causa dos efeitos provocados pela ciclofosfamida, uma vez
que a infecção pelo P. berghei não estava estabelecida a ponto de provocar a morte pelo
aumento da parasitemia. Na determinação do protocolo experimental, quando doses
altas de ciclofosfamida foram utilizadas, em regimes antes e após a infecção,
impediram o estabelecimento da infecção. Entretanto, a utilização de doses mais baixas
e administradas apenas antes da administração do inóculo permitiram o estabelecimento
da infecção em 100% dos animais acompanhada de 100% de sobrevida,
correspondendo, portanto, ao protocolo P 7, ou seja, protocolo de escolha para a
realização dos experimentos posteriores. Os resultados dos parâmetros avaliados nesse
grupo foram a taxa de parasitemia e a alteração do peso corporal e estão representados
na figura 42. A curva de parasitemia apresentou um aumento gradativo nos primeiros
dias após infecção, atingindo um pico máximo de aproximadamente 5% de parasitemia
no 15° dia após infecção (Figura 42 A). Posteriormente, os níveis de parasitemia
reduziram e, a partir do 21° dia após infecção, não foi observada a presença do parasita
no esfregaço sanguíneo. Embora, a linhagem de ratos utilizada e o protocolo do
presente estudo tenham sido diferentes do realizado por Pierrot et al. (2003), os
resultados obtidos em relação a parasitemia foram semelhantes, pois esses autores
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 106
observaram picos de parasitemia entre o 12° e o 15° dia após infecção. Sugiro fazer
uma figura só com dois eixos Y
FIGURA 41 – Curva de parasitemia média (A) e acompanhamento do peso médio (B)
corporal de ratos Wistar macho após imunossupressão com ciclofosfamida e
infecção pelo P. berghei, utilizando o protocolo P 7 com inóculo de 2x107
hemácias de camundongo Swiss, infectado pelo P. berghei. Os resultados
estão apresentados como a média erro padrão da média (n = 4).
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (dias)
Parasi
tem
ia (
%)
Inócu
lo
Adm
inis
traçã
o d
e C
iclo
fosf
am
ida
Inócu
lo
Adm
inis
traçã
o d
e
Cic
lofo
sfam
ida
280
290
300
310
320
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (dias)
Peso
(g)
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (dias)
Parasi
tem
ia (
%)
Inócu
lo
Adm
inis
traçã
o d
e C
iclo
fosf
am
ida
Inócu
lo
Adm
inis
traçã
o d
e
Cic
lofo
sfam
ida
280
290
300
310
320
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (dias)
Peso
(g)
A
B
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 107
Diante dos resultados obtidos, os estudos posteriores para a avaliação da
cardiotoxicidade foram realizados 12° dia após infecção, período em que a parasitemia
estava aumentando, porém, sem atingir o seu máximo.
A parasitemia foi determinada no dia da administração do tratamento com Hf e
os animais do grupo Hf.HCl apresentaram níveis de parasitemia de 4,2% 2,3%, e os
animais do grupo NC-Hf, níveis de 4,8% 2,7%, os quais não foram significativamente
diferentes.
A resposta para os parâmetros avaliados nos diferentes grupos está apresentada
abaixo em valores absolutos, os quais não apresentaram diferenças significativas
quando o Hf foi administrado na forma livre ou encapsulada (Tabela 8).
Tabela 8- Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e
parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a
administração i.v. de100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf em ratos Wistar infectados pelo
P. berghei.
Tempo
(horas)
QT
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
QTc
(ms)
FC
(bpm)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,16 A 104 2 51 1 40 1 177 2 296 13 125 5 56 5
B 91 8 53 3 40 3 165 15 351 20 120 3 64 1
0,5 A 112 13 60 4 44 4 193 11 324 62 123 10 65 2
B 104 6 57 1 41 1 177 9 299 18 108 9 54 7
1 A 110 3 53 2 42 1 180 2 264 18 121 9 56 1
B 108 1 53 1 45 3 185 3 296 15 101 9 54 3
2 A 112 14 56 3 45 4 230 52 324 35 118 6 63 4
B 116 10 68 3 44 1 189 11 259 16 105 7 50 2
8 A 96 7 42 8 41 2 183 15 414 15 121 4 71 2
B 100 4 54 3 43 1 183 7 363 14 121 1 67 3
24 A 97 5 45 4 38 13 182 7 398 14 136 6 87 11
B 91 4 50 3 42 1 169 7 391 16 125 3 76 8
Os valores estão apresentados como a média erro padrão. A e B representam grupos que receberam o
fármaco livre e encapsulado, respectivamente, na dose de 100 mg/kg. n = 4 animais por grupo.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 108
Os dados apresentados na figura 42 A mostram que ambas as formulações de Hf,
Hf.HCl e NC-Hf, induziram a aumentos imediatos e significativos do intervalo QT após
a administração em animais infectados pelo P. berghei. Diferenças significativas
(P < 0,05) entre as formulações foram observadas nos tempos de 10 min e 2 horas. A
variação máxima observada no grupo que recebeu Hf.HCl foi de 36%, 1 horas após a
administração, enquanto a variação máxima observada no grupo que recebeu NC-Hf foi
de 40%, 2 horas após a administração. Embora o prolongamento do intervalo QT
observado em 8 e 24 horas após a administração de NC-Hf tenha sido mais pronunciado
que aquele induzido pelo fármaco livre, provavelmente, nesse período, o fármaco livre
está sendo metabolizado e conseqüentemente eliminado do compartimento sanguíneo.
Apesar das NC convencionais serem rapidamente fagocitadas pelas células do SFM,
segundo Mosqueira et al. (2004), provavelmente, em animais infectados, o SFM é
saturado pela captura dos eritrócitos parasitados e NC convencionais permanecem maior
tempo na corrente circulatória. Esse fato poderia, portanto, explicar o aumento das
variações do intervalo QT induzido pelo NC-Hf, uma vez que as mesmas estariam
liberando mais tardiamente o fármaco no compartimento sanguíneo.
Em relação ao QTc, não foram observadas diferenças significativas entre as duas
formulações administradas. Entretanto, a alteração máxima observada para o grupo que
recebeu Hf.HCl foi de 25%, 2 horas após a administração enquanto para o grupo que
recebeu NC-Hf essa alteração foi de 27%, 8 horas após a administração do fármaco.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 109
FIGURA 42 – Cinética de variação do intervalo QT (A) e do QTc (B) de ratos Wistar machos
infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.
0
15
30
45
60
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Vari
açã
o d
o I
nte
rvalo
QT
(%
) .
0
15
30
45
60
0 4 8 12 16 20 24Tempo (horas)
Vari
açã
o d
o Q
Tc
(%)
.
Hf.HCl NC-Hf
0
15
30
45
60
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Vari
açã
o d
o I
nte
rvalo
QT
(%
) .
0
15
30
45
60
0 4 8 12 16 20 24Tempo (horas)
Vari
açã
o d
o Q
Tc
(%)
.
Hf.HCl NC-Hf
A
B
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 110
A análise do intervalo PR demonstrou uma redução desse parâmetro quando o
Hf foi administrado na forma livre, entretanto, quando o fármaco foi administrado na
forma encapsulada, foi observado um perfil de resposta diferente, verificando aumentos
significativos desse parâmetro. A variação máxima verificada foi de -22%, 8 horas após
a administração de Hf.HCl e de 18%, 2 horas após a administração de NC-Hf (Figura
43 A).
Por outro lado, ambas as formulações de Hf induziram a aumentos imediatos do
intervalo QRS. As alterações máximas verificadas foram de 11%, 1 hora após a
administração do Hf.HCl e de 12%, 8 horas após a administração do NC-Hf (Figura
43 B). Um perfil de resposta semelhante ao intervalo QT foi observado para o QRS, ou
seja, foi observado uma maior variação do intervalo QRS, no tempo de 8 horas, para o
grupo que recebeu NC-Hf em comparação àquele que recebeu Hf.HCl. Esse resultado
sugere que as NC aumentam o tempo de residência do fármaco no compartimento
sanguíneo o que leva à alterações mais pronunciadas em tempos mais tardios.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 111
FIGURA 43 – Cinética de variação do intervalo PR (A) e QRS (B) de ratos Wistar machos
infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.
-30
-15
0
15
30
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
do I
nte
rva
lo P
R (
%)
.
0
5
10
15
20
25
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
do I
nte
rva
lo Q
RS
(%
)
Hf.HCl NC-Hf
-30
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0
15
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0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
do I
nte
rva
lo P
R (
%)
.
0
5
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0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
do I
nte
rva
lo Q
RS
(%
)
Hf.HCl NC-Hf
A
B
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 112
Em relação à pressão arterial, foi observada redução, com variação máxima de
5% para PAS e 30% para PAD, 2 horas e 0,5 hora após a administração de 100 mg/kg
de Hf.HCl, respectivamente. Entretanto, foi observado que a redução máxima induzida
após a administração da mesma dose de NC-Hf, foi de 12% para PAS e 31% para PAD,
2 horas após a administração (Figura 44 A e B). Embora tenham apresentado valores
diferentes, essas alterações foram estatisticamente equivalentes. As alterações
observadas na PAD, 8 e 24 horas após a administração de NC-Hf também foram
superiores àquelas induzidas por Hf.HCl, entretanto as mesmas não apresentaram
diferença significativa.
Na análise da FC foi observado bradicardia intensa imediatamente após a
administração do Hf em ambas as formulações avaliadas, as quais foram
significativamente equivalentes (Figura 44 C). A alteração máxima induzida por Hf.HCl
foi de -19%, 10 min após a administração enquanto, a alteração máxima observada após
a administração de NC-Hf foi de -32%, 2 horas após a administração. Novamente, as
alterações observadas 8 horas após a administração de NC-Hf foram superiores àquelas
induzidas por Hf.HCl.
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 113
FIGURA 44 – Cinética de variação da PAS (A), PAD (B) e da FC (C) de ratos Wistar machos
infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de
100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.
-20
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0
10
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0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
da P
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(%
)
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Tempo (horas)
Va
ria
ção d
a P
AD
(%
)
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Tempo (horas)
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ção
da
FC
(%
)
Hf.HCl NC-Hf
-20
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Tempo (horas)
Va
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ção
da P
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(%
)
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Tempo (horas)
Va
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ção d
a P
AD
(%
)
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0 4 8 12 16 20 24
Tempo (horas)
Va
ria
ção
da
FC
(%
)
Hf.HCl NC-Hf
A
B
C
Resultados e Discussão: Parte 4
Elaine Amaral Leite 114
Em resumo, observa-se que houve um retardo na resposta farmacológica para
muitos parâmetros após a administração do Hf encapsulado, tanto no animal sadio
quanto no infectado. Entretanto, em termos de variação percentual dos parâmetros
analisados, os valores são muito semelhantes o que indica que no animal infectado as
NC estariam disponibilizando o fármaco para interação com as células cardíacas de
maneira muito semelhante à solução de Hf livre.
Se em teoria, a diferença entre as respostas para as formulações no animal sadio
fosse atribuída à acumulação do Hf nanoparticulado em células e órgãos do SFM, a
saturação do SFM seria uma explicação plausível para a ausência de diferença entre as
formulações no animal infectado. Por outro lado, não há como demonstrar, no presente
trabalho, se o fármaco é liberado das NC com velocidades diferentes no animal sadio e
no infectado, o que também poderia ser outra hipótese sugerida para explicar esses
efeitos.
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 116
DISCUSSÃO GERAL
No presente trabalho, todas as formulações de NC brancas e NC contendo Hf
foram preparadas segundo método descrito por Fessi et al. (1989), um método simples e
de fácil execução. O polímero pré-formado, poli--caprolactona, foi escolhido para
preparação das NC-Hf, uma vez que consiste em um produto estável, de baixo custo e
comercialmente disponível apresentando alto grau de pureza. Essas características
permitem, portanto, que a formulação seja facilmente transposta para a escala industrial.
O principal objetivo de utilizar o Hf na forma vetorizada em nanocápsulas foi
evitar complicações previamente observadas após administração parenteral da solução
de Hf.HCl (Krishna et al., 1993). Com base no trabalho desenvolvido por esses autores,
a dose usada em humanos, para tratamento de malária falciparum, é de 1 mg/kg
administrada por infusão durante 1 hora por via i.v. De acordo com a caracterização
realizada no nosso estudo, as formulações mais adequadas para a administração
parenteral seriam aquelas contendo 1 e 10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal. A
primeira formulação poderia ser administrada por infusão utilizando-se um volume de
70 mL para um adulto, enquanto para NC contendo 10 mg de Hf/mL de suspensão
colodial o volume correspondente a dose de 1 mg/kg seria 7 mL, o qual poderia ser
administrado in bolus por via i.v. Portanto, a formulação de escolha para a avaliação in
vivo foi a de 10 mg/mL visto que, em ratos seria possível administrar volumes baixos
por via i.v., prevenindo quaisquer influências nos parâmetros cardiovasculares
analisados.
Em todos os experimentos foram utilizadas NCs contendo Hf com a mesma
carga superficial, ou seja, carregadas positivamente. No entanto, não foi possível
analisar a influência de tal característica na resposta farmacológica. Embora as
formulações controles (sem o fármaco) tenham sido administradas em volumes
correspondentes às doses utilizadas, nenhuma alteração foi observada após sua
administração. Entretanto, deve-se considerar que o potencial de superfície foi
modificado, uma vez que as mesmas apresentaram-se negativamente carregadas.
Um dos principais problemas associado com Hf é sua baixa solubilidade em
água. O Hf é uma substância extremamente lipofílica e embora possa ser dissolvido em
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 117
diversos solventes orgânicos, após a administração i.v. o fármaco tende a precipitar no
meio fisiológico (Batey et al., 1997). Na formulação para administração intravenosa
preparada por Krishna et al. (1993) o Hf.HCl foi dissolvido em
dimetilacetamida/polietilenoglicol (40/60 v/v), diluído posteriormente em glicose 5%,
entretanto essa preparação precipitava rapidamente o que requeria o preparo
imediatamente antes da administração. Além disso, os autores relataram uma
significativa toxicidade local, onde observaram o aparecimento de eritemas associado
ao solvente utilizado. Estudos anteriores demonstraram ainda uma grande variação
interindividual após a administração do Hf por via oral, obtendo-se baixas
concentrações do fármaco e de seu metabólito ativo na corrente sanguínea, as quais
estariam provavelmente relacionadas à causa do insucesso terapêutico observado em
alguns pacientes (ter-Kuile et al., 1993). Diante disso, o desenvolvimento de uma
formulação adequada e segura para a administração i.v. em pacientes com malária
severa é extremamente necessário. Brocks e Betageri (2002) desenvolveram uma
formulação prolipossomal de Hf para administração oral em ratos, obtendo aumentos de
47% da área sob a curva tempo versus concentração plasmática. Mosqueira et al. (2004)
demonstraram em estudos realizados in vivo, em modelo murino, que o Hf encapsulado
em NC mantém sua atividade biológica e quando comparado ao fármaco livre observou-
se um aumento de 6 vezes da área sob a curva. Além disso, Mosqueira et al. (1999)
sugeriu várias evidências (potencial zeta, teor de encapsulação, perfil de liberação) para
confirmar que o Hf estaria verdadeiramente associado às NCs. Nossos resultados
corroboram tais estudos, visto que, apesar de utilizar técnicas distintas para
quantificação de Hf associado às NCs, os resultados foram semelhantes, demonstrando
que aproximadamente 99,8% de fármaco encontra-se associado as partículas,
descartando portanto a necessidade de técnicas de purificação para eliminar a substância
ativa que se encontra livre em solução. Foram encontradas ainda alterações
significativas na carga superficial quando altas concentrações foram associadas ao
sistema, pressupondo que tais alterações sejam decorrentes da presença do Hf
positivamente carregado. A análise por MFA permitiu também distinguir uma nítida
diferença entre NC branca e NC contendo o Hf, através da visualização de um material
ao redor das estruturas.
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 118
Mosqueira et al. (2004) relataram aumento da dose letal do Hf de 30 mg/kg para
100 mg/kg quando o Hf foi administrado como suspensão coloidal de NC em
camundongo infectados pelo Plasmodium berghei, sugerindo uma redução da
toxicidade geral do Hf após encapsulação. Como no presente estudo, as partículas
preparadas foram muito semelhantes às descritas por Mosqueira et al. (2004) esperava-
se uma resposta também similar. Nossos resultados de DL50 demonstraram a redução da
toxicidade. Entretanto, não existiam, até o momento, relatos na literatura que
demonstrasse se essa redução de toxicidade teria como foco o sistema cardiovascular, o
qual foi objeto de estudo do nosso trabalho.
O presente estudo demonstrou claramente que o Hf.HCl provoca um
prolongamento do intervalo QT de ratos e foi reportado aqui, pela primeira vez, que
uma formulação de nanocarreadores poliméricos do tipo NC foi capaz de reduzir a
toxicidade cardíaca induzida pelo fármaco. Segundo Touze et al. (2002), dentre os
antimaláricos eficazes no tratamento de malária, o halofantrino é o mais cardiotóxico
deles. Vários estudos já têm relatado sua capacidade de induzir prolongamento do
intervalo QT em cobaias e coelhos (Batey et al., 1997; Lightbown et al., 2001),
entretanto o prolongamento do intervalo QT induzido pelo Hf no modelo rato foi
observado pela primeira vez nesse estudo.
Nas altas doses estudadas o modelo rato se mostrou adequado, pois possibilitou
observar as diferenças de variação dos parâmetros entre o fármaco livre e encapsulado,
embora animais mais sensíveis para as variações do intervalo QT sejam também
utilizados para estudo da cardiotoxicidade de drogas, em experimentação pré-clínica.
(Crumb & Cavero, 1999). Além disso, não há relatos na literatura de infecção de
cobaias pelo P. berghei o que impossibilitaria o estudo da contribuição da doença
(malária) na cardiotoxicidade do halofantrino na mesma espécie animal. Janse et al.
(1989) demonstraram que eritrócitos de coelhos e cobaias são resistentes à infecção pelo
P. berghei.
Os experimentos para avaliação da cardiotoxicidade em curto período de tempo,
realizados em animais sadios anestesiados, demonstraram a ocorrência de um efeito
dose-dependente sobre o intervalo QT do ECG quando altas doses de Hf foram
utilizadas, confirmando achados de trabalhos anteriores (Batey et al., 1997).
Provavelmente, como observado em cobaias anestesiados, no rato altas doses de Hf
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 119
levaram ao bloqueio de canais de K+, responsáveis pelo processo de repolarização
cardíaca. Entretanto, a encapsulação reduziu significativamente as alterações do QT em
ambas as doses utilizadas, demonstrando a capacidade das NCs em reduzir a
cardiotoxicidade, conferindo maior proteção cardíaca. Foi verificado que, até 30 min
após a administração do fármaco, quanto maior a dose utilizada, maior a proteção
conferida pela encapsulação. Entretanto, avaliando um efeito mais tardio, até 24 horas
após administração de NC-Hf em altas doses (150 mg/kg), foi demonstrado uma maior
variação do intervalo QT, atingindo níveis semelhantes aos induzidos pelo fármaco livre
até 30 min. Isso sugere que as NCs aumentam o tempo de residência do fármaco no
compartimento sanguíneo e que, mesmo a longo prazo, continuam conferindo proteção
cardíaca, induzindo uma toxicidade menos pronunciada, uma vez que todos os animais
sobrevivem durante as 48 horas experimentais.
Em relação aos outros parâmetros do ECG analisados, alterações
significativamente menores foram induzidas pelo Hf associado à NC quando comparado
ao Hf livre. Além disso, variações significativas da pressão arterial e freqüência
cardíaca foram induzidas por todas as formulações de Hf, tanto na avaliação a curto
prazo como na avaliação por períodos mais prolongados. Entretanto, foi interessante
observar, que a administração de 150 mg/kg de NC-Hf mesmo induzindo a alterações na
freqüência cardíaca e PA em tempos prolongados, não levou à morte de nenhum animal
durante o período experimental, diferentemente do que foi observado para o fármaco
livre. Esse fato confirma, mais uma vez, a redução da toxicidade observada após a
encapsulação do Hf, sugerindo que a toxicidade do Hf livre é decorrente da associação
das alterações nos canais de potássio, verificadas pelo prolongamento do intervalo QT,
bem como das alterações hemodinâmicas induzidas pelo Hf, as quais atingem níveis
incompatíveis com a sobrevivência do animal, induzindo possivelmente um choque
irreversível.
Diante disso, pode-se sugerir que as NC-Hf alteram a resposta quantitativa dos
parâmetros cardiovasculares em relação ao Hf livre, mas também alteram a resposta
qualitativa dos mesmos, tanto a curto prazo quanto a longo prazo, e isso pode ser
observado pelo perfil das curvas de resposta farmacológica das NC-Hf em relação ao
fármaco livre. Provavelmente, a modificação do perfil das curvas se dá pelas alterações
da distribuição do fármaco no organismo, inclusive pela captura maciça das
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 120
nanocápsulas pelo SFM o que acarreta em acúmulo de partículas no interior das células
fagocitárias em órgãos específicos, tais como fígado, baço, medula óssea (Mosqueira et
al., 2001 a)
Por outro lado, no animal infectado, a situação parece ser bastante distinta, uma
vez que observamos um perfil de resposta oposto ao do fármaco livre. Se investigarmos
as razões deste comportamento, a possibilidade de saturação do SPM parece sinalizar
que a malária poderia influenciar na capacidade de fagocitose destas células. Dados da
literatura demonstraram que, em pacientes com malária severa, os níveis de
lipoproteínas LDL foram significativamente reduzidos quando comparado a pacientes
sadios (Mohanty et al., 1992). Segundo McIntosh et al. (1999), mudanças no perfil de
lipoproteínas plasmáticas teriam uma provável influência na ligação do Hf, o que
possivelmente influenciaria seus efeitos tóxicos. Seriam necessários, experimentos
posteriores, investigando se há influência dos parâmetros hematológicos e bioquímicos
atribuídos à doença que interfeririam na velocidade e na quantidade do fármaco liberado
pelas NCs na circulação sanguínea.
A redução das alterações cardiovasculares observadas após a administração de
NC-Hf em relação à administração do fármaco livre está provavelmente relacionada à
capacidade da nanocápsula em modificar a distribuição da droga no organismo,
prolongando seu tempo de permanência no compartimento vascular como demonstrado
anteriormente por Mosqueira et al. (2004). Além disso, a redução dos efeitos tóxicos do
fármaco quando encapsulado poderia ser atribuída à fração do que se encontra livre para
a associação ao tecido cardíaco, se comparado à administração do fármaco em solução.
Estudos demonstram que o Hf livre se associa extensivamente a lipoproteínas
plasmáticas, principalmente lipoproteínas de baixa e de alta densidade (Brocks &
Wasan, 2002). Provavelmente, a associação do Hf ao núcleo oleoso das nanocápsulas
reduz a concentração do fármaco livre que se associa a lipoproteínas no sangue,
reduzindo, conseqüentemente, a fração que seria transportada ao tecido cardíaco via
receptores de LDL.
Diante disso, os resultados deste trabalho demonstraram a capacidade dos
carreadores poliméricos, nanocápsulas, em reduzir a cardiotoxicidade do Hf quando
comparado ao fármaco livre. Sabe-se que altas doses de Hf são necessárias para o
tratamento de pacientes com malária em determinadas áreas do mundo, aumentando
Discussão Geral
Elaine Amaral Leite 121
conseqüentemente o risco de efeitos adversos cardíacos. Portanto, o desenvolvimento e
a avaliação de nanoestruturas capazes de reduzir tais efeitos é de grande interesse, uma
vez que pode levar a tratamentos mais seguros e eficazes.
Conclusão
Elaine Amaral Leite 123
CONCLUSÕES
A microscopia de força atômica permitiu observar a morfologia das NCs e
avaliar propriedades físicas das partículas tais como estabilidade após aplicação
de uma determinada “força” (set point = 0) e flexibilidade do filme polimérico.
Essa característica confere às partículas a capacidade de se adaptar para
atravessar espaços intercelulares in vivo.
A deformação das NCs quando depositadas sobre a superfície da mica evidencia
a presença de um núcleo oleoso envolvido por uma membrana polimérica,
constituindo sistemas de liberação do tipo reservatório.
A nanoencapsulação do Hf modificou a resposta farmacológica e a sua duração
no tempo, no modelo rato, reduzindo a toxicidade (DL50) e as alterações
eletrofisiológicas cardíacas em animais sadios. Provavelmente, em animais
sadios, as nanocápsulas causam uma proteção significativa do coração,
reduzindo a cardiotoxicidade. Esse fato foi atribuído, nesse trabalho, à
capacidade das nanocápsulas de restringirem a captação de fármacos por tecidos
e órgãos que apresentem epitélios endoteliais contínuos, causando uma proteção
significativa dos mesmos com conseqüente redução dos efeitos adversos.
A toxicidade induzida pelo Hf veiculado em nanocápsulas, tanto a curto como a
longo prazo, foi menos pronunciada que a induzida pelo fármaco livre,
sugerindo que as NCs alteram a resposta qualitativa e quantitativa dos
parâmetros cardiovasculares analisados.
A encapsulação do Hf provocou uma alteração mais tardia dos parâmetros
cardiovasculares analisados, tanto em animais sadios como em animais
infectados pelo P. berghei.
Em animais infectados as alterações induzidas pelo fármaco encapsulado foram
semelhantes àquelas induzidas pelo fármaco livre, sugerindo que a malária
Conclusão
Elaine Amaral Leite 124
experimental em ratos também influencia o perfil de distribuição do fármaco no
organismo.
O presente trabalho demonstra a importância da avaliação da toxicidade de
fármacos na fase pré-clínica em modelos animais infectados, uma vez que, a
doença pode alterar significativamente a biodisponibilidade do fármaco no
organismo.
Referências Bibliográficas
Elaine Amaral Leite 126
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n. 4
Resultados e Discussão: Capítulo 1
Elaine Amaral Leite 137
ANEXO I
Parâmetros cardiovasculares de um animal representativo do grupo Hf.HCl até
30 minutos após administração i.v. de 150 mg/kg do fármaco.
HALO 14 Dose: 150 mg/kg
Tempo Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6 Ciclo 7 Ciclo 8 Ciclo 9 Ciclo 10 Média %variação
Controle
QT 0,0983 0,0983 0,1 0,0983 0,0983 0,1 0,1017 0,1033 0,1017 0,0983 0,09982
RR 0,1866 0,1866 0,185 0,185 0,185 0,185 0,1866 0,1866 0,185 0,1866 0,1858
PR 0,0667 0,0633 0,065 0,065 0,065 0,0667 0,063 0,0667 0,065 0,0667 0,0633
QRS 0,0283 0,03 0,0283 0,03 0,03 0,03 0,03 0,0283 0,0283 0,0283 0,02915
PAS 110,48 111,41 114,98 118,2 119,07 116,99 113,08 108,58 110,6 114,06 113,745
PAD 75,23 72,7 74,19 76,32 78,86 78,63 76,09 73,39 71,95 72,64 75
QTc 0,1300374 0,1300374 0,1324763 0,1302242 0,1302242 0,1324763 0,1345351 0,1366517 0,1347284 0,1300374 0,13214282
FC 321,54341 321,54341 324,32432 324,32432 324,32432 324,32432 321,54341 321,54341 324,32432 321,54341 322,933866
30 segundos
QT 0,1283 0,1233 0,1217 0,1283 0,13 0,1233 0,1233 0,125 0,1254 25,6
RR 0,23 0,23 0,2283 0,2283 0,23 0,23 0,23 0,2283 0,2293625 23,4
PR 0,0817 0,0833 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0783 0,08 0,08125 28,4
QRS 0,0417 0,0417 0,04 0,04 0,0383 0,0367 0,04 0,04 0,0398 36,5
PAS 49,42 49,25 49,6 49,19 48,44 48,33 49,48 49,25 49,12 -56,8
PAD 19,99 20,1 20,33 20,05 19,82 19,95 19,82 20,05 20,01375 -73,3
QTc 0,16391 0,1575222 0,1556705 0,1641128 0,1660818 0,1575222 0,1575222 0,1598916 0,16027915 21,3
FC 260,86957 260,86957 262,81209 262,81209 260,86957 260,86957 260,86957 262,81209 261,598012 -19,0
1 minuto
QT 0,1333 0,1317 0,1317 0,13 0,1333 0,1317 0,135 0,135 0,1327125 33,0
RR 0,2383 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,24 0,2372375 27,7
PR 0,08 0,085 0,0833 0,0833 0,0817 0,08 0,0833 0,0817 0,0822875 30,0
QRS 0,0417 0,0417 0,0417 0,0433 0,04 0,04 0,0383 0,04 0,0408375 40,1
PAS 46,2 47,87 47,64 47,98 47,58 47,64 46,26 47,41 47,3225 -58,4
PAD 18,89 19,12 19,24 19,41 19,41 19,24 18,84 19,12 19,15875 -74,5
QTc 0,1692945 0,1674621 0,1674621 0,1653005 0,1694966 0,1674621 0,1716582 0,1712505 0,16867335 27,6
FC 251,78347 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 250 252,917354 -21,7
1min30s
QT 0,1317 0,1317 0,1333 0,135 0,1333 0,1317 0,135 0,1317 0,132925 33,2
RR 0,2466 0,245 0,2466 0,2483 0,2466 0,25 0,2483 0,245 0,24705 33,0
PR 0,08 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,0833 0,0822875 30,0
QRS 0,0433 0,0433 0,0417 0,04 0,0383 0,0383 0,0417 0,0433 0,0412375 41,5
PAS 46,08 45,91 46,08 45,79 44,82 45,33 45,97 45,79 45,72125 -59,8
PAD 18,49 18,61 18,43 18,49 18,15 18,32 18,26 18,49 18,405 -75,5
QTc 0,1663107 0,1664913 0,1683312 0,1702829 0,1683312 0,1659316 0,1702829 0,1664913 0,16780663 27,0
FC 243,309 244,89796 243,309 241,64317 243,309 240 241,64317 244,89796 242,876159 -24,8
2 minutos
QT 0,135 0,1317 0,1367 0,1333 0,1367 0,1317 0,1317 0,13382857 34,1
RR 0,255 0,255 0,2583 0,2566 0,2566 0,2583 0,2566 0,25662857 38,1
PR 0,085 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,08285714 30,9
QRS 0,04 0,0383 0,0417 0,0417 0,0383 0,0383 0,0433 0,04022857 38,0
PAS 45,33 45,62 45,33 45,39 43,89 45,16 45,33 45,15 -60,3
PAD 17,86 18,15 18,26 17,8 17,63 17,74 17,86 17,9 -76,1
QTc 0,1695289 0,1653849 0,1712962 0,1672197 0,1714848 0,1650308 0,1652125 0,16787969 27,0
FC 235,29412 235,29412 232,28804 233,82697 233,82697 232,28804 233,82697 233,806459 -27,6
3 minutos
QT 0,1383 0,14 0,1433 0,1417 0,1433 0,1483 0,145 0,14284286 43,1
RR 0,2783 0,2766 0,2766 0,2766 0,2783 0,2766 0,28 0,27757143 49,4
PR 0,0867 0,0933 0,09 0,0933 0,0917 0,0883 0,09 0,09047143 42,9
QRS 0,0417 0,0433 0,0433 0,0417 0,0433 0,04 0,0417 0,04214286 44,6
PAS 46,31 46,49 46,54 46,49 46,49 44,93 46,08 46,19 -59,4
PAD 17,05 17,05 17,11 17,51 17,11 16,76 17,11 17,1 -77,2
QTc 0,1711604 0,1734414 0,1775296 0,1755474 0,1773484 0,183724 0,1792703 0,17686021 33,8
FC 215,59468 216,91974 216,91974 216,91974 215,59468 216,91974 214,28571 216,164862 -33,1
4 minutos
QT 0,1433 0,1467 0,1467 0,1467 0,1483 0,1433 0,14583333 46,1
RR 0,2983 0,2966 0,3 0,2966 0,3 0,2983 0,2983 60,5
PR 0,0917 0,095 0,0933 0,095 0,0967 0,0917 0,0939 48,3
QRS 0,0433 0,04 0,04 0,0433 0,0417 0,045 0,04221667 44,8
PAS 48,27 46,72 47,93 48,27 48,44 48,33 47,9933333 -57,8
PAD 17,05 16,76 16,99 16,94 16,99 17,11 16,9733333 -77,4
QTc 0,1753089 0,1796394 0,1792985 0,1796394 0,181254 0,1753089 0,17840818 35,0
FC 201,13979 202,29265 200 202,29265 200 201,13979 201,144147 -37,7
5 minutos
QT 0,1467 0,1467 0,1433 0,1417 0,1417 0,1417 0,14363333 43,9
RR 0,3216 0,3183 0,3216 0,3216 0,3166 0,32 0,31995 72,2
PR 0,0933 0,0917 0,0967 0,0967 0,0967 0,0967 0,0953 50,6
QRS 0,045 0,0433 0,04 0,045 0,0467 0,0433 0,04388333 50,5
PAS 51,5 51,21 49,94 51,5 51,67 51,73 51,2583333 -54,9
PAD 17,63 17,53 17,11 17,51 17,58 17,74 17,5166667 -76,6
QTc 0,1772328 0,1775377 0,1731252 0,1711921 0,1716398 0,1713345 0,17367703 31,4
HALO 14 Dose: 150 mg/kg
Tempo Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6 Ciclo 7 Ciclo 8 Ciclo 9 Ciclo 10 Média %variação
Controle
QT 0,0983 0,0983 0,1 0,0983 0,0983 0,1 0,1017 0,1033 0,1017 0,0983 0,09982
RR 0,1866 0,1866 0,185 0,185 0,185 0,185 0,1866 0,1866 0,185 0,1866 0,1858
PR 0,0667 0,0633 0,065 0,065 0,065 0,0667 0,063 0,0667 0,065 0,0667 0,0633
QRS 0,0283 0,03 0,0283 0,03 0,03 0,03 0,03 0,0283 0,0283 0,0283 0,02915
PAS 110,48 111,41 114,98 118,2 119,07 116,99 113,08 108,58 110,6 114,06 113,745
PAD 75,23 72,7 74,19 76,32 78,86 78,63 76,09 73,39 71,95 72,64 75
QTc 0,1300374 0,1300374 0,1324763 0,1302242 0,1302242 0,1324763 0,1345351 0,1366517 0,1347284 0,1300374 0,13214282
FC 321,54341 321,54341 324,32432 324,32432 324,32432 324,32432 321,54341 321,54341 324,32432 321,54341 322,933866
30 segundos
QT 0,1283 0,1233 0,1217 0,1283 0,13 0,1233 0,1233 0,125 0,1254 25,6
RR 0,23 0,23 0,2283 0,2283 0,23 0,23 0,23 0,2283 0,2293625 23,4
PR 0,0817 0,0833 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0783 0,08 0,08125 28,4
QRS 0,0417 0,0417 0,04 0,04 0,0383 0,0367 0,04 0,04 0,0398 36,5
PAS 49,42 49,25 49,6 49,19 48,44 48,33 49,48 49,25 49,12 -56,8
PAD 19,99 20,1 20,33 20,05 19,82 19,95 19,82 20,05 20,01375 -73,3
QTc 0,16391 0,1575222 0,1556705 0,1641128 0,1660818 0,1575222 0,1575222 0,1598916 0,16027915 21,3
FC 260,86957 260,86957 262,81209 262,81209 260,86957 260,86957 260,86957 262,81209 261,598012 -19,0
1 minuto
QT 0,1333 0,1317 0,1317 0,13 0,1333 0,1317 0,135 0,135 0,1327125 33,0
RR 0,2383 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,24 0,2372375 27,7
PR 0,08 0,085 0,0833 0,0833 0,0817 0,08 0,0833 0,0817 0,0822875 30,0
QRS 0,0417 0,0417 0,0417 0,0433 0,04 0,04 0,0383 0,04 0,0408375 40,1
PAS 46,2 47,87 47,64 47,98 47,58 47,64 46,26 47,41 47,3225 -58,4
PAD 18,89 19,12 19,24 19,41 19,41 19,24 18,84 19,12 19,15875 -74,5
QTc 0,1692945 0,1674621 0,1674621 0,1653005 0,1694966 0,1674621 0,1716582 0,1712505 0,16867335 27,6
FC 251,78347 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 250 252,917354 -21,7
1min30s
QT 0,1317 0,1317 0,1333 0,135 0,1333 0,1317 0,135 0,1317 0,132925 33,2
RR 0,2466 0,245 0,2466 0,2483 0,2466 0,25 0,2483 0,245 0,24705 33,0
PR 0,08 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,0833 0,0822875 30,0
QRS 0,0433 0,0433 0,0417 0,04 0,0383 0,0383 0,0417 0,0433 0,0412375 41,5
PAS 46,08 45,91 46,08 45,79 44,82 45,33 45,97 45,79 45,72125 -59,8
PAD 18,49 18,61 18,43 18,49 18,15 18,32 18,26 18,49 18,405 -75,5
QTc 0,1663107 0,1664913 0,1683312 0,1702829 0,1683312 0,1659316 0,1702829 0,1664913 0,16780663 27,0
FC 243,309 244,89796 243,309 241,64317 243,309 240 241,64317 244,89796 242,876159 -24,8
2 minutos
QT 0,135 0,1317 0,1367 0,1333 0,1367 0,1317 0,1317 0,13382857 34,1
RR 0,255 0,255 0,2583 0,2566 0,2566 0,2583 0,2566 0,25662857 38,1
PR 0,085 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,08285714 30,9
QRS 0,04 0,0383 0,0417 0,0417 0,0383 0,0383 0,0433 0,04022857 38,0
PAS 45,33 45,62 45,33 45,39 43,89 45,16 45,33 45,15 -60,3
PAD 17,86 18,15 18,26 17,8 17,63 17,74 17,86 17,9 -76,1
QTc 0,1695289 0,1653849 0,1712962 0,1672197 0,1714848 0,1650308 0,1652125 0,16787969 27,0
FC 235,29412 235,29412 232,28804 233,82697 233,82697 232,28804 233,82697 233,806459 -27,6
3 minutos
QT 0,1383 0,14 0,1433 0,1417 0,1433 0,1483 0,145 0,14284286 43,1
RR 0,2783 0,2766 0,2766 0,2766 0,2783 0,2766 0,28 0,27757143 49,4
PR 0,0867 0,0933 0,09 0,0933 0,0917 0,0883 0,09 0,09047143 42,9
QRS 0,0417 0,0433 0,0433 0,0417 0,0433 0,04 0,0417 0,04214286 44,6
PAS 46,31 46,49 46,54 46,49 46,49 44,93 46,08 46,19 -59,4
PAD 17,05 17,05 17,11 17,51 17,11 16,76 17,11 17,1 -77,2
QTc 0,1711604 0,1734414 0,1775296 0,1755474 0,1773484 0,183724 0,1792703 0,17686021 33,8
FC 215,59468 216,91974 216,91974 216,91974 215,59468 216,91974 214,28571 216,164862 -33,1
4 minutos
QT 0,1433 0,1467 0,1467 0,1467 0,1483 0,1433 0,14583333 46,1
RR 0,2983 0,2966 0,3 0,2966 0,3 0,2983 0,2983 60,5
PR 0,0917 0,095 0,0933 0,095 0,0967 0,0917 0,0939 48,3
QRS 0,0433 0,04 0,04 0,0433 0,0417 0,045 0,04221667 44,8
PAS 48,27 46,72 47,93 48,27 48,44 48,33 47,9933333 -57,8
PAD 17,05 16,76 16,99 16,94 16,99 17,11 16,9733333 -77,4
QTc 0,1753089 0,1796394 0,1792985 0,1796394 0,181254 0,1753089 0,17840818 35,0
FC 201,13979 202,29265 200 202,29265 200 201,13979 201,144147 -37,7
5 minutos
QT 0,1467 0,1467 0,1433 0,1417 0,1417 0,1417 0,14363333 43,9
RR 0,3216 0,3183 0,3216 0,3216 0,3166 0,32 0,31995 72,2
PR 0,0933 0,0917 0,0967 0,0967 0,0967 0,0967 0,0953 50,6
QRS 0,045 0,0433 0,04 0,045 0,0467 0,0433 0,04388333 50,5
PAS 51,5 51,21 49,94 51,5 51,67 51,73 51,2583333 -54,9
PAD 17,63 17,53 17,11 17,51 17,58 17,74 17,5166667 -76,6
QTc 0,1772328 0,1775377 0,1731252 0,1711921 0,1716398 0,1713345 0,17367703 31,4
Resultados e Discussão: Capítulo 1
Elaine Amaral Leite 138
6 minutos
QT 0,1417 0,1417 0,145 0,1433 0,1433 0,145 0,14333333 43,6
RR 0,345 0,345 0,34 0,3433 0,3416 0,3433 0,34303333 84,6
PR 0,0917 0,095 0,1 0,0967 0,0967 0,095 0,09585 51,4
QRS 0,04 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,0417 0,04251667 45,9
PAS 53,05 53,86 54,61 54,72 54,09 53,51 53,9733333 -52,5
PAD 17,63 18,38 18,08 18,26 18,2 17,8 18,0583333 -75,9
QTc 0,1691999 0,1691999 0,1735621 0,1712513 0,1713931 0,1732829 0,17131484 29,6
FC 173,91304 173,91304 176,47059 174,77425 175,64403 174,77425 174,914867 -45,8
7 minutos
QT 0,1517 0,1533 0,1533 0,1517 0,155 0,153 53,3
RR 0,3683 0,3666 0,37 0,3716 0,3683 0,36896 98,6
PR 0,0983 0,0983 0,095 0,1 0,0967 0,09766 54,3
QRS 0,0383 0,0417 0,045 0,04 0,0383 0,04066 39,5
PAS 52,3 55,53 55,65 54,55 51,09 53,824 -52,7
PAD 17,28 17,28 17,51 17,22 17,17 17,292 -76,9
QTc 0,1791783 0,1812077 0,1809291 0,1789121 0,183076 0,18066064 36,7
FC 162,91067 163,66612 162,16216 161,46394 162,91067 162,622713 -49,6
8 minutos
QT 0,155 0,1533 0,1517 0,1533 0,155 0,15366 53,9
RR 0,3983 0,4 0,3933 0,3933 0,3966 0,3963 113,3
PR 0,1017 0,105 0,1083 0,105 0,1033 0,10466 65,3
QRS 0,0433 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,04334 48,7
PAS 55,53 54,03 53,92 55,24 55,47 54,838 -51,8
PAD 16,65 16,24 17,11 16,65 16,65 16,66 -77,8
QTc 0,1807021 0,1785934 0,1772277 0,1790969 0,180831 0,17929025 35,7
FC 150,64022 150 152,5553 152,5553 151,28593 151,407351 -53,1
9 minutos
QT 0,1517 0,15 0,1517 0,15 0,1533 0,15134 51,6
RR 0,4066 0,4066 0,4116 0,4166 0,4166 0,4116 121,5
PR 0,11 0,1067 0,1083 0,1067 0,11 0,10834 71,2
QRS 0,04 0,0433 0,0433 0,045 0,04 0,04232 45,2
PAS 53,34 55,41 55,7 55,18 53,86 54,698 -51,9
PAD 16,24 16,42 16,42 16,36 16,07 16,302 -78,3
QTc 0,1762481 0,174273 0,1758894 0,1735687 0,1773872 0,17547327 32,8
FC 147,56517 147,56517 145,77259 144,02304 144,02304 145,789806 -54,9
10 minutos
QT 0,1517 0,15 0,1533 0,15 0,1567 0,15234 52,6
RR 0,44 0,4383 0,4366 0,4383 0,435 0,43764 135,5
PR 0,1133 0,1133 0,115 0,11 0,1133 0,11298 78,5
QRS 0,04 0,0417 0,045 0,0417 0,04 0,04168 43,0
PAS 53,74 55,93 56,11 54,84 54,15 54,954 -51,7
PAD 15,55 15,9 16,07 15,73 16,3 15,91 -78,8
QTc 0,1739443 0,172106 0,1760063 0,172106 0,18002 0,17483652 32,3
FC 136,36364 136,89254 137,42556 136,89254 137,93103 137,101062 -57,5
12min30s
QT 0,155 0,1517 0,1583 0,155 0,155 55,3
RR 0,4933 0,4933 0,4883 0,4916 0,491625 164,6
PR 0,12 0,12 0,1183 0,12 0,119575 88,9
QRS 0,0433 0,0433 0,0383 0,0417 0,04165 42,9
PAS 57,55 57,66 55,18 57,55 56,985 -49,9
PAD 15,44 15,67 15,44 15,67 15,555 -79,3
QTc 0,1743732 0,1706608 0,1783883 0,1744736 0,17447399 32,0
FC 121,62984 121,62984 122,87528 122,05045 122,046352 -62,2
15 minutos
QT 0,1533 0,1533 0,1567 0,1517 0,15375 54,0
RR 0,5449 0,5416 0,5433 0,5449 0,543675 192,6
PR 0,1183 0,1233 0,125 0,125 0,1229 94,2
QRS 0,0417 0,0383 0,04 0,0417 0,040425 38,7
PAS 57,6 56,45 58,18 57,32 57,3875 -49,5
PAD 15,32 16,01 15,21 15,26 15,45 -79,4
QTc 0,1696248 0,1697966 0,1734719 0,1678544 0,17018693 28,8
FC 110,11195 110,78287 110,43622 110,11195 110,360746 -65,8
20 minutos
QT 0,1533 0,155 0,1533 0,15386667 54,1
RR 0,6266 0,6333 0,6333 0,63106667 239,6
PR 0,135 0,1317 0,1317 0,1328 109,8
QRS 0,0333 0,0383 0,0367 0,0361 23,8
PAS 55,93 58,58 57,89 57,4666667 -49,5
PAD 15,38 14,63 15,03 15,0133333 -80,0
QTc 0,1657208 0,1672618 0,1654273 0,16613665 25,7
FC 95,754868 94,741829 94,741829 95,0795082 -70,6
25 minutos
QT 0,1517 0,1567 0,155 0,15446667 54,7RR 0,7433 0,7433 0,7299 0,73883333 297,6
PR 0,14 0,1367 0,14 0,1389 119,4
QRS 0,0383 0,0367 0,0317 0,03556667 22,0
PAS 54,78 54,84 52,76 54,1266667 -52,4
PAD 12,73 13,02 13,31 13,02 -82,6
QTc 0,159389 0,1646424 0,1633508 0,1624607 22,9
FC 80,721109 80,721109 82,203042 81,2150862 -74,9
30 minutos
QT
RR
PR
QRS
PAS
PAD
QTc
FC
6 minutos
QT 0,1417 0,1417 0,145 0,1433 0,1433 0,145 0,14333333 43,6
RR 0,345 0,345 0,34 0,3433 0,3416 0,3433 0,34303333 84,6
PR 0,0917 0,095 0,1 0,0967 0,0967 0,095 0,09585 51,4
QRS 0,04 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,0417 0,04251667 45,9
PAS 53,05 53,86 54,61 54,72 54,09 53,51 53,9733333 -52,5
PAD 17,63 18,38 18,08 18,26 18,2 17,8 18,0583333 -75,9
QTc 0,1691999 0,1691999 0,1735621 0,1712513 0,1713931 0,1732829 0,17131484 29,6
FC 173,91304 173,91304 176,47059 174,77425 175,64403 174,77425 174,914867 -45,8
7 minutos
QT 0,1517 0,1533 0,1533 0,1517 0,155 0,153 53,3
RR 0,3683 0,3666 0,37 0,3716 0,3683 0,36896 98,6
PR 0,0983 0,0983 0,095 0,1 0,0967 0,09766 54,3
QRS 0,0383 0,0417 0,045 0,04 0,0383 0,04066 39,5
PAS 52,3 55,53 55,65 54,55 51,09 53,824 -52,7
PAD 17,28 17,28 17,51 17,22 17,17 17,292 -76,9
QTc 0,1791783 0,1812077 0,1809291 0,1789121 0,183076 0,18066064 36,7
FC 162,91067 163,66612 162,16216 161,46394 162,91067 162,622713 -49,6
8 minutos
QT 0,155 0,1533 0,1517 0,1533 0,155 0,15366 53,9
RR 0,3983 0,4 0,3933 0,3933 0,3966 0,3963 113,3
PR 0,1017 0,105 0,1083 0,105 0,1033 0,10466 65,3
QRS 0,0433 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,04334 48,7
PAS 55,53 54,03 53,92 55,24 55,47 54,838 -51,8
PAD 16,65 16,24 17,11 16,65 16,65 16,66 -77,8
QTc 0,1807021 0,1785934 0,1772277 0,1790969 0,180831 0,17929025 35,7
FC 150,64022 150 152,5553 152,5553 151,28593 151,407351 -53,1
9 minutos
QT 0,1517 0,15 0,1517 0,15 0,1533 0,15134 51,6
RR 0,4066 0,4066 0,4116 0,4166 0,4166 0,4116 121,5
PR 0,11 0,1067 0,1083 0,1067 0,11 0,10834 71,2
QRS 0,04 0,0433 0,0433 0,045 0,04 0,04232 45,2
PAS 53,34 55,41 55,7 55,18 53,86 54,698 -51,9
PAD 16,24 16,42 16,42 16,36 16,07 16,302 -78,3
QTc 0,1762481 0,174273 0,1758894 0,1735687 0,1773872 0,17547327 32,8
FC 147,56517 147,56517 145,77259 144,02304 144,02304 145,789806 -54,9
10 minutos
QT 0,1517 0,15 0,1533 0,15 0,1567 0,15234 52,6
RR 0,44 0,4383 0,4366 0,4383 0,435 0,43764 135,5
PR 0,1133 0,1133 0,115 0,11 0,1133 0,11298 78,5
QRS 0,04 0,0417 0,045 0,0417 0,04 0,04168 43,0
PAS 53,74 55,93 56,11 54,84 54,15 54,954 -51,7
PAD 15,55 15,9 16,07 15,73 16,3 15,91 -78,8
QTc 0,1739443 0,172106 0,1760063 0,172106 0,18002 0,17483652 32,3
FC 136,36364 136,89254 137,42556 136,89254 137,93103 137,101062 -57,5
12min30s
QT 0,155 0,1517 0,1583 0,155 0,155 55,3
RR 0,4933 0,4933 0,4883 0,4916 0,491625 164,6
PR 0,12 0,12 0,1183 0,12 0,119575 88,9
QRS 0,0433 0,0433 0,0383 0,0417 0,04165 42,9
PAS 57,55 57,66 55,18 57,55 56,985 -49,9
PAD 15,44 15,67 15,44 15,67 15,555 -79,3
QTc 0,1743732 0,1706608 0,1783883 0,1744736 0,17447399 32,0
FC 121,62984 121,62984 122,87528 122,05045 122,046352 -62,2
15 minutos
QT 0,1533 0,1533 0,1567 0,1517 0,15375 54,0
RR 0,5449 0,5416 0,5433 0,5449 0,543675 192,6
PR 0,1183 0,1233 0,125 0,125 0,1229 94,2
QRS 0,0417 0,0383 0,04 0,0417 0,040425 38,7
PAS 57,6 56,45 58,18 57,32 57,3875 -49,5
PAD 15,32 16,01 15,21 15,26 15,45 -79,4
QTc 0,1696248 0,1697966 0,1734719 0,1678544 0,17018693 28,8
FC 110,11195 110,78287 110,43622 110,11195 110,360746 -65,8
20 minutos
QT 0,1533 0,155 0,1533 0,15386667 54,1
RR 0,6266 0,6333 0,6333 0,63106667 239,6
PR 0,135 0,1317 0,1317 0,1328 109,8
QRS 0,0333 0,0383 0,0367 0,0361 23,8
PAS 55,93 58,58 57,89 57,4666667 -49,5
PAD 15,38 14,63 15,03 15,0133333 -80,0
QTc 0,1657208 0,1672618 0,1654273 0,16613665 25,7
FC 95,754868 94,741829 94,741829 95,0795082 -70,6
25 minutos
QT 0,1517 0,1567 0,155 0,15446667 54,7RR 0,7433 0,7433 0,7299 0,73883333 297,6
PR 0,14 0,1367 0,14 0,1389 119,4
QRS 0,0383 0,0367 0,0317 0,03556667 22,0
PAS 54,78 54,84 52,76 54,1266667 -52,4
PAD 12,73 13,02 13,31 13,02 -82,6
QTc 0,159389 0,1646424 0,1633508 0,1624607 22,9
FC 80,721109 80,721109 82,203042 81,2150862 -74,9
30 minutos
QT
RR
PR
QRS
PAS
PAD
QTc
FC
Resultados e Discussão: Capítulo 1
Elaine Amaral Leite 139
ANEXO II – PRODUÇÃO CIENTÍFICA ASSOCIADA A ESSA DISSERTAÇÃO
Artigos completos publicados em periódicos:
1. MOSQUEIRA, V. C. F.; LEITE, E. A.; BARROS, C. M.; VILELA, J. M. C.;
ANDRADE, M. S. Polymeric Nanostructures For Drug Delivery: Characterization By
Atomic Force Microscopy. Microscopy & Microanalysis, Inglaterra, v. 11, n. supp 3, p.
36-39, 2005.
2. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; MOSQUEIRA, V. C. F.; ANDRADE, M. S. Poly-
Caprolactone Nanocapsules Morphological Features by Atomic Force Microscopy.
Microscopy & Microanalysis, Inglaterra, v. 11, n. supp 3, p. 48-51, 2005.
3. LEITE, E. A. ; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N., MACHADO-
COELHO, G. L. L., BARRAT, G., MOSQUEIRA, V. C. F. Cardiotoxicity reduction
induced by halofantrine entrapped in nanocapsules devices. (Submetido)
Trabalhos completos publicados em eventos nacionais e internacionais
1. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; MOSQUEIRA, V. C. F.; ANDRADE, M. S. Poly-
caprolactone nanocapsules morphological features by atomic force microscopy. In:
Third Latin American Symposium on Scanning Probe Microscopy (III LASPM), Ouro
Preto, Minas Gerais, v. 3., p. nn-oo, 2005.
2. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; GRABE-GUIMARÃES, A.; MOSQUEIRA, V. C.
F.; ANDRADE, M. S. Poly-epsilon-caprolactone nanocapsules characterization by
atomic force microscopy. In: III Encontro da REDE de Nanobiotecnologia Nacional
(NANOBIOTEC), Águas de São Pedro, São Paulo, v. 3, p. 25-26, 2005.
3. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.
C. F. No dose-dependece response is observed in QT-interval prolongation induced by
halofantrine loaded nanocapsules. In: II Reunião da Rede de Nanotecnologia,
Campinas, São Paulo, v. 2, p. 113-114, 2003.
4. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.
C. F. Nanoencapsulation reduces QT-interval prolongation of ECG provoked by
Halofantrine in a rat model. In: VI PHARMATECH - Internacional Conference on
Pharmaceutics and Pharmaceutical Technology, 2001, Recife. Proceedings of the VI
Pharmatech and APGI Symposium on Membrane Transport. v. 6, p. 113-114, 2001.
5. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.
C. F. Entrapment of antimalarial drug in biodegradable nanocapsules reduces side effect
of heart damage. In: II Latin Americam Congress of Artificial Organs and Biomaterial,
2001, Belo Horizonte. Proceedings of the II Latin Americam Congress of Artificial
Organs and Biomaterial. v. 2, 2001.
Resultados e Discussão: Capítulo 1
Elaine Amaral Leite 140
Resumos apresentados em eventos nacionais
1. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; GRABE-GUIMARAES, A.; MOSQUEIRA, V. C.
F., ANDRADE, Margareth Spangler. Halofantrine-Nanocapsules Characterization by
Atomic Force Microscopy. In: 4° Seminário de Encerramento das Atividades da
Segunda Fase da Rede de Nanobiotecnologia, Campinas, São Paulo. Anais do 4°
Seminário de Encerramento das Atividades da Segunda Fase da Rede de
Nanobiotecnologia, p.14, 2005.
2. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.
C. F. Redução da Cardiotoxicidade do Halofantrino veiculado em Nanocápsulas. In:
XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Águas de
Lindóia - SP. Anais do XXXVI Congresso da SBFTE. v. 36, p. 179, 2004.
3. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.
C. F. Efeitos da nanoencapsulação do halofantrino sobre as alterações do ECG. In:
Congresso da Sociedade Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental
(SBFTE), Águas de Lindóias, São Paulo. Anais do Congresso da Sociedade Brasileira
de Farmacologia e Terapêutica Experimental (SBFTE), 2002.
4. GRABE-GUIMARÃES, Andrea; LEITE, E. A.; GUIMARÂES, H. N.;
MOSQUEIRA, Vanessa Carla Furtado. Determinação de Variações do Intervalo QT do
ECG de ratos tratados com diferentes formulações de Halofantrino. In: XVI Reunião
Anual da Federação das Sociedades de Biologia Experimental, Caxambu, Minas
Gerais. Anais da XVI FeSBE. v. 16, p. 176, 2001.