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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SOCIAIS APLICADAS –
CCBSA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
NATALINA DANTAS
DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE
NANO/MICROCRISTAIS PARA INCREMENTO DE SOLUBILIDADE
DE FÁRMACOS E ANÁLISE CITOTÓXICA EM MODELO DE
ARTEMIA SALINA
João Pessoa, PB
2012
2
NATALINA DANTAS
DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE
NANO/MICROCRISTAIS PARA INCREMENTO DE SOLUBILIDADE
DE FÁRMACOS E ANÁLISE CITOTÓXICA EM MODELO DE
ARTEMIA SALINA
Orientador: Dr. Francisco Jaime Bezerra Mendonça Junior
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas
da Universidade Estadual da Paraíba, em
cumprimento as exigências para obtenção do
grau de Bacharel em Ciências Biológicas
F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA SETORIAL CAMPUS V – UEPB
D192d Dantas, Natalina.
Desenvolvimento de uma nova técnica de obtenção de
nano/microcristais para incremento de solubilidade de fármacos e
análise citotóxica em modelo de artemia salina / Natalina Dantas. –
2012.
56f. : il. color
Digitado.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências
Biológicas) – Universidade Estadual da Paraíba, Centro de
Ciências Biológicas e Sociais Aplicadas, Curso de Ciências
Biológicas, 2012.
“Orientação: Prof. Dr. Francisco Jaime Bezerra Mendonca
Junior, Curso de Ciências Biológicas”.
1. Nanocristais. 2. Nanossuspensões. 3. Derivados tiofênicos.
I. Título.
21. ed. CDD 547.594
2
3
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus, aquele que me deu toda coragem,
perseverança e apoio em todos momentos, nunca me permitindo desistir dos meus objetivos e
me fazendo lutar para alcançar meus sonhos. Sei senhor que não sou uma filha como deveria,
que lhe agrade em todas as minhas ações, mas compreenda sou falha e nada do que eu faço é
por todo mal.
Dedico este trabalho também a todos que acreditaram e acreditam na educação como
instrumento transformador da sociedade e principalmente naqueles que possibilitaram a mim
a conclusão de todo projeto de vida que vim e venha a desenvolver: Minha família.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela força que me deste durante esta difícil trajetória, para persistir
apesar dos desafios e adversidades, enfrentando-os sem esmorecer, alcançando vitoriosa esta
etapa de minha vida.
Há momentos em nossas vidas, que a única coisa de que precisamos, é poder olhar a
nossa volta e ver alguém que realmente se importa conosco e que simplesmente nos diga
"estou tão orgulhoso de você... e não importa o que aconteça, sempre estarei ao seu lado te
apoiando." E por isso, agradeço à minha família.
Em especial a minha irmã Rosa Dantas que apesar de todos os conflitos a amo e ela é
como uma mãe que cuida e se preocupa até demais. Ela é a minha fortaleza e refúgio, dedico
e agradeço de todo o meu coração esta conquista tão importante em minha vida. Obrigada
pelo amor que me ajudou a trilhar este caminho, compartilhando ideias e ideais por mais
distantes e inatingíveis que pareça, lutando comigo e me incentivando a prosseguir, fossem
quais fossem os obstáculos, acreditando e confiando na minha capacidade, sacrificando-se
muitas vezes em favor da família.
À minha irmã, Damiana Dantas pessoa muito especial que também nos últimos anos
estive ao meu lado, apoiando e compreendendo-me incondicionalmente. Até mesmo nos
momentos mais difíceis e delicados. A qualquer hora, estive de braços abertos, acalmando
meu coração, fazendo-me sorrir e perceber o lado positivo de cada adversidade. Juntas rimos
e sofremos nas incontáveis horas de cansaço, preocupação e incertezas.
A meu querido professor e orientador Dr. Francisco Jaime Bezerra Mendonça
Junior expresso todo meu carinho e sincero agradecimento pelo seu voto de confiança,
principalmente por ter acreditado em mim, no meu trabalho e potencial . Sempre esteve junto
apoiando a cada passo na concretização deste desafio. A palavra desânimo não fez parte do
nosso dia-a-dia, muito pelo contrário, houveram muitos momentos de alegria. Agradeço
também ao professor Dr. Elquio Eleamen Oliveira pela ideia do projeto de nanocristais e
por ter me permitido ser sua aluna de iniciação científica. Eu o agradeço por todo
oconhecimento a mim transmitido.
5
Ao longo deste caminho, encontrei pessoas muito importantes que percorreram ao
meu lado, vivendo minha luta, e que de alguma forma, partilharam dos prazeres e
dificuldades ao longo destes 4 anos. Aos colegas e amigos de turma Elisângela, Jander, e
Randson obrigada pelo ombro amigo, pelas conversas, pelas trocas de conhecimentos, pela
ajuda e apoio. Cada um de vocês deixou um pouco de si, contribuindo para a felicidade de
hoje. A família LSVM eu também agradeço por vocês fazerem parte da minha história.
Um sincero agradecimento a todos os professores que por mim passaram ao longo
desta graduação e deixou de alguma forma algum ensinamento. Em especial agradeço aos
professores Ricardo Olímpio de Moura e Ênio Wocily Dantas por contribuir não apenas
com seus conhecimentos em sala de aula, mas também com valores morais como,
responsabilidade, dedicação, amizade e amor pelo o que faz. Enfim à todos que estiveram ao
meu lado partilhando comigo momentos único, que deixarão saudades.
Meu Muito Obrigada ... “Valeu à pena!!!”
6
Adicione conhecimento como se fosse viver por toda vida e viva como se fosse
morrer amanhã
Añadi conocimiento como si fueras a vivir toda la vida y vive como si fueras a
morir mañana
(Charlie Chaplin)
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RESUMO
Um dos principais problemas relacionados ao desenvolvimento de novos fármacos é a
obtenção de parâmetros ADME (Absorção/Distribuição/Metabolismo/Excreção) satisfatórios.
A maior parte dos novos fármacos que chegam às fases pré-clínicas e clínicas são rejeitados
antes de chegarem ao mercado ou por apresentarem efeitos colaterais incompatíveis ou por
não possuir perfil farmacocinético satisfatório. Para essa última possibilidade, a solubilidade
do composto no meio aquoso se mostra um parâmetro essencial. Nesse trabalho seis derivados
tiofênicos, (codificados: 7CN05, 7CN08, 7CN09, 7CN10, 6CN14 e 6CN10) sintetizados no
Laboratório de Síntese e Vetorização de Moléculas da Universidade Estadual da Paraíba que
se mostraram ativos em testes preliminares de atividade antifúngica e citotóxica in vitro,
foram selecionados no intuito da promoção de um incremento de suas solubilidades (visto que
os mesmos apresentam como característica comum, uma muito baixa solubilidade) através do
desenvolvimento de nanossuspensões contendo micro/nanocristais. Objetivou-se ainda a
determinação e comparação da citotoxicidade das formulações e dos produtos em estado bruto
através de ensaios de letalidade em Artemia salina. Para tanto foram: determinados o
comprimento de onda máximo (λMÁX); obtidas as curvas de calibração usando
espectrofotômetro UV/Vis; e realizados teste de solubilidade em água e metanol para cada um
dos compostos na forma bruta. Em seguida foi desenvolvido um processo de produção das
nanossuspensões baseado no método da nanoprecipitação. As formulações foram avaliadas
quanto ao tamanho das partículas e a solubilidade. A determinação da solubilidade dos
fármacos em sua forma bruta demonstrou que os compostos são praticamente insolúveis em
água. Em 5 dos 6 compostos não foi possível determinar os valores de solubilidade, sendo
atribuído o valor zero. Para o composto 6CN10, o valor da solubilidade foi determinado em
0,5683µg/ml. Após preparação das formulações dos nanocristais as solubilidades
determinadas tiveram valores variando entre 64,61µg/ml (7CN10) e 925,32µg/ml (6CN10). A
análise microscópica comprovou a redução do tamanho dos cristais dos compostos em
algumas centenas de vezes. O incremento na solubilidade obtida com as nanossuspensões
resultou também numa alteração do perfil farmacológico dos compostos. Foi observado que
alguns fármacos formulados apresentaram valores de citotoxicidade superior (até 500 vezes)
quanto comparados com os fármacos em sua forma bruta. Estes resultados comprovam que o
processo desenvolvido para obtenção dos micro/nanocristais foi eficiente, induz a um
incremento significativo na solubilidade do fármaco e promove alterações do perfil
farmacológico (indicativo da possibilidade de diminuição da dose com manutenção da
atividade biológica), se apresenta como uma técnica barata, interessante e promissora para a
indústria farmacêutica promover o incremento da solubilidade e a melhora do perfil ADME
de princípios ativos de baixa solubilidade.
Palavras-Chave: nanocristais, nanossuspensões, solubilidade, derivados tiofênicos.
8
ABSTRACT
One of the main problems related to the development of new drugs is to obtain satisfactory
ADME (Absorption / Distribution / Metabolism / Excretion) parameters. Most new drugs that
arrive at the pre-clinical and clinical trials are rejected before they reach the market or due to
incompatible collateral effects or do not have suitable pharmacokinetic profile. For this last
possibility, the compound solubility in the aqueous medium is an essential parameter. In this
work six thiophenics derivatives, (coded: 7CN05, 7CN08, 7CN09, 7CN10, and 6CN14
6CN10) synthesized in the Laboratory of Synthesis and Vectorization of Molecules of State
University of Paraíba that were active in early trials of antifungal activity and cytotoxic in
vitro, were selected in order to promote an increase in their solubilities (since they have a
common characteristic, a very low solubility) by developing nanosuspensions containing
micro / nanocrystals. Still had as objective the determination and comparison of the
cytotoxicity of the formulations and products in the crude state by tests in brine shrimp
lethality. For that were determined the maximum wavelength (λMÁX); calibration curves
obtained by using a spectrophotometer UV / Vis; and solubility test conducted in water and
methanol for each compound in crude form. Then we developed a process of producing
nanosuspensions based on the method of nanoprecipitation. The formulations were evaluated
for particle size and solubility. The determination of solubility of the drug in crude form
demonstrated that the compounds are practically insoluble in water. In 5 of the 6 compounds
was not possible to determine the solubility values being assigned the value zero. For
compound 6CN10, the value of solubility was determined as 0.5683 µg / ml. After
preparation of nanocrystals formulations the solubilities determined had values ranging from
64.61 µg / ml (7CN10) and 925.32 µg / ml (6CN10). Microscopic analysis confirmed the
reduction of the size of the crystals of compounds in few hundred times. The increase in
solubility obtained with nanosuspensions also resulted in a change of the pharmacological
profile of the compounds. It was observed that some drugs formulated showed higher
cytotoxicity values (up to 500 times) as compared with the drug in its crude form. These
results prove that the developed process for obtaining micro / nanocrystals was efficient,
induces a significant increase in drug solubility and promotes changes in the pharmacological
profile (indicative of the possibility of dose reduction while maintaining the biological
activity), presents as an inexpensive technique, interesting and promising for the
pharmaceutical industry to promote the increased solubility and improved ADME profile of
active ingredients of low solubility.
Keywords: nanocrystals, nanosuspensions, solubility, derived thiophenic
9
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Estruturas químicas dos compostos em estudo ............................................ 16
FIGURA 2. Tabela de conversão do percentual da média de náuplius mortos probit
Extraído de Finney(1952) ............................................................................................. ....30
FIGURA 3 a. Cristal bruto de 6CN10. Objetiva 100x ................................................. 34
FIGURA 3 b. Micro/nanocristal de 6CN10. Objetiva de 100x ..................................... 34
FIGURA 4 a. Cristal bruto de 7CN05. Objetiva 100x .................................................... 35
FIGURA 4b Micro/nanocristal de 7CN05. Objetiva de 100x. ........................................ 35
FIGURA 5 a. Cristal bruto 7CN10. Objetiva 100x ........................................................... 36
FIGURA 5 b. Micro/nanocristal 7CN10. Objetiva de 100x ........................................... 36
FIGURA 6 a. Formulação 7CN10 sem liofilização. Objetiva 100x .. ............................. 37
FIGURA 6 b. 7CN10 liofilizado. Objetiva 100x . ............................................................. 37
10
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Termos descritivos de solubilidade e seus significados .............................. 19
TABELA 2. Tabela construída utilizando os dados do composto 6CN10 para
obtenção do gráfico de regressão linear .......................................................................... 30
TABELA 3. Dados obtidos a partir de testes de varredura, curva de calibração e
solubilidade ...................................................................................................................... 32
TABELA 4. Tabela construída com os dados do composto 7CN10 para realização do
cálculo da CL50 ................................................................................................................ 39
11
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1. Curva 6CN14 em metanol (concentração (μg/mL) x absorbância) ........ 31
GRÁFICO 2. Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 7CN 10 .............. 39
12
SUMÁRIO
1. Introdução .............................................................................................................. 14
2. Revisão da Literatura ........................................................................................... 17
2.1. A nanotecnologia na ciência farmacêutica .............................................................. 17
2.2. Solubilidade de fármacos pouco solúveis ............................................................... 18
2.3. Fatores que afetam a solubilidade ........................................................................... 20
2.4. Técnicas para aumento da solubilidade de fármacos baseados na redução
do tamanho da partícula .................................................................................................... 21
2.4.1 Nanosuspensão ........................................................................................................ 21
2.5. Importância dos Tiofênicos ..................................................................................... 23
2.6. Teste de citotoxicidade de fármacos ....................................................................... 25
3. Objetivos ................................................................................................................ 25
3.1 Objetivo Geral ......................................................................................................... 25
3.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 25
4. Metodologia ........................................................................................................... 25
4.1 Determinação do comprimento de onda máximo (λMÁX) de cada um dos compostos
................................................................................................................................. 25
4.2 Obtenção da curva de calibração............................................................................. 26
4.3 Teste de solubilidade em metanol ........................................................................... 26
4.4 Teste de solubilidade em água ................................................................................ 27
4.5 Preparação das nanosuspensões .............................................................................. 27
4.6 Caracterização das nanosuspensões ........................................................................ 28
13
4.6.1 Determinação dos tamanhos dos cristais................................................................. 28
4.7 Comportamento das nanosuspensões quanto ao processo de liofilização .............. 28
4.8 Teste de citotoxicidade das nanosuspensões dos fármacos 6CN10, 6CN14,
7CN05, 7CN08, 7CN09, 7CN10 ...................................................................................... 28
4.8.1 Preparo das amostras ............................................................................................... 29
4.8.2 Obtenção dos dados................................................................................................. 29
4.8.3 Análise dos dados .................................................................................................... 29
5. Resultados e discussão .......................................................................................... 31
5.1 Parte experimental ................................................................................................... 31
5.2 Parte Biológica ........................................................................................................ 38
5.2.1 Teste de citotoxicidade das nanosuspensões ........................................................... 39
6. Conclusão ............................................................................................................... 41
7. Perspectivas ........................................................................................................... 42
8. Referências .................................................................................................................. 43
9. Anexos .......................................................................................................................... 48
9.1 Anexo I: Espectros de varredura dos compostos estudados ......................................... 48
9.2 Anexo II: Gráficos da curva de calibração dos compostos estudados .......................... 51
9.3 Anexo III: Gráfico de regressão linear PROBIT dos compostos ................................. 53
9.4 Figuras dos micro/nanocristais ..................................................................................... 55
14
1. Introdução
Os últimos 20 anos têm sido marcados por um intenso avanço tecnológico em muitos
campos do conhecimento, e o domínio da nanociência e da nanotecnologia é um dos mais
promissores campos de pesquisa da ciência, prometendo uma verdadeira revolução
tecnológica (KASAMA, et al., 2008).
A infinidade de benefícios e perspectivas oferecidas a todas as áreas de atuação pela
nanociência deve-se à interdisciplinaridade desta tecnologia inovadora. A comunidade
científica brasileira tem acompanhado a tendência mundial e vem aumentando sua produção
intelectual em nanociência e nanotecnologia, em todas suas linhas de pesquisa. Devido à
versatilidade e funcionalidade dos materiais gerados, a nanotecnologia está sendo empregada
nos mais diversos segmentos, destacando-se os setores farmacêutico, alimentício e cosmético
(ARAKI, 2007). No que se refere ao mercado farmacêutico e cosmético, a principal vantagem
está na capacidade de desenvolver sistemas para veiculação de fármacos e ativos,
possibilitando a produção de formulações mais eficazes e estáveis. (GRANADA, et al., 2007).
Dentre essas novas tecnologias desenvolvidas, inclui-se a produção de nanocristais
que envolve a redução do tamanho da partícula do fármaco, geralmente para menos de 1.000
nanômetros. A nanocristalização pode ser aplicada tecnicamente a qualquer fármaco. Existem
dois métodos distintos para a produção de nanocristais: desenvolvimento “bottom-up” e “top-
down”. Redução de tamanho de partícula de cristais maiores, formando os nanocristais “top-
down” ou através da construção de partículas por precipitação de moléculas dissolvidas
“bottom-up”( MÜLLER & KECK, 2004) . A produção pela tecnologia top-down baseia-se no
processo de homogeneização por alta pressão preferencialmente em meio aquoso. O princípio
básico da técnica botton-up é que a droga dissolvida em um solvente é precipitada pela adição
de um não solvente.
Os nanocristais obtidos apresentam enorme interesse científico, pois promovem o
aumento da superfície exposta da droga, assim como sua taxa de absorção e eficiência como
fármaco, isso favorece na redução da sua dose terapêutica e no aumento de sua
biodisponibilidade (DURÁN, et al., 2010). Os compostos cuja solubilidade aquosa é baixa
são aqueles que geralmente são escolhidos para serem processados em nanocristais
(RABINOW, 2004) .
Estima-se que mais de 40% dos fármacos em desenvolvimento apresentam baixa
solubilidade, gerando um número significativo de protótipos que são descartados por não
15
serem aprovados nos testes clínicos devido sua baixa absorção (MARQUES et al., 2009).
Sendo assim, um dos maiores desafios com que a indústria farmacêutica atualmente se depara,
consiste em desenvolver estratégias para melhorar a solubilidade destes fármacos em água,
melhorando assim a sua biodisponibilidade (VIPPAGUNTA, et al., 2006) e perfil
farmacológico .
Os derivados 2-amino-tiofênicos já são conhecidos na literatura pelo seu extenso
espectro de atividades biológicas associadas. Dentro desse grupo já existem compostos com
diversas aplicações na indústria farmacêutica e síntese orgânica (PUTEROVÁ;
KRUTOSIKOVA; VÉGH, 2009), como o metafenileno (anti-histamínico), ácido tiaprofênico
(antiinflamatório), olanzapina (tratamento de esquizofrenia) e o siltiofan (ação fungicida)
(STEFANI, 2009).
Devido a este potencial farmacológico o Laboratório de Síntese e Vetorização de
Moléculas (LSVM) da Universidade Estadual da Paraíba investiu na síntese de novas
moléculas derivadas do núcleo 2-amino-tiofeno como por exemplo: 2-[(2,4-dicloro-
benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3 carbonitrila (7CN05), 2-
[(3,4-dicloro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila
(7CN08), 2-[(5-bromo-2-metóxi-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-
ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN09), 2-[(4-nitro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-
tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN10), 2-[(4-flúor-benzilideno)amino]-
4,5,6,7-tetraidro-4H-benzo[b]tiofeno-3carbonitrila (6CN14) e 2-[(4-nitrobenzilideno)amino]-
4,5,6,7-tetraidro-4H-benzo[b]tiofeno-3-carbonitrila, (6CN10) (figura 1), tendo este último
comprovada atividade antifúngica (MENDONÇA- JUNIOR et al., 2011).
Além do grande potencial biológico, esses compostos apresentam como característica
comum uma baixa solubilidade em água. De forma a resolver esta característica indesejada e
com isso permitir um incremento da atividade biológica desses derivados, o objetivo deste
trabalho é melhorar o perfil de solubilidade destas moléculas sintetizadas no LSVM através
do desenvolvimento de micro/nanocristais a partir de uma nova metodologia de obtenção de
nanosuspensão e avaliar sua citotoxidade frente ao modelo de Artemia salina através da
determinação dos valores da CL50 antes e após procedimento nanotecnológico.
16
S
S
CN
N
N
CN
S
CN
N
S
N
CN
S
N
CN
S
N
CN
NO2F
6CN14 6CN10
Cl
Cl
Cl
Cl
Br
OMe
NO2
7CN05
7CN08
7CN10
7CN09
Figura 1. Estruturas químicas dos compostos em estudo.
17
2. Revisão da Literatura
2.1. A nanotecnologia na ciência farmacêutica
A nanotecnologia é um ramo recente da ciência que se aplica a praticamente todos os
setores da pesquisa, da engenharia de materiais e de mercado. A habilidade de caracterizar,
manipular e organizar materiais em escala nonométrica está promovendo uma revolução
científica e tecnológica de proporções ainda não identificadas (LEE, 2004). A nanotecnologia
tornou-se um dos temas promissores na indústria de pesquisas farmacêutica e com isso
também a necessidade de adequadas técnicas de análise de tais sistemas (CARL ENGLERT,
2007).
Na área farmacêutica, os sistemas nanométricos ainda não são amplamente difundidos
como as emulsões, suspensões e demais formas farmacêuticas sólidos, semi-sólidos e
líquidos, porém possuem grande potencial de serem usados como sistemas sofisticados de
liberação de drogas (LEE, 2004).
A tecnologia de liberação controlada caracteriza o sistema capaz de prover algum
controle terapêutico, seja de natureza temporal, espacial ou ambos. Quando o veículo
empregado promove apenas uma liberação em tempo prolongado podemos denominar como
liberação sustentada (DURÁN, 2010). Tal tecnologia envolve diferentes aspectos
multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço da saúde humana, como por
exemplo, melhoria da sua biodisponibilidade, redução da dose terapêutica e toxicidade.
Para alcançar este objetivo, tem sido desenvolvidos diversos sistemas nanométricos
mais sofisticados, revestidos por polímeros hidrófilos, denominados de tecnologia Stealth que
permite um tempo de circulação maior no organismo (MARQUES, et al., 2009) . Isso é
permetido devido ao desenvolvimento de técnicas de nanoemulsões e nanosuspensões as
quais trabalham na redução do tamanho das partículas, melhorando a solubilidade e
biodisponibilidade de drogas pouco solúveis em água.
As emulsões são amplamente empregadas como veículos nas indústrias cosméticas e
farmacêuticas por apresentarem vantagens como veiculação de fármacos ativos hidrofílicos e
lipofílicos na mesma formulação, além de possibilitarem o controle de aspectos sensoriais
adaptados às necessidades da via de administração para os quais se destinam (CAMARGO,
2008). Em geral as emulsões são compostas por três fases: aquosa, oleosa e tensoativo. São
estabilizados cineticamente pela adição de agentes tensoativos capazes de diminuir a tensão
18
superficial do sistema e de formar um filme interfacial com propriedades estéricas e
eletrostáticas em torno dos glóbulos da fase interna (MORRISON & ROSS, 2002).
Os nanocristais apresentam grandes vantagens tecnológicas, uma vez que muitas das
suas propriedades elétricas e termodinâmicas dependem do tamanho das partículas, podendo,
com isso ser controlado através de cuidadosos processos de produção. Entre as vantagens que
os nanocristais podem oferecer destacam-se: i. Aumento da eficácia terapêutica; ii.
Diminuição da dose terapêutica e do número de administrações iii. Incremento de solubilidade
(MARQUES et al., 2009).
Pela nanobiotecnologia está previsto o provimento de meios para diagnósticos
prematuros e melhora no diagnóstico de doenças, permitindo tratamentos em fases iniciais das
doenças.
2.2. Solubilidade de fármacos pouco solúveis
A maioria das novas moléculas em desenvolvimento tem por finalidade serem
incorporadas em formas farmacêuticas sólidas orais que lhes permitam uma dissolução e
absorção reprodutíveis e adequadas à obtenção das concentrações plasmáticas necessárias
para a obtenção do efeito terapêutico pretendido (CHARMAN & CHARMAN, 2003). No
entanto, muitas destas novas moléculas, são pouco solúveis em água, apresentando uma baixa
absorção após sua administração oral. O efeito terapêutico de um fármaco depende da sua
biodisponibilidade e da solubilidade das suas moléculas.
A solubilidade de um soluto é a quantidade máxima de soluto que se pode dissolver numa
determinada quantidade de solvente ou de solução a uma determinada temperatura. Por outras
palavras, a solubilidade pode também ser definida como a capacidade de uma substância formar
uma solução (MULLER & PITERS, 1998).
A solubilidade é um dos parâmetros mais importantes para alcançar a concentração
desejada do fármaco na circulação sistêmica, para se obter uma resposta farmacológica.
Atualmente, apenas 8% dos novos fármacos possuem igualmente elevada solubilidade e
permeabilidade (MARQUES et al., 2009 ).
Dependendo da sua solubilidade em água, cada fármaco possui um perfil diferente e
único de liberação e de ação no alvo. Os fármacos pouco solúveis em água, assim como os
que apresentam sérios efeitos colaterais, requerem uma tecnologia para a sua liberação em um
alvo-específico. Outros problemas como lenta absorção e a aplicação de volumes excessivos
19
em administrações intravenosas podem ser melhorados através do uso de sistemas de
liberação sustentada (sistemas inteligentes), (SHAH, 2006). Isto ampliaria o uso de vários
fármacos, alguns deles biotecnológicos, tais como a afidicolina .
A solubilidade de um fármaco é um parâmetro chave nos estudos de pré-formulação.
De acordo com a Farmacopeia Brasileira II (2011) as substâncias podem ser classificadas
quanto à sua solubilidade (tabela 1).
Solvente
Quantidades aproximadas do solvente, em
mililitros, para um grama da substância
Muito solúvel
Menos de 1 parte
Facilmente solúvel
De 1 a 10 partes
Solúvel De 10 a 30 partes
Ligeiramente solúvel De 30 a 100 partes
Pouco solúvel De 100 a 1 000 partes
Muito pouco solúvel De 1 000 a 10 000 partes
Tabela 1. Termos descritivos de solubilidade e seus significados.
Outro problema de fármacos pouco solúveis em meio aquoso é a sua baixa
biodisponibilidade quando administrados oralmente. Este fato pode ser atribuído a dois
fatores, além da sua possível degradação no aparelho digestivo: baixa velocidade de
dissolução e, baixa permeabilidade do fármaco nas paredes do aparelho digestivo (DURÁN
et. al., 2010). Em geral, fármacos que possuem baixa solubilidade apresentam também uma
baixa velocidade de dissolução (MULLER et.al. , 2004).
A absorção oral de fármacos pouco solúveis em água pode ser melhorada pelo
aumento da velocidade de dissolução do fármaco através do aumento da sua área superficial e,
aumento da solubilidade de saturação do fármaco. O primeiro aspecto pode ser atingido por
micronização, entretanto para a maioria dos produtos biotecnológicos este procedimento não é
suficiente, devido à solubilidade muito baixa destes produtos. Desta forma, o aumento da área
superficial não possibilita a obtenção de uma rápida velocidade de dissolução para atingir
níveis plasmáticos terapêuticos. Porém, a transformação de cristais do fármaco em
20
nanocristais poderia aumentar sua absorção oral. Isto porque a redução para nanocristais, além
de aumentar a velocidade de dissolução do fármaco (aumento da área superficial) aumenta
simultaneamente a sua “solubilidade de saturação”. Deste modo, as partículas de nanocristais
podem ser administradas por via oral e por via intravenosa em suspensões aquosas (MULLER
et.al., 2004).
2.3. Fatores que afetam a solubilidade
O tamanho das partículas de sólido influencia a solubilidade, porque à medida que a
partícula vai ficando menor, a relação área de superfície/volume aumenta. A grande área de
superfície permite uma grande interação com o solvente. A temperatura também afeta a
solubilidade por que, se o processo de dissolução absorve energia, a solubilidade aumenta à
medida que aumenta a temperatura. Se o processo de dissolução liberta energia, a solubilidade
diminui com o aumento da temperatura. Geralmente, um aumento na temperatura de
dissolução aumenta a solubilidade de um soluto sólido (ALMEIDA, 2009).
O tamanho molecular também influencia na solubilidade do fármaco. Quanto maior
for a molécula, ou maior for o seu peso molecular, menos solúvel é a substância. Moléculas
grandes são geralmente mais difíceis de serem envolvidas por moléculas de solvente.
Outro aspecto importante no estudo de nanonização dos fármacos é a forma dos
nanocristais formados, visto que a estrutura cristalina (forma) destes pode modificar vários
aspectos da sua ação, assim como suas estabilidade e biodisponibilidade (FANTIN et
al.,2003). O polimorfismo (existência de diferentes formas cristalinas de um mesmo fármaco)
pode causar variações no ponto de fusão, estabilidade, densidade e na solubilidade do
fármaco, já que estas propriedades dependem da tendência de escape da molécula de uma
estrutura cristalina particular. Além disto, a forma polimórfica influencia na concentração de
saturação (cs) sendo que a solubilidade é maior para as modificações polimórficas que
apresentam alta energia interna e baixo ponto de fusão (RABINOW, 2004)
2.4. Técnicas para aumento da solubilidade de fármacos baseados na redução do
tamanho da partícula
A redução do tamanho de partícula pode ser alcançada por nanoemulsão e
nanosuspensão. Cada uma das técnicas utiliza diferentes equipamentos para reduzir o
tamanho de partícula (PINNAMANENI, 2002).
21
2.4.1. Nanosuspensão
Recentemente, foi obeservadoque a maioria das drogas insolúveis em água pertencem
aos grupos de agentes: anticâncerígeno, antiinfeccioso, sistema nervoso central (SNC) e anti-
viral. Com o aumento da incidência de tais doenças, tem havido um forte interesse em formas
de dosagem para aplicações de nanosuspensões injetáveis (WONG et al. , 2008).
Uma importante vantagem das drogas em nanosuspensões é a sua possibilidade de
administração por vias diferentes, tais como a oral (LIVERSIDGE & CUNDY, 1995),
parenteral ( PETERS et al., 2000) e ocular (ROSÁRIO et al., 2002). Além disso,
nanosuspensões tem demonstrado resultados farmacológicos e farmacocinéticos superiores às
tradicionais formas farmacêuticas para cada via de administração.
Para nanosuspensões, de acordo com equação de Noyes-Whitney e Ostwald-
Freundlich, o tamanho da partícula em escala nanométrica pode levar a um aumento de
velocidade de dissolução e a solubilidade de saturação (JACOBS & MULLER, 2002), de
modo que a absorção oral de drogas pouco solúveis, juntamente com maior
biodisponibilidade pode ser obtida quando comparada com a formulação tradicional
(BERNHARD & MULLER, 1999). Para além disso, devido ao seu tamanho pequeno,
nanosuspensões podem ser injetadas por via intravenosa podendo alcançar uma
biodisponibilidade de 100% (MULLER & KECK, 2004).
A alta biodisponibilidade (até 100%) de um fármaco pode ser obtida com nanocristais
com diâmetro médio inferior a 400 nm. Nesta faixa de diâmetro é possível a aplicação destes
fármacos por via intravenosa, já que seu tamanho é muito menor que o diâmetro dos vasos
capilares (5-6 µm). Uma vantagem da nanocristalização é o aumento da biodisponibilidade
oral do fármaco nanocristalino. Esta biodisponibilidade pode ser aumentada através da
incorporação do nanocristais em nanoestruturas como, por exemplo, em nanopartículas
lipídicas sólidas (NLS), carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) ou transformado em
conjugado fármaco-lipídio (CFL), (SHAH, 2006)
Vários métodos de nanocristalização são conhecidos, mas o mais simples é a
homogeneização à alta pressão. Em 1999, Müller e colaboradores desenvolveram um novo
método para produção de nanosuspensões de fármacos utilizando como solvente a água. Este
método utiliza um homogeneizador de alta pressão que contém um pistão cilíndrico que pode
gerar uma pressão de até 2000 bar. A suspensão é pressionada através de um orifício de 3-5
mm a uma pressão entre 150-1500 bar. Nestas condições o líquido começa a ferver formando
22
bolhas de gás que explodem quando a suspensão deixa o orifício. Em seguida, a pressão volta
ao normal (cavitação). A formação de bolhas de gás seguida por suas explosões gera ondas de
choque que causam a diminuição das partículas (MULLER ; JACOBS & KAYSER, 2000).
A nanonização também pode ser realizada pelo método denominado NanoCrystal® (
MERISKO-LIVERSIDG & LIVERSIDGE, 2008). Esse método se baseia na moagem de
suspensões aquosas de cristais micrométricos do fármaco estabilizados por tensoativos.
Este processo, aprovado em vários países, é versátil, pode ser aplicado em diferentes
compostos aumentando sua solubilidade em água e permitindo a obtenção de formulações de
nanocristais para administração oral e intravenosa (MERISKO-LIVERSIDG &
LIVERSIDGE, 2008). Através deste processo, nanocristais de diferentes fármacos foram
preparados como o cilostazol , que apresentou um aumento na sua biodisponibilidade quando
aplicado em cachorros Beagle (JINNO et al., 2006)
As nanossuspensões podem ser estabilizadas por lecitina ou por outros tensoativos,
tais como Tween 80 ou o Poloxamero 188 (MULLER & JUNGHANNS, 2006).
Os tensoativos são moléculas com distintas regiões polares e não polares. Quando
pequenas moléculas apolares são adicionadas elas podem-se acumular no núcleo hidrofóbico
das micelas. Este processo de solubilização é muito importante em processos biológicos e
industriais. A presença de tensoativos pode reduzir a tensão superficial e aumentar a
solubilidade do fármaco no solvente orgânico (SWARBRICK & BOYLAN, 2002)
KECK & MÜLLER, (2006) afirmam que independentemente da maneira da produção,
os fármacos nanocristalinos têm grandes vantagens como, por exemplo, a utilização de
sistemas simples de produção. Isto é de suma importância já que quanto mais complicado é o
sistema de produção, mais tempo este produto ficará longe do mercado e dos pacientes.
Sistemas simples podem chegar, rapidamente, a ser uma realidade.
2.5. Importância dos derivados tiofênicos
Com o aumento da resistência a antibióticos, por parte principalmente em populações
bacterianas, tem-se evoluído a procura por fármacos mais eficazes e seguros, que causem
menos efeitos colaterais possíveis, proporcionando aos seus usuários menor rejeição e maior
sucesso nos tratamentos. Nesse contexto, a química orgânica medicinal através dos
planejamentos e modificações moleculares tem contribuído para a maior parte das novas
descobertas, observando-se um crescimento considerável de compostos sintéticos para uso
medicinal, os quais têm sido empregados no combate às diversas doenças, entre eles estão os
23
heterociclos tiofênicos que são amplamente descritos na literatura como possuidores de
relevantes propriedades farmacológicas (VERÇOZA, et AL, 2009).
O tiofeno consiste em um heterocíclico aromático pentagonal, onde um carbono
metilênico é substituído por um átomo de enxofre e um par de ligações duplas (ZHONGHAI,
2005). Uma das características importantes dessa molécula é a possibilidade de sofrer
modificações estruturais em todos os carbonos da molécula (posições 2, 3, 4, e 5) o que
viabiliza uma gama de opções reacionais no processo de síntese de seus derivados
(ZHONGHAI, 2005).
Os derivados do tiofeno apresentam grande potencial em inibir o crescimento de
microrganismos, através de suas significativas atividades biológicas, tais como antifúngicos
(GOVINDASWAMY & MOHAN, 1998), analgésico (SHAFEEQUE & MOHAN, 1999),
antibacteriano (DZHURAVERY, et al., 1992), antioxidante e anti-inflamatórios ( DALBIR.
S; MOHAN; SHARMA, 1992), anticancerígena (FERREIRA, et al., 2006) antimitótica
(ROMAGNOLI et al., 2007) dentre outras.
Simão e colaboradores, (2009), demonstraram atividade anti-T. cruzi do 2-[(4-
Benziloxibenzilideno)-amino]-5-metil-tiofeno-3-carbonitrila , frente à forma tripomastigota
do parasita, e verificou também significante atividade antifúngica in vitro com valores de
Concentração Mínima Inibitória ( CMI ) inferiores à droga padrão fluconazol em duas
linhagens celulares de fungos C. albicans e C. krusei que foi utilizada como cepa de
referência.
Os derivados do tiofeno apresentam também um extenso número de moléculas com
atividade antibacteriana, dentre elas pode-se encontrar o fenil-(2,3,5-trimetil-benzo[b]tiofeno-
6-il)-amino (I) comprovado por Ferreira et al., (2004), e o 3-fenilamino-benzo[b]tiofeno-2-
ácido carboxílico-etil-ester (II), Pinto et al., (2008).
Então devido a todas estas propriedades farmacológicas apresentadas pelo os
derivados tiofênicos, é importante empregar novos métodos para melhorar suas propriedades
físico-químicas, dentre elas a solubilidade, a fim de aumentar suas atividades biológicas.
2.6. Teste de citotoxicidade de fármacos
Atualmente, milhares de novas moléculas químicas são sintetizadas e isoladas de
diferentes fontes naturais, contudo a maior parte de suas atividades biológicas/farmacológicas
24
e aspectos de toxicidade, ainda são muito pouco estudadas ou desconhecidas para aqueles que
as isolaram ou produziram.
A síntese de novas substâncias bioativas requer ensaios preliminares de determinação
da toxicidade, antes de serem pensados quaisquer outros testes biológicos in vivo, pois
fornecem importantes indicativos da viabilidade da condução dos testes in vivo, como por
exemplo: indicação da dose máxima tolerável, DL50, dose terapêutica, efeitos adversos, entre
outros.
Dentro desse contexto, A. salina Leach vem sendo utilizada com frequência em
bioensaios de determinação de toxicidade, que utilizam a CL50 (concentração letal para 50%
da população) para a avaliação de atividades biológicas (NUNES et al., 2008). Esses testes
tem se mostrado uteis tanto para avaliar a toxicidade de compostos orgânicos químicos
sintéticos, quanto de compostos ou extratos advindos de fontes naturais. Assim os testes com
artêmias são uma opção de ensaiar a citotoxicidade de diversos compostos, de maneira mais
barata e mais acessível aos pesquisadores, já que dispensa equipamento sofisticado e
treinamento especializado.
Muitos pesquisadores já utilizaram do uso dos testes de toxicidade com artêmia para
determinação da CL50. Por exemplo, HOQUE & ISLAM (2008), fizeram o uso de artêmias
frente a indofeninas sintetizadas a partir de derivados tiofênicos, tiazóis e isatina obtendo
CL50 que variaram 0,99 a 1,77 μg/mL, demonstrando-se tóxicos para as artêmias. Dentro
desse contexto, resolvemos avaliar e comparar a toxicidade das nanosuspensões e dos
fármacos não formulados em teste de citotoxicidade usando o modelo de Artemia salina, de
acordo com a metodologia desenvolvida por MEYER et al., (1982) e adaptada por RIBEIRO,
(2011).
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Melhorar o perfil de solubilidade de moléculas sintéticas derivadas de tiofenos 6CN10,
6CN14, 7 CN05, 7 CN08, 7CN09, 7 CN10 produzidas no Laboratório de Síntese e
Vetorização de Moléculas da UEPB, através do desenvolvimento de uma nova técnica
de obtenção de micro/nanocristais, determinar e comparar a citotoxicidade dessas
moléculas nanoprecipitada e na sua forma bruta (natural) através do teste de letalidade,
usando Artemia salina.
3.2. Objetivos específicos
25
Determinar a solubilidade das moléculas em água e em solvente orgânico.
Desenvolver uma tecnologia para obtenção de nanosuspensões.
Caracterizar as nanosuspensões quanto ao tamanho dos seus cristais e determinar a
concentração dos fármacos após a nanosuspensão
Verificar o comportamento das nanosuspensão quando submetido ao processo de
liofilização.
Determinar a citotoxicidade dos compostos frente ao modelo de Artemia salina após
melhoramento da solubilidade e comparar os resultados com os testes de citotoxicidade
dos mesmos na forma bruta.
4. Metodologia
4.1. Determinação do comprimento de onda máximo (λMÁX) de cada um dos compostos
O primeiro teste a ser realizado foi o de Varredura feito na Universidade Federal do
Rio Grande do Norte (UFRN) no espectrofotômetro (Shimadzu) com os solventes acetona,
clorofórmio, etanol e metanol para obter o comprimento de onda máximo (λMÁX) e a
absorbância nas seguintes concentrações 1, 2, 5, 10 e 20 µg/ml. No teste utilizou-se 10 mg do
6CN10 adicionados em um balão de 50 ml e solubilizado com os respectivos solventes,
exceto para o metanol que foi 10 mg/100 ml formando a solução mãe . E então feitas as
leituras no espectrofotômetro.
Para a varredura das moléculas 6CN14, 7CN05, 7CN08, 7CN09 e 7CN10, o solvente
utilizado foi apenas o metanol na concentração de 10 µg/ml e foram aferidos o comprimento
de onda máximo (λMÁX).
4.2. Obtenção da curva de calibração
Com os resultados do teste de varredura foi possível obter a curva de calibração no
espectrofotômetro tipo UV-Spectrophotometer SP-2000 UV da Universidade Estadual da
Paraíba. Esta curva foi usada para obter o valor da solubilidade da concentração de
substâncias cuja concentração se desconhece. Ela estabelece uma relação entre a absorbância
da solução padrão em diferentes concentrações. Esta análise foi feita em triplicata utilizando
26
as concentrações padrão de 100 μg/mL para 6CN14, 7CN05, 7CN08, 7CN09 e 7CN10 e
200μg/ ml para 6CN10 e λMÁX.
Destas soluções mães foram realizadas diluições para concentrações de 2,5 μg/ml, 5
μg/ml, 7,5 μg/ml, 10 μg/ml, 12,5 μg/ml e 15 μg/ml em todos os compostos com exceção do
6CN10 cujas concentrações foram 0,2 μg/ml, 0,4 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 3 μg/ml, 4 μg/ml, 5
μg/ml, 6 μg/ml, 7 μg/ml, 8 μg/ml, 10 μg/ml, 12 μg/ml. Com a média dos resultados, foi obtido
a equação da reta através da regressão linear no programa Microsoft Office Excel 97/2003.
4.3. Teste de solubilidade em metanol
Os testes de solubilidade em metanol foram realizados em triplicatas, em frascos
fechados para cada um dos fármacos analisados. Neste experimento foram pesados em
balança analítica com precisão de quatro decimais (OHAUS, modelo Adventurer) 20 mg de
cada um dos fármacos, em seguida foram adicionados 20 ml de metanol e deixado sob
agitação por 72 horas à temperatura ambiente numa rotação de 500 rpm em placa agitadora
(Ika color Squid (IKA)). Para o composto 6CN10 o tempo de agitação foi de 96 horas.
Depois de 72 horas, foram retiradas alíquotas de 500 µl, postos em balões
volumétricos de 10 ml e os volumes completados com metanol.
Para as soluções dos compostos 6CN10 e 7CN05 foi necessário fazer diluições
adicionais. Para o composto 7CN05 do balão de 10 ml foram retirados 1000 μl colocados em
um novo balão de 5ml completando-se novamente com metanol. Para o 6CN10 foi necessário
retirar também 1000 μl adicionado em um novo balão de 10 ml. As soluções foram então lidas
em espectrofotômetro, de onde foi possível obter os valores de absorbância.
Através dos resultados obtidos foram feitos cálculos para determinação da
concentração e solubilidade dos fármacos. Para isso utilizou-se a equação da reta encontrada
na curva de calibração. Os cálculos das concentrações de solubilidade encontrados foram
avaliados e classificados de acordo com os dados da Farmacopeia brasileira IV edição (2011).
4.4. Teste de solubilidade em água
O teste de solubilidade em água foi feito em triplicata para cada um dos fármacos
analisados. No experimento 20 mg dos fármacos foram adicionados em 20 ml de água
destilada em um frasco fechado e colocado sob agitação em agitador magnético a 500 rpm e
temperatura ambiente por 72 horas. Passado este tempo foram coletadas 3 ml, que foram
27
filtrado em filtro Millipore de 0,2 µm (para retenção do fármaco não solubilizado). Deste
filtrado, foi pipetado 1 ml, transferido para um balão volumétrico de 5 ml e o volume foi
completado com 4 ml de metanol. Em seguida foi feita a leitura da absorbância no
espectrofotômetro.
Com os valores de absorbância lidas nas três triplicatas foi feita uma média e com ela
calculada o valor da solubilidade em água para cada um dos compostos.
4.5 Preparação das nanosuspensões
A fim de otimizar as condições de micro/nanocristalização para incorporação do
fármaco na formulação e assim incrementar sua solubilidade em meio aquoso, a partir da
redução do tamanho dos cristais dos compostos testados, um novo método de preparação das
nanosuspensões foi desenvolvido e este foi realizado em todas as formulações.
O processo para produção das nanosuspensões encontra-se em fase de patenteamento.
Resumidamente, os fármacos foram solubilizados em solvente orgânico, homogeneizados
através de técnica de baixa energia e depois precipitado rapidamente com redução de volume
para obtenção dos nanocristais.
4.6. Caracterização das nanosuspensões
4.6.1. Determinação dos tamanhos dos cristais
Para determinação do tamanho dos micro/nanocristais das formulações foram
preparadas lâminas, imediatamente após a obtenção das formulações finais e visualizadas em
microscópio óptico Olympus Bx 41 com sistema de captura de imagem Bell na objetiva de
100 x e os tamanhos de alguns cristais foram determinados.
Também foram avaliados os tamanhos dos cristais dos fármacos na sua forma natural
(bruta), preparando-se lâminas e visualizadas no microscópio óptico, para poder desta forma
avaliar se houve ou não redução no tamanho dos cristais.
4.7. Comportamento das nanosuspensões quanto ao processo de liofilização
Foram separados 4mL de cada uma das nanosuspensões, e colocadas em frascos de
penicilina e congelados em freezer comum (-10 oC), em seguida congeladas em freezer -80
oC
para serem liofilizados.
28
Lâminas foram preparadas utilizando as nanossuspensões liofilizadas e os tamanhos
dos cristais foram observados, e tiveram seus tamanhos determinados e comparados com as
nanossuspensões recém preparadas.
A liofilização foi realizada com o intuito de evitar um provável crescimento dos
tamanhos dos cristais através do processo de agregação dos micro/nanocristais. Também é
importante para evitar o crescimento de fungos e bactérias, visto que se trata de uma
formulação em meio aquoso sem o uso de agentes bactericidas.
4.8. Teste de citotoxicidade das nanosupensões dos fármacos 6CN10, 6CN14, 7CN05,
7CN 08, 7CN 09, 7CN10.
Os testes de citotoxicidade frente à Artemia salina foram baseados na metodologia
proposta por MEYER et al.; (1982), com adaptações feitas por RIBEIRO, (2011).
4.8.1. Preparo das amostras
Para o preparo das amostras foram feitos cálculos de soluções a partir das
concentrações mães das formulações que eram de 1000 µg/ml para os compostos 6CN10,
6CN14, 7CN08, 7CN09 e 2500 µg/ml para os compostos 7CN05 e 7CN10. Testadas nas
seguintes concentrações 500, 100, 50, 25, 10 e 1 µg/ml. Em tubos de ensaio com volume final
de2 ml e 10 naúplios de artêmias cada.
Após adicionar os volumes das formulações correspondentes as suas respectivas
concentrações, o volume do tubo foi completado com água salina até atingir 2 ml.
Foi também testado uma solução branca (controle negativo), composta exclusivamente
por Tween 80 a 5 % em solução salina e com isso identificar se a causa das possíveis mortes
dos náuplius foi devido ao fármaco ou ao tensoativo presente na formulação.
4.8.2. Obtenção dos dados
Após 24 horas de exposição dos náuplius às formulações dos compostos, o número de
náuplius vivos e mortos em cada tubo foi determinada por controle visual Posteriormente foi
calculada a média do número de náuplios mortos para cada concentração de cada composto.
29
4.8.3. Análise dos dados
A partir dos dados obtidos, foi determinado a CL50 po análise de regressão linear
através do método estatístico PROBIT.
Utilizando o software Microsoft Excel 2003, foi criada uma tabela com quatro colunas
(tabela 3), na primeira foi colocado as concentrações usadas no experimento, na segunda o
logaritmo das concentrações na base 10, seguida pelo percentual de náuplius mortos e o valor
do PROBIT referente ao percentual de náuplius mortos obtido a partir da tabela proposta por
Finney (1952) (figura 2).
Concentração
(µg/ml ) Log da
concentração % naúplius mortos PROBIT
500 2,69897 96 6,75
100 2 23,33 4,26
50 1,69897 26,66 4,36
10 1 13,33 3,87
1 0 10 3,72
Tabela 2. Tabela construída utilizando os dados do composto 6CN10 para obtenção do gráfico de
regressão linear.
30
Figura 2. Tabela de conversão do percentual da média de náuplius mortos para o probit.
Extraído de Finney (1952)
Com estes dados foi criado um gráfico de regressão linear, onde “y” se refere ao valor
do PROBIT e “x” ao log das concentrações. O R² representa o coeficiente de linearidade e nos
fornece indiretamente a confiabilidade dos valores, quanto mais próximo de 1 mais linear é a
reta e mais confiáveis são os dados.
Para saber a concentração que mata 50% dos indivíduos (CL50), substiui o “y” da
equação da reta pelo valor 5 e obtêm-se o valor “x”, que será o log da CL50, obtendo assim o
valor da CL50.
5. Resultados e discussão
5.1. Parte experimental
A espectroscopia é um dos métodos de análise mais usado nas investigações
biológicas e físico-químicas de fármacos. Através desta análise foi possível obter o
comprimento de onda máximo (λMÁX) para cada um dos compostos em metanol numa
concentração 100 µg/ml para 7CN05, 7CN08, 7CN09, 7CN10, 6CN14 e 200 µg/ml para o
6CN10 (Tabela 3).
Através destes dados retirou-se a curva analítica para cada fármaco. Dentre todos os
testes realizados em triplicata, quem apresentou os melhores coeficiente de correlação (R²)
com valores satisfatório (mais próximo de 1) para utilização da equação da reta nos cálculos
do teste de solubilidade foram 6CN14, 6CN10, 7CN08, 7CN09, 7CN10 e 7CN05
respectivamente como por exemplo mostra os gráficos 1.
31
Gráfico 1. Curva analítica do 6CN14 em metanol (eixo X é a concentração (μg/mL ) x eixo Y
( absorbância ).
32
Tabela 3. Dados obtidos a partir de testes de varredura, curva de calibração, solubilidade e valores de CL50 dos derivados tiofênicos em forma
bruta e micro/nanocristalizado
Fármaco
λMÁX
(nm)
Curva
Analítica/ R²
Co
nce
ntr
açã
o
ME
OH
(μ
g/m
L)
So
l/F
árm
aco
em
Ág
ua
(μg
/mL
)
Co
nce
ntr
açã
o
na
no
/mic
ro
cris
tais
(μ
g/m
L)
So
lub
ilid
ad
e
na
no
/mic
ro
cris
tais
filt
ra
do
(μ
g/m
L)
CL
50 f
árm
aco
bru
to
(μg/m
L)
CL
50 f
árm
aco
form
ula
do
(μg/m
L)
6CN10
400
y = 0,0695x - 0,0021
R² = 0,9998
768,63
0,5683
925,32
26,92
>1000
1,9
6CN14
377
y = 0,1793x - 0,007
R² = 0,9999
48,52
*
355,5
82,96
679
2,98
7CN05
389
y = 0,166x - 0,0005
R² = 0,999
175,68
*
671,08
7,259
>1000
2,05
7CN08
383
y = 0,1517x - 0,0017
R² = 0,9998
51,38
*
361,48
8,76
>1000
2,33
7CN09
398
y = 0,1514x - 0,0124
R² = 0,9996
41,35
*
393,6
13,23
>1000
3,01
7CN10 y = 0,1524x - 0,0079
33
401 R² = 0,9996 46,83 * 64,615 26,3 71,03 2,01
* Valor não detectado no equipamento utilizado
33
A solubilidade dos fármacos é uma propriedade que influência diferentes aspectos
relativos à farmacocinética e estabilidade química da molécula. Auxilia também na escolha do
solvente mais adequado para utilizações analíticas, assim como na eleição do veículo mais
idôneo para uso em ensaios in vivo ou para uma possível formulação líquida do fármaco
(MULLER, et al., 1999).
Dos solventes testados o que apresentou maior capacidade para solubilizar o 6CN10 e,
portanto, utilizados nos testes de solubilidade dos compostos 6CN14, 7CN05, 7CN08,
7CN09, 7CN10 foi o metanol, o qual após 72 horas apresentaram os maiores valores de
absorbância usados na equação da reta (tabela 3). Foi observado para o 6CN10 que após 72
horas o fármaco começou a recristalizar no meio. Podendo-se dizer assim que o tempo
máximo de saturação do 6CN10 foi de 72 horas. Os outros compostos não passaram pela
mesma observação após 72 horas.
Em geral, fármacos que possuem baixa solubilidade apresentam também uma baixa
velocidade de dissolução (MULLER, et al., 1999). Dentre os compostos avaliados o que
apresentou melhor solubilidade em metanol foi o 6CN10, seguido pelo 7CN05 e 7CN08 com
concentrações de 768,63, 175,68 e 51,38 μg/mL respectivamente. Os outros compostos
apresentaram valores de concentração entre 40 e 50 μg/mL (tabela 3).
O teste de solubilidade em água indicou a insolubilidade de todos os fármacos testados
em meio aquoso, apresentando valor muito baixo, porém mensurável (0,5683 μg/mL) apenas
para o 6CN10.
Problemas de solubilidade em drogas recém desenvolvidas com alto potencial
farmacológico é um grave obstáculo no desenvolvimento de formulações, especialmente
quando eles mostram baixa solubilidade aquosa e simultaneamente em meios orgânicos
(MULLER & PITERS, 1998). Uma alternativa bastante utilizada atualmente para estas
drogas pouco solúveis em meio aquoso é a preparação de nanossuspensão, onde se tem uma
nítida redução de tamanho das partículas de fármacos e com isso se abre uma grande
possibilidade de que este fármaco tenha sua administração por via intravenosa, entretanto para
isso o tamanho das partículas devem ser inferior a 5 μm ( KRAUSE & MULLER, 2001).
Para incrementar a solubilidade dos fármacos ativos 6CN10, 6CN14, 7CN05, 7CN08,
7CN09 e 7CN10 a nanoprecipitação foi a técnica escolhida com o propósito de reduzir o
tamanho dos cristais.
34
Todos os compostos tiveram um excelente incremento de solubilidade, saindo de uma
concentração mínima de 0,5683 μg/mL, para uma concentração máxima de 925,32 μg/mL para o
composto 6CN10 (tabela 3).
Das formulações realizadas a que apresentou melhor solubilidade com relevante
redução do tamanho dos cristais foi 6CN10 apresentando concentração equivalente a 925,32
μg/mL com 1% de Tween 80 (tabela 3). Nessa formulação partiu-se do fármaco com cristais
de tamanho 3,83 μm (cristal bruto) e na formulação final os cristais apresentaram 0,06 μm ou
60 nm. (nanocristal) (figura 6a e 6b). O fármaco 7CN05 foi o segundo a apresentar melhor
solubilidade com concentração 671,08 μg/mL, e também uma relevante redução no tamanho
de seus cristais de 1,28 μm (cristal bruto) para 0,17 μm cristal formulado (figura 7a e 7b). Os
micro/nanocristais dos compostos 6CN14 e 7CN08 ficaram na faixa de 0,3 μm e 7CN09 0,2
μm.
Figura 3a) cristal bruto de 6CN10; 3b) micro/nanocristal de 6CN10. Objetiva de 100x.
Figura 4a) cristal bruto de 7CN05; 4b) micro/nanocristal de 7CN05. Objetiva de 100x.
6a 6b
7a 7b
35
Analisando os dados de acordo com o tradicional sistema de classificação
biofarmacêutica, (2011) (tabela 1), os compostos passaram da classificação experimental de
insolúvel, para muito pouco solúvel, com exceção do 7CN10 que continua como insolúvel ou
seja para solubilizar cada grama de soluto ele precisa de aproximadamente 100.000 partes de
solvente.
Este resultado pode está relacionado com a proporção de tensoativo, a qual necessita
de mais testes para encontrar a concentração ideal para este composto, assim também como o
tamanho do cristal pode está influenciando.
Através de visualização em microscópio óptico foi observado uma relevante redução
de tamanho em escala micrométrica ou até mesmo nanométrica do 7CN 10, não sendo
possível medir o tamanho dos cristais devido sua dimensão, quando comparado com o
fármaco em sua forma natural (bruta) (figura 8a e 8b). A hipótese levantada para esta baixa
solubilidade nesta formulação pode está relacionada com a formação de uma população maior
nanocristais que são refletidos no espectrofotômetro, não apresentando assim sua absorbância
real e por tanto causando um erro no cálculo de sua solubilidade.
Figura 5a) cristal bruto 7CN10; 5b) micro/nanocristal 7CN10. Objetiva de 100x.
A escolha do tensoativo e da sua concentração são fatores que influenciam diretamente
as características das nanosuspensões, designadamente as suas dimensões, a retenção do
princípio. Ele forma uma barreira mecânica e/ou elétrica que impede a coalescência das
partículas durante a sua formação, e também a sua agregação durante o armazenamento.
(BUNJES et al., 2003).
As características físico-químicas dos nanocristais obtidos pelo método de
nanosuspensão podem ser afetadas por um conjunto de parâmetros tecnológicos, que incluem
8a 8b
36
a solubilidade do princípio ativo, o polimorfismo do fármaco, a natureza e concentração do
tensoativo, a temperatura, a força de cisalhamento e o número de ciclos de homogeneização
efetuados ( SOUTO et al., 2011). O que pode explicar um fármaco apresentar uma melhora de
solubilidade superior, utilizando-se do mesmo procedimento.
A solubilidade do filtrado das nano suspensões também foram baixas apresentando o
6CN14 a melhor solubilidade com concentração 82,96 μg/mL (tabela 3). Isso pode ter
ocorrido devido às filtragens de algumas formulações terem sido efetuadas após um período
de tempo. Como estas não possuem estabilizantes na sua formulação, isso favoreceu a
aglomeração dos micro/nanocristais ocorrendo precipitação dos fármacos, diminuindo sua
solubilidade.
Para a observação do comportamento das nanosuspensões quanto ao processo de
liofilização, as amostra após este procedimento foram visualizadas em microscópio óptico de
forma a obter aspectos relacionados à estabilidade das formulações, analisando a interferência
do tamanho e coalescência dos cristais. A figura 9a e 9b mostra um exemplo utilizando o
composto 7CN10 antes e depois da liofilização. Foi observado que ocorreu uma aglomeração
dos cristais, favorecendo desta forma um aumento no tamanho dos micro/nanocristais. Isso
pode ter ocorrido devido ao tamanho nanométrico para o fármaco 7CN10, a presença do
tensoativo que não é eliminado durante a liofilização ou ainda a falta de estabilizantes mais
eficiente nas nanosuspensões, sendo a presença destes, essencial para a estabilidade e
durabilidade das mesmas. Macroscopicamente foi observado também que os fármacos não se
apresentam em pó seco.
Figura 6a) Formulação 7CN10 sem liofilização; 6b) 7CN10 liofilizado. Objetiva 100x.
9a 9b
37
Para se obter uma máxima estabilidade física e evitar o efeito de Ostwald ripening as
nano-suspensões deverão ser tão homogênea quanto possível, o que significa redução do
número de partículas micrométricas. Um parâmetro crítico para a produção de micro
partículas é a necessidade de parar o crescimento das nanopartículas precipitadas por adição
controlada de tensioativos e assim evitar a formação de partículas micrométricas. O controle
das condições de precipitação e a necessidade de tomar medidas contra o crescimento de
partículas podem afetar a reprodutibilidade do tamanho das partículas (GRAU; KAYSER;
MULLER, 2000). Sabe-se que uma das características da tecnologia nano é a grande
instabilidade associada com o alto nível de tensão localizada na superfície do fármaco. Essa
instabilidade facilita o agregamento dos nanocristais formando aglomerados com dimensões
micrométricas (MAZALI, 2001). Portanto é importante desenvolver métodos que possam
prevenir ou controlar a oaumento na taxa de agregação durante seu crescimento ou fenômeno
Ostwald ripening.
Elevadas concentrações de tensoativos, inviabiliza a aplicação cosmética e/ou
farmacêuticas destes sistemas, e as nanosuspensões podem ser preparadas utilizando-se
concentrações de tensoativos entre 3,0 e 5,0 %. Acima destes valores as avaliações das
atividades biológicas se tornam inviáveis, devido à toxicidade do tensoativo (BULHÕES &
ROSANI, 2009 ).
A tecnologia nas formulações com nanocristais fornece novas estratégias para resolver
aspectos associados com moléculas pouco solúveis em água. Além disto, esta tecnologia
possibilitou o desenvolvimento de novos produtos através de processos escalonáveis e com
grande possibilidade de atingir o mercado. Estratégias de formulação de fármacos
nanoparticulados são necessidade eminente na indústria farmacêutica. Isto permitiria abrir
novos caminhos ou alternativas para abordar necessidades médicas ainda não satisfeitas
(MERISKO-LIVERSIDGE E LIVERSIDGE, 2008).
As tentativas para solubilizar as drogas em micelas ou com ciclodextrinas são de
sucesso limitado para muitos fármacos. Uma abordagem alternativa é a preparação de
nanosuspensões (MULLER et al., 1999).
5.2. Parte biológica
5.2.1. Teste de citotoxicidade das nanosuspensões
38
A pesquisa e o desenvolvimento de medicamentos inovadores têm sido uma
empreitada cada vez mais cara e complexa, o que torna mais escassa a introdução de novas
moléculas no mercado (JOSHI , 2007). Estima-se que de cada 30.000 compostos sintetizados,
apenas 0,003% chegam a se tornar fármacos disponíveis no comércio (FEDERSEN, 2003).
Dentre as causas que explicam estes inúmeros fracassos estão problemas derivados de sua
biodisponibilidade e toxicidade, que podem estar relacionados ao escasso conhecimento
acerca de parâmetros como solubilidade da molécula em estudo (WANG & URBAN, 2004).
Então para dar viabilidade aos estudos das moléculas 6CN10, 6CN14, 7CN05, 7CN08,
7CN09 e 7CN10 após melhoramento de suas solubilidades, o teste de citotoxicidade in vitro
através do modelo de Artemia salina se faz necessário para futuramente poder dar
continuidade in vivo com mais segurança.
Após a realização dos ensaios, que em suma caracterizam-se pela exposição dos
animais as diferentes concentrações dos compostos, com posterior contagem no número de
animais vivos e mortos em cada tubo após 24 horas, os dados obtidos foram agrupados em
tabelas, como exemplificado na tabela 4 (composto 7CN10). Estes dados foram utilizados
para a identificação da concentração letal para 50% da população de náuplius (CL50).
Tabela 4. Tabela construída com os dados do composto 7CN10 para realização do cálculo da
CL50.
Correlacionando os valores do PROBIT com o logaritmo das concentrações, tivemos
como resultado um gráfico de regressão linear para cada composto testado. Como mostra os
gráficos 3 e 4 para os compostos 7CN10 e 6 CN14 respectivamente.
Concentração
(μg/mL)
Log da
concentração
% naúplios
mortos
PROBIT
500 2,69897 96 6,75
100 2 33,33 4,56
50 1,69897 30 4,48
10 1 0 0
1 0 3,33 3,12
39
Gráfico 2. Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 7CN 10
Analisando as CL 50 obtidas com as nanosuspensões, observamos que houve um
aumento da toxicidade para todos os fármacos formulados, chegando a ser até 500 vezes mais
tóxico que na sua forma natural (bruta) como visto para o composto 6 CN10, que também
apresentou a maior solubilidade (tabela 3). E verdade que não houve uma correlação positiva
para todos os compostos, entre a toxicidade e solubilidade, ou seja, quanto maior a
solubilidade, maior também sua toxicidade, visto que o 7CN10 apresenta a menor
solubilidade e é o segundo mais tóxico. Este resultado pode ser reflexo do que já foi discutido
anteriormente quanto a problemas no diagnóstico de sua real solubilidade. Isso se torna mais
forte ao perceber que este composto foi o mais tóxico na sua forma bruta. Quanto aos outros
compostos como não há uma diferença discrepante na CL50 pode-se dizer que há uma boa
correlação entre o ganho de solubilidade e toxicidade das formulações.
De acordo com Ferraz et al., ( 2009),estudos com A. salina demonstram que as drogas
com os valores de CL50 inferiores a 1000 ϻg/mL tem potencial para apresentar ação
antineoplásicas.
A citotoxicidade do branco também foi avaliada, e verificou-se que o percentual de
5% de tensoativo Tween 80 utilizada nas formulações não chegaram a ser extremamente letal
para os náuplius de Artemia salina , resultando em apenas 20% de mortalidade dos mesmos.
Como a maior concentração de 500 μg/mL dos fármacos testados por exemplo 6CN10, 7CN10
mataram 100% das artêmias e estas consequentemente continham a maior concentração de
Tween, constatou-se que suas mortes foram devido a ação tóxica do fármaco e não do
tensoativo.
40
Apesar de os compostos 2-[(4-nitrobenzilideno)amino]-4,5,6,7-tetraidro-4H-
benzo[b]tiofeno-3-carbonitrila (6CN10), 2-[(2,4-dicloro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-
tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN05), 2-[(3,4-dicloro-benzilideno)-
amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN08), 2-[(5-bromo-2-
metóxi-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila
(7CN09), 2-[(4-nitro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-
carbonitrila (7CN10) e 2-[(4-flúor-benzilideno)amino]-4,5,6,7-tetraidro-4H-benzo[b]tiofeno-
3carbonitrila (6CN14) já apresentarem comprovadas atividades biológicas, estudos
complementares sobre suas propriedades físico-químicas se fazem ainda necessárias, para
auxiliar nos processos de incorporação dessas moléculas em sistemas de transporte de
fármacos, o que podem resultar em alterações nos parâmetros farmacocinéticos, e por sua vez
no incremento da ação biológica/farmacológica.
Estudos de pré-formulação poderiam propiciar uma maior compreensão das suas
características biofarmacêuticas e permitir vislumbrar alternativas para melhorar sua ação
terapêutica através do incremento de sua solubilidade por uma metodologia simples e sem
altos custos.
6. Conclusão
Os efeitos associados com o tamanho nanométrico das partículas são por si só muito
interessantes e abrem oportunidades únicas para novas aplicações e também para o
aprimoramento da tecnologia atual.
A nova técnica de nanosuspensão desenvolvida, demonstrou ser altamente eficiente
favorecendo um incremento de solubilidade em meio aquoso a partir da redução do tamanho
dos cristais para a escala micro/nanométrica, passando de uma concentração mínima de
0,5683 μg/mL para um máximo de 925,32 ϻg/mL, observada para o composto 6CN10 sem
procedimento de filtração, e também passou de zero para uma concentração máxima 82,96
μg/mL com filtração no composto 6CN14, entretanto mais estudos precisam ser realizados e a
técnica aprimorada quanto a proporções de tensoativo, e estabilidade para as formulações.
Quanto a caracterização do tamanho dos cristais, a visualização microscópica
conseguiu atender as expectativas de poder verificar a redução do tamanho dos cristais com
formação dos nanocristais dos fármacos formulados. Sendo possível observar uma diminuição
de 3,83 μm (cristal bruto) para 0,06 μm ou 60 nm (nanocristal) no composto 6CN10 e de 1,28
41
μm (cristal bruto) para 0,17 μm no composto 7CN05. ). Os micro/nanocristais dos compostos
6CN14 e 7CN08 ficaram na faixa de 0,3 μm e 0,2 μm para 7CN09. O 7CN10 apresentou os
menores cristais não sendo possível sua medição.
O incremento de solubilidade foi muito eficaz para o aumento da citotoxidade avaliada
a partir dos valores da CL50, ocorrendo um aumento de citotoxicidade de até 500 vezes maior
para os micro/nanocristais com CL50 igual a 1,9 μg/mL, 2,05 μg/mL, 3,01 μg/mL, 2,33 μg/mL,
2,98 μg/mL e 2,01 μg/mL para os compostos 6CN10, 7CN05, 7CN09, 7CN08, 6CN14 e
7CN10 respectivamente em relação aos mesmos na forma natural (bruta), com CL50 maiores
que 1000 μg/mL para os compostos 6CN10, 7CN05, 7CN09, 7CN08, 679 μg/mL para o
6CN14 e 71,03 μg/mL o 7CN10..
Pode-se então concluir que esta nova técnica de produção de nanosuspensões
desenvolvida em nosso laboratório foi capaz de melhorar a solubilidade dos fármacos de
estudo, através da redução do tamanho dos cristais e se apresenta como uma técnica
promissora para a indústria farmacêutica para o incremento da solubilidade de fármacos
pouco solúveis em meio aquoso.
7. Perspectivas
Realizar testes de caracterização dos nanocristais mais elaborados como Microscopia
Eletrônica de Transmissão (MET) afim verificar através de uma imagem espacial a
distribuição atômica e a morfologia do nanocristal.
Potencial zeta para observar a distribuição do diâmetro médio das partículas, para se
obter resultados muito mais seguros.
Encaminhar as formulações de todos os compostos para se realizar testes antitumorias
e antimicrobianos.
42
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47
9. Anexos
9.1. Anexos I
Espectros de varredura do composto 7CN09
48
Espectros de varredura do composto 6CN14
49
Espectros de varredura do composto 7CN10
50
9.2 Anexo II
Curva de calibração do como 2-[(2,4-dicloro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-
4H-ciclohepta[b]tiofeno-3 carbonitrila ( 7CN 05)
51
Curva de calibração do 2-[(3,4-dicloro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-
ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN 08)
Curva de calibração do 2-[(5-bromo-2-metóxi-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-
4H-ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila (7CN 09)
52
Curva de calibração do 2-[(4-nitro-benzilideno)-amino]-5,6,7,8-tetraidro-4H-
ciclohepta[b]tiofeno-3-carbonitrila
9.3 Anexo III
Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 7CN09
53
Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 7CN08
Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 7CN05
54
Gráfico de regressão linear PROBIT para o composto 6CN10
9.4. Anexo IV- Figuras dos micro/nanocristais
Micro/nanocristais do composto 6CN14
55
Micro/nanocristais do composto 7CN08
Micro/nanocristais do composto 7CN09
56
