Sveuilite u RijeciOdjel za biotehnologiju

Ani Vivoda,prediplomski studij Biotehnologija i istraivanje lijekova

Nedavni napredak u tekuinskoj kromatografiji i kapilarnoj elektroforezi za analizu glikana glikoproteina

-Seminarski rad-

Rijeka, 2014.godina

SADRAJ

1.Uvod 12.Razrada 22.1.Struktura eernih lanaca u glikoproteinima3 2.1.1. N-vezani glikoproteini 3 2.1.2. O-vezani glikoproteini 4 2.2. Metode za otputanje oligosaharida za glikoproteina4 2.3. Specifino zarobljavanje glikana5 2.4. Reakcije obiljeavanja saharida6 2.4.1. Reduktivna aminacija6 2.4.2.Drugi biljezi (obiljeavajui reagensi) za oligosaharide7 2.5. Tekuinska kromatografija saharida8 2.6. Kapilarna elektroforeza saharid83.Zakljuak94.Literatura10

10

Oligosaharidi povezani na proteine, zbog svoje iroke raznolikosti i kompleksnosti, predstavljaju veliki izazov za analitiku. Kako bi ispitivali njihove funkcije u biolokim sustavima bitno nam je imati pouzdanu analitiku metodu za kvantitativno profiliranje glikoproteinskih glikana. Najpouzdanija i izravna metoda za prouavanje sastava glikana je fluorescentno oznaavanje, popraeno tekuinskom kromatografijom ili kapilarnom elektroforezom. Upravo se u znanstvenom radu Nedavni napredak u tekuinskoj kromatografiji i kapilarnoj elektroforezi za analizu glikana glikoproteina[4] obrauje tema glikana, njihovo otputanje s glikoproteina i najnovijim saznanjima o metodama tekuinske kromatografije i kapilarne elektroforeze.Ovaj seminarski rad e se temeljiti na analizi prethodno navedenog znanstvenog rada, i to najvie na njegovom uvodnom dijelu, strukturi glikana, otputanju glikana s glikoproteina, hvatanju glikoproteina i metodama oznaavanja.

Kratice upotrebljene u seminarskom radu:2-AA -2 aminobenzojevih kiselina2-AB -2 aminobenzamidomAMC- 7 - amino - 4 - metilkumarinAsn-aminokiselina asparaginGal-galaktozaGCB-grafitna ugljina kromatografijaGlc-glukozaHPLC- tekuinska kromatografija visoke djelotvornostiHyl-hidroksilizinMan-manozaNAc- N-acetil(galaktozamin)Ser-aminokiselina serinSPE-kruta faza ekstrakcijeThr-aminokiseina treoninXyl-ksiloza

1. Uvod

U razliitim biomolekulama su pronaeni ugljikohidratni lanci koji su produkt razliitih posttranslacijskih modifikacija. Procjenjuje se da vie od 70% svih ljudskih proteina je glikozilirano.[4] Glikozilacija je sloen, visokospecifian i strogo reguliran posttranslacijski proces kovalentnog vezanja sloenih eernih struktura na proteine i lipide, a glavna mjesta glikozilacije jesu endoplazmatska mreica i Golgijev aparat.[2] Glikozilacija se esto pojavljuje na povrini stanica i izvanstaninim matricama, tako stvarajui stanino okruenja korisno za eljene interakcije.[4] Glikozilacijom nastaju glikoproteini. Glikoproteini su jedna od glavnih skupina kompleksnih ugljikohidrata koji se nalaze u organizmu, to su protein koji sadravaju jedan ili vie oligosaharidnih lanaca ( glikana ) kovalentno vezanih za njihovu polipeptidnu okosnicu.[2] Oligosaharidi su ugljikohidrati izgraeni od triju do deset monosaharida. [3] Poznato je da glikani kodiraju znaajne bioloke informacije te da to ovisi o eerima od kojih su izgraeni, njihovim sekvencama i njihovom povezivanju.[2] Glikani se prouavaju jer imaju kljune uloge u vanim biokemijskim procesima kao to su procesi biolokog prepoznavanja, koji se odvijaju na membranama stanica i u kojima sudjeluju glikani u sastavu glikoproteina. Ukljueni su u put prijenosa signala, u uroeni imunoloki odgovor, utjeu na stabilnost i nabiranje proteina, kao i na njihovu sudbinu. [4,1] Poznato je da biosinteza glikana moe biti znaajno pogoena stanjima bolesti, tako jedna tipina tumorska stanica ima izmjenjene glikane u odnosu na zdravu stanicu. Zato se ekspresija odreenih glikana danas prepoznaje kao biomarkeri za odreene imunoloke odgovore uzrokovane bolestima. Stoga, odreivanje strukture glikana koji mogu postojati u malim koliinama u pojedinim proteinima, i u odreenim pozicijama glikozilacije , je vano u klinikoj dijagnozi. Meutim, predvianje glikanske struktura je nemogue na temelju genomske tehnike, jer glikani su produkt vie uzastopnih i kompetitivnih enzimskih djelovanja. Stoga, razumijevanje funkcije glikana i njihovih promjena u odnosu na bolest je vano podruje bioloke analize, koja se esto naziva i glikomika i glikoproteomika. [4] Uslijed velike sloenosti glikanskih struktura i nedostatka prikladnih analitikih metoda, do nedavno je analiza glikana bila ograniena na vrlo malo informacija, te je to bio dugotrajan i sloen process koji je trajao satima i zahtijevao vrlo sofisticirane metode i tehnike. Nedavnim razvojem kapilarne elektroforeze i visokotlane tekuinske kromatografije visoke djelotvornosti koja se zasniva na hidrofilnim interakcijama, a kojom se analiziraju fluorescentno obiljeeni glikani, mogue je provesti detaljnu kvantitativnu analizu glikanskih struktura prisutnih u uzorku u relativno kratkom vremenu.Meutim , sada potpuno odreivanje strukture nije toliko vano jer su strukture vie od nekoliko tisua vrsta glikana razjanjene te se funkcionalne studije glikozidaza i transferaza koriste za predvianje glikanske strukture . Najvanija koristi od glikanskih profila dobivenih iz kromatografije je radi praenja fiziolokih stanja , te za kontrolu kvalitete glikoproteinskih lijekova .

2. Razrada

2.1. Struktura eernih lanaca u glikoproteinima

Pronaeno je vie od 40 vrsta peptid-saharidnih veza u glikoproteinima, no glikoproteine, s obzirom na prirodu veze, moemo podijeliti u tri najvanije vrste:1.) oni koji sadravaju N-glikozidnu vezu, ukljuujui amidni duik asparagina i N-acetilglukozamin (GlcNAc-Asn);2.) oni koji sadravaju O-glikozidnu vezu, ukljuujui i hidroksilni boni lanac serina i treonina i eer kao to je N-acetilgalaktozamin ( Gal-NAc-Ser/Thr);3.) GPI-usidreni glikoproteiniN-vezani i O-vezani glikoproteini su najei . Oligosaharidi u ove dvije vrste glikoproteina se sastoje od samo nekoliko monosaharida (slika 1), ali su vrlo komplicirani i imaju varijacije od nekoliko tisua. [4,2]

Slika 1 Strukture najeih monosaharida u glikoproteinima. Slika preuzeta iz znanstvenog rada [1]

2.1.1. N-vezani glikoproteini

U N - glikozilaciji , oligosaharidni lanci su povezani na asparaginske (Asn ) ostatke s definiranom sekvencom, Asn-X-Ser/Thr , gdje je X bilo koja aminokiselina osim prolina . Svi N - vezani glikani sadre zajedniku strukturu-pentasaharid, (sainjeno od pet manoznih jedinica), ali se dalje svrstavaju u tri podskupine na temelju strukture njihovih antenskih grana tako da ine oligomanozne, kompleksne ili hibridne tipove glikana . Glikani s visokim sadrajem manoze imaju jo dodana dva do est Man ostataka . Kompleksni glikani imaju najvie strukturnih varijacija , sadre dvije ili vie grana s barem jednim N-acetilglukozaminom i galaktozom. Hibridni je tip glikana mjeavina izmeu oligomanoznih i kompleksnih sadri jednu granu kompleksne strukture te jednu ili vie oligomanoznih grana. Strukturne varijacije glikana su specifine za svaki glikoprotein i zbog mnotva varijacija je teko predvidjeti strukturu glikana na temelju informacija o njihovom izvoru. [4,2]2.1.2. O-vezani glikoproteini

Oligosaharidni lanci povezani sa Ser ili Thr su druga skupina, poznat kao O-vezani glikoproteini. U ljudskim glikoproteinima je pronaeno najmanje etiri podskupine o-glikozidnih veza:1.)GalNAc-Ser(Thr) tip veze pronaen u mucinima;2.)Gal-Gal-Xyl-Ser (vezani trisaharid) koju sadravaju proteoglikani;3.)Gal-hidroksilizin veza (Hyl) koju sadravaju kolageni;4.)mnogi proteini jezgre i proteini citosola sadravaju boni lanac koji se sastoji od jedne Glc-Nac skupine vezane za serinski ili treoninski ostatak (GlcNAc-Ser(Thr)). [2]Prvi tip veze je najzastupljeniji. Najei O-vezani glikoproteini su izluni glikoproteini i oni imaju strukture s 1-20 ostataka eera.Veze izmeu GalNAc i Ser / Thr (Mucin i) i Xyl -Ser (proteoglikanski tipa )su nestabilne u alkalnim uvjetima, ali Gal1-Hyl (tipa kolagen) veza je stabilna. Kemijska stabilnost veza je vana u otputanju oligosaharidnih lanaca sa glikoproteina. [4,2]

2.2.Metode za otputanje oligosaharida za glikoproteina

Prema razlikama u kemijskim svojstvima peptid-glikan veze, koriste se razliiti kemijski postupci cijepanja kako bi dolo do otputanja glikana . Tretman s bezvodnim hidrazinom omoguuje oslobaanje -Asn i Ser / Thr - vezanih glikana, ali potrebni uvjeti reakcije moraju biti razliiti. Alkalna obrada je prvi izbor za otputanje O - vezanih glikana koji se granaju u C - 3 GalNAc vezi za Ser / Thr; to grananje ih ini vrlo osjetljivim na alkalne uvjete i esto uzrokuje razgradnju saharida. Za sprjeavanje razgradnje ,alkalna reakcija se provodi u prisutnosti velike koliine borhidrida ( ~ 1 M ) . Meutim , ovi uvjeti dovode do gubitka aldehidnih skupina iz osloboenih oligosaharida , to oteava oznaavanje s fluorescentnim bojama . Nedavna istraivanja ukazuju na alternativne reakcijske uvjete uz upotrebu amonijevog karbonata i amonijaka / amonijeva karbamata. eerni lanci povezani na Hyl , Hyp i Tyr u O - glikozidnim vezama su stabilni u jakoj alkalnoj obradi te se fragmenti koji sadre ove veze mogu izolirati kao glikopeptidi nakon obrade ili hidrazinom ili metalnim hidroksidom. Najee koritena metoda za oslobaanje N vezanih glikana je enzimatskom obradom pomou peptidnih N - glikanaza F ( PNGase F ) , za koju se radije koristi glikoamidaza nego glikozidaza. PNGase F cijepa amidne veze ostatka Asn povezanih na oligosaharidne lanace u obliku Asp i glikozilamina. Osloboeni glikozilamini nisu stabilni i postupno se prevode u reducirajue oligosaharide i amonijak ako stoje u vodenoj otopini preko noi . PNGase F razgradnja je osjetljiva na rigidnost peptida . Proteini su prvo denaturiran sa SDS , a disulfidi se cijepaju s tiolnim reagensom , a zatim razgrade s PNGase F. Optimalni pH enzima je u rasponu od 7 do 9, ali enzim je takoer aktivan i pri pH od 5 do 7 . Druge N - glikozidaze i endo - - N acetilglukozaminidaze su dostupne za osloboditi veliki broj razliitih N - vezanih glikana . Dvije O-glikanaze izolirane iz Diplococcus pneumoniae i Streptococcus pneumoniae su sada komercijalno dostupne. Zbog visoke specifinosti O-glikanaza esto se koriste u kemijskoj analizi O-vezanih oligosaharida.[4]

2.3. Specifino zarobljavanje glikana

Glikani osloboeni sa glikoproteina se esto ne mogu odmah koristiti zbog prisutnosti velike koliine peptida, soli i drugih spojeva u smjesi uzorka. Prisutnost tih neistoa znai da su potrebne specifine metode za izoliranje glikana iz reakcijske smjese. Razliiti postupci se primjenjuju za proiavanje glikana na temelju razlike u polarnosti i funkcionalnosti peptida i glikana. Velika koliina protein se moe ukloniti taloenjem iz otopine tako da se doda hladni etanol ili aceton. Ekstrakcija s otapalima koji se ne mijeaju s vodom, kao to je etil acetat i kloroform, se esto koristi za uklanjanje reagensa za oznaavanje iz reakcijske smjese, a moe se koristiti i za uklanjanje protein (koji se taloe) .Kruta faza ekstrakcije (SPE), se koristi za frakcioniranje glikana iz matrice uzorka pomou hidrofobne faze, kao to je C18 silika, HLB , i GCB i hidrofilne faze, kao to su kristalinina celuloza, silica modificiran s CN, NH2, amidima i druge hidrofilne skupine. GCB(grafitna ugljina kromatografija) je jedan od izbora za SPE ugljikohidrata u vodi . Povijesno gledano ,korisnost GCB je prepoznata na temelju sposobnosti aktivnog ugljena da ekstrahira ugljikohidrate iz vode. Ekstrakcijska sposobnost GCB se temelji na molekularnom obliku , kiselosti i polarnosti estica. Glikani iz neobraenih uzorka se adsorbiraju na GCB koristei vodu ili razrijeenu otopinu trifluoroctene kiseline ili octene kiseline; adsorbirani saharidi se ispiru s oko 30 %-nim zakiseljenim acetonitrilom ili metanolom. GCB se takoer koristi da se uhvate glikopeptidi. Kombinacija GCB-a i C18 SPE stupaca se koristi za proiavanje glikana za metilacijsku analizu. Borat se moe koristiti da se dobije diester kompleks sa vicinalnim diolima saharida na pH vrijednost veoj od 8. Stoga, ionsko izmjenjivake smole boratnog oblika su najizravniji postupak za hvatanje saharida. Glikopeptidi koji sadre sijalinsku kiselinu se mogu adsorbirati na SPE-titan. Adsorpcija kiselih ne- glikopeptida se moe sprijeiti koritenjem aromatskih karboksilnih kiselina, kao to je ftalna kiselina. Fosfati u proteinima imaju snaan afinitet za TiO2. Stoga, smjesa peptide se esto tretira s fosfatazama prije obogaivanja glikopeptida.Serotonin ima jedinstvenu sposobnost da vee ostatke sijalinske kiseline sa kiselih glikana i glikopeptida pri niskim koncentracijama soli. Serotonin-vezani silika je razvijen za specifino zadravanje glikana koji sadre sijalinsku kiselinu.Veina analitikih separacija zahtijevaju prethodno ienje reakcijske smjese kako bi se uklonio viak reagensa i soli. Reakcijske smjese se proiste koristei kolonu za gel filtracij, a kolone za ionsku izmjenu tekue-tekue se mogu koristi za manje oligosaharide . Reakcijska smjesa 8 - aminopyrene - 1 ,3,6 - trisulfonic kiseline ( APTS ) za oznaavanje se moe proistiti gel filtracijom koritenjem G10 Sephade kolone. Nedavno , NAP - 5 kolone (kratke kolone Sephadex G25 ) su koritene da se omogui odvajanje APTS - glikana iz reakcijske smjese u 3 Min. Ostali postupci koji upotrebljavaju hidrofobne oznake ( npr. 7 - amino - 4 - metilkumarin ( AMC ) ) koriste Oasis HLB patrone Waters i matrice bazirane na ugljiku . Reakcijska smjesa oznaena s 2 aminobenzamidom ( 2 - AB ) je odvojena tradicionalnom uzlaznom kromatografijom na papiru. Viak 2 aminobenzojevih kiselina ( 2 - AA ) se moe odvojiti od obiljeenih eera ekstrakcijom u etil acetatu. Druge hidrofilne faze , kao to su staklo , celuloza , i CN -silikagel , se takoer koriste za uklanjanje vika reagensa. Visoko acetonitrilni uvjeti , obino vie od 95 % , su korisni za hvatanje pikomolskih koliina derivatiziranih oligosaharida na hidrofilnom SPE . Visoka koncentracija acetonitrila / etanola je korisna za taloenje velikih polisaharida izravno iz vodene reakcijska smjese 2 - AA . Lektini pripremljeni od nekih biljaka i bakterije imaju jedinstvene afinitete za ugljikohidratima, neki lektini prepoznaju terminalne ostatke monosaharida, kao to su konkanavalin A (Con A), prepoznaju glikane s visokim udjelom manoze s visokim afinitetom i sloeni tipa glikana s umjerenim afinitetom. Lektin afinitetne kolone se primjenjuju za utvrivanje glikana povezanih sa stanicama raka u plasmi. Lektin-uvrene nanoestice se koriste za hvatanje glikoproteina iz ljudskih tjelesnih tekuina.[4]

2.4. Reakcije obiljeavanja saharida

2.4.1. Reduktivna aminacija

Uvoenje fluorescentne oznake na reducirajue krajeve glikana omoguuje specifinu i osjetljivu detekciju glikana u pikomolskim konc. i poboljava rezoluciju u HPLC-u(tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti) i CE-u(kapilarna elektroforeza) supresijom spore ravnotee izmeu alfa- i beta-anomera. Nadalje, individualno obiljeavanje omoguuje i kvantitativno profiliranje glikana u sloenim uzorcima izravno iz podruja pikova dobivenih separacijom podataka iz HPLC ili CE profila.

Slika 2 Reduktivn aminacija saharida sa aromatskim aminom; slika preuzeta iz znanstvenig rada [4]

Iako su razvijene mnoge metode derivacije za osjetljivu detekciju u HPLC i CE ,najpopularniji nain za ugljikohidrate je reduktivna aminacija (slika 2). Aldehidna grupa saharida se kondenzira s primarnim aminom iz biljega tako da formiraju Schiffovu bazu. Schiffove baze su imini (spojevi koji imaju dvostruku vezu ugljik-duik) koji na duikovu atomu imaju vezan ugljik (dakle ope formule RR'C=N-R''). Veina Schiffovih baza je nestabilna i postoje samo kao reakcijski meuprodukti, ali one Schiffove baze kod kojih je R'' aromatski sustav su stabilne, mogu se izolirati te ih je mnogo pripravljeno i proueno. Schiffova baza se konvertira u stabilni derivat aminoalditola koritenjem hidridnih reagensa. Formiranje Schiffove baze je olakano kiselim uvjetima, dok bi amin trebao biti kondenziran kao slobodna baza. Dakle, slabe kiseline, poput octene i limunske, se esto koriste pri ovoj reakciji. Natrijev cijanoborohidrid je najee koriten hidridni reagens; meutim, dobiveni derivat je ponekad ovisan o tipu koritenog borohidridnog reagensa. Obiljeavanje s 2-AP zahtijeva dimetilamin-boran za kvantitativne rezultate. Derivacija N-acetilglukozamina s AMC nije kvantitativna kad se koristi NaBH3CN, ali su dobiveni eljeni rezultati koritenjem piridin-borana kao hidridnog reagensa. Kao alternative cijanoborohidridu jo se koriste i NaBH(OAc)3 dimetilaminboran i 2-pikolin-boran.Brojni su biljezi bili predloeni za reduktivnu aminaciju, neki od njih su prikazani na slici 4. Reaktivnost biljega ovisi o elektronskoj gustoi amino grupa te o molekularnoj veliini reagensa. Brzina reakcije snano ovisi o koncentraciji amino-reagensa i temperaturi reakcije. Koritena koliina amina kree se u rasponu od 0.2 do 1.0 M, a temperature od 70-100 C tijekom 30 60 min ili na 37 C preko noi.Reaktivnost i jaina fluorescencije derivata ovise o kemijskim svojstvima biljega. Reaktivnost 2-AA je 50 puta vea nego reaktivnost 2-AB, te 2-AA ima jai intenzitet fluorescencije. 2-AA i 2-AB su najpopularniji biljezi, iako su tek nedavno uvedeni. Derivati reduktivne aminacije su kemijski vrlo stabilni. Meutim, veina njih, pogotovo derivati 2-AP-a i APTS-a, se konvertiraju natrag u slobodne oligosaharide tretiranjem vodikovim peroksidom/octenom kiselinom. [4]2.4.2.Drugi biljezi (obiljeavajui reagensi) za oligosaharide

Schiffova baza formirana u reakciji izmeu reducirajueg ugljikohidrata i amina nije jako stabilna, ali je bila koritena u HPLC analizi . Primijeeno je da aromatski hidrazini, kao fenilhidrazin i danzilhidrazin, daju pojaanu osjetljivost detekcije za MS i pojaanu apsorpciju i fluorescenciju u HPLC analizi. Ova je metoda sad komercijalno dostupna kao kit za derivaciju (derivatization kit).1-fenil-3-metil-5-pirazolon (PMP) nije fluorescentan, ali je fotometrijski osjetljiv reagens za saharide. Reakcija obiljeavanja odvija se pri neutralnom pH, to moe sprijeiti nepovoljne gubitke monosaharidnih ostataka labilnih u kiselinama .Meuproizvodi oligosaharilamina formirani u razgradnji PNG-azom F koriteni su pri derivaciji Fmoc-Cl-om ili 4-flouro-7-nitrobenzofurazanom (NBD-F) i razdvajanju HPLC-om za analizu oligosaharida. Reakcija se odvija tijekom 2 h s razgradnjom PNG-azom i fluorometrijskim obiljeavanjem , to bi moglo biti korisno za automatizirane analize profiliranja glikana u glikoproteinskim lijekovima.[4]

2.5. Tekuinska kromatografija saharida

Oznaeni oligosaharidi sa razliitim fluorescentnim oznakama se mogu razdvojiti kromatografijom . Tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti je oblik kromatografije na stupcu koji se esto koristi u analitikoj kemiji. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smjese na osnovi kemijskih interakcija izmeu tvari koja se analizira i stacionarne faze u stupcu. Za tekuinsku kromatografija visoke djelotvornost-HPLC u analizi ugljikohidrata , metode detekcije moraju biti paljivo odabrane kako bi se maksimalno poveala osjetljivost i specifinost.Jedna od najsofisticiranijih tehnika za analizu glikana je HPAEC (High-performance anion exchange chromatography ) sa visokom osjetljivou i rezolucijom za monosaharide i oligosaharide.Za razdvajane glikana koriste se :kromatografja s reverznom fazom, grafitna ugljina kromatografija, kromatografija hidrofombnim interakcijama, HPAEC (high-performance anion exchange chromatography) visoki pH, kromatografija hidrofobnom interakcijom, kromatografija slabom anionskom izmjenom (WAx-HPLC) i multidimenzionalni HPLC. [4]

2.6. Kapilarna elektroforeza saharida

Kapilarna elektroforeza (CE) omoguuje brze separacije mnogih vrsta analita bazirano na njihovoj pokretljivou u elektromagnetnom polju s izvanrednom uinkovitou i razluivou za analitike izazove kakvi se esto susreu u laboratoriju. Za odvajanje glikana koriste ste : kapilarna elektroforeza sa bornim kompleksima, razdvajanje ugljikohidrata kao aniona koritenjem jake alkalne otopine, kapilarna elektroforeza na temelju veliine koristei neutralno nabijene kapilare, micelarna elektrokinetika kromatografija(MEKC) i elektroforeza kapilarnim afinitetom za profiliranje glikana (CAE). [4]

3. Zakljuak

Glikozilacija je posttranslacijska modifikacija proteina koja obogauje njihovu sloenost i funkciju. Mnogi proteini su izmijenjeni kovalentno vezanim glikanima, to je vano za normalne fizioloke procese, ukljuujui smatanje proteina, razgradnju i izluivanje, stanino signaliziranje, imunoloke funkcije i prepisivanje slijeda DNA. Poremeaji glikozilacije se javljaju u irokom rasponu bolesti, ukljuujui rak, dijabetes, kardiovaskularne, uroene, imunoloke i zarazne bolesti. Znai da se u mnogim bolestima mijenja sastav glikana i smatra se da serumski glikoproteini dobro odraavaju procese koji su se odvijali unutar stanice u trenutku njihove sinteze. Zato se ekspresija odreenih glikana danas prepoznaje kao biomarkeri za odreene bolesti. Stoga je razvoj jednostavnih metoda za analizu glikana vano za dijagnozu, prognozu i praenja bolesti, ali takoer i za razvoj glikproteinskih lijekova. Na osnovi veze izmeu proteina i glikana potrebno je izabrati potrebnu metodu za otputanje glikana s glikoproteina, metodu za njihovo hvatanje i oznaavanje. Danas, najefikasnije metode i koje se mogu provesti u relativno kratkom vremenu za analizu glikana su kapilarna elektroforeza i visokotlane tekuinske kromatografije visoke djelotvornosti koja se zasniva na hidrofilnim interakcijama.

4. Literatura

[1]Masnikosa R. (2012.) : Odreivanje strukture glikana: pojam, znaaj i priprema uzorka za analizu. Kemijski pregled, vol.53: 123-129.

[2]R.K.Murray, D.A. Bender i sur. (2011.): Glikoproteini. U: J.Lovri i J.Serti (ur.) Harperova ilustrirana biokemija. Zagreb, Medicinska naklada, str. 506.-526. [3]R.K.Murray, D.A. Bender i sur. (2011.): Fizioloki znaajni ugljikohidrati. U: J.Lovri i J.Serti (ur.) Harperova ilustrirana biokemija. Zagreb, Medicinska naklada, str. 113-129. [4]Suzuki S. (2013.) : Recent Developments in Liquid Chromatography and CapillaryElectrophoresis for the Analysis of Glycoprotein Glycans. Analytical sciences, vol.29 :1117-1128.