Bacteriología

Seminario 4

Bacterias Gram negativas Parte 2

Microbiología 1II Cátedra

Facultad de Medicina (UBA)

Objetivos

1. Respecto a H. pylori: Importancia como agente colonizador de mucosa gástrica, caracterizar patogenia y su nicho ecológico Mencionar metodología diagnóstica

2. Género Brucella: Importancia de transmisión zoonótica, asociar especie con animal transmisor, caracterizar factores de patogenicidad

3. Haemophilus y Neisseria: Ejemplos de especies capsuladas. Importancia de vacunación

4. Identificar factores de virulencia de B. pertusis. Importancia de vacunación

5. Destacar a B. fragilis como microorganismo anaerobio y formar parte de la biota normal

Helycobacter spp

Helycobacter• Bacilo gramnegativo• Espiralados• Móvil (flagelo polar)• Microaerofílico • Producen gran cantidad de UREASA ( permite sobrevivir a los ácidos gástricos)

• Catalasa positivos• Oxidasa positivos• No fermentan carbohidratos• El lípido A (LPS) muestra una baja actividad endotóxica.• Hay 3 especies:

• H. pylori• H. cinaedi• H. fennelliae

Helicobacterias entéricas (gastroenteritis)

Helicobacterias gástricas (gastritis)

Agente etiológico de gastritis, ulceras pépticas, adenocarcinoma gástrico y linfomas B del tejido asociado a la mucosa gástrica (MALT)

El ser humano es el principal reservorio de H. pylori.

Transmisión fecal-oral.

H. pylori:

• Factores de virulencia:• Ureasa (NH3 aumenta el ph neutralizando la acidez)• Atravesar la capa de moco gástrico mediante el movimiento activo del flagelo.

• Adherencia  (hemaglutinina,  adhesinas,  Ag.  Sanguíneos  de Lewis)

• Citotoxina  vacuolizante  A  (VacA):  proteína  que  al  ser endocitada  por  las  células  epiteliales  causa  lesiones mediante la formación de vacuolas.

• Proteína CagA: citotoxina que interfiere en la estructura del citoesqueleto de la célula huésped. 

Una vez adquirida H. pylori, la infección se hace crónica y persiste de por vida si no hay tratamiento.

• La bacteria ingresa a la luz gástrica. La ureasa le permite sobrevivir en el ambiente acido por la producción de NH3 que lo neutraliza.

• Los flagelos le permiten a la bacteria atravesar la capa de moco y adherirse a las células epiteliales (adhesinas)

•Luego la H. pylori libera la proteína CagA y la VacA. Esta ultima induce la formación de grandes vacuolas en las células. 

• Además se reclutan neutrófilos que causan daño tisular por la producción de IROs.

Manifestaciones clínicas:• Gastritis:  inflamación  de  la  mucosa  gástrica  (infiltración  de neutrófilos y células mononucleares)

• Fase aguda:  sensación de plenitud, nauseas,  vómitos e hipoclorhidria (menor producción de acido en el estomago)

• Gastritis crónica: la enfermedad se limita al antro gástrico (producción normal o baja de Ac. Clorhídrico) o a todo el estomago, pangastritis (sin secreción acida)

• Un  10-15%  de  pacientes  con  gastritis  crónicas  desarrollan ulceras pépticas.

• Carcinoma gástrico: debido a que la gastritis crónica sustituye la mucosa gástrica normal por fibrosis con proliferación de un epitelio intestinal.

• Linfoma asociado al MALT.• H. cinaedi y H. fenelliae producen gastroenteritis y bacteriemia en pacientes inmunodeprimidos.

Diagnóstico de H.pyloriExisten diferentes métodos: • Detección  de  anticuerpos  específicos  en  una  muestra  de sangre del paciente o de heces, utilizando antígenos. 

• Prueba del aliento con urea, en  la cual el paciente bebe urea marcada con 14C o 13C, produciéndose posteriormente (debido al metabolismo de la bacteria) dióxido de carbono marcado, el cual es detectado en la respiración. 

• Biopsia,  en  la  cual  se  mide  la  ureasa  activa  en  la  muestra extraída (el denominado "test rápido de la ureasa"). 

• Muestra histológica o de un cultivo celular. • PCR,  la  cual  permite  también  identificar  genes  asociados  a virulencia (CagA y VacA), genes asociados a adhesión (BabA) y genes de resistencia a antibióticos (Claritromicina).

BRUCELLA• Coco bacilo Gram negativo • Intracelular facultativo• Aerobios estrictos• Son catalasa y oxidasa positivo• Hidrolizan urea • La temperatura optima es de 37°C y su pH de 6,6 y 7,4• Produce BRUCELOSIS

• Existen 7 especies de Brucella pero solo 5 causan patologías en humanos :

     - B. melitiensis : cabras y ovejas      - B. abortus : bovinos     - B. suis : porcinos     - B. canis : caninos     - B. maris : mamíferos marinos

FACTORES DE VIRULENCIA• LPS : A (abortus)  y  B (melitensis) , es reconocido por los TLR4 • Proteína de membrana externa• Flagelo  

PATOGENIA • Pueden  sobrevivir  en  periodos  prolongados   en  el  interior  de  células fagocíticas

• Pueden  infectar  fagocitos profesionales  (macrófagos,  linfocitos b y células dendríticas ) y fagocitos no profesionales

• Si  el  huésped  no  controla  a  Brucella  en  puerta  de  entrada  la   infección progresa  con  la diseminación  de  las bacterias  pudiendo afectar  cualquier parénquima

• Cuando  Brucella  ingresa  por  vía  oral  ,  penetra  a  través  de  las  células M intestinal hacia la placa de Peyer   y desde allí se disemina hacia los órganos del sistema retículoendotelial

• La  Ig M aumenta  al  inicio  y  produce  su  pico  al  tercer mes  para   luego  ir disminuyendo  paulatinamente  ,  la  Ig  G  comienza  aumentar  luego  de  la segunda  semana  .En  lo   referente  a  la  respuesta  celular   el  perfil  activo   frente a estas infecciones es el TH1 con la formación de granulomas

DIAGNOSTICO:

• Aislamiento de sangre de brucella por hemocultivo:      -Etapa aguda: hemocultivo       -Etapa crónica: hemocultivo, cultivo de LCR, de medula 

ósea o de liquido articular• Otros cultivos: Biopsia hepática, ganglio  linfático,  líquido peritoneal  , liquido sinovial , pus de abscesos

• En  áreas  endémicas  de  B.abortus y  B.suis  se  realiza  serología (aglutinación en tubo); también puede detectarse Ac por ELISA

• La identificación de la especie se lleva acabo mediante:      Pruebas bioquímicas (Ej.: oxidasa positiva)     Crecimiento en colorantes (fuscina para B.abortus y B.melitiensis ,      

tionina para B.suis y B.melitiensis)     Aglutinación con antisueros específicos

Elisa

Haemophilus spp.

GÉNERO HAEMOPHILUS• Cocobacilo Gram negativo• Anaerobio facultativo• Exigentes nutricionalmente: requieren factor X (hemina) y factor 

V (NAD o NADP) para crecer• Oxidasa positivos•  Catalasa positivos (H.ducreyi es catalasa negativa) • Reservorio: humano• Transmisión: La portación faríngea de Haemophilus influenzae b 

es importante en  la transmisión que se produce por gotitas aéreas o por contacto directo con secreciones.

                                             Desarrollo en agar chocolate 

Haemophilus influenzae: Patogenicidad

Adhesinas:• Fimbrias: Colonización de nasofaringe• OMP (proteínas de membrana externa): P1 y P2. Generan Ac prtectores• LOS (Lipooligosacárido): asociado a la inflamación. Genera Ac protectores

Cápsula:  (Fosfato de polirribitol)Las cepas que no poseen cápsula se denominan no tipificables. El polisacárido capsular permite definir 6 serotipos: el tipo “b” produce el 95% de las enfermedades invasivas.Los  anticuerpos  anti-cápsula  son  protectores.  Los  anticuerpos  frente  a  la  cápsula suponen  un  estímulo  importante  de  la  fagocitosis  bacteriana  y  la  actividad bactericida mediada por el complemento. Estos anticuerpos se desarrollan como consecuencia de una infección natural, la vacunación con PRP purificado, o la transferencia pasiva de anticuerpos maternos.

IgA proteasa: degrada IgA de mucosasNeuraminidasa

Haemophilus influenzae: Manifestaciones clínicas

H.influenzae

Nocapsulado

Neumonía, sinusitis, otitis media,conjuntivitis

Capsulado

Meningitis bacteriana purulentaNeumoníaEpiglotitisCelulitisArtritis sépticaBacteriemia con foco oculto

üH. Influenzae “no tipificables” o “no capsulados” son oportunistas.

Haemophilus influenzae: Diagnóstico

• Toma de muestra• Microscopía: se observan cocos o cocobacilos gramnegativos• Cultivo: se realiza en AGAR CHOCOLATE• Pruebas bioquímicas• Detección de Ag capsulares, principalmente del grupo b •     

Haemophilus influenzae: Vacunación

La vacunación activa con vacunas conjugadas con PRP (antígeno capsular  purificado)  permite  prevenir  la  mayoría  de  las infecciones por Haemophilus influenzae tipo b

Haemophilus ducreyiEs el agente etiológico de la enfermedad de transmisión sexual: chancro blando o chancroide ,  caracterizada  por  una  pápula dolorosa  a  la  palpación  con  una  base  eritematosa  que  se transforma  en  una  ulceración  dolorosa  con  linfadenopatía asociada

Factores de virulencia:üCitotoxinaüFimbriasüLOSüHemolisina

Haemophilus ducreyi: DiagnósticoClínico: lesión genitalToma de muestra  MicroscopíaCultivo (H. ducreyi requiere que el microbiólogo investigue específicamente esta bacteria puesto que su recuperación exige técnicas especiales de cultivo)Pruebas bioquímicas:     Factor X           +    Factor V           -    Catalasa           -    No fermenta: glucosa, sacarosa, manosa, lactosa 

NEISSERIA

• Diplococos Gram negativos con requerimientos exigentes de crecimiento

• Aerobios• Oxidasa positivos• Generan ácido por oxidación de hidratos de carbono• Reservorio humano exclusivo• Muchas especies son flora habitual

• Dos especies patógenas: • Neisseria meningitidis• Neisseria gonorrhoeae

Neisseria spp.

Neisseria meningitidisEPIDEMIOLOGÍA• Coloniza nasofaringe de personas sanas• Es la segunda causa de meningitis en adultos• Transmisión: por aerosolización de las secreciones• La incidencia más elevada en niños menores de 5 años, en personas

que viven en instituciones cerradas y en pacientes con defectos en los últimos factores del complemento

ENFERMEDADESMeningitis: inflamación purulenta de las meninges; elevada tasa de mortalidad excepto con tratamiento precoz Meningococemia: infección diseminada caracterizada por trombosis de pequeños vasos sanguíneos y afectación multiorgánicaNeumonía: forma más leve, caracterizada por bronconeumonía en sujetos con enfermedad pulmonar de base

Neisseria meningitidisFACTORES DE VIRULENCIASOBREVIVE DENTRO DE LOS PMN Y LOS DESTRUYE

• FIMBRIAS Y PILI: permiten la colonización de la nasofaringe• PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERNA: Clase 1 a 5• LOS: endotóxico, es antigénico• IgA PROTEASA• CÁPSULA: antifagocitaria. Se han descripto 12 serogrupos: A, 

B, C, H, I, K, L, X, Y, Z, 29 E, W135.• A, B, C, Y y W135 son lo más asociados a enfermedad• Existen VACUNAS contra cápsula A, C, AC y ACYW135• Cápsula B no es inmunogénica, por ello las vacunas se 

realizan con proteínas de membana externa • Recordar reacción cruzada grupo B con K1 de E.coli     

     

Neisseria meningitidis: Diagnóstico

• Toma de muestra: LCR, hemocultivo  • Microscopia: Gram• Cultivo: Agar sangre, agar chocolate, medio de Thayer Martin• Pruebas bioquimicas

•     Oxidasa positivo•     Generan ácido a partir de gucosa y  maltosa

• Pruebas de detección rápida de antígenos capsulares • PCR

Neisseria gonorrhoeaeENFERMEDADESLas  infecciones  están  limitadas  a  las  superficies  mucosas  con  células epiteliales  columnares  (uretra,  cérvix,  recto,  faringe,  conjuntiva);  no  en vagina  (células  escamosas)  excepto  en  prepúberes,  en  quienes  puede producir vulvovaginitis

Gonorrea: Enfermedad de transmisión sexual, caracterizada por secreción purulenta en la localización afectada (p. ej., uretra, cuello del útero, epidÍdimo, próstata, ano)Infecciones diseminadas: diseminación de la infección desde el aparato genitourinario a través de la sangre Oftalmía neonatal: infección ocular purulenta adquirida por el neonato al pasar por canal de parto

Neisseria gonorrhoeaeFACTORES DE VIRULENCIA:• Pili, proteínas PorB y Opa: Intervienen en la fijación y la 

penetración en las células huésped• LOS: Endotoxina.• Vive dentro de los pmn y pueden pasar a sangreEPIDEMIOLOGÍA:• Afecta exclusivamente al ser humano• Es la ETS mas frecuente luego de Chlamydia• Existe subregistro • El principal reservorio son las personas asintomáticas• Alta incidencia en mujeres de 15 a 19 años y en varones de 20 a 

24 años; en personas con múltiples parejas sexuales• Las mujeres con infecciones asintomáticas tienen alto riesgo de 

desarrollar  enfermedad  pélvica  inflamatoria  y  gonococcia diseminada

Bordetella pertussis

Bordetella pertussisAGENTE ETIOLÓGICO DE LA TOS CONVULSA

• Bacilo GRAM NEGATIVO• Aerobio estricto• Fastidioso• Reservorio: HUMANO

Afecta la vía aérea superiorColoniza las cilias del epitelio respiratorioSe disemina por contigüidad  

Bordetella pertussis

1) Colonización Enfermedad del tracto respiratoriosuperior: Fiebre y tos. La bacteria puede aislarse de nasofaringe 

2) ToxemiaTos seca, prolongada y paroxística. Excesiva producción de mucus y vómitos. Estridor característico  

• Hemaglutinina filamentosa• Toxina pertussisOtros 2 tipos de adhesinas, 2 tipos de fimbrias y pertactina 

• Adenilatociclasa invasiva• Toxina letal• Citotoxina traqueal• Toxina pertussis• LPS

Tos convulsa: Presenta 2 estadíos:

Factores de patogenicidadHEMAGLUTININA FILAMENTOSA (HAF)• Estimula la fagocitosis por PMN• Forma  estructuras  filamentosas  en  la  superficie  celular.  Une  residuos  de galactosa de sulfátidos presentes en gran cantidad en la membrana de las células ciliadas. 

• Mutaciones en su expresión reducen la capacidad para colonizar• Anticuerpos anti-HAF protegen contra la infección. 

TOXINA PERTUSSIS (TP)• Es un hexámero (S1, S2, S3, dos S4 y S5) que puede actuar como adhesina y como toxina. Estimula la fagocitosis por PMN

• Toxina tipo A-B (A=S1 y B=S2 a S5)• S2 y S3 funcionan como adhesinas: S2 se une a un glicolípido de las células ciliadas;  S3  se  une  a  gangliósidos  que  se  encuentran  principalmente  en células fagocíticas

• S1 es el componente A, que tiene actividad ADP-ribosilante.• Ac anti-componentes de la toxina previenen la colonización en       células ciliadas y protegen de la infección.

Factores de patogenicidadADENILATOCICLASA INVASIVA• Produce AMPc directamente sólo en células eucariotas• Actúa localmente reduciendo la fagocitosis• Sólo es efectiva cuando se une a calmodulina

CITOTOXINA TRAQUEAL• Fragmento de peptidoglicano que se libera. • Es tóxica para las células epiteliales ciliadas y estimula la liberación de IL-1 (fiebre)

 

LPS• Es heterogéneo, según la cantidad de fosfatos en la molécula lipídica• 2 tipos de LPS:  

– Con Lípido A : no pirogénic – Con Lípido X: pirogénico. Su Ag O es un potente adjuvante

Complicaciones principales de la Tos Convulsa

• Infecciones secundarias• Otitis media• Neumonía

• Daño  neurológico  ireversible  por  edema, hemorragias, émbolos en cerebro

Diagnóstico de Tos convulsa

Hisopado faríngeo o aspirado nasofaríngeo• Cultivo en Bordet Gengou (5-7 días)• IFD en la muestra

• Linfocitosis

Tos convulsa: Vacunas Según el Ministerio de Salud, se aplica:• A los 2, 4 y 6 meses: con la VACUNA PENTAVALENTE (DTP-HB-Hib: difteria, tétanos, 

Tos convulsa, Hepatitis B, Haemophilus influenzae b)• A los 18 meses: con la VACUNA CUÁDRUPLE (DTP-Hib: difteria, tétanos, Tos 

convulsa, Haemophilus influenzae b)• A los 6 años: con la VACUNA TRIPLE BACTERIANA CELULAR (DTP: difteria, tétanos, 

Tos convulsa)• A los 11 años: con la vacuna TRIPLE BACTERIANA ACELULAR (dTpa: difteria, 

tétanos, Tos convulsa)• Durante el embarazo: con la vacuna triple bacteriana acelular a partir de la semana 

20 de gestación.• A puérperas que no se hayan vacunado durante el embarazo o en el posparto 

inmediato.• Al personal de salud que presta cuidado a niños menores de un año.• A convivientes de prematuros menores de 1500 gramos.

Legionella pneumophila

Legionella pneumophila• Bacilo Gram negativo• Flagelado• Aeróbico• Patógeno intracelular facultativo• Causa infecciones oportunistas• Está presente en el agua y en el medio ambiente• Reservorio ambiental en amebas y protozoarios

Legionella pneumophila• Generalmente se adquiere por respirar vapor de agua que contiene las

bacterias. El vapor puede provenir de bañeras o duchas calientes o de unidades de aire acondicionado en edificios grandes.

• Las bacterias no pasan de una persona a otra.• Produce enfermedad en ancianos e inmunocomprometidos

• LEGIONELOSIS Neumonía necrotizante severa multifocal

• FIEBRE DE PONTIAC: Enfermedad febril no pulmonar

Legionella pneumophila: Diagnóstico

Cultivo en medios selectivos (Agar BCYE) 

IFD:  para detectar antígenos de  Legionella en muestras clínicas. Se Ac monoclonales unidos a fluoresceína. 

Hibridización molecular con sondas específicas

Género Bacteroides

Género Bacteroides • Bacilos   Gram  negativos,  anaerobios  no  formadores  de 

esporas

• Principal  componente  de  la  flora  habitual  gastrointestinal, vaginal y bucal en los mamíferos

• En el intestino del huésped juegan un papel importante en el procesamiento  de  las  moléculas  complejas  en  otras  más simples

• Se  han  encontrado  concentraciones  tan  altas  como  10 10 -1011 células por gramo de heces humanas

• Bacteroides  es  generalmente  resistente  a  una  amplia variedad de antibióticos

Bacteroides fragilis

• Aunque representa sólo el 1-2% de la flora normal, es  la especie aisladas en el 81% de las infecciones clínicas anaeróbicas

• No es invasivo, pero puede producir  infecciones intraabdominales en caso que la pared de la mucosa del intestino se altere (cirugía gastrointestinal,  apendicitis  perforada  o  gangrenosa,  úlcera perforada,  diverticulitis,  traumatismo,  y  enfermedad  intestinal inflamatoria)

• El  modelo  actual  para  el  desarrollo  de  estas  infecciones abdominales se basa en el concepto de sinergia

Bacteroides fragilis• Después de la interrupción de la pared intestinal, la flora normal se 

infiltra en  la cavidad peritoneal normalmente estéril,  y durante  la etapa temprana, aguda de la infección (aprox. 20 hs), los aerobios (ej,  E.coli)  son  los  miembros  más  activos  de  la  infección, destruyendo el tejido y reduciendo el potencial de oxido-reducción

• Cuando  el  oxígeno  ha  disminuído,  se  crean  las  condiciones ideales  para  la  replicación  de  los  anaerobios,  y  los  Bacteroides comienzan a predominar durante la segunda etapa, crónica de la infección

• Los  Bacteroides  contribuyen  al  desarrollo  de  una  infección sinérgica de tres maneras: 

• Estimulando la formación de abscesos, • Por reducción de la fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares, e • Inactivación de los antibióticos por beta-lactamasas 

Factores de virulencia:

• Cápsula: antifagocitaria. Estimula una respuesta mediada por células T 

• LPS     • Fimbrias: adhesión• Enterotoxinas:rompe unión entre células 

epiteliales del intestino• Exoenzimas

Diagnóstico

• Toma  de  muestra:  es  importante  el medio  de transporte  para  conservar  los anaerobios  y  la correcta  elección  de  la  metodología  (Ej. Punción-aspiración) 

• Microscopía• Cultivo: medios complementados con bilis y en atmósfera anaerobia