Next Generation Sequencing (NGS) Revolution i den kliniska ... · Wizard® Genomic Purification Kit (Promega) 2 loopar of >1µL kollonier resuspi Nuclei Lysis Solution sedan enl protokoll

Next Generation Sequencing (NGS) –

Revolution i den kliniska vardagen?

Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska länskliniken

Molekylärdiagnostik & FOU

Universitetssjukhuset Örebro

Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

INNEHÅLL

BAKGRUND – DNA

HISTORA – DNA SEKVENSERING

NEXT GENERATION SEQUENCING

MISEQ - ILLUMINA

DATA ANALYS

KLINISKA APPLIKATIONER

FORSKNING till KLINISK APPLIKATION

NGS SOM RUTINANALYS

SAMMANFATTNING


BAKGRUND - DNA

1953 Dubbelhelix – Watson & Crick

James D. Watson, 1928

Francis Crick, 1916

Baser: G=Guanin

C=Cytosin

A=Adenin

T=Thymin


1975 Sanger sekvensering

(stoppnukleotider)

1977 Maximam - Gilbert sekvensering

(kemisk nedbrytningssekvensering)

1977 Utveckling av Sanger sekvensering

HISTORA - DNA SEKVENSERING

Walter Gilbert, 1932

Frederick Sanger, 1918

G* C* A* T*

G*

G*

G*


http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=sv&prev=/search?q%3Dsequencing%2Bhistory%26rls%3Dcom.microsoft:sv:IE-SearchBox%26rlz%3D1I7GGLJ&rurl=translate.google.com&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki///upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f8/Frederick_Sanger2.jpg

1977 Bakteriofag X174

1984 Epstein-Barr-virus, 170 tusen bp

1987 1:a Helautomatiska DNA

sekvenserings maskinen ABI 370



http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=sv&prev=/search?q%3Dsequencing%2Bhistory%26rls%3Dcom.microsoft:sv:IE-SearchBox%26rlz%3D1I7GGLJ&rurl=translate.google.com&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki///upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f8/Frederick_Sanger2.jpg

1995 1:a bakteriegenomet Haemophilus influenzae 1,8 miljoner bp

1996 Pyrosekvensering – Pål Nyrén & Mostafa Ronaghi,

KTH, Stockholm

2001 1:a Humana genomet >3 miljarder bp



NEXT GENERATION SEQUENCING

2000 MPSS – (Lynx Therapeutics) –

Massive Parallell Signature Sequencing

2010 SMRT (Pacific Bioscience) –

Single Molecule Realtime Technology

Referensgenom

http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/

”massiv parallell sekvensering”

Ordlista

Sekvenseringsdjup = x coverage, dvs hur många gånger samma bas ”täcks in”

De novo sequencing = sekvensering av ”okända” organismer

Resequencing = sekvensering av känd organism där ett referensgenom

används i analysen, se bild ovan.





MISEQ - ILLUMINA

Bibl. prep

2 h

hands-on

4-6 h

MiSeq sekv

20 min

hands-on

1-2 dygn

Analys

Helt automatiserad på

MiSeq eller alt. mjukvara

~1 dygn


MISEQ - ILLUMINA

Tagmentering – fragmentering och inmärkning


MISEQ - ILLUMINA

Kluster generering -

Flödescell


MISEQ - ILLUMINA

Sekvensering


MISEQ - ILLUMINA

Ex. MiSeq run


Flödesschema - NexteraXT

DNA preparation

Tagmentering

PCR-amplifiering

PCR-rening

Normalisering

(kulor)

Poolning

MiSeq

Normalisering

(BioAnalyzer & qPCR)

MISEQ - ILLUMINA

Kritiska steg för kvalitén

på NGS data


DNA preparationen: kvalité + mängd

Wizard® Genomic

Purification Kit (Promega)

2 loopar of >1µL kollonier

resuspi Nuclei Lysis Solution

sedan enl protokoll

Eluera i Tris-HCL utan EDTA

Bra kvalité

(Även andra metoder fungerar,

tex QIASymphony)

Qubit ® 2.0 Fluorometer

(Invitrogen)

Qubit dsDNA BR assay

Kit (Molecular Probes)

Späd till 0,2 ng/µL

(mät mellan spädningar)

Exakt mängd: 1 ng (5µL)

MISEQ - ILLUMINA


MISEQ - ILLUMINA

Tagmentering

>1 ng DNA minskad fragmentering (för långa fragment)

<1 ng DNA ökad fragmentering (för korta fragment)


MISEQ - ILLUMINA

Libary quality check – Bioanalyzer with High Sensitivity DNA kit (Agilent)

1 µL ospätt bibliotek

Figuren visar ett lyckat sekvenserat

bibliotek.

Ett typiskt bibliotek visar en distribution

från ~250 bp till 1000 bp men även

fragment upp till 1500 bp går att

sekvensera.

qPCR Koncentrationen av varje bibliotek fastställs

med qPCR från KAPA vars primerar binder

in till Illuminas p5 och p7-indexar.

Samma mängd in i poolen – mer lika resultat

dvs antal reads per isolat

Normalisering


DATA ANALYS

Samarbete med Bioinformatiker?

Lägga ihop sekvenser till Contigs ”assembla”: SPAdes, CLC, Velvet Optimiser m.fl.

contigs.fasta

databaser för Typning av bakterier: BIGSdb, SeqSphere m.fl.

databaser för Antibiotikaresistens tex ResFinder, BLAST m.fl.


DATA ANALYSIS

MiSeq BaseSpace Apps

+

OR

+


DATA ANALYSIS


DATA ANALYSIS


DATA ANALYSIS


DATA ANALYS

BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database

http://pubmlst.org/databases/

Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data

Assembled FASTQ file


http://pubmlst.org/databases/


Mikrobiologi:

Utbrottsutredningar – smittspårning, källan till smitta

Epidemiologisk typning – övervakning och rapportering

Karaktärisering av resistensmarkörer – koll på mutationer, hitta nya

Identifiera “okända” organismer – kända/okända

Detektera kända virulensfaktorer – ident. sjukdomsframkallande bakterier

Patologi/kemi:

Cancerpaneler – ta reda på cancertyp och sen rikta behandlingen

SNP analys – analysera enstaka positioner i gener kopplade till viss sjukdom

Transkriptom analys – karaktärisera uttryck av gener ex kolla vilka gener som är

påslagna hos sjuka resp friska (RNA – cDNA – NGS)



http://www.bbc.co.uk/news/health-20314024

2013-10-14

Multiresistenta

Staphylococcus aureus

”SUPERBUG”

MRSA utbrott



EHEC - utbrott


KLINISKA APPLIKATIONER Ötzi = Ismannen



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Nu

mb

er

of

iso

late

s

Year

B

C

Y

W-135

SYFTE

Undersöka de genetiska grunderna till ökningen

av N. meningitidis serogrupp Y i Sverige


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Inc

ide

ns p

er

10

0,0

00

in

vå

nare

År

Övriga (n=44)

Klon YIII (n=6)

Klon YII (n=7)

Klon YI (n=28)


(n=85)

Finetyping

7 x MLST gener

porA

porB

fetA

fHbp

penA


Strain type YII

P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23);

2-55; 25; 22

Strain type YIII

P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23);

3-36; 25; 1

Strain type YI

P1.5-2,10-1,36-2; F4-1;

ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22

Illumina HiSeq,

Oxford University

1995-2012 (n=185)

Subtype 1

2006-2012

Subtype 2

1995-2012

NGS

ger samma grova indelning som ”fintypning” av de 12 generna

YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1

är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige


Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria

meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012

Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén,

Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling

Accepted in Journal of Clinical Microbiology April 2015


Finetyping

MLST (7)

MLVA

fHbp

fetA

penA

porB

Rutintypningar: genetiska/fenotypiska

- dagligen/veckovis

PCR

A B C

Y W-135

Kapselgener

VR1 VR2,3

porA

SP GBS MC 16S

HI LM

DNA prep Serogruppering/antibiogram

Identifiering Genogruppering Genosubtypning

Misstänkt bakteriell meningit

NGS

Epidemiol övervakning – 2 ggr/år

Utbrottsutredningar – i stunden

NGS SOM RUTINANALYS


SAMMANFATTNING

NGS – enorma möjligheter!!!

Epidemiologisk typning

Utbrottsutredningar

Karaktärisera resistensmarkörer

Identifiera okända organismer

Hitta virulensgener

Cancerpaneler

etc

Begränsningar

Saknar Bioinformatiskt kunnande!!!

Dataanalysen tar ganska lång tid och datakraft


Tack!


Documents

Next Generation Sequencing (NGS) Revolution i den kliniska ... · Wizard® Genomic Purification Kit (Promega) 2 loopar of >1µL kollonier resuspi Nuclei Lysis Solution sedan enl protokoll