NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

--------

Nguyễn Lệ Hà

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG

ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS

MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Nha Trang 2011

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.com Clic

k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om

http://www.pdfxviewer.com/


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

--------

Nguyễn Lệ Hà

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG

ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS

MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 62 54 10 05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. TRẦN THỊ LUYẾN 2. PGS. TS ĐỒNG THỊ THANH THU

Nha Trang 2011

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự quan tâm

tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, các tập thể, các cá nhân trong và ngoài

trường, đã góp phần vào sự hòan thành luận án này.

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới các cô giáo hướng dẫn: GS.TS.

Trần Thị Luyến, Nguyên Hiệu phó trường Đại học Nha Trang, PGS.TS. Đồng Thị

Thanh Thu, Nguyên Trưởng bộ môn Hóa sinh trường Đại học tổng hợp TPHCM,

những người đã hết lòng chỉ bảo tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện

luận án, góp phần làm nên kết quả của luận án này.

Xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng, CN Đỗ Thị Tuyến, Viện

Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, Th.S Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Trưởng

phòng Miễn dịch Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, PGS. TS Ngô Đăng Nghĩa vì

những ý kiến đóng góp và sự giúp đỡ trong quá trình thực nghiệm.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học Trường Đại học Nha

Trang, Ban giám hiệu và Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm Trường Đại học

Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều tiện thuận lợi cho tôi trong quá trình

học tập, nghiên cứu và bảo vệ luận án.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm,

chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành công việc.

Nguyễn Lệ Hà

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công

trình nào khác.

Tác giả luận án

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DANH SÁCH HÌNH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DANH SÁCH BẢNG. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DANH SÁCH SƠ ĐỒ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

MỞ ĐẦU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chương 1- TỔNG QUAN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1 GIỚI THIỆU VỀ TÔM SÚ Penaeus monodon. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1.1 Cấu tạo và đặc điểm sinh học của tôm sú. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1.2 Tập tính ăn của tôm sú. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME VÀ PROTEASE TRONG

THỦY SẢN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2.1 Giới thiệu chung về enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2.2 Phương pháp tách và làm sạch enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2.4 Protease của động vật thủy sản. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TỪ CÁ VÀ THỦY SẢN VÀO

MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.1. Sự phân giải có chọn lọc mô thịt cá và thủy sản. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.2. Sử dụng enzyme protease trong chiết rút carotenoprotein từ phế liệu

của quá trình chế biến các loài giáp xác. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.3. Sử dụng protease vào thu nhận chitin và protein từ phế thải chế biến

tôm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.4. Ứng dụng protease chiết rút từ cá và thủy sản thay thế rennet trong

sản xuất phomai. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.5. Sử dụng enzyme protease trong sản xuất dịch cá (nước mắm) . . . . . .

1.3.6. Sử dụng protease trong sản xuất bột đạm cá thủy phân . . . . . . . . . . .

TRANG

i

i

ii

vii

viii

1

5

5

5

6

6

7

11

12

14

15

18

19

20

20

21

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



1.4 CAROTENOPROTEIN TRONG ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN VÀ MỘT

SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT RÚT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.1 Carotenoid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.2 Astaxanthin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.3 Carotenoprotein. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.4 Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến

động vật giáp xác. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ ỨNG DỤNG CỦA

ENZYME PROTEASE TỪ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN . . . . . . . . . . . . . . . .

Chương 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . . . .

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU . . . . . . . . . . . . .

2.1.1 Nguyên liệu để tách chiết và tinh sạch enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1.2 Nguyên liệu dùng trong quá trình ứng dụng enzyme protease vào thủy

phân. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2.1 Thu nhận protease tinh sạch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2.2 Khảo sát các tính chất của protease sau tinh sạch . . . . . . . . . . . . . . .

2.2.3 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme CPE thu nhận từ đầu tôm sú

vào thủy phân protein từ hỗn hợp máu và gan cá basa . . . . . . . . . . .

2.2.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa . . . . . .

2.2.5 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ đầu tôm sú vào

thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm thu nhận carotenoprotein . . . . . . .

2.2.6 Tối ưu hóa quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein . . . . . . . . .

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG. . . . . . . . . . . . . . .

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chương 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN. . . . . . . . . . . . . .

3.1 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH

TINH SẠCH PROTEASE TỪ GAN TỤY VÀ ĐẦU TÔM SÚ . . . . . . . . . .

23

23

24

29

33

37

41

41

41

41

42

42

42

47

52

55

55

60

61

62

63

63

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



3.1.1. Các thông số cho quá trình thu nhận chế phẩm protease từ gan tụy và

đầu tôm sú. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1.2. Thu nhận protease tinh sạch từ chế phẩm enzyme gan tụy và đầu tôm

sú Penaeus monodon bằng sắc ký lọc gel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2. MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE SAU TINH SẠCH TỪ GAN

TỤY VÀ ĐẦU TÔM SÚ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2.1. Trọng lượng phân tử của protease gan tụy và đầu tôm . . . . . . . . . . . .

3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease sau tinh sạch . . . . . . . .

3.2.3. Độ bền nhiệt của protease sau tinh sạch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm . . . . . . .

3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ protease sau tinh sạch

3.2.6 Ảnh hưởng của một số kim loại và chất ức chế đến hoạt độ protease

tôm sú sau tinh sạch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2.7. Động học của protease gan tụy tôm sau tinh sạch . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP MÁU VÀ

GAN CÁ BA SA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TÁCH

CHIẾT TỪ ĐẦU TÔM SÚ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.1 So sánh quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease đầu tôm

trên hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt . . . . . . . . . . . . .

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme protease đến quá trình

thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa gia nhiệt . . . . . . . . . . . .

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan

cá gia nhiệt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân hỗn hợp máu và

gan cá gia nhiệt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.4 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP MÁU VÀ GAN

CÁ BASA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME TỪ ĐẦU TÔM SÚ . . . . . .

3.4.1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân . . . . . . . . . . .

3.4.2 Xác định chỉ tiêu tối ưu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

63

70

76

76

83

85

88

90

92

97

101

101

103

106

107

109

109

110

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



3.4.3 Thiết lập phương trình hồi qui của quá trình thủy phân . . . . . . . . . . . .

3.4.4 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng, tìm thông số tối ưu của quá trình thủy

phân. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .

3.4.5 Sơ bộ đánh giá chất lượng dịch thủy phân thu được. . . . . . . . . . . . . . . .

3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THU NHẬN BỘT

CAROTENOPROTEIN TỪ ĐẦU VÀ VỎ TÔM BẰNG CHẾ PHẨM

ENZYME PROTEASE TÁCH CHIẾT TỪ ĐẦU TÔM SÚ . . . . . . . . . . . . .

3.5.1 Thành phần phế liệu đầu và vỏ tôm sú. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5.2 Xác định điểm đẳng điện của dịch thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm . . .

3.5.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm thu nhận bột

carotenoprotein. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU, VỎ TÔM

THU SẢN PHẨM BỘT CAROTENOPROTEIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân . . . . . . . . . . .

3.6.2 Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thủy phân. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.3 Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng carotenoid CP và xác

định thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein giàu

carotenoid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.4 Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng protein AP và xác định

thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein giàu

protein. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.5 Kiểm tra tính tương thích của các chỉ tiêu tối ưu vào thực nghiệm . . . .

3.6.6 Sơ bộ đánh giá về chất lượng của bột carotenoprotein thu nhận từ phế

liệu tôm theo thông số tối ưu hóa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

TÀI LIỆU THAM KHẢO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PHỤ LỤC

110

114

121

123

123

124

126

140

141

142

142

149

156

158

161

164

165

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DC

CPE

ĐC

PI

S

V

PMSF

SBTI

TLCK

TPCK

EDTA

Dịch chiết

Chế phẩm enzyme

Đối chứng

Điểm đẳng điện

Nồng độ cơ chất

Vận tốc phản ứng thủy phân

Phenylmethyl sulphonyl fluoride

Soybean trypsin inhibitor

Tosyl-lysine chloromethyl ketone

Tosil-phenyl chloromethyl ketone

Ethylene diamine tetraacetic acid

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU

HL

CP

AP

T

C

tg

Hàm lượng peptid và acid amin mạch ngắn

Hàm lượng carotenoid

Hàm lượng protein hòa tan

Nhiệt độ thủy phân

Nồng độ chế phẩm enzyme

Thời gian thủy phân

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình Trang 1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

2.1

2.2

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

Cấu tạo ngoài và trong của tôm sú

Nguyên tắc hoạt động của một số loại sắc ký Tách các phân tử bằng lọc gel

Cấu trúc hóa học của một số carotenoid

Các dạng astaxanthin

Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad

Thiết bị điện di

Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ gan tụy:dung môi (w/v) đến hiệu

suất thu nhận protease của dịch chiết từ gan tụy tôm sú

Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm:dung môi (w/v) đến hiệu

suất thu nhận protease của dịch chiết từ đầu tôm sú

Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ nội tạng:dung môi (w/v) đến hoạt

độ riêng của dịch chiết từ gan tụy tôm sú

Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm:dung môi (w/v) đến hoạt

độ riêng của dịch chiết từ đầu tôm sú

Ảnh hưởng của thời gian chiết rút đến hoạt độ protease dịch chiết từ

gan tụy và đầu tôm sú

Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ chất kết tủa đến hoạt độ riêng

protease của chế phẩm enzyme từ gan tụy tôm sú

Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ riêng

protease của chế phẩm enzyme từ đầu tôm sú

Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ riêng protease chế

phẩm enzyme từ gan tụy và đầu tôm sú

Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH4)2SO4 từ đầu tôm Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ đầu tôm

sú

5

10

11

25

28

46

48

64

64

66

66

67

69

69

70

73

73

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



Hình Tên hình Trang

3.11

3.12

3.13

3.14

3.15

3.16

3.17

3.18

3.19

3.20

3.21

3.22

3.23

3.24

3.25

3.26

Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH4)2SO4 từ gan

tụy tôm

Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ gan tụy

tôm

Điện di đồ Zymogram của protease gan tụy tôm sú

Điện di đồ Zymogram của protease đầu tôm sú

Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng

cách di chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamide 12%

Điện di đồ Zymogram so sánh hệ protease gan tụy (a) và đầu tôm

sú (b)

Điện di đồ Substrate-Gel so sánh hệ protease gan tụy (a) và đầu

tôm sú (b)

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ tương đối của protease gan

tụy và đầu tôm

Độ bền nhiệt của protease gan tụy và đầu tôm ở các nhiệt độ khác

nhau

Ảnh hưởng của pH đến độ hoạt động của protease thu nhận từ gan

tụy và đầu tôm sú

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến độ hoạt động của protease từ

gan tụy và đầu tôm

Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ protease tôm sú

Ảnh hưởng của một số chất kìm hãm đến hoạt độ của protease tôm

Biến đổi vận tốc phản ứng thủy phân V theo nồng độ cơ chất [S]

Quan hệ giữa nghịch đảo vận tốc và nghịch đảo nồng độ cơ chất

trong phản ứng thủy phân do protease tôm xúc tác

Đồ thị Hill- quan hệ giữa log[v/(Vmax-v)] và log[S]

74

74

76

77

78

79

80

84

86

89

91

93

95

98

98

100

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om




3.27

3.28

3.29

3.30

3.31

3.32

3.33

3.34

3.35

3.36

3.37

3.38

Biến động hàm lượng peptid và acid amin trong quá trình thủy

phân hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến biến đổi hàm lượng peptid và

acid amin trong dịch thủy phân ở 40oC





Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biến đổi hàm lượng peptid và acid

amin trong dịch thủy phân khi nồng độ CPE bổ sung là 2%

Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân theo

thời gian ở nồng độ CPE bổ sung 3,5%

Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân theo

thời gian ở nồng độ CPE bổ sung 4,5%

Ảnh hưởng của nhiệt độ (T) và thời gian (tg) đến hàm mục tiêu HL

(Function) khi nồng độ chế phẩm enzyme CPE bổ sung là 3%


(Function) khi nồng độ chế phẩm enzyme CPE bổ sung là 3,5%




peptid và acid amin khi nồng độ chế phẩm enzyme CPE bổ sung là

4,5%

Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme bổ sung đến hàm lượng

peptid và acid amin tạo thành sau 14,5 giờ thủy phân ở nhiệt độ

57oC

102

104

104

105

106

108

108

116

117

118

119

120

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om




3.39

3.40

3.41

3.42

3.43

3.44

3.45

3.46

3.47

3.48

3.49

3.50

3.51

Độ hòa tan của protein ở dịch trong sau kết tủa thu

carotenoprotein

Hiệu suất thu nhận carotenoid trong quá trình thủy phân phế liệu

tôm tươi và đã gia nhiệt

Hiệu suất thu nhận protein hòa tan trong quá trình thủy phân phế

liệu tôm tươi và đã gia nhiệt

Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận carotenoid

khi thủy phân phế liệu tôm ở 40oC







Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận carotenoid khi

thủy phân phế liệu tôm với nồng độ CPE 2%


thủy phân phế liệu tôm với nồng độ CPE 3,5%


thủy phân phế liệu tôm với nồng độ CPE 5%

Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu protein khi thủy

phân phế liệu tôm ở 40oC





125

127

127

130

130

131

131

132

133

133

136

136

137

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



Hình Tên hình Trang 3.52

3.53

3.54

3.55

3.56

3.57

3.58

3.59

3.60

3.61

3.62

3.63

Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận protein khi

thủy phân phế liệu tôm ở 65oC

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận protein khi thủy

phân phế liệu tôm với nồng độ CPE 2%


phân phế liệu tôm với nồng độ CPE 3,5%



Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 2%

Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 3,5%

Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 5%

Bề mặt đáp ứng hàm CP sau 10 giờ thủy phân

Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 2%

Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 3,5%

Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 5%

Bề mặt đáp ứng hàm AP sau khi thủy phân 9,5 giờ

138

139

139

140

146

147

148

149

153

154

155

156

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

3.11

3.12

3.13

3.14

3.15

3.16

3.17

Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy tôm sú

Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch protease từ đầu tôm sú

Trọng lượng phân tử của protease gan tụy và đầu tôm Penaeus

monodon

Hoạt tính còn lại (%) của protease gan tụy và đầu tôm sú khi có

mặt một số chất ức chế đặc hiệu

Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu trong quá trình thủy

phân hỗn hợp máu và gan cá

Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui

Nhận xét cảm quan dịch thuỷ phân hỗn hợp máu và gan cá basa

Một số chỉ tiêu hóa học của dịch thủy phân từ hỗn hợp máu và

gan cá basa

Thành phần acid amin trong dịch đạm thủy phân

Thành phần cơ bản của phế liệu đầu, vỏ tôm P. monodon

Khoảng biến thiên của các yếu tố biến đổi cần tối ưu khi thủy

phân đầu, vỏ tôm

Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui CP

Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui AP

Thông số tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein

Các thông số kỹ thuật bột carotenoprotein trên thực tế và theo

tính toán

Thành phần hóa học cơ bản của bột carotenoprotein

Thành phần acid amin của bột carotenoprotein

72

75

78

95

110

115

121

121

122

124

141

145

152

157

158

159

159

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

2.10

3.1

3.2

3.3

Bố trí thí nghiệm nghiên cứu enzyme protease từ đầu và gan tụy tôm

sú

Bố trí thí nghiệm xác định dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp thu dịch

chiết enzyme

Bố trí thí nghiệm xác định tác nhân và nồng độ tủa thích hợp thu chế

phẩm enzyme

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của

enzyme protease

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme

protease từ đầu và gan tụy tôm sú

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl tới

hoạt độ enzyme protease

Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thuỷ phân hỗn hợp máu và

gan cá basa bằng chế phẩm enzyme từ đầu tôm sú

Bố trí thí nghiệm so sánh quá trình thủy phân bằng CPE protease

đầu tôm trên hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ

tôm

Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện để kết tủa dịch

carotenoprotein sau khi thủy phân

Qui trình tách chiết chế phẩm enzyme từ đầu hoặc gan tụy tôm sú

Qui trình ứng dụng CPE đầu tôm vào thuỷ phân hỗn hợp máu và gan

cá basa

Qui trình thu nhận bột carotenoprotein từ đầu và vỏ tôm

43

44

45

49

50

50

53

54

56

59

71

123

160

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



1

MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung, protease nói riêng được sử

dụng ngày càng phổ biến như một phương tiện trợ giúp hiệu quả ở rất nhiều lĩnh

vực sản xuất thực phẩm và ngày càng đóng vai trò quan trọng hơn trong công nghệ

thực phẩm[14,32]. Sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị

trường thế giới tăng 20-30% mỗi năm [83,85]. Cho đến thời điểm hiện tại, chế

phẩm protease được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực

vật hoặc động vật. Các protease thu nhận từ những phần ăn được của thực vật và

động vật được coi là an toàn, không cần kiểm định và vì vậy, ngày càng thu hút sự

quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm

enzyme thương mại và của người tiêu dùng.

Tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành chế biến thủy sản,

chủ yếu là tôm sú và tôm thẻ chân trắng đông lạnh, trong đó tôm sú là đối tượng

chủ lực quyết định thành công của ngành tôm Việt nam. Mười một tháng đầu năm

2010, sản lượng tôm sú xuất khẩu là 129.000 tấn, trị giá 1,304 tỉ USD, giữ vị trí đầu

trong các mặt hàng thủy sản đông lạnh xuất khẩu, tăng 42,4% về khối lượng và

58,8% về giá trị so với cùng kỳ 2009. Dự kiến giá trị xuất khẩu tôm sú cả năm 2010

là 141.000 tấn, đạt 1,45 tỉ USD. Tôm dùng cho chế biến được cung cấp từ hai

nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó, nguồn tôm nuôi đang chiếm ưu thế và nuôi

tôm ở Việt nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng.

Đồng thời với khối lượng lớn tôm xuất khẩu hàng năm thì phế liệu của nó là

đầu và vỏ tôm cũng chiếm lượng khá lớn. Nếu tính rằng khối lượng đầu tôm trung

bình chiếm 25-30% so với khối lượng toàn cơ thể thì song song với lượng tôm xuất

khẩu năm 2009 là 209.000 tấn sẽ là 50-60.000 tấn đầu tôm được thải ra từ quá trình

chế biến. Trong đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



2

và nhiều hợp chất sinh học khác, đặc biệt là hệ enzyme trong đầu tôm có hoạt độ

khá cao. Phế liệu tôm được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ

để sản xuất chitin. Cách sử dụng như vậy cũng mang lại hiệu quả kinh tế. Tuy

nhiên, vẫn rất cần thiết để tìm ra những phương hướng sử dụng nguồn phế liệu này

một cách có hiệu quả hơn, mang lại những lợi ích cao hơn về kinh tế, kỹ thuật và

môi trường.

Đề tài “ Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú

Penaeus monodon vào chế biến thủy sản” được tiến hành với mong muốn kiếm tìm

những hiểu biết đầy đủ về enzyme protease trong tôm nhằm đáp ứng các nhu cầu

thông tin về mặt hàng nuôi trồng và chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản đất nước,

giúp chúng ta hiểu và lý giải được các biến đổi của tôm sau khi thu hoạch, trong

quá trình chế biến cũng như bảo quản, từ đó đề ra những biện pháp hữu hiệu gìn giữ

chất lượng tôm. Đề tài cũng hướng tới thu nhận protease từ nguồn phế liệu dồi dào

này để ứng dụng trong thủy phân một vài đối tượng phế liệu chế biến thuỷ sản

nhằm nâng cao hiệu quả tận dụng của các phế liệu thải ra và góp phần nhỏ bảo vệ

môi trường.

MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu tách chiết protease từ tôm sú nuôi

Penaeus monodon và tính chất của nó, nghiên cứu ứng dụng enzyme này trong thuỷ

phân protein ở một vài phế liệu chế biến thuỷ sản (máu và gan cá basa Pangasiadon

hypophthanus, phế liệu đầu vỏ tôm) để thu nhận các sản phẩm có giá trị kinh tế cao

hơn.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đề tài tập trung vào đối tượng nghiên cứu là tôm sú nuôi ở vùng biển Cần

Giờ, thành phố Hồ Chí Minh. Phế liệu chế biến thuỷ sản được nghiên cứu tận dụng

gồm hai nguồn: hỗn hợp máu và gan cá basa Pangasiadon hypophthanus nuôi ở

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



3

Tiền giang; hỗn hợp phế liệu đầu và vỏ tôm sú thải ra từ qui trình sản xuất tôm sú

đông lạnh xuất khẩu với nguồn tôm được nuôi ở Cần giờ.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để đạt được mục đích nghiên cứu chung đã đặt ra, đề tài tập trung vào các

nội dung cụ thể sau đây:

1. Xác định qui trình tách chiết và thu nhận chế phẩm enzyme protease CPE từ

phế liệu của ngành thuỷ sản là nội tạng và đầu tôm sú Penaeus monodon.

Xác định dung môi chiết protease, tỷ lệ dung môi chiết: mẫu, và thời gian

chiết thích hợp thu dịch chiết enzyme DC.

Xác định tác nhân kết tủa thích hợp, tỷ lệ tác nhân tủa: mẫu, và thời gian tủa

thích hợp thu chế phẩm enzyme CPE.

2. Tinh sạch enzyme protease từ đầu và nội tạng tôm sú bằng sắc ký lọc gel.

3. Khảo sát một số tính chất của enzyme protease từ nội tạng và đầu tôm.

Xác định phân tử lượng của protease từ nội tạng và đầu tôm.

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối ăn, một số ion kim loại và chất

ức chế đến hoạt độ của protease.

Xác định các thông số động học của protease.

4. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme CPE thu nhận được vào thuỷ phân

dịch hỗn hợp máu và gan cá basa:

Khảo sát khả năng thủy phân của CPE tách chiết từ đầu tôm trên hỗn hợp

máu và gan cá ở dạng tươi hoặc đã qua xử lý nhiệt.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình thủy phân.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



4

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian giữ nhiệt đến quá trình thủy phân.

Tối ưu hóa quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa bằng CPE.

Sơ bộ đánh giá chất lượng của dịch thuỷ phân thu được.

5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme protease vào thủy phân đầu tôm sú

thu bột carotenoprotein.

So sánh quá trình thủy phân phế liệu tôm tươi và đã gia nhiệt

Khảo sát quá trình thủy phân phế liệu tôm

Tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng phương pháp phân tích hồi qui

Đánh giá chất lượng của sản phẩm bột carotenoprotein thu được.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt nam cung cấp đầy đủ các thông tin khoa

học về hệ enzyme protease trong tôm sú nuôi. Kết quả của đề tài làm phong phú

thêm những hiểu biết về protease trong tôm, góp phần định hướng cho những ứng

dụng sau này trong bảo quản và chế biến tôm nuôi ở nước ta. Đây cũng là nghiên

cứu đầu tiên ứng dụng protease tách chiết từ phế liệu đầu tôm vào thuỷ phân dịch

máu và gan cá basa, thủy phân đầu, vỏ tôm, các nguồn phế liệu đang rất cần giải

pháp để giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm có giá trị cho các ứng

dụng tiếp theo trong sản xuất thực phẩm.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



5

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ TÔM SÚ Penaeus monodon

Tôm sú (Tên tiếng Anh: Giant/Black Tiger Shrimp) được định loại là:

Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp

Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác

Bộ: Decapoda – Bộ mười chân

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

Loài: Monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.1.1 Cấu tạo và đặc điểm sinh học của tôm sú [114]

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài và trong của tôm sú [114]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



6

Tôm sú sinh trưởng nhanh, khoảng 4-5 tháng là tôm đạt mức trưởng thành,

dài đến 27 cm và trọng lượng khoảng 250 g. Trong tự nhiên, tôm sú có thể chịu

được sự biến động về độ mặn rất lớn (3-45%), độ mặn tối ưu là 15-25%. Tôm sú

thuộc loài sinh hoạt về đêm và thường ăn thịt lẫn nhau.

Tôm sú thuộc loại động vật máu lạnh, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi trường

bên ngoài. Nhiệt độ ảnh hưởng đến nhiều phương diện trong đời sống của tôm: hô

hấp, tiêu hóa thức ăn, miễn nhiếm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng…Nhiệt độ thay

đổi theo mùa, vì thế, tại miền Nam Việt Nam có thể nuôi tôm quanh năm, trong khi

miền Bắc chỉ nuôi tôm trong mùa nóng. Ở nhiệt độ 28oC, tôm sú lớn tương đối

chậm, ở nhiệt độ 30oC tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc các dịch bệnh. Nhiệt độ

tối ưu cho tôm sú phát triển tại các vùng ao hồ nhiệt đới là 28-30oC

1.1.2 Tập tính ăn của tôm sú [117]

Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống và di chuyển chậm hơn là xác

thối rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnh

vụn hữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng. Tôm sống ngoài tự nhiên ăn

85% là giáp xác, cua nhỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại 15% là cá, giun

nhiều tơ, thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu cơ, cát bùn.

Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú

trong ao, hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Tôm bắt mồi bằng

càng, sau đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày.

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME VÀ PROTEASE TRONG THỦY

SẢN

1.2.1 Giới thiệu chung về enzyme [3,6,7 31,154,155]

Enzyme hay còn gọi là men, là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein.

Enzym có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzyme không những làm nhiệm vụ

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



7

xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng

của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống) mà còn xúc tác cho các phản ứng

ngoài tế bào. Vì có nguồn gốc từ sinh vật do đó enzyme thường được gọi là xúc tác

sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt

của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện bình thường

ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, axit mạnh hay kiềm

mạnh v.v…) nhưng trong cơ thể, nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp

nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện rất “êm dịu nhẹ nhàng”:

37oC, áp suất thường, không có kiềm mạnh, axit mạnh hay nồng độ cao v.v… nhờ

đó mà tránh được tối đa các phản ứng phụ và sản phẩm phụ không mong muốn

[154,155].

Enzyme đã được sử dụng như phương tiện trợ giúp hiệu quả ở rất nhiều lĩnh

vực sản xuất thực phẩm và ngày càng đóng vai trò quan trọng hơn trong công nghệ

thực phẩm. Trước đây, người ta chỉ chú trọng đến việc điều khiển hoạt động của các

enzyme có sẵn trong thực phẩm, vì vậy, chỉ có một số ứng dụng nhất định như sản

xuất các sản phẩm lên men nhờ hoạt động của các protease nội bào ở điều kiện

thích hợp. Ngày nay, việc sử dụng enzyme đã trở nên phổ biến và đóng vai trò quan

trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm với rất nhiều sản phẩm phục vụ nhu cầu

tiêu dùng của con người. Các enzyme cũng đóng vai trò quan trọng trong việc cải

thiện năng suất và thông số kỹ thuật ở nhiều công đoạn sản xuất. Hơn thế, những

thành tựu công nghệ sinh học ngày nay còn cho phép sản xuất ra nhiều loại enzyme

khác nhau với giá thành rẻ và dễ dàng nhờ qui trình tách chiết và tinh sạch đã được

cải tiến [154].

1.2.2 Phương pháp tách và làm sạch enzyme [7,22,28,39]

Enzyme là loại protein có mặt trong mọi tế bào cơ thể sống. Các enzyme có

thể tiết ra ngoài môi trường (enzyme ngoại bào extracellular), tuy nhiên phần lớn

chúng tồn tại trong tế bào (enzyme nội bào intracellular). Các enzyme này thường

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



8

không có khả năng di chuyển qua màng sinh học. Do đó, việc tách chúng ra khỏi tế

bào là điều rất khó khăn. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào

bằng nhiều phương pháp như:

Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh,

cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa …

Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm

Phương pháp hóa học: dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol,

ethylacetate…

Có ba điều cần lưu ý khi tách enzyme khỏi tế bào, đó là :

Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần

khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều khó khăn.

Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng dễ bị biến tính khi bị tác động của

các yếu tố bên ngoài, dễ bị hư hỏng khi bảo quản, do đó, trong khi nghiên

cứu cần bảo quản enzyme ở trạng thái khô, dung dịch đặc (có thể có chất ổn

định) và trong điều kiện lạnh, các thí nghiệm cần tiến hành nhanh chóng

trong môi trường có pH, nhiệt độ thích hợp và không có mặt các chất làm

ngừng hoạt động của enzyme.

Enzyme là protein. Protein enzyme luôn đi cùng những loại protein không

phải enzyme nhưng lại có tính chất hóa lý rất giống protein enzyme. Do đó,

việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng

đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định.

Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung

dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương

pháp trên. Dịch chiết thu được gọi là chế phẩm thô vì trong chế phẩm này, ngoài

enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme và các thành phần khác của tế

bào.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



9

Như vậy, việc làm sạch enzyme chính là loại protein không phải là enzyme

(đôi khi loại bỏ cả các protein-enzyme không mong muốn), nước, các thành phần

khác của tế bào khỏi enzyme.

Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme đang cần, người ta thực

hiện những phương pháp sau:

Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn

lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và

bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5. Ở

điều kiện này, những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến

tính. Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành

phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.

Phương pháp kết tủa phân đoạn

Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác

nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách

này, người ta tách được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch

enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ

như ethanol, acetone để kết tủa protein hoặc các polymer không cực như dextran,

polyethylene glycol.

Phương pháp hấp thu chọn lọc

Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch

enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ được sử

dụng rộng rãi như hydrocyapatite. Phương pháp này có thể thực hiện một trong hai

cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính

enzyme, thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC. Sau khi hấp thụ ta lại

tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



10

Phương pháp sắc ký: Người ta có thể phân loại phương pháp sắc ký

dựa trên các cơ sở khác nhau

-Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác

nhân trao đổi ion, có thể áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange

Chromatography) để làm sạch enzyme. Thường sử dụng phương pháp sắc ký trao

đổi ion sau:

o Nhựa trao đổi ion.

o Dẫn suất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,

diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-

cellulose.

-Dựa vào đặc tính phân cực của protein có thể phân chia:

o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography).

o Sắc ký giấy.

o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).

o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction

Chromatography - HIC)

-Dựa vào kính thước phân tử protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration

Chromatography)

-Dựa trên nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): sắc ký ái lực

(Affinity Chromatography)

Hình 1.2 Nguyên tắc hoạt động của một số loại sắc ký [39]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



11

1.2.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel [7,22,29,39]

1.2.3.1 Bản chất của phương pháp

Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân

tử và phân tích định lượng tương tác phân tử.

Hình 1.3 Tách các phân tử bằng lọc gel [39]

1.2.3.2 Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel

Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh

học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng

tác động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các

cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường

độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí

nghiệm. Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI

và dễ dàng khử muối.

Nhược điểm

Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)

Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.

Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó đạt

được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử

dụng kết hợp với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp

phụ.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



12

1.2.4. Protease của động vật thủy sản

1.2.4.1 Giới thiệu enzyme protease [65,79,80,85,153]

Trong số các enzyme tự nhiên thu nhận được từ các loài thuỷ sản, protease là

nhóm quan trọng và được phân làm hai nhóm proteinase (endo-) và peptidase (exo-)

Chúng xúc tác các phản ứng thuỷ phân liên kết peptid trong các mạch polypeptide

và protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do,

một ít peptid ngắn, pepton. Chúng cũng thường tác động lên các liên kết ester đơn

giản [79].

Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà

các protease có đặc tính khác nhau. Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân

protein, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn

có thể thuỷ phân các liên kết ester, liên kết amit và cùng có thể xúc tác cho chuyển

về gốc acid amin, tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau. Khác với protease thực

vật (chỉ chứa nhóm – SH), theo cách phân loại của Hiệp hội sinh hoá ứng dụng

quốc tế, protease trong động vật thuỷ sản có thể chia làm bốn nhóm cơ bản là

protease acid và aspartic, serin, thiol (hay cystine) và metalloprotease [85]. Theo

Haard, các protease lại có thể chia làm hai nhóm chính là các enzyme acid và

enzyme kiềm và trung tính [79].

1.2.4.2 Một số nghiên cứu về protease từ tôm và thuỷ sản

Hầu hết các enzyme tồn tại trong thuỷ sản đều có mặt ở các động vật trên cạn

[153]. Tuy nhiên, chúng khác nhau về trọng lượng phân tử, thành phần acid amin,

pH hoạt động tối ưu, nhiệt độ hoạt động tối ưu, độ ổn định, phản ứng trước các loại

chất hoạt hoá và ức chế cũng như tính chất động học [65].

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài

giáp xác khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động

vật có xương sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở

giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



13

cá. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease

serin tựa trypsin và có khả năng hoạt động rất cao [85]. Ngoài ra, còn có enzyme

chymotrypsin, astacine, collagenase… [71,75, 89, 90, 93, 102, 104]

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các

protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, gan tụy và sau đó đến

cơ thịt [4,18]. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá gan tụy nằm ở phần đầu nên

hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác [12].

Nguyễn Việt Dũng đã bước đầu tách chiết protease từ thịt tôm sú và đo độ

hoạt động của chúng ở các nhiệt độ và pH khác nhau, qua đó nhận biết protease

trong loại tôm này hoạt động thích hợp nhất ở pH= 6,6 và nhiệt độ 50oC [17].

Nguyễn thị Mỹ Trang cũng đã tách chiết và nghiên cứu một số tính chất của

protease trong đầu tôm bạc nghệ. Việc nghiên cứu protease của Phạm Thị Trân

Châu và cộng sự tiến hành trên đầu tôm biển miền Bắc Việt Nam cho thấy phạm vi

hoạt động của nó khá rộng từ 6 đến 9 và hoạt động tối ưu ở pH=7,5 và ở pH=8,5

[12]. Các kết quả này chứng tỏ một điều là hệ enzyme protease trong tôm hòan toàn

không đơn giản mà bao gồm nhiều loại protease khác nhau. Hỗn hợp men tách chiết

ở các nghiên cứu trên cũng khác nhau khi được tách chiết từ các phần khác nhau

của tôm.

Như vậy, hệ enzyme protease trong tôm được nghiên cưú ở Việt nam cho

đến nay thực hiện chủ yếu trên đối tượng tôm biển, những thông tin về tôm sú nuôi

còn khá hiếm hoi, mặc dù đây chính là đối tượng chủ yếu của ngành nuôi trồng và

chế biến thuỷ sản xuất khẩu ở nước ta. Hệ enzyme protease có vai trò quan trọng

trong quá trình tự phân giải mô cơ của thuỷ sản, vì vậy, những hiểu biết này thật sự

quan trọng trong việc giúp chúng ta hiểu và lý giải được các biến đổi của tôm sau

khi thu hoạch và trong quá trình chế biến cũng như bảo quản, đề ra những biện pháp

hữu hiệu gìn giữ chất lượng tôm hoặc sử dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu phế

thải của quá trình chế biến.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



14

Trên thế giới, một số nhà khoa học cũng đã chú trọng đến vấn đề này. Shann-

Tzong Jiang và cộng sự đã thành công trong tách chiết Cathepsin D từ một số loại

tôm nuôi ở Đài loan và đã xác định được nhiệt độ tối thích, pH cho enzyme ở các

loại này hoạt động cũng như phân tử lượng của chúng, các yếu tố hoạt hóa và ức

chế của Cathepsin D từ các nguồn này cũng đã được thử nghiệm [145]. Trong gan

tụy của tôm còn có các men trypsin và collagenase [36, 64]. Nip và cộng sự chỉ ra

rằng, collagenase đóng vai trò quan trọng đối với kết cấu của cơ thịt khi bảo quản,

tôm ướp lạnh có thời gian bảo quản tương đối ngắn vì sự có mặt của collagenase

làm cho mô thịt tôm mềm dần [122]. Huss và cộng sự cho rằng, các collagenase

trong tôm do các tuyến gan tuỵ (cơ quan tiêu hoá) sinh ra [18]. Olsen, Johansen và

Myrnes (1990) đã phát hiện trong nước thải từ công đoạn rã đông nguyên liệu tôm

Pandalus borealis có chứa một số các enzyme tiêu hoá [125]. Hệ tiêu hoá của tôm

có chứa một số enzyme phân giải protein như carboxypeptidase A và B, trypsin,

chymotrypsin, cathepsin và collagenase [128].

Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo

loài. Người ta nhận thấy khả năng hoạt động của protease (với cơ chất casein) ở tôm

càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn

ở Penaeus pencillatus, P.monodon và P.japonnicus [46,122,145,162].

1.3. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TỪ CÁ VÀ THỦY

SẢN VÀO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM

Các thủy sản như cá, tôm và nhuyễn thể là nguồn cung cấp enzyme dồi dào,

phong phú [123]. Enzyme từ nguyên liệu thủy sản là một trong những sản phẩm thu

hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu do chúng tồn tại trong mô cơ với nồng

độ lớn [163,165]. Nhiều nghiên cứu tính chất của các enzyme này trong hơn hai

thập kỷ gần đây cho ta cơ sở để tin rằng, nếu ứng dụng vào sản xuất, các enzyme sẽ

cho hiệu quả tốt [113, 115, 119]. Cũng phải đề cập tới một điều là, việc tách chiết

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



15

enzyme từ phế thải thủy sản và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm còn mang

lại lợi ích bảo vệ môi trường.

Các ưu điểm vượt trội của enzyme từ động vật thủy sản khi ứng dụng vào

sản xuất thực phẩm là chúng có thể cho hiệu quả tốt hơn so với phương pháp cơ học

hay hóa học thông thường. Làm sạch da cá, tôm, mực bằng enzyme giúp giảm thiểu

nguy cơ hư hỏng vật lý gây giập cơ thịt nguyên liệu, đồng thời cho hiệu suất thu sản

phẩm cao hơn [76]. Việc sử dụng các enzyme này cũng không đòi hỏi phải kiểm tra

độ an toàn vì chúng được tách chiết từ các phần ăn được của nguyên liệu. Enzyme

từ thủy sản thường thể hiện hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp hoặc không cao lắm, vì

vậy nhà sản xuất có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ thấp, giúp tiết kiệm năng

lượng, phản ứng này cũng dễ dàng ngừng lại khi nâng nhiệt độ lên không quá cao

và nhờ đó giảm được nguy cơ hư hỏng do vi sinh vật [79, 80]. Tuy nhiên, việc sử

dụng enzyme có nguồn gốc từ phế liệu thủy sản vào ứng dụng ở qui mô công

nghiệp có một hạn chế là tính thời vụ của các nguồn phế liệu này và sự thiếu ổn

định về hiệu suất thu chế phẩm enzyme và hoạt tính của chúng do chất lượng thức

ăn và do các phế liệu thủy sản rất dễ hư hỏng [157].

1.3.1. Sự phân giải có chọn lọc mô thịt cá và thủy sản

Do bản chất sinh hóa khác nhau giữa lớp da và cơ thịt động vật thủy sản,

người ta có thể sử dụng enzyme để thực hiện quá trình phân giải một cách có định

hướng, sao cho tế bào da cá bị hòa tan nhưng lại không gây ảnh hưởng đến lớp cơ

thịt [157]. Điều này cho phép sử dụng enzyme như một công cụ đặc biệt vào công

nghệ chế biến thực phẩm nhằm loại bỏ hoặc biến đổi có chọn lọc một số bộ phận

xác định ở nguyên liệu động vật thủy sản cần chế biến.

1.3.1.1 Loại da cá bằng phương pháp dùng enzyme

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



16

Có thể sử dụng các enzyme protease nội bào tách chiết từ cá với mục đích

loại lớp da của nguyên liệu này. Đây là phương pháp ưu việt hơn hẳn các phương

pháp cơ, hóa học thường gây thương tổn và làm giảm hiệu suất thu sản phẩm [85].

Ở Iceland, hàng năm có khoảng chừng 2000 tấn cá đuối bị thải trở lại biển vì

công đoạn loại da thật sự là việc quá khó khăn, thường phải thực hiện bằng phương

pháp thủ công. Mặc dù có nhiều loại máy bóc da cá nhưng hiệu quả không cao,

nhiều trường hợp phải lặp lại nhiều lần, và sau cùng vẫn cần kiểm tra và loại lần

cuối bằng thủ công. Quá trình đó làm hao hụt khá nhiều cơ thịt cá và vì vậy hiệu

quả kinh tế không cao. Một số phòng thí nghiệm ở Iceland đã thử nghiệm loại da cá

đuối Raja radiate bằng enzyme. Đầu tiên, người ta tiến hành biến tính collagen da

cá bằng cách xử lý nước ấm trong thời gian ngắn, tiếp đó ngâm trong hỗn hợp chứa

enzyme proteolytic và glycolytic 4 giờ ở 25oC hoặc 10-12 giờ ở 5oC [155]. Công

đoạn cuối cùng là rửa sạch lớp da hòa tan này bằng nước.

Cá trích cũng đã được thử nghiệm bóc tách da ở Na Uy. Người ta xử lý cá

bằng dung dịch acid acetic 5% ở 10oC nhằm biến tính collagen da cá, sau đó chuyển

sang ngâm trong các bể chứa có pha protease acid tách chiết từ gan tụy cá tuyết

[76]. Sau quá trình xử lý như trên, lớp vảy và da phía ngoài được loại ra để lại bề

mặt màu bạc rất mỏng. Đối với cá thu, cá ngừ bò và cá ngừ đại dương cũng có thể

loại da bằng cách tiến hành tương tự [50].

Fehmerling (1973) đã sử dụng dung dịch hỗn hợp gồm nhiều enzyme khác

nhau như proteolytic, glycosidase, hydrolase và lypolytic với nồng độ khác nhau

0,003-3% để loại bỏ những phần không mong muốn như da, vỏ của nhiều loại thủy

sản khác nhau như hàu, hến, tôm, mực, nghêu, cá da trơn, cá ngừ đại dương, cá hồi,

cá tuyết và một số loài cá mình dẹt khác [69].

1.3.1.2 Dùng enzyme để bóc da mực

Tính chất cơ học, lý học và hóa sinh của cơ thịt mực cũng như lớp da của nó

rất khác so với cá [121,136]. Ở nhiều nơi, người tiêu dùng cho rằng da mực quá dày

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



17

và dai nên không muốn dùng nó để chế biến thực phẩm, do mực có lớp màng dưới

da cấu tạo từ mô liên kết dày đặc, lớp màng này vẫn còn nguyên trên thân mực sau

khi bóc da và co lại lúc nấu tạo cho các miếng mực độ dai cứng khó nhai nuốt. Để

giải quyết vấn đề này, một số nhà nghiên cứu cho rằng, có thể dùng enzyme để

phân giải có chọn lọc da mực mà không ảnh hưởng đến cơ thịt của nó [166], hơn

thế nữa, sản phẩm mực ống chế biến có sử dụng enzyme còn có khác biệt đáng kể

so với sản phẩm thu nhận bằng máy hay thủ công ở chỗ nó không có lớp vỏ dai dày

bao bọc. Mực ống lột da chế biến bằng phương pháp này có hình dạng như bình

thường sau khi gia nhiệt và đặc biệt là không hề có lớp màng dai bên ngoài, đây

thực sự là một ưu điểm đáng kể. Bằng cách bổ sung thêm protease vào quá trình chế

biến mực theo cách thông thường, cơ thịt mực sẽ mềm mại hơn, đặc biệt là phần ria

mực, và làm cho nó dường như ngon hơn [123,163].

Strom & Raa (1993) nhận thấy trong gan tụy mực có mặt một số enzyme có

khả năng phân giải da mực và đã sử dụng chúng để loại da một số loại như mực ống

Illex, Todarodes, Nototodarus và mực nang bằng cách rửa mực đã moi ruột bằng

nước lạnh, sau đó làm mềm da bằng enzyme trong bể ở nhiệt độ thấp [158]. Các tác

giả này cũng đã thử xử lý mực bằng cách ngâm trước trong dung dịch muối 5%, sau

đó gia nhiệt nhẹ (45oC, 10 phút) để hoạt hóa enzyme từ gan tụy của mực và nhờ vậy

làm mềm lớp da dai dày của nó.

1.3.1.3 Sử dụng enzyme để đánh vảy và sản xuất cốt ngọc trai

Ở một số thị trường, người ta ưa chuộng fillet cá còn da nhưng đã loại sạch

vảy. Khi đánh vảy theo cách cơ học, một số loài cá như cá tuyết Melanogrammus

aeglefinus thường bị dập nát vì thịt chúng rất mềm [156]. Các thí nghiệm thực hiện

tại phòng thí nghiệm thủy sản Iceland đã chỉ ra rằng, nếu sử dụng enzyme thì có thể

tránh được các tổn thương cho da và thịt cá, chỉ cần xử lý nguyên liệu cá bằng dung

dịch enzyme ở 0oC, sau đó rửa sạch bằng cách phun tia nước [156]. Quá trình xử lý

bằng enzyme còn loại được cả các vi sinh vật trên bề mặt nguyên liệu, nhờ đó kéo

dài thời gian bảo quản [136].

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



18

Có một sáng chế đã được cấp bản quyền ở Canada là sáng chế tách vảy và

loại da cá bằng enzyme keratolytic kết hợp với một hay nhiều loại hợp chất hoạt

động bề mặt (anion, lưỡng tính hoặc không mang điện tích) trong môi trường ít

nước [136]. Ở Nhật bản, người ta đã sử dụng phần cốt ngọc thu nhận từ vảy cá

trích, cá mòi, hay cá hồi vào sản xuất ngọc trai nhân tạo và nhiều sản phẩm khác từ

khá lâu. Thành phần tạo nên hợp chất có ánh xà cừ màu trắng bạc ở vảy cá là

quanin. Hợp chất này có mặt ở lớp da ngoài hoặc lớp vảy của các loài cá sống nơi

tầng nước mặt [123]. Trong vảy cá, quanin kết hợp với collagen và calcium

phosphate tạo nên màu trắng bạc óng ánh xà cừ. Người ta gọi dịch huyền phù có

những tinh thể quanin lơ lửng là “cốt ngọc”. Có thể thu được cốt ngọc từ vảy cá

bằng cách dùng các enzyme proteolytic như trypsin chẳng hạn [163].

1.3.1.4 Dùng enzyme để bóc tách các màng và cơ quan nội tạng thủy sản

Trong sản xuất gan cá tuyết đóng hộp, việc bóc tách lớp màng gan cá là một

nhiệm vụ quan trọng nhằm ngăn ngừa dòi phát triển ở lớp màng collagen bao bọc

gan cá làm hư hỏng sản phẩm. Ở Iceland, người ta đã thử nghiệm bóc lớp màng này

bằng cách sử dụng enzyme và tăng hiệu suất thu gan cá 20-30% so với phương

pháp thủ công [163,165]. Lớp màng đen bao quanh bong bóng cá tuyết cũng dễ bóc

hơn, giúp tăng hiệu suất lên ít nhất tám lần [155]. Collagen thu được từ bong bóng

cá tuyết còn được sử dụng như chất làm trong khi sản xuất bia rượu ở Nhật bản

[127].

1.3.2. Dùng enzyme protease để chiết rút carotenoprotein từ phế liệu của quá

trình chế biến các loài giáp xác

Việc phát triển ngành chế biến thủy sản trong đó có chế biến tôm luôn song

hành cùng với lượng lớn các phế liệu mà nếu được sử dụng một cách có hiệu quả và

kinh tế sẽ giúp nâng cao lợi nhuận và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Các

carotenoprotein, loại phụ phẩm thu nhận từ quá trình chế biến tôm thường được sử

dụng như chất bổ sung cho sản xuất thức ăn chăn nuôi hoặc chất tạo màu trong công

nghệ thực phẩm[112]. Nếu tách carotenoid bằng dung môi hữu cơ hoặc dầu sẽ có

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



19

tác dụng làm giảm lượng chitin và tro, nhờ đó hiệu suất thu chất màu cao. Tuy

nhiên sản phẩm thu được bằng cách như vậy không đi kèm với protein nên giảm

tính ổn định do dễ bị oxy hóa [85]. Trong phế liệu chế biến thủy sản, protein chiếm

khoảng 1/3 hàm lượng chất khô, vì vậy, người ta đã thử nghiệm dùng enzyme để

tận thu chúng song song với quá trình thu nhận carotenoid ở dạng carotenoprotein

nguyên thủy. Quá trình tách chiết carotenoprotein từ các phế liệu thủy sản như tôm,

cua, tôm hùm đạt hiệu quả cao nếu trong dung dịch đệm để tách chiết có mặt trypsin

[54]. Cano-Lopez và các tác giả khác còn cho biết, nếu sử dụng trypsin từ cá tuyết

Atlantic trong quá trình tách chiết carotenoprotein từ phế liệu tôm thì có thể thu

nhận được 64% astaxanthin và 81% protein, trong khi nếu dùng trypsin bò thì chỉ

có thể thu được 49% astaxathin và 65% protein trong cùng điều kiện như nhau. Khi

thực hiện trên vỏ tôm hùm thì Simpson, Dauphin và Smith (1992) lại thấy rằng,

trypsin từ tụy tạng bò cho hiệu suất thu chất màu cao hơn so với khi sử dụng chế

phẩm thô từ phế thải chế biến cá tuyết Atlantic [151].

1.3.3. Dùng protease để thu nhận chitin và protein từ phế thải chế biến tôm

Phế liệu tôm là nguồn cung cấp chitin dồi dào. Phế liệu tôm ướt có chứa 4-

5% chitin. Để thu nhận chitin từ phế liệu cần phải loại bỏ các protein còn dính sót

lại, sau đó khử khoáng. Người ta thường dùng kiềm để loại protein, nhưng cách này

có thể gây nên hiện tượng deacetyl một phần và thậm chí thuỷ phân mạch polymer,

do đó sản phẩm thu được sẽ có tính chất không bền. Các enzyme protease có thể

cho hiệu quả rất tốt khi dùng để thực hiện quá trình loại protein từ phế liệu tôm.

Simpson và cộng sự (1994) đã dùng chymotrypsin để loại protein và đạt hiệu quả

tốt khi tỉ lệ enzyme: cơ chất là 7: 1000 (w/w) ở pH 8, thời gian xử lý là 72 giờ ở

40oC [154].

1.3.4. Ứng dụng protease chiết rút từ cá và thủy sản thay thế rennet trong sản

xuất phomai

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



20

Trong dịch chiết chất nhờn ở dạ dày hải cẩu con có bốn zymogen của

protease acid A, B, C, D. Protease A là loại tương tự chymosin [144]. Người ta thấy

rằng, chế phẩm thô protease dạ dày hải cẩu Phoca groelandica có khả năng làm

đông sữa ở khoảng pH rộng hơn so với pepsin lợn [143], thêm vào đó, phomai sản

xuất bằng protease dạ dày hải cẩu có chất lượng cảm quan cao hơn nhiều so với sản

phẩm cùng loại làm bằng rennet bò. Shamsuzzaman & Haard (1983) cho rằng,

pepsin A chính là thành phần chủ yếu của pepsin tách chiết từ hải cẩu làm sữa đông

tụ [144]. Khi thử nghiệm với chế phẩm thô protease acid tách chiết từ cá tuyết, Han

(1993) thấy rằng loại enzyme này không có tác dụng làm đông tốt bằng protease từ

dạ dày hải cẩu hay chymosin từ bò, nó cũng không cho hiệu quả tốt khi pH lớn hơn

6,4. Hiện nay, người ta đang thử nghiệm dùng protease từ cá ngừ đại dương để làm

đông sữa và thu được kết quả khá tốt: loại protease này cho hiệu quả cao trong

khoảng pH 5,5-6,4, tương tự như rennet [52,84].

1.3.5. Sử dụng enzyme protease trong sản xuất dịch cá (nước mắm)

Dịch cá (nước mắm) là sản phẩm lên men ở dạng lỏng được sản xuất nhờ

quá trình thủy phân protein cá ở điều kiện nồng độ muối cao. Người ta thường sản

xuất dịch cá bằng cách trộn muối (20-30%) với cá nhỏ như cá cơm, cá nục, cá mòi,

cá sòng … và ủ trong thùng kín. Ở châu Á và một số nước ven biển có thời tiết

nóng như Việt nam, Thai lan, Cambodia, Malaysia, Philipine và Indonesia, đây còn

là phương pháp bảo quản hữu hiệu lâu đời [47]. Trong quá trình lên men, các

enzyme chịu muối trong cá và cả vi sinh vật bên ngoài tác động vào thủy phân thịt

cá ở điều kiện độ mặn cao để tạo nên dịch nước mắm trong suốt màu hổ phách có

hàm lượng acid amin tự do cao và mùi vị thơm ngon đặc trưng. Orejana và Liston

(1981) đã nghiên cứu vai trò của các enzyme proteolytic trong sản phẩm nước mắm

và kết luận, enzyme đóng vai trò chủ yếu trong quá trình phân giải thịt cá là enzyme

tựa trypsin, các protease khác như cathepsin B cũng đóng vai trò đáng kể và làm

tăng hàm lượng protein hòa tan trong sản phẩm nước mắm. Nhiều nhà nghiên cứu

đã thử bổ sung enzyme, mà chủ yếu là các proteinase thực vật như bromelain, ficin

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



21

và papain để thúc đẩy quá trình sản xuất nước mắm từ cá hay hàu để thu nhận nước

mắm ngắn ngày [30,47,60].

Thông thường, quá trình chín của cá trích ướp muối để sản xuất nước mắm

kéo dài 6-12 tháng. Bằng cách bổ sung các enzyme proteolytic như trypsin và

chymotrypsin, người ta đã giảm được thời gian này xuống còn 2 tháng mà không

ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của nước mắm loại 1 [58]. Gildberg và cộng sự

(1984) cũng thử nghiệm sản xuất nước mắm 2 tháng từ cá cơm Stolephorus và cho

rằng mùi vị của sản phẩm hoàn toàn có thể chấp nhận được [77]. Để rút ngắn thời

gian, họ sử dụng kỹ thuật áp dụng nồng độ muối thấp 5% ở pH 4 vào lúc bắt đầu

muối. Tuy nhiên, ở hầu hết trường hợp sản xuất nước mắm ngắn ngày, sản phẩm

thu được kém ngon và có vị đắng. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp lên men

truyền thống là hoạt tính enzyme giảm dần và sản phẩm sau cùng ổn định, chỉ còn

sót lại rất ít enzyme hoạt động và hương vị thơm ngon [79].

Ở Newfoundland Canada, Shahidi & Synowiecki (1991) đã thử sản xuất

nước mắm từ cá ốt đực vảy nhỏ. Nhiều nhà nghiên cứu khác cũng đã thu được sản

phẩm tốt từ nguyên liệu cá ốt đực vảy nhỏ Mallotus villosus khi sử dụng gan tụy

mực xay nhỏ với nồng độ 2,5%. Các tác giả này cũng cho biết rằng, mẫu nước mắm

xử lý bằng gan tụy mực được ưa chuộng và có nồng độ acid amin cao nhất khi so

sánh với những mẫu khác sản xuất nhờ protease, trypsin và chymotrypsin từ nấm

mốc [47].

1.3.6. Sử dụng protease trong sản xuất bột đạm cá thủy phân

Dùng protease xử lý để sản xuất bột đạm cá thủy phân là một phương cách

thuận tiện cho phép sử dụng nguồn nguyên liệu cá tạp rẻ tiền, phụ phẩm từ qui trình

chế biến cá fillet và cả phế thải cá để tạo ra các sản phẩm mới với những tính chất

chức năng vượt trội [142]. Phương pháp này được sử dụng khá rộng rãi nhằm cải

thiện tính chất hòa tan và một số tính chất chức năng phụ thuộc độ hòa tan của

protein cá.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



22

Các nghiên cứu sản xuất bột đạm cá thủy phân đã bắt đầu từ những năm

1960 và đạt được kết quả đáng khích lệ. FDA (Food and Drug Administration –

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ) đã thông qua tên gọi bột đạm cá

thủy phân “fish protein concentrate” thay cho tên gọi trước kia đơn giản là bột cá

“fish powder”. Protein cá có thể dùng để bổ sung giá trị dinh dưỡng cho các sản

phẩm từ ngũ cốc, cũng có thể dùng như một thành phần dinh dưỡng cho sản xuất

các loại bột và dịch uống cho người ăn kiêng, hoặc sản xuất thức ăn gia súc. Đây

cũng là một giải pháp đầy hứa hẹn để sản xuất ra dịch thay thế sữa mẹ cho các vật

nuôi còn nhỏ và tạo nên những tính chất ưu việt cho chế độ dinh dưỡng vật nuôi

[156]. Onodenalore và Shahidi (1994) thông báo rằng, quá trình thủy phân protein

cá bằng enzyme đóng vai trò thật sự quan trọng để tạo ra các sản phẩm với tính chất

chức năng độc đáo và có lợi cho sức khỏe [159].

Để sản xuất bột đạm cá thủy phân, có thể áp dụng một trong hai qui trình cơ

bản: qui trình tự phân giải kiểu truyền thống và qui trình ngắn ngày. Ở cả hai qui

trình này, các enzyme proteolytic xúc tác thủy phân cắt liên kết peptid trong phân tử

protein và các polypeptid để sản sinh ra các peptid thấp phân tử và cả amino acid.

Cả hai qui trình này đều khá đơn giản: cá sau khi xay nhỏ được trộn đều với

enzyme (có thể là enzyme của bản thân cá hoặc từ nguồn thực vật, động vật, vi sinh

vật bên ngoài), sau đó ủ ở điều kiện tối ưu cho enzyme hoạt động [129,132]. Loại

enzyme sử dụng và thông số của quá trình chế biến sẽ quyết định đặc tính của sản

phẩm thu được. Hơn thế nữa, điều kiện phân giải nhẹ nhàng (thời gian thủy phân

ngắn, nhiệt độ vừa phải) là thật sự quan trọng để thu được sản phẩm với tính chất

như hệ nhũ tương dạng gel. Venugopal và Shahidi (1995) thông báo rằng, quá trình

thủy phân kéo dài và thiếu kiểm soát có thể sẽ tạo ra sản phẩm peptid ngắn mạch

thiếu các tính chất chức năng của protein nguyên thủy và làm sản phẩm bị đắng.

Như vậy, mức độ thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong việc tối ưu hóa

quá trình để phát triển sản phẩm [81].

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



23

Nhìn chung, quá trình thủy phân protein cá có bổ sung enzyme từ nguồn

ngoài phức tạp hơn và cũng đắt hơn vì chi phí cho lượng enzyme cần bổ sung chiếm

tỉ lệ đáng kể trong giá thành sản phẩm. Một vấn đề nữa liên quan đến qui trình ngắn

ngày là sự tạo thành của các peptid không ưa nước tạo nên vị đắng [146,150]. Theo

Haard (1994), ruột các loài thủy sản không xương sống có chứa nhiều loại amino-

và carbopeptidase có thể ứng dụng để khử đắng cho sản phẩm thủy phân từ cá [81].

So với các protease từ nguồn vi sinh vật đang được áp dụng, các protease nội tại cá

có tính đặc hiệu khá độc đáo và chuyên biệt, vì vậy, có thể đáp ứng tốt hơn các yêu

cầu của qui trình sản xuất đạm cá thủy phân [87].

1.4 CAROTENOPROTEIN TRONG ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT RÚT

Phức chất carotenoprotein được tạo thành do carotenoid kết hợp với protein

tồn tại rất phổ biến ở các động vật giáp xác như tôm, cua, tạo ra màu sắc đa dạng

rực rỡ (xanh biển, xanh lá cây, tím hồng, đỏ …) cho vỏ ngoài, mô cơ, biểu mô,

máu, trứng, và cả thành dạ dày của chúng [166].

Loại carotenoid rất thường tìm thấy trong phức chất carotenoprotein (nhưng

không phải duy nhất) là astaxanthin (3,3’-dihydroxy-β,β-caroten-4,4’-dione). Đây

cũng là loại chất màu được cho là đóng vai trò chủ đạo tạo nên màu sắc cho động

vật thủy sản, đặc biệt là các loài giáp xác [167,168].

1.4.1 Carotenoid

Carotenoid thuộc về nhóm chất màu hòa tan trong chất béo rất phổ biến ở

các vật thể sống. Chúng có mặt trong các thực vật, trong tất cả các động vật từ loại

đơn bào đến các loài có vú. Ở thực vật, tảo và vi khuẩn có khả năng quang hợp,

carotenoid đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp. Chúng cũng có mặt ở

một số loài vi khuẩn không quang hợp, ở nấm men và nấm mốc với vai trò bảo vệ

ngăn ngừa các tổn hại do ánh sáng và oxy gây nên. Mặc dù các động vật không có

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



24

khả năng tổng hợp carotenoid, nhiều loài vẫn hấp thụ hợp chất này từ thức ăn.

Carotenoid đem lại cho động vật các màu sắc rực rỡ, thể hiện vai trò chất chống oxy

hóa và là nguồn vitamin A [53,55,126]. Trong tự nhiên có khoảng 600 carotenoid

khác nhau [49,126], tuy nhiên con số này chưa phải là cuối cùng, bởi vì các nhà

nghiên cứu vẫn còn tiếp tục phát hiện ra nhiều carotenoid mới [116].

Trong tự nhiên, các carotenoid không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng

ester, glucosid, sulfate và carotenoprotein. Carotenoid có cấu trúc hóa học đặc trưng

gồm một chuỗi 40 carbon đóng vai trò xương sống của phân tử (Hình 1.4). Chuỗi

carbon này có thể có hai nhóm mạch vòng hai đầu, cũng có thể kết thúc bằng các

nhóm chức có chứa oxy. Đây chính là cơ sở để người ta phân biệt các carotenoid

làm hai nhóm chính: nhóm hydrocarbon carotenoid được gọi đơn giản là caroten (ví

dụ β-caroten trong cà rốt) và dẫn xuất oxy hóa của nó là xanthophyll (ví dụ lutein,

chất tạo màu vàng cho những cánh hoa cúc). Mặc dù trong một phân tử caroten và

xanthophyll thường chứa 40 nguyên tử carbon, vẫn có một số trường hợp ngoại lệ

khi phân tử carotenoid có số lượng nguyên tử carbon ít hơn 40 (gọi là

apocarotenoid) và cũng có khi con số này cao hơn (gọi là carotenoid bậc cao) [126].

1.4.2 Astaxanthin

Astaxanthin (3,3′-Dihydroxy-β,β-carotene-4,4′-dione) với công thức hóa học

C40H52O4 (Hình 1.5) là loại carotenoid thuộc nhóm xanthophyll có màu đỏ cam tạo

nên màu tự nhiên đặc trưng của cơ thịt, da và trứng cá hồi, của lớp tế bào biểu mô

nhiều loài thuỷ sản khác như cá vàng, cá chép đỏ hay tôm. Ở nhiều động vật không

xương sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ của lớp mô phía ngoài,

của máu, trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với

protein. Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó

thường gặp nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



25

Astaxanthin có khung cấu tạo gần giống β-carotene nhưng tính chất hoá học

lại khác, nó có tính chống ôxy hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác

như β-caroten và thậm chí cả α-tocopherol [118]. Người ta đã nghiên cứu và thấy

Hình1.4 Cấu trúc hóa học của một số carotenoid [114]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



26

rằng, nó thật sự giúp ích cho tim mạch, cho các loại bệnh ung thư, cho hệ miễn dịch

trong cơ thể con người bằng cách tăng số lượng kháng thể. Nó cũng giúp tăng

khả năng kháng viêm và chống suy nhược thần kinh, vì vậy đã được sử dụng để

điều trị các bệnh như Alzheimer và Parkinson. Astaxanthin còn có tác dụng bảo vệ

lipid, LDL cholesterol khỏi bị oxy hoá, bảo vệ tế bào và màng tế bào, giúp cơ thể

tăng sức dẻo dai, chịu đựng. Ngoài ra nó còn bảo vệ da và mắt khỏi những tổn hại

do tia bức xạ bằng cách vô hoạt các oxy nguyên tử [139]. Thêm vào đó, astaxanthin

còn đóng vai trò quyết định như là vật trung gian trong quá trình sinh sản, thể hiện

hoạt tính sinh học chống lại Helycobacter pylori và ngăn ngừa bệnh đục thủy tinh

thể. Các astaxanthin ester còn thực sự hữu dụng khi chữa trị các bệnh thuộc về cơ.

Gần đây, các nhà nghiên cứu đã thực hiện rất nhiều thực nghiệm để kiểm chứng về

tầm quan trọng của astaxanthin đối với sức khỏe và hầu hết đã tiến hành đến giai

đoạn trong ống nghiệm hay thử nghiệm sơ bộ trên người.

Astaxanthin được dùng trong sản xuất thức ăn cho cá để tạo ra màu hồng

cam cho thịt cá hồi nuôi nhân tạo (Johnson, 1980) bởi vì chúng không có khả năng

tự tổng hợp chất này [94]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra, ở cá và các loài giáp xác,

astaxanthin có vai trò quyết định đối với quá trình lớn lên và thể hiện vai trò như

một vitamin, quan trọng hơn nữa là cá hấp thụ astaxanthin tốt và tích trữ chúng

trong cơ thịt hiệu quả hơn nhiều so với các xanthophyll tương tự khác như

canthaxanthin, lutein hay zeaxanthin [161]. Ngoài tác dụng tạo màu đẹp,

astaxanthin còn có tác dụng chống oxy hóa mỡ trong thịt cá hồi khi bảo quản đông,

vì vậy mà giảm được hiện tượng ôi thiu [108].

Khi bổ sung astaxanthin vào thức ăn của động vật nuôi như gà, lợn, bò, cừu,

người ta cũng quan sát thấy chúng sinh sản tốt hơn, có sức đề kháng bệnh tật tốt

hơn, gà ít bị chết và đẻ nhiều trứng, đặc biệt màu sắc lòng đỏ trứng đậm hơn và tỉ lệ

gà nhiễm Salmonella giảm hẳn xuống (Lignell và cộng sự, 1998). Chế độ ăn có bổ

sung astaxanthin cũng có tác dụng tạo màu cho thịt gà công nghiệp, đây là điều khá

hấp dẫn với nhiều người tiêu dùng [35].

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



27

Có ba nguồn cung cấp astaxanthin vẫn thường được sử dụng để bổ sung vào

thức ăn tạo màu cho thịt cá hồi là astaxanthin nhân tạo, astaxanthin thu nhận từ

nguồn vi sinh vật và loại tận thu từ phế liệu chế biến động vật giáp xác. Tuy nhiên,

khi dùng astaxanthin nhân tạo, cá hồi chỉ tiêu hoá được khoảng 5% [72], một số nhà

nghiên cứu thậm chí còn cho rằng, màu sắc thịt cá hồi thu được đẹp hơn khi

astaxanthin trong thức ăn của chúng là nguồn tự nhiên. Các loại tảo cũng là nguồn

cung cấp astaxanthin, ưu điểm lớn nhất của chúng là có nồng độ chất màu khá cao,

tuy nhiên khi dùng bổ sung vào thức ăn cho cá, hệ số tiêu hoá chất màu lại thấp do

hàm lượng astaxanthin ester quá cao (Seung và cộng sự, 1999) [138]. Chất màu này

có thể tận thu từ phế liệu chế biến các loài giáp xác bằng cách chiết xuất trong dầu

như dầu đậu nành chẳng hạn, cách này có nhược điểm là nồng độ chất màu bão hoà

trong dầu tương đối thấp nên sẽ cần bổ sung vào thức ăn nhiều để đạt lượng chất

màu cần thiết, làm cho hàm lượng dầu trong thức ăn vượt quá mức thích hợp cho cá

tiêu hoá.

Astaxanthin tồn tại ở nhiều dạng khác nhau. Có thể phân loại chúng thành

stereoisomer, isomer đối xứng và dạng tự do hay còn gọi là este hóa. Cả ba loại này

đều có trong tự nhiên. Ví dụ, loại astaxanthin stereoisomer chiếm ưu thế trong tôm

Euphausia superba là 3R,3’R [49] và phần chính của loại này thuộc nhóm este hóa

[72]. Ở cá hồi tự nhiên, loại stereoisomer chiếm ưu thế là 3S,3’S; astaxanthin cơ thịt

cá hồi tồn tại ở dạng xanthophyll tự do (Bernhard, 1990) [49]. Loài tảo xanh

Haematococcus pluvialis lại có astaxanthin tồn tại dưới dạng stereoisomer 3S,3’S.

Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác [49]. Nó

thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở nhiều động

thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc màu xanh biển, xanh lá và

vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hòa tan trong

phần mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp với

các phân tử như acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hóa học thật sự và tạo thành

ester. Màu đỏ của nhiều loại tảo tuyết và Haematococcus được tạo nên bởi nhiều

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



28

ester như vậy tập trung ở các giọt chất béo của cytoplasmic. Đôi khi, astaxanthin

tồn tại trong tế bào ở dạng tự do, không liên kết với phân tử nào khác, nhưng trường

hợp này hiếm khi xảy ra bởi vì lúc đó astaxanthin thật sự kém bền.

Hình 1.5 Các dạng astaxanthin [49]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



29

Astaxanthin nhân tạo thường được sản xuất ở dạng xanthophyll tự do (không

ester hóa) ở dạng hỗn hợp của ba stereoisomer: 3S,3’S; 3R,3’S và 3R,3’R. Hiện nay

mới chỉ có hai hãng sản xuất astaxanthin với qui mô công nghiệp là Hoffmann-La

Roche AG và BASF AG.

Các nhà khoa học cho rằng, astaxanthin tự nhiên và nhân tạo thể hiện tính

chất hóa học khác nhau. Mặc dù cả hai loại này đều có đồng phân đối xứng chủ yếu

là đồng phân E, tuy nhiên, astaxanthin nhân tạo được sản xuất ở dạng tự do (không

ester hóa) trong một hỗn hợp các stereoisomer 3R,3’R; 3R,3’ và 3S, 3’S theo tỉ lệ

1:2:1. Astaxanthin tự nhiên thì lại thường ở dạng ester hóa và hầu hết là dạng

3S,3’S; đôi khi cũng có loại astaxanthin chứa đa phần 3R,3’R nhưng điều này rất

hiếm khi xảy ra [49]. Ở Haematococcus pluvialis, astaxanthin tồn tại dưới dạng

đồng phân 3S,3’S chủ yếu là monoester (trên 90%), diester (khoảng 8%) và phân tử

tự do (khoảng 1%). Nó có xu hướng sản sinh ra nhiều hạt màu trong thịt cá hồi hơn

so với astaxanthin nhân tạo khi cung cấp cùng một nồng độ trong thức ăn.

1.4.3 Carotenoprotein

Carotenoprotein phân bố rộng rãi ở các ngành động vật không xương sống,

đặc biệt là các loài giáp xác. Chúng thường không chỉ hiện diện trong vỏ của các

loài giáp xác mà còn có mặt ở nhiều cơ quan khác như lớp ngoại bì, trứng, buồng

trứng, dạ dày hay ở bạch huyết của động vật [167]. Carotenoprotein cũng được tìm

thấy ở nhiều động vật không xương sống và có xương sống, một số loại thực vật

cũng có chứa hợp chất này với nhiều vai trò khác nhau [165].

Người đầu tiên quan sát thấy hiện tượng hòa tan trong nước của một số lớn

các phần tử màu như xanh biển, xanh lá, màu xám trong động vật giáp xác và một

số loài không xương sống khác có lẽ là Merejkowsky (1883). Các chất màu này

chuyển sang màu đỏ “zooerythrin” khi bị đun nóng hoặc ngâm trong acid, kiềm

hoặc rượu [166].

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



30

Poulton (1885) đã nhận xét rằng, dường như sự kết hợp của carotenoid với

protein đem lại hiệu quả giữ màu tốt. Giả thuyết này ra đời dựa trên quan sát thấy

xanthophyll trong ấu trùng ăn thực vật rất bền dưới tác dụng của ánh sáng. Tác giả

đã cho là điều này xảy ra nhờ chất màu này tồn tại ở dạng kết hợp với protein trong

máu hoặc mô cơ của chúng. Đến năm 1966 đã có ít nhất hai trường hợp chứng tỏ

rằng, liên kết giữa carotenoid với apoprotein có tác dụng bảo vệ carotenoid khỏi bị

oxy hóa và biến đổi do ánh sáng, bảo vệ cấu trúc bậc ba của protein khó bị biến đổi.

Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng, loại carotenoid crustacyanin tạo

màu cho vỏ tôm hùm đóng vai trò chủ yếu chịu trách nhiệm cho sự tạo thành cấu

trúc bậc bốn cực kỳ phức tạp [58].

Một số xanthophyll có thể kết hợp với protein tạo ra hợp chất

carotenoprotein đóng nhiều vai trò sinh lý khác nhau trong cơ thể động vật. Trong

số các xanthophyll, người ta thấy rằng, astaxanthin và canthaxanthin là hai chất

thường tồn tại ở dạng phức chất với protein [59], mặc dù còn có các xanthophyll

khác như các nhóm giả cũng kết hợp protein để tạo phức.

1.4.3.1 Bản chất của carotenoprotein

Carotenoprotein “thực thụ”

Carotenoprotein “thực thụ” được định nghĩa là loại phức chất trong đó một

carotenoid kết hợp với một protein bằng quan hệ hóa học lượng pháp.

Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy

rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc về nhiều nhóm khác nhau.

Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại

nhóm carotenoid dường như là một protein thuần túy chỉ gồm các gốc amino acid

tạo thành (Cheesman, 1967) [59]. Ovoverdin là protein màu xanh lá ở trứng tôm

hùm, đây là protein được nghiên cứu sớm nhất, từ những năm 1937 bởi Stern &

Salomon. Ovoverdin là lipoprotein với một nhóm giả lớn chứa nhiều gốc

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



31

phospholipid chiếm tới 22% trọng lượng phân tử [59]. Ngoài ra, còn có cả thành

phần carbohydrate có chứa hexosamin và gốc đường không chứa nhóm amino

chiếm 4,8% trọng lượng phân tử. Ovorubin, loại protein màu đỏ chiếm tới ba phần

tư lượng nitrogen trong trứng của loài Pomacea canaliculata, là một glycoprotein

với một nhóm giả chứa gốc mannose, galactose và glucosamine chiếm gần 20%

khối lượng protein [59]

Các lipoprotein có chứa carotenoid phối hợp với lipid

Trong nhiều liên kết của protein với carotenoid, bản thân các carotenoid

không có mối tương tác đặc biệt nào với protein mà lại đóng vai trò là một phần

trong nhóm giả lipid. Ở các phức chất như vậy, carotenoid có thể gồm vài loại phân

tử với tỉ lệ khác nhau và dường như chúng được “hòa tan” một cách thiếu qui luật

trong chất béo. Người ta cho rằng, lipoprotein trong lòng đỏ trứng của các loài chim

có tính chất như vừa được trình bày, chính bởi vì hàm lượng carotenoid của chúng

khác nhau rõ rệt tùy vào chế độ ăn. Nhận xét này đồng nhất với phát hiện: các phân

đoạn lipoprotein màng khác nhau ở động vật có vú chịu trách nhiệm cho việc kết

nối các carotenoid, vitamin A và ester của vitamin A, trong khi đó, Krinsky,

Cornwell và Oncley (1958) lại cho rằng β-carotene và lutein phân bố không giống

nhau ở các loại protein của màng trong cơ thể người. Mặc dù thành phần carotenoid

trong lipoprotein màng dường như không được gắn kết bằng liên kết hóa học lượng

pháp và chắc chắn là carotenoid không đóng vai trò gì trong phân tử, sự lựa chọn

“chất mang” vẫn thu hút các nhà nghiên cứu quan tâm tìm hiểu [167].

Có khá nhiều carotenoprotein đã được nghiên cứu ở động vật giáp xác thuộc

về nhóm các “phức chất không đặc biệt”. Ở trường hợp hạn hữu đã được Zagalsky

ghi nhận vào năm 1964, các lipoprotein từ tuyến sinh dục của Pecten maximus có

chứa vài loại xanthophyll khác nhau nhưng hàm lượng carotenoid tổng số thì lại ổn

định. Ở một số trường hợp khác, khi một carotenoprotein “thực sự” có một nhóm

giả lipid, nó có thể chứa một lượng carotenoid không liên kết theo hóa học lượng

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



32

pháp bằng lượng carotenoid liên kết với protein bằng các mối liên kết đặc biệt và

điều này làm biến đổi đáng kể màu sắc của toàn bộ phức chất. Đây chính là hiện

tượng xảy ra ở trường hợp carotenoprotein màu xanh lá cây của động vật đẳng túc

Idothea granulose [63,105].

1.4.3.2 Tính chất chung của carotenoprotein [116,166,167]

Sự dễ dàng của việc tách nhóm carotenoid ra khỏi các apoprotein cho phép

suy luận rằng, trong phức chất carotenoprotein không có mối liên kết hóa trị giữa

các nhóm này. Tất cả các carotenoprotein đã được nghiên cứu đều bị tách ra thành

carotenoid và apoprotein khi ở trong môi trường aceton hoặc ethanol lỏng, điều này

cho thấy rằng, liên kết giữa chúng trong phức hợp này không phải là liên kết cộng

hóa trị. Việc xử lý như vậy có tác dụng làm kết tủa các apoprotein gần như không

màu, và nếu quá trình lặp lại vài lần thì kết tủa thu được hoàn toàn không lẫn các

carotenoid. Tuy nhiên, ngay cả khi thực hiện kết tủa ở nhiệt độ thấp, một số protein

vẫn bị biến tính. Ở trường hợp của crustacyanin và ovorubin, carotenoprotein có thể

hoàn nguyên lại dạng nguyên thủy bằng cách trộn dung dịch aceton có chứa

carotenoid với dung dịch protein lỏng, pha loãng bằng nước sau đó loại aceton bằng

thẩm tích. Nhưng ovoverdin thì lại không thể hoàn nguyên như vậy sau khi tách

chiết mặc dù đối với phức chất này và nhiều carotenoprotein khác, việc xử lý nhiệt

nhẹ nhàng có tác dụng tách phần nào carotenoid ra khỏi protein nhưng chỉ cần làm

lạnh là sẽ khôi phục được phức chất ban đầu.

Trong khi crustacyanin và ovorubin là những chất khá bền có thể bảo quản

thời gian dài ở điều kiện lạnh hoặc đông khô hay trong dung dịch mà không biến

đổi đáng kể, một số chất màu trong trứng của động vật giáp xác sau khi tách chiết

lại cực kỳ kém bền, kể cả khi được bảo quản trong bóng tối, chính điều này làm cho

việc tách chiết một lượng không quá ít hoặc nghiên cứu tính chất của chúng trong

thời gian kéo dài gặp khó khăn.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



33

Crustacyanin và ovorubin ở dạng dung dịch khá bền trước tác dụng của ánh

sáng, tuy nhiên khi bảo quản ở trạng thái đông khô, cả hai protein này đều có những

biến đổi (dù là chậm) khi tiếp xúc với ánh sáng. Cùng điều kiện như vậy,

crustacyanin bị biến tính một phần sau khi chịu chiếu xạ một tuần, còn ovorubin thì

lại có những biến đổi trong quang phổ hấp phụ, đồng nghĩa với một sự biến đổi

trong mối liên kết carotenoid-protein. Dung dịch ovoverdin bạc màu rất nhanh trong

ánh sáng ban ngày.

Điều đáng chú ý là sản phẩm đông khô của crustacyanin, ovoverdin và

carotenoprotein của Asterias rubens có màu đỏ, ngay cả ovoverdin dù không bền

nhưng phần còn sót lại vẫn cho thấy màu tự nhiên của nó khi pha loãng trong nước.

Rõ ràng là nước đóng một vai trò đáng kể trong kiểu cấu trúc của protein và điều

này thật sự quan trọng trong liên kết tạo phức với carotenoid.

Một phát hiện quan trọng liên quan đến liên kết của carotenoid với

apoprotein là cả ovorubin và crustacyanin đều vô cùng khó lan tỏa trên bề mặt tiếp

xúc giữa nước và không khí. Tuy nhiên, sau khi tách khỏi carotenoid, cả hai protein

này đều tan bình thường. Đối với crustacyanin, người ta đã xác định được là

carotenoprotein hoàn nguyên có tính chất lan tỏa tương tự như nguyên thủy. Như

vậy, vai trò của carotenoid có vẻ là “ổ khóa” trên cấu trúc bậc ba hay bậc bốn của

protein. Thí nghiệm đã cho thấy rằng, khi đun nóng dung dịch ovorubin tới nhiệt độ

100oC trong thời gian ngắn, nó không bị biến tính đáng kể, nhưng apoprotein thì lại

biến tính ngay lập tức chính ở các điều kiện này.

Các quan sát trên đây giúp nhận ra một điều là các carotenoid liên kết với

protein khó bị biến đổi hơn nhiều so với khi tồn tại ở dạng tự do dưới tác dụng của

quá trình oxy hóa hay ánh sáng. Đó cũng là bằng chứng chắc chắn cho sự ổn định

mang tính chất tương hổ qua lại giữa carotenoid và protein.

1.4.4 Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến động

vật giáp xác

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



34

Phế liệu chế biến các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, tôm hùm thường bao

gồm một số thành phần như: các muối kim loại (15-35%), protein (25-50%), chitin

(25-35%), lipid và chất màu. Đã có rất nhiều nghiên cứu của các tác giả khác nhau

về thành phần carotenoid và carotenoprotein trong nguồn phế liệu này. Chất chủ

yếu tạo nên màu của các loại tôm cua là astaxanthin ở dạng tự do hay ester hóa với

hàm lượng thường dao động trong khoảng 119 và 148 μg/g, ngoài ra còn có một

lượng nhỏ các chất màu khác như lutein, zeaxanthin và astacene [139].

Một xu hướng đang được các chuyên gia trên thế giới rất quan tâm là làm thế

nào sử dụng được lượng chất màu quí giá mà chủ yếu là astaxanthin đang bị bỏ phí

trong phế liệu chế biến. Các số liệu đã công bố cho thấy rằng, hàm lượng chất màu

trong phế liệu thường thấp, ví dụ astaxanthin thường tồn tại với lượng nhỏ hơn 1000

μg/g nguyên liệu thô. Điều này có nghĩa là để đạt được số lượng chất màu đáng kể

nhằm có được hiệu quả mong muốn, cần phải tiêu thụ một lượng khá lớn phế phẩm.

Vì vậy, khi sản xuất thức ăn cho cá, người ta thường dùng phế liệu này để phối trộn

thức ăn. Tuy nhiên, phương pháp này không thể áp dụng cho người cần bổ sung

astaxantin vào chế độ ăn. Cũng phải kể thêm là quá trình sấy khô phế liệu chế biến

tôm cua nhờ tác dụng của nhiệt độ là rất không phù hợp bởi vì khi đó carotenoid dễ

dàng bị phân hủy do phản ứng oxy hóa. Một bất lợi nữa là hàm lượng chitin và tro

trong phế liệu rất cao sẽ làm cá khó hấp thụ do đó không thể tùy tiện trộn vào thức

ăn. Nhiều công trình nghiên cứu khác nhau đã thực hiện nhằm kiếm tìm một giải

pháp cho vấn đề này. Một trong những phương hướng được thử nghiệm là ủ chua,

nghĩa là xử lý phế liệu bằng acid vô cơ hoặc hữu cơ vừa có tác dụng bảo quản phế

liệu khỏi bị phân hủy do vi sinh vật, vừa dễ tách chất màu. Trong quá trình xử lý

như vậy, một phần muối calci hòa tan vào dung dịch acid pH4-5 dẫn đến kết quả là

nồng độ astaxanthin trong phần rắn tăng lên và dễ hấp thụ hơn (Torrisen và cộng sự,

1981) [161]. Một số các tác giả cũng đã dùng dầu thực vật hoặc dầu cá để tách chiết

astaxanthin và bổ sung vào thức ăn cá hoặc thu nhận protein và chất màu dưới dạng

phức bền carotenoprotein.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



35

Một trong các cách truyền thống thu nhận chất màu carotenoid là chiết rút

trong dung môi chất béo. Hiệu quả của quá trình này cho việc tách astaxanthin từ vỏ

tôm đã được đánh giá khi sử dụng các loại dầu thực vật: hướng dương, đậu nành,

mù tạt, dầu dừa, dầu cám gạo, dầu lạc với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi khác nhau và

thời gian, nhiệt độ chiết rút thay đổi (Sachindra, 2005) [137]. Nghiên cứu đã rút ra

kết luận, dầu hướng dương là môi trường cho hiệu suất thu chất màu carotenoid cao

nhất, các thông số tối ưu của quá trình là: tỉ lệ dầu hướng dương: vỏ tôm là 2:1,

nhiệt độ 70oC và thời gian gia nhiệt là 150 phút. Hàm lượng carotenoid thu được

tính theo astaxanthin ở điều kiện tối ưu là 24 μg/g vỏ tôm tươi.

Dầu gan cá tuyết cũng đã được Shahidi và Synowiecki (1991) thử nghiệm

dùng làm dung môi để tách carotenoprotein [141]. Vỏ tôm sau khi xay nhỏ được

trộn với dầu gan cá tuyết theo các tỉ lệ khác nhau, đun nóng ở nhiệt độ 50, 60 và

80oC trong 0,5 giờ. Kết quả cho thấy, chế độ xử lý cho hiệu suất thu chất màu cao

nhất (74%) là tỉ lệ dầu gan cá tuyết: vỏ tôm là 2:1, nhiệt độ 60oC trong 0,5 giờ. Phân

tích thành phần carotenoid trong vỏ tôm cho thấy chất màu chủ yếu là astaxanthin

diester (74,29%), monoester (19,72%) và astaxanthin tự do (3,95%), zeaxanthin

cũng có mặt nhưng số lượng rất không đáng kể (0,62%).

Hầu hết protein và dầu trong phế liệu chế biến tôm cua có thể thu lại được

cùng với astaxanthin ở dạng hợp chất carotenoprotein (Cano-Lopez, 1987) [54].

Các nhà nuôi trồng thuỷ sản đặc biệt chú ý đến hợp chất này vì cá hồi nuôi hấp thụ

chúng tốt hơn nhiều so với astaxanthin đơn chất (Long, 1988) [108]. Khi chiết rút

chất màu carotenoid bằng các dung môi hữu cơ hoặc dầu đậu nành, hàm lượng tro

và chitin trong sản phẩm rất thấp, hiệu suất thu chất màu cao, nhưng sản phẩm

không chứa protein lại kém ổn định và dễ bị oxy hoá (Seung, 1999) [139]. Simpson

và Haard (1985) đã chỉ ra rằng, dùng môi trường nước có bổ sung enzyme

proteolytic là phương cách rất tốt để chiết được hầu hết protein và astaxanthin ở

dạng carotenoprotein bền vững từ nguyên liệu phế thải chế biến tôm. Các phức bền

carotenoprotein tỏ ra là nguồn bổ sung chất màu và aminoacid tuyệt hảo (Simpson,

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



36

1885; Simpson, 1992) [151]. Carotenoprotein từ phế liệu động vật giáp xác có màu

nâu xanh, khi bị đun nóng sẽ biến tính và thể hiện màu cam đỏ mà người tiêu dùng

ưa chuộng.

Chakrabarti (2002) đã tách chiết carotenoprotein từ vỏ tôm bằng nhiều loại

enzyme thương mại khác nhau: trypsin, pepsin và papain trong dung dịch đệm

citrate-phosphat ở điều kiện nhiệt độ phòng và pH tối ưu cho từng loại enzyme.

Carotenoprotein hòa tan trong đệm sau đó được kết tủa bằng cách giảm pH xuống

điểm đẳng điện, gia nhiệt, làm nguội rồi ly tâm và sấy trong chân không. Kết quả thí

nghiệm cho thấy việc sử dụng trypsin cho thành phẩm carotenoprotein thu được có

lượng chất màu carotenoid cao nhất (55% hàm lượng có trong nguyên liệu thô) sau

4 giờ, mùi thơm và hàm lượng protein đạt được tốt. Thành phẩm này được đánh giá

là phù hợp cho mục đích thực phẩm. Các enzyme khác như papain và pepsin cho

kết quả thấp hơn nhưng không khác biệt nhiều [57].

Ưu thế của trypsin trong việc tách chiết carotenoprotein được khẳng định

thêm qua nghiên cứu của Klomklao và cộng sự (2009). Tác giả này thực hiện tách

chiết bằng trypsin cá xanh Pomatomus saltatrix trên nguyên liệu vỏ tôm sú Thái

lan. Hiệu suất thu carotenoprotein đạt cực đại khi thực hiện thủy phân trong dung

dịch EDTA 0,5M có bổ sung trypsin với nồng độ 1,2 đơn vị/g vỏ tôm trong vòng 1

giờ ở nhiệt độ 25oC. Sản phẩm sau khi kết tủa bằng HCl đến pH 4,5 và đông khô

chứa 70,2% protein, 19,76% lipid, 6,57% tro, 1,5% chitin và 87,91 μg astaxanthin/g

mẫu. Nghiên cứu cũng đã so sánh tác dụng của trypsin cá xanh và trypsin bò trong

điều chế carotenoprotein và thấy hiệu suất tương đương [100].

Thử nghiệm dùng enzyme proteolytic thương mại vào việc tách chiết

astaxanthin cũng đã được thực hiện trên phế liệu chế biến tôm (Lee, 1999). Một số

dung môi khác nhau như tri-sodium EDTA, di-sodium EDTA, ethyl ether và

chloroform đã được sử dụng. Các tác giả cũng thử ủ chua trước cho vỏ tôm bằng

acid acetic để loại bớt calci, sau đó mới tiến hành chiết astaxanthin. Tất cả nhằm tìm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



37

ra chế độ tối ưu cho việc thực hiện quá trình chiết chất màu. Thực nghiệm đã chỉ ra

rằng, hiệu quả tách carotenoprotein đạt được tốt nhất khi thực hiện trên nguyên liệu

vỏ tôm không ủ chua trước, trong môi trường EDTA có bổ sung enzyme với tỷ lệ

vỏ tôm: dung môi là 1:3 (w/v), thời gian chiết 24 giờ ở nhiệt độ 55oC (là nhiệt độ tối

ưu của enzyme proteolytic sử dụng). Sản phẩm thu được dạng lỏng chia làm hai

lớp: lớp trên có màu đỏ chứa 91,9% lượng chất màu của nguyên liệu thô (tương

đương hàm lượng 47,6 μg/g vỏ tôm tươi) và lớp dưới màu thẫm chứa 2,3%, như

vậy, lượng màu còn sót lại trong bã ly tâm rất ít. Tỷ lệ giữa hai lớp chất màu thu

được là 0,2 (v/v), nghĩa là, nên thu lớp chất lỏng màu đỏ phía trên sẽ cho nồng độ

chất màu cao và thuận tiện để sử dụng hoặc nếu cần tinh chế sau này [106].

Như vậy, carotenoprotein là chất có tiềm năng sử dụng như một thực phẩm

chức năng cho con người và cả trong chăn nuôi, đặc biệt là carotenoprotein chiết

rút từ động vật giáp xác với hàm lượng astaxanthin cao và tính chất bền vững khi

bảo quản. Sản phẩm này không những chỉ mang lại cho con người những lợi ích

sức khỏe và kinh tế (khi dùng cho thức ăn gia súc) mà còn giúp tận dụng nguồn phế

liệu chế biến thủy sản, tạo ra giá trị gia tăng và góp phần cải thiện môi trường.

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ ỨNG DỤNG

CỦA ENZYME PROTEASE TỪ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN

Trong ngành chế biến thủy sản Việt nam, ứng dụng của protease tập trung

vào việc tận dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu để chế biến nước mắm,

mắm cá, mắm tôm chua…

Khi chế biến nước mắm, thịt cá được thủy phân bằng enzyme sẵn có trong

bản thân nguyên liệu, ở điều kiện có muối ăn với nồng độ cao nhằm đình chỉ hoạt

động của các khuẩn gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hòa tan mà chủ yếu là axit

amin và peptid mạch ngắn. Do thủy phân thịt cá ở điều kiện tự nhiên như vậy

thường có thời gian dài, khoảng 1-2 năm, nước mắm ngắn ngày đã được nghiên cứu

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



38

sản xuất bằng cách bổ sung thêm enzyme protease từ tụy tạng, ruột non của bò, lợn,

protease từ các chủng vi sinh vật như Aspergillus oryzae [2], [16], Bacillus pumilus

[19,23,24,26] hoặc sử dụng các chế phẩm protease từ thực vật như bromelin,

papain. Nhiều loại chế phẩm protease thương mại cũng đang được chào bán, chúng

có ưu điểm là tăng nhanh quá trình thuỷ phân thịt cá, rút ngắn thời gian ủ mắm

xuống chỉ còn 10-30 ngày [11], tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là không

đạt được hương vị, màu sắc đặc trưng của nước mắm truyền thống, thời gian bảo

quản cũng ngắn hơn nhiều.

Protease từ vi sinh vật như Aspergillus oryzae cũng đã được sử dụng để sản

xuất bột đạm từ ruốc [25] hay B. subtilis để tạo ra nước mắm trong thời gian ngắn

hơn với hàm lượng đạm cao hơn phương pháp truyền thống [1].

Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học

nước ta cũng đã mở rộng lĩnh vực nghiên cứu của mình vào ứng dụng trong chế

biến thuỷ sản. Hiện nay hướng nghiên cứu được tập trung nhiều nhất là nâng cao

hiệu quả sử dụng phế liệu thủy sản cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế.

Protease từ đầu tôm biển đã được Nguyễn Văn Lệ cùng nhiều tác giả khác sử dụng

trong sản xuất bột đạm từ phế liệu tôm [20]. Các protease nội tạng cá (thu, ngừ) và

gan mực ống cũng đã được Đỗ Văn Ninh thử nghiệm thành công để thuỷ phân cá

mối và sản xuất dịch đạm cá đậm đặc và bột đạm cá. Sản phẩm thu được có các chỉ

tiêu hóa học không khác nhau nhiều, nhưng dịch đạm và bột đạm thu được khi sử

dụng protease từ cá thu cho giá trị cảm quan cao nhất [25]. Phạm thị Trân Châu và

các tác giả khác đã nghiên cứu ứng dụng protease của B. pumilus, B. subtilis vào

thuỷ phân phế liệu cá để thu bột đạm hoà tan [8]. Ngô thị Mại và Nguyễn Thị Dự sử

dụng enzyme protease để tận dụng phế liệu và nguyên liệu thuỷ sản có giá trị kinh

tế thấp [24]. GS Nguyễn Quốc Khang nghiên cứu protease tiêu hóa của một số loài

cá nước ngọt để sản xuất thức ăn cho cá có bổ sung protein thủy phân, hoặc phối

chế chế phẩm protease vào thức ăn của cá giống, cá thịt để tăng hệ số tiêu hóa, hấp

thu thức ăn

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



39

Có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng hệ enzyme protease trong chế

biến thủy sản ở Việt nam mới chỉ dừng ở qui mô phòng thí nghiệm và chưa được

chuyển giao áp dụng trong thực tế sản xuất. So với các enzyme đang được sử dụng

trong sản xuất thực phẩm, ứng dụng của các enzyme có nguồn gốc thủy sản còn rất

hạn chế. Cho dù được coi là một trong những phương tiện hữu ích đầy hứa hẹn và

đã được ứng dụng thành công trong một số lĩnh vực, việc nghiên cứu về các enzyme

từ nguyên liệu thủy sản vẫn đang đòi hỏi sự đầu tư nghiên cứu nghiêm túc. Việc tận

thu enzyme ở qui mô công nghiệp cũng mới đang trong giai đoạn thử nghiệm và

cần được nghiên cứu tiếp tục. Để có hướng phát triển tốt, chúng ta rất cần đầu tư để

có thêm hiểu biết không chỉ về enzyme mà cả các qui trình sản xuất đang áp dụng

và phát triển các công nghệ mới để đáp ứng các yêu cầu khác nhau của nhiều loại

thực phẩm.

Bên cạnh mong muốn tận dụng các enzyme vào mục đích chế biến thực

phẩm, cần phải chú trọng đến khía cạnh kinh tế của quá trình, cần kiểm chứng về

khả năng ứng dụng vào thực tế. Điều này chủ yếu liên quan đến giá thành của các

sản phẩm được sản xuất bằng cách ứng dụng enzyme, vì việc tách chiết chúng ra

khỏi nguồn tự nhiên trước khi sử dụng là một hạn chế lớn làm tăng giá thành.

Chúng ta sẽ cần thực hiện nhiều nghiên cứu để nhận diện được loại enzyme nào là

đặc chủng nhất, tiềm năng nhất và các điều kiện hoạt động tối ưu của chúng, khi đó

sẽ có nhiều hy vọng ứng dụng loại enzyme ấy vào sản xuất và tạo ra sản phẩm giá

thành rẻ. Nguồn thu enzyme vẫn dựa trên đối tượng chủ yếu là thực vật và nội tạng

động vật giết mổ, trong khi phế liệu thủy sản cũng chứa nhiều enzyme nhưng lại

chưa được tận dụng triệt để, lượng thải ra ngày một lớn và góp phần làm ô nhiễm

môi trường. Do đó, sử dụng nguồn phế liệu này để tạo ra những sản phẩm có ích

phục vụ cho cuộc sống là điều cần thực hiện.

Trong bức tranh toàn cảnh ngành thủy sản Việt Nam, hai sản phẩm chiếm

giữ vị trí nổi bật và góp phần lớn nhất vào kinh ngạch xuất khẩu của đất nước là

tôm sú và cá basa. Những dự đoán từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



40

Việt Nam VASEP cho rằng, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực của năm

2010, kim ngạch dự kiến sẽ đạt 1,4 tỉ USD. Đối với cá basa, theo đánh giá của

VASEP, đây là sản phẩm thủy sản duy nhất có tốc độ phát triển nhanh và được

nhiều thị trường ưa chuộng trong thời gian ngắn. Trong khoảng 10 năm gần đây,

sản lượng cá basa của Việt Nam đã tăng 50 lần, giá trị xuất khẩu tăng khoảng 65 lần

và hiện chiếm tới 99,9% thị phần thế giới. Với tiềm năng xuất khẩu to lớn như vậy,

việc sản xuất các mặt hàng từ tôm và cá phát triển mạnh ở nước ta. Đồng thời với

khối lượng tôm xuất khẩu thì khối lượng phế liệu đầu và vỏ tôm thải ra rất lớn, và

cùng với quá trình chế biến cá basa thì một lượng không nhỏ máu và gan cá cũng bị

loại bỏ như phế liệu có khả năng gây nên ô nhiễm môi trường. Hướng nghiên cứu

tận dụng các loại phế liệu nêu trên có thể đem lại giải pháp tiềm năng vừa giúp

mang lại giá trị gia tăng cho cơ sở sản xuất, vừa giải quyết được vấn đề xử lý chất

thải và giảm thiểu các tác hại gây nên cho môi trường.

Với mong muốn thực hiện được các mục đích nêu trên, nghiên cứu đã hướng

vào sử dụng phế liệu đầu tôm sú để tận thu chế phẩm enzyme protease và ứng dụng

nó trong thủy phân hai đối tượng cũng là phế liệu chế biến thủy sản là hỗn hợp máu,

gan cá basa và đầu, vỏ tôm. Các sản phẩm của nghiên cứu gồm dịch đạm thủy phân

từ máu, gan cá, và bột carotenoprotein sẽ không chỉ phù hợp dùng cho thức ăn vật

nuôi mà còn có thể là thực phẩm chức năng hữu dụng cho con người.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



41

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu để tách chiết và tinh sạch enzyme

Mẫu đầu (bao gồm gan tụy) và gan tụy tôm sú Penaeus monodon được phân

tách từ tôm sú sống, loại 40-50 con/kg được nuôi ở Cần Giờ. Tôm được chở trong

thùng sục khí về phòng thí nghiệm, rửa sạch và giết chết bằng cách trộn với nước đá

vụn, tỷ lệ tôm/đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc gan tụy. Đầu và gan tụy tôm được

tách riêng 20 cái/bao PE, cấp đông nhanh và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ

-20oC để sử dụng dần trong thí nghiệm, thời gian bảo quản không quá 4 tuần.

2.1.2 Nguyên liệu dùng trong quá trình ứng dụng enzyme protease vào thủy

phân

Mẫu đầu tôm sú để thu nhận CPE và ứng dụng vào thủy phân được phân tách

và đóng gói bảo quản đông lạnh tại công ty Cổ Phần Thủy Sản Số 1, Quận Tân Phú.

Đầu tôm sú được đóng thành bao nhỏ thuận tiện cho thí nghiệm. Nếu sử dụng ngay,

các túi đầu tôm được bảo quản bằng đá xay ở nhiệt độ 0-4oC, thời gian không quá 2

giờ. Nếu cần cất giữ lâu hơn thì cấp đông nhanh và bảo quản ở nhiệt độ -20oC trước

khi sử dụng, thời gian bảo quản không quá bốn tuần. Phế liệu đầu, vỏ tôm ứng dụng

vào thủy phân cũng được thu nhận và bảo quản tương tự.

Mẫu máu và gan cá basa Pangasiadon hypophthanus được phân tách và

đóng gói bảo quản đông lạnh tại công ty cổ phần thủy sản Hùng Vương, Mỹ Tho,

Tỉnh Tiền Giang. Việc lấy máu cá được thực hiện bằng cách cắt tiết cá (loại 0,8-

1kg) và thả vào bồn chứa nước với tỉ lệ cá: nước là 10:1(v/w). Máu và gan cá được

bảo quản đông -20oC trước khi sử dụng, thời gian bảo quản không quá bốn tuần.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



42

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại hóa chất tinh khiết

dùng cho phân tích được sản xuất tại các hãng Merck hoặc Sigma.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bố trí thí nghiệm để thu nhận protease tinh sạch

Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động

của enzyme protease từ mẫu đầu và gan tụy tôm sú được tiến hành theo sơ đồ 2.1

2.2.1.1 Chiết rút thu dịch chiết DC và CPE protease gan tụy và đầu tôm sú

Toàn bộ quá trình tách chiết enzyme được thực hiện ở nhiệt độ 0-4oC. Đầu

(hoặc gan tụy) tôm sú được nghiền nhỏ, hòa tan trong dung môi chiết rồi ly tâm

6000 vòng/ph trong 15 phút, vớt bỏ phần chất béo nổi trên bề mặt và thu dịch chiết

DC. Chế phẩm enzyme CPE protease thu được bằng cách kết tủa dịch chiết với tác

nhân tủa trong thời gian xác định từ phần thực nghiệm ở trên, ly tâm 6000 vòng/ph

trong 15 phút để thu cặn.

Xác định dung môi và thời gian chiết rút thích hợp đối với protease từ

gan tụy và đầu tôm sú

Nghiên cứu tiến hành chiết tách enzyme protease từ mẫu gan tụy và đầu tôm

sú bằng các dung môi khác nhau: nước cất, muối sinh lý, đệm phosphate

0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với các tỷ lệ khối lượng

mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, khuấy liên tục trên máy khuấy từ trong 40

phút. Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch

chiết. Xác định hoạt độ protease và hàm lượng protein của từng DC, so sánh,

chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung môi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí thí

nghiệm như sơ đồ 2.2

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



43

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu enzyme protease từ đầu và gan tụy tôm sú

Nghiền mịn trong dung môi

Ly tâm

Dịch chiết

Cặn

Kết tủa dịch chiết

Ly tâm

Chế phẩm enzyme

Lựa chọn dung môi, thời gian chiết thích hợp

Lựa chọn tác nhân, thời gian kết tủa thích hợp

Dịch

Đầu/ Gan tụy tôm

Tinh sạch CPE bằng sắc ký lọc gel

Khảo sát tính chất của enzyme

Protease tinh sạch

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



44

Sơ đồ 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp thu dịch

chiết enzyme

Xác định thời gian chiết rút protease thu DC

Hiệu suất của quá trình chiết rút phụ thuộc vào thời gian chiết. Sau khi xác

định được tỷ lệ, dung môi chiết, tiến hành thí nghiệm xác định thời gian chiết thích

hợp cho enzyme. Mẫu đầu hoặc gan tụy tôm sau nghiền được bổ sung dung môi với

tỉ lệ tối ưu chọn từ thí nghiệm xác định dung môi ở trên, sau mỗi khoảng thời gian

20, 30, 40,....., 90 phút được ly tâm thu DC và xác định hoạt độ enzyme, từ đó chọn

thời gian chiết thích hợp.

Xác định tác nhân kết tủa thích hợp và nồng độ thu chế phẩm enzyme

từ dịch chiết

Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein-enzyme hiệu

quả ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết

Gan tụy tôm sú (đã nghiền)

Hòa với các dung môi

Nước cất Tỷ lệ 1/0,5-1/5 (w/v)

Muối sinh lý Tỷ lệ 1/0,5-1/5

Đệm phosphate Tỷ lệ 1/1-1/10 (w/v)

Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-1/10

Xác định hoạt tính protease của DC Xác định hàm lượng protein của DC

Chọn ra dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp

Đầu tôm sú (đã nghiền)

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



45

tủa. Tiến hành kết tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân tủa với nồng độ

khác nhau trong thời gian 60 phút, ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong

15 phút thu cặn tủa CPE, sau đó loại tác nhân tủa bằng cách quạt gió (để đuổi

ethanol và acetone) hoặc thẩm tích (để loại (NH4)2SO4), hòa CPE với dung dịch

đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 để đưa về cùng thể tích nhất định (lượng ít nhất có

thể). Xác định hoạt độ protease và hàm lượng protein của từng CPE, so sánh, chọn

ra nồng độ tủa thích hợp và loại tác nhân tủa thích hợp. Thí nghiệm được bố trí như

ở sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tác nhân và nồng độ tủa thích hợp thu chế

phẩm enzyme

Xác định thời gian kết tủa thích hợp thu CPE

Sau khi xác định được tác nhân kết tủa và nồng độ thích hợp, các thông số này

được áp dụng để tách chiết protease thu CPE. Dịch chiết được bổ sung tác nhân kết

DC enzyme từ gan tụy tôm

Kết tủa bằng các tác nhân với nồng độ tủa khác nhau

Ethanol Tỷ lệ 1/1-8 (v/v)

Acetone Nồng độ 50-75%

(NH4)2SO4 Nồng độ 50-75%

Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein hoà tan của CPE

Chọn tác nhân và nồng độ tủa thích hợp

DC enzyme từ đầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



46

tủa với nồng độ tối ưu, giữ trong 20, 30, 40,..... và 90 phút rồi ly tâm thu CPE, xác

định hoạt độ protease và hàm lượng protein của từng CPE để lựa chọn thời gian kết

tủa thích hợp.

2.2.1.2 Tinh sạch CPE protease bằng sắc ký lọc gel [29,39]

Chế phẩm enzyme protease thu được từ thí nghiệm trên được tinh sạch trên

sắc ký lọc gel dạng cột áp suất thấp Bio- Rad.

Việc tinh sạch protease trong CPE mẫu đầu và mẫu gan tụy thu được nhờ tác

nhân tủa là ethanol và muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp được thực hiện bằng

phương pháp sắc ký lọc gel trên thiết bị sắc ký cột áp suất thấp của hãng Bio-Rad,

sử dụng gel Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5.000 – 100.000 Da), kích thước

cột: chiều dài 50 cm, đường kính 1,5 cm. Các thông số của quá trình tinh sạch như

sau:

Flow adaptor : 1,5 cm.

Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút.

Thể tích mẫu đem phân tích : 1ml.

Dung dịch đệm Tris-HCl pH 7,5

Hình 2.1 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



47

Các phân đoạn chứa dịch enzyme protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel

được thu gom tự động trong bộ phận thu gom (collector) của thiết bị, thể tích mỗi

phân đoạn là 2ml. Hàm lượng protein trong mỗi phân đoạn được đo tự động trong

thiết bị sắc ký ở bước sóng 280 nm và ghi nhận trên sắc ký đồ nhờ phần mềm Data

View. Hoạt độ protease của các phân đoạn được xác định bằng phương pháp

Amano [38].

2.2.2 Khảo sát các tính chất của protease sau tinh sạch

2.2.2.1 Trọng lượng phân tử của protease

Trọng lượng phân tử của protease tôm sú được xác định bằng phương pháp sử dụng

điện di Substrate-Gel Electrophoresis và Zymogram.

Điện di Substrate-Gel Electrophoresis [74,135]

Điện di Substrate-Gel Electrophoresis được thực hiện theo phương pháp của

García-Carreno và cộng sự (1993) trên gel polyacrylamide với gel gom 4% và gel

phân tán 12%. Protease sau sắc ký lọc gel (hàm lượng protein 500µg/ml) được pha

loãng với tỉ lệ từ 1:5 đến 1:500 (v/v) bằng dung dịch đệm xử lý mẫu (Tris-HCl 1M

pH6,8; SDS 10%; glycerol 20%, không tác nhân khử β- mercaptoethanol), không

gia nhiệt. Mỗi mẫu protease gan tụy hoặc đầu đều được điện di song song năm mẫu

trên cùng bản gel với độ pha loãng khác nhau 5, 25, 50, 100 và 500 lần, lượng mẫu

đưa lên giếng là 15µl. Thang protein chuẩn được điện di trên bản gel có cùng thành

phần với điện di Zymogram hoặc Substrate-Gel để có thể so sánh và tính toán phân

tử lượng của các protease.

Quá trình điện di thực hiện ở hiệu điện thế 110V, 30A, thời gian điện di là 2

giờ trên thiết bị điện di đứng của hãng Bio-Rad. Bản gel sau điện di được ngâm và

lắc đều trong 100 ml dung dịch casein 2% (w/v) pha trong đệm Tris-HCl, pH 7,5 ,

nhiệt độ 37oC trong thời gian 30 phút để casein thấm vào bản gel và enzyme hoạt

động làm xuất hiện các vùng hoạt tính. Sau khi rửa bằng nước, gel được nhuộm

trong thuốc nhuộm Coomassie Brilliant blue 0,1% pha trong dung dịch methanol

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



48

40%, acid acetic 10% trong 2 giờ, việc giải nhuộm màu sau đó được thực hiện trong

dung dịch I chứa 40% methanol và 10% acid acetic với thời gian 30 phút, tiếp tục

rửa kết thúc bằng dung dịch II gồm 0,5% methanol và acid acetic 10% trong 2 giờ.

Phân tử lượng của protease được thực hiện bằng cách so sánh với thang

chuẩn 161-0371 của Sigma bao gồm myosin (200.000 Da), β-galactosidase

(116.250 Da), phosphorylase b (97.400 Da), serum albumin (66.200 Da), ovalbumin

(45.000 Da), cacbonic anhydrase (31.000 Da), tripsin inhibitor (21.500 Da),

lysozym (14.400 Da) và aprotinin (6.500 Da). Thang chuẩn được chạy trên cùng gel

với protease, sau điện di được cắt ra và nhuộm riêng ngay mà không cần xử lý với

casein. Cách thức nhuộm thang chuẩn tương tự như đã trình bày ở trên.

Hình 2.2 Thiết bị điện di

Điện di Zymogram (điện di trên gel có bổ sung cơ chất)

Quá trình thực hiện điện di trên gel có bổ sung cơ chất zymogram cũng

tương tự như substrate gel nhưng thành phần gel phân tán được bổ sung thêm casein

với nồng độ 0,1%. Sau điện di, bản gel được ngâm trong dung dịch Triton X100

2,5% hai lần, mỗi lần 30 phút, tiếp tục ngâm trong dung dịch gồm glycine 0,1M và

CaCl2 2mM pH8, thời gian 30 phút, sau đó thay mới bằng chính nó để ngâm qua

đêm. Công đoạn nhuộm bằng Coomassie Brilliant blue và giải nhuộm thực hiện

tương tự như đã trình bày ở phương pháp điện di Substrate- Gel.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



49

2.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease [133,138,149]

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme. Tiến hành xác định hoạt độ enzyme protease của mẫu gan tụy và đầu tôm

sú ở khi ủ với casein 1% pH 7,0 trong 60 phút với dãy nhiệt độ ủ 22, 27, 32, 37, 42,

47, 52, 57, 62, 67, 72, 77, 82oC theo phương pháp Amano [38]. Qui trình thí

nghiệm như trong sơ đồ 2.4

Sơ đồ 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của

enzyme protease

2.2.2.3 Xác định độ bền nhiệt của protease tôm sú [75,82]

Protease được ủ ở các nhiệt độ cần khảo sát trong thời gian 30 phút, sau đó

đưa nhanh về 37oC rồi đo hoạt độ bằng phương pháp Amano với cơ chất casein.

2.2.2.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease [124,130]

pH là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính

enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối

ưu nhất. Tiến hành thí nghiệm, ủ enzyme protease của mẫu đầu và gan tụy tôm sú

với dung dịch casein 1% trong môi trường có pH thay đổi từ 1 đến 12 trong thời

Kết luận về ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme

Protease gan tụy/ đầu tôm

Ủ với casein 1% pH 7,0 trong 60 phút ở các nhiệt độ (oC)

2oC ….. 27oC 37oC….….

….82oCC

Xác định hoạt tính protease

32oC 87oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



50

gian 60’. Xác định hoạt tính theo phương pháp Amano [38]. Qui trình bố trí thí

nghiệm như ở sơ đồ 2.5

Sơ đồ 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme protease

từ đầu và gan tụy tôm sú

Sơ đồ 2.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl tới hoạt độ

enzyme protease

Kết luận về ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme

Protease gan tụy/ đầu tôm sú

Ủ với casein 1% trong 60 phút, với pH

1….. ….. ..

6,5 7,5… ..…..


7 .....12

ĐC 1% 2% 3% 4%....... 24% 25%

Nhận xét về ảnh hưởng của muối ăn đến hoạt độ enzyme

Protease gan tụy/ đầu tôm

Ủ với dung dịch NaCl


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



51

2.2.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ protease

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính protease tôm sú được xem xét

bằng cách xác định hoạt tính enzyme ở các môi trường có nồng độ muối: 0%, 1%,

3%, 5%,…, 24%. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ 2.6

2.2.2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất ức chế đặc hiệu

đến hoạt tính protease tôm sú [37,38,41,92]

Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các ion kim loại Mo2+, Pb2+, Mg2+, Ba2+,

Co2+, Hg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+ và Fe2+, Ca2+ lên hoạt tính protease được thực hiện

bằng cách bổ sung các ion kim loại này vào phản ứng xác định hoạt tính enzyme

theo phương pháp Amano với nồng độ 0,001M.

Để tìm hiểu cụ thể hơn về các enzyme có mặt trong hệ protease gan tụy và

đầu tôm, nghiên cứu đã xác định hoạt tính protease khi có mặt các chất ức chế đặc

hiệu theo phương pháp của Garcia-Carreno (1992) [75]. Dung dịch phenylmethyl

sulphonyl fluoride (PMSF), soybean trypsin inhibitor (SBTI), tosyl-lysine

chloromethyl ketone (TLCK), tosil-phenyl chloromethyl ketone (TPCK), 51olypept

diamine tetraacetic acid (EDTA), 1,10-phenanthroline và Iodoacetate được ủ với

cùng thể tích enzyme sao cho đảm bảo đúng nồng độ thích hợp cần thiết (ghi rõ

trong bảng kết quả), giữ ở 25oC trong 15 phút, sau đó xác định hoạt tính còn lại theo

phương pháp Amano [38].

2.2.2.7 Các thông số động học của protease từ tôm sú Penaeus

monodon [62]

Để nghiên cứu động học của protease, enzyme protease (20 U/ml) được cho

tác dụng với cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau trong khoảng 0,01-0,12 mM,

đo lượng sản phẩm tyrosin tạo thành và từ đó xác định vận tốc của phản ứng. Các

thông số động học được xác định nhờ phương trình động học Hill xây dựng trên cơ

sở phân tích số liệu thu được về nồng độ và vận tốc phản ứng.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



52

2.2.3 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme (CPE) thu nhận từ đầu tôm sú

vào thủy phân protein từ hỗn hợp máu và gan cá basa

Nghiên cứu ứng dụng CPE đầu tôm vào thủy phân hỗn hợp máu và gan cá

basa được thực hiện theo sơ đồ 2.7

a) Các bước chuẩn bị thủy phân protein

Thu nhận chế phẩm enzyme CPE từ đầu tôm

Quá trình được thực hiện ở nhiệt độ lạnh 0-4oC. Đầu tôm không cần rã đông được

đồng hóa với Tris-HCl 0,05M pH 7,5 theo tỉ lệ chiết thích hợp, giữ lạnh trong thời

gian cần thiết (kết quả từ phần tách chiết thu nhận enzyme), sau đó ly tâm tách cặn

với tốc độ 6000 vòng/ph. DC được tủa bằng ethanol rồi ly tâm 6000 vòng/ph thu

cặn là bột nhão, sau đó làm khô bằng quạt gió trong 15 phút để thu chế phẩm

enzyme CPE. Chế phẩm này được bảo quản đông ở -20oC để dùng dần trong thí

nghiệm, thời gian bảo quản không quá bốn tuần.

Chuẩn bị hỗn hợp máu và gan cá basa cho thủy phân

Máu và gan cá basa được phối trộn theo tỷ lệ khối lượng 80% máu cá và

20% gan cá, nghiền nhỏ trong thiết bị đồng hóa để dùng cho thí nghiệm. Đối với

hỗn hợp cần gia nhiệt trước khi thủy phân thì nâng nhiệt cho hỗn hợp đến sôi trước,

sau đó làm nguội và đồng hóa. Hỗn hợp có thể bảo quản bằng lạnh đông ở -20oC, rã

đông đến nhiệt độ cần thiết khi thực hiện thủy phân, thời gian bảo quản không quá

bốn tuần.

2.2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ hỗn

hợp máu và gan cá

Quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá thực chất là quá trình phân giải

protein để tạo thành các đoạn polypeptide ngắn mạch dần đến acid amin. Vì vậy, có

thể dùng hàm lượng peptid ngắn mạch và acid amin để đo mức độ protein giải.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



53

Sơ đồ 2.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thuỷ phân hỗn hợp máu và gan cá

basa bằng chế phẩm enzyme từ đầu tôm sú

Hỗn hợp máu và gan cá basa

Dịch tươi Gia nhiệt đến sôi

Làm nguội

Nghiền mịn

Thuỷ phân bằng CPE Các thông số của quá trình thuỷ phân

Tối ưu hoá quá trình thuỷ phân

Thuỷ phân bằng các thông số tối ưu, kiểm tra độ tin cậy của các thông số này

Gia nhiệt sôi diệt enzyme

Dịch thuỷ phân

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



54

b) So sánh quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease đầu tôm trên

hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

Hỗn hợp máu và gan cá (tươi và gia nhiệt) được ủ đến khi đạt nhiệt độ cần

thủy phân, bổ sung enzyme với nồng độ 2% so với hỗn hợp rồi giữ trong bể ủ nhiệt

để tiến hành thủy phân ở nhiệt độ ổn định. Tại các thời điểm xác định, lấy mẫu, sau

đó đun sôi vô hoạt enzyme, làm nguội và xác định hàm lượng peptid mạch ngắn và

axit amin của dịch (sau đây sẽ gọi ngắn gọn là hàm lượng peptid và axit amin),

nhận xét cảm quan để có lựa chọn thích hợp. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ 2.8

c) Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme protease đến quá trình thủy

phân hỗn hợp máu và gan cá basa gia nhiệt

Thí nghiệm thực hiện với các nồng độ CPE là 0,5; 2; 3,5 và 4,5% ở nhiệt độ

50oC. Hàm lượng peptid mạch ngắn và acid amin được xác định theo thời gian thủy

phân ở các thời điểm 0, 1, 2, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 18, 20 giờ.

Sơ đồ 2.8 Bố trí thí nghiệm so sánh quá trình thủy phân bằng CPE protease đầu

tôm trên hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

Ủ ở 50oC, với thời gian

0h 4h… 2h 20 h

Xác định hàm lựợng peptid và a.amin

Nhận xét

Mẫu tươi Mẫu gia nhiệt

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



55

c) Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ tới quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá

gia nhiệt

Thực hiện thủy phân ở nồng độ chế phẩm enzyme là 2% tại các nhiệt độ 40,

50, 60, 65oC. Qúa trình được đánh giá bằng hàm lượng peptid mạch ngắn và acid

amin tạo thành theo thời gian thủy phân.

d) Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan

cá gia nhiệt

Thực hiện thí nghiệm tương tự như ở mục b, với nồng độ CPE bổ sung là 3,5

và 4,5%.

2.2.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa [5]

Các số liệu về quá trình thủy phân ở các nhiệt độ, nồng độ enzyme bổ sung,

và thời gian thu được ở phần trên được xem xét và phân tích để lựa chọn khoảng

biến thiên thích hợp sử dụng cho tối ưu hóa, sau đó dùng phần mềm

STATGRAPHICS Plus và tìm phương trình hồi qui. Thông số tối ưu hóa của quá

trình được suy ra từ những phân tích bề mặt đáp ứng thu được. Kết quả tối ưu sau

đó được kiểm tra lại bằng thực nghiệm nhằm đảm bảo sự thống nhất giữa lý

thuyết tối ưu và thực tế trước khi rút ra kết luận cuối cùng về các thông số của quá

trình thuỷ phân.

Sơ bộ đánh giá chất lượng dịch thủy phân thu được

Dịch thủy phân thu nhận được theo các thông số tối ưu được đánh giá chất

lượng bằng một số chỉ tiêu hóa học như nitơ tổng số, nitơ acid amin, nitơ NH3 và

bằng cảm quan để có được đề nghị hợp lý về ứng dụng của nó sau này. Thành phần

acid amin trong dịch cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký khí.

2.2.5 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ đầu tôm sú vào

thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm thu nhận carotenoprotein

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



56

Nghiền nhỏ 3-5 mm

Lắc trộn đều 2 phút

0h 3h 6h 9h 12h 15h

Lọc qua vải thô Bã

HCl 10%

Kết tủa đẳng điện

Bổ sung chất trợ lắng

Chitosan 1.5%

Bổ sung CPE

2% 3,5% 5%

Thủy phân ở các nhiệt độ:

40 50 60 650C

Bổ sung Na-EDTA 0,5M tỷ lệ 1:3(w/v)

Rửa sạch , để ráo

Bổ sung NaCl 1%

ĐẦU & VỎ TÔM

Gia nhiệt 5 phút, 98oC Để tươi

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



57

Sơ đồ 2.9 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm

Nghiên cứu ứng dụng CPE đầu tôm vào thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm để

thu nhận carotenoprotein được thực hiện theo sơ đồ 2.9 nhằm mục đích thu nhận

bột carotenoprotein đông khô. Việc tối ưu hóa quá trình thủy phân được thực hiện

dựa trên các thông số của quá trình và kết quả phân tích hàm lượng protein, hàm

lượng carotenoid của sản phẩm bột carotenoprotein thu nhận được.

Lắng lạnh 4o C ,2 h

Bột nhão carotenoprotein

Đông khô

Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng carotenoid

Tối ưu hóa quá trình thủy phân

Dịch trong

Ly tâm 10000 vòng/ph, 15 phút

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



58

Chuẩn bị CPE:

Việc chuẩn bị CPE protease từ đầu tôm được thực hiện tương tự như đã thực

hiện trong mục 2.2.3.1

Chuẩn bị hỗn hợp đầu, vỏ tôm và thực hiện thủy phân:

Đầu và vỏ tôm thu nhận trực tiếp từ qui trình chế biến tôm sú đông lạnh xuất

khẩu được rửa, để ráo sau đó nấu chín bằng cách đun sôi ở nhiệt độ 98oC trong 5

phút, làm nguội và xay nhỏ 3-5mm trong dung dịch Na2-EDTA 0,5M pH7. Tỉ lệ

đầu, vỏ tôm: dung dịch Na2-EDTA là 1:3 (w/v). Sau khi để nguội đến nhiệt độ

cần thủy phân, hỗn hợp được bổ sung CPE với nồng độ cần thiết, khuấy trộn mỗi

nửa giờ trong khi vẫn giữ ở nhiệt độ này để thực hiện thủy phân protein. Vào

các thời điểm định trước, mẫu được lấy ra, lọc qua nhiều lớp vải thô, dịch lọc được

kết tủa bằng HCl 10% đến khi đạt pH đẳng điện, thêm dung dịch chitosan sao cho

nồng độ đạt được là 100ppm, sau đó để lắng ở 4oC trong 2 giờ. Bột carotenoprotein

thu nhận được bằng cách ly tâm 15 phút ở 10.000 vòng/phút được đông khô trong

thiết bị đông khô ở nhiệt độ -40oC.

Xác định pH đẳng điện để kết tủa dịch carotenoprotein sau khi thủy phân

Hỗn hợp đầu và vỏ tôm chuẩn bị như trên được thủy phân bằng CPE với

nồng độ 4%, thời gian thủy phân 9 giờ ở nhiệt độ 50oC, dịch carotenoprotein thu

nhận sau lọc được bổ sung HCl 10% đến khi đạt pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6 rồi thêm

chitosan để đạt nồng độ 100ppm, sau đó lắng ở 4oC trong 2 giờ. Quá trình ly tâm

được thực hiện 15 phút với tốc độ vòng quay 10.000 vòng/phút để thu dịch trong.

Hàm lượng protein hòa tan của dịch trong được xác định bằng phương pháp

Bradford [51]. Điểm đẳng điện pI là giá trị pH cho độ hòa tan protein của dịch trong

thấp nhất. Bố trí thí nghiệm được thực hiện như trong sơ đồ 2.10

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



59

Rửa sạch , để ráo

ĐẦU & VỎ TÔM

Gia nhiệt 5 phút, 980 C

Bổ sung CPE 3%

Thủy phân ở nhiệt độ 500C

Bổ sung muối ăn NaCl 1%

Nghiền nhỏ 2-5 mm

Bổ sung Na2-EDTA 0,5M

Lọc qua vải thô

Kết Tủa bằng HCl 10% đến pH:

4 4,5 5 5,5 6

Thêm chất chợ lắng Chitosan

Bã

Lắng lạnh 4o C , 2 giờ

Dịch trong

Bột nhão carotenoprotein

Ly tâm 10.000 vòng/ph, 15 phút

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



60

Sơ đồ 2.10 Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện để kết tủa dịch carotenoprotein sau khi thủy phân

2.2.6 Tối ưu hóa quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein [5]

Các số liệu về quá trình thủy phân bằng CPE với nồng độ bổ sung khác nhau

2%; 3,5% và 5% theo thời gian ở các nhiệt độ thủy phân 40, 50, 60 và 65oC thu

được ở phần trên được xem xét và loại bớt để sử dụng phân tích trên

phần mềm STATGRAPHICS Plus và tìm phương trình hồi qui. Thông số tối ưu

hóa của quá trình được suy ra từ những phân tích bề mặt đáp ứng thu được. Kết

quả tối ưu sau đó được kiểm tra lại bằng thực nghiệm nhằm đảm bảo sự thống

nhất giữa lý thuyết tối ưu và thực tế trước khi rút ra kết luận cuối cùng về các

thông số của quá trình thuỷ phân.

Đánh giá chất lượng bột carotenoprotein thu được

Sản phẩm bột carotenoprotein đông khô thu nhận được theo các thông số tối

ưu được phân tích thành phần qua một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein,

chất béo, hàm lượng tro, chitin và đặc biệt là hàm lượng carotenoid để có được đề

nghị hợp lý về ứng dụng của nó sau này. Thành phần acid amin trong bột cũng được

xác định bằng phương pháp sắc ký khí.

Xác định hàm lượng protein hòa tan

Kết luận về điểm đẳng điện của dịch thủy phân

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



61

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG

Hoạt độ protease được xác định theo phương pháp Amano (Amano, 2002)

dùng casein từ sữa (Merck) làm cơ chất. Một đơn vị hoạt độ protease (U)

được định nghĩa là lượng enzyme để tạo ra lượng acid amin tương đương với

100µg tyrosine trong 60 phút ở điều kiện nhiệt độ 37±0,5 oC [38].

Hàm lượng protein hòa tan được xác định theo phương pháp Bradford [51],

dùng albumine huyết thanh bò làm chất chuẩn.

Hàm lượng carotenoid được xác định bằng phương pháp Tolasa (2005)

[160]. Mẫu tôm (hoặc bột carotenoprotein) được chiết ba lần, mỗi lần bằng

40ml aceton, tách cặn bằng cách cho qua giấy lọc. Để tách các thành phần

hòa tan trong nước, dịch chiết aceton được bổ sung 40ml ether dầu hỏa và

đưa vào phễu chiết, thêm 100ml dung dịch NaCl 0,5% (w/v), sau đó lắc nhẹ

bằng tay, để ổn định trong thời gian 2 giờ đến khi hai pha tách hoàn toàn.

Lớp ether dầu hỏa phía trên được tách riêng và đo độ hấp thụ ở bước sóng

472nm trên thiết bị đo quang UV-Vis. Hàm lượng carotenoid được xác định

với chất chuẩn là carotene (Merkc).

Hàm lượng nitơ tổng số xác định theo TCVN 3705-90

Hàm lượng nitơ ammoniac xác định theo TCVN 3706-90

Hàm lượng nitơ Formon xác định theo TCVN 3707-90

Nitơ acid amin = Nitơ Formon – Nitơ amoniac.

Hàm lượng chất béo xác định theo TCVN 3703-90

Hàm lượng HL peptid mạch ngắn và acid amin xác định bằng phương pháp

so màu theo phương pháp Amano [38], dùng tyrosin làm chất chuẩn.

Hàm lượng acid amin của các mẫu sản phẩm thủy phân xác định bằng

phương pháp sắc ký khí.

Hàm lượng tro xác định bằng phương pháp trọng lượng, nung ở 600oC [27]

Độ ẩm xác định bằng phương pháp trọng lượng, sấy đến độ ẩm không đổi ở

105oC [27]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



62

Hàm lượng chitin xác định theo phương pháp Chakrabarti (2002) đã làm

bằng cách khử khoáng trong HCl 1,25M với thời gian 2 giờ ở nhiệt độ

phòng, khử protein nhờ KOH nóng 5%, 2 giờ ở 100oC [57].

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các thí nghiệm được thực hiện song song ba lần, mỗi lần ba mẫu, được loại

bỏ sai số thô theo nguyên tắc thống kê, phân tích phương sai sử dụng ANOVA một

yếu tố kiểm tra sự khác biệt giữa ba lần lặp, nếu không có sự khác biệt thì lấy giá trị

trung bình.

Phân tích ANOVA nhiều yếu tố được áp dụng để làm rõ ảnh hưởng của các

yếu tố khác nhau đến quá trình thủy phân thực hiện, số liệu phân tích được sử dụng

để tính toán và vẽ đồ thị trên phần mềm Excel hoặc STATGRAPHICS Plus.

Phần nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân sử dụng phân tích hồi quy đa

biến. Các phân tích hồi qui tuyến tính, mô hình hồi qui và bề mặt đáp ứng của quá

trình thủy phân được xây dựng với sự trợ giúp của phần mềm STATGRAPHICS

Plus.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



63

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊNCỨU

VÀ BIỆN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ

TRÌNH TINH SẠCH PROTEASE TỪ GAN TỤY VÀ ĐẦU

TÔM SÚ

3.1.1. Các thông số cho quá trình thu nhận chế phẩm protease từ gan tụy và

đầu tôm sú

3.1.1.1 Xác định dung môi chiết rút protease thu dịch chiết DC

Protease từ gan tụy và đầu tôm sú được tách chiết theo phương pháp ở mục

2.2.1.1. Thực nghiệm cho thấy rằng, với cùng lượng nguyên liệu đầu hoặc gan tụy

tôm, sự khuyếch tán của enzyme ra dung môi tăng dần khi tăng tỉ lệ dung môi so

với nguyên liệu, đạt giá trị cực đại sau đó giảm xuống. Khi sử dụng các dung môi

khác nhau, tỉ lệ mẫu: dung môi thích hợp cho dịch chiết có tổng hoạt tính lớn nhất

trên mỗi đơn vị khối lượng nguyên liệu cũng khác nhau. Dịch chiết (DC) protease

thu được sau ly tâm có hoạt tính cao nhất khi chiết bằng Tris-HCl với tỉ lệ mẫu:

dung môi là 1:7 ở cả hai trường hợp thu DC từ gan tụy và đầu tôm. Khi dùng dung

dịch đệm phosphate làm dung môi, DC cũng có hoạt tính tương đối cao (đặc biệt là

khi chiết rút protease từ đầu tôm). Như vậy, việc tách chiết protease từ gan tụy và

đầu tôm nên thực hiện ở môi trường gần trung tính pH 7-7,5 và dung môi thích hợp

là Tris-HCl, điều này phù hợp với đặc điểm của Tris-HCl là dung dịch đệm tổng

hợp, hầu như không ảnh hưởng đến các phản ứng sinh hóa [29].

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



64

Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ gan tụy:dung môi (w/v) đến hiệu suất

thu nhận protease của dịch chiết từ gan tụy tôm sú

Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm:dung môi (w/v) đến hiệu suất

thu nhận protease của dịch chiết từ đầu tôm sú

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1:0,5 1:1 1:1,5 1:2 1:2,5 1:3 1:3,5 1:4 1:4,5 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/g

gan

tụy)

Tỷ lệ gan tụy: dung môi (w/v)

Nước cấtNaCl 0,09%Đệm phosphateTris-HCl

0

50

100

150

200

250

1:0,5 1:1 1:1,5 1:2 1:2,5 1:3 1:3,5 1:4 1:4,5 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/g

đầu

tôm

)

Tỷ lệ đầu tôm: dung môi (w/v)

Nước cất

NaCl 0,09%

Đệm phosphate

Tris-HCl

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



65

Các số liệu thực nghiệm cũng cho thấy rằng, hoạt tính protease trên một đơn

vị khối lượng gan tụy tôm cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết

(gấp từ 3,41-4,33 lần). Điều này dễ hiểu vì gan tụy tôm có nhiệm vụ sản sinh

enzyme tiêu hóa, còn đầu tôm thì lại có thêm cả phần vỏ và thịt tôm ít có hoạt tính

sinh học. Hoạt tính protease cao của gan tụy tôm cũng giúp giải thích sự hư hỏng

xảy ra thường thấy nhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản của

tôm đã bỏ đầu, tách chỉ bao giờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế

biến và bảo quản.

Với những phân tích ở trên, ta thấy rằng, tỉ lệ nguyên liệu: dung môi Tris-

HCl (w/v) giúp thu được hoạt tính protease cao nhất đối với cả gan tụy và đầu tôm

là 1:7. Tuy nhiên, lượng dịch chiết thu được trong trường hợp này sẽ nhiều, do đó

sẽ đòi hỏi lượng đáng kể tác nhân tủa để thu chế phẩm enzyme sau này. Xét trên

phương diện kinh tế, tác nhân tủa luôn đắt tiền hơn nhiều so với nguyên liệu đầu

tôm, vì vậy, ta sẽ tiếp tục phân tích số liệu ở trên nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi thích

hợp nhất cho dịch chiết có hoạt tính riêng protease cao nhất.

Đồ thị trên hình 3.3 và 3.4 cho thấy, càng dùng nhiều dung môi thì dịch chiết

càng “loãng” ra, hoạt tính riêng càng giảm, nghĩa là, để thu được dịch chiết “đậm

đặc” có hoạt tính riêng lớn, ta nên dùng ít dung môi sẽ tốt hơn. Tỉ lệ nguyên liệu:

dung môi cho dịch chiết có hoạt tính riêng cao nhất là 1:1, tuy nhiên, khi tăng tỉ lệ

này thành 1:2, 1:3 thì giá trị hoạt tính riêng giảm không đáng kể, đồng thời hoạt tính

protease thu được trên một đơn vị khối lượng nguyên liệu tăng lên gần gấp đôi

(hình 3.1 và 3.2), điều này có thể do khi lượng dung môi tăng, protease hòa tan tốt

hơn.

Trên cơ sở các phân tích số liệu như trên và quan sát thực nghiệm cho thấy

nếu tỉ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) quá nhỏ, ta sẽ khó thu dịch chiết vì lượng vô

cùng ít, tỉ lệ nguyên liệu: dung môi thích hợp nhất cho chiết rút protease từ gan tụy

và đầu tôm được chọn là 1:3 (w/v).

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



66

Hình 3. 3. Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ gan tụy: dung môi (w/v) đến hoạt độ

riêng của dịch chiết từ gan tụy tôm sú

Hình 3. 4. Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm: dung môi (w/v) đến hoạt độ

riêng của dịch chiết từ đầu tôm sú

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1:0,5 1:1 1:1,5 1:2 1:2,5 1:3 1:3,5 1:4 1:4,5 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10

Hoạ

t độ

riêng

(U/m

g pr

otei

n)

Tỉ lệ gan tụy: dung môi chiết (w/v)

Nước cấtNaCl 0,09%Đệm phosphateTris-HCl

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1:0,5 1:1 1:1,5 1:2 1:2,5 1:3 1:3,5 1:4 1:4,5 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10

Hoạ

t độ

riêng

(U/m

g pr

otei

n)

Tỷ lệ đầu: dung môi chiết (w/v)

Nước cất

Nước muối

Đệm phosphate

Tris-HCl

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



67

Một điều đáng chú ý có thể nhận thấy từ hai biểu đồ 3.3 và 3.4 là mặc dù

Tris-HCl luôn cho kết quả tách chiết tốt nhất đối với cả gan tụy và đầu tôm, sau đó

đến dung dịch đệm phosphate, dung dịch muối sinh lý và nước cất, nhưng sự khác

biệt trong hiệu quả tách protease từ gan tụy khi dùng các dung môi khác nhau

không quá rõ ràng, trong khi đó, việc tách protesase từ đầu tôm lại đạt kết quả tốt

nhất khi sử dụng Tris-HCl hoặc đệm phosphate, nước cất và dung dịch muối sinh lý

cho dịch chiết có hoạt tính riêng chỉ bằng nửa, thậm chí còn thấp hơn nữa. Điều này

có lẽ do đầu tôm chứa một lượng đáng kể cơ thịt, và phần cơ thịt này cũng có nhiều

protein mang hoạt tính enzyme, các protease này có tính chất khác so với các

protease gan tụy, chúng hòa tan tốt hơn trong môi trường đệm Tris-HCl hay

phosphate và ít hòa tan trong nước cất và dung dịch muối ăn.

3.1.1.2 Xác định thời gian chiết rút protease thu dịch chiết

Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian chiết rút đến hoạt độ protease dịch chiết từ gan

tụy và đầu tôm sú

Việc chiết rút protease từ gan tụy và đầu tôm sú được tiến hành trong dung

môi Tris-HCl 0,05M pH7,5 với tỉ lệ mẫu:dung môi 1:3, thời gian chiết thay đổi từ

20-90 phút. Kết quả cho thấy, dịch chiết protease thu được có hoạt độ cao nhất khi

thời gian chiết lần lượt là 40 và 60 phút với nguyên liệu là gan tụy và đầu tôm. Dễ

thấy rằng, khi thời gian chiết càng dài, lượng protein-enzyme khuếch tán ra dịch

chiết càng tăng lên, nhưng nếu kéo dài quá thì sẽ tăng lượng protein tạp không có

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80 90

Hoạ

t độ

riêng

tươ

ng đ

ối (%

)

Thời gian chiết rút (phút)

Gan tụyĐầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



68

hoạt tính enzyme, đồng thời các protease trong dịch chiết có thể thủy phân lẫn nhau

làm hoạt độ chung của dịch chiết giảm xuống.

3.1.1.3 Xác định tác nhân kết tủa protease từ dịch chiết gan tụy và đầu tôm để

thu nhận chế phẩm enzyme CPE

Dịch chiết gan tụy và đầu tôm thu nhận ở trên được dùng để kết tủa bằng các

tác nhân ethanol, acetone và (NH4)2SO4 với nồng độ khác nhau. Thực nghiệm cho

thấy rằng, CPE thu được có hoạt tính tăng dần khi tăng nồng độ tác nhân tủa, đạt tới

giá trị cực đại, sau đó giảm nhanh. Lý do của điều này là, nồng độ tác nhân tủa thấp

không đủ để kết tủa triệt để các protein-enzyme, nhưng nếu nồng độ tăng cao quá

thì lại làm biến tính protease và do vậy hoạt độ enzyme sẽ thấp.

Từ hình 3.6 và 3.7, dễ nhận ra rằng (NH4)2SO4 70% là tác nhân tốt nhất và

acetone là tác nhân kém nhất khi tủa DC enzyme từ gan tụy và đầu tôm , tuy nhiên,

tại các nồng độ thích hợp nhất của quá trình tủa bằng các tác nhân khác nhau, CPE

thu được có hoạt độ không khác nhau nhiều lắm. Vì vậy, quá trình tách chiết chế

phẩm enzyme từ đầu tôm để ứng dụng sau này có thể thực hiện kết tủa bằng ethanol

bởi vì ethanol có giá thành rẻ lại rất dễ loại khỏi CPE nên sẽ thuận lợi cho thực

hiện. Việc sử dụng (NH4)2SO4 làm tác nhân kết tủa để điều chế CPE cho sản phẩm

với hoạt tính cao hơn đôi chút nhưng quá trình loại muối này ra khỏi CPE sẽ rất khó

khăn và không có tính kinh tế.

3.1.1.4 Xác định thời gian kết tủa thu chế phẩm enzyme

Tiến hành kết tủa thu CPE từ nội tạng bằng (NH4)2SO4 70%, và đầu tôm

bằng ethanol trong khoảng thời gian từ 20-90 phút. Kết quả cho thấy, thời gian kết

tủa tăng lên thì CPE thu được có hoạt tính cũng tăng, đạt cực đại ở 70 phút đối với

mẫu gan tụy tôm và 50 phút ở mẫu đầu tôm, sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm

xuống. Hiển nhiên là, thời gian kết tủa tăng thì lượng enzyme kết tủa sẽ nhiều,

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



69

nhưng khi kéo dài thời gian tiếp xúc giữa tác nhân tủa với enzyme thì sẽ gây ra sự

biến tính một phần protease và hoạt độ CPE thu được giảm xuống.

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ chất kết tủa đến hoạt độ riêng

protease của chế phẩm enzyme từ gan tụy tôm sú

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ riêng protease

của chế phẩm enzyme từ đầu tôm sú

0

10

20

30

40

50

60

50 55 60 65 66.7 70 75 80.0 83.3 85.7 87.5 88.9

Hoạ

t độ

riêng

pro

teas

e (U

/mg

prot

ein)

Nồng độ tác nhân kết tủa (%)

Sulfate ammonium

Aceton

Ethanol

0

5

10

15

20

25

50 55 60 65 66.7 70 75 80.0 83.3 85.7 87.5 88.9

Hoạ

t độ

riêng

pro

teas

e (U

/mg

prot

ein)


Sulfate ammonium

Aceton

Ethanol

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



70

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ riêng protease chế phẩm

enzyme từ gan tụy và đầu tôm sú

Như vậy, chế phẩm enzyme protease từ đầu (hoặc gan tụy) tôm sú có thể thu

nhận được qua các bước cơ bản: chiết rút enzyme từ nguyên liệu đã nghiền nhỏ

bằng Tris-HCl 0,05M pH7,5 với tỉ lệ 1:3 (w/v), thời gian chiết 40 phút (đối với đầu

tôm) và 60 phút (đối với gan tụy ). DC thu được bằng cách cho qua rây có lỗ với

kích thước 1mm*1mm để loại lượng lớn vỏ tôm, sau đó ly tâm 6000 vòng/ph, 15

phút, loại cặn đem làm thức ăn gia súc. DC thu được đem kết tủa bằng ethanol với

nồng độ 80%, 50 phút để điều chế CPE từ đầu tôm hoặc bằng (NH4)2SO4 70%, 70

phút để thu CPE từ gan tụy tôm. Công đoạn ly tâm thu CPE cũng được thực hiện ở

6000 vòng/ph trong 15 phút. Qui trình được tóm tắt trong sơ đồ 3.1

3.1.2. Thu nhận protease tinh sạch từ chế phẩm enzyme gan tụy và đầu tôm sú

Penaeus monodon bằng sắc ký lọc gel

Chế phẩm enzyme thu được từ quá trình tách chiết protease từ đầu và gan tụy

tôm sú được đem tách trên sắc ký lọc gel Bio-Gel P-100. Kết quả sắc ký đồ lọc gel

chế phẩm enzyme kết tủa bằng (NH4)2SO4 và bằng ethanol thể hiện trên hình 3.9

đến 3.12

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80 90

Hoạ

t độ

riêng

tươ

ng đ

ối (%

)

Thời gian kết tủa (phút)

Gan tụyĐầu

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



71

Sơ đồ 3.1 Qui trình tách chiết chế phẩm enzyme từ đầu hoặc gan tụy tôm sú

Trên hình 3.9 và 3.10 là sắc ký đồ lọc gel CPE đầu tôm. Cả hai sắc ký đồ của

CPE kết tủa bằng (NH4)2SO4 và ethanol đều có ba đỉnh protein, như vậy, thành

phần protein trong CPE đầu tôm có ít nhất ba loại với khối lượng phân tử khác

nhau. Đường biểu diễn nồng độ protein ở các đỉnh của CPE đầu tôm tủa bằng

(NH4)2SO4 và ethanol không có cùng kiểu chứng tỏ tác nhân tủa có ảnh hưởng nhất

định đến thành phần protein thu được của CPE, tuy nhiên sự khác nhau đó không

nhiều lắm, dù dùng tác nhân nào thì protein chiếm ưu thế vẫn rơi vào đỉnh cuối.

Đầu tôm/ gan tụy

Nghiền nhỏ

Chiết rút bằng Tris-HCl 0,05M pH7,5

Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1:3

Ly tâm 6000 vòng/ph, 15 phút thu DC

Kết tủa DC bằng ethanol hoặc (NH4)2SO4

Ly tâm 6000 vòng/ph, 15 phút thu cặn

Lọc qua rây thưa 1*1mm2 Vỏ tôm

Cặn DC

CPE thành phẩm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



72

Đường biểu diễn hoạt độ protease của CPE trên cả hai sắc ký đồ có 4 đỉnh rõ

ràng cho phép suy luận là có bốn loại protease khác nhau, điều này tương đồng với

nghiên cứu của Nguyễn Văn Lệ trên đối tượng đầu tôm biển [21]. Đỉnh chủ yếu của

hai sắc ký đồ này đều là đỉnh thứ 2, các đỉnh còn lại có hoạt tính thấp, như vậy,

protease trong đầu tôm ít phức tạp, chỉ có một loại đóng vai trò chính, ba loại khác

có mặt trong đầu tôm nhưng không quan trọng lắm vì hoạt độ thấp hơn hẳn so với

đỉnh chính.

Các đỉnh protein và hoạt độ protease không trùng nhau, đỉnh tập trung nhiều

protein nhất (đỉnh 3) lại là nơi có hoạt độ protease thấp (gồm đỉnh 3 và 4) cho ta suy

ra là trong CPE còn nhiều protein tạp có trọng lượng phân tử cao so với protease.

Sự khác nhau của đồ thị phân tách protein CPE tủa bằng (NH4)2SO4 và

ethanol nhưng sắc ký đồ hoạt độ protease lại tương đối giống nhau chứng tỏ rằng,

dù tác nhân tủa khác nhau gây tác dụng tủa protein khác nhau nhưng có khả năng

rất lớn là loại protease thu được trong cả hai loại CPE là tương đồng.

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch protease từ đầu tôm sú

Sản phẩm

Tổng hàm lượng protein (mg)

Tổng đơn vị hoạt độ protease

(U)

Hoạt độ riêng

(U/mg protein)

Hiệu suất (%)

Độ tinh sạch (lần)

Dịch chiết 704,70 6318,25 8,97 100,00 1,00

Chế phẩm enzyme

tủa bằng (NH4)2SO4 148,89 3414,13 22,93 54,04 2,56

tủa bằng ethanol 174,99 3672,87 20,99 58,13 2,34

Lọc gel

từ CPE tủa bằng (NH4)2SO4 9,84 1589,89 161,63 25,16 18,03 từ CPE tủa bằng ethanol 11,22 1422,37 126,82 22,51 14,14

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



73

Hình 3.9 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH4)2SO4 từ đầu tôm

Hình 3.10 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ đầu tôm

0

5

10

15

20

25

30

35

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/m

l)

A-2

80 n

m

Phân đoạn

A-280 nmHoạt độ protease (U/ml)

0

5

10

15

20

25

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/m

l)

A-2

80 n

m

Phân đoạn

A-280 nm

Hoạt độ protease (U/ml)

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



74

Hình 3.11 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH4)2SO4 từ gan tụy tôm

Hình 3.12 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ gan tụy tôm sú

Khi xem xét sắc ký đồ lọc gel của CPE protease gan tụy tôm kết tủa bằng

(NH4)2SO4 và ethanol, ta thấy vẫn có ba đỉnh protein nhưng số đỉnh hoạt độ lại

khác, lúc này chỉ có một đỉnh chủ yếu, các đỉnh còn lại thật sự không rõ ràng. Sự

0

5

10

15

20

25

30

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/m

l)

A-28

0 nm

Phân đoạn

A-280 nmHoạt độ protease (U/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55

Hoạ

t độ

prot

ease

(U/m

l)

A-28

0 nm

Phân đoạn

A-280 nm


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



75

khác nhau giữa CPE từ đầu và gan tụy có lẽ bởi vì trong đầu tôm, ngoài gan tụy còn

có phần thịt cũng chứa protease.

Bảng 3.2 Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy tôm sú

Sản phẩm

Tổng hàm lượng protein (mg)

Tổng đơn vị hoạt độ

protease (U)

Hoạt độ riêng (U/mg

protein)

Hiệu suất (%)

Độ tinh sạch (lần)

Dịch chiết 655,78 16132,50 24,60 1,00 1,00

Chế phẩm enzyme

tủa bằng muối (NH4)2SO4

169,72 10025,86 59,07 62,15 2,40

tủa bằng ethanol 164,08 9627,98 58,68 59,68 2,39

Lọc gel

từ CPE tủa bằng (NH4)2SO4

9,75 3902,40 400,25 24,19 16,27

từ CPE tủa bằng ethanol

10,82 3867,56 357,45 23,97 14,53

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



76

3.2. MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE SAU TINH

SẠCH TỪ GAN TỤY VÀ ĐẦU TÔM SÚ

3.2.1. Trọng lượng phân tử của protease gan tụy và đầu tôm

Trọng lượng phân tử của protease tôm sú được xác định bằng phương pháp

điện di Zymogram và Substrate-Gel Electrophoresis.

Giếng 1 2 3 4 5 6

Hình 3.13 Điện di đồ Zymogram của protease gan tụy tôm sú

(Độ pha loãng protease sau tinh sạch đưa vào giếng 1:5 lần, giếng 2: 25 lần, giếng

3: 50 lần, giếng 4: 100 lần, giếng 5: 500 lần)

Trong hình 3.13 và 3.14 lần lượt là điện di đồ zymogram của protease gan

tụy và đầu tôm sú. Thành phần gel phân tán của Zymogram được bổ sung thêm

casein với nồng độ 0,1%. Các protease được xử lý SDS nhưng không bị biến tính vì

không dùng tác nhân khử β-mecaptoethanol và không gia nhiệt chạy trong điện

trường về cực dương tạo thành các vạch protease màu sáng trên bản gel xanh sau

khi nhuộm màu và giải nhuộm. Phân tử lượng của các protease trong gan tụy và đầu

tôm được xác định dựa vào khoảng di chuyển tương đối Rf của vạch protease và đồ

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



77

thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển Rf của chúng

khi điện di trên gel polyacrylamide 12%.

Giếng 1 2 3 4 5 6

Hình 3.14 Điện di đồ Zymogram của protease đầu tôm sú

(Độ pha loãng protease sau tinh sạch đưa vào giếng 1:5 lần, giếng 2: 25 lần,

giếng 3: 50 lần, giếng 4: 100 lần, giếng 5: 500 lần, giếng 6: thang protein chuẩn)

Đường chuẩn xác định phân tử lượng các protease được xây dựng trên đồ thị

với trục hoành là khoảng di chuyển tương đối Rf của các protein chuẩn và trục tung

biểu diễn giá trị logarit tự nhiên của phân tử lượng protein tương ứng (hình 3.15).

Phương trình đường chuẩn như sau:

Y = -3,3661x + 12,036, với hệ số R2 = 0,973

Trong đó, Y là giá trị logarit tự nhiên trọng lượng phân tử của protease (Dalton)

x là khoảng di chuyển tương đối của vạch protein (Rf)

Dựa vào đường chuẩn này và hệ số Rf –khoảng di chuyển tương đối của các

vạch protein trên điện di đồ Zymogram ta suy ra được phân tử lượng của các

protease trong gan tụy và đầu tôm sú như trong bảng 3.3

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



78

Hình 3.15 Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng cách di

chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamide 12%

Bảng 3.3 Trọng lượng phân tử của protease gan tụy và đầu tôm

Penaeus monodon

Tên protease Trọng lượng phân tử (Dalton)

Protease gan tụy tôm Protease đầu tôm

A

B

C

D

E

F

G

20.200

22.000

25.000

35.300

40.200

-

-

20.200

22.000

25.000

35.300

40.200

49.200

76.000

Như vậy, trong gan tụy tôm sú có ít nhất năm protease khác nhau là A, B, C,

D, E, trong đó, ba enzyme chủ yếu là A, B, C với phân tử lượng không khác nhau

nhiều, dao động trong khoảng từ 20.200 đến 25.000 Da. Trong ba protease này, loại

B tỏ ra chiếm ưu thế hơn cả, sau đó là C và cuối cùng là A. Điều này có thể dễ dàng

nhận ra từ điện di đồ (hình 3.13), vì vạch B trên điện di đồ bao giờ cũng hiện ra rõ

ràng hơn so với A và C ở cùng nồng độ pha loãng. Riêng protease A hiện khá rõ khi

độ pha loãng từ 5 đến 50 lần, mờ dần khi con số này tăng lên thành 100 lần và hầu

y = -3,3893x + 12,051R² = 0,9703

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0ln

MRf

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



79

như không còn nhìn được nữa khi mẫu đưa vào giếng được pha loãng 500 lần. Hai

protease D và E với trọng lượng phân tử 35.300 và 40.200 Da có tồn tại trong hệ

enzyme protease đầu tôm nhưng hoạt tính thật sự không lớn, chúng chỉ thể hiện

những vệt rất mờ trên điện di đồ Zymogram khi lượng mẫu protease đưa vào giếng

lớn (độ pha loãng 5 lần), càng mờ hơn khi độ pha loãng này tăng lên thành 25 lần,

và hoàn toàn không nhìn thấy khi lượng mẫu đưa lên giếng được pha loãng thêm

nữa.

(a) (b)

Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Hình 3.16 Điện di đồ Zymogram so sánh hệ protease gan tụy (a) và đầu tôm sú (b)

(Độ pha loãng protease sau tinh sạch đưa vào giếng 1, 11:500 lần, giếng 2, 10: 100

lần, giếng 3, 9: 50 lần, giếng 4, 8: 25 lần, giếng 5, 7: 5 lần, giếng 6: thang protein

chuẩn)

Từ điện di đồ protease đầu tôm (hình 3.14) có thể nhận thấy trong đầu tôm

có ít nhất bảy loại protease A, B, C, D, E, F và G với phân tử lượng được liệt kê

trong bảng 3.3. Hình 3.16 cho ta dễ dàng so sánh hệ protease gan tụy và đầu tôm: cả

hai cùng có ba protease chủ yếu là A, B, C trong đó B có hoạt tính nổi trội hơn cả,

chúng cũng cùng có hai protease D và E với hoạt tính kém hơn nhiều so với ba loại

A, B, C. Sự khác nhau ở hệ protease đầu tôm so với gan tụy là đầu tôm có thêm hai

protease F và G, mặc dù hoạt tính của chúng thật sự rất thấp (thể hiện qua hình ảnh

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



80

mờ nhạt của vạch trên điện di đồ), thấp hơn cả D và E. Sự khác nhau giữa hệ

protease gan tụy và đầu tôm có lẽ do đầu tôm không chỉ có gan tụy chứa enzyme

này mà phần thịt trong đó cũng có protease mang hoạt tính. Tuy nhiên, ở cả hai

nguồn, loại protease thật sự đóng vai trò chủ chốt và đại diện là ba loại A, B và C.

(a) (b)

Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Hình 3.17 Điện di đồ Substrate-Gel so sánh hệ protease gan tụy (a)

và đầu tôm sú (b)

(Độ pha loãng protease sau tinh sạch đưa vào giếng 1, 11:5 lần, giếng 2, 10: 25

lần, giếng 3, 9: 50 lần, giếng 4, 8: 100 lần, giếng 5, 7: 500 lần, giếng 6: thang

protein chuẩn)

Nghiên cứu cũng thử phân tích protease gan tụy và đầu tôm bằng cách sử

dụng điện di Substrate-Gel theo phương pháp của García-Carreno và cộng sự

(1993). Điện di đồ Substrate-Gel thể hiện trên hình 3.17 cho thấy, lúc thoạt nhìn, ta

có cảm giác điện di đồ Substrate-Gel khá giống Zymogram, tuy nhiên, khi nhìn kỹ

sẽ nhận ra sự khác biệt: các vạch protease thể hiện kém rõ ràng trong trường hợp

mẫu đưa lên giếng ít pha loãng (từ 5 lần đến 50 lần), cũng rất khó để phân biệt được

số lượng vạch protein, và khi pha loãng thêm (100 hay 500 lần) thì sẽ chỉ thấy hai

vạch protease B và C rõ (căn cứ vào trọng lượng phân tử được xác định theo cách

tương tự đã làm đối với Zymogram ở trên). Vạch protease A rất mờ nhạt trên bản

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



81

điện di có thể do một trong hai nguyên nhân: hoạt tính (hoặc nồng độ) của A quá

thấp so với B, hoặc B có hoạt tính quá mạnh (hay nồng độ cao hơn hẳn A), do đó B

phân giải hoàn toàn lượng casein thấm vào gel ở vùng lân cận, vạch sáng do B tạo

ra quá lớn, đến mức A bị lẫn vào và không thể hiện đơn lẻ. Ta cũng thấy rằng, ở độ

pha loãng mẫu đưa vào giếng thấp (5 đến 25 lần), hai vạch D và E (ở cả protease

gan tụy và đầu) hiện ra trên Substrate-Gel rõ, nhưng chúng dường như bị “dính”

vào nhau, khi tăng độ pha loãng lên, chúng dường như “biến mất”. Hai vạch F và G

(ở protease đầu tôm) thì thật sự mờ đến mức khó nhìn ra nổi kể cả ở độ pha loãng

mẫu đưa lên giếng điện di thấp, chứng tỏ tỉ lệ lượng protease F và G có lẽ rất ít và

hoạt tính của chúng hoàn toàn không đáng kể so với A, B và C.

Như vậy, cả hai phương pháp điện di Zymogram và Substrate-Gel đều có thể

áp dụng để xác định trọng lượng phân tử và phác họa những nét cơ bản về thành

phần và hoạt tính tương đối của các protease trong gan tụy và đầu tôm, tuy nhiên,

hình ảnh vạch protease trên bản gel Zymogram rõ ràng hơn nhiều so với Substrate-

Gel. Có lẽ việc “nhốt” casein trực tiếp vào gel polyacrylamid của điện di

Zymogram đã thể hiện tác dụng cố định mạng casein cung cấp cho mỗi vạch

protease, vì vậy mật độ casein bị phân giải ở vùng lân cận nó trên bản gel tương đối

đồng đều, do vậy, vạch sáng hiện lên rõ ràng. Đối với trường hợp Substrate-Gel,

casein được cung cấp đồng đều và liên tục cho mọi điểm trên bản gel sau khi các

vạch protease đã cố định trên đó, protease ở vạch nào có hoạt tính lớn sẽ phân giải

nhiều casein hơn, do đó vạch sau khi nhuộm và giải nhuộm trắng hơn, dễ loang lẫn

vào nhau hơn. Với giải thích như vậy, Zymogram tỏ ra hiệu quả hơn trong nhận

diện các protease có mặt, nhưng Substrate-Gel lại cho đánh giá về hoạt tính tương

đối của từng protease rõ ràng hơn. Điều này cũng gợi mở một khía cạnh khác cần

lưu ý khi nghiên cứu enzyme bằng điện di có cơ chất: Để khai thác được tối đa hiệu

quả của phương pháp này và thu nhận bức tranh đầy đủ nhất, chúng ta không những

chỉ cần thực nghiệm với nhiều nồng độ enzyme đưa vào giếng khác nhau mà nồng

độ cơ chất sử dụng và phương cách cho phản ứng phân giải cơ chất tiến hành cũng

cần thử nghiệm một cách có cân nhắc.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



82

Các tính toán và phân tích ở trên giúp rút ra kết luận: hệ protease ở gan tụy

và đầu tôm sú được nghiên cứu đều bao gồm ba protease chủ yếu A, B, C với phân

tử lượng lần lượt là 20.200, 22.000, 25.000 Da và hai protease ít hoạt tính hơn là

D, E (phân tử lượng theo thứ tự là 35.300, 40.200 Da). Riêng đầu tôm còn có thêm

hai protease nữa với hoạt tính rất bé là F và G (với trọng lượng phân tử 49.200 và

76.000 Da).

Nếu so sánh hệ protease trong gan tụy tôm sú Việt nam với hệ protease trong

bộ phận tiêu hóa ở tôm sú Đài loan (Jiang, 1991) [92] ta sẽ thấy một số khác biệt:

Protease trong gan tụy tôm Việt nam có năm loại so với bốn ở tôm Đài loan. Tuy

nhiên điểm đáng chú ý là ở cả hai loại tôm đều có ba protease chủ yếu với trọng

lượng phân tử tương đối thấp và gần nhau, mặc dù protease trong tôm Việt nam

đang được nghiên cứu có phân tử lượng hơi cao hơn một chút (20.200, 22.000,

25.000 Da) so với 18.500, 20.900 và 23.300 Da (bao gồm hai trypsin và một

chymotrypsin). Điều này khá tương đồng với kết luận được rút ra khi nghiên cứu về

protease trên bốn loài tôm P. vannamei, P. monodon, P. stylirostris và P.

californiensis của Albuquerque-Cavalcanti (2002) [36], các protease chính (được

xác định là trypsin) có trọng lượng phân tử trong khoảng 17.000-22.000 Da. Nghiên

cứu trên cá chỉ vàng Pricanthus macracanthus đánh bắt ở Thái lan (Pham, 2006)

cũng xác định loại trypsin trong ruột cá này có phân tử lượng 23.800 Da [130],

Simpson (1984) thì lại chỉ ra phân tử lượng của trypsin ở cá tuyết Atlantic, cá tuyết

Greenland lần lượt là 24.000 và 23.500 Da [148,149].

Trên cơ sở xem xét trọng lượng phân tử của protease đã xác định được từ

thực nghiệm, so sánh với các dữ liệu từ các tài liệu tham khảo, và kết luận mang

tính thống kê của nhiều tác giả về hệ protease trong động vật giáp xác thường có

thành phần chính là trypsin và chymotrypsin, trong đó trypsin chiếm hơn 50% hoạt

tính, ta suy ra rằng, có nhiều khả năng là các protease tồn tại trong gan tụy tôm sú

Việt nam cũng thuộc về nhóm tựa trypsin và chymotrypsin. Tuy nhiên, khi thử hoạt

tính collagenase của protease tôm sú Việt nam, kết quả cho thấy protease này có thể

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



83

phân giải cơ chất collagen, mặc dù không mạnh. Nghiên cứu trên collagenase

(chính xác hơn là serine collagenolytic protease) trong tuyến tiêu hóa của cua

Carcinus maenas cho biết có một loại collagenase với phân tử lượng 23.000 Da,

hoạt động tốt nhất ở pH trung tính 7-8, có nhiệt độ tối ưu là 30oC (Roy, 1996).

Collagenase từ cua Chionoecetes và tôm Panaeus vannamei thì lại có phân tử lượng

25.000 Da (Roy, 1996) [135]. Garcia-Careno và cộng sự khi nghiên cứu trên tôm

đất cũng cho biết hệ protease của đối tượng này có collagenase thuộc nhóm serin

[75]. Như vậy, thành phần của protease trong tôm sú Việt nam còn chưa rõ ràng và

cần phải được xem xét cụ thể hơn nữa trong các thí nghiệm kế tiếp.

3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease sau tinh sạch

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease sau tinh sạch được biểu diễn

trên đồ thị trong hình 3.18. Điểm dễ thấy nhất từ đồ thị là biến đổi hoạt tính theo

nhiệt độ của protease thu được từ gan tụy và đầu tôm sú rất giống nhau. Kết quả

kiểm định t- test cũng cho biết không có sự khác biệt ở độ tin cậy 95%.

Cả hai loại protease gan tụy và đầu tôm sú đều thể hiện hoạt tính tốt ở vùng

nhiệt độ cao 47-67oC, đạt giá trị tối đa ở 62oC. Chúng hoạt động rất yếu trong

khoảng nhiệt độ thấp, hầu như không hoạt động tại khoảng gần 0oC và trên đó, tăng

rất ít ở nhiệt độ dần đạt tới 12oC (protease từ gan tụy và đầu tôm lần lượt thể hiện

2,71 và 1,43% hoạt tính so với cực đại), ngay cả khi tăng lên thành 27oC thì cả hai

loại protease này cũng chỉ đạt được chưa tới 17% hoạt tính (16,39% đối với gan tụy

và 14,77% đối với đầu tôm). Hoạt độ protease sau đó tăng đều và mạnh hơn, đạt giá

trị cực đại tại 62oC, duy trì hoạt độ tốt (hơn 80% so với cực đại) khi tăng nhiệt độ

lên tới 67oC. Việc tiếp tục tăng nhiệt độ lên cao nữa có tác dụng làm giảm hoạt tính

của protease nhanh. Ở 77oC, protease gan tụy và đầu tôm theo thứ tự chỉ còn 27,27

và 34,80% hoạt tính, hạ tiếp xuống còn 10,74 và 16,67% ở 82oC và gần như bị vô

hoạt tại 87oC.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



84

Nhiệt độ tối thích của protease (tại đó vận tốc phản ứng đạt cực đại) từ gan

tụy và đầu tôm sú là 62oC, thấp hơn so với protease từ nội tạng tôm P. orientalis

[124] là 70oC và cao hơn so với tôm P. kerathurus và P. japonicus là 50oC [73]. So

với tôm sú P. monodon của Đài loan với nhiệt độ tối thích là 55 và 65oC (Jiang

1991) [92], tôm sú Việt Nam chỉ thể hiện hoạt độ tối đa ở một nhiệt độ là 62oC. Kết

quả này cũng có sự tương đồng với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Lệ công bố

năm 1996, protease trong đầu tôm Bộp và tôm Rảo có nhiệt độ thích hợp nhất ở 55o

và 60oC [21]. Protease trong tôm sú nuôi cũng có nhiệt độ tối thích cao hơn so với

của protease thịt tôm là 50oC theo công bố của Nguyễn Việt Dũng [17], điều này

cho thấy hệ protease trong gan tụy và thịt tôm không giống nhau. Protease gan tụy

cá thu, cá ngừ và gan mực ống đánh bắt ở biển Việt nam cũng có nhiệt độ tối thích

là 55oC [25].

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ tương đối của protease

gan tụy và đầu tôm

Trong khoảng nhiệt độ 47-67oC, protease gan tụy và đầu tôm hoạt động rất

tốt, đạt trên 60%. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chúng đều ưa nhiệt độ ấm, nhiệt

độ thích hợp cho protease tôm hoạt động khá cao và cao hơn nhiều so với nhiệt độ

môi trường sống của chúng. Ở ngoài khoảng nhiệt độ này, hoạt tính protease giảm

nhanh và hầu như bị vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ thấp hơn 17oC và cao hơn 82oC.

Điều này giải thích tác dụng bảo quản của nhiệt độ thấp cho tôm đã chết: nhiệt độ

0

20

40

60

80

100

120

2 7 12 17 22 27 32 37 42 47 52 57 62 67 72 77 82 87 92

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

Nhiệt độ (oC)


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



85

thấp vừa có tác dụng kìm hãm vi sinh vật phát triển vừa làm giảm hoạt độ của

enzyme trong tôm và nhờ đó thời gian bảo quản sẽ kéo dài. Hoạt tính enzyme được

cải thiện đáng kể nếu môi trường phản ứng mà nó xúc tác có nhiệt độ trong khoảng

52-67oC, đây là điều có thể đạt được bằng cách phơi nắng nên có thể lợi dụng khi

dùng enzym này trong các ứng dụng cho sản xuất về sau. Ở khoảng nhiệt độ 52-

67oC, rất nhiều protein có thể bị biến tính, sự biến tính của một số protein trong vi

sinh vật sẽ là thuận lợi lớn cho quá trình thủy phân bằng protease thu nhận được từ

nghiên cứu vì sẽ giảm được đáng kể phản ứng phân hủy gây thối.

Từ đồ thị trên hình 3.18 dễ thấy một điều là mặc dù protease từ đầu và gan

tụy tôm có cùng nhiệt độ tối thích nhưng protease từ đầu tôm trong hầu hết trường

hợp đều hoạt động không tốt bằng protease từ gan tụy ở cùng nhiệt độ môi trường

phản ứng, điều này có thể là do đầu tôm không chỉ chứa gan tụy mà có cả phần thịt

cũng chứa enzyme. Hai vạch protease F và G dù rất mờ nhạt trên điện di đồ

protease đầu tôm (hình 3.14) hoàn toàn có thể là nguyên nhân làm nên sự khác biệt

đó. Tuy nhiên, vì protease F và G thể hiện hoạt động ít đáng kể trong toàn bộ hoạt

độ của hệ protease đầu tôm nên dù không hoàn toàn giống nhau nhưng hai đường

biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm trong hình

3.18 khá tương đồng.

Như vậy, thành phần protease trong gan tụy và đầu tôm có sự khác biệt, tuy

nhiên vì gan tụy chiếm phần lớn trong đầu tôm và enzyme tập trung chủ yếu ở đây

nên sự khác nhau về thành phần giữa chúng chỉ ở mức độ rất nhỏ, do đó, sự khác

nhau trong hoạt động của protease từ các nguồn trên khi nhiệt độ thay đổi có thể

ghi nhận được nhưng không thật sự rõ ràng. Protease trong gan tụy và đầu tôm

hoạt động tốt trong khoảng 52-67oC với nhiệt độ tối ưu là 62oC.

3.2.3. Độ bền nhiệt của protease sau tinh sạch

Trong hình 3.19 là đồ thị thể hiện độ bền nhiệt của protease từ gan tụy và

đầu tôm sú ở các nhiệt độ khác nhau. Protease được ủ ở các nhiệt độ cần khảo sát

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



86

trong thời gian 30 phút, sau đó đưa nhanh về 37oC rồi đo hoạt độ còn lại bằng

phương pháp Amano với cơ chất casein. Điểm chung nhất có thể thấy được từ đồ

thị là kiểu biến đổi độ bền nhiệt của protease ở cả gan tụy và đầu tôm rất giống nhau

(không khác biệt với độ tin cậy 95% từ kết quả t-test). Chúng đều tỏ ra bền với

nhiệt độ trong khoảng 37-52oC, sau 30 phút ủ, hoạt tính của chúng giảm không

đáng kể, thậm chí ở 52oC, protease từ cả hai nguồn đều còn hơn 90% hoạt độ, chỉ từ

nhiệt độ 57oC trở đi, con số này mới giảm nhanh. Sau 30 phút ủ ở 67oC, protease từ

cả hai nguồn còn chưa tới 50% hoạt tính và ở nhiệt độ 77oC, chúng nhanh chóng bị

vô hoạt gần như hoàn toàn (protease gan tụy và đầu tôm chỉ còn lần lượt 2,36 và

5,46% hoạt tính).

Hình 3.19 Độ bền nhiệt của protease gan tụy và đầu tôm

ở các nhiệt độ khác nhau

Khi so sánh độ bền nhiệt của protease tôm sú Việt nam với cùng loài tôm

này nuôi ở Đài loan, có thể thấy sự khác biệt khá rõ ràng: tôm Đài loan kém bền

nhiệt hơn hẳn. Ba trong bốn loại protease thành phần (được xác định là trypsin) đều

giảm hoạt tính khoảng một nửa chỉ sau 5 phút ủ ở nhiệt độ 50oC, duy nhất trường

hợp protease chymotrypsin giữ hoạt tính gần như không thay đổi sau 5 phút ủ ở

khoảng 35-55oC, thậm chí protease này còn duy trì được gần 80% hoạt tính với

cùng thời gian ủ ở 65oC (Jiang, 1991) [92]. Tuy nhiên, sự so sánh này chỉ mang tính

0

20

40

60

80

100

120

37 42 47 52 57 62 67 72 77 82

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

Nhiệt độ (oC)


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



87

tương đối vì cơ chất sử dụng khi xác định hoạt tính protease trong hai nghiên cứu

khác nhau, ở trường hợp tôm Đài loan cơ chất sử dụng là p-toluenesulfonyl-L-

arginine methyl ester TAME (đối với trypsin) và Benzoyl-L-arginine ethyl ester

BAEE (đối với chymotrypsin), trường hợp tôm Việt nam đang được nghiên cứu lại

sử dụng cơ chất casein.

Nghiên cứu trên protease gan tụy tôm Penaeus orientalis của Oh và cộng sự

[124] về độ bền nhiệt có khá nhiều điểm tương đồng với tôm sú Penaeus monodon

đang thực hiện (mặc dù tôm sú tỏ ra bền nhiệt hơn một chút). Với cùng thời gian ủ

30 phút ở nhiệt độ quan tâm sau đó xác định hoạt tính còn lại bằng cơ chất casein,

protease gan tụy tôm Penaeus orientalis cũng hầu như không giảm hoạt tính trong

khoảng 40-50oC, hoạt động rất tốt ở 55oC (còn hơn 80% hoạt tính) và chỉ giảm

mạnh khi tăng nhiệt độ lên hơn 60oC và gần như mất hoạt tính ở 70oC.

Nghiên cứu của Đỗ Văn Ninh (2004) trên protease gan tụy cá thu, cá ngừ và

gan mực ống sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel cho kết quả hoạt độ còn lại sau khi ủ

30 phút ở nhiệt độ 60oC khoảng 50% [25], cao hơn không nhiều so với protease

trong đầu tôm bộp và tôm rảo [21]. So với hai nghiên cứu trên, protease tôm sú tỏ ra

bền nhiệt hơn khi ở 62oC vẫn còn gần 70% hoạt tính. Tuy nhiên, có vẻ như môi

trường sống đã ảnh hưởng lớn đến đặc điểm sinh lý và sinh hoá của các quần thể

sống trong đó, các loài thuỷ sản nuôi trồng và đánh bắt ở vùng biển nước ta có cùng

chung đặc điểm nhiệt độ môi trường sống là vùng nước ấm nên ảnh hưởng của nhiệt

độ đến hoạt động của hệ enzyme cũng khá tương đồng: nhiệt độ tối thích và khoảng

nhiệt độ thích hợp cho các enzyme này hoạt động thường khá giống nhau, dao động

trong khoảng 55-65oC (như đã phân tích ở phần trên), độ bền nhiệt của chúng dù có

khác biệt nhưng chung một đặc điểm là bền hơn hẳn so với các protease của sinh

vật sinh trưởng nơi nước lạnh.

Theo Garcia-Carreno và Haard (1992), Kim và cộng sự (1992), trong các

loại giáp xác và động vật thân mềm thường khá phổ biến các protease serin như

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



88

trypsin, chymotrypsin, collagenase, trong đó collagenase ít phổ biến hơn so với hai

loại trypsin và chymotrypsin [75], [96]. Các protease serin có hoạt tính collagenase

thường rất kém bền với nhiệt [155], ngay cả nhiệt độ 40oC cũng có thể làm chúng

vô hoạt, vì vậy, ứng dụng của chúng vào thực tế rất hạn chế. Protease gan tụy và

đầu tôm sú Việt nam cũng có hoạt tính collagenase (nghiên cứu đã thử hoạt tính

trên cơ chất collagen) nhưng khá yếu, như vậy, collagenase trong tôm sú góp phần

rất nhỏ đến hoạt độ chung của hệ protease, vì vậy, độ bền nhiệt của protease tôm sú

có thể coi là rất tốt và có tiềm năng cho ứng dụng thủy phân protein ở nhiệt độ cao.

Như vậy, protease gan tụy và đầu tôm sú có độ bền nhiệt rất tốt so với các

loại thủy sản khác đã được nghiên cứu. Chúng giữ hoạt tính tốt ở khoảng nhiệt độ

khá cao 37-57oC, thậm chí 62oC. Đây thật sự là lợi thế đáng kể khi áp dụng vào

thủy phân protein và chế biến thực phẩm nói chung để điều khiển phản ứng thuận

lợi, bởi vì hầu hết các vi sinh vật gây thối không phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ

37-57oC, thậm chí 62oC.

3.2.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm

Đồ thị trong hình 3.20 thể hiện mối quan hệ giữa độ pH và khả năng hoạt

động của protease gan tụy và đầu tôm sú. Kết quả nghiên cứu cho thấy protease từ

gan tụy và đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng axit pH từ 1 đến 5, tăng

nhanh ở pH 6 trở lên, đạt cực đại tại pH 7,5 rồi giảm nhanh khi pH tăng trong vùng

kiềm, điều này phù hợp với đặc điểm hệ enzyme của tôm là không có pepsin hoạt

động trong môi trường axit [79].

Nếu so với nghiên cứu của Oh và cộng sự (2000) về tính chất của protease từ

gan tụy tôm Penaeus orientalis hoạt động tốt trong môi trường pH 6-9 [123] thì

protease gan tụy tôm sú Penaeus monodon có điểm tương đồng là chúng cũng hoạt

động tốt ở vùng trung tính đến kiềm nhẹ pH 6-9 (hoạt độ tương đối đạt được từ

khoảng 50% trở lên). Tuy nhiên, protease tôm sú nhạy cảm với pH hơn nhiều, ở pH

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



89

7,5 chúng hoạt động tốt nhất nhưng hoạt tính này giảm nhanh khi giá trị pH thay đổi

từ trị số tối ưu về cả hai phía kiềm và acid.

Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease thu nhận từ gan tụy và đầu

tôm sú

Kết quả của nghiên cứu này có sự khác biệt so với công trình của tác giả

Phạm Thị Trân Châu cùng cộng sự: pH tối ưu CPE protease từ đầu tôm biển là pH

8,5 [12]. Nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về protease cơ thịt tôm sú cho thấy

enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 6,6 [17] hơi thấp hơn so với pH tối ưu của

protease từ gan tụy và đầu tôm.

Có một điểm cần nhấn mạnh là, cả hai protease gan tụy và đầu tôm đều tỏ ra

rất nhạy cảm với pH trong môi trường gần trung tính đến kiềm pH 6-9, việc tăng

hoặc giảm nhẹ pH từ giá trị tối ưu có tác dụng làm hoạt tính protease giảm đáng kể.

Điều này sẽ là lưu ý cần ghi nhớ khi ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy phân

protein để tạo ra điều kiện thuận lợi nhất và đạt kết quả mong muốn nhất. Sự giảm

hoạt tính mạnh của các protease ở môi trường pH thấp hoặc cao có thể xảy ra do

biến đổi không thuận nghịch của chúng như đã được ghi nhận ở loài tôm sông

Procambarus clarkia [96]. Độ hoạt động khác nhau của protease thu từ gan tụy và

đầu tôm ở các pH ngoài gía trị tối ưu 7,5 như thể hiện trên hình 3.20 thật sự không

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

pH

Gan tụy

Đầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



90

quá rõ rệt trong khoảng pH gần trung tính tới kiềm nhẹ 6-9, và khá rõ rệt ở các vùng

xung quanh có thể là do sự khác biệt trong thành phần protease đầu tôm có lẫn cả

các enzyme tồn tại trong phần thịt đầu. Điều này phù hợp với nghiên cứu của

Nguyễn Việt Dũng trên đối tượng cơ thịt tôm sú, protease hoạt động rất tốt ở pH

6,6-7 và giảm mạnh hoạt tính khi pH biến đổi về cả hai phía acid và kiềm [17].

Nếu so sánh protease của tôm sú với các protease tách chiết từ nội tạng cá

thu, cá ngừ đánh bắt ở biển Việt nam sẽ thấy sự khác biệt lớn. Hệ protease trong

tôm chỉ gồm các protease nhóm trung tính và kiềm, còn ở cá gồm cả nhóm acid,

kiềm và trung tính, trong đó nhóm protease acid hoạt động mạnh hơn cả, sau đó tới

nhóm kiềm và cuối cùng là nhóm trung tính [25]. Đồ thị liên hệ giữa pH và hoạt độ

protease của gan tụy và đầu tôm sú chỉ có một đỉnh duy nhất ở pH 7,5, vì vậy, có

nhiều khả năng là hệ protease trong tôm đơn giản hơn trong cá và các loại protease

trong tôm có tính chất khá tương đồng. Điều này càng tỏ ra có cơ sở hơn nếu ta nhớ

lại hình sắc ký đồ lọc gel protease tôm sú (hình 3.9 đến 3.12) chỉ có một đỉnh hoạt

độ chủ yếu duy nhất (thể hiện enzyme ở đó có nhiều khả năng có trọng lượng phân

tử gần nhau), trong khi sắc ký đồ protease nội tạng cá thu, cá ngừ do Đỗ Văn Ninh

nghiên cứu [25] có rất nhiều đỉnh khác nhau chứng tỏ có thể có nhiều protease khác

nhau về trọng lượng phân tử.

3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ protease sau tinh sạch

Kết quả xác định hoạt tính protease gan tụy và đầu tôm ở các nồng độ NaCl

khác nhau được trình bày trong đồ thị ở hình 3.21

Kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ NaCl ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

tính protease của tôm. Nồng độ muối 0-1% cho kết quả hoạt tính protease tôm đạt

cực đại. Hoạt tính này giảm khá đều khi nồng độ muối tiếp tục tăng lên. Điều này

có thể lý giải là do NaCl phân ly thành Na+ và Cl - , ở nồng độ muối thấp lớp vỏ

hydrate của phân tử protein chưa bị biến đổi, chưa gây biến tính protein. Mặc khác,

các ion này cũng liên kết với các phần mang điện trong phân tử enzyme, làm tăng

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



91

điện tích của các trung tâm hoạt động này. Kết quả những biến đổi trên làm tăng

cường sự tương tác giữa phân tử enzyme và phân tử protein, làm thay đổi chiều

hướng và sự phân bố electron trong phân tử protein, điểm tương tác tại các liên kết

trong phân tử protein dễ bị cắt đứt hơn trước. Ở nồng độ muối tăng lên cao hơn thì

hoạt tính protease giảm do NaCl có tính phân ly mạnh nên ở nồng độ cao, các ion

đã liên kết mạnh với các phân tử nước, tạo áp suất thẩm thấu lớn, kéo các phân tử

nước khỏi liên kết với phân tử protein, làm cấu trúc không gian bậc cao của phân tử

mất đi, phân tử protein-enzyme dễ bị biến tính, kết tủa, làm hoạt tính enzym giảm

còn protein của cơ chất thì cũng mất nước và khó bị thủy phân.

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ của protease từ gan tụy và

đầu tôm

Lý giải cho sự biến đổi hoạt độ theo nồng độ muối NaCl rất tương đồng của

protease từ gan tụy và đầu tôm (không có sự khác biệt với độ tin cậy 95%) tương tự

như đã trình bày ở phần trước, sự có mặt của hai protease G và F trong đầu tôm khá

mờ nhạt, protease thật sự đóng vai trò chính cho hoạt động của protease gan tụy và

đầu tôm sú là nhóm bao gồm các protease A, B và C đã nhận diện được từ phương

pháp điện di cơ chất.

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

Nồng độ NaCl (%)

Gan tụy

Đầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



92

So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính

protease có nguồn gốc thực vật như bromelin, papain thì protease của gan tụy và

đầu tôm chịu muối tốt hơn nhiều. Các enzyme này thậm chí còn giữ được hoạt tính

tốt hơn so với protease từ nội tạng cá thu, cá ngừ và gan mực ống. Kết quả nghiên

cứu của Đỗ Văn Ninh trên protease nội tạng cá và gan mực cho thấy, các protease

này có thể duy trì hoạt động ở mức 50-60% so với cực đại tại nồng độ muối 6-7%

[25], tuy nhiên các protease từ gan tụy tôm sú còn tỏ ra ưu việt hơn vì giữ được

cùng mức 50 – 60% khi nồng độ muối trong môi trường là 13%. Hoạt độ tốt của

protease gan tụy và đầu tôm giúp giải thích hiện tượng “chín” của mắm tôm ở nồng

độ muối cao nhanh hơn so với mắm cá sản xuất theo phương pháp cổ truyền.

3.2.6 Ảnh hưởng của một số kim loại và chất ức chế đến hoạt độ protease tôm

sú sau tinh sạch

3.2.6.1 Ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt độ protease tôm sú

Một số nghiên cứu của tác giả trong và ngoài nước cho thấy, muối kim loại

có thể ảnh hưởng đến hoạt độ protease. Một carboxypeptidase trong môn vị cá thu

Scomber japonicas tăng hoạt tính năm lần khi có mặt coban với nồng độ 1mM,

carboxypeptidase của một loài cá nhỏ Nam cực Euphausia superb và cá Chanos

channos cũng tăng hoạt tính lên lần lượt 3,5 và 2,2 lần khi thêm coban vào phản

ứng (Jiang,1991) [92]. Nghiên cứu đã thử xem xét ảnh hưởng của một số kim loại

thường có vai trò quan trọng tới hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm sú, kết quả thể

hiện ở hình 3.22

Các ion kim loại Mo2+, Pb2+, Mg2+, Ba2+, Co2+ hầu như không gây ảnh hưởng

đáng kể đến hoạt độ protease. Điều này cho phép suy luận chúng không hề liên kết

với các protease trong tôm. Hg2+ thì lại có tác dụng ức chế protease đáng kể, hoạt

độ còn lại lần lượt là 53,66 và 50,46% ở gan tụy và đầu tôm. Tác dụng ức chế của

Zn2+ cũng khá rõ ràng, tuy nhiên hoạt độ còn lại lớn hơn trường hợp của Hg2+, các

con số này theo thứ tự là 70,74 và 73,08%. Klee (1998) thông báo rằng, hai kim loại

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



93

Hg2+ và Zn2+ có thể tạo ra liên kết với nhóm –SH của enzyme và do đó làm giảm

hoạt tính protease [92]. Như vậy, rất có thể, tác dụng ức chế của Hg2+ và Zn2+ đối

với protease đầu tôm là do chúng liên kết với một trung tâm hoạt động không đặc

hiệu của enzyme này. Báo cáo về tác dụng ức chế của hai kim loại Hg2+ và Zn2+

cũng được ghi nhận trên một enzyme tựa trypsin và tựa chymotrypsin ở tôm sú Đài

loan (Jiang, 1991) [92]. Roy và cộng sự cũng cho biết hiện tượng tương tự quan sát

được đối với collagenase thuộc nhóm protease serin trên đối tượng cua Carcinus

maenas [135]. Tất cả những điều này cho phép suy luận, liên kết sulfit đóng vai trò

quan trọng tạo nên cấu trúc đặc trưng để protease thể hiện được đầy đủ chức năng

của mình.

Hình 3.22 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ protease tôm sú

Kết quả thực nghiệm cũng cho thấy, các kim loại Cu2+, Mn2+ và Fe2+ có tác

dụng hoạt hóa protease tôm sú, trong đó đáng kể nhất là Mn2+, hoạt độ protease tăng

lên 169,6 và 189,8% theo thứ tự đối với gan tụy và đầu tôm, kế tiếp là Cu2+ với các

số liệu lần lượt là 180,9 và 120,2%. Fe2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt độ protease

nhưng không đáng kể bằng hai trường hợp Cu2+ và Mn2+ (số liệu thực nghiệm là

106,9 và 130,1%).

020406080

100120140160180200

ĐC Mo2+ Pb2+ Zn2+ Mg2+ Ba2+ Co2+ Ca2+ Cu2+ Mn2+ Fe2+ Hg2+

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

Kim loại thêm vào phản ứng

Gan tụy

Đầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



94

Một quan sát đáng chú ý từ thực nghiệm là Ca2+ hầu như không ảnh hưởng

đến hoạt độ protease gan tụy tôm sú nhưng tác dụng của nó đối với protease gan tụy

và đầu tôm có hơi khác nhau, mặc dù chỉ là rất nhỏ, Ca2+ làm giảm nhẹ hoạt độ

protease gan tụy (90,20%) và tăng nhẹ hoạt độ protease đầu tôm (113,61%). Ta biết

rằng, collagenase được phân chia thành hai loại, mỗi loại có vai trò sinh lý khác

nhau, gồm có metallo-collagenase và collagenase thuộc nhóm protease serin.

Metallo-collagenase là enzyme trong cấu trúc có chứa Zn2+ và đòi hỏi Ca2+ để ổn

định, bền vững. Đây là loại enzyme ngoại bào và có nhiệm vụ tái cấu trúc mạng

lưới tế bào mô cơ, có phân tử lượng lớn từ 30.000-150.000 Da. Các collagenase

thuộc nhóm protease serin (được tìm thấy trong gan tụy một số loại giáp xác như

tôm, cua, cá da trơn…) lại không liên quan nhiều đến hình thái học mà chịu trách

nhiệm chính trong việc tiêu hóa thức ăn. Phân tử lượng của chúng thường nằm

trong khoảng 24.000-36.000 Da (Roy, 1996) [135]. Các enzyme này đóng vai trò

xúc tác tương tự các trypsin, chymotrypsin và elastase ở động vật có vú, chúng có

khả năng thủy phân nhiều cơ chất, không chỉ loại đặc trưng của collagenase (Roy,

1996). Như vậy, việc ion Ca2+ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt độ protease gan

tụy tôm sú nhưng lại có tác dụng tăng cường hoạt tính protease đầu tôm có thể do

sự khác biệt về thành phần của gan tụy và đầu tôm. Trong đầu tôm sú có lẽ có

collagenase thuộc nhóm metalloprotease vì đầu tôm có một phần thịt tôm, và rất có

thể đây chính là hai (hoặc một trong hai) protease F và G, hai vạch mờ trên điện di

cơ chất đã thực hiện ở phần trước. Tuy nhiên tác dụng tăng nhẹ hoạt tính do Ca 2+

tạo nên thật sự ít đáng kể, và ta vẫn phải lặp lại một điều khẳng định là hệ enzyme

trong gan tụy và đầu tôm sú tỏ ra rất ít khác nhau.

3.2.6.2 Ảnh hưởng của một số chất ức chế đến hoạt độ protease tôm sú

Để tìm hiểu cụ thể hơn về các enzyme có mặt trong hệ protease gan tụy và

đầu tôm, nghiên cứu đã thử hoạt tính protease khi có mặt các chất ức chế đặc hiệu,

kết quả được trình bày trong bảng 3.4

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



95

Bảng 3.4 Hoạt tính còn lại (%) của protease gan tụy và đầu tôm sú

khi có mặt một số chất ức chế đặc hiệu

Hợp chất thêm vào

phản ứng

Nồng độ

chất thêm vào

Hoạt độ còn lại (%)

Gan tụy Đầu tôm

Đối chứng

PMSF

SBTI

TLCK

TPCK

EDTA

1,10-phenanthroline

Iodoacetate

-

0,1mM

10mg/ml

0,1mM

0,1mM

1 mM

1 mM

1 mM

100

15

32

39

81

98

98

97

100

13

33

35

85

96

97

96

Hình 3.23 Ảnh hưởng của một số chất kìm hãm đến hoạt độ của protese tôm sú

Điều dễ nhận thấy đầu tiên là hoạt độ còn lại khi thêm các chất ức chế đặc

hiệu vào phản ứng xác định hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm sú rất giống nhau.

Sự khác biệt không đáng kể này thật sự đã có thể dự đoán trước từ những phân tích

kết quả điện di trên hệ protease tôm sú và tính chất của chúng được trình bày ở phần

0

20

40

60

80

100

120

Hoạ

t độ

tươ

ng đ

ối (%

)

Chất thêm vào phản ứng

Gan tụy

Đầu tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



96

trên. Ta biết rằng hệ protease này bao gồm ít nhất năm protease, với ba protease chủ

yếu A, B, C có phân tử lượng rất gần nhau. Tuy nhiên, sự mờ nhạt của các vạch

protease E, F, G và H so với A, B, C cho phép suy luận có lẽ chỉ A, B, C đóng vai

trò chủ chốt trong hoạt động của hệ protease gan tụy và đầu tôm. Điều này càng

được khẳng định hơn khi xem xét các tính chất của nó: protease tôm sú chỉ có một

nhiệt độ tối thích, một pH tối thích, và thể hiện hoạt độ tốt nhất ở một giá trị nồng

độ muối duy nhất.

Hoạt tính protease tôm sú bị giảm mạnh (chỉ còn 13-15%) khi có mặt PMSF,

chất ức chế đặc hiệu của nhóm protease serin, là bằng chứng cho biết protease tôm

sú là thành viên của nhóm này. Đây là điều được khẳng định lại qua kết quả xác

định hoạt độ khi thêm SBTI vào phản ứng, hoạt độ còn lại lần lượt là 32 và 33% đối

với gan tụy và đầu tôm. SBTI là chất ức chế các protease serin, nó kìm hãm trypsin,

ít nhạy hơn một chút với chymotrypsin. Khi có mặt TLCK (chất ức chế trypsin),

hoạt độ protease còn lại chỉ đạt con số 39 và 35% ở gan tụy và đầu tôm, như vậy,

các protease chủ yếu trong tôm sú thuộc về loại enzyme tựa trypsin. Ngoài ra, trong

tôm sú còn các enzyme tựa chymotrypsin vì TPCK có tác dụng giảm nhẹ hoạt tính

protease, hoạt tính còn lại khoảng 80%. EDTA (chất kìm hãm các metalloprotease),

1, 10-phenanthroline (đặc hiệu cao đối với kẽm trong trung tâm hoạt động của

metalloprotease) và iodoacetic acid hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính

protease, cho thấy rằng, trong gan tụy và đầu tôm sú có lẽ không có metalloprotease

(như collagenase chẳng hạn) hoặc tồn tại nhưng với hoạt tính rất thấp.

Như vậy, hệ protease đầu và gan tụy tôm sú thuộc nhóm protease serin,

trong đó thành phần chủ yếu quyết định hoạt tính là enzyme tựa trypsin, kế đó là

enzyme tựa chymotrypsin. Gan tụy và đầu tôm không chứa các metalloprotease

hoặc có chứa nhưng hoạt độ vô cùng bé.

Điều khẳng định ở trên xác nhận lại một số điều đã được các nhà khoa học

ghi nhận. Các nghiên cứu thực hiện rải rác ở khắp thế giới trên 50 loài giáp xác

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



97

cung cấp thông tin thú vị là hệ tiêu hóa của các động vật này có hoạt tính proteolytic

vô cùng cao (Tsai I.H., 1991) [162], có thể là do tập quán tiêu thụ thức ăn giàu

protein (thức ăn nuôi tôm công nghiệp thường chứa 40-50% chất đạm), trong đó,

loại protease chính là trypsin và chymotrypsin, với hoạt tính của trypsin chiếm hơn

nửa tổng hoạt tính protease (Ezquerra, 1997) [68].

3.2.7. Động học của protease gan tụy tôm sau tinh sạch

Từ những kết quả thu được trên điện di Zymogram và Substrate-Gel, ta biết

rằng, gan tụy và đầu tôm cùng có thành phần là năm protease A, B, C, D, E, trong

đó A, B, C chiếm vai trò quyết định, protease F và G chỉ có trong đầu tôm, không

tìm thấy trong gan tụy. Tuy nhiên, những kết quả về tính chất rất tương đồng của

protease gan tụy và đầu tôm trình bày ngay trên đây cho thấy, protease từ hai nguồn

này thật sự rất giống nhau, và có thể suy ra, sự có mặt của F và G có lẽ không đóng

vai trò nào quan trọng, ảnh hưởng đáng kể đến tính chất chung của các protease

này. Những vạch mờ nhạt F và G trên điện di đồ cũng thể hiện mức độ ít quan trọng

của chúng. Vì vậy, trong phần nghiên cứu động học của enzyme protease tôm sú

sau đây sẽ chỉ xét đến protease gan tụy tôm.

Đồ thị Michaelis-Menten trong hình 3.24 cho thấy ảnh hưởng của nồng độ

cơ chất đến tốc độ phản ứng thủy phân do protease tôm sú xúc tác. Vận tốc phản

ứng thủy phân casein tăng dần khi nồng độ cơ chất tăng lên, tuy nhiên, nó không

tăng tuyến tính cùng nồng độ mà tuân theo qui luật chung: ở nồng độ enzyme cố

định, khi nồng độ cơ chất tăng lên thì tốc độ phản ứng tăng, sau đó tăng chậm dần

và đạt cực đại, không tăng thêm nữa, đây cũng chính là lúc đường cong biểu diễn

vận tốc phản ứng tiến đến đường tiệm cận nằm ngang. Đường tiệm cận này biểu

diễn giá trị vận tốc cực đại Vmax . Quan sát đường cong trên đồ thị này, ta nhận thấy

một điều là dường như nó không hoàn toàn giống một hyperbolic, dạng đường cong

thường gặp khi nghiên cứu phản ứng giữa một enzyme đơn và một cơ chất. Để nhận

biết loại mô hình phản ứng thủy phân rõ nét hơn, dữ liệu trên đây sẽ phải được xử lý

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



98

và vẽ lại trên đồ thị Lineweaver-Burk (hình 3.25) biểu diễn quan hệ giữa nghịch đảo

tốc độ phản ứng và nghịch đảo nồng độ cơ chất 1/V- 1/[S].

Hình 3.24 Biến đổi vận tốc phản ứng thủy phân V theo nồng độ cơ chất [S]

Hình 3.25 Quan hệ giữa nghịch đảo vận tốc và nghịch đảo nồng độ cơ chất trong

phản ứng thủy phân do protease tôm xúc tác

Mối quan hệ giữa 1/V và 1/[S] không tuân theo qui luật đường thẳng mà là

đường cong parabol có phương trình hồi qui là hàm bậc hai với hệ số xác định

R2=0,9964 cho phép khẳng định điều suy luận trên: động học phản ứng enzyme

02468

1012141618

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

Vận

tốc p

hản

ứng

V

[S], mM

y = 2E-05x2 + 8E-06x + 0.0563R² = 0.9964

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 20 40 60 80 100 120

1/V

1/[S]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



99

protease tôm sú Penaeus monodon không tuân theo phương trình Michaelis-

Menten, quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất không có dạng đường

cong hyperbolic.

Từ những phân tích kết quả điện di trên hệ protease tôm sú được trình bày ở

phần 3.2.1 và tính chất của chúng, ta biết rằng hoạt động của hệ protease này không

phải chỉ có một enzyme đơn mà do ba protease chủ yếu A, B, C có phân tử lượng

rất gần nhau và có lẽ có tính chất khá giống nhau quyết định. Theo Coperland [62],

một trong những nguyên nhân dẫn tới mối quan hệ Michalis-Menten không tuân

theo qui luật hyperbolic là do các enzyme thể hiện sự ảnh hưởng qua lại khi gắn kết

với cơ chất (Copeland, 2000). Theo lý thuyết này, một số hệ enzyme có thể bao

gồm một số tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị có trung tâm hoạt động của riêng mình. Sự

gắn kết của một phân tử cơ chất vào một trung tâm hoạt động có thể ảnh hưởng đến

ái lực của một trung tâm hoạt động khác. Hiện tượng này gọi là hợp tác tương hổ

(cooperativity). Sự hợp tác tương hổ được coi là tích cực (positive) nếu liên kết của

cơ chất với một trung tâm hoạt động có tác dụng hỗ trợ cơ chất gắn kết với trung

tâm hoạt động khác, và ngược lại bị coi là tiêu cực (negative cooperativity) nếu nó

ngăn cản ái lực của cơ chất với trung tâm hoạt động tiếp theo. Số lượng trung tâm

hoạt động có khả năng gắn kết cơ chất vào enzyme và mức độ hợp tác tương hổ

giữa chúng có thể lượng hóa nhờ hệ số Hill h trong phương trình đường thẳng:

log푣

푉 − 푣= ℎ푙표푔[푆] − log (퐾 )

Với v là vận tốc phản ứng tại thời điểm đang xét

Vmax là tốc độ phản ứng cực đại

h là hệ số Hill

[S] là nồng độ cơ chất đang xét

K’ là hằng số, vừa phản ánh hằng số Michaelis Km, vừa phản ánh ảnh hưởng

qua lại giữa các trung tâm hoạt động của enzyme

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



100

Sử dụng các số liệu thu được để vẽ lại đồ thị trong hệ trục tọa độ log[v/(Vmax-v)] và

log[S] ta có đồ thị như trong hình 3.26. Các số liệu phù hợp nhất với phương trình

đường thẳng với hệ số xác định R2=0,9891

Hình 3.26 Đồ thị Hill- quan hệ giữa log[v/(Vmax-v)] và log[S]

Phương trình động học Hill của protease gan tụy tôm có dạng:

푦 = 2,8174푥 + 5,0508

Hay viết cách khác: log = 2,8174푙표푔[푆] + 5,0508

Hệ số góc của đường thẳng này chính là hệ số Hill, và ta có ℎ = 2,8174

Đường thẳng cắt trục tung tại điểm có tung độ 5,0508, vì vậy:

log(퐾 ) = −5,0508

Suy ra K’ = 8,9x10-6

Như vậy, ái lực giữa protease tôm sú với cơ chất có thể coi là rất tốt, và hợp

tác tương hổ giữa các trung tâm hoạt động của enzyme này là dạng tích cực, sự gắn

kết của một cơ chất vào trung tâm hoạt động này sẽ thúc đẩy, tạo điều kiện thuận

lợi cho cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động khác.

y = 2.8174x + 5.0508R² = 0.9891

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

-2.1 -1.9 -1.7 -1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7

log

[v/(

V max

-v)]

log [S]

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



101

Kết luận trên đây cũng giúp giải thích vì sao protease tôm sú có hoạt tính rất

cao so với enzyme cùng loại khi nồng độ protein như nhau. Các thực nghiệm trong

phần điện di cơ chất ở trên, khi lượng mẫu ban đầu đưa vào giếng là 30µg, protease

thể hiện hoạt tính quá mạnh, hoàn toàn không thể phân biệt các vạch protease. Thí

nghiệm sau đó đã phải giảm nồng độ mẫu đưa vào giếng xuống vô cùng nhiều (pha

loãng 5 đến 500 lần) để quan sát được rõ ràng và đầy đủ các protease với hoạt tính

mạnh yếu khác nhau trong gan tụy và đầu tôm.

3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP

MÁU VÀ GAN CÁ BA SA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME

PROTEASE TÁCH CHIẾT TỪ ĐẦU TÔM SÚ Thông số ban đầu của hỗn hợp máu và gan cá basa đưa vào thủy phân:

pH 7

Hàm lượng nitơ tổng: 11,101 ± 0,23 g/l

Trong nghiên cứu này, hỗn hợp máu và gan cá basa được chọn để thủy phân,

vì nếu sử dụng riêng máu cá thì hàm lượng nitơ tổng hơi thấp, sử dụng riêng gan cá

thì sản phẩm thủy phân dễ có vị đắng, mặt khác vẫn cần bổ sung nước thêm thì mới

thủy phân gan cá dễ dàng được. Sau khi cắt tiết, cá basa cần được thả vào nước

lạnh để bơi trong đó, cá quẫy sẽ giúp máu cá thoát ra nhiều và thịt cá trắng, tỉ lệ

cá:nước là 10:1(w/w), dịch máu cá thu được vì vậy đã bị pha loãng, tuy nhiên điều

này lại phù hợp để bổ sung thêm gan cá và nghiền mịn trước khi thủy phân.

3.3.1 So sánh quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease đầu tôm

trên hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

Thí nghiệm tiến hành trên mẫu hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia

nhiệt được thực hiện ở nhiệt độ 50oC, nồng độ CPE bổ sung là 2%, kết quả thể hiện

trên hình 3.27. Quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá thực chất là quá trình

phân giải protein nhờ CPE để tạo thành các đoạn peptide mạch ngắn dần đến acid

amin. Theo thời gian thuỷ phân, hàm lượng peptid và acid amin tạo thành cao hơn

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



102

và tăng nhanh hơn ở mẫu đã qua gia nhiệt, nguyên nhân có lẽ do protein trong máu

và gan cá đã biến tính dưới tác dụng của nhiệt nên dễ bị phân giải hơn. Cảm quan

cho thấy sau 6 giờ, hỗn hợp máu và gan cá tươi bắt đầu có mùi hôi nồng khác với

mùi tanh đặc trưng của máu, thời gian càng tăng mùi hôi càng nồng và rất khó chịu

khi để tới 12 giờ. Đối với hỗn hợp máu và gan cá đã qua gia nhiệt thì thời gian càng

tăng mùi tanh càng giảm. Tại thời điểm 12 giờ, cảm quan được mùi tanh đã giảm

nhiều. Điều này có lẽ do trong bản thân nguyên liệu máu và gan cá tươi còn tồn tại

một lượng vi sinh vật, 50oC không phải là nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật gây

thối rữa nhưng chúng vẫn còn hoạt động và có khả năng thích nghi dần. Thời gian

đầu, vi sinh vật hoạt động ở mức độ yếu. Sau thời gian thích nghi, chúng sẽ hoạt

động mạnh làm cho hỗn hợp tươi có mùi hôi sau 6 giờ. Ngoài ra cũng phải kể thêm

một nguyên nhân nữa là nguyên liệu máu cá có nhiều nhớt lẫn vào khi cắt tiết, đây

là môi trường rất thuận lợi cho vi sinh vật gây thối rữa hoạt động và phát triển. Đối

với hỗn hợp máu và gan cá đã gia nhiệt, mùi tanh giảm có thể là do quá trình gia

nhiệt đã tiêu diệt được phần lớn vi sinh vật gây hư hỏng thối rữa và làm bay hơi một

phần các hợp chất gây mùi cho hỗn hợp, nhiệt độ 50oC của quá trình thuỷ phân

cũng có tác dụng làm bay hơi mùi tanh dần, vì vậy dịch thuỷ phân trở nên bớt tanh.

Hình 3.27 Biến động hàm lượng peptid và acid amin trong quá trình thủy phân hỗn

hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 2 4 6 8 10 12

Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)

Thời gian thuỷ phân (h)

Hỗn hợp tươi

Hỗn hợp gia nhiệt

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



103

Trong hỗn hợp máu và gan cá tươi, ngoài CPE bổ sung vào, còn có các

enzyme khác có sẵn trong gan và máu cá hoạt động làm cho quá trình thủy phân

không kiểm soát được. Với mục đích tận dụng nguồn enzyme sẵn có này, nghiên

cứu cũng đã tiến hành khảo sát với mẫu tươi không bổ sung enzyme, ủ ở 50oC,

trong 12 giờ. Tuy nhiên mẫu này cũng xuất hiện mùi hôi nồng từ 6 giờ trở đi, hàm

lượng peptid mạch ngắn và acid amin thu được thấp hơn hẳn so với mẫu gia nhiệt.

Dù quá trình thủy phân mẫu hỗn hợp máu và gan cá tươi có lượng enzyme nhiều

hơn (vì có thêm lượng enzyme sẵn có trong nguyên liệu) nhưng có lẽ sự biến tính

của cơ chất do tác dụng của nhiệt độ trong qúa trình gia nhiệt đã làm protein của

máu và gan cá dễ bị thuỷ phân hơn và cho kết quả hàm lượng peptid mạch ngắn và

acid amin cao hơn. Việc xử lý nhiệt cho dịch hỗn hợp trước khi thuỷ phân cũng có

tác dụng tốt về mặt vi sinh, nhờ vậy sau 12 giờ kể từ khi bắt đầu quá trình ủ nhiệt

khối dịch vẫn có mùi tốt, giảm tanh và không bị thối.

Như vậy, dùng hỗn hợp gan và máu cá tươi cho thủy phân là không phù hợp

để thu thành phẩm, trong phần tiếp theo, đề tài sử dụng hỗn hợp gan và máu cá đã

qua gia nhiệt để thủy phân nhằm hạn chế được ảnh hưởng của các vi sinh vật gây

phân hủy nguyên liệu, thu được dịch thuỷ phân với hàm lượng peptid mạch ngắn và

acid amin cao hơn, có chỉ tiêu cảm quan tốt hơn.

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme protease đến quá trình thủy

phân hỗn hợp máu và gan cá basa gia nhiệt

Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ CPE đến quá trình thủy phân

được thực hiện ở nhiệt độ 40, 50 và 60oC với tỉ lệ CPE bổ sung vào hỗn hợp là 0,5;

2; 3,5 và 4,5%. Rõ ràng là, khi tăng nồng độ enzyme thì hàm lượng peptid mạch

ngắn và acid amin tạo thành cũng tăng. Ta dễ nhận thấy là nồng độ 0,5% dường như

hơi thấp nên sản phẩm tạo thành không nhiều, và khi nâng lên trên 2,5% thì lượng

sản phẩm tăng, tuy nhiên ảnh hưởng của nồng độ đến lượng sản phẩm tạo thành

không còn rất rõ rệt như trước.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



104

Hình 3.28 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến biến đổi hàm lượng peptid và acid

amin trong dịch thủy phân ở 40oC



So sánh các đồ thị biểu diễn biến đổi hàm lượng peptid và acid amin của dịch

thủy phân theo nồng độ ở các nhiệt độ khác nhau có thể thấy rằng, ở tất cả các nhiệt

độ trong khoảng khảo sát 40oC-60oC, tốc độ tạo thành peptid và acid amin đều tăng

tỷ lệ thuận với việc tăng nồng độ CPE sử dụng, tuy nhiên hằng số tỷ lệ sẽ không

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20


Hàm

lượn

g pe

ptid

& a

cid

amin

(g

/l)0.523.54.5

00.5

1

1.52

2.53

3.54

4.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20


Hàm

lượn

g pe

ptid

& a

cid

amin

(g

/l)

0.523.54.5

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



105

giống nhau: khi thủy phân ở 40oC lượng peptid và acid amin tạo thành ở các nồng

độ CPE bổ sung từ 0,5-4,5% tăng khá đều đặn, nhưng tại các nhiệt độ 50,60oC sản

phẩm tạo thành tăng mạnh khi tăng nồng độ CPE từ 0,5 lên thành 2%, khi tiếp tục

tăng lên nữa thì hàm lượng peptid và acid amin cũng tăng nhưng không có sự cách

biệt lớn như trước (các đường biểu diễn ở nồng độ CPE 2-4,5% cao hơn hẳn so với

0,5%). Vậy là, nồng độ CPE bổ sung và nhiệt độ thuỷ phân có ảnh hưởng lẫn nhau,

việc tăng nồng độ enzyme và nhiệt độ đồng thời trong khoảng khảo sát sẽ có tác

dụng tăng mạnh hàm lượng peptid và acid amin tạo thành.

Từ ba đồ thị trên hình 3.28, 3.29, 3.30 có thể dễ nhận thấy là hàm lượng peptid

và acid amin tạo thành tối đa ở các nồng độ từ 0,5 đến 4,5% đều thấp hơn khi thực

hiện thủy phân ở nhiệt độ 40oC, con số này cao hơn hẳn khi thuỷ phân ở 50 và

60oC. Trị số hàm lượng peptid mạch ngắn và acid amin tạo thành tối đa ở hai nhiệt

độ 50 và 60oC rất giống nhau cho phép suy luận rằng nhiệt độ tốt nhất để thực hiện

thuỷ phân có thể ở trong khoảng này.



Một điều cần lưu ý là, nếu sử dụng nồng độ CPE cao thì chi phí sẽ tăng đáng

kể. Vì vậy, để thu được dịch thủy phân có hàm lượng peptid và acid amin cao thì

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)


0.5

2

3.5

4.5

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



106

cần tăng nồng độ CPE sử dụng (lớn hơn 0,5%) nhưng cần cân nhắc thật cẩn thận để

đạt được hiệu quả kinh tế.

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá

gia nhiệt

Hình 3.31 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biến đổi hàm lượng peptid và acid amin

trong dịch thủy phân khi nồng độ CPE bổ sung là 2%

Quá trình thủy phân được tiến hành ở các nhiệt độ 40, 50, 60, 65oC trên hỗn

hợp máu và gan cá gia nhiệt có bổ sung cùng nồng độ enzyme là 2%. Từ đồ thị 3.31

ta thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khá rõ, khi nhiệt độ tăng từ

40oC lên thành 50oC thì hàm lượng peptid mạch ngắn và acid amin tạo thành tăng

mạnh. Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 50oC thành 60oC thì hàm lượng peptid

và acid amin lại tăng không đáng kể và giảm hẳn khi thủy phân ở nhiệt độ 65oC.

Phân tích cảm quan mẫu thuỷ phân ở 40oC cho thấy, từ 8 giờ trở đi, dịch thủy phân

có màu nâu sẫm mùi hơi nặng hơn so với các mẫu ủ ở 50, 60, 65oC vào cùng thời

điểm lấy mẫu và bắt đầu xuất hiện mùi hôi khó chịu sau 16 giờ thủy phân. Đối với

các mẫu thủy phân ở nhiệt độ 50, 60, 65oC, vào thời điểm 18 giờ, dịch có màu nâu

vàng, loãng hơn, mùi tanh giảm nhiều.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20


Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)

40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



107

Từ kết quả thực nghiệm thu được ta thấy rằng, không nên áp dụng nhiệt độ

thủy phân dưới 40oC, và việc tăng nhiệt độ lên trên 65oC cũng là điều không cần

thiết, có nhiều khả năng là nhiệt độ thích hợp để thủy phân nằm trong khoảng 50-

60oC. Vì vậy, các thực nghiệm tiếp theo nên thực hiện ở khoảng nhiệt độ xung

quanh đó 40-65oC để xác định giá trị thích hợp nhất cho quá trình thuỷ phân.

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan

cá gia nhiệt

Nghiên cứu đã thực hiện thủy phân dịch máu và gan cá ở các chế độ nhiệt độ

40oC, 50, 60 và 65oC với nồng độ CPE bổ sung 3,5 và 4,5% để có thêm số liệu về

biến đổi hàm lượng peptid và acid amin theo thời gian, kết quả thể hiện trên hình

3.32, 3.33. Tương tự với quá trình thủy phân khi dùng nồng độ CPE bổ sung 2%

(hình 3.30), ta cũng dễ dàng nhận ra là yếu tố thời gian có ảnh hưởng mạnh tới sản

phẩm thu được. Thời gian thủy phân càng dài, lượng peptid và acid amin tạo nên

càng lớn, đạt cực đại, sau đó giảm dần. Nguyên nhân của sự giảm hàm lượng peptid

và acid amin khi thủy phân kéo dài có lẽ do một lượng acid amin đã bị sử dụng để

tạo thành các sản phẩm cấp thấp như NH3 hay các hợp chất dễ bay hơi khác, và

cũng vì thế mà ở giai đoạn cuối (từ 18 giờ trở đi), sản phẩm thủy phân bắt đầu có

mùi nặng, khó chịu hơn.

Hai đồ thị 3.32 và 3.33 cũng thể hiện sự khác nhau về biến đổi hàm lượng

peptid và acid amin trong dịch thuỷ phân khi nồng độ CPE khác nhau. Với nồng độ

enzyme bổ sung 3,5% các đường biểu diễn quá trình ở nhiệt độ 50, 60, 65oC dù khá

giống nhau và gần nhau nhưng vẫn tách rời một cách rõ ràng, khi tăng lên thành

4,5% các đường này dường như lẫn vào nhau, đặc biệt hàm lượng peptid và acid

amin của quá trình thuỷ phân ở 50 và 60oC gần như trùng nhau ở giai đoạn cuối.

Như vậy, có nhiều khả năng là nồng độ CPE để đạt được hàm lượng peptid và acid

amin cao nhất nằm trong khoảng 3,5 đến 4,5%, còn nhiệt độ tối ưu để thực hiện quá

trình thì trong khoảng 50-60oC.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



108

Hình 3.32 Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân theo thời

gian ở nồng độ CPE bổ sung 3,5%

Hình 3.33 Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân theo thời

gian ở nồng độ CPE bổ sung 4,5%

Quan sát từ các đồ thị cũng cho thấy, hàm lượng peptid và acid amin tăng

mạnh trong các giờ đầu thuỷ phân (cho tới khoảng 9 giờ), sau đó chậm dần lại. Thời

gian thuỷ phân cho kết quả tốt nhất ở tất cả các nồng độ enzyme sử dụng trong thí

0.00.51.01.52.02.53.03.54.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)


40oC50oC60oC65oC

00.5

11.5

2

2.53

3.5

44.5

0 5 10 15 20 25


Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)

40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



109

nghiệm là khoảng 14-16 giờ. Đây cũng chính là vùng nhiệt độ sẽ được đặt ở tâm

khảo sát khi thực hiện tối ưu hoá quá trình thủy phân.

Qua các phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ CPE và thời gian thủy

phân đến sự hình thành của peptid và acid amin trong thành phẩm thu được ở các

mục trên, có thể suy ra các vùng thông số nên sử dụng để xem xét hàm tối ưu là:

nhiệt độ: 40-65oC, nồng độ CPE bổ sung: 2-4,5% và thời gian thủy phân 9-20 giờ.

3.4 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP

MÁU VÀ GAN CÁ BASA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME TỪ

ĐẦU TÔM SÚ

3.4.1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Căn cứ vào các kết quả đã thu được từ thực nghiệm về tính chất của protease

tôm sú, các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng để xác định các thông số thí

nghiệm của quá trình thủy phân.

Các yếu tố cố định

o Tỉ lệ máu và gan cá: 80% máu và 20% gan cá

o pH hỗn hợp đưa vào thủy phân: 7

o Lượng muối NaCl bổ sung: 1% (w/v)

o Khuấy trộn đều dịch thủy phân sau mỗi nửa giờ

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu bao gồm ba yếu tố: nhiệt độ, nồng độ CPE và

thời gian thủy phân. Các thông số về điều kiện biên của từng yếu tố được lựa chọn

trên cơ sở phân tích các biến đổi của hàm lượng peptid và acid amin theo thời gian,

nhiệt độ và nồng độ CPE bổ sung, cụ thể như trong bảng 3.5

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



110

Bảng 3.5 Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu trong quá trình thủy phân

hỗn hợp máu và gan cá

Yếu tố cần tối ưu Khoảng biến thiên

Nhiệt độ (oC)

Nồng độ CPE (%)

Thời gian (giờ)

40 - 65

2 - 4,5

9 - 20

3.4.2 Xác định chỉ tiêu tối ưu

Quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá thực chất là quá trình phân giải

protein để tạo thành các đoạn polypeptid ngắn mạch dần đến acid amin. Vì vậy, có

thể dùng hàm lượng peptid ngắn mạch và acid amin để đo mức độ protein giải. Hàm

mục tiêu của quá trình thủy phân sẽ là HL (hàm lượng peptid mạch ngắn và acid

amin): HL max

Mặt khác, trong hỗn hợp thủy phân luôn có mặt các vi sinh vật gây thối rữa,

phân hủy acid amin thành các sản phẩm cấp thấp có mùi hôi thối. Do vậy, để tối ưu

hóa quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá, bên cạnh hàm mục tiêu HL max,

cần đánh giá cảm quan để dừng quá trình thủy phân ngay khi có dấu hiệu của sự hư

hỏng. Theo các kết quả khảo sát đã thực hiện ở phần trên, dấu hiệu hư hỏng dễ nhận

thấy bằng cảm quan là mùi của dịch thuỷ phân, và vì định hướng nghiên cứu là thu

được sản phẩm để sử dụng vào mục đích thực phẩm nên kết quả tối ưu sẽ chỉ được

chấp nhận khi mùi của dịch thuỷ phân còn có thể chấp nhận được.

3.4.3 Thiết lập phương trình hồi qui của quá trình thủy phân

Các số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hồi qui của quá trình thủy phân

là các số liệu thu được về ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ và thời gian đến hàm

lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân theo thời gian ở phần 3.3. Số liệu sử

dụng thoả mãn điều kiện là nằm trong khoảng biến thiên đã chọn ở mục 3.4.1. Phần

mềm STATGRAPHICS Plus được sử dụng để xử lý số liệu, đưa ra phương trình hồi

qui của quá trình thủy phân.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



111

Với mục đích xem xét các số liệu thực nghiệm có mang ý nghĩa thống kê hay

không và định hướng trước cho phân tích hồi qui, tức là xác định các yếu tố tác

động đáng kể trong mô hình hồi qui sẽ xây dựng, ta thực hiện bảng phân tích

ANOVA

Tóm tắt phân tích ANOVA

Hàm phụ thuộc: HL: Hàm lượng peptid và acid amin tạo thành

Các biến độc lập: T : nhiệt độ thuỷ phân

tg : thời gian thuỷ phân

C : nồng độ CPE bổ sung

Số thực nghiệm xem xét: 84

Bảng ANOVA phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đơn lẻ (nhiệt độ T, thời

gian tg, nồng độ CPE C) và các tương tác đôi, tương tác ba giữa chúng lên hàm mục

tiêu HL (hàm lượng peptid và acid amin). Giá trị p cho biết yếu tố được xem xét có

ý nghĩa thống kê hay không.

Phân tích ANOVA cho hàm số HL thực hiện xem xét ảnh hưởng của các

biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng C*T, C*tg, T*tg được thể hiện ở

bảng 3.21, phụ lục B. Phân tích cho thấy cả sáu giá trị p tương ứng với sáu biến C,

T, tg, C*T, C*tg và T*tg đều nhỏ hơn 0,05 (tức là 5%). Như vậy, sáu yếu tố này đều

mang ý nghĩa thống kê và có thể xem xét giữ lại trong phương trình hồi qui, nói

cách khác, cả nhiệt độ, thời gian, nồng độ CPE và các hiệu ứng tương tác đôi giữa

chúng đều ảnh hưởng đến hàm lượng peptid và acid amin tạo thành trong quá trình

thủy phân.

Khi xét thêm một tương tác ba giữa các yếu tố ảnh hưởng nêu trên, bảng

ANOVA cho kết quả ngược lại hoàn toàn, không có giá trị p nào nhỏ hơn 0,05

chứng tỏ không hề có ảnh hưởng tương tác ba giữa chúng và sự có mặt của tương

tác này sẽ làm sai lệch kết quả của mô hình hồi qui (bảng 3.22, phụ lục B).

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



112

Như vậy, hàm mục tiêu của nghiên cứu thực hiện là HL (hàm lượng peptid

và acid amin tạo thành trong quá trình thuỷ phân) chịu ảnh hưởng của ba yếu tố là

nhiệt độ T, nồng độ CPE bổ sung C, thời gian thuỷ phân tg và các tương tác đôi

giữa chúng. Vì vậy, ta sẽ xây dựng phương trình hồi qui đa biến Multiple Regresion

bậc nhất với các biến độc lập là T, tg, C và tương tác đôi giữa chúng (bảng 3.23,

phụ lục B). Phương trình hồi qui của mô hình có dạng:

HL = -1,26817 + 0,137652*C + 0,0574873*T + 0,0792201*tg

+0,00216844*C*T + 0,0116617*C*tg - 0,00202781*T*tg (3.1)

Gía trị p trong bảng ANOVA áp dụng cho mô hình này nhỏ hơn 0,01, như

vậy, có một mối quan hệ mang ý nghĩa thống kê giữa các biến số ở mức độ tin cậy

99%. Tuy nhiên, giá trị R2 = 61,23% cho biết mô hình chỉ giải thích được 61%

trường hợp các giá trị khác nhau của HL. Điều này là kết quả của việc phần lớn biến

số trong mô hình không mang ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy cần thiết. Như

vậy, cần phải xem xét lại việc xây dựng mô hình hồi qui. Thử sử dụng các biến độc

lập không có tương tác đôi (bảng 3.24, phụ lục B) để xây mô hình bậc một, ta có kết

quả hàm lượng peptid và acid amin trong quá trình thuỷ phân là hàm số sau đây:

HL = -0,634897 + 0,424134*C + 0,0351673*T + 0,00909758*tg (3.2)

Phương trình hồi qui (3.2) này cũng có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy

99% do p nhỏ hơn 0,1, tuy nhiên hệ số R2=59,828% chứng tỏ nó chỉ có thể áp dụng

để giải thích gần 60% trường hợp thực nghiệm. Các giá trị p của hằng số trong

phương trình và yếu tố thời gian tg lại lớn hơn 0,05, chứng tỏ sự có mặt của chúng

ít mang tính thống kê và ít phù hợp trong phương trình thu được.

Có vẻ như biến đổi của hàm lượng peptid và acid amin không phụ thuộc vào

các biến số C, T và tg theo qui luật bậc nhất, ta tiến hành xác định lại phân tích với

số bậc cao hơn là bậc hai với các biến C, T, tg, C2, T2, tg2 và tương tác đôi C*T,

C*tg, T*tg (bảng 3.25, phụ lục B). Khi đó phương trình mô hình hồi qui tương thích

với thực nghiệm ở mức độ tin cậy 99% như sau:

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



113

HL = -16,6604 - 0,0959104*C + 0,480559*T + 0,818599*tg + 0,0363745*C*C -

0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg + 0,00216844*C*T + 0,0116617*C*tg -

0,00202781*T*tg (3.3)

Có một điều đáng lưu ý khi đọc kết quả phân tích là, mặc dù hệ số R2 của

phương trình (3.3) khá cao (92,9423%) nhưng các giá trị p của các biến số C, C2,

C*T ở đây lại cao hơn 0,1 (bảng 3.25, phụ lục B) chứng tỏ số liệu của các biến này

có thể không gây ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê đến mô hình đang tìm kiếm.

Gía trị p cao nhất thuộc về C (p = 0,7038), vì vậy ta sẽ thực hiện phân tích mới

trong đó không xem xét ảnh hưởng của C đến HL nhưng có mặt đầy đủ các yếu tố

còn lại:

HL = -16,8632 + 0,481919*T + 0,82125*tg + 0,0267656*C*C -0,00403577*T*T

- 0,0255576*tg*tg + 0,00176058*C*T + 0,0108664*C*tg - 0,00202781*T*tg (3.4)

Phương trình (3.4) thu được có p nhỏ hơn 0,01 chứng tỏ nó tương thích với

thực nghiệm tuy nhiên p của C*T = 0,37 lại khá cao (bảng 3.26, phụ lục B), nói

khác đi, cần xem xét loại bỏ C*T khỏi phương trình để phương trình bớt phức tạp.

Lúc này ta sẽ thu được (3.5)

Phương trình (3.5) có hệ số R2=95,8517% có nghĩa là nó áp dụng đúng trong

95,85% trường hợp thực nghiệm, mô hình này phản ánh quan hệ giữa các biến số ở

mức độ đáng tin cậy 99% vì p trong phân tích ANOVA bằng 0,0000. Các hệ số p

của các biến số cũng đều xấp xỉ bằng 0,0000, trong đó gía trị cao nhất thuộc về C*T

là 0,0328 < 0,05 (bảng 3.27, phụ lục B). Như vậy,sự có mặt của các yếu tố T, tg, C2,

T2, tg2, T*tg, và C*tg đều có ý nghĩa. Khi xem xét các phân tích đơn giản hơn với

các biến số bậc một và hai nhưng vắng mặt tương tác giữa chúng (bảng 3.28 và

3.29, phụ lục B), kết quả cũng thu được các phương trình hồi qui tương thích thực

nghiệm tuy nhiên hệ số R2 của chúng thấp hơn so với (3.5), vì vậy, phương trình

(3.5) được chấp nhận:

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



114

HL = -17,0127 + 0,487788 T + 0,81786 tg + 0,0390555 C2 – 0,00403577T2

- 0,0255576 tg2 + 0,0118836 Ctg - 0,00202781 Ttg (3.5)

Trong đó:

HL Hàm lượng peptid và acid amin tạo thành của quá trình thủy phân (g/l)

T Nhiệt độ quá trình thuỷ phân (oC)

tg Thời gian thuỷ phân (giờ)

C Nồng độ CPE sử dụng (%)

3.4.4 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng, tìm thông số tối ưu của quá trình thủy

phân

Nhìn vào phương trình hồi qui (3.5) có thể thấy rằng, đây là một phương

trình bậc hai nên mặt đáp ứng của nó sẽ là mặt cong có điểm cực trị. Vì các số liệu

thực nghiệm sử dụng để thiết lập phương trình của mặt cong này cho thấy rằng, nếu

tăng nồng độ CPE sử dụng, tăng nhiệt độ và thời gian thuỷ phân thì hàm lượng

peptid và acid amin HL sẽ tăng dần, đạt cực đại, sau đó giảm xuống, nên chắc chắn

mặt đáp ứng của (3.5) sẽ có điểm cực đại, đó cũng chính là điểm tối ưu mà ta đang

quan tâm.

Để đánh gía mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian thuỷ phân, nồng độ

CPE đến hiệu suất thuỷ phân (hàm lượng peptid và acid amin tạo thành HL), ta cần

xem xét các hệ số của phương trình hồi qui (3.5) thể hiện trong bảng 3.6

Nhìn vào bảng giá trị các hệ số của phương trình hồi qui ta dễ nhận ra một

điều là hệ số của nhiệt độ và thời gian có giá trị lớn nhất so với các hệ số khác và

mang dấu dương thể hiện ảnh hưởng đáng kể của chúng đến quá trình thuỷ phân.

Việc tăng nhiệt độ và (hoặc) thời gian thuỷ phân sẽ dẫn đến sự tăng đáng kể hàm

lượng peptid và acid amin tạo thành. Điều đáng lưu ý là, mặc dù gía trị của hệ số

thời gian (0,81786) lớn hơn so với hệ số nhiệt độ (0,487788) nhưng trong khoảng

khảo sát, giá trị của nhiệt độ (40-65oC) bao giờ cũng lớn hơn nhiều so với thời gian

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



115

(9-20 giờ) nên thật ra cả hai yếu tố này đều thể hiện mức độ ảnh hưởng tương đối

giống nhau đến kết quả là hàm lượng peptid và acid amin tạo thành. Ba hệ số âm

trong phương trình thuộc về T2, tg2 và T*tg, tuy giá trị của chúng không lớn bằng hệ

số của nhiệt độ và thời gian đơn lẻ nhưng bản thân giá trị T2 và tg2 lại rất lớn nên sẽ

khó kết luận được về sự tăng giảm của hàm mục tiêu HL khi thay đổi gía trị các tác

nhân T, tg. Ta sẽ cần vẽ mặt đáp ứng để tìm cực trị của hàm hồi qui.

Bảng 3.6 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui

Yếu tố ảnh hưởng Dấu của hệ số Hệ số

T Tg C2 T2 tg2

C*tg T*tg

+ + + - - + -

0,487788 0,817860 0,039056 0,004036 0,025558 0,011884 0,002028

Việc tăng nồng độ CPE bổ sung cũng có tác dụng tăng hàm HL vì hệ số của

C2 là một số dương (+0,0390555), hệ số của C*tg cũng là một số dương (0,011883).

Xét tất cả các biến số và tương tác có mặt C ta thấy một điều là chúng luôn có số hệ

số dương, vì vậy, ảnh hưởng của C lên HL sẽ theo qui luật tỉ lệ thuận và không thể

tìm được cực trị để xác định giá trị nào của C trong khoảng khảo sát cho HL cao

nhất. Trên cơ sở các số liệu thực nghiệm, khi tăng nồng độ CPE thì HL sẽ tăng, tuy

nhiên mức độ tăng HL chậm lại dần khi nồng độ C tăng lên, nói khác đi, hệ số tỷ lệ

giữa HL và C không phải là một hằng số. Khi tăng C đến một mức nào đó, HL sẽ

không tăng nữa mặc dù điều kiện thuỷ phân không đổi. Như vậy, ta sẽ vẽ mặt đáp

ứng của hàm số HL trong phương trình (3.5) để tìm thời gian tg và nhiệt độ T tối ưu

cho giá trị HL cao nhất, sau đó áp dụng chúng để tìm lại giá trị C bằng cách thực

hiện thêm một số thực nghiệm ở tâm tối ưu này.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



116

Hình 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ (T) và thời gian (tg) đến hàm mục tiêu HL


Ở tất cả các nồng độ CPE bổ sung trong khoảng từ 3-4,5%, mặt đáp ứng đều

có giá trị cực đại, hay hàm lượng peptid và acid amin thu được cao nhất ở nhiệt độ

57oC với thời gian thuỷ phân là 14,5 – 15 giờ. Các phân tích cảm quan từ thực

nghiệm đã chỉ ra rằng, khi nhiệt độ thủy phân trong khoảng 50-65oC thì ở thời điểm

18 giờ từ khi quá trình thủy phân bắt đầu, dịch thủy phân thu được vẫn có mùi tốt,

sau 20 giờ dịch bắt đầu có mùi hơi nồng nhưng chỉ khi rất chú ý mới nhận ra, vì

40 45 50 55 60 65T

9 111315171921

tg1.21.6

22.42.83.23.6

HL

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



117

vậy, sự lựa chọn tối ưu sẽ chú trọng đến hàm lượng peptid và acid amin HL tạo

thành.


(Function) khi nồng độ chế phẩm enzyme CPE bổ sung là 3,5%

T

tg

Function2.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.540 45 50 55 60 65

9

11

13

15

17

19

21

40 45 50 55 60 65T

9 111315171921

tg1.41.82.22.6

33.43.8

HL

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



118



Trong vùng nhiệt độ xấp xỉ 57oC và thời gian 14,5 – 15 giờ, nếu tăng nồng

độ CPE sử dụng sẽ làm tăng hàm mục tiêu HL, tuy nhiên, theo những phân tích từ

phần trước, ta không thể xác định nồng độ tối ưu của quá trình thuỷ phân bằng cách

dùng mô hình hồi qui đã thực hiện, việc cần làm sẽ là thực hiện thêm một số thí

nghiệm ở tâm phương án với hai thông số tối ưu đã được xác định là nhiệt độ

T= 57oC, thời gian thuỷ phân tg=14,5 giờ, biến thay đổi trong thí nghiệm này là

T

tg

Function2.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.7

40 45 50 55 60 659

11

13

15

17

19

21

40 45 50 55 60 65T

9 111315171921

tg1.62

2.42.83.23.6

4

HL

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



119

nồng độ CPE bổ sung trong khoảng 3,5-5%. Kết quả được trình bày trong bảng

3.30, phụ lục B và hình 3.38

Hình 3.37 Ảnh hưởng của nhiệt độ (T) và thời gian (tg) đến hàm mục tiêu

(Function) HL khi nồng độ chế phẩm enzyme bổ sung là 4,5%

Các số liệu thực nghiệm cho thấy, với cùng điều kiện thuỷ phân như nhau,

khi tăng nồng độ chế phẩm enzyme CPE bổ sung sẽ có tác dụng tăng hàm lượng

peptid và acid amin tạo thành. Điều này dễ hiểu là do lượng enzyme tăng sẽ tăng

phản ứng thuỷ phân cơ chất và tăng lượng sản phẩm tạo thành. Tuy nhiên, khi đạt

40 45 50 55 60 65T

9 111315171921

tg1.82.22.6

33.43.84.2

HL

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



120

tới một giới hạn nồng độ nhất định, tăng nồng độ CPE không tạo nên hiệu ứng

tương tự như trước. Trong thí nghiệm thực hiện ở trên, nồng độ CPE 4,5% cho kết

quả hàm lượng peptid và acid amin tối đa, từ nồng độ này trở lên, hàm lượng peptid

và acid amin tạo thành gần như không đổi, và như vậy, việc tăng lượng CPE bổ

sung lên cao hơn 4,5% là hoàn toàn không cần thiết.

Hình 3.38 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme bổ sung đến hàm lượng

peptid và acid amin tạo thành sau 14,5 giờ thủy phân ở nhiệt độ 57oC

Ta có thể chấp nhận nồng độ CPE 4,5% để thực hiện thuỷ phân hỗn hợp máu

và gan cá basa nhằm thu được hàm lượng peptid mạch ngắn và acid amin cao nhất,

tuy nhiên xem xét thật kỹ lại các số liệu thực nghiệm trong bảng 3.30 (phụ lục B)

có thể thấy rằng, hàm lượng peptid và acid amin tạo thành khi sử dụng nồng độ

CPE 3,75 và 4% thật ra chỉ thấp hơn hàm lượng tạo thành ở nồng độ 4,5% một

lượng nhỏ lần lượt là 3,2 và 0,5% tương ứng với lượng CPE sử dụng giảm đi được

16,7 và 11,1%. Áp dụng nồng độ enzyme nào cho thuỷ phân là vấn đề cần cân nhắc

vì tăng hàm lượng sử dụng lên cao không mang lại hiệu quả tăng hàm lượng peptid

và acid amin lên nhiều nhưng chi phí cho CPE lại lớn đáng kể. Trên cơ sở các phân

tích này, ta chấp nhận nồng độ CPE sử dụng là C= 4%, khi đó, hàm lượng peptid

mạch ngắn và acid amin tối đa đạt được là HLmax = 3,96 ± 0,06 g/l. Đây là giá trị có

thể chấp nhận được và các thông số của quá trình tối ưu như sau:

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

4.0

4.1

3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25

Hàm

lượ

ng p

eptid

& a

cid

amin

(g

/l)

Nồng độ CPE bổ sung (%)

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



121

Nhiệt độ 57oC

Thời gian 14,5 giờ

Nồng độ enzyme 4%

3.4.5 Sơ bộ đánh giá chất lượng dịch thủy phân thu được

Dịch đạm thủy phân thu được bằng cách thủy phân theo chế độ đã tối ưu

được lọc thu dịch trong sau đó thực hiện đánh giá cảm quan và xác định một số chỉ

tiêu hóa học, kết quả được trình bày trong bảng 3.7, 3.8 và 3.9

Bảng 3.7 Nhận xét cảm quan dịch thuỷ phân hỗn hợp máu và gan cá basa

Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu hóa học của dịch thủy phân từ

hỗn hợp máu và gan cá basa

Chỉ tiêu Nitơ tổng số (g/l)

Nitơ acid amin

(g/l)

Nitơ amoniac

(g/l)

Hàm lượng 9,8 ± 0,09 3,4 ± 0,027 2,7 ± 0,015

Các thông số về thành phần hóa học và nhận xét cảm quan của dịch thủy

phân cho thấy nó có thể là nguồn cung cấp đạm bổ sung cho chế biến thực phẩm.

Dịch thuỷ phân chưa đạt tiêu chuẩn của nước mắm loại hai vì hàm lượng nitơ tổng

số và nitơ acid amin chưa đủ cao, nhưng nếu sử dụng nó thay cho nước muối để lội

qua bã chượp đã lấy nước cốt thì sẽ thu được nước mắm có độ đạm cao hơn, mùi

Chỉ Tiêu Nhận xét

Trạng thái Dịch lỏng, không có bọt khí

Màu Nâu vàng

Mùi Thoảng mùi tanh, có mùi thơm nhẹ

Vị Ngọt nhạt

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



122

tanh nhẹ của dịch thuỷ phân cũng không còn nhận ra được vì mùi mắm sẽ lấn át.

Dịch thủy phân thu được ở trên cũng có thể xử lý khử mùi bằng than hoạt tính và

ứng dụng vào sản xuất sản phẩm thay thế sữa cho bò, lợn con hay ứng dụng trong

thức ăn cá và vật nuôi, một số thành phần trong dịch thủy phân được tin là có tác

dụng tốt cải thiện hệ miễn dịch do đó vật nuôi ít bị bệnh hơn [153].

Bảng 3.9 Thành phần acid amin trong dịch đạm thủy phân (g/l)

Tên acid amin Hàm lượng Tên acid amin Hàm lượng

Alanin

Glycine

Valine

Leucine

Isoleucine

Threonine

Serine

Proline

Asparagines

0,086

0,023

0,173

0,060

0,131

0,060

0,086

0,195

0,124

Methionin

4-hydroxyproline

Glutamine

Phenylalanine

Lysine

Histidine

Hydroxylysine

Tyrosine

0,113

0,180

0,425

0,455

0,098

0,376

0,036

0,582

Như vậy, việc sử dụng chế phẩm enzyme protease từ đầu tôm vào thủy phân

hỗn hợp máu và gan cá basa tỏ ra có hiệu quả tốt để thu dịch thủy phân và ứng dụng

vào mục đích thực phẩm hay dùng cho chăn nuôi. Quy trình thực hiện bao gồm: gia

nhiệt hỗn hợp máu (80%) và gan (20%) cá basa đến sôi, đồng hóa và làm nguội đến

nhiệt độ thủy phân 57oC sau đó bổ sung 4% CPE, 1% muối NaCl và ủ ở nhiệt độ đó

trong khoảng thời gian 14,5 giờ. Dịch thủy phân được đun sôi diệt enzyme và bảo

quản cho ứng dụng tiếp theo. Qui trình tóm tắt được thể hiện trên sơ đồ 3.2

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



123

Sơ đồ 3.2 Qui trình ứng dụng CPE đầu tôm vào thuỷ phân hỗn hợp

máu và gan cá basa

3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THU NHẬN

BỘT CAROTENOPROTEIN TỪ ĐẦU VÀ VỎ TÔM BẰNG

CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TÁCH CHIẾT TỪ ĐẦU

TÔM SÚ

3.5.1 Thành phần phế liệu đầu và vỏ tôm sú

Thành phần cơ bản của hỗn hợp đầu và vỏ tôm thu nhận được trong quá

trình chế biến tôm xuất khẩu được trình bày trong bảng 3.10.

Máu (80%) và gan cá basa (20%)

Gia nhiệt sôi, để nguội đến 60oC

Đồng hóa

-Bổ sung 4% CPE protease, 1% muối ăn, -Điều chỉnh pH về 7 bằng acid acetic

Ủ ở nhiệt độ 57oC, 14,5 giờ, khuấy đảo

Đun sôi diệt enzyme, để nguội

Lọc (nếu cần)

Thành phẩm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



124

Bảng 3.10 Thành phần cơ bản của phế liệu đầu, vỏ tôm P. monodon

Chỉ tiêu Hàm lượng

Độ ẩm Protein* Chất béo* Tro* Chitin* Carotenoid*

76,96 ± 3,42 % 34,28 ± 1,34 % 4,88 ± 0,92 % 28,37 ± 0,77 % 31,11 ± 0,28 %

133,56 ± 5,36 µg/g *Hàm lượng tính trên nguyên liệu khô

Độ ẩm của phế liệu tôm sú là 76,96% tương tự như số liệu mà Watt và

Merill (1963), Kinsella (1988), Simpson (1997) và Chakrabarti (2002) [57] công bố.

Thành phần protein trong phế liệu tôm sú Việt nam 34,28% cao hơn một chút so với

30,88% ở phế liệu tôm sú Thái lan [100], cao hơn nhiều so với tôm M. monoceros

của Ấn độ 8-10% (Chakrabarti, 2002), nhưng lại thấp hơn ở phế liệu tôm C.crangon

và P. borealis (Synowiecki, 2000) [159]. Hàm lượng chất béo ở phế liệu tôm sú

Việt nam 4,88% cũng cao hơn ở tôm sú Thái lan (3,93%) (Klomklao, 2007), và cao

hơn khá nhiều so với 2-3% ở tôm M. monoceros của Ấn độ (Chakrabarti 2002) mặc

dù so với C.crangon và P. borealis thì lại thua xa (số liệu lần lượt là 9,95 và

10,23%) [159]. Sự khác nhau này có thể do ảnh hưởng của giống loài, môi trường

sinh trưởng và chế độ thức ăn khi nuôi tôm lớn, cũng có thể do mức độ trưởng

thành của tôm khi đánh bắt và cả cách thức xử lý nguyên liệu tôm nguyên con để

thu nhận đầu, vỏ tôm phế liệu, cũng cần nói thêm rằng, phương pháp xác định và

thiết bị đo lường cũng đóng vai trò rất đáng kể trong sự khác nhau này. Hàm lượng

carotenoid của tôm sú Việt nam tương đồng với tôm sú nuôi ở Ấn độ, nhưng thấp

hơn tôm sú đánh bắt từ nguồn tự nhiên (Babu, 2008) [45]. Điều này dễ hiểu bởi vì

chế độ ăn của chúng khác nhau, tôm tự nhiên ăn nhiều thức ăn tự nhiên chứa

carotenoprotein (như một số loài sinh vật phù du hay tảo biển), còn thức ăn nuôi

tôm công nghiệp lại chứa nhiều đạm và có ít sắc tố.

3.5.2 Xác định điểm đẳng điện của dịch thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



125

Việc thu nhận carotenoprotein từ dịch thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm được

thực hiện nhờ phương pháp kết tủa ở điểm đẳng điện. Dịch lọc được đưa về pH

đẳng điện nhằm thu hồi protein và carotenoid dưới dạng carotenoprotein bằng dung

dịch HCl 10%. Nếu điều chỉnh pH cao hơn điểm đẳng điện có thể protein chưa bị

kết tủa hoàn toàn, làm giảm hiệu suất quá trình thu nhận. Nếu điều chỉnh pH thấp

hơn thì mức độ keo tụ có thể giảm xuống, lúc này có thể nồng độ H+ dư nên một số

protein tích điện dương yếu, đẩy nhau, liên kết giữa các phân tử protein yếu đi, tăng

khả năng hydrat hóa, độ hòa tan của protein tăng lên và khó kết tụ hơn. Vì vậy,

nghiên cứu đã tiến hành xác định điểm đẳng điện của dịch thủy phân thu được bằng

cách xác định hàm lượng protein hòa tan của dịch trong sau khi ly tâm thu kết tủa

carotenoprotein từ dịch thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm, kết quả trình bày trong hình

3.39.

Ta thấy rằng, giá trị pH có tác dụng kết tủa protein tốt nhất hay độ hòa tan

của dịch thủy phân nhỏ nhất là 4,5. Giá trị này cao hơn so với giá trị 5,78 của dịch

xay nghiền phế liệu tôm hồng Metapenaeus monoceros (Chakrabarki, 2002), cũng

cao hơn so với điểm đẳng điện của dung dịch máu cá trong qui trình chế biến cá tra

đông lạnh (Trang Sĩ Trung, 2008). Nguyên nhân của điều này có lẽ là thành phần

protein trong các nguyên liệu khác nhau, cũng có thể do dịch phế liệu tôm sau thủy

phân có nhiều axit amin và peptid mạch ngắn được tạo thành, thành phần của các

phần tử mang điện đã thay đổi nhiều so với nguyên liệu chưa thủy phân.

Hình 3.39 Độ hòa tan của protein ở dịch trong sau kết tủa thu carotenoprotein

0

2

4

6

8

10

3.5 4 4.5 5 5.5 6

Hàm

lượ

ng p

rote

in h

òa

tan

(mg/

ml)

pH

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



126

Quan sát từ thực tế cho thấy, sau khi điều chỉnh pH về 4,5 trong dịch thủy

phân bắt đầu xuất hiện các hạt protein nhỏ mịn, quá trình lắng xảy ra khá chậm. Để

tăng nhanh công đoạn lắng, nghiên cứu này đã sử dụng thêm chất trợ lắng chitosan

với nồng độ 100 ppm (Trang Sĩ Trung, 2008) [33] và thực hiện lắng ở nhiệt độ lạnh

0-4oC trong 2 giờ. Chitosan được bổ sung vào dịch thủy phân ngay sau khi đạt pH

cần thiết. Chitosan thể hiện là một chất keo tụ rất tốt, không độc, mang hoạt tính

sinh học có lợi nên sản phẩm thu hồi khi sử dụng chitosan có thể được ứng dụng

trong thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc. Sau khi bổ sung chitosan vào dịch kết

tủa protein, tốc độ lắng protein nhanh hơn và lớp dịch phía trên gần như trong suốt

sau 2h lắng ở nhiệt độ lạnh (4oC). Điều này có thể là do chitosan có khả năng hấp

phụ, tạo cầu nối liên kết với các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích

thước lớn hơn và lắng xuống. Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl hóa cao thì trong

dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các

phân tử protein tích điện âm trong dung dịch thủy phân, giảm khả năng hydrat hóa,

tập hợp lại và kết tụ [33].

Như vậy, để tăng hiệu quả thu nhận bột nhão carotenoprotein, dịch thủy

phân phế liệu tôm sau lọc nên được kết tủa bằng HCl ở pH 4,5 với sự trợ lắng của

chitosan 100 ppm và thực hiện ở điều kiện lạnh 4oC trong 2 giờ

3.5.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm thu nhận bột

carotenoprotein

3.5.3.1 So sánh quá trình thủy phân bằng CPE protease đầu tôm trên phế liệu

đầu và vỏ tôm tươi và đã gia nhiệt

Mặc dầu việc so sánh quá trình thủy phân phế liệu tôm tươi và đã gia nhiệt

hoàn toàn có thể dự đoán được từ thí nghiệm tương tự đã thực hiện đối với hỗn hợp

máu và gan cá basa, nhưng nghiên cứu vẫn đã thử quá trình này theo hai cách: thực

hiện giống như phương pháp trình bày trong sơ đồ 2.9 với đầu, vỏ tôm được gia

nhiệt chín và khi phế liệu tôm vẫn còn tươi được đem thủy phân. Thí nghiệm tiến

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



127

hành ở nhiệt độ 50oC, nồng độ CPE bổ sung 3,5%, kết quả thể hiện trên hình 3.40

và 3.41.

Hình 3.40 Hiệu suất thu nhận carotenoid trong quá trình thủy phân phế liệu tôm

tươi và đã gia nhiệt

Hình 3.41 Hiệu suất thu nhận protein hòa tan trong quá trình thủy phân phế liệu

tôm tươi và đã gia nhiệt

Các đường biểu diễn trên đồ thị cho thấy, theo thời gian hiệu suất thu nhận

carotenoid và protein đều tăng dần, đạt cực đại sau đó giảm xuống. Tuy nhiên, các

giá trị đạt được ở mọi thời điểm thủy phân đều có sự chênh lệch đáng kể giữa mẫu

gia nhiệt và không gia nhiệt. Việc thủy phân phế liệu tôm đã gia nhiệt tỏ ra thuận lợi

hơn nhiều, hiệu suất thu nhận carotenoid và protein hòa tan đều cao gấp đôi, thậm

chí hơn gấp đôi so với mẫu tươi đem thủy phân, có lẽ nhờ được gia nhiệt mà protein

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 2 4 6 8 10 12 14

Hiệ

u su

ất th

u nh

ận

caro

teno

id

(mg/

g ph

ế liệ

u)

Thời gian thủy phân (giờ)

Phế liệu tôm gia nhiệtPhế liệu tôm tươi

05

10152025303540

0 2 4 6 8 10 12 14

Hiệ

u su

ất th

u nh

ận p

rote

in

(mg/

g ph

ế liệ

u)


Phế liệu tôm gia nhiệtPhế liệu tôm tươi

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



128

trong thịt tôm đã biến tính trở nên dễ phân giải hơn trước tác dụng của CPE

protease, do đó, hàm lượng acid amin, peptid mạch ngắn và do đó cả carotenoid

cũng tăng lên.

Mặc dù về mặt lý thuyết, hàm lượng enzyme protease tham gia vào thủy

phân ở mẫu đầu, vỏ tôm tươi luôn nhiều hơn so với mẫu đã gia nhiệt vì trong bản

thân đầu tôm tươi có một lượng đáng kể enzyme còn hoạt tính, tuy nhiên sự phong

phú trong thành phần enzyme đầu tôm dường như lại chính là nguồn gốc của quá

trình phân giải và phân hủy không kiểm soát. Ta biết rằng, trong đầu tôm không chỉ

chứa protease mà còn cả các polyphenoloxydase điều khiển sự biến đen của tôm, sự

có mặt của chúng có tác hại đáng ngại bởi làm cho dịch thủy phân ngày càng sẫm

đen hơn và bột carotenoprotein thu được sau đông khô không còn màu vàng cam

tươi sáng nữa, thay vào đó là màu nâu, thậm chí nâu đen khi quá trình thủy phân đã

kéo dài hơn 5 giờ.

Một điều khá dễ nhận thấy từ đồ thị hình 3.40 và 3.41 là, thời điểm quá

trình đạt hiệu suất thu nhận carotenoid và protein cực đại đến sớm hơn ở mẫu thủy

phân tươi so với mẫu đã gia nhiệt (lần lượt là 6 và 9 giờ). Điều này có lẽ do sự hiện

diện của vi sinh vật gây thối phân hủy nguyên liệu tôm và cả CPE bổ sung vào. Phế

liệu tôm sống được thủy phân ở 50oC, mặc dù không phải là nhiệt độ thích hợp cho

vi sinh vật gây thối rữa nhưng chúng vẫn hoạt động và có thể thích nghi dần, vì vậy,

từ khoảng 5 giờ trở đi dịch thủy phân và bột carotenoprotein không những có màu

không đẹp mà còn khá nồng và chuyển sang hôi nhẹ, mùi hôi thối càng tăng thêm

khi thời gian thủy phân tăng. Ngược lại trường hợp trên, mẫu phế liệu tôm đã gia

nhiệt chín cho kết quả thủy phân rất tốt, màu cam vàng tươi của sản phẩm bột

carotenoprotein còn giữ được đến tận giờ thứ 28, mùi thơm hơi thoảng tanh dễ chịu

của tôm đã nấu chín.

Như vậy, dùng phế liệu tôm còn sống cho thủy phân là không phù hợp để

thu nhận carotenoprotein. Vì vậy, trong nghiên cứu tiếp theo, đề tài sử dụng CPE

protease để thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm đã gia nhiệt chín nhằm hạn chế ảnh

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



129

hưởng của polyphenoloxydase, hạn chế hoạt động của các vi sinh vật gây thối, thu

được sản phẩm carotenoprotein giàu carotenoid, giàu protein và có màu sắc, mùi tốt

hơn.

3.5.3.2 Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian thủy phân và nồng độ CPE

sử dụng tới hiệu suất thu nhận carotenoid trong quá trình thủy phân thu nhận

carotenoprotein

Quá trình thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm đã gia nhiệt chín để thu bột

carotenoprotein được thực hiện với ba nồng độ CPE là 2; 3,5 và 5% ở các nhiệt độ

40, 50, 60 và 65oC theo thời gian. Việc thủy phân được coi là thành công khi hiệu

suất thu carotenoid (hay astaxanthin) và protein đạt cao nhất có thể, trong đó thông

số carotenoid-astaxanthin được coi trọng hàng đầu vì tính kinh tế của nó.

Các số liệu hiệu suất thu nhận carotenoid ở các chế độ nhiệt độ, thời gian và

nồng độ CPE khác nhau của quá trình được trình bày trong bảng 3.31 (phụ lục B)

và hình 3.42 đến 3.48. Số liệu này được sử dụng vào phân tích ANOVA nhiều nhân

tố (Bảng 3.33 -Phụ lục B), kết quả phân tích cho thấy cả ba thông số: nồng độ chế

phẩm enzyme C, nhiệt độ thủy phân T và thời gian thủy phân tg đều có ảnh hưởng

đáng kể đến hiệu suất thu nhận carotenoid CP với độ tin cậy lớn hơn 95% vì cả ba

giá trị p đều bằng 0,000<0,05, tương tác đôi giữa chúng cũng cho kết quả tương tự,

nghĩa là đều có ảnh hưởng rõ rệt mang tính thống kê đến hàm lượng carotenoid tạo

thành. Qua giá trị của trung bình bình phương (Mean square), ta thấy ảnh hưởng

của thời gian thủy phân lớn hơn ảnh hưởng của hàm lượng CPE sử dụng và nhiệt độ

có vai trò thấp hơn cả. Khi xét về ảnh hưởng của các tương tác đôi thì thứ tự gây

ảnh hưởng theo trình tự: nồng độ CPE-thời gian, nhiệt độ-thời gian và cuối cùng là

nồng độ CPE-nhiệt độ. Tuy nhiên tất cả ảnh hưởng này đều có ý nghĩa thống kê, vì

trị số p rất thấp (< 0,001). Multiple Range Test cũng được thực hiện để so sánh sự

khác biệt giữa các chế độ thủy phân khi thực hiện ở các khoảng hàm lượng CPE,

nhiệt độ và thời gian khác nhau, kết quả phân tích cho thấy, mỗi biến đổi của từng

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



130

yếu tố C, T hay tg đều ảnh hưởng có ý nghĩa và tạo nên sự khác biệt đáng kể đến

hiệu suất thu carotenoid trong quá trình thủy phân.

Phân tích ảnh hưởng của nồng độ CPE sử dụng tới hiệu suất thu nhận

carotenoid từ quá trình thủy phân:

Hình 3.42 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận carotenoid




Các đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận

carotenoid khi thủy phân phế liệu tôm ở các nhiệt độ 40, 50, 60 và 65oC trên hình

3.42 đến 3.45 cho thấy, hàm lượng CPE sử dụng cho thủy phân càng cao thì hiệu

suất thu carotenoid cũng tăng tương ứng, điều này đúng cho tất cả các quá trình

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u ca

rote

noid

(m

g/g)


2%3.50%5%

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u ca

rote

noid

(m

g/g)


2%3.50%5%

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



131

thủy phân ở nhiệt độ khác nhau. Ta dễ nhận ra rằng, nồng độ CPE 2% dường như

hơi thấp nên sản phẩm tạo thành không nhiều, và khi nâng lên 3,5% thì hiệu suất

thu carotenoid tăng lên rất đáng kể, việc tăng CPE sử dụng cho thủy phân sau đó

thành 5% cũng có tác dụng tăng sản phẩm tạo thành nhưng hiệu quả đạt được không

còn rõ rệt như trước.





Ta biết rằng, các phản ứng do enzyme điều khiển luôn phụ thuộc tỷ lệ thuận

với hàm lượng enzyme, nhưng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

uca

rote

noid

(mg/

g)


2%3.50%5%

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

uca

rote

noid

(m

g/g)


2%3.50%5%

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



132

tăng nữa do các sản phẩm được tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của

enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức độ bão hoà (Coperland, 2000) [62]. Quá trình

thủy phân phế liệu tôm bằng CPE protease cũng tuân theo qui luật này, có thể là

nồng độ CPE tối đa nên sử dụng để đạt hiệu quả thu thành phẩm khi thủy phân ở

trong khoảng 3,5 và 5% vì mặc dù phép so sánh cặp đôi trong Multiple Range Test

cho thấy hiệu suất thu carotenoid bởi hai chế độ thủy phân này có khác biệt, nhưng

so với hiệu quả đạt được khi tăng nồng độ CPE từ 2 lên 3,5% thì việc tăng CPE từ

3,5 lên 5% đem lại những khác biệt thật sự khiêm tốn.

Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu nhận carotenoid từ

quá trình thủy phân:

Quá trình thủy phân phế liệu tôm được thực hiện ở các nhiệt độ 40, 50, 60 và

65oC, và ta hoàn toàn có thể dựa vào các đồ thị trên hình 3.42 đến 3.45 để rút ra một

nhận xét chung nhất là, khi nhiệt độ thủy phân tăng lên, hiệu suất thu carotenoid

cũng tăng rõ rệt. Dễ thấy rằng, hiệu suất thu carotenoid cực đại ở cùng nồng độ CPE

sử dụng luôn cao hơn khi nhiệt độ tăng từ 40o lên thành 50oC, sau đó giảm nhẹ

xuống khi tiếp tục tăng thành 60o và giảm đáng kể ở nhiệt độ thủy phân 65oC.

Hình 3.46 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận carotenoid khi thủy


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u ca

rote

noid

(mg/

g)


40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



133

Để làm rõ những điều vừa bàn luận ở trên, biến đổi hiệu suất thu nhận

carotenoid ở chế độ nhiệt độ khác nhau sẽ được biểu diễn lại trên hình 3.46 đến

3.48. Rõ ràng là, ở bất kỳ nồng độ CPE sử dụng là bao nhiêu trong khoảng khảo sát

thì nhiệt độ 50oC đều cho kết quả cao nhất. Việc hiệu suất thu carotenoid tăng mạnh

khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 40 lên 50oC rồi sau đó giảm nhẹ xuống khi tiếp tục

tăng lên 60oC, và tiếp tục giảm ở 65oC cho phép suy luận, có nhiều khả năng là

nhiệt độ tối ưu để thực hiện quá trình thủy phân cao hơn 50oC không nhiều.

Hình 3.47 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận carotenoid khi thủy phân

phế liệu tôm với nồng độ CPE 3,5%

Hình 3.48 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận carotenoid khi thủy


00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u ca

rote

noid

(mg/

g)


40oC50oC60oC65oC

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u ca

rote

noid

(mg/

g)


40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



134

Một điều đáng chú ý được nhận ra khi theo dõi thủy phân phế liệu tôm là quá

trình này có thể diễn ra ở nhiệt độ cao (thậm chí cả ở 65oC vẫn xảy ra khá tốt) trong

thời gian dài (15 giờ và có thể hơn nữa). Như vậy, enzyme protease từ đầu tôm tỏ ra

bền nhiệt và ưa nhiệt. Điều này đã có thể dự đoán được phần nào từ những nghiên

cứu về tính chất của protease tôm sú ở mục 3.2: enzyme này giữ hoạt tính tốt sau

nửa giờ ở 52oC, thậm chí 57 và 62oC, đồng thời thể hiện hoạt tính rất tốt trong

khoảng 47-70oC với nhiệt độ tối thích là 62oC. Tuy nhiên, kết quả thủy phân thu

được vẫn là điều ngạc nhiên thú vị vì CPE protease đã giữ hoạt tính tốt hơn nửa

ngày đêm ở nhiệt độ cao 50-60oC, có lẽ cơ chất thủy phân trong quá trình này là thịt

tôm (không phải casein như khi nghiên cứu tính chất) đã gia nhiệt chín, protein

trong thịt tôm bị biến tính nên dễ thủy phân và CPE thì duy trì hoạt độ tốt hơn

nhiều.

Phân tích ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới việc thu nhận

carotenoid

Các đồ thị thể hiện trên hình 3.42 đến 3.48 đều giúp phân tích về ảnh hưởng

của thời gian tới hiệu suất thu carotenoid. Dễ nhận thấy rằng thời gian thủy phân

ảnh hưởng rất đáng kể tới hiệu suất thu sản phẩm. Thời gian thủy phân càng dài,

hiệu suất thu carotenoid càng lớn, đạt cực đại sau đó giảm dần. Nguyên nhân của sự

giảm hiệu suất thu carotenoid khi thủy phân kéo dài có lẽ do chúng bị phân hủy

dưới tác dụng của nhiệt độ, thời gian đầu, đa số các carotenoid (mà trong nguyên

liệu tôm thì phần lớn là astaxanthin) còn nằm trong liên kết với protein nên được

bảo vệ tốt, cùng với thời gian thủy phân, protein bị phân giải sâu sắc tạo thành

nhiều acid amin tự do và giải phóng ra carotenoid - astaxanthin tự do nên dễ bị phân

hủy.

Kết quả phân tích ANOVA đã cho biết rằng, thời gian là yếu tố quan trọng

nhất quyết định hiệu suất thu caroteinoid – astaxanthin, xác định đúng điểm dừng

thủy phân sẽ giúp đạt kết quả tối ưu mỹ mãn. Các số liệu thực nghiệm cho phép dự

đoán thời gian cần thiết là khoảng 9-10 giờ. Điều này sẽ được khẳng định khi thực

hiện tối ưu hóa quá trình thủy phân và kiểm chứng trên thực nghiệm.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



135

3.5.3.3 Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian thủy phân và nồng độ CPE

sử dụng tới hiệu suất thu protein hòa tan của sản phẩm carotenoprotein

Quá trình thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm đã gia nhiệt chín để thu bột

carotenoprotein được thực hiện với ba nồng độ CPE là 2; 3,5 và 5% ở các nhiệt độ

40, 50, 60 và 65oC theo thời gian. Các số liệu về hiệu suất thu protein hòa tan được

trình bày trong bảng 3.34 (phụ lục B) và hình 3.49 đến 3.52.

Số liệu này được phân tích ANOVA nhiều nhân tố (Bảng 3.36 -Phụ lục B),

kết quả phân tích cho thấy cả ba thông số: nồng độ chế phẩm enzyme C, nhiệt độ

thủy phân T và thời gian thủy phân tg đều có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu

protein AP với độ tin cậy lớn hơn 95% vì cả ba giá trị p đều bằng 0,000<0,05, tương

tác đôi giữa chúng cũng cho kết quả tương tự, nghĩa là đều có ảnh hưởng rõ rệt

mang tính thống kê đến hiệu suất thu nhận protein AP tạo thành. Qua giá trị của

trung bình bình phương (Mean square), ta thấy ảnh hưởng của thời gian thủy phân

lớn nhất, sau đó đến nhiệt độ, ảnh hưởng của hàm lượng CPE sử dụng ít hơn cả.

Điều này có hơi khác so với kết quả phân tích yếu tố ảnh hưởng quá trình thu nhận

carotenoid, theo đó thời gian đóng vai trò quan trọng nhất còn nhiệt độ ít ảnh hưởng

nhất. Khi xét về ảnh hưởng của các tương tác đôi thì thứ tự gây ảnh hưởng theo

trình tự: nhiệt độ-thời gian, nồng độ CPE-thời gian và cuối cùng là nồng độ CPE-

nhiệt độ. Tất cả các ảnh hưởng này đều có ý nghĩa thống kê, vì trị số p rất thấp p<

0,001. Multiple Range Test cũng được thực hiện để so sánh sự khác biệt giữa các

chế độ thủy phân khi thực hiện ở các khoảng hàm lượng CPE, nhiệt độ và thời gian

khác nhau, kết quả phân tích cho thấy, mỗi biến đổi của từng yếu tố C, T hay tg đều

ảnh hưởng có ý nghĩa và tạo nên sự khác biệt đáng kể đến hiệu suất thu nhận

protein trong sản phẩm carotenoprotein.

Ảnh hưởng của nồng độ CPE tới hiệu suất thu nhận protein trong quá

trình thủy phân:

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



136

Các đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu protein

khi thủy phân phế liệu tôm ở các nhiệt độ 40, 50, 60 và 65oC được biểu diễn trên

các hình 3.49 đến 3.52.

Hình 3.49 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu protein khi thủy phân

phế liệu tôm ở 40oC

Hình 3.50 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu protein khi thủy phân

phế liệu tôm ở 50oC

Ta dễ nhận ra rằng, hàm lượng CPE sử dụng cho thủy phân càng cao thì hiệu

suất thu nhận protein cũng tăng tương ứng, điều này đúng cho tất cả các quá trình

thủy phân ở nhiệt độ khác nhau. Những gì đã xảy ra khi thu nhận carotenoid một

lần nữa lặp lại ở đây: nồng độ CPE 2% dường như hơi thấp nên sản phẩm tạo thành

không nhiều, và khi nâng lên 3,5% thì hiệu suất thu protein tăng lên rất đáng kể,

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10 12 14 16

HIệ

u su

ât th

u pr

otei

n(m

g/g)


2%3.50%5%

05

1015202530354045

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u pr

otei

n(m

g/g)


2%3.50%5%

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



137

việc tăng nồng độ CPE sử dụng cho thủy phân sau đó thành 5% cũng có tác dụng

tăng sản phẩm tạo thành nhưng hiệu quả đạt được không còn rõ rệt như trước, điều

này rất dễ nhận thấy vì hai đường biểu diễn thật sát gần nhau. Lý giải cho điều này

cũng tương tự trước, việc tăng nồng độ CPE sử dụng quả thật sẽ cho hiệu suất thu

protein cao hơn, nhưng tính chất tăng tỷ lệ thuận như vậy chỉ quan sát được đến một

giới hạn nhất định. Sự tăng quá mức CPE sẽ không thể đem lại lợi ích thu nhiều sản

phẩm nhưng có khả năng sẽ góp phần nâng cao giá thành bột carotenoprotein thu

được. Hiệu suất thu protein sau khi đạt cực đại sẽ giảm xuống do thời gian thủy

phân kéo dài, một phần acid amin đã bị sử dụng để tạo ra các sản phẩm cấp thấp

như NH3 hay các hợp chất dễ bay hơi.

Hình 3.51 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận protein khi thủy


Nếu quan sát kỹ các đường biến đổi hiệu suất thu protein và carotenoid trong

quá trình thủy phân ta sẽ nhận ra chúng rất giống nhau. Điều này là dễ hiểu vì trong

phế liệu tôm, các carotenoid thường không tồn tại riêng lẻ mà nằm trong phức với

protein, và cùng protein phân tán trong mô cơ với từng tế bào sợi cơ, bó cơ bao bọc

bởi màng liên kết (cấu tạo chủ yếu từ collagen và một phần elastin), một số nằm sâu

trong các kẽ nhỏ và liên kết với vỏ tôm, do đó, sự thủy phân mạng lưới liên kết và

protein sẽ làm giải phóng các acid amin và peptid mạch ngắn, giúp kéo

carotenoprotein khỏi mạng lưới bao bọc và hòa tan vào dịch thủy phân. Hàm lượng

05

1015202530354045

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ât th

u pr

otei

n(m

g/g)


2%3.50%5%

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



138

protein hòa tan càng tăng cao thì lượng carotenoid cũng tăng tương ứng, tuy nhiên,

có khả năng là nếu sự thủy phân xảy ra quá sâu sắc thì phức chất carotenoprotein sẽ

bị phá vỡ và carotenoid dễ bị phân hủy. Đây có thể là lý do sau khi đạt cực đại thì

hiệu suất thu carotenoid giảm dần xuống

Hình 3.52 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thu nhận protein khi thủy


Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu nhận protein trong


Từ các đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu protein khi

thủy phân ở các nồng độ CPE khác nhau trên hình 3.53 đến 3.55 ta dễ rút ra một

nhận xét chung nhất là, khi nhiệt độ thủy phân tăng lên, hiệu suất thu protein cũng

tăng rõ rệt. Hiệu suất thu protein ở cùng nồng độ CPE sử dụng luôn cao hơn khi

nhiệt độ tăng từ 40o lên 50oC, sau đó giảm nhẹ xuống khi tiếp tục tăng đến 60o và

giảm đáng kể ở nhiệt độ thủy phân 65oC, có lẽ là, nhiệt độ tối ưu để thực hiện quá

trình thủy phân thu protein là nhiệt độ trên 50oC không nhiều.

Kết quả thu nhận protein trên đây cũng giúp khẳng định lại nhận xét từ phần

trước: enzyme protease từ đầu tôm tỏ ra bền nhiệt và ưa nhiệt, vì quá trình thủy

phân ở nhiệt độ cao từ 40o đến 65oC đều diễn ra tốt trong khoảng thời gian dài hơn

nửa ngày đêm, với nhiệt độ cho kết quả hiệu suất thu nhận protein cao nhất là

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u pr

otei

n(m

g/g)


2%3.50%5%

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



139

khoảng 50oC. Có thể do cơ chất của quá trình thủy phân là thịt tôm đã gia nhiệt chín

bị biến tính nên việc thủy phân thuận lợi và dễ duy trì hoạt độ.

Hình 3.53 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận protein khi thủy phân

phế liệu tôm với nồng độ CPE 2%


phế liệu tôm với nồng độ CPE 3,5%

Phân tích ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thu nhận protein trong


Phân tích ANOVA cho biết, thời gian là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến

hiệu suất thu nhận protein khi thủy phân. Điều này cũng dễ dàng nhận ra được từ

các đồ thị 3.49 đến 3.55. Thời gian thủy phân càng kéo dài thì hiệu suất thu protein

hòa tan càng lớn, đạt cực đại sau đó giảm dần. Một phần acid amin được tạo thành

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u pr

otei

n (m

g/g)


40oC50oC60oC65oC

05

10152025303540

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ât th

u pr

otei

n (m

g/g)


40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



140

có thể đã bị vi sinh vật sử dụng để tạo thành sản phẩm cấp thấp như NH3 hay các

hợp chất dễ bay hơi làm giảm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân và do đó

của cả sản phẩm bột carotenoprotein xuống.


phế liệu tôm với nồng độ CPE 5%

Qua phần phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân đầu, vỏ

tôm ở trên, ta thấy rằng, các thông số cho kết quả hiệu suất thu nhận carotenoid và

protein cao nhất dao động trên dưới các giá trị: nhiệt độ thủy phân 50oC, thời gian 9

giờ và nồng độ CPE dưới 5%, từ đây suy ra khoảng khảo sát để tìm thông số tối ưu

của quá trình thủy phân sẽ là:

Nhiệt độ thủy phân: 40-65oC

Thời gian thủy phân: 6-15 giờ

Nồng độ CPE sử dụng: 2-5%

3.6 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU

ĐẦU, VỎ TÔM THU SẢN PHẨM BỘT

CAROTENOPROTEIN

Mục đích của việc tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm là

để tìm ra các thông số thời gian, nhiệt độ và nồng độ CPE sử dụng cho kết quả thu

05

1015202530354045

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hiệ

u su

ất th

u pr

otei

n (m

g/g)


40oC50oC60oC65oC

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



141

nhận sản phẩm carotenoprotein với hiệu suất thu carotenoid và protein cao nhất,

trong đó, hiệu suất thu carotenoid được chú trọng hàng đầu vì giá trị kinh tế của nó

cao gấp nhiều lần so với bột đạm thủy phân.

3.6.1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Căn cứ vào các kết quả thu được từ thực nghiệm khi nghiên cứu tính chất của

protease tôm sú và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng, các thông số thí

nghiệm của quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm với mục đích thu nhận bột

carotenoprotein được xác định như sau:

Các yếu tố cố định

Phế liệu đầu vỏ tôm (tỉ lệ số lượng đầu: vỏ là 1:1), xay nhỏ 2-5 mm, gia nhiệt

chín ở 98oC, 5 phút

Tỉ lệ phế liệu: dung dịch Na2-EDTA 0,5M pH 7 là 1:3

Lượng muối NaCl bổ sung: 1% (w/v)

Khuấy trộn đều dịch thủy phân sau mỗi nửa giờ

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu bao gồm ba yếu tố: nhiệt độ, nồng độ CPE và

thời gian thủy phân. Dựa vào các phân tích kết quả thăm dò trong phần 3.5 nghiên

cứu quá trình thủy phân phế liệu tôm để thu carotenoprotein, điều kiện biên của

từng yếu tố cần nghiên cứu được đề nghị trong bảng 3.11

Bảng 3.11 Khoảng biến thiên của các yếu tố biến đổi cần tối ưu khi thủy phân đầu,

vỏ tôm

Yếu tố cần tối ưu Ký hiệu Khoảng biến thiên

Nhiệt độ thủy phân (oC)



T

C

tg

40 – 65

2 – 5

6 - 15

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



142

3.6.2 Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân phế liệu tôm được thực hiện với mục đích thu nhận bột

carotenoprotein, thực chất là thu nhận carotenoid-astaxanthin và protein. Trong phế

liệu tôm, các carotenoid thường không tồn tại riêng lẻ mà nằm trong phức với

protein, và cùng protein phân tán trong mô cơ, một số nằm sâu trong các kẽ nhỏ và

liên kết với vỏ tôm, do đó, sự thủy phân mạng lưới liên kết và protein sẽ làm giải

phóng các acid amin và peptid mạch ngắn, giúp kéo carotenoprotein khỏi mạng lưới

bao bọc và hòa tan vào dịch thủy phân. Hàm lượng protein hòa tan càng tăng cao thì

lượng carotenoid cũng tăng tương ứng, tuy nhiên, có khả năng là nếu sự thủy phân

xảy ra quá sâu sắc thì phức chất carotenoprotein sẽ bị phá vỡ và carotenoid dễ bị

phân hủy.

Như vậy, quá trình thủy phân nhằm tới mục tiêu là đạt hiệu suất thu

carotenoid CP→max và protein hòa tan AP→max, trong đó, chỉ số được chú trọng

nhiều hơn là carotenoid-astasanthin vì chính chất màu này đem lại hiệu quả kinh tế

cao cho sản phẩm carotenoprotein.

3.6.3 Thiết lập phương trình hồi qui hiệu suất thu carotenoid CP và xác

định thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein

giàu carotenoid

Các số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hồi qui CP là các số liệu thu

được về ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ CPE và thời gian đến hiệu suất thu

carotenoid CP khi thủy phân thu nhận bột carotenoprotein đã trình bày trong phần

3.5 ở trên. Số liệu sử dụng thỏa mãn điều kiện là nằm trong khoảng biến thiên đã

xác định. Phần mềm STATGRAPHIC Plus được sử dụng để phân tích số liệu, đưa ra

phương trình hồi qui cho hàm mục tiêu CP.

3.6.3.1 Phương trình hồi qui hiệu suất thu nhận carotenoid

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



143

Vì số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hồi qui đã loại bớt một phần,

không còn đầy đủ như đã được phân tích ở phần 3.5 nên cần xem xét lại ảnh hưởng

của các yếu tố trong vùng khảo sát và định hướng trước cho phân tích hồi qui, ta

thực hiện phân tích ANOVA nhiều chiều (bảng 3.38, phụ lục B). Kết quả cho thấy,

các yếu tố đơn lẻ nhiệt độ T, nồng độ chế phẩm enzyme C, thời gian tg và tương tác

đôi giữa chúng đều có ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê đến hàm mục tiêu CP với

mức độ tin cậy 95% vì cả sáu giá trị p đều nhỏ hơn 0,05, do đó các yếu tố và tương

tác này sẽ được giữ lại trong mô hình hồi qui. Khi xem xét khả năng ảnh hưởng của

tương tác ba giữa các yếu tố đơn lẻ T, C và tg, không có giá trị p nào nhỏ hơn 0,05

(bảng 3.39, phụ lục B) chứng tỏ không hề có ảnh hưởng tương tác ba giữa chúng và

sự có mặt của tương tác này sẽ làm sai lệch kết quả mô hình hồi qui.

Hàm mục tiêu đang xét là hiệu suất thu nhận carotenoid CP chịu ảnh hưởng

của ba yếu tố nhiệt độ T, nồng độ CPE bổ sung C, thời gian thuỷ phân tg và các

tương tác đôi giữa chúng. Từ các kết quả thực nghiệm ở phần 3.5, đồ thị biểu diễn

mối quan hệ hiệu suất thu carotenoid với nồng độ CPE hay nhiệt độ theo thời gian

đều có dạng đường cong, do đó ta loại trừ khả năng phương trình hồi qui là đa biến

bậc nhất. Phân tích hồi qui đa biến Multiple Regresion bậc hai với các biến độc lập

là T, tg, C, C2, T2, tg2 và tương tác đôi C*T, C*tg, T*tg (bảng 3.40, phụ lục B) cho

kết quả phương trình hồi qui có dạng (3.6):

CP = -4.58597 + 0.318839*C + 0.145763*T + 0.137964*tg -0.000265738*C*T - 0.00132375*C*tg - 0.0000468667*T*tg - 0.0307762*C*C - 0.00136915*T*T - 0.00643203*tg*tg (3.6)

Giá trị p trong phân tích ANOVA phương trình này nhỏ hơn 0,01 chứng tỏ

tồn tại một mối quan hệ mang ý nghĩa thống kê giữa các yếu tố ở mức tin cậy 99%.

R2=96,7% chứng tỏ phương trình có thể giải thích 96,7% trường hợp thực nghiệm.

Tuy nhiên, giá trị p của tương tác T*tg lại lớn (0,7294>0,1) chứng tỏ nó không gây

nên ảnh hưởng mang tính chất thống kê ở độ tin cậy bằng hoặc lớn 90%, do đó, sẽ

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



144

cần loại bỏ. Phân tích hồi qui (bảng 3.41, phụ lục B) gồm các yếu tố T, tg, C, C2, T2,

tg2 và tương tác đôi C*T, C*tg cho kết quả phương trình hồi qui có dạng như sau:

CP = -4.55952 + 0.318839*C + 0.145271*T + 0.135444*tg -0.000265738*C*T -

0.00132375*C*tg - 0.0307762*C*C - 0.00136915*T*T -0.00643203*tg*tg (3.7)

Giá trị p trong phân tích ANOVA phương trình này nhỏ hơn 0,01 chứng tỏ

tồn tại một mối quan hệ mang ý nghĩa thống kê giữa các yếu tố ở mức tin cậy 99%.

R2=96,7% chứng tỏ phương trình có thể giải thích 96,7% trường hợp thực nghiệm.

Tuy nhiên, giá trị p của tương tác C*T lại lớn (0,47>0,1) chứng tỏ nó không gây nên

ảnh hưởng mang tính chất thống kê ở độ tin cậy bằng hoặc lớn 90%, do đó, nên loại

bỏ. Phân tích hồi qui (bảng 3.42, phụ lục B) gồm các yếu tố T, tg, C, C2, T2, tg2 và

tương tác đôi C*tg cho kết quả phương trình hồi qui có dạng như sau:

CP = -4.50952 + 0.304555*C + 0.144341*T + 0.135444*tg -

0.00132375*C*tg - 0.0307762*C*C - 0.00136915*T*T - 0.00643203*tg*tg (3.8)

Phân tích ANOVA cho biết phương trình này tương thích với thực nghiệm

nhưng giá trị p của yếu tố tương tác C*tg là 0,2089>0,01 nên sẽ cần cân nhắc loại

khỏi phương trình (3.8). Phương trình mới có dạng (3.9), có hệ số R2=96,54% có

nghĩa là nó áp dụng đúng trong 96,54% trường hợp thực nghiệm, mô hình này phản

ánh quan hệ giữa các biến số ở mức độ đáng tin cậy 99% vì p-value trong phân tích

ANOVA bằng 0,0000. Các hệ số p của các biến số cũng đều bằng 0,0000 (bảng

3.43, phụ lục B). Như vậy, sự có mặt của các yếu tố T, C, tg, C2, T2, tg2 đều có ý

nghĩa và phương trình (3.9) được chấp nhận:

CP = -4,46088 + 0,290656 C + 0,144341 T + 0,130811 tg – 0,0307762 C2

- 0,00136915 T2 – 0,00643203 tg2 (3.9)

Trong đó:

CP Hiệu suất thu carotenoid của quá trình thủy phân (mg/g)


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



145



3.6.3.2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng hiệu suất thu nhận carotenoid, tìm

thông số tối ưu của quá trình thủy phân để hiệu suất thu carotenoid khi

thủy phân thu bột carotenoprotein cao nhất CP→max

Để đánh gía mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ T, thời gian thuỷ phân tg và

nồng độ CPE sử dụng C đến hiệu quả thu nhận carotenoid, ta cần xem xét các hệ số

của phương trình hồi qui (3.9)

Bảng 3.12 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui CP


C

T

tg

C2

T2

tg2

+

+

+

-

-

-

0,290656

0,144341

0,130811

0,030776

0,001370

0,006432


điều là hệ số của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân có giá trị lớn

nhất so với các hệ số khác và mang dấu dương thể hiện ảnh hưởng đáng kể của

chúng đến quá trình thuỷ phân. Việc tăng nồng độ CPE sử dụng, nhiệt độ và (hoặc)

thời gian thuỷ phân sẽ dẫn đến sự tăng đáng kể hàm lượng carotenoid thu nhận

được. Điều lưu ý là, mặc dù giá trị của hệ số nồng độ CPE sử dụng (0,290656) lớn

hơn so với hệ số nhiệt độ (0,144341) và thời gian (0,130811) nhưng trong khoảng

khảo sát, giá trị của nhiệt độ (40-65oC) bao giờ cũng lớn hơn thời gian (9-20 giờ) và

lớn hơn nồng độ CPE nhiều lần (2-5%) nên trên thực tế, hai yếu tố này sẽ thể hiện

ảnh hưởng tương đối lớn hơn đến kết quả là hiệu suất thu carotenoid. Ba hệ số âm

trong phương trình thuộc về C2, T2 và tg2, tuy giá trị của chúng không lớn bằng hệ

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



146

số của nhiệt độ và thời gian đơn lẻ nhưng bản thân giá trị T2 và tg2 lại rất lớn nên sẽ

khó kết luận được về sự tăng giảm của hàm mục tiêu khi thay đổi gía trị các tác

nhân C, T, tg. Ta sẽ cần vẽ mặt đáp ứng để tìm cực trị của hàm hồi qui.

Hình 3.56 Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 2%

Carotenoid- Hiệu suất thu carotenoid (mg/g); T- Nhiệt độ (oC); tg- Thời gian (giờ)

Các bề mặt đáp ứng thể hiện phụ thuộc của hàm mục tiêu hiệu suất thu

carotenoid CP vào nhiệt độ T và thời gian tg ở các nồng độ CPE khác nhau 2; 3,5 và

5% được thể hiện trên hình 3.56 đến 3.58. Điểm chung nhất của các bề mặt này là

chúng cùng đạt giá trị cực đại, hay hàm mục tiêu CP đạt tối đa khi nhiệt độ thủy

phân là 53oC sau thời gian 10 giờ. Nếu so với quá trình thủy phân máu và gan cá

basa (với nhiệt độ 57oC và thời gian 14,5 giờ) thì cả hai thông số ở đây đều thấp

hơn một chút. Có lẽ thành phần protein trong máu và gan cá khác so với thịt tôm, cơ

40 45 50 55 60 65

T

6

8

10

12

14

16

tg

Carotenoid0.050.10.150.20.250.30.350.40.45

40 45 50 55 60 65T

6 8 10121416tg0

0.10.20.30.40.5

Car

oten

oid

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



147

chất khác nhau là nguyên nhân dẫn đến khác biệt điều kiện thủy phân tối ưu, tính

chất của CPE dường như cũng thay đổi tùy thuộc cơ chất mà nó phân giải.

Hình 3.57 Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 3,5%


Hai thông số nhiệt độ và thời gian thủy phân tối ưu đã xác định được khá dễ

dàng, tuy nhiên, nồng độ CPE cần thiết để đạt hàm mục tiêu CP tối đa vẫn còn là ẩn

số, ta sẽ thử xem xét bề mặt đáp ứng (hình 3.59) thể hiện phụ thuộc của CP vào

nhiệt độ và nồng độ CPE để xem xu hướng của enzyme này.

40 45 50 55 60 65T

6 8 10121416tg0.2

0.30.40.50.60.7

Car

oten

oid

40 45 50 55 60 65

T

6

8

10

12

14

16

tg

Carotenoid0.250.30.350.40.450.50.550.6

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



148

Bề mặt đáp ứng CP trong hình 3.59 cho kết quả về nhiệt độ tối ưu tương tự

đã suy được là 53oC như trên, nhưng không cho phép xác định được nồng độ CPE

thích hợp nhất cần sử dụng. Mặt cong có dạng giống hyperbol này thể hiện CP tăng

khi C tăng từ 2-4%, sau đó dần đạt tới bão hòa khi nồng độ CPE tăng tiếp từ 4-5%.

Quan sát hình chiếu trên bề mặt phẳng ở phía dưới cho ta suy luận nồng độ enzyme

cho hiệu quả thu nhận carotenoid CP cao nhất là 4,5%, tuy nhiên, điều này sẽ phải

được kiểm chứng lại trong mục 3.6.5

Như vậy, theo phân tích bề mặt đáp ứng của hàm hồi quy CP, các thông số

tối ưu cho thủy phân thu bột carotenoprotein giàu carotenoid sẽ là: nhiệt độ: 53oC,

thời gian thủy phân: 10 giờ với nồng độ CPE sử dụng là 4,5%

Hình 3.58 Bề mặt đáp ứng hàm CP ở nồng độ CPE 5%


40 45 50 55 60 65T(oC)

6 8 10121416tg (h)0.25

0.350.450.550.650.75

Car

oten

oid

(mg/

g)

40 45 50 55 60 65

T

6

8

10

12

14

16

tg

Carotenoid0.30.350.40.450.50.550.60.65

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



149

Hình 3.59 Bề mặt đáp ứng hàm CP sau 10 giờ thủy phân

Carotenoid- Hiệu suất thu carotenoid (mg/g); T- Nhiệt độ (oC); C- Nồng độ CPE (%)

3.6.4 Thiết lập phương trình hồi qui hiệu suất thu protein AP và xác định

thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein giàu

protein

Các số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hồi qui AP là các số liệu thu

được đã trình bày trong phần 3.5 ở trên về ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ CPE và

thời gian đến hiệu suất thu protein trong quá trình thủy phân. Số liệu sử dụng thỏa

mãn điều kiện là nằm trong khoảng biến thiên đã xác định. Phần mềm

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5C

404550556065T0.24

0.340.440.540.640.74

Car

oten

oid

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

C

40

45

50

55

60

65

T

Carotenoid0.290.340.390.440.490.540.590.640.69

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



150

STATGRAPHIC Plus được sử dụng để phân tích số liệu, đưa ra phương trình hồi

qui cho hàm mục tiêu AP.

3.6.4.1 Phương trình hồi qui hiệu suất thu nhận protein

Việc xây dựng phương trình hồi qui hiệu suất thu protein được bắt đầu từ

phân tích ANOVA nhiều chiều (bảng 3.45, phụ lục B) trên các số liệu sử dụng cho

quá trình tối ưu để xem xét lại ảnh hưởng của các yếu tố trong vùng khảo sát và

định hướng trước cho phân tích hồi qui. Kết quả cho thấy, các yếu tố đơn lẻ nhiệt độ

T, nồng độ chế phẩm enzyme C, thời gian tg và tương tác đôi giữa chúng đều có

ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê đến hàm mục tiêu AP với mức độ tin cậy 95% vì

cả sáu giá trị p đều nhỏ hơn 0,05, do đó các yếu tố và tương tác này sẽ được giữ lại

trong mô hình hồi qui. Khi xem xét khả năng ảnh hưởng của tương tác ba giữa các

yếu tố đơn lẻ T, C và tg, không có giá trị p nào nhỏ hơn 0,05 (bảng 3.46, phụ lục B)

chứng tỏ không hề có ảnh hưởng tương tác ba giữa chúng và sự có mặt của tương

tác này sẽ làm sai lệch kết quả mô hình hồi qui.

Hàm mục tiêu đang xét là hiệu suất thu nhận protein AP chịu ảnh hưởng của

ba yếu tố nhiệt độ T, nồng độ CPE bổ sung C, thời gian thuỷ phân tg và các tương

tác đôi giữa chúng. Từ các kết quả thực nghiệm ở phần 3.5, đồ thị biểu diễn mối

quan hệ AP với nồng độ CPE hay nhiệt độ theo thời gian đều có dạng đường cong

bậc hai, do đó ta loại trừ khả năng phương trình hồi qui là đa biến bậc nhất. Phân

tích hồi qui đa biến Multiple Regresion bậc hai với các biến độc lập là T, tg, C, C2,

T2, tg2 và tương tác đôi C*T, C*tg, T*tg (bảng 3.47, phụ lục B) cho kết quả phương

trình hồi qui có dạng:

AP = -243.959 + 8.17741*C + 9.00026*T + 4.73421*tg + 0.0415276*C*T -0.0570668*C*tg + 0.00123844*T*tg - 0.966014*C*C - 0.0867718*T*T -0.236527*tg*tg (3.10)

Giá trị p trong phân tích ANOVA của phương trình này nhỏ hơn 0,01 chứng

tỏ tồn tại một mối quan hệ mang ý nghĩa thống kê giữa các yếu tố ở mức tin cậy

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



151

99%. R2=93,4% chứng tỏ phương trình có thể giải thích 93,4% trường hợp thực

nghiệm. Tuy nhiên, giá trị p của tương tác T*tg lại lớn (0,9072>0,1) chứng tỏ nó

không gây nên ảnh hưởng mang tính chất thống kê ở độ tin cậy bằng hoặc lớn 90%,

do đó, sẽ cần loại bỏ.

Phân tích hồi qui gồm các yếu tố đơn lẻ và tương tác như trên nhưng đã loại

bớt T*tg (bảng 3.48, phụ lục B) cũng cho kết quả hàm hồi qui thể hiện mối quan hệ

mang ý nghĩa thống kê giữa các yếu tố với độ tin cậy 99% nhưng giá trị p của tương

tác C*tg lại lớn (0,4891>0,1) nên ta sẽ tiếp tục loại bỏ tương tác này và tìm kiếm

một phương trình hồi qui mới. Phân tích hồi qui ở bảng 3.49, phụ lục B với các yếu

tố T, tg, C, C2, T2, tg2 và tương tác đôi C*T cũng khuyên loại bớt C*T với lý do

tương tự. Cuối cùng, phương trình có thể chấp nhận được theo kết quả phân tích ở

bảng 3.50, phụ lục B như sau:

AP = -250.373 + 9.81032*C + 9.15861*T + 4.60104*tg - 0.966014*C*C

-0.0867718*T*T - 0.236527*tg*tg (3.11)

Trong đó:

AP Hiệu suất thu nhận protein trong quá trình thủy phân (mg/g)




3.6.4.2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng hiệu suất thu nhận protein, tìm thông

số tối ưu của quá trình thủy phân để hiệu suất thu protein cao nhất

AP→max

Để đánh gía mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ T, thời gian thuỷ phân tg và

nồng độ CPE sử dụng C đến hiệu quả thu nhận carotenoid, ta cần xem xét các hệ số

của phương trình hồi qui (3.11)

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



152

Bảng 3.13 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui AP


C

T

tg

C2

T2

tg2

+

+

+

-

-

-

9,81032

9,15861

4,60141

0,966014

0,086772

0,236527


điều là hệ số của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân có giá trị lớn

nhất so với các hệ số khác và mang dấu dương thể hiện ảnh hưởng đáng kể của

chúng đến quá trình thuỷ phân. Việc tăng nồng độ CPE sử dụng, nhiệt độ và (hoặc)

thời gian thuỷ phân sẽ dẫn đến sự tăng đáng kể hàm lượng protein thu nhận được.

Trong các hệ số của biến bậc một, C có hệ số lớn nhất (9,81032), hệ số của T cũng

xấp xỉ (9,15861), nhưng trong khoảng khảo sát, giá trị của nhiệt độ (40-65oC) bao

giờ cũng lớn hơn nồng độ CPE nhiều lần (2-5%) nên T sẽ thể hiện ảnh hưởng lớn

hơn C đến kết quả là hàm lượng protein thu nhận được. Ba hệ số âm trong phương

trình thuộc về C2, T2 và tg2, tuy giá trị của chúng không lớn bằng hệ số của các yếu

tố đơn lẻ nhưng bản thân giá trị T2, tg2 và cả C2lại rất lớn nên sẽ khó kết luận được

về sự tăng giảm của hàm mục tiêu AP khi thay đổi gía trị các tác nhân C, T, tg. Ta

sẽ cần vẽ mặt đáp ứng để tìm cực trị của hàm hồi qui.

Các bề mặt đáp ứng thể hiện phụ thuộc của hàm mục tiêu AP vào nhiệt độ T

và thời gian tg ở các nồng độ CPE khác nhau 2; 3,5 và 5% được thể hiện trên hình

3.60 đến 3.63. Điểm chung nhất của các bề mặt này là chúng cùng đạt giá trị cực

đại, hay hàm mục tiêu AP đạt tối đa khi nhiệt độ thủy phân là 53oC sau thời gian 9,5

giờ. Kết quả này cho ta khẳng định lại một lần nữa, nhiệt độ thích hợp hơn cả cho

hoạt động của CPE từ đầu tôm sú trên cơ chất thịt tôm đã gia nhiệt chín là 53oC.

Thời gian thủy phân cho hiệu suất thu tối đa lượng protein AP khá giống với

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



153

carotenoid CP (lần lượt là 9,5 và 10 giờ) cho thấy sự liên quan chặt chẽ giữa mức

độ thủy phân thịt tôm và hàm lượng chất màu carotenoid thu được. Độ chênh lệch

0,5 giờ thủy phân có lẽ liên quan đến phần thịt tôm kết dính vào vỏ. Để phân giải

được hết thịt tôm tạo nên sự gia tăng hàm lượng protein, thời gian thủy phân cần

thiết là 9,5 giờ, phần thịt tôm kết dính với vỏ không phải là nguồn cơ chất đáng kể

để hàm lượng protein AP tăng cao hơn nữa, nhưng đây lại là phần chứa nhiều chất

màu carotenoprotein, vì vậy, sau 10 giờ thủy phân, hàm CP đạt tới giá trị cực đại.

Hình 3.60 Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 2%

AP- Hiệu suất thu protein (mg/g); T- Nhiệt độ (oC); tg- Thời gian (giờ)

40 45 50 55 60 65T

6 8 10121416tg0

51015202530

AP

T

tg

AP7.764719.7058811.647113.588215.529417.470619.411821.352923.294125.235327.176529.1176

40 45 50 55 60 656

8

10

12

14

16

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



154

Để biết nồng độ CPE cần thiết cho thủy phân đạt hiệu suất thu protein cao

nhất, ta sẽ xem xét bề mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của AP vào nồng độ C và

nhiệt độ thủy phân T (hình 3.63). Tương tự như đối với hàm CP, bề mặt này không

giúp ta dễ dàng xác định được giá trị nồng độ CPE tối ưu, chỉ có thể dự đoán khi

tăng C từ giá trị 3,5 đến 4% thì AP tăng nhưng không đáng kể, và khoảng tăng nồng

độ CPE từ 4 lên 5% sẽ còn ít có tác dụng tăng AP hơn nữa.

Hình 3.61 Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 3,5%


Mặc dù hiệu suất thu protein đúng là một trong hai hàm mục tiêu cần đạt tối

đa, nhưng giá trị kinh tế của protein không cao như carotenoid, việc tăng nồng độ C

lên khi không tăng được hàm lượng protein nhiều tương ứng sẽ không mang lại hiệu

40 45 50 55 60 65T6

8 10 1214 16

tg121722273237

AP

T

tg

AP13.915.817.719.621.523.425.327.229.131.032.934.8

40 45 50 55 60 656

8

10

12

14

16

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



155

quả kinh tế mong đợi, vì vậy, ta chấp nhận nồng độ C=4,5-5%, khá tương đồng

thông số C tối ưu để hàm mục tiêu CP đạt giá trị cao nhất.

Như vậy, các thông số tối ưu để hàm mục tiêu AP đạt giá trị tối đa chấp

nhận được là: nhiệt độ: 53oC, thời gian thủy phân: 9,5 giờ với nồng độ CPE bổ

sung là 4,5-5%

Hình 3.62 Bề mặt đáp ứng hàm AP ở nồng độ CPE 5%


40 45 50 55 60 65T

6 8 10121416tg15

192327313539

AP

40 45 50 55 60 65

T

6

8

10

12

14

16

tg

AP17.419.822.224.627.029.431.834.236.6

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



156

Hình 3.63 Bề mặt đáp ứng hàm AP sau khi thủy phân 9,5 giờ

AP- Hiệu suất thu protein (mg/g); T- Nhiệt độ (oC); C- Nồng độ CPE bổ sung (%)

3.6.5 Kiểm tra tính tương thích của các chỉ tiêu tối ưu vào thực nghiệm

Từ những kết quả tối ưu của hàm mục tiêu CP và AP có thể thấy rằng chúng

khá giống nhau: nhiệt độ thủy phân tối ưu cùng là 53oC, hàm lượng CPE sử dụng là

4,5% đối với CP và 4,5-5% đối với AP, thời gian thủy phân: 10 giờ đối với CP và

9,5 giờ đối với AP. Để tiện so sánh, các số liệu trên sẽ được trình bày trong bảng

3.14

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5C

404550556065T15

192327313539

AP

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

C

40

45

50

55

60

65

T

AP17.419.822.224.627.029.431.834.236.6

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



157

Như đã phân tích ở phần trên, việc thu nhận carotenoprotein nhằm vào hai

mục tiêu là hiệu suất thu carotenoid đạt tối đa CP→max và hiệu suất thu protein hòa

tan cũng đạt giá trị cao nhất AP→max, trong đó hàm mục tiêu liên quan đến thu

nhận carotenoid được ưu tiên hơn vì chính chất màu này tạo nên giá trị kinh tế cao

cho sản phẩm carotenoprotein, và sự lựa chọn thông số tối ưu cho cả quá trình thủy

phân sẽ dựa theo đúng nguyên tắc này. Một điều thật sự đáng ghi nhận là sự khác

biệt của các thông số để đạt được cả hai mục tiêu hàm lượng carotenoid và protein

tối đa không khác nhau đáng kể, cũng có nghĩa là khi thông số thủy phân tối ưu sao

cho hiệu suất thu carotenoid đạt cao nhất được chọn thì đó cũng là điều kiện rất tốt,

gần như tối ưu để giá trị hiệu suất thu protein cũng cao xấp xỉ giá trị tốt nhất.

Bảng 3.14 Thông số tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein

Yếu tố CP→max AP→max

Nhiệt độ thủy phân (oC)



53

4,5

10

53

4,5 – 5

9,5

Như vậy, các thông số tối ưu của quá trình thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm thu

nhận bột carotenoprotein sẽ là: nhiệt độ thủy phân: 53oC, thời gian: 10 giờ với nồng

độ CPE bổ sung là 4,5%.

Các thông số tối ưu suy từ mô hình hồi qui trên đây đã được áp dụng vào

thủy phân để kiểm tra lại tính tương thích với thực tế. Các thông số kỹ thuật của bột

carotenoprotein thành phẩm được trình bày trong bảng 3.15

So sánh các thông số về hiệu suất thu nhận carotenoid và protein trong bảng

trên ta thấy, số liệu thực tế luôn cao hơn một chút so với dự đoán theo mô hình hồi

qui, khác biệt về hiệu suất thu carotenoid là 1,8% và protein là 2%. Mức chênh lệch

như vậy có thể chấp nhận được vì bản thân thành phần của nguyên liệu có thể khác

nhau ít nhiều tùy thuộc chế độ ăn, môi trường sống và mùa vụ thu hoạch v.v…

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



158

Bảng 3.15 Các thông số kỹ thuật bột carotenoprotein trên thực tế và theo tính toán

Chỉ tiêu Hiệu suất thực tế

(mg/g)

Hiệu suất dự đoán

(mg/g)

Hiệu suất thu carotenoid

Hiệu suất thu protein hòa tan

0,7056 ± 0,0257

39,0357 ± 2,6258

0,69289 ± 0,02972

38,2337 ± 2,3427

Như vậy, phương trình hồi qui (3.9) và (3.11) hoàn toàn có thể sử dụng để

dự đoán hiệu suất thu nhận carotenoid và protein khi thủy phân phế liệu đầu, vỏ

tôm. Các thông số tối ưu để quá trình thủy phân cho bột carotenoprotein có hiệu

suất thu carotenoid cao nhất và protein cũng rất cao là:

Nhiệt độ: 53oC

Nồng độ CPE bổ sung: 4,5%

Thời gian thủy phân: 10 giờ

3.6.6 Sơ bộ đánh giá về chất lượng của bột carotenoprotein thu nhận từ

phế liệu tôm theo thông số tối ưu hóa

Mô tả cảm quan của bột carotenoprotein thành phẩm: Bột mịn, hơi xốp màu

cam đỏ đậm tươi sáng, thơm mùi thịt tôm nấu chín, vị ngọt nhẹ dễ chịu, khi

nấu trong dầu tan nhanh và cho màu cam đỏ đậm rất đẹp.

Thành phần hóa học của bột carotenoprotein: các thành phần chủ yếu được

trình bày trong bảng 3.16

Như vậy, những đánh giá ban đầu về cảm quan và thành phần của bột

carotenoprotein rất tốt và tỏ ra phù hợp cho mục đích thực phẩm. Bột không những

giàu đạm, giàu acid amin mà còn cung cấp lượng lớn carotenoid –astaxanthin, hợp

chất chống oxy hóa hữu hiệu nguồn gốc thiên nhiên đang được chú ý vì những lợi

ích to lớn có thể mang lại cho sức khỏe vật nuôi và cả con người.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



159

Bảng 3.16 Thành phần hóa học cơ bản của bột carotenoprotein

Thành phần Hàm lượng

Protein thô

Lipid

Tro

Chitin

Carotenoid

70,68 ± 0,36 %

16,89 ± 0,23 %

6,37 ± 0,18 %

3,25 ± 0,11 %

0,7056 ± 0,0257 mg/g

Bảng 3.17 Thành phần acid amin của bột carotenoprotein


(%)


(%)

Alanin

Glycine

Valine

Leucine

Isoleucine

Threonine

Serine

Proline

0,95

2,12

1,26

0,72

1,71

0,39

0,5

1,13

Methionin

4-hydroxyproline

Glutamine

Phenylalanine

Lysine

Histidine

Tyrosine

Asparagine

1,04

0,77

3,51

2,66

0,86

2,79

3,38

1,40

Qui trình sản xuất carotenoprotein từ đầu vỏ tôm được tóm tắt trong sơ đồ 3.3

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



160

Sơ đồ 3.3 Qui trình thu nhận bột carotenoprotein từ đầu và vỏ tôm

Đầu, vỏ tôm

Xay nhỏ, gia nhiệt chín

Để nguội

Thủy phân ở 53oC, 10 giờ

Lọc qua vải thô

Kết tủa dịch lọc ở pH 4,5

Ly tâm 10.000 vòng/phút, 15 phút

Lắng lạnh 4oC, 2 giờ

Đông khô ở -40oC

Bột carotenoprotein

NaCl

CPE 4,5% Na2-EDTA 0,5M

Bã

Dịch trong

HCl 10% Chitosan

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



161

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

KẾT LUẬN

1. Đã xác lập được qui trình tách chiết chế phẩm enzyme protease từ gan tụy và đầu

tôm sú ( sơ đồ 3.1).

2. Protease từ gan tụy và đầu tôm có thể tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sử dụng Bio-

Gel P-100. Độ sạch của protease sau sắc ký tăng lên 16,27 lần đối với gan tụy và

18,03 lần đối với đầu tôm.

3. Đã xác định được thành phần và tính chất của protease gan tụy và đầu tôm sú như

sau:

Protease từ gan tụy và đầu tôm sú gồm ít nhất năm loại protease khác nhau với

phân tử lượng từ 20.200 đến 40.200 Da, riêng đầu tôm còn có thêm hai protease

với phân tử lượng là 49.200 và 76.000 Da. Ba protease chiếm vai trò hoạt động

chủ đạo có phân tử lượng 20.200 đến 25.000 Da.

Protease gan tụy và đầu tôm sú bền nhiệt, có nhiệt độ tối thích là 62oC, pH hoạt

động tối ưu là 7,5 với nồng độ muối ăn NaCl thích hợp cho hoạt động là 1%.

Hoạt độ của protease gan tụy và đầu tôm giảm khi có mặt của một số ion kim

loại, đặc biệt là Hg2+. Ion Mn2+ làm tăng hoạt tính của protease tôm sú.

Protease gan tụy và đầu tôm thuộc nhóm protease serine, trong đó các enzyme

tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động.

Protease tôm sú có ái lực với cơ chất tốt, hợp tác tương hổ giữa các trung tâm

hoạt động của enzyme này là dạng tích cực, sự gắn kết của một cơ chất vào một

trung tâm hoạt động sẽ thúc đẩy, tạo điều kiện thuận lợi cho cơ chất gắn vào

trung tâm hoạt động khác.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



162

4. Đã sử dụng chế phẩm enzyme CPE từ đầu tôm vào thủy phân hỗn hợp máu và gan

cá basa thu dịch đạm có hàm lượng nitơ tổng là 9,8 g/l, nitơ acid amin là 3,4 g/l .

Quá trình thủy phân có thể thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các điều kiện tối ưu như

sau: Nhiệt độ thủy phân: 57oC, thời gian thủy phân 14,5 giờ, nồng độ CPE bổ sung:

4% so với hỗn hợp, nồng độ muối ăn bổ sung 1%, pH hỗn hợp lúc bắt đầu thủy

phân là 7

5. Đã sử dụng CPE đầu tôm để thủy phân đầu, vỏ tôm và thu nhận bột carotenoprotein

với hàm lượng carotenoid cao 0,706 mg/g; hàm lượng protein cao 70,68%, rất giàu

acid amin (26,99%) phù hợp dùng cho vật nuôi và thực phẩm chức năng cho người.

Qui trình thực hiện (sơ đồ 3.3) với các thông số đã được tối ưu hóa như sau: Nhiệt

độ thủy phân: 53oC, thời gian thủy phân 10 giờ, nồng độ CPE bổ sung: 4,5% so với

nguyên liệu đầu, vỏ tôm, tỉ lệ phế liệu đầu, vỏ tôm so với dung dịch Na2-

EDTA0,5M pH7 bổ sung vào để thủy phân: 1:3 (w/v), nồng độ muối ăn bổ sung

1%, pH lúc bắt đầu thủy phân: 7

ĐỀ XUẤT CHO CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Từ các kết quả thu được từ thực nghiệm, một số các đề xuất cho nghiên cứu sau này

được đề nghị như sau:

Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản xuất CPE từ đầu tôm ở qui mô lớn hơn để áp

dụng vào sản xuất nhằm nâng cao giá trị sử dụng của đầu tôm, cho phép thu

được lượng lớn vỏ “sạch” lẫn ít thịt thuận lợi cho qui trình sản xuất chitin. Phần

cặn tách được khi ly tâm lấy dịch chiết có nhiều thịt tôm và protein không hòa

tan có thể dùng làm nguồn cung cấp đạm rất tốt cho thức ăn gia súc.

Nên sử dụng phụ phẩm của quá trình sản xuất CPE và bột carotenoprotein là vỏ

tôm đã loại phần lớn protein làm đối tượng nghiên cứu để xác định qui trình sản

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



163

xuất chitin thích hợp cho nó, nhằm có chế độ xử lý thích đáng ít hao phí hóa

chất, mang lại lợi ích kinh tế và tác dụng bảo vệ môi trường.

Tiếp tục nghiên cứu các ứng dụng sản phẩm dịch thủy phân từ hỗn hợp máu và

gan cá để áp dụng vào sản xuất, ví dụ, sử dụng làm thức ăn thay thế sữa cho vật

nuôi, bổ sung vào thức ăn gia súc hoặc dùng nó thay cho nước muối để lội qua

bã chượp sau khi rút nước mắm cốt, tăng hiệu quả thu nước mắm với hàm lượng

đạm cao hơn.

Thử nghiệm sử dụng một số chất phòng thối vào thủy phân dịch hỗn hợp máu

và gan cá basa, hỗn hợp đầu, vỏ tôm nhằm kiểm tra khả năng thu dịch đạm thuỷ

phân với hàm lượng acid amin cao hơn.

Thử nghiệm thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm trong các môi trường đệm khác như

đệm citrate-phosphat hoặc ủ lên men phế liệu trước khi thủy phân bằng CPE

protease đầu tôm nhằm ức chế sự thối rữa do vi sinh vật gây ra.

Thử nghiệm loại chất béo trước khi tiến hành thủy phân đối với cả hai đối tượng

máu và gan cá basa thu dịch đạm thủy phẩm, phế liệu đầu, vỏ tôm sú thu nhận

bột carotenoprotein.

Khảo sát tác dụng trợ lắng của chitosan khi kết tủa thu bột nhão carotenoprotein

với các nồng độ chitosan sử dụng khác nhau. Thử nghiệm thu bột nhão

caroteinoprotein với thời gian lắng lạnh khác nhau.

Thử nghiệm sử dụng các loại protease khác vào thủy phân đầu, vỏ tôm, so sánh

hiệu quả với enzyme protease thu nhận từ tôm sú.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



164

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Nguyễn Lệ Hà (2007), Protease từ nội tạng và đầu tôm sú Penaeus monodon,

các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách chiết và tính chất của chúng, Tạp chí Khoa

học-Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha trang.

2. Nguyễn Lệ Hà (2009), “Thử nghiệm thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa

bằng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ đầu tôm sú Penaeus monodon và

bước đầu tối ưu hóa quá trình, Tạp chí Khoa học –Công nghệ Thủy sản, Trường

Đại học Nha trang.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



165

TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO BẰNG TIẾNG VIỆT

1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thuỷ phân protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,

2. Nguyễn Trọng Cẩn (1983), Nghiên cứu ứng dụng enzyme proteaza của mốc A, oryzae để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, Báo cáo khoa học, Trường Đại học thủy sản Nha trang.

3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

4. Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng (2006), Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản, tập 1 Nguyên liệu chế biến thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

5. Nguyễn Cảnh (2000), Qui hoạch thực nghiệm, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

6. Nguyễn Hữu Chấn (1983), Enzyme và xúc tác sinh học, Nhà xuất bản Y học Hà nội.

7. Nguyễn Hữu Chấn (2000), Những vấn đề hoá sinh học hiện đại, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

8. Phạm thị Trân Châu và tập thể tác giả (1977), Nghiên cứu ứng dụng proteinaza ngoại bào của Bacillus pumilus, Báo cáo tại hội nghị sinh học các trường Đại học toàn quốc lần thứ nhất, Thành phố Hồ Chí Minh.

9. Phạm thị Trân Châu (1991), Proteinaza và ứng dụng, Báo cáo tại Hội thảo: Mở rộng khả năng chế biến thực phẩm thông qua công nghệ sinh học, Hà nội 8-10/10.

10. Phạm thị Trân Châu (1992), Nghiên cứu sử dụng enzyme protease để tăng nhanh quá trình chế biến cá, Báo cáo tại hội thảo khoa học chống thất thoát sau thu hoạch hải sản, Hà nội tháng 12.

11. Phạm thị Trân Châu (1993), Công nghệ enzyme và ứng dụng proteinaza trong công nghệ chế biến, Tạp chí Thủy sản, số 5.

12. Phạm thị Trân Châu và tập thể tác giả (1995), Protease đầu tôm biển, Tạp chí Thủy sản số 5.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



166

13. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1997), Hoá sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục.

14. Phạm thị Trân Châu (2006), Công nghệ sinh học, Tập 3, Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo dục.

15. Lương Hữu Đồng (1972), Nghiên cứu nước mắm ngắn ngày và quy trình nhiệt và sản xuất nước mắm ngắn ngày, Báo cáo khoa học - Viện nghiên cứu Hải sản Hải Phòng.

16. Lương Hữu Đồng (1975), Kỹ thuật sản xuất nước mắm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà nội.

17. Nguyễn Việt Dũng (1999), Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và phương pháp bảo quản nguyên liệu, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy Sản Nha Trang.

18. Huss và tập thể tác giả (1995), Cá tươi- chất lượng và các biến đổi về chất lượng, Tài liệu kỹ thuật thuỷ sản của FAO, No, 348, Rome, FAO,, Bản dịch của Bộ thuỷ sản- Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thuỷ sản SAEQIP, Nhà xuất bản nông nghiệp 2004.

19. Nguyễn Văn Lệ, Phạm thị Trân Châu, Nguyễn Đình Giai (1977), Kết quả bước đầu về thăm dò ứng dụng chế phẩm proteinaza ngoại bào Bac, pumilus ào quá trình thuỷ phân cá, Báo cáo khoa học - Viện nghiên cứu Hải sản Hải phòng.

20. Nguyễn Văn Lệ, Phạm thị Trân Châu, Nguyễn Văn Ngoạn (1995), “Một số chỉ tiêu sinh hoá của bột protein nhận được từ đầu tôm”, Tạp chí Thuỷ sản số 4/1995.

21. Nguyễn Văn Lệ (1996), Nghiên cứu và sử dụng proteinaza đầu tôm trong chế biến thuỷ sản, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

22. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Tp, Hồ Chí Minh.

23. Trần Thị Luyến (2006), Các phản ứng cơ bản và biến đổi của thực phẩm trong quá trình công nghệ, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



167

24. Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự (1992), Sử dụng enzyme trong việc tận thu phế liệu thủy sản có giá trị kinh tế thấp, Báo cáo khoa học tại Hội thảo khoa học: Chống thất thoát sau thu hoạch hải sản, Hải phòng.

25. Đỗ Văn Ninh, (2004), Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của proteza trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy Sản Nha Trang.

26. Lê Văn Nhương (1991), Công nghệ sinh học trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống Việt nam, Báo cáo khoa học Viện Công nghiệp thực phẩm Hà nội.

27. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1991), Kiểm nghiệm lương thực và thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà nội.

28. Nguyễn Tiến Thắng, (2003), Công nghệ enzyme protein, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp, Hồ Chí Minh.

29. Nguyễn Tiến Thắng (2003), Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh,

30. Đồng Thị Thanh Thu (2000), Sinh hoá ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.

31. Đồng Thị Thanh Thu (2004), Giáo trình Sinh hoá cơ bản, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên.

32. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (1997), Hoá sinh Công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

33. Trang Sĩ Trung, (2008),”Nghiên cứu ứng dụng chitosan trong việc thu hồi protein từ nước rửa surimi”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ thủy sản số 2/2008.

34. Trang Sĩ Trung, (2009), “Đánh giá chất lượng sản phẩm và hiệu quả môi trường của quy trình sản xuất chitin cải tiến kết hợp xử lý enzyme”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ thủy sản số1/2009.

CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO BẰNG TIẾNG ANH

35. Akiba Y,, Sato K,, Takahashi K và cộng sự (2001), “Meat color modification in broiler chickens by feeding yeast Phaffia rhodozyma containing high concentrations of astaxanthin” J. Appl. Poultry Research, 10: 154-161.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



168

36. Albuquerque-Cavalcanti C, D, Garcia-Carreno, F,L,, Navarrete Del Toro, M,A, (2002), Trypsin and Trypsin Inhibitors from Penaeid Shrimp, J, Food Biochem, 26, 233-251.

37. Albuquerque-Cavalcanti C., Garcia-Carreno F.L., Navarrete M.A. (2002), Trypsin and trypsin inhibitors from Penaeus shrimp”, J.Food Biochem. 26, 233-251.

38. Amano, (2002), Protease N “Amano” – Assay method for Protease activity (Amano method).

39. Amersham Pharmacia Biotech AB, (1999), Protein Purification Handbood, Snits &design AB, Sweden.

40. An, H., Peters, M.Y., & Seymour, T.A., (1996), “Role of endogenous enzymes in surimi gelation”, Trends in Food Science & Technology, 7, 321-327.

41. Armando Burgos-Hernandez (2005), “In vitro studies of the effects of aflatoxin B1 ans fumonisin B1 on trypsin-like and collagenase-like activity from the hepatopancreas of white shrimp (Litopenaeus vannamei)”, Aquaculture xx

42. Armenta R.E., Guerrero-Legarreta I., (2009), “Amino acid profile and enhancement of the enzymatic hydrolysis of fermented shrimp carotenoproteins”, Food Chemistry 112, 310-315.

43. Asgeirsson, B., & Bjarnason, J.B., (1991), “Structural and kinetic properties of chymotrypsin from Atlantic cod (Gadus morhua), Comparison with bovine chymotrypsin”, Comparative Biochemistry and Physiology, 99B, 327-335.

44. Asgeirsson, B., & Bjarnason, J.B., (1993), “Properties of elastase from Atlantic cod, a cold proteinase”, Biochimica et Biophysica Acta, 1164, 91-100.

45. Babu C.M., Chakrabarti R., Sambasivarao K., (2008), “Enzymatic isolation of carotenoid-protein complex from shrimp head waste and its use as a source of carotenoids”, LWT 41, 227-235.

46. Baranowski, E.S., Nip W.K., and Moy J.H., (1984), “Partial characterization of a crude enzyme extract from the freshwater prawn Macrabrachium rosenbergii”, J. Food Sci. 49, 1494-1495.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



169

47. Beddows, C,G,, & Ardeshir, A,G, (1979), “The production of soluble fish protein solution for use in fish sauce manufacture I. The use of added enzyme”, Journal of Food Technology, 14, 603-612.

48. Beddows, C.G., Ismail, M., & Steinkraus, K,H, (1976), “The use of bromelain in the hydrolysis of mackeral and the investigation of fermented fish aroma”, Journal of Food Technology, 11, 379-388.

49. Bernhard, K., “Synthetic astaxanthin. The route of a carotenoid from research to commercialization”, In: "Carotenoids: Chemistry and Biology," N, I, Krinsky et al, (editors), Plenum Press, New York, 1990, pp, 337-363.

50. Borrensen, T. (1992), “Biotechnology, by-products and aquaculture”, In E, G, Blingh (Ed,), Seafood science and technology (pp, 278-287), Oxford, UK: Maston Book Services Ltd.

51. Bradford, M.M., “A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical Biochemistry 72: 248-254, 1976.

52. Brewer, P., Helbig, N., Haard, N.F., (1984), “Atlantic cod pepsin, Characterization and use as a rennet substitute”, Canadian International Food Science and Technology Journal, 17, 38-43.

53. Britton G, (1995), “Structure and properties of carotenoids in relation to function”, FASEB J,, 9: 1551-1558.

54. Cano-Lopez,A., Simpson, B.K., & Haard,N.F., (1987), “Extraction of carotenoprotein from shrimp process wastes with the aid of trypsin from Atlantic cod”, J. Food Science, 52, 503-504, 506.

55. Ceccaldi H.J., (1967), “Studies on the carotenoprotein from the stomach wall of Aristeus antennatus”, Comp, Biochem, Physiol, 21, 435-438.

56. Celis-Guerrero L.E., Garcia-Carreno F.L., Navarrete M.A., (2004), ‘Characterization of proteases in the digestive system of spiny lobster Panulirus interruptus” , Mar. Biotechnol. 6, 262-269.

57. Chakrabarti R., (2002), “Carotenoprotein from tropical brown shrimp shell waste by enzymatic process”, Food Biotechnology, 16(1): 81-90.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



170

58. Chaveesuk, R,, Smith, J,P, & Simpson, B,K, (1993), “Production of fish sauce and acceleration of sauce fermentation using proteolytic enzymes”, J. Aquatic Food Product Technology, 2(3), 59-77.

59. Cheesman D.F., Lee W.L. & Zagalsky P.F. (1967), “Carotenoproteins in invertebrates”, Biol, Rev, 42, 131-160.

60. Chuapoehuk, P., & Raksakulthai, N., (1992), “Use of papain and bromelin in the production of oyster”, Asean Food Journal, 7, 196-199.

61. Cohen, T., & Gertler, A. (1981), “Pancreatic proteolytic enzymes from carp Cyprinus carpio I, Purification and physical properties of trypsin, chymotripsin, elatase and carboxypeptidase B”, Comparative Biochemistry and Physiology, 69B, 647-653.

62. Coperland R.A., (2000), Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism and data analysis, Wiley-VCH, Inc. 109-145.

63. Czeczuga B., & Krywuta S., (1981), “Investigations on carotenoprotein complexes in animals- II. The presence of carotenoproteins in the carapace of orconectes limosus (RAF,)”, Comp.Biochem. Physiol. 68B, 339-343.

64. D. Indra (2005), “Isolation, purification and characterization of collagenase from hepatopancreas of the land snail Achatina fulica”, Comp.Biochem. Physiol., part B 142.

65. De-Vecchi, S.D., & Coppes, Z., (1996), “Marine fish digestive proteases - relevance to food industry and south-west Atlantic region – a review”, Journal of Food Biochemistry, 20, 193 – 214.

66. Dixon, B, (1990), “Cod waste yields useful enzymes”, Biotechnology, 8, 791. 67. El-Shemy, M.G. (1997), “Characterization of affinity purified trypsin from

hybrid tilapia (Tilapia nilotica/ aurea)”, J. Food Biochemistry, 21, 163-175. 68. Ezquerra, J.M., Garcia-Carreno, F.L. & Haard, N.F., 1997, “Effect of feed diets

in digestive protease from the hepatopancreas of white shrimp (Penaeus vannamei)”, J. Food Biochem, 21,401-419.

69. Fehmerling, G.B., (1973), Separation of edible tissue from flish of marine creatures, US Patent 3729324.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



171

70. Ferrer, O.J., Koburger, J.A., Simpson, B.K., Gleenson, R.A., & Marshall, M.R., (1989), “Phenoloxidase levels in Florida spiny lobster (Panulirus argus): Relationship to season and molting stage”, Comparative Biochemistry and Physiology, 93B, 595-599.

71. Fong, W.P., Chan, E.Y,, & Lau, K.K., (1998), “Isolation of two chymotrypsins from grass carp”, Biochemistry and Molecular Biology International, 45, 409-418,

72. Foss, P.T., Storebakken, K. Scheidt & S. Liaaen-Jensen (1984), “Carotenoids in diets for salmonids, 1, Pigmentation of rainbow trout and sea trout with individual optical isomers of astaxanthin in comparison with canthaxanthin”, Aquaculture 41: 213-226.

73. Galgani, F., Benjamin, Y., Ceccaldi, H.J., (1984), “Identification of digestive proteinase of Penaeus kerathurus (Forskal): A comparison with Penaeus japonicus bate”, Comp. Biochem. Physiol. 78B, 355-361.

74. Garcia-Carreno F. L., Dimes L.E., Haard N.F., (1993), “Substrate-Gel Electrophoressis for composition and molecular weight of proteinases of proteinaceous proteinase inhibitors“, Analytical Biochemistry 214, 65-69.

75. Garcia-Carreno, F.L., & Haard, N.F.,(1992), “Characterization of proteinase classes in Langostilla (Pleuroncodes planipes) and crayfish (Pacifastacus astacus) extracts”, J. of Food Biochemistry, 17,97-113.

76. Gilberg, A., (1993), “Enzymic processing of marine raw materials”, Process Biochemistry, 28, 1-15.

77. Gilberg, A., Xian-Quan, S., (1994), “Recovery of tryptic enzymes from fish sauce”, Process Biochemistry, 29, 151-155.

78. Grisley,M.S.,& Boyle,P.R.,(1990), “Chitinase, a new enzyme in octopus saliva”, Comparative Biochemistry and Physiology,95B, 311-316.

79. Haard, N. F. (1998), “Speciality enzymes from marine organisms”, Food Technology, 53(7), 64-67.

80. Haard, N. F., & Simpson, B. K., (1994), “Protease from aquatic organisms and their uses in the seafood industry”, In A, M, Martin (Ed,), Fisheries processing: biotechnological applications (pp, 132-154), London, UK: Chapman and Hall.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



172

81. Haard, N.F. (1994), “Protein hydrolysis in seafoods”, In F, Shahidi, & J, R, Botta (Eds,), Seafood chemistry, processing technology and quality (pp, 11-33), Glasgow, UK: Blackie Academic and Professional.

82. Haard, N.F., (1986), “Atlantic cod protease, Characterization with casein and milk substrate and influence of separose immobilization on salt activation, temperature characteristics and milk clotting reaction”, Journal of Food Science, 51, 316-326.

83. Haard, N.F., Simpson, B.K., & Sikorski, Z.E., (1994), “Biotechnological applications of seafood proteins and other nitrogenous compounds”, In Z.E. Sikorski,B.S. Pan,& F., Shahidi(Eds.), Seafood proteins (pp, 194-216), New York,NY: Chapman and Hall.

84. Haard, N.F.,(1986), “Atlantic cod protease, characterization with casein and milk subtrate and influence of separose immobilization on salt activation, temperature characteristics and milk clotting reaction”, Journal of Food Science, 51,313-316.

85. Haard,N.F.,(1992), “A review of proteolytic enzymes from marine organisms and their application in the food industry”, Journal of Aquatic Food Product Technology, 1(1),17-35.

86. Hameed,K.S.,&Haard, N.F.,(1985), “Isolation and characterization of cathepsin C from Atlantic short finned squid Illex illecebrosus”, Comparative Biochemistry and Physiology, 82B,241-246.

87. Han, X. Q., (1993), Recovery of digestive enzymes from Atlantic cod (Gadus morhua) and their utilization in food processing, MSc Thesis, Dept, Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, St, John’s, NF, Canada.

88. Han,X.Q.,& Shahidi,F.,(1995), “Extraction of darp seal gastric proteases and their immobilization on chitin”, Food Chemistry,52,71-76.

89. Hitoshi Aoki và cộng sự (2004), “Partial purification of proteases that are generated by processing of the northern shrimp Pandalus borealis and which can tenderize beef”, Int. J. Food Sci. Tech., Vol.39.

90. Hitoshi Aoki, Nazmul Ahsan, Kenji Matsuo, Toshihiko Hagiwara, and Shugo Watabe (2002), “Purification and Characterization of Collagenolytic Proteases

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



173

from the Hepatopancrease of northern shrimp (Pandalus eous)”, J. Agric.Food Chem., 51 (3), 777-783.

91. Jensen, R. G., (1983), “Detection and determiantion of lipase (acylglycerol hydrolase) activity from various sources, Lipids”, 18, 650–657.

92. Jiang, S.T., Moody, M.W. & Chen, H.C., (1991), “Purification and characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp (Penaeus monodon)”, J. Food. Sci. 56, 322-326.

93. Jiang, S.T., Wang J.H., Chen S.S., (1991), “Purification and some properties of calpain II from tilapia muscle”, J. Agri. Food. Chem, 39, 237-241.

94. Johnson, E.A., T.G. Villa & M.J., Lewis (1980), “Phaffia rhodozyma as and astaxantin sourse in salmonid diets”, Aquaculture 20: 123-134,

95. Kawamura, Y,, Nishimura, K,, Matoba, T,, & Yonezawa, D., (1984), “Effects of protease inhibitors on the autolysis and protease activities of Antarctic krill”, Agricultural Biology and Chemistry, 48, 923–930.

96. Kim, H.R., Meyers, S.R., Godber, J.S., (1992), “Purification and characterization of anionic trypsins from the hepatopancreas of crayfish, Procambarus clarkia”, Comp. Biochem. Physiol.107B, 197-203.

97. Kinoshita, M., Toyohara, H., & Shimizu, Y., (1990), “Characterization of two distinct latent proteinases associated with myofibrils of crucian carp (Carassius auratus cuvieri)”, Comparative Biochemistry and Physiology, 97B, 315–319.

98. Kinsella, J. E., German, J. B., & Shetty, J., (1985), “Urease from fish liver: isolation and some properties”, Comparative Biochemistry and Physiology, 82B, 621-624.

99. Kinsella, J. E., German, J. B., & Shetty, J., (1985), “Urease from fish liver: isolation and some properties”, Comparative Biochemistry and Physiology, 82B, 621–624.

100. Klomklao S., Benjakul S., Visessanguan W., Kishimura H., and Simpson B.K., (2009), “Extraction of carotenoprotein from black tiger shrimp shells with the aid of bluefish trypsin”, J. Food Biochem. 33: 201-217.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



174

101. Koga, D., Mizuki, K., Ide, A., Kono, M., Matsui, T., & Shimizu, C., (1990), “Kinetics of a chitinase from a prawn, Penaeus japonicas”, Agricultural Biology and Chemistry, 54, 2505–2512.

102. Kolodziejska, I., & Sikorski, Z. E., (1996), “Neutral and alkaline muscle proteases of marine fish and aquatic invertibrates, A review”, Journal of Food Biochemistry, 20, 349–363.

103. Kristjansson, M.M., & Nielsen, H.H., (1992), “Purification and characterization of two chymotrypsin-like proteases from the pyloric caeca of rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss)”, Comprative Biochemistry and Physiology, 101B, 247–253.

104. Kristjansson, M.M., Gudmundsdottir, S., Fox, J.W., & Bjarnason, J.B., (1995), “Characterization of collagenolytic serine proreinase from the Atlantic cod (Gadus morhua)”, Comprative Biochemistry and Physiology, 110B, 707–717.

105. Lee S.H., & Min D.B., (1990), “Effects, quenching mechanisms, and kinetic of carotenoids in chlorophyll sensitized photooxidation of soybean oil”, J. Agric. Food Chem,, 38: 1630-1634.

106. Lee S.H., Roh S.K., Park K.H., Yoon K.R., (1999), “Effective extraction of astaxanthin pigment from shrimp using proteolytic enzymes”, Biotechnol, Bioprocess Eng,, 4(3): 199-204.

107. Lee, Y.Z., Simpson, B.K., & Haard N.F., (1982), “Supplementation of squid fermentation with protealytic enzymes”, Journal of Food Biochemistry, 6, 127-134.

108. Long A., & N.F., Haard (1988), “The effect of carotenoid-protein association on pigmentation and growth rates of rainbow trout (Salmoqairdneri)”, Bull. Aquacult. Assoc.Can. 4: 98-100.

109. Lundstrom, R.C., Correia, F. F., & Wilhelm, K. A., (1982),“ Enzymatic dimetylamine and formaldehyde production in minced American plaice and blackback flounder mixed with red hake TMAO-ase active fraction”, Journal of Food Science, 47, 1305–1307.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



175

110. Makinodan, Y., Kyaw, N.N., & Ikeda, S., (1982), “Intercellular distribution of fish muscle alkaline proteinase”, Comparative Physiology and Biochemistry, 73B, 785–789.

111. Makinodan, Y., Toyohara, H., & Ikeda, S., (1983), “Combined action of carp muscle cathepsins A and D on proteins”, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 49, 1153–1161.

112. Manu-Taiwah, W., & Haard, N.F., (1987), “Recovery of carotenoprotein from the exoskeleton of snow crab (Chinocetes opilio)”, Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 20, 31-33,

113. Matsumiya, M., & Mochizuki, A., (1997), “Purification and characterization of chitinase from the liver of Japanese common squid Todarodes pacificus”, Fisheries Science, 63, 409–413.

114. Melba G. Bondad-Reantaso, Sharon E. McGladdery, Iain East, Rohana P. Subasinghe, (2001), “Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases”, FAO Fisheries Technical Paper No.402, Supplement 2, Rome, FAO, 240 p.

115. Menzefricke, K., (1997), “Enzyme demand set for steady expansion”, The World of Ingredients, 2, 38–39.

116. Mercadante, A., (1999) New carotenoids: recent progress, Invited Lecture 2, Abstracts of the 12th International Carotenoid Symposium, Cairns, Australia, July 1999.

117. Merriam-Webster Online Dictionary, (2008), “Shrimp”, Retrieved October 13, 2008.

118. Miki W., (1991), “Biological function and activities of animal carotenoids”, Pure & Appl. Chem., 63: 141-146.

119. Mohr,V.,(1980), “Enzymes technology in the meat and fish industries”, Proc. Biochem., 8/9, 18–21 32.

120. Navarrete M.A., Garcia-Carreno F. L., Manuel D.L., Celis-Guerrero L. and Saborowski R., (2006), ”Aspartic proteinases in the digestive tract of marine decapod crustaceans”, J. Exp.Zool. 305A, 645-654.

121. Nilsen, K., Viana, M.T., & Raa, J., (1989), “Biotechnology in squid processing: removing skins enzymatically”, Infofish International, 2, 27–28.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



176

122. Nip, W. K., Lan, C., & Moy, J. H., (1985), ‘Partial charcterization of a collagenolytic enzyme fraction from the hepatopancreas of the freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii”, Journal of Food Science, 50, 1187–1188,

123. Ockerman, H. W., (1992), “Fishery by-products”, In G.M., Hall (Ed.), Fish processing technology (pp. 155–192), Glasgow, UK: Blackie Academic and Professional.

124. Oh, E.S., Kim, D.S., Kim, J.H. & Kim, H.R., (2000), “Enzymatic properties of a protease from the hepatopancrease of shrimp, Penaeus orientalis”, J. Food Biochem, 24, 251-264.

125. Olsen, R. L., Johanson, A., & Myrnes, B. (1990), “Recovery of enzymes from shrimp wastes”. Processing Biochemistry, 25, 67-68.

126. Ong A.S.H. & E.S. Tee (1992), “Natural sources of carotenoids from plants and oil”, Meth. Enzymol., 213: 142-167.

127. Orejana, F. M., & Liston, J. (1981), “Agents of proteolysis and its inhibition in patis (fish sauce) fermentation” Journal of Food Science, 47, 198–203 209.

128. Oshima, T. (1996), “By-products and seafood production in Japan” Journal of Aquatic Food Product Technology, 5(4), 27–42.

129. Owens, J. D., & Mendoza, L. S. (1985), “Enzymically hydrolysed and bacterially fermented fishery products” Journal of Food Technology, 20, 273–293.

130. Pham Van Hau and Benjakul S., (2006), “Purification and characterization of trypsin from pyloric caeca of bigeye snapper Pricanthus macracanthus”, J. Food Biochem. 30, 478-495.

131. Raa, J. (1990), “Biotechnology in aquaculture and the fish processing industry: a success story in Norway”. In M. N. Voigt, & J. R. Botta (Eds.), Advances in fisheries technology for increased profitability (pp. 509-524). Lancaster, PA: Technomic Publication Company.

132. Raa, J. (1997), “Newcommercial products from waste of the fish processing industry”. In A. Bremner, C. Davis and B. Austin (Eds.) Making the most of the catch, (pp. 33–36), Proceedings of the Seafood Symposium, AUSEAS, Brisbane, Australia.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



177

133. Raa, J., & Walther, B. T. (1998), “Purification and characterization of chymotrypsin, trypsin and elastase like proteinase from cod Gadus morhua L.”, Comparative Biochemistry and Physiology, 93B, 317-324.

134. Raksakulthai, N., Lee, Y. Z., & Haard, N. F. (1986), “Effect of enzyme supplements on the production of fish sauce prepared from male capelin Mallotus villosus”. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 19, 28–33.

135. Roy Philippe et al (1996), “Purification, kinetical and molecular characterizations of a serin collagenolytic of a serine collagenolytic protease from Greenshore Crab Carcinus maenas”. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 115B, No 1.

136. Rudolf, E. (1990), Process for the preparation of fish skin, Canadian Patent 1267753.

137. Sachindra N.M., Mahendrakar N.S. (2005), “Process optimization for extraction of carotenoids from shrimp waste with vegetable oils”, Bioresource Technology, 96: 1195-1200.

138. Sanchez-Chiang, L., & Ponce, O., (1981), ‘Gastric sinogens and gastrisins from Merluccaius gayi-purification and properties”, Comparative Biochemistry and Physiology, 68B, 251–257.

139. Seung H.L, Seung K.R., Ki H.P. & Kwang R.Y. (1999), “Effective extration of astaxanthin pigment from shrimp using proteolytic enzymes”, Biotechnol. Bioprocess Eng. 4(3), 199-204.

140. Shahidi F. & Botta F.R. Eds. (1994), Seafoods: Chemistry, processing, technology and quality. Chapman and Hall. Londres.

141. Shahidi F. and Synowiecki J. (1991), “Isolation and Characterization of Nutrients and Value-Added Products from Snow Crab (Chinoecetes opilio) and Shrimp (Pandalus borealis) Processing Discards”, J. Agric. Food Chem., 39: 1527-1532.

142. Shahidi, F. (1994), “Proteins from seafood processing discards”, In Z.E. Sikorski, B. S. Pan, & F. Shahidi (Eds.), Seafoods proteins (pp. 171–193). NewYork, NY: Chapman and Hall.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



178

143. Shamsuzzaman, K., & Haard N. F. (1983), “Evaluation of harp seal gastric protease as a rennet substitute for cheddar cheese”, Journal of Food Science, 48, 179-182.

144. Shamsuzzaman, K., & Haard, N. F. (1984), “Purification and characterization of a chymosin-like protease from gastric mucosa of harp seal (Paophilus groenlandicus)”, Canadian Journal of Biochemistry and Cell Biology, 62, 699–708.

145. Shann-tzong jiang et al. (1992). “Comparative study on the Cathepsin D from banded shrimp (Penaeus japonicus) and grass shrimp (Penaeus monodon)”, J. Agric. Food Chem., 40.

146. Shenderyuk, V. I., & Bykowski, P. J (1990). “Salting and marinating of fish”. In Z. E. Shirorski (Ed.), Seafood: resources, nutritional composition, and preservation (pp. 147-162). Boca Raton, FL: CRC Press.

147. Shotton, D.M. (1970). In S. P. Colowik, & N. O. Kaplan (Eds.), Methods in enzymology (pp. 113–140). Academic Press, NewYork.

148. Simpson, B. K., & Haard, N. F. (1984a), “Trypsin from Greenland cod as a food-processing aid”, Journal of Applied Biochemistry, 6, 135–143.

149. Simpson, B. K., & Haard, N. F. (1984b), “Trypsin from Greenland cod, Gadus ogac. Isolation and comparative properties”, Comparative Biochemistry and Physiology, 79B, 613–622.

150. Simpson, B. K., & Haard, N. F. (1987), “Cold-adapted enzymes from fish”, In D. Knorr (Ed.), Food Biotechnology (pp. 495-527), New York, NY: Marcel Dekker.

151. Simpson, B. K., Dauphin, L., & Smith, J. P. (1992), “Recovery and characterization of carotenoprotein from lobster (Homarus americanus) waste”. Journal of Aquatic Food Product Technology, 1(3), 129–146.

152. Simpson, B.K., & Haard, N.F, (1984). “Purification and characterization of trypsin from the Greenland cod (Gadus ogac)”. Can. J. Biochem. Cell. Biol., 62, 894-900.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



179

153. Simpson, B.K., Simpson, M. V., & Haard, N. F. (1989), ‘On the mechanism of enzyme action: digestive proteases from selected marine organisms”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 11, 226–234.

154. Simpson, B.K., Smith, J.P., & Haard, N.F. (1991), “Marine enzymes”, In Y. H. Hui (Ed.), Encyclopedia of Food Science and Technology (pp. 1645-1653). New York, NY: John Wiley and Sons.

155. Stefansson, G. (1988), “Enzymes in the fishing industry”, Food Technology, 42(3), 64–65.

156. Stefansson, G., & Steingrimsdottir, U. (1990), “Application of enzymes for fish processing in Iceland – present and future aspects”, In M. N. Voigt & J. R. Botta (Eds.), Advances in fisheries technology for increased profitability (pp. 237-250). Lancaster, PA: Technomic Publication.

157. Strom, T., & Raa, J. (1982), “A newprocessing method for small pelagic fishes”. Infofish Marketing Digest, 3, 24–27.

158. Strom, T., & Raa, J. (1993), “Marine biotechnology in Norway”, Journal of Marine Biotechnology, 1, 3–7.

159. Synowiecki J., Al-Khateeb N.A., (2000), “The recovery of protein hydrolysate during enzymatic isolation of chitin from shrimp Crangon crangon processing discards”, Food Chemistry 68, 147-152.

160. Tolasa S., Cakli S., Ostermeyer U., (2005), Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid, Eur. Food Res. Technol 221, 787-791.

161. Torrissen O.J. & Christiansen R. (1995), “Requirements for carotenoids in fish diets”, J. Appl. Ichthyol, 11: 225-230.

162. Tsai I.H., Lu P.J and Chuang J.L. (1991), “The midgut chymtrypsins of shrimps (Penaeus monodon, Penaeus japonicas and Penaeus penicillatus)”, Biochimica et Biophysica Acta 1080: 59-67

163. Venugopal, V., & Shahidi, F. (1995), “Value-added products from underutilized fish species”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35, 431–453.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



180

164. Walsh, K. A., & Wilcox, P. E. (1970), “Serine proteases”, In G.E. Perlmann, & L. Lorand (Eds.), Methods in enzymology (pp. 31–41), NewYork, NY: Academic Press.

165. Windsor, M., & Barlow, S. (1981), Introduction to fishery by-products, Farnham, UK: Fishing News Books.

166. Zagalsky P.F. (1976), “Carotenoid-protein complexes”, Pure appl. Chem. 47, 103-120.

167. Zagalsky P.F. (1984), “Invertebate Carotenoprotein”, In Methods in Enzymology (pp. 216-247). New York, NY: Academic Press.

168. Zagalsky P.F., Cheesman D.F. & Ceccaldi H.J. (1967), “Studies on carotenoid-containing lipoproteins isolated from the eggs and ovaries of certain marine inverterbrates”, Comp. Biochem. Physiol. 34, 579-607.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



1

PHỤ LỤC A

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỬ DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU

1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có

độ nhạy cao, có thể xác định tới 1g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ưu điểm

lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

protein, nhất là amoniumsulfate.

1.1 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang

tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng

hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang

dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ

hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung

dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc

nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch

bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với

lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD

= ODX – ODO. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa

vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein

tương ứng trên trục hoành.

1.2 Hoá chất

Dung dịch albumine 0.1%.

Nước cất

Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



2

o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g.

o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g.

o Phosphoric acid: 85%.

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hoà tan trong ethnol trong một chai

đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nước cất.

Lắc đều và giữ lạnh dưới 4oC.

1.3 Tiến hành

Dựng đường chuẩn albumine

Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40,

50, 60, 70, 80, 90, 100 g/ml.

Bảng 1.1. Dựng đường chuẩn albumine

Ống nghiệm Đối

chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ

(g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch

albumin chuẩn

(l)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Nước cất (l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Thuốc thử

Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi pha

đúng nồng độ, để khoảng 20 phút.

Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm.

Dựng đường chuẩn.

Định lượng protein trong mẫu thí nghiệm

Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford.

Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.

Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



3

Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn.

1.4 Tính toán kết quả

Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm

lượng protein của mẫu là X (g/ml) có trong m (g) nguyên liệu.

Vậy lượng protein có trong 1 gam nguyên liệu là:

Hàm lượng protein (mg/g) =

2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (phương pháp

Amano)

2.1 Nguyên tắc

Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein của

enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng

phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin

tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme.

2.2 Vật liệu, hoá chất và thiết bị

Hoá chất

HCl 0.1 M

Na2CO3 0.4 M

Dung dịch Trichloracetic 0.4 M

Tyrosin tinh khiết

NaOH 0.1 M

Thuốc thử Folin

H3PO4 1/30 M

Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M

Dụng cụ và thiết bị

Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc.

Bể ổn nhiệt

Máy đo quang phổ UV – Vis

Máy đo pH

X 1000. m

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



4

2.3 Các bước tiến hành

Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Bảng 1.2. Đường chuẩn tyrosine.

Ống số Đối

chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ (g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch tyrosine

chuẩn (l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch HCl

(l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Thuốc thử Folin

(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 100 gtyrosine / mlHCl như bảng 3.3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào

dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào

dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20

phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10,

As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. As100

Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ hấp

thu của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso.

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ

được giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ

protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.

Xác định hoạt tính enzyme protease

Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7.

Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C trong 10

– 15 phút.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



5

Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp

này ở 37 0,50C trong một giờ.

Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme.

Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để

loại tủa.

Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc.

Thêm 1 ml thuốc thử Folin.

Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút.

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm (ghi

nhận kết quả này là Am).

Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành

các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp

thụ là A0.

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách

lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt

tínhprotease theo tính toán sau :

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme

để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch lọc

dưới điều kiện thí nghiệm.

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) =

F = [10/As10 + 20/As20 + 30/As30 + 40/As40 + 50/As50 + 60/

As60 + 70/As70 + 80/As80 + 90/As90+100/As100]/10

Am : độ hấp thu của mẫu

A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng

F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước

sóng 660 nm trên đường chuẩn.

n : Hệ số pha loãng của enzyme

1/100 : Hệ số chuyển đổi

(Am – A0).F.1/100.n.V m

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



6

V : Thể tích của dung dịch enzyme

m : khối lượng chế phẩm enzyme thô.

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease: từ kết quả hàm lượng

protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính hoạt tính riêng của

enzyme.

HTR (UI/mg) =

3. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel

3.1 Dụng cụ và thiết bị

Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ.

Phễu đổ gel.

Bình hút chân không.

Flow adaptor 1,5 cm.

Cột sắc ký Bio-rad, kích thước 50 x 1,5 cm; thể tích: 88 ml (thể tích = chiều

cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 () = 50 x (1,5/2)2 x 3,14).

Bình đựng dung dịch đệm.

Ống nghiệm: 50 cái..

Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch.

3.2 Hóa chất

Gel Bio-Gel P-100 của hãng Bio-Rad

Gel Bio-Gel P 150 của hãng Bio-Rad

Đệm phosphate 0.1M; pH 7.0: đã khử bọt khí.

3.3 Các bước tiến hành

Chuẩn bị gel

Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



7

Cân 4g gel Bio-Gel P100 dùng chạy sắc ký tinh sạch enzym protease khô, cho

bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1M pH 7.0 đựng trong cốc. Đối với

Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 20oc để hydrate hóa. Sau khi thể huyền phù đồng nhất

của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, chỉ cần để ổn định trong suốt quá

trình hydrate hóa.

Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung

dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung

dịch trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình.

Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề

mặt bằng cách hút để lọai các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90%

hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy

20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. tránh

làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình

thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy

gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow

adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể

tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột

và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền

bằng cách dùng xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.

Chuẩn bị mẫu

Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn); hòa

tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45

micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột.

Thu và xác định mẫu tách được.

Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ

sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP-Data

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



8

view trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân

đoạn 2 ml.

3.4 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch

Thu các fraction chứa dịch enzyme protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến

hành xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 và hàm

lượng protein theo phương pháp Bradford.

Hàm lượng protein sau tinh sạch tính bằng đơn vị mg protein/ ml dung dịch

enzyme sau tinh sạch.

Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch tính bằng đơn vị UI/ ml dung dịch

enzyme sau tinh sạch.

3.5 Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau

tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.

Trong đó:

HTenzyme1: hoạt tính enzyme protease trước tinh sạch (đvht/ml dung dịch enzyme

trước tinh sạch).

HTtenzyme2: hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (đvht/ml dung dịch enzyme

sau tinh sạch).

Trong đó:

Hlproteainsautinhsach: hàm lượng protein sau tinh sạch

Hoattinhriengenzyme1: hoạt tính riêng của enzyme protease trước tinh sạch.

Hiệu suất về hoạt tính enzyme 10012 x

HTenzymeHTenzyme

Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch (dvht/mg) autinhsachHLproteins

HTenzyme2

Độ tinh sạch của enzyme protease sau sắc ký 12

engenzymeHoattinhriengenzymeHoattinhri

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



9

Hoattinhriengenzyme2: hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch.

4. Xác định trọng lượng phân tử - Điện di

4.1 Thiết bị và dụng cụ

Bộ điện di đứng.

Bộ nguồn chạy điện di Bio-Rad.

Pipetteman.

Đầu típ.

Eppendorf.

Dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp...).

4.2 Chuẩn bị hộp điện di

Khuôn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di phải được rửa sạch và lau khô

bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel

Chuẩn bị gel phân tích (nghiên cứu này dùng gel polyacrylamide 12%), khuấy đều và

nhanh chóng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel. Gel sẽ được bơm đến vạch

cách lược là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp

một lớp nước cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ đông lại trong 20-

30 phút.

4.3 Đổ gel tập trung

Gel tập trung được pha ở nồng độ 4 %. Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ.

Trước khi đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nước phía trên gel phân tích bằng cách

nghiêng và dùng giấy thấm.

Tương tự gel phân tách, sau khi chuẩn bị xong, dung dịch phải được đưa nhanh vào

khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nước trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập

trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược được đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp

bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ đông tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu

lại các vị trí lỗ giếng.

Đưa mẫu vào các giếng

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



10

Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy

dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ điện di Cẩn thận lấy lược ra

và cho mẫu vào các giếng. Lượng mẫu là 10 μl đưa vào các lỗ giếng. Chú ý không

để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng để dễ

thảo luận sau này.

Chạy điện di: Sau khi hoàn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di

lại và cho dòng điện đi qua. Thời gian để chạy điện di là 2 giờ. Ta có thể quan sát

quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Coomassie

Brilliant blue 0,1%

Nhuộm gel: Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung

dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên

máy lắc.

Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và

đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu

nền và các băng protein hiện rõ trên gel.

Phân tích kết quả, chụp hình gel.

Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các

band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.

Tính giá trị Rf :

Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và

các giá trị Rf của chúng.

Trọng lượng phân tử của các protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể

xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phương trình của đồ thị.

Rf = Khoảng cách di chuyển của protein

Khoảng cách di chuyển của vạch màu

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



11

PHỤ LỤC B KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Bảng 3.1 Hoạt độ protease (U/g nội tạng tôm) khi chiết rút bằng các tác nhân chiết khác nhau với tỉ lệ nội tạng: dịch chiết khác nhau

Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v)

Tác nhân chiết Nước cất

NaCl

Đệm

phosphate Đệm Tris-

HCl 1:0,5 148,84 126,24 1:1,0 223,65 224,76 270,90 295,60 1:1,5 275,22 306,15 1:2,0 303,38 358,52 431,84 431,88 1:2,5 330,55 388,08 1:3,0 342,24 446,67 472,29 537,75 1:3,5 407,58 429,77 1:4,0 402,24 402,76 492,92 614,16 1:4,5 377,24 359,10 1:5,0 348,00 323,25 568,15 701,60 1:6 611,28 758,58 1:7 671,93 857,43 1:8 642,16 811,68 1:9 633,06 756,99 1:10 627,90 734,00

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



12

Bảng 3.2 Hoạt độ protease (U/g đầu tôm) khi chiết rút bằng các tác nhân chiết khác nhau với tỉ lệ đầu tôm: dịch chiết khác nhau



NaCl

Đệm

phosphate Đệm Tris-

HCl 1:0,5 45,79 44,30 1:1,0 71,51 66,29 85,27 89,77 1:1,5 83,24 69,53 1:2,0 95,58 71,84 119,80 128,54 1:2,5 97,58 77,88 1:3,0 99,66 82,56 131,22 158,88 1:3,5 66,85 103,18 1:4,0 66,04 80,92 138,80 161,84 1:4,5 65,66 60,98 1:5,0 61,70 59,60 151,85 180,60 1:6,0 197,10 200,94 1:7,0 179,48 207,90 1:8,0 166,16 177,44 1:9,0 165,15 171,00 1:10 161,90 134,70

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



13

Bảng 3.3 Hoạt độ riêng protease (U/mg) khi chiết rút bằng các tác nhân chiết khác nhau với tỉ lệ nội tạng: dịch chiết khác nhau

Tỷ lệ nội tạng: dung môi (w/v)


NaCl

Đệm phosphate

Đệm Tris-HCl

1:0,5 25,5730 26,7614 1:1,0 27,0763 28,7766 30,2682 32,5193 1:1,5 27,2226 27,5639 1:2,0 26,1534 27,3947 27,8966 29,6621 1:2,5 24,8534 26,2377 1:3,0 22,9537 25,9761 22,9156 30,1261 1:3,5 24,9893 25,5972 1:4,0 25,5228 24,7317 21,0650 28,1725 1:4,5 25,7147 23,8522 1:5,0 26,0674 24,1105 20,2911 27,8966 1:6,0 19,0430 27,1892 1:7,0 19,6299 26,8671 1:8,0 17,7196 27,0565 1:9,0 16,9087 26,8722 1:10 15,3521 27,1852

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



14

Bảng 3.4 Hoạt độ riêng protease (U/mg) khi chiết rút bằng các tác nhân chiết khác nhau với tỉ lệ đầu tôm: dịch chiết khác nhau


Tác nhân chiết

Nước cất NaCl Đệm phosphate

Đệm Tris-HCl

1:0,5 45,79 44,30 1:1,0 71,51 66,29 85,27 89,77 1:1,5 83,24 69,53 1:2,0 95,58 71,84 119,80 128,54 1:2,5 97,58 77,88 1:3,0 99,66 82,56 131,22 158,88 1:3,5 66,85 103,18 1:4,0 66,04 80,92 138,80 161,84 1:4,5 65,66 60,98 1:5,0 61,70 59,60 151,85 180,60 1:6,0 197,10 200,94 1:7,0 179,48 207,90 1:8,0 166,16 177,44 1:9,0 165,15 171,00 1:10 161,90 134,70

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ protease nội tạng và đầu tôm

Thời gian chiết (phút)

Hoạt độ riêng tương đối (%)

Hoạt độ riêng protease (U/mg)

Nội tạng Đầu tôm Nội tạng Đầu tôm 20 84,44 81,48 23,5308 4,5678 30 86,49 89,29 24,1024 5,0055 40 94,61 100,00 26,3648 5,6058 50 98,44 95,95 27,4317 5,3786 60 100,00 88,43 27,8662 4,9570 70 76,95 87,90 21,4430 4,9275 80 74,01 85,07 20,6230 4,7689 90 70,41 81,28 19,6216 4,5566

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



15

Bảng 3.6 Hoạt độ riêng protease (U/mg) của CPE từ nội tạng tôm khi kết tủa bằng các tác nhân khác nhau


Tác nhân kết tủa (NH4)2SO4 Aceton Ethanol

50,0 31,628 15,139 7,825 55,0 36,954 23,115 - 60,0 37,417 32,572 - 65,0 47,880 35,585 - 66,7 - - 33,057 70,0 55,660 38,704 - 75,0 46,660 36,781 40,500 80,0 34,270 28,500 53,070 83,3 - - 48,980 85,7 - - 47,230 87,5 - - 42,560 88,9 - - 37,580

Bảng 3.7 Hoạt độ riêng protease (U/mg) của CPE từ đầu tôm khi kết tủa bằng các tác nhân khác nhau


Tác nhân kết tủa (NH4)2SO4 Aceton Ethanol

50,0 31,628 15,139 7,825 55,0 36,954 23,115 - 60,0 37,417 32,572 - 65,0 47,880 35,585 - 66,7 - - 33,057 70,0 55,660 38,704 - 75,0 46,660 36,781 40,500 80,0 34,270 28,500 53,070 83,3 - - 48,980 85,7 - - 47,230 87,5 - - 42,560 88,9 - - 37,580

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



16

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ protease nội tạng và đầu tôm

Thời gian chiết (phút)

Hoạt độ riêng tương đối (%)

Hoạt độ riêng protease (U/mg)


Bảng 3.9 Xác định trọng lượng phân tử protease tôm sú

Phân tử lượng M (kDa)

Khoảng cách di chuyển

Rf

ln M

200000 2,5 0,0472 12,1548 116250 4,5 0,0849 11,6635 97400 7,5 0,1415 11,4866 66200 9,0 0,2321 11,1004 45000 19,0 0,3585 10,7144 31000 26,0 0,4906 10,3417 21500 36,0 0,6792 9,9758 14400 41,5 0,7830 9,5750 6500 48,0 0,9057 8,7796

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



17

Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease tôm sú

Nhiệt độ Hoạt độ tương đối (%) Hoạt độ protease

Nội tạng Đầu tôm Nội tạng Đầu tôm 0 0,00 0,00 0,000 0,000

12 2,71 1,43 53,784 7,360 27 16,39 14,77 325,883 68,932 32 28,97 23,62 575,932 110,212 37 49,82 35,31 990,300 164,779 42 59,70 52,20 1186,732 243,576 47 69,87 63,60 1388,769 296,784 52 83,25 78,95 1654,780 368,425 57 89,82 88,65 1785,400 413,668 62 100,00 100,00 1987,778 466,650 67 84,91 83,46 1687,900 389,453 72 63,78 49,89 1267,894 232,800 77 27,27 34,80 542,120 162,400 82 10,74 16,67 213,465 77,800 87 3,36 7,07 66,784 32,980

Bảng 3.11 Độ bền nhiệt của protease tôm sú

Nhiệt độ (oC) Họat độ tương đối (%) Hoạt độ protease Nội tạng Đầu tôm Nội tạng Đầu tôm

37 100,00 100,00 1598,000 879,760 42 99,82 98,67 1595,124 868,059 47 97,36 95,66 1555,813 841,578 52 96,70 91,78 1545,266 807,444 57 82,76 83,41 1322,505 733,808 62 66,76 71,37 1066,825 627,885 67 32,78 41,54 523,824 365,452 72 9,78 12,38 156,284 108,914 77 2,36 5,46 37,713 48,035

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



18

Bảng 3.12 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease tôm sú

pH Hoạt độ tương đối (%) Hoạt độ protease

Nội tạng Đầu tôm Nội tạng Đầu tôm 1 5,41 8,94 42,700 97,380 2 9,86 16,50 77,843 179,800 3 13,23 30,06 104,500 327,613 4 17,05 33,33 134,600 363,247 5 17,49 37,28 138,135 406,323

5,5 23,98 37,84 189,368 412,370 6 43,92 38,47 346,780 419,218

6,5 61,58 57,02 486,200 621,360 7 83,43 81,64 658,760 889,646

7,5 100,00 100,00 789,600 1089,780 8 75,58 57,31 596,780 624,560 9 46,32 44,27 365,743 482,475

10 38,39 40,23 303,150 438,436 11 32,63 30,34 257,640 330,623 12 24,02 21,85 189,670 238,132

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



19

Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng độ muối đến hoạt độ protease Nồng độ muối

(%) Hoạt độ tương đối (%) Hoạt độ protease


11 73,24 70,75 1687,732 339,560 13 68,61 68,42 1581,223 328,350 15 63,64 57,99 1466,563 278,320 17 57,36 52,87 1321,746 253,760 19 47,68 45,54 1098,761 218,560 21 40,68 40,93 937,453 196,430 23 34,68 29,26 799,217 140,440 25 19,99 18,41 460,774 88,364 27 14,69 14,03 338,424 67,342 29 7,22 9,30 166,437 44,642

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ protease

Tác nhân

Hoạt độ tương đối (%)


Nội tạng Đầu tôm Nội tạng Đầu tôm ĐC 100,00 100,00 678,90 472,57

Mo2+ 82,80 96,16 562,16 454,44 Pb2+ 87,34 89,46 592,94 422,76 Zn2+ 70,74 73,08 480,26 345,37 Mg2+ 87,28 93,38 592,53 441,30 Ba2+ 92,78 87,35 629,89 412,78 Co2+ 79,95 84,38 542,78 398,77 Ca2+ 90,20 113,61 612,38 536,87 Cu2+ 156,25 120,17 1060,78 567,88 Mn2+ 169,60 189,77 1151,40 896,78 Fe2+ 106,89 130,09 725,68 614,79 Hg2+ 53,66 50,46 364,30 238,46

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



20

Bảng 3.15 Kết quả xác định động học phản ứng thủy phân của protease tôm sú

Nồng độ cơ chất (mM)

Hàm lượng tyrosin

tạo thành (µg/ml)

Tốc độ phản ứng

V

1/[S]

1/V

log [S]

log[v/(Vmax-v)]

0,01 90,67 4,47 100,00 0,22386 -2,00000 -0,44434 0,02 141,23 9,52 50,00 0,10501 -1,69897 0,13888 0,03 189,02 14,30 33,33 0,06992 -1,52288 0,74177 0,04 202,84 15,68 25,00 0,06376 -1,39794 1,11259 0,05 206,65 16,07 20,00 0,06225 -1,30103 1,28748 0,06 210,12 16,41 16,67 0,06093 -1,22185 1,53257 0,07 212,35 16,63 14,29 0,06012 -1,15490 1,80772 0,08 213,48 16,75 12,50 0,05971 -1,09691 2,05990 0,10 214,24 16,82 10,00 0,05944 -1,00000 2,37958

Bảng 3.16 So sánh quá trình thủy phân dịch hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt


Hàm lượng peptid & acid amin (g/l)

Hỗn hợp tươi Hỗn hợp gia nhiệt 0 0,159 0,169 2 0,217 0,630 4 0,368 0,960 6 0,521 1,361 8 0,652 1,840

10 0,932 2,320 12 1,030 2,570

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



21 Bảng 3.17 Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin trong dịch thủy phân (g/l) ở các điều kiện khác nhau

Nồng độ

CPE sử

dụng (%)

Nhiệt độ

thủy phân (oC)


0 1 2 4 6 7 9 11 13 15 16 18 20 0,5 40 0,163 0,244 0,275 0,380 0,483 0,500 0,619 0,830 0,930 1,002 1,037 0,919 0,806 0,5 50 0,163 0,230 0,319 0,460 0,654 0,723 0,900 1,270 1,535 1,731 1,717 1,471 1,160 0,5 60 0,163 0,365 0,444 0,790 1,020 1,240 1,470 1,700 1,900 2,210 2,280 1,833 0,806 0,5 65 0,163 0,200 0,290 0,420 0,623 0,695 0,856 1,123 1,465 1,653 1,712 1,470 0,980 2 40 0,169 0,251 0,510 0,700 0,951 1,142 1,280 1,471 1,530 1,640 1,700 1,640 1,530 2 50 0,169 0,520 0,630 0,960 1,361 1,630 2,120 2,450 2,700 2,950 2,900 2,640 1,744 2 60 0,169 0,575 1,000 1,360 1,740 1,900 2,281 2,570 2,790 2,953 3,030 2,782 1,592 2 65 0,169 0,398 0,568 0,861 1,253 1,520 1,897 2,280 2,600 2,865 2,865 2,562 1,652

3,5 40 0,179 0,383 0,673 1,102 1,244 1,340 1,640 1,900 2,093 2,400 2,503 2,451 2,258 3,5 50 0,179 0,700 0,929 1,530 2,029 2,220 2,640 3,084 3,300 3,382 3,280 3,138 2,203 3,5 60 0,179 0,862 1,368 1,890 2,458 2,621 2,900 3,210 3,470 3,623 3,700 3,520 2,258 3,5 65 0,179 0,598 0,897 1,270 1,840 2,124 2,590 2,950 3,214 3,299 3,221 3,025 2,169 4,5 40 0,186 0,781 1,030 1,360 1,723 1,823 2,031 2,264 2,452 2,624 2,744 2,713 2,579 4,5 50 0,186 1,174 1,523 2,108 2,530 2,793 3,130 3,467 3,750 3,980 4,000 3,820 3,350 4,5 60 0,186 1,220 1,700 2,200 2,720 3,030 3,256 3,503 3,750 4,000 3,980 3,752 2,880 4,5 65 0,186 0,800 1,220 1,897 2,365 2,633 3,025 3,400 3,720 3,850 3,880 3,750 3,265

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



22

Bảng 3.18 Tóm lược phân tích ANOVA các thông số của quá trình thủy phân máu và gan cá basa Analysis Summary Dependent variable: HL Factors: C T tg Number of complete cases: 208

Bảng 3.19 Phân tích ANOVA cho hàm HL với các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng Analysis of Variance for HL - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 70,8787 3 23,6262 2332,66 0,0000

B:T 18,828 3 6,276 619,64 0,0000

C:tg 143,678 12 11,9732 1182,13 0,0000

INTERACTIONS

AB 1,32528 9 0,147253 14,54 0,0000

AC 11,2519 36 0,312552 30,86 0,0000

BC 6,2432 36 0,173422 17,12 0,0000

RESIDUAL 1,09387 108 0,0101284

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 253,299 207

--------------------------------------------------------------------------------

All F-ratios are based on the residual mean square error,

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



23

Bảng 3.20 Tóm lược phân tích ANOVA các thông số sử dụng trong tối ưu hóa bằng phương pháp hồi qui

Bảng 3.21 Phân tích ANOVA cho hàm HL với các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng

Analysis of Variance for HL - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 16,0051 2 8,00253 985,86 0,0000

B:T 15,3912 3 5,13039 632,03 0,0000

C:tg 8,58393 6 1,43065 176,25 0,0000

INTERACTIONS

AB 0,344028 6 0,057338 7,06 0,0001

AC 0,350554 12 0,0292128 3,60 0,0014

BC 1,84959 18 0,102755 12,66 0,0000

RESIDUAL 0,292223 36 0,00811731

--------------------------------------------------------------------------------

Analysis Summary

Dependent variable: HLFactors: C T tg

Number of complete cases: 84

The StatAdvisor--------------- This procedure performs a multifactor analysis of variance for HL. It constructs various tests and graphs to determine which factors havea statistically significant effect on HL. It also tests forsignificant interactions amongst the factors, given sufficient data. The F-tests in the ANOVA table will allow you to identify thesignificant factors. For each significant factor, the Multiple RangeTests will tell you which means are significantly different from whichothers. The Means Plot and Interaction Plot will help you interpretthe significant effects. The Residual Plots will help you judgewhether the assumptions underlying the analysis of variance areviolated by the data.

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



24


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 3.22 Phân tích ANOVA cho hàm HL với các biến độc lập C, T, tg và các tương tác đôi, ba giữa chúng

Analysis of Variance for HL - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 16,0051 2 8,00253

B:T 15,3912 3 5,13039

C:tg 8,58393 6 1,43065

INTERACTIONS

AB 0,344028 6 0,057338

AC 0,350554 12 0,0292128

BC 1,84959 18 0,102755

ABC 0,292223 36 0,00811731

RESIDUAL 0,0 0

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 3.23 Phân tích hồi qui bậc nhất cho hàm HL với các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng, Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------

Dependent variable: HL

-----------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



25

Standard T

Parameter Estimate Error Statistic P-Value

-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -1,26817 1,66706 -0,760723 0,4491

C 0,137652 0,344825 0,399195 0,6909

T 0,0574873 0,0279655 2,05565 0,0432

tg 0,0792201 0,0926466 0,855079 0,3952

C*T 0,00216844 0,00513549 0,422247 0,6740

C*tg 0,0116617 0,0137732 0,846694 0,3998

T*tg -0,00202781 0,00147381 -1,3759 0,1728

-----------------------------------------------------------------------------

Analysis of Variance

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 26,2174 6 4,36956 20,27 0,0000

Residual 16,5992 77 0,215574

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83

R-squared = 61,2319 percent

R-squared (adjusted for d,f,) = 58,211 percent

Standard Error of Est, = 0,464299

Mean absolute error = 0,365556

Durbin-Watson statistic = 0,735579

The StatAdvisor

---------------

The output shows the results of fitting a multiple linear

regression model to describe the relationship between HL and 6

independent variables, The equation of the fitted model is

HL = -1,26817 + 0,137652*C + 0,0574873*T + 0,0792201*tg +

0,00216844*C*T + 0,0116617*C*tg - 0,00202781*T*tg

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



26

Bảng 3.24 Phân tích hồi qui bậc nhất cho hàm HL với ba biến độc lập C, T và tg, không xét tương tác đôi giữa chúng

Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -0,634897 0,390026 -1,62783 0,1075

C 0,424134 0,0492427 8,61313 0,0000

T 0,0351673 0,00526923 6,67408 0,0000

tg 0,00909758 0,0141319 0,643761 0,5216

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 25,6163 3 8,53876 39,71 0,0000

Residual 17,2003 80 0,215003

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83






The StatAdvisor

---------------


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



27



HL = -0,634897 + 0,424134*C + 0,0351673*T + 0,00909758*tg

Bảng 3.25 Phân tích hồi qui bậc hai cho các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -16,6604 1,247 -13,3603 0,0000

C -0,0959104 0,251289 -0,381674 0,7038

T 0,480559 0,0376206 12,7738 0,0000

tg 0,818599 0,0671191 12,1962 0,0000

C*C 0,0363745 0,0313888 1,15884 0,2502

T*T -0,00403577 0,000339569 -11,885 0,0000

tg*tg -0,0255576 0,0018547 -13,7799 0,0000

C*T 0,00216844 0,00223515 0,970155 0,3351

C*tg 0,0116617 0,00599461 1,94537 0,0555

T*tg -0,00202781 0,000641454 -3,16128 0,0023

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 39,7947 9 4,42163 108,28 0,0000

Residual 3,02188 74 0,0408363

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



28






The StatAdvisor

---------------




HL = -16,6604 - 0,0959104*C + 0,480559*T + 0,818599*tg + 0,0363745*C*C

- 0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg + 0,00216844*C*T + 0,0116617*C*tg -

0,00202781*T*tg

Bảng 3.26 Phân tích hồi qui bậc hai cho các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng với C được loại bớt


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -16,8632 1,1217 -15,0335 0,0000

T 0,481919 0,0372376 12,9417 0,0000

tg 0,82125 0,0663774 12,3724 0,0000

C*C 0,0267656 0,0186396 1,43595 0,1552

T*T -0,00403577 0,000337629 -11,9533 0,0000

tg*tg -0,0255576 0,00184411 -13,859 0,0000

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



29

C*T 0,00176058 0,00195194 0,901965 0,3700

C*tg 0,0108664 0,00558868 1,94436 0,0556

T*tg -0,00202781 0,00063779 -3,17944 0,0021

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 39,7887 8 4,97359 123,20 0,0000

Residual 3,02783 75 0,0403711

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83






The StatAdvisor

---------------




HL = -16,8632 + 0,481919*T + 0,82125*tg + 0,0267656*C*C -

0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg + 0,00176058*C*T + 0,0108664*C*tg -

0,00202781*T*tg

Bảng 3.27 Phân tích hồi qui bậc hai cho các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi giữa chúng với C và C*T được loại bớt Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



30

-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -17,0127 1,10802 -15,3541 0,0000

T 0,487788 0,0366198 13,3203 0,0000

tg 0,81786 0,0661895 12,3563 0,0000

C*C 0,0390555 0,0127035 3,07439 0,0029

T*T -0,00403577 0,000337215 -11,968 0,0000

tg*tg -0,0255576 0,00184184 -13,8761 0,0000

C*tg 0,0118836 0,00546699 2,17371 0,0328

T*tg -0,00202781 0,000637007 -3,18334 0,0021

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 39,7559 7 5,67941 141,03 0,0000

Residual 3,06068 76 0,0402721

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83






The StatAdvisor

---------------




Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



31

HL = -17,0127 + 0,487788*T + 0,81786*tg + 0,0390555*C*C -

0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg + 0,0118836*C*tg - 0,00202781*T*tg

Bảng 3.28 Phân tích hồi qui bậc hai cho các biến độc lập C, T, tg và không xét các tương tác đôi giữa chúng


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -16,0271 1,10382 -14,5197 0,0000

C 0,190571 0,217567 0,875921 0,3838

T 0,458239 0,0382896 11,9677 0,0000

tg 0,748477 0,0579733 12,9107 0,0000

C*C 0,0363745 0,0336929 1,07959 0,2837

T*T -0,00403577 0,000364495 -11,0722 0,0000

tg*tg -0,0255576 0,00199085 -12,8375 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 39,1936 6 6,53226 138,83 0,0000

Residual 3,62297 77 0,0470515

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



32





The StatAdvisor

---------------




HL = -16,0271 + 0,190571*C + 0,458239*T + 0,748477*tg + 0,0363745*C*C

- 0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg

Bảng 3.29 Phân tích hồi qui bậc hai cho các biến độc lập C, T, tg và không xét các tương tác đôi giữa chúng với C được loại bớt Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -15,7489 1,05556 -14,9199 0,0000

T 0,458239 0,0382325 11,9856 0,0000

tg 0,748477 0,0578867 12,93 0,0000

C*C 0,0657209 0,00356208 18,4502 0,0000

T*T -0,00403577 0,000363951 -11,0888 0,0000

tg*tg -0,0255576 0,00198787 -12,8567 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



33


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 39,1575 5 7,8315 166,94 0,0000

Residual 3,65907 78 0,0469111

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 42,8166 83






The StatAdvisor

---------------




HL = -15,7489 + 0,458239*T + 0,748477*tg + 0,0657209*C*C -

0,00403577*T*T - 0,0255576*tg*tg

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



34

Bảng 3.30 Biến đổi hàm lượng peptid và acid amin của dịch thuỷ phân khi sử

dụng các nồng độ CPE bổ sung khác nhau ở chế độ thủy phân 57oC với thời

gian 14,5 giờ

Nồng độ CPE bổ sung (%)

Hàm lượng peptid & acid amin tạo

thành (g/l)

3,50 3,450

3,75 3,856

4,00 3,962

4,25 3,971

4,50 3,982

4,75 3,986

5,00 3,986

Bảng 3.31 Hiệu suất thu chất màu carotenoid (mg/g đầu vỏ tôm) trong quá

trình thủy phân ở các điều kiện khác nhau

Nồng độ

CPE sử

dụng (%)

Nhiệt độ oC


0 3 6 9 12 15

2 40 0,0936 0,1060 0,1813 0,2155 0,2102 0,1274

2 50 0,0936 0,1790 0,2952 0,4152 0,4059 0,3363

2 60 0,0936 0,1571 0,2597 0,3718 0,3534 0,2874

2 65 0,0936 0,1272 0,2008 0,2408 0,2116 0,1417

3,5 40 0,0936 0,1853 0,2883 0,4217 0,3927 0,2321

3,5 50 0,0936 0,3027 0,5247 0,6782 0,6542 0,4972

3,5 60 0,0936 0,2476 0,4358 0,5747 0,5436 0,4231

3,5 65 0,0936 0,2076 0,3441 0,4657 0,4351 0,2564

5 40 0,0936 0,1979 0,3759 0,4437 0,4580 0,3247

5 50 0,0936 0,3347 0,5763 0,7244 0,6969 0,5213

5 60 0,0936 0,2723 0,4653 0,6031 0,5674 0,4571

5 65 0,0936 0,2072 0,3947 0,4832 0,4657 0,3073

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



35

Bảng 3.32 Tóm lược phân tích ANOVA cho hàm lượng carotenoid CP thu nhận từ quá trình thủy phân

Analysis Summary

Dependent variable: CP

Factors:

T

C

tg


Bảng 3.33 Phân tích ANOVA cho hàm lượng carotenoid CP thu nhận từ quá trình thủy phân

Analysis of Variance for CP - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 0,386448 2 0,193224 1016,83 0,0000

B:T 0,320766 3 0,106922 562,67 0,0000

C:tg 1,25143 5 0,250285 1317,11 0,0000

INTERACTIONS

AB 0,00745379 6 0,0012423 6,54 0,0002

AC 0,11353 10 0,011353 59,74 0,0000

BC 0,0944369 15 0,00629579 33,13 0,0000

RESIDUAL 0,0057008 30 0,000190027

--------------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



36

Bảng 3.34 Hiệu suất thu protein (mg/g đầu vỏ tôm) trong quá trình thủy phân ở các điều kiện khác nhau

Nồng độ CPE sử

dụng (%) Nhiệt độ oC


0 3 6 9 12 15 2 40 5,7672 11,8746 15,9278 16,7836 15,6350 12,5764 2 50 5,7672 16,7932 22,6583 25,2243 23,5479 20,9769 2 60 5,7672 15,2670 21,7683 23,2241 22,0987 19,0122 2 65 5,7672 11,2362 14,3476 15,5742 15,0027 12,3367

3,5 40 5,9827 11,2647 18,8920 22,3565 18,7658 13,9826 3,5 50 5,9827 16,2435 31,2658 37,2436 34,7247 30,1468 3,5 60 5,9827 13,4683 25,4650 34,3230 32,6547 28,7263 3,5 65 5,9827 11,9887 20,6532 23,0724 19,6687 12,6873 5 40 6,0231 12,7291 20,1788 23,2278 21,2054 15,8003 5 50 6,0231 18,3552 34,2218 40,7632 35,7936 31,2287 5 60 6,0231 15,2192 28,7755 38,7850 34,7632 29,9879 5 65 6,0231 13,5472 23,3381 26,0718 22,7460 16,1220

Bảng 3.35 Tóm lược phân tích ANOVA cho hàm lượng protein hòa tan AP thu nhận từ quá trình thủy phân

Analysis Summary

Dependent variable: AP

Factors:

C

T

tg


Bảng 3.36 Phân tích ANOVA cho hàm lượng protein hòa tan AP thu nhận từ quá trình thủy phân

Analysis of Variance for AP - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



37

MAIN EFFECTS

A:C 507,423 2 253,712 122,01 0,0000

B:T 1230,16 3 410,055 197,20 0,0000

C:tg 3776,08 5 755,217 363,19 0,0000

INTERACTIONS

AB 59,9082 6 9,9847 4,80 0,0015

AC 251,419 10 25,1419 12,09 0,0000

BC 421,675 15 28,1117 13,52 0,0000

RESIDUAL 62,3821 30 2,0794

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 3.37 Tóm lược phân tích ANOVA cho tối ưu hàm lượng carotenoid CP thu nhận từ quá trình thủy phân Analysis Summary


Factors:

C

T

tg


Bảng 3.38 Phân tích ANOVA cho hàm lượng carotenoid CP có xem xét ảnh hưởng của các tương tác đôi Analysis of Variance for CP - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 0,458555 2 0,229277 1245,35 0,0000

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



38

B:T 0,385123 3 0,128374 697,28 0,0000

C:tg 0,171031 3 0,0570104 309,66 0,0000

INTERACTIONS

AB 0,00809731 6 0,00134955 7,33 0,0004

AC 0,0130318 6 0,00217196 11,80 0,0000

BC 0,00856356 9 0,000951506 5,17 0,0015

RESIDUAL 0,00331392 18 0,000184107

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 3.39 Phân tích ANOVA cho hàm lượng carotenoid CP có xem xét ảnh hưởng của các tương tác đôi và ba Analysis of Variance for CP - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 0,458555 2 0,229277

B:T 0,385123 3 0,128374

C:tg 0,171031 3 0,0570104

INTERACTIONS

AB 0,00809731 6 0,00134955

AC 0,0130318 6 0,00217196

BC 0,00856356 9 0,000951506

ABC 0,00331392 18 0,000184107

RESIDUAL 0,0 0

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



39

Bảng 3.40 Phân tích hồi qui bậc hai cho CP với các biến độc lập C, T, tg và các tương tác đôi giữa chúng Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -4,58597 0,220327 -20,8143 0,0000

C 0,318839 0,0366667 8,6956 0,0000

T 0,145763 0,00726437 20,0655 0,0000

tg 0,137964 0,0130278 10,5899 0,0000

C*T -0,000265738 0,000368372 -0,721385 0,4751

C*tg -0,00132375 0,0010545 -1,25533 0,2170

T*tg -0,0000468667 0,000134511 -0,348424 0,7294

C*C -0,0307762 0,00408406 -7,53568 0,0000

T*T -0,00136915 0,0000667134 -20,5229 0,0000

tg*tg -0,00643203 0,000481311 -13,3635 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 1,01349 9 0,11261 125,03 0,0000

Residual 0,0342265 38 0,000900697

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 1,04772 47






Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



40

The StatAdvisor

---------------


regression model to describe the relationship between CP and 9


CP = -4,58597 + 0,318839*C + 0,145763*T + 0,137964*tg -

0,000265738*C*T - 0,00132375*C*tg - 0,0000468667*T*tg - 0,0307762*C*C

- 0,00136915*T*T - 0,00643203*tg*tg

Bảng 3.41 Phân tích hồi qui bậc hai cho CP với các biến độc lập C, T, tg và các tương tác đôi C*T, C*tg Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -4,55952 0,204493 -22,2967 0,0000

C 0,318839 0,0362513 8,79524 0,0000

T 0,145271 0,00704503 20,6204 0,0000

tg 0,135444 0,0107148 12,6409 0,0000

C*T -0,000265738 0,000364199 -0,729651 0,4700

C*tg -0,00132375 0,00104255 -1,26972 0,2117

C*C -0,0307762 0,0040378 -7,62202 0,0000

T*T -0,00136915 0,0000659577 -20,7581 0,0000

tg*tg -0,00643203 0,000475859 -13,5167 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 1,01338 8 0,126673 143,88 0,0000

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



41

Residual 0,0343358 39 0,000880406

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 1,04772 47






The StatAdvisor

---------------




CP = -4,55952 + 0,318839*C + 0,145271*T + 0,135444*tg -

0,000265738*C*T - 0,00132375*C*tg - 0,0307762*C*C - 0,00136915*T*T -

0,00643203*tg*tg

Bảng 3.42 Phân tích hồi qui bậc hai cho CP với các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi C*tg Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -4,50952 0,191544 -23,543 0,0000

C 0,304555 0,0303326 10,0405 0,0000

T 0,144341 0,00688813 20,955 0,0000

tg 0,135444 0,0106519 12,7155 0,0000

C*tg -0,00132375 0,00103644 -1,27721 0,2089

C*C -0,0307762 0,00401413 -7,66697 0,0000

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



42

T*T -0,00136915 0,000065571 -20,8805 0,0000

tg*tg -0,00643203 0,000473069 -13,5964 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 1,01291 7 0,144702 166,30 0,0000

Residual 0,0348045 40 0,000870114

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 1,04772 47






The StatAdvisor

---------------




CP = -4,50952 + 0,304555*C + 0,144341*T + 0,135444*tg -

0,00132375*C*tg - 0,0307762*C*C - 0,00136915*T*T - 0,00643203*tg*tg

Bảng 3.43 Phân tích hồi qui bậc hai cho CP với các biến độc lập C, T, tg không có mặt tương tác đôi giữa chúng Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



43

-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -4,46088 0,189158 -23,5828 0,0000

C 0,290656 0,0285302 10,1876 0,0000

T 0,144341 0,00694095 20,7956 0,0000

tg 0,130811 0,010092 12,9618 0,0000

C*C -0,0307762 0,00404491 -7,60862 0,0000

T*T -0,00136915 0,0000660739 -20,7216 0,0000

tg*tg -0,00643203 0,000476697 -13,4929 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 1,01149 6 0,168582 190,81 0,0000

Residual 0,0362239 41 0,00088351

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 1,04772 47






The StatAdvisor

---------------




CP = -4,46088 + 0,290656*C + 0,144341*T + 0,130811*tg - 0,0307762*C*C

- 0,00136915*T*T - 0,00643203*tg*tg

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



44

Bảng 3.44 Tóm lược phân tích ANOVA cho tối ưu hàm lượng protein AP thu nhận từ quá trình thủy phân Analysis Summary


Factors:

C

T

tg


Bảng 3.45 Phân tích ANOVA cho tối ưu hàm lượng protein AP thu nhận từ quá trình thủy phân đầu vỏ tôm với các tương tác đôi


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 719,389 2 359,694 246,89 0,0000

B:T 1558,36 3 519,455 356,54 0,0000

C:tg 303,028 3 101,009 69,33 0,0000

INTERACTIONS

AB 93,8846 6 15,6474 10,74 0,0000

AC 33,121 6 5,52016 3,79 0,0129

BC 41,157 9 4,573 3,14 0,0186

RESIDUAL 26,2246 18 1,45692

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



45

Bảng 3.46 Phân tích ANOVA cho tối ưu hàm lượng protein AP thu nhận từ quá trình thủy phân đầu vỏ tôm với các tương tác đôi và ba


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:C 719,389 2 359,694

B:T 1558,36 3 519,455

C:tg 303,028 3 101,009

INTERACTIONS

AB 93,8846 6 15,6474

AC 33,121 6 5,52016

BC 41,157 9 4,573

ABC 26,2246 18 1,45692

RESIDUAL 0,0 0

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 3.47 Phân tích hồi qui bậc hai cho AP với các biến độc lập C, T, tg và các tương tác đôi giữa chúng


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -243,959 17,2937 -14,1068 0,0000

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



46

C 8,17741 2,878 2,84135 0,0072

T 9,00026 0,570188 15,7847 0,0000

tg 4,73421 1,02257 4,62973 0,0000

C*T 0,0415276 0,0289139 1,43625 0,1591

C*tg -0,0570668 0,0827688 -0,689472 0,4947

T*tg 0,00123844 0,0105579 0,1173 0,9072

C*C -0,966014 0,320562 -3,0135 0,0046

T*T -0,0867718 0,0052364 -16,5709 0,0000

tg*tg -0,236527 0,0377786 -6,26086 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 2564,3 9 284,923 51,35 0,0000

Residual 210,864 38 5,54905

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 2775,17 47






The StatAdvisor

---------------


regression model to describe the relationship between AP and 9


AP = -243,959 + 8,17741*C + 9,00026*T + 4,73421*tg + 0,0415276*C*T -

0,0570668*C*tg + 0,00123844*T*tg - 0,966014*C*C - 0,0867718*T*T -

0,236527*tg*tg

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



47

Bảng 3.48 Phân tích hồi qui bậc hai cho AP với các biến độc lập C, T, tg và các tương tác đôi C*T, C*tg


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -244,658 16,0282 -15,2642 0,0000

C 8,17741 2,84138 2,87797 0,0065

T 9,01326 0,55219 16,3228 0,0000

tg 4,80078 0,839824 5,71641 0,0000

C*T 0,0415276 0,028546 1,45476 0,1537

C*tg -0,0570668 0,0817156 -0,698358 0,4891

C*C -0,966014 0,316483 -3,05234 0,0041

T*T -0,0867718 0,00516977 -16,7845 0,0000

tg*tg -0,236527 0,0372979 -6,34156 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 2564,23 8 320,529 59,26 0,0000

Residual 210,94 39 5,40872

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 2775,17 47






Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



48

The StatAdvisor

---------------




AP = -244,658 + 8,17741*C + 9,01326*T + 4,80078*tg + 0,0415276*C*T -

0,0570668*C*tg - 0,966014*C*C - 0,0867718*T*T - 0,236527*tg*tg

Bảng 3.49 Phân tích hồi qui bậc hai cho AP với các biến độc lập C, T, tg và tương tác đôi C*T Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -242,561 15,6432 -15,5058 0,0000

C 7,57821 2,69134 2,81578 0,0075

T 9,01326 0,548643 16,4283 0,0000

tg 4,60104 0,784551 5,86455 0,0000

C*T 0,0415276 0,0283626 1,46417 0,1510

C*C -0,966014 0,31445 -3,07208 0,0038

T*T -0,0867718 0,00513656 -16,893 0,0000

tg*tg -0,236527 0,0370583 -6,38256 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 2561,59 7 365,942 68,54 0,0000

Residual 213,578 40 5,33945

-----------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



49

Total (Corr,) 2775,17 47






The StatAdvisor

---------------




AP = -242,561 + 7,57821*C + 9,01326*T + 4,60104*tg + 0,0415276*C*T -

0,966014*C*C - 0,0867718*T*T - 0,236527*tg*tg

Bảng 3.50 Phân tích hồi qui bậc hai cho AP với các biến độc lập C, T, tg không có các tương tác đôi giữa chúng Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

CONSTANT -250,373 14,9088 -16,7936 0,0000

C 9,81032 2,24866 4,36275 0,0001

T 9,15861 0,547062 16,7414 0,0000

tg 4,60104 0,795419 5,78442 0,0000

C*C -0,966014 0,318806 -3,0301 0,0042

T*T -0,0867718 0,00520771 -16,6622 0,0000

tg*tg -0,236527 0,0375716 -6,29535 0,0000

-----------------------------------------------------------------------------

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



50


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Model 2550,14 6 425,024 77,44 0,0000

Residual 225,025 41 5,48841

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr,) 2775,17 47






The StatAdvisor

---------------




AP = -250,373 + 9,81032*C + 9,15861*T + 4,60104*tg - 0,966014*C*C -

0,0867718*T*T - 0,236527*tg*tg

Click t

o buy N

OW!PD

F-XChange Viewer

ww


k to b

uy NOW

!PD

F-XChange Viewer

ww

w.docu-track.c

om



Documents

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN