NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY …gust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26974.pdf · 2.2.4. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng

1

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

---------------------------------

Nguyễn Thị Hoàn

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY

BỆNH THỰC VẬT TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019

2

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

---------------------------------


NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY

BỆNH THỰC VẬT TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 842 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS Lê Gia Hy

Hà Nội- tháng 4 năm 2019

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi

của bản thân và sự hướng dẫn tận tình của PGS.TS Lê Gia Hy và ThS. NCS

Vũ Thị Hạnh Nguyên.

Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của tác giả khác, nếu có đều

được trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chưa được bảo vệ tại

bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa hề được công

bố trên bất kỳ một phương tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời

cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 19 tháng 04 năm 2019

Người cam đoan


2

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Gia Hy và ThS.

NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên đã trực tiếp định hướng, tận tình hướng dẫn tôi

hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin cảm ơn sự động viên giúp đỡ chỉ bảo tận tình của các anh chị

Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện những

điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành bản luận văn.

Tôi xin trân trong gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng các thầy cô

giáo trường Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức và

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biêt ơn đến gia đình, người thân, bạn bè

và đồng nghiệp – những người đã luôn động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn

thành khóa học này.

Học viên


3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

DNA Axit deoxyribonucleic

KB King’B

RI Relative inhibition (Phần trăm ức chế

tăng trưởng sợi nấm)

RPM Revolutions per minute (Tốc độ lắc

vòng/phút)

v/v Đơn vị thể tích/thể tích

VKNS Vi khuẩn nội sinh

VSVNS Vi sinh vật nội sinh

VSV Vi sinh vật

w/v Đơn vị khối lượng/thể tích

4

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tiêu đề Trang

1.1 Các tác nhân gây bệnh gây bênh chết nhanh, chết chậm và

thán thư trên cây hồ tiêu

7

2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

khuếch đại gen 16S rDNA

27

3.1 Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ các mẫu rễ, thân,

lá trên hồ tiêu tại Đắk Lắk

30

3.2 Số lượng chủng phân lập được trên các môi trường khác

nhau

33

3.3 Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh trên

cây hồ tiêu

33

3.4 Khả năng kháng nấm trên cây hồ tiêu của các chủng nội

sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

37

3.5 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn nội

sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

38

3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến khả năng

phát triển của chủng HDL34

40

3.7 Khả năng đồng hóa nguồn carbon và nitơ chủng HDL3 41

3.8 Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng HDL34 42

3.9 Ảnh hường của nguồn cacbon và nitơ đến khả năng sinh

chất kháng sinh của chủng HDL34

44

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh tổng

hợp chất kháng khuẩn của chủng HDL34

45

3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng

hợp chất kháng khuẩn của chủng HDL34 nội sinh

46

5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Tiêu đề Trang

1.1 Cây hồ tiêu 3

1.2 Hình dạng khuẩn lạc (A) và bào tử nấm (B) của nấm

Fussarium gây bệnh cây hồ tiêu

9

1.3 Bệnh thối rễ cây hồ tiêu do nấm Phytophthora 9

1.4 Nấm Phytophthora tấn công dây lươn cây hồ tiêu 9

3.1 Vi sinh vật nội sinh theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu. 31

3.2 Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh

phân lập được

35

3.3 Khả năng đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh

vật nội sinh trên cây hồ tiêu

37

3.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn

nội sinh

38

3.5 Ảnh nhuộm Gram của chủng HDL34 (A) và hình ảnh

khuẩn lạc của chủng HDL34 (B) trên môi trường MPA

39

3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên

gel agarose 1,0%

42

3.7 Khả năng kháng nấm bệnh của chủng HDL34 trên các môi

trường khác nhau

43

3.8 Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp

chất kháng nấm của chủng HDL34

46

3.9 Khả năng kháng nấm bệnh P. capsici VTN của chủng

HDL34

47

6

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU 3

1.1.1. Cây hồ tiêu và tiềm năng phát triển cây hồ tiêu ở Việt

Nam

3

1.1.2. Hiện trạng canh tác trồng cây hồ tiêu ở Đăk Lăk 4

1.1.3. Bệnh cây và ảnh hưởng của bệnh nấm đối với cây trồng 4

1.1.4. Khả năng đối kháng của các vi sinh vật đối với nấm

gây bệnh thực vật

5

1.1.5. Các loại bệnh gây hại trên cây hồ tiêu và biện pháp

phòng chống ở Tây Nguyên

7

1.1.6. Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong đấu

tranh sinh học phòng chống bệnh cho cây trồng

13

1.2. VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ

NĂNG ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

16

1.2.1. Vi sinh vật nội sinh (endophylic microorganisms) trên

cây hồ tiêu

16

1.2.2. Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh năng kháng nấm gây

bệnh trên cây hồ tiêu

16

1.2.3. Khả năng ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng

chống nấm gây bệnh cây hồ tiêu

18

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH

VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY

HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM

18

1.3.1. Nghiên cứu bệnh gây hại trên cây hồ tiêu 18

7

1.3.2. Biện pháp phòng trừ bệnh cây hồ tiêu bằng biện pháp

sinh học

20

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 22

2.1.1. Các mẫu cây hồ tiêu và chủng giống vi sinh vật kiểm

định

22

2.1.2. Hóa chất và thiết bị 22

2.1.3. Môi trường nuôi cấy 23

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1. Phương pháp thu mẫu 23

2.2.2. Khử trùng bề mặt và phân lập vi sinh vật nội sinh 24

2.2.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh 24

2.2.4. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật

nội sinh với nấm bệnh

24

2.2.5. Xác định khả năng ức chế nấm bệnh của dịch lọc vi

sinh vật nội sinh

25

2.2.6. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh 25

2.2.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng

lựa chọn

26

2.2.8. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào 27

2.2.9. Lựa chọn môi trường và điều kiện nnuooi cấy thích hợp 28

2.2.10. Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora

capsici

28

2.2.11. Xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ 30

8

HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU

Ở ĐĂK LĂK

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ các

mẫu cây hồ tiêu

30

3.1.2. Sơ bộ phân nhóm vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu

phân lập được

31

3.1.3. Phân bố vi sinh vật nội sinh theo môi trường phân lập 32

3.1.4. Khả năng đối kháng với nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu

của các nhóm vi sinh vật phân lập được

33

3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ

KHẢ NĂNG DIỆT NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU

CAO Ở ĐẮK LẮK

36

3.2.1. Hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu của các

chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

36

3.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi

khuẩn nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

37

3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN LOẠI VÀ AN TOÀN SINH

HỌC CỦA CHỦNG HDL34

39

3.3.1. Đặc điểm sinh học 39

3.3.2. Phân loại chủng HDL34 dựa trên phân tích trình tự gen

16S rDNA

41

3.3.3. Độ an toàn sinh học của chủng HDL34 42

3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THỬ NGHIỆM

KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG CHỦNG HDL34

43

9

3.4.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng chủng

HDL34

43

3.4.2. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của chủng HDL34 ở

quy mô phòng thí nghiệm

47

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

4.2. KIẾN NGHỊ

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

49

1

MỞ ĐẦU

Hồ tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là

một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển

Malabar ở Nam Ấn Độ (Nazeem et al., 2008). Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được

trồng chủ yếu tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha,

trong đó, Tây Nguyên là vùng có nhiều tiềm năng về đất đai, khí hậu để mở

rộng diện tích trồng tiêu (4 tỉnh Tây Nguyên: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông và

Lâm Đồng đã chiếm 55.339 ha). Tuy diện tích hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong

tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm nhưng giá trị xuất khẩu đạt

khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây chè, 3,8 lần cây điều, gấp

4 lần cây cao su.

Tuy có nhiều lợi thế để phát triển, song thực tế trong những năm qua cây

hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm chí nhiều thời điểm người sản xuất

còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do chạy theo giá thị trường, phát triển

cây tiêu không theo quy hoạch, không chú trọng đến việc cải tạo đất, không

xử lý mầm bệnh. Một số diện tích tiêu trồng trên những vùng đất không phù

hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm sóc theo đúng quy trình kỹ

thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,... khiến tình hình sâu bệnh hại trên cây

hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh. Bẹnh hại nghiem trọng nhất hiẹ n nay đối

với hồ tieu là bẹnh chết nhanh do nấm Phytophthora và bẹnh chết chạm có

thể do sự cọ ng hợp của các tác nha n nấm Fusarium sp., Rhyzoctonia sp.,

Pythium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp., gây ra.

Ở nuớc ta hiẹn nay, viẹc phòng trừ dịch hại tre n cay tie u chủ yếu bằng

biẹn pháp hóa học thu ờng gạp nhiều khó kha n, vì không những khó tiêu diệt

được bào tử nấm gây bệnh, mà còn ảnh hưởng đến sinh vạ t, côn trùng có lợi

làm mất ca n bằng sinh thái. Hướng sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm gây

bệnh trong phòng chống bệnh cho cây trồng nói chung và cây hồ tiêu nói

riêng, đuợc xem là giải pháp cần thiết nhằm thay thế các loại thuốc hoá học

gây độc hại môi trường. Đối với bẹnh hại tre n hồ tieu đã đu ợc nghien cứu và

có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tế sản xuất, như sử dụng một số loài

nấm Dactylella oviparasitica, Arthrobotrys oligospore, Verticillium

2

chlamydosporium, Monacrosporium gepgyropagum có khả năng diệt tuyến

trùng hay nấm Trichoderma đang đu ợc sử dụng khá phổ biến trong phòng trừ

nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu (Ngo Thị Xuye n, 2002).

Sử dụng vi sinh vạ t đối kháng phân lập từ đất se khống chế kìm hãm các

vi sinh vạt gay bẹ nh, đay chính là hiẹu quả của viẹc quản lý dịch hại dựa tre n

co sở bảo vẹ can bằng sinh thái trong đất. Tuy nhiên, biện pháp phòng trừ

sinh học bằng các vi sinh vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng

dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng

vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có

khả năng kháng nấm và tuyến trùng là việc làm cấp thiết nhằm hạn chế sử

dụng thuốc hóa học, phát triển phong phú quần thể vi sinh vật có lợi se giúp

cho cay trồng phát triển, ta ng sức đề kháng sa u bẹnh. Xuất phát từ những vấn

đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối

kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk” với mục đích

nghiên cứu sự đa dạng, phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh có

hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu, với các nội dung chính sau

đây:

1. Phân lập và đánh giá sự phân bố vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu ở

Đắk Lắk;

2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng diệt nấm gây

bệnh trên cây hồ tiêu cao ở Đắk Lắk;

3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại và an toàn sinh học của

chủng được tuyển chọn;

4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng, phát

triển của các chủng được tuyển chọn và thử nghiệm khả năng kháng nấm gây

bệnh trên lá hồ tiêu.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU

1.1.1. Cây hồ tiêu và tiềm năng phát triển cây hồ tiêu ở Việt Nam

Hạt tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là

một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển

Malabar ở Nam Ấn Độ (Ravindran, 2000; Nazeem et al., 2008). Hồ tiêu được

lan truyền bởi thương nhân Hindu và du khách đến Malaysia và Indonesia.

Ngày nay, Hồ tiêu được trồng thương mại ở các vùng nhiệt đới bao gồm

Malabar, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Sri Lanka, Việt Nam và

Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa để hỗ trợ nhu cầu tiêu thụ tiêu đen trên toàn

thế giới (Victor R. Preedy, 2016). Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được trồng ở

nhiều vùng sinh thái như ở miền đồi núi đất đỏ, miền trung như tỉnh Quảng

Trị hoặc vùng Đông Nam Bộ và các tỉnh Tây Nguyên. Tuy nhiên, hồ tiêu chủ

yếu trồng tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha,

trong đó, Tây Nguyên là

vùng có nhiều tiềm năng

về đất đai, khí hậu để mở

rộng diện tích trồng tiêu

(4 tỉnh Tây Nguyên: Gia

Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông

và Lâm Đồng đã chiếm

55.339 ha). Hồ tiêu là loại

cây trồng khó tính, mẫn

cảm với sự thay đổi thất

thường của thời tiết, mặt

khác bộ rễ cây tiêu rất dễ

tổn thương bởi các tác động từ bên ngoài và khi bộ rễ đã tổn thương thì không

hút được nước, các chất dinh dưỡng, tạo cho các loại sâu bệnh hại thừa cơ

xâm nhập để tàn phá. Phytophthora capsici là tác nhân gây bệnh chết nhanh ở

thực vật thường được coi là tác nhân gây bệnh thối rữa và bệnh rụng lá ở tiêu

(Anandaraj và Sarma, 1995a, Babadoost, 2005, Nguyen, V.L. (2015).

Hình 1.1: Cây hồ tiêu

4

1.1.2. Hiện trạng canh tác trồng cây hồ tiêu ở Đắk Lắk

Theo Thống kê của ngành nông nghiệp, hồ tiêu được trồng khoảng

100.000ha chủ yếu là Đông Nam Bộ và Tây Nguyên và là một trong những

loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế và giá trị xuất khẩu cao. Tuy diện tích

hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu

năm, giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây

chè, 3,8 lần cây điều, gấp 4 lần cây cao su (Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT

ngày 3/7/2014 của Bộ NN và PTNN). Tuy có nhiều lợi thế để phát triển song

thực tế trong những năm qua cây hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm

chí nhiều thời điểm người sản xuất còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do

chạy theo giá thị trường, phát triển cây tiêu không theo quy hoạch, không chú

trọng đến việc cải tạo đất, không xử lý mầm bệnh. Một số diện tích tiêu trồng

trên những vùng đất không phù hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm

sóc theo đúng quy trình kỹ thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,... khiến tình

hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh. Bệnh hại

nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh, chết chậm.

1.1.3. Bệnh cây và ảnh hưởng của bệnh nấm đối với cây trồng

Theo thống kê của Tổ chức Nông- Lương thế giới (FAO): Các loại cây

trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với khoản 100.000 loại sâu hại,

10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây

bệnh. Chính vì vậy, hàng năm khoảng 20% sản lượng lương thực, thực phẩm

trên thế giới bị mất trắng.

Trên thế giới bệnh cây đã gây ra những thiệt hại to lớn cho sản xuất

nông nghiệp, chúng phá huỷ đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu,

chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới. Riêng lúa chiếm khoảng

9%, ngô 10%, cây rau 12% và cây ăn quả 16,5%. Trong các loại bệnh cây,

bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%.

Theo Ou, 1972, trong số 45 bệnh lúa đã mô tả có tới 60% do nấm gây

ra, cũng theo kết quả nghiên cứu khoa học bảo vệ thực vật 1971-1976 của

Viện Bảo vệ thực vật, trong số 24 bệnh hại lúa ở Việt Nam có tới 13 bệnh do

5

nấm gây ra, 34 bệnh ngô có 26 bệnh do nấm gây ra và 21 bệnh khoai tây có 8

bệnh do nấm. Những bệnh nấm chủ yếu và có tầm quan trọng nhất, là các

bệnh: đạo ôn, khô vằn, tiêm hạch, đốm nâu, thối rễ, mốc sương… Một số

bệnh nấm tiêu biểu gây hại cho cây trồng được quan tâm nhiều nhất là bệnh

thối thân, rễ ở thực vật do nhiều loài nấm ký sinh gây ra như Phytophthora

sp., Pythium sp., Botrytis cinerespers, Diplodia sp., Fusarium sp., Rhizoctonia

solani Kuln, Sclerotium batiticola Faud nhưng chủ yếu là F. oxysporum. Chỉ

riêng tính ở khoai tây thiệt hại do Fusarium sp. gây bệnh thối củ trên đồng

ruộng và trong bảo quản lên tới 20% số củ thu hoạch được. Ngoài ra, chúng

còn gây một số bệnh khác như bệnh mốc hồng và thối thân ở ngô. Nấm

Fusarium oxysorum còn gây ra bệnh héo mạch dẫn và nhiều bệnh thối thân

thối rễ ở nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua… Bệnh

héo thân cây còn do Pseudomonas solanacerium là loài vi khuẩn Gram âm ký

sinh đa thực vật, bào gồm nhiều chủng gây bệnh héo rũ trên 35 họ cây trồng

khác nhau, rất phổ biến ở nước ta và nhiều nước trên thế giới. Bệnh héo rũ vi

khuẩn là loại bệnh gây tắc ống dẫn, sau mấy ngày toàn cây héo rũ, chết khô

dần.

1.1.4. Khả năng đối kháng của các vi sinh vật đối với nấm gây bệnh

thực vật

Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có thể kháng lại các vi sinh vật

gây bệnh cho cây, nhất là đất được canh tác tốt, đúng kỹ thuật se tạo điều kiện

cho vi sinh vật có lợi phát triển cạnh tranh với các vi sinh vật có hại gây bệnh

cho cây. Trong số các nhóm vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm thì vi

khuẩn và xạ khuẩn có tỷ lệ đối kháng cao, có tới 40-60% các chủng xạ khuẩn

sống trong đất có khả năng kháng lại các loại nấm gây bệnh cho cây trồng

như nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ, nấm Pyricularia oryzae gây

bệnh đạo ôn ở lúa, nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn ở lúa, ngô...

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các nhà khoa học ở nhiều

nước đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật, xạ khuẩn có khả năng

ức chế nấm gây bệnh thực vật. Theo Kamada, 1974 khi điều tra xạ khuẩn

trong đất ở Nhật Bản cho thấy ở nơi có nhiều xạ khuẩn đối kháng thì ở đó có

6

các dòng Fusarium bị biến mất rất nhanh, ở Bungari những chủng xạ khuẩn

chống nấm thường thuộc nhóm xám và các loài S. griseus, S. albus , S.

candidus… Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài

loại nấm gây bệnh, nhưng cũng có loài có hoạt phổ kháng khuẩn rộng. Ví dụ,

loài S. laveudulae var. huinansis có hoạt tính ức chế mạnh cả vi khuẩn Gram

dương và Gram âm và nấm gây bệnh. Những chủng như vậy có ưu thế làm tác

nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng những

chủng này phải thận trọng để tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ vi sinh vật

có lợi trong vùng rễ, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng

nấm in vitro đều thể hiện trong đất (thường từ khoảng 4-5%) nhưng chúng có

vai trò quan trọng trong việc làm sạch đất khỏi nấm gây bệnh và ngăn ngừa

khả năng nhiễm bệnh cho cây. Xạ khuẩn chống nấm ngoài tiết ra chất kháng

sinh chúng còn tác động lên khu hệ vi sinh vật thông qua enzym dung giải -

đây là phức hệ bao gồm nhiều enzym. Ngoài ra, các chủng vi sinh vật còn tiết

ra các chất kích thích sinh trưởng của thực vật cũng như khu hệ vi sinh vật có

lợi trong vùng rễ.

Hơn nữa, nhiều loại vi sinh vật sống cộng sinh, không gây bệnh cho

người, động vật và cây trồng. Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có

hoạt tính đối kháng cao và tạo chế phẩm kháng sinh kháng nấm áp dụng vào

công tác bảo vệ thực vật có tầm quan trọng đặc biệt.

Ngay từ năm 1935 các nhà khoa học Liên Xô (cũ) đã dùng một số loại vi

khuẩn thuộc chi Pseudomonas bám vào đất để chống nấm Sclerotonia và

Botrytis bảo vệ nhiều loại cây. Nhiều công trình nghiên cứu dùng nấm đối

kháng như Trichoderma chống bệnh cho bông, khoai tây và cây trồng khác.

Ngay từ những năm 1930, ở Trung Quốc đã sử dụng xạ khuẩn và các

chất trao đổi của chúng để nghiên cứu hạn chế các bệnh thực vật và từ năm

1950, họ đã chọn được 5406 chủng trong đó 400 chủng xạ khuẩn phân lập

được từ đất vùng rễ cây bông và cỏ đinh lăng ức chế Rhizoctonia solani và

Verticillicum alboatrum gây bệnh thối rễ cây bông non và ứng dụng trong

phòng chống bệnh cho 6 triệu ha hồng. Trong 30 năm qua Trung Quốc cũng

đã dùng phân vi sinh (Yield-increasing bacteria) để phòng chống bệnh và tăng

7

năng suất cây trồng và từ năm 1979 bắt đầu nghiên cứu thử nghiệm trên 50 vụ

với diện tích lớn cho kết quả khả quan. Chế phẩm phân vi sinh có thể dạng

ướt hoặc nước, chúng có thể dùng để ngâm hạt, phun trên lá trộn vào hạt hoăc

bón vào rễ cây. Qua thực tế phân vi sinh làm giảm nhiều loại bệnh như đạo ôn

ở lúa do Rhizoctonia solari gây ra, bệnh thối củ cải đường do Gaeceme

nomyces, Gramynus var. tnitia, bệnh ghẻ ở củ cải đường do Rhizoctonia

cerealis, bệnh đốm lá đen ở khoai lang do Ceratocytis fibriato…

Hệ vi sinh vật trong phân vi sinh tạo ra chất kháng sinh ức chế vi sinh

vật gây bệnh, sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm và sinh ra enzym và

thúc đẩy hoạt tính enzym trong cây.

Thực tế cho thấy, hiện nay con người ngày một sử dụng rộng rãi nhiều

chế phẩm kháng sinh và các chủng vi sinh vật đối kháng làm phân bón vi sinh

vật sử dụng trong sản xuất nông, lâm nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao và

khắc phục được các yếu tố bất lợi của thuốc hóa học.

1.1.5. Các loại bệnh gây hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng

chống ở Tây Nguyên

Bảng 1.1: Các tác nhân gây bệnh gây bênh chết nhanh, chết chậm và

thán thư trên cây hồ tiêu

Bệnh Tác nhân gây hại Bộ phận gây

hại

Mức độ

phổ biến

Mức độ

gây hại

Chết

nhanh Phytophthora sp.

Khu vực gốc,

rễ, lá, gié tiêu,

quả

+++ +++

Chết chậm Fusarium sp. Rễ +++ +++

Thán thư Colletotrichum sp. Lá, thân, gié

tiêu, quả +++ ++

Ghi chú: +++ rất phổ biến, rất nghiêm trọng; ++ phổ biến, trung bình; +: ít, nhẹ (Nguồn:

Nguyễn Tăng Tôn, 2005)

Theo Nguyễn Tăng Tôn, 2005, trên thế giới người ta đã phát hiện có 105

loài nấm gây bệnh trên cây tiêu được phân lập từ rễ, thân, lá, đất như

Pythium, Puccinia, Phytophthora, Fusarium, Alternaria, Colletotrichum,

8

Curvularia, Cylindrocarpon, Corticilium, Lasiodiplodia, Rhizoctonia,

Verticillium, Cladosporium, Acremonium, Aphanoascus, Aureobasidium,

Cephaliophora, Cephalosporium, Cercosporina, Fusariella, Haplariopsis,

Nadsonia, Exobasidium, Didymostilbe, Haplariopsis… Trong số đó, có 3 loài

nấm phổ biến Phytophthora, Fusarium và Colletotrichum gây bệnh chết

nhanh, chết chậm và thán thư, và gây thiệt hại nặng đến năng suất cây hồ tiêu

(Bảng 1.1).

Ngoài ra, trên cây hồ tiêu còn bị một số bệnh ít phổ biến khác mà tác

nhân gây ra là nấm hại như bệnh khô cành – khô trái, bệnh nấm chỉ, bệnh nấm

hồng, bệnh thối rễ do mốc trắng, bệnh héo do nấm hạch, bệnh bồ hóng.

Đối với hồ tiêu hầu hết các các bộ phận cây thân, lá và quả đều dễ bị

nhiễm Phytophthora. Nấm Phytophthora được biết đến như là một loại mầm

bệnh phát triển vào mùa mưa khi thời tiết ẩm ướt (Anandaraj và Sarma, 1995,

Gevens et al., 2008; Lamour et al., 2012a, 2012b , Fisher et al.,2012). P.

capsici thường phát sinh và phát triển lây lan trong thời gian mùa mưa, cao

điểm là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa độ ẩm tương đối cao hơn 79%, do đó

bệnh Phytophthora phổ biến trong thời kỳ ẩm ướt của năm (Babadoost, 2005,

Sarma et al., 2013).Sự nhiễm bệnh liên quan đến P. capsici ở Lampung,

Indonesia vào năm 1885 và sau đó được xác định bởi Muller vào năm 1936

(Drenth and Guest, 2004, Sarma et al.,2013). Giữa tháng 11 năm 2010 và

tháng 1 năm 2011, 13 vườn tiêu ở 4 khu vực tại bang Sarawak, Malaysia đã bị

bệnh thối gốc do Phytophthora và tỷ lệ mắc bệnh rất nghiêm trọng trong thời

kỳ bùng phát dịch bệnh (Farhana và cộng sự, 2013). Ulu Sarikei ở Sarikei là

vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (75%), sau đó là Pasai Siong ở Sibu (70%)

và thấp nhất ở Tatau ở Bintulu (5%) (Farhana et al.,2013). Trong khi đó, mức

độ nghiêm trọng của bệnh được ghi nhận ở Ulu Sarikei (70%), sau đó là Pasai

Siong (62%) và thấp nhất ở Tatau (4%) (Farhana et al., 2013), tác nhân gây

bệnh thối gốc của tiêu được xác định là P. capsici Leonian. Qua giai đoạn

dịch bệnh trên, chính quyền tại Malaysia đã khuyến cáo và nâng cao nhận

thức của người dân về tác động gây hại của hóa chất diệt nấm hoá học đối với

sức khoẻ, môi trường và hệ sinh thái và khuyến khích sử dụng biện pháp

9

phòng ngừa sinh học như là giải pháp an toàn để kiểm soát bệnh

Phytophthora (Anandaraj và Sarma, 1995b, Marins et al., 2014). Để giảm

thiểu việc áp dụng thuốc trừ nấm, mục tiêu của nghiên cứu này là sàng lọc các

vi sinh vật và nấm nội sinh trên cây hồ tiêu để ức chế sự phát triển của P.

capsici và nấm bệnh khác.

Hình 1.2: Hình dạng khuẩn lạc (A) và bào tử nấm (B) của nấm

Fussarium gây bệnh cây hồ tiêu

Hình 1.3: Bệnh thối rễ cây hồ tiêu do nấm Phytophthora

Hình 1.4: Nấm Phytophthora tấn công dây lươn cây hồ tiêu

(Ghi chú: Hình 1.1; 1.2 và 1.3 theo https://phanbondientrang.vn/cong-nghe/nam-gay-

benh-tren-cay-ho-tieu-391.html)

https://phanbondientrang.vn/cong-nghe/nam-gay-benh-tren-cay-ho-tieu-391.html

https://phanbondientrang.vn/cong-nghe/nam-gay-benh-tren-cay-ho-tieu-391.html

10

Ở Việt Nam, nói đến cây hồ tiêu, trước hết là nói đến bệnh hại, đó là vấn

đề lớn nhất với người trồng tiêu. Trong những năm gần đây, thiệt hại do dịch

bệnh trên cây tiêu có xu hu ớng tăng cả về diện tích lẫn mức độ thiệt hại. Dịch

hại phân bố rộng khắp trên các vùng trồng tiêu trong cả nu ớc và là nguyên

nhân chính làm giảm năng suất cây tiêu, giảm tuổi thọ vu ờn tiêu và thu nhập

của nông dân trồng tiêu. Tổng hợp tình hình thiệt hại do dịch bệnh ở 16 tỉnh

trồng hồ tiêu, Cục Bảo vệ Thực vật cho biết bệnh chết nhanh, tuyến trùng và

rệp sáp là ba loại dịch hại phát sinh từ đất hiện diện phổ biến và gây hại nặng

cho cây tiêu ở tất cả các tỉnh, trong đó bệnh gây hại nặng nhất là bệnh chết

nhanh, kế đến là tuyến trùng và rệp sáp.

Bệnh chết nhanh (Quick wilt, Phytophthora foot rot) hay còn gọi là thối

gốc, rễ, chết dây trên cây tiêu. Có tên gọi như vậy là vì từ khi thấy cây tiêu “ủ

rũ”, dây héo, xuống lá bắt đầu chuyển vàng, rụng nhiều lá chỉ để lại dây, sau

đó cây tiêu chết rất nhanh trong vòng vài tuần lễ. Quan sát dấu hiệu cây hồ

tiêu bị bệnh khi được nhổ lên thì thấy toàn bộ rễ bị thối đen nhất là phần cổ

rễ, phần thân sát mặt đất bị thối rã, vỏ cây bong ra, mùi hôi nhẹ. Một khi đã

xuất hiện bệnh se làm cây chết hàng loạt nọc tiêu, dẫn đến việc phòng và trị

bệnh rất khó khăn, tốn kém và thường không mang lại hiệu quả vì khi triệu

chứng đã biểu hiện ra bên ngoài thì bộ rễ tiêu đã bị nấm tấn công trước đó 1

đến 2 tháng. Bệnh thối gốc, chết dây có nguyên nhân do một loại nấm sống

dưới đất, ưa ẩm là Phytophthora (Phytophthora palmivora, Phytophthora

capsici,…). Các nấm gây bệnh này thường phát sinh và phát triển lây lan

trong thời gian mùa mưa, cao điểm là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa. Nấm

Phytophthora thường kết hợp với các loại nấm ở trong đất khác như Pythium,

Fusarium, Rhizoctonia… cùng tấn công cây hồ tiêu làm cây chết rất nhanh.

Nấm bệnh có thể xâm nhập được hầu hết tất cả các bộ phận của cây như lá, rễ,

thân, nhánh…đặc biệt là phần nằm trong đất và sát mặt đất. Nếu có thêm

những tác nhân từ bên ngoài tác động vào, bệnh se dễ dàng phát triển thành

dịch. Khi dịch đã phát sinh, sự lây lan nhanh chóng của bệnh theo kiểu vết

dầu loang do nu ớc mua chảy tràn. Bước vào mùa mưa, mầm bệnh có trong đất

được nước lây nhiễm lên phần trên của cây. Ở một số quốc gia khác nhu : Ấn

11

Độ, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan, Philippine còn xuất hiện thêm loài nấm

P. nicotianae và loài nấm P. palmivora còn xuất hiện ở Indonesia, Ấn Độ,

Thái Lan, Trung Quốc, Brazil (Đoàn Nhân Ái, 2007).

Bệnh chết chậm (hay còn gọi bệnh tiêu vàng lá, bệnh tuyến trùng…) vì

bệnh làm cho cây tiêu sinh trưởng chậm, lá bị vàng héo trên toàn trụ tiêu và

rụng dần, ban đầu là các lá già, sau đó đến rụng đốt. Quan sát trong vườn tiêu

thì bệnh xuất hiện thành từng vùng, lúc đầu là một vài cây sau đó lan sang các

cây bên cạnh và tạo thành vùng bệnh. Tiêu bị bệnh chết chậm có thể vẫn cho

quả nhưng năng suất cực kỳ kém, phần mạch dẫn nhựa của thân dây có màu

nâu đen, và quá trình này kéo dài vài ba tháng đến cả năm. Một số cây có điều

kiện dinh dưỡng tốt và tiêu tơ bộ rễ đang phát triển mạnh, thì có thể chống

chọi với bệnh lên đến 2-3 năm nhưng cuối cùng vẫn chết. Bệnh chết chậm

cùng với bệnh tiêu chết nhanh tạo thành cặp “song sát” gây ra nỗi ám ảnh cho

người trồng tiêu, một khi tiêu đã mắc bệnh, rất dễ lây lan ra cả vườn tiêu, gây

nên dịch và làm tiêu chết hàng loạt. Bộ rễ tiêu bị bệnh chết chậm phát triển

kém, khi đào lên quan sát thì thấy các nốt sần nằm rải rác hoặc nằm thành

từng chuỗi. Ở tiêu con (tiêu tơ mới trồng được 1-2 năm) các triệu chứng vàng

lá do tuyến trùng thường dễ bị nhầm với thiếu dinh dưỡng, để nhận biết nên

quan sát nếu thấy lá non teo nhỏ, bạc màu, vàng đồng loạt trên toàn trụ, bứt lá

thấy khá dai. thì nên kiểm tra ngay phần rễ, nếu xuất hiện nốt sần thì khả năng

cao là tuyến trùng Meloidogyne đã vào làm tổ, cây có thể sinh trưởng chậm

nhưng chưa chết ngay, vào giai đoạn kinh doanh se phát bệnh do bắt đầu

nhiễm nấm. Theo đánh giá tại Tây Nguyên, nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chết

chậm là tuyến trùng Meloidogyne incognita và một số loại nấm (Fusarium

sp., Fusarium solani, Phytophthora sp., Pythium sp.) gây ra. Ban đầu tuyến

trùng tấn công vào bộ rễ gây ra những vết thương tổn, tạo điều kiện cho nấm

tấn công. Rễ tiêu bị nhiễm nấm yếu dần dẫn tới việc cung cấp nước và dinh

dưỡng cho phần cành lá bên trên không hiệu quả. Theo thời gian sợi nấm và

bào tử se lan dần lên phần thân và cành, rễ bắt đầu thối và cây se chết.

Sở dĩ gọi tuyến trùng là sát thủ giấu mặt vì chúng có kích thước hiển vi

nên mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có loại tuyến trùng nội ký sinh

(Meloydogyne) làm cho rễ bị u bướu thì các nhà khoa học mới biết tác động

12

gây bệnh của tuyến trùng. Thường khi cây bị vàng lá bất thường chúng ta hay

nghĩ là do nấm Phytophthora sp. Fusarium sp. Pythium sp… Nhưng một

trong những nguyên nhân sâu xa là do tuyến trùng tấn công rễ, làm rễ bị tổn

thương, tạo cơ hội cho các loại nấm trên tấn công hại rễ tiêu. Ngoài tuyến

trùng Meloidogyne (còn gọi tuyến trùng nốt sần) gây hại hồ tiêu, trên tiêu có

nhiều loại tuyến trùng gây hại phổ biến khác như Pratylenchus, Radopholus,

Xiphinema, Circonemoides, Tylenchus sp, Rotylenchulus, Paratrichodorus,....

Bệnh chết nhanh trên cây tiêu rất nguy hiểm, nấm gây bệnh tấn công trên

tất cả các phần của cây tiêu, và ở tất cả các thời kỳ sinh tru ởng của cây,

truờng hợp nấm bệnh tấn công vào rễ hoặc cổ rễ se gây cây chết đột ngột

(Phan Quốc Sủng, 2000). Bệnh thường phát triển nhiều trong mùa mu a,

những lá bên duới se dễ nhiễm nấm bệnh sau những co n mu a lớn vào đầu

mùa mu a. Nấm bệnh xâm nhập vào cây trực tiếp qua biểu bì hoặc gián tiếp

qua khí khổng. Cây bị nhiễm bệnh ở cổ rễ se chết héo thình lình, lá chuyển

sang màu đen, khô sớm nhu ng còn dính lại trên cây. Nguợc lại, nếu cây bị

nhiễm từ rễ, lá bị héo vàng, và cây rụng lá từ từ. Nguyên nhân gây bệnh là do

loài nấm Phytophthora palmivora, Phytophthora capsici, Fusarium sp.,

Rhyzoctonia sp., Pythium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp.,... (Phan Quốc

Sủng, 2000)

Ngoài ra, hồ tiêu hiện là cây trồng bị rất nhiều loài tuyến trùng ký sinh

gây hại, ví dụ như tại Tân Lâm (Quảng Trị), cây tiêu bị nhiễm đến 49 loài

tuyến trùng, trong đó có 4 loài đu ợc đánh giá quan trọng gây nguy hiểm cho

cây gồm Meloidogyne incognita gây bệnh nốt sần, Rotylen chulus gây đen rễ,

Xiphinema americanum truyền virus gây bệnh vàng lá, Paratrichodorus

namus truyền virus gây bệnh xoắn lá (Nguyễn Ngọc Châu, 1995). Nghiên cứu

về tình hình dịch hại và đề xuất các biện pháp phòng trừ đối với vùng trồng

tiêu thuộc các tỉnh Tây Nguyên (Đào Thị Lan Hoa và cộng sự, 2003; Trần

Kim Loang và cộng sự) cho rằng bệnh hại rễ là các đối tu ợng xuất hiện phổ

biến, gây thiệt hại nghiêm trọng và rất khó phòng trừ là nấm Phytopthora spp.

và tuyến trùng Meloidogyne sp. là quan trọng. Sử dụng vi sinh vật đối kháng

13

se khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây bệnh, đây chính là hiệu quả của

việc quản lý dịch hại dựa trên co sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất.

1.1.6. Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong đấu tranh sinh

học phòng chống bệnh cho cây trồng

Theo Cook JR và Ber KF (1983), “Biện pháp đấu tranh sinh học”

(biocontrol) trong bảo vệ thực vật là sử dụng một hay nhiều loại vi sinh vật để

kiềm chế bệnh thực vật sinh ra từ đất. Biện pháp này là cơ sở của hệ thống

quản lý thống nhất các tai họa (IPM) do tổ chức FAO để xướng. Qua thực tế

cho thấy, các loại vi sinh vật đối kháng trong đất phát triển và xâm nhập vào

bên trong và trên cây tạo khả năng chống chịu cho cây chủ. Biện pháp này

nhằm giải phóng đất khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tìm kiếm các biện pháp

phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó ra đời nền công nghiệp hoá học trừ

sâu, diệt các mần bệnh cho cây trồng. Cho đến nay, không ai phủ nhận vai trò

tích cực của thuốc hoá học trừ sâu bệnh hại cây trồng. Nhưng biện pháp hoá

học cũng có những mặt hạn chế của nó. Nhiều trường hợp ô nhiễm môi

trường khi dùng thuốc diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu hóa học làm cho người bị

ngộ độc, súc vật bị chết và sinh vật đi kèm theo cây trồng cũng bị ảnh hưởng

dẫn đến sự mất cân bằng sinh thái. Đáng ngại hơn một số thuốc trừ sâu chậm

bị phân huỷ và là mối nguy hại lâu dài trong đất (ví dụ DDT có thể kéo dài 25

năm). Các hợp chất này được tích luỹ trong đất và nồng độ của chúng tăng

theo thời gian. Nghiêm trọng hơn là sự tuỳ tiện về liều dùng và thời gian phun

thuốc hoá học chống sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc lớn trên các loại rau

màu và cây lương thực, gây những vụ ngộ độc tại hại ảnh hưởng nghiêm

trọng đến sức khoẻ con người.

Chính vì vậy, những cuộc tìm kiếm, thử nghiệm các biện pháp mới nhằm

phòng chống bệnh cho cây trồng đã được tiến hành và đã thu được kết quả

khả quan. Sau một thời gian tìm tòi nghiên cứu, người ta đã phát hiện được

vai trò tích cực của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của

sinh quần. Biện pháp đấu tranh sinh học được hoàn thiện thêm dần khi người

ta sử dụng vi sinh vật để phòng chống sâu bệnh cho cây trồng. Ở nhiều nước,

14

chế phẩm vi sinh được sản xuất ở qui mô lớn và được sử dụng rộng rãi trong

công tác phòng trừ bệnh cho cây trồng và cây rừng. Có thể nói biện pháp đấu

tranh sinh học bằng vi sinh vật đã thực sự trở thành nội dung quan trọng của

hệ thống phòng trừ sâu bệnh tổng hợp.

Chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học nói chung và vi sinh

vật nói riêng có nhiều điểm ưu việt như sau:

- Không gây độc hại cho người, động vật và cây trồng; có khả năng tiêu

diệt chọn lọc các loại sâu bệnh và không ảnh hưởng xấu đến khu hệ vi sinh

vật trong đất, cho nên nó không phá vỡ cân bằng sinh thái, không gây ô nhiễm

môi trường.

- Sử dụng các chế phẩm vi sinh vật, một số loại mang ý nghĩa phòng

bệnh lâu dài. Trong đấu tranh sinh học, việc sử dụng các loại vi sinh vật cũng

cần cân nhắc kỹ lưỡng trước khi đưa vào áp dụng trong thực tế sản xuất.

Con người đã và đang nghiên cứu mở rộng tác dụng của chế phẩm thuốc

trừ sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh vật bằng nhiều biện pháp. Một trong những

biện pháp đó là thực hiện chuyển gen chi phối việc tạo tính độc cho nhiều loại

sâu bệnh hại sang cho nhiều loại cây trồng, tạo nên cây trồng tự nó có khả

năng kháng được sâu bệnh. Ở Việt Nam cũng đã có thành công trong việc

chuyên gene kháng rầy nâu, kháng bệnh đạo ôn cho lúa, kháng sâu hà cho

khoai lang. Trong tương lai chắc chắn se mang lại hiệu quả to lớn cho ngành

trồng trọt.

Phát triển nông nghiệp bền vững là quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ

với việc tăng cường sử dụng các chế phẩm sinh học đang là xu hướng chung

Việt Nam cũng như các nước trên thế giới. Các chế phẩm công nghệ sinh học

ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm chính với các

tính năng khác nhau như sau: (1) Nhóm chế phẩm công nghệ sinh học dùng

cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích

tăng trưởng bón cho cây trồng; (2) Nhóm chế phẩm công nghệ sinh học ứng

dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng và (3) Nhóm chế phẩm công

nghệ sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp.

15

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm nên tạo điều kiện thuận

lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh thực

vật. Vì vậy, việc sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học nhằm tăng năng

suất, sản lượng đã dẫn tới thoái hóa đất, tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật, mất

cân bằng hệ sinh thái trong đất và ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây

ô nhiễm môi trường.

Theo hướng trên, ngay từ năm 1990, KC-08-14: “Nghiên cứu và ứng

dụng công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bệnh bằng các chế phẩm vi khuẩn và

nấm” thuộc Chương trình Công nghệ sinh học (1990-1995) đã tuyển chọn

được tập hợp các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống

nấm, đặc biệt là các loại nấm Piricularia oryzae gây bệnh đạo ôn, Pellicularia

oryzae gây bệnh khô vằn, Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cho cây

trồng; lên men tạo chế phẩm và thử nghiệm chế phẩm ở quy mô đồng ruộng

cho kết quả tốt, giảm bệnh nấm trên cây. Từ đó đã nghiên cứu nâng cao hoạt

tính các chủng xạ khuẩn ứng dụng vào phòng chống bệnh cho cây trồng.

Nhiều đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng ứng

dụng phòng chống bệnh cho cây trồng, như các đề tài ở Viện Công nghệ sinh

học đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm (tế bào, dịch ngoại bào) từ vi khuẩn đối

kháng Burkholderia, Pseudomonas và Bacillus có tác dụng kiểm soát hiệu

quả nấm R.solani gây hại cây rau và F. oxysporum gây hại cây cà chua; vi

khuẩn đối kháng Pseudomonas sinh tổng hợp chất ngoại bào syringomycin,

syringostatin, syringotoxin, cepacin A, cepacin B, phenazine và pyrrolnitrin;

Burkholdria sinh tổng hợp chất cepacin và pyrrolnitrin; Bacillus sinh tổng

hợp iturin, surfacin, bacilysin, bacillomycin và mycobacillin có hoạt tính diệt

nấm R. solani, F. oxysporum gây bệnh thối rễ, thối thân ở nhiều loại cây trồng

quan trọng. Trong các vi sinh vật đối kháng, nhóm vi khuẩn Bacillus đuợc

chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm nhu : Rhizoctonia,

Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytophthora và một số vi khuẩn khác nhờ

vào khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn.

Hu ớng phòng trừ bệnh cây bằng biện pháp sinh học đã và đang đu ợc

nhiều các nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam nghiên cứu và cho ra các

16

chế phẩm sinh học có nhiều triển vọng. Đây là một trong những biện pháp

đấu tranh sinh học có hiệu quả để phòng trừ các loại nấm gây bệnh hại cây

trồng, giúp cây trồng phát triển tốt ho n, làm cho tác nhân gây bệnh không

kháng thuốc, an toàn với môi tru ờng sinh thái, phù hợp với xu hu ớng an toàn

nông nghiệp hiện nay. Tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm

bệnh là biện pháp phổ biến của công tác phòng trừ sinh học. Hiện nay nhiều

chế phẩm vi sinh vật đối kháng đang được bán và sử dụng trong phòng chống

bệnh cho cây trồng.

1.2. VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ NĂNG

ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

1.2.1. Vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) trên cây hồ

tiêu

Năm 1957, Smith đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micro-

monospora sp. ở mô tế bào từ 4/20 giống cà chua khỏe mạnh và chủng xạ

khuẩn này có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxysporum f. sp.

Lycopersici. Từ đó, có rất nhiều định nghĩa về vi sinh vật nội sinh

(endophytic), trong đó, Bacon và White đã định nghĩa Vi sinh vật nội sinh

như sau: “Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế

bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ”. Điều đó cũng có

nghĩa, các VSVNS cũng giống như vi sinh vật khác có khả năng đối kháng

các vi sinh vật gây bệnh cây, nhưng không ảnh hưởng sấu đến cây chủ.

Ngoài ra, các nghiên cứu về VSVNS trên cây hồ tiêu của Conn et al.,

2008 và Nascimento và cộng sự, 2015 cho thấy, với sự có mặt VSVNS se

tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích tăng trưởng, tăng khả năng

miễn dịch cho vật chủ bằng cách sản sinh ra những sản phẩm trao đổi chất thứ

cấp.

1.2.2. Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh trên

cây hồ tiêu

Bệnh thối rữa do Phytophthora capsici là một trong những trở ngại

nghiêm trọng đến sản xuất tiêu ở Việt Nam và các nước khác, đòi hỏi phải

17

thường xuyên phun thuốc trừ nấm trong nông nghiệp. Để giảm thiểu việc sử

dụng các hoá chất độc hại, một số giải pháp quản lý an toàn như các giống

kháng bệnh, các tác nhân kiểm soát sinh học đã được đề xuất. Một số vi sinh

vật đối kháng ở vùng rễ đã được sử dụng để phòng bệnh thối gốc (Anith et

al.,2003; Diby et al.,2005) và một số vi khuẩn nội sinh (Van Buren et

al.,1993; Chen et al.,1995; Chanway 1996; Zinniel et al.,2002). Quần thể vi

sinh vật nội sinh đã được xác định trong khoai tây (Sturz et al.,1999; Garbeva

et al.,2001), ngô (McInroy và Kloepper 1995), bông (Misaghi và

Donndelinger 1990, McInroy và Kloepper 1995) và dưa chuột (Mahafee và

Kloepper 1997). VSV nội sinh có thể xâm nhập hoặc lan truyền tới các bộ

phận khác nhau của thực vật (Hallmann et al.,1997), trong gian bào (Patriquin

và Dobereiner 1978) hoặc trong hệ thống mạch nhựa cây (Bell et al.,1995).

Vi khuẩn có thể xâm chiếm và tồn tại trong rễ, đi vào trong các mô cây như

củ (Hollis, 1951), trái cây (Samish et al.,1961), thân cây (Misaghi và

Donndelinger 1990), hạt và noãn (Mundt và Hinkle, 1976). Năm 2008,

Aravind và cộng sự đã phân lập được 74 chủng vi sinh vật nội sinh trên cây

tiêu đen (Piper nigrum L.) để đánh giá đối kháng đối với P. capsici, trong đó

6 chi thuộc Pseudomonas spp. (20 chủng, Serratia (1 chủng), Bacillus spp.

(22 chủng), Arthrobacter spp. (15 chủng), Micrococcus spp. (7 chủng),

Curtobacterium sp. (1 chủng) và 8 chủng không xác định đã được phân lập từ

các mô, nội mô của rễ và thân. Ba chủng IISRBP 35, IISRBP 25 và IISRBP

17 có khả năng đối kháng Phytophthora tới 70% trong phòng thí nghiệm và

nhà lưới. Các chủng IISRBP 35 được định danhlà Pseudomonas aeruginosa

(Pseudomonas EF568931), IISRBP 25 là P. putida (Pseudomonas

EF568932), và IISRBP 17 là Bacillus megaterium (B. megaterium

EU071712).

Năm 2015, Nascimento và cộng sự đã phân lập được 28 chủng vi sinh

vật nội sinh trên cây tiêu đen (Piper nigrum L.) thuộc 13 chi: Bacillus,

Paenibacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Sinorhizobium,

Agrobacterium, Ralstonia, Serratia, Cupriavidus, Mitsuaria, Pantoea, và

Staphylococcus. Kết quả cho thấy, hai chủng vi sinh vât nội sinh Pt12 và

Pt13, được xác định là Pseudomonas putida và Pseudomonas sp., tương ứng,

18

có thể ức chế F. solani f. sp piperis trong thử nghiệm in vitro. Trước đây,

nhóm nghiên cứu này đã mô tả đặc tính phân tử của 23 vi sinh vật nội sinh từ

hồ tiêu P. tuberculatum, trong đó có hai loài Pseudomonas có khả năng kiểm

soát bệnh thối rễ của tiêu đen ở vùng Amazon.

1.2.3. Khả năng ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng chống

nấm gây bệnh cây hồ tiêu

Vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) là những vi sinh vật có

thể sinh trưởng, phát triển trong các mô của cây. Conn et al., (2008) công bố

kết quả nghiên cứu gây nhiễm chủng Streptomyces sp. EN27 và

Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana đã làm

tăng sức đề kháng lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum, kích

hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic và etylen. Mối liên

hệ giữa VSV nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính

sinh học được sinh ra bởi VSV nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có

tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. Mujal et al.,

(2015) công bố chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ hồ tiêu Bacillus

megaterium có hoạt tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium,

Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hợp chất kháng nấm. Aravildet al.,

(2009, 2010), đã phân lập 71 chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ và thân cây hồ

tiêu và tuyển chọn được 3 chủng có khả năng ức chế nấm thối rễ hồ tiêu

Phytophthora capsici tới 70% trong điều kiện phòng thí nghiệm và mô hình

trong nhà lưới. Ngoài ra, người ta cũng đã phát hiện nhiều loại vi nấm nội

sinh trên thực vật và ký sinh trên tuyến trùng (nấm nội ký sinh): đây là các

loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ thể tuyến trùng để ký sinh gây

bệnh cho tuyến trùng. Một số loài nấm như Nematoctonus spp, Meria

coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định.

1.3. NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG

PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM

1.3.1. Nghiên cứu bệnh gây hại trên cây hồ tiêu

19

Bẹ nh hại nghiem trọng nhất hiẹ n nay đối với hồ tie u là bẹnh chết nhanh

do nấm Phytophthora và bẹnh chết chạ m có thể do sự cọ ng hợp của các tác

nhan nấm và tuyến trùng gây ra.

a. Bệnh chết nhanh

Bệnh chết nhanh ở Việt Nam được ghi nhận vào năm 1952, nhưng không

được biết đến tác nhân gây bệnh. Tác giả Phạm Văn Biên et al. (1990) ghi

nhận tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu là nấm Phytophthora

palmivora và Diệp Đông Tùng et al. (1999) đã xác định tác nhân gây thối rễ

chết cây hồ tiêu tại Phú Quốc là do nấm Phytophthora parasitica var.

piperina. Theo Phan Quốc Sủng (2001) xác định tác nhân gây bệnh chết

nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora spp. gây nên. Bằng phương pháp

PCR, Trần Kim Loang et al.(2006) bước đầu đã xác định tác nhân gây bệnh

chết nhanh cây hồ tiêu tại Tây Nguyên là nấm Phytophthora palmivora. Tác

giả Nguyễn Vĩnh Trường (2008), dựa vào triệu chứng gây bệnh, đặc điểm

hình thái của các chủng phân lập được từ 4 tỉnh: Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu,

Bình Phước và Quảng Trị, đã xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ

tiêu là do nấm Phytophthora capsici. Kết quả này đã được kiểm tra lại bằng

phương pháp PCR-RFLP của vùng ITS, sử dụng primer ITS4 và ITS6.

Tác giả Phạm Ngọc Dung et al. (2010) xác định tác nhân gây bệnh chết

nhanh hồ tiêu ở Đăk Nông là do nấm Phytophthora tropicalis một loài mới

được phân tách từ loài Phytophthora capsici bằng kết quả chạy PCR và phân

tích chuỗi Internal Transcribed Spacer (ITS).

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên

cứu thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một

số bệnh hại cây trồng trong đó có chế phẩm sinh học đa chức năng SH1 của

Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do

nấm Phytophthora sp., chế phẩm Trichoderma spp. phòng trừ bệnh thối quả

ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây

Nguyên, Trần Kim Loang et al.(2008). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu và ứng

dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng và chống bệnh nấm gây bệnh chết

nhanh trên cây hồ tiêu.

20

b. Bệnh vàng lá chết chậm

Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1991) cho biết ở tất cả

các vùng trồng tiêu của Việt Nam đều có hiện tượng một số cây hoặc toàn bộ

vườn chết toàn bộ, chỉ còn trơ lại cây nọc, gây thiệt hại rất lớn. Bệnh làm chết

cả tiêu kiến thiết cơ bản và tiêu kinh doanh. Thông thường, bệnh chết chậm

dẫn tới 10 - 30 % diện tích tiêu bị hại nặng không có khả năng cho thu hoạch.

Một số vùng trồng tiêu lâu năm ở Phú Quốc và Quảng Trị, Quảng Bình

bệnh này phát triển mạnh tạo thành dịch lớn, gây thiệt hại nặng nề và đe dọa

ngành sản xuất tiêu ở đây. Ở Bình Long, Lộc Ninh tỷ lệ tiêu chết và bệnh là

30%, xã Bình Giã, Châu Thành, Đồng Nai có tới 90 % tiêu bị chết (Phạm Văn

Biên, 1989). Theo tác giả Nguyễn Ngọc Châu (1995), đã ghi nhận cây hồ tiêu

không chỉ bị bệnh do nhiều loại tuyến trùng ký sinh trên rễ như: Meloidogyne,

Radophonus, Rotylencholus… mà còn có một số nấm như: Fusarium,

Rhizoctonia…cùng tác động gây hại lên bộ rễ của cây tiêu. Những thao tác

trong khi bón phân, xới xáo đất và đặc biệt trong mùa mưa nếu tạo ra các vết

thương cho bộ rễ là điều kiện cho nấm bệnh xâm nhiễm và gây hại bộ rễ và

cuối cùng cây bị chết. Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1993),

các loài tuyến trùng Meloidogyne sp.tuy khác nhau về ký chủ song giống nhau

về quá trình phát triển. Tốc độ và thời gian phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ,

ánh sáng, ký chủ mà chúng gây hại.

Theo Nguyễn Ngọc Châu (2003), các loài tuyến trùng ký sinh thực vật

cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn,

nấm, Rickettsia Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và

tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch của tuyến trùng có

tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế tác hại

do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng.

1.3.2. Biện pháp phòng trừ bệnh cây hồ tiêu bằng biện pháp sinh học

Ở Việt Nam, các nhà khoa học chỉ ra rằng sự chuyển dịch phần lớn nền

nông nghiệp sang phương thức canh tác hữu cơ thì mới có thể vừa hạn chế

tình trạng đói nghèo trên thế giới, vừa góp phần cải thiện môi trường và biến

21

đổi khí hậu. Hiện nông nghiệp hữu cơ đang được áp dụng trên toàn thế giới.

Ở nước ta nông nghiệp hữu cơ đang ở giai đoạn đầu phát triển. Nông nghiệp

hữu cơ nhằm tạo ra các sản phẩm hữu cơ có chất lượng cao, đảm bảo vệ sinh

an toàn thực phẩm, góp phẩn bảo vệ sức khỏe con người, bảo vệ môi trường

sinh thái cộng đồng, giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu, đáp ứng với yêu

cầu hội nhập kinh tế quốc tế. Với định hướng như vậy, trong thời gian gần

đây, các hướng nghiên cứu về cây hồ tiêu chỉ tập trung vào các giải pháp khoa

học công nghệ và thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ

chế biến và xuất khẩu (Phạm Văn Biên, 2005), giải pháp quản lý tổng hợp

dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu (Nguyễn Tăng Tôn, 2009), biện pháp

kỹ thuật tổng hợp trong sản xuất cây tiêu theo hướng bền vững (Đỗ Trung

Bình, 2012 Phạm Thị Thùy, 2013), biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp nấm

Phytophthora gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu (Nguyễn Văn Tuất, 2012), xây

dựng mô hình ứng dụng tổng hợp một số sản phẩm phân bón sinh học-hoá

học và thuốc bảo vệ thực vật sinh học-hoá học trong canh tác cây hồ tiêu theo

hướng phát triển bền vững tại Tây Nguyên (Nguyễn Thị Thu (2016) v.v…

Sử dụng vi sinh vật đối kháng se khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây

bệnh đây chính là hiệu quả của việc quản lý dịch hại dựa trên co sở bảo vệ

cân bằng sinh thái trong đất. Biện pháp phòng trừ sinh học bằng các vi sinh

vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản

xuất nông nghiệp ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh

trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có khả năng kháng

nấm là việc làm cần thiết nhằm hạn chế sử dụng thuốc hóa học, phát triển

phong phú quần thể vi sinh vật có lợi se giúp cho cây trồng phát triển, tăng

sức đề kháng sâu bệnh.

Như vậy, ở Việt Nam chưa quan tâm nhiều đến nhóm vi sinh vật, đặc

biệt là các vi sinh vật nội sinh đối kháng trong việc phòng chống bệnh cho cây

hồ tiêu mà mới chỉ dừng lại ở việc sử dụng biện pháp hóa học cũng như các

chế phẩm sinh học từ nấm rễ đã hiệu quả mang lại chưa cao. Đây là vấn đề

nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát triển

ổn định và bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam.

22

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Các mẫu cây hồ tiêu và chủng giống vi sinh vật kiểm định

1. Các mẫu cây hồ tiêu thu thập từ Đắk Lắk

Mẫu cây hồ tiêu (3 mẫu rễ, 3 mẫu thân và 3 mẫu lá cây) được thu thập

tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk tại 3 địa điểm với tọa độ như sau:

12°35’18’’B;108°11’7’’Đ, 12°35’19’’B; 108°11’8’’Đ,

12°35’24’’B;108°11’5’’Đ vào tháng 07/2017.

2. Chủng giống vi sinh vật kiểm định

Ba chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum

CNLM, Phytophthora capsici CNLM và Rhizoctonia solani CNLM được

nhận từ Bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ

sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

1. Hóa chất:

Cao malt Himedia, Ấn Độ;

Cao nấm men Himedia, Ấn Độ;

Cao thịt Himedia, Ấn Độ;

Casein, Sigma, Mỹ;

Thạch Agar Fluka, Đức;

Pepton Fermentas, Mỹ;

Glycerol; MgSO4.7H2O; K2HPO4: Merck, Đức.

2. Thiết bị nghiên cứu:

Tủ cấy vô trùng Nunre, Mỹ

Nồi hấp khử trùng ALP, Nhật Bản

Tủ lạnh Panasonic, Nhật Bản

Cân phân tích SMIC, Trung Quốc

Tủ sấy Sanyo, Nhật Bản

23

Máy ly tâm lạnh Sorvall RC5B, Mỹ

Máy ổn nhiệt N-Biotek, Mỹ

Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ

Máy đo pH Thermo Scientific, Mỹ

Tủ cấy an toàn sinh học

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

1. Môi trường MPA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20;

H2O: 1000 ml; pH7.

2. Môi trường NA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20; H2O:

1000 ml; pH: 6,5-7.

3. Môi trường TSA (g/l): NaCl: 5; casein thủy phân: 15; peptone: 5;

thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7.

4. Môi trường KB (g/l): Casein thủy phân: 20; K2HPO4: 1,5;

MgSO4.7H2O: 1,2; glyxerol khử trùng: 20ml; thạch: 18; H2O: 1000 ml; pH:

6,5-7.

5. Môi trường PDA (g/l): Glucose: 20; khoai tây: 300; thạch: 20; H2O:

1000 ml; pH 6,5 - 7.

6. Môi trường MPA + CMC (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5; CMC:

10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Živković Set al., 2010).

7. Môi trường MPA + Casein (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5;

Casein: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kateka Det al., 2009).

8. Môi trường MPA + Chitin (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5;

Chitin: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kasana RC et al., 2008).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp thu mẫu: Theo TCVN 8551: 2010 về cây trồng

Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu, có thể tóm tắt như sau: Các mẫu

cây hồ tiêu (hồ tiêu khỏe và hồ tiêu bị bệnh) trong mùa khô và mùa mưa được

lấy bằng dao đã khử trùng và lưu giữ trong các túi nilon sạch. Mỗi mẫu cây

hồ tiêu được chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilông sạch có

24

ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC

cho đến khi xử lý và phân tích trong vòng 48 giờ.

2.2.2. Khử trùng bề mặt và phân lập vi sinh vật nội sinh

VSVNS được tiến hành phân lập từ các mẫu rễ, thân, lá của cây hồ tiêu

theo phương pháp của Aravind và cộng sự, năm 2009. Mẫu rễ, thân, lá được

rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu. Các mẫu

được khử trùng trong dung dịch 5% NaClO, 5 phút, rửa lại mẫu bằng dụng

dịch 2% (w/v) Na2S2O3 trong 2 phút để loại bỏ clo dư. Tiếp tục xử lý mẫu

trong ethanol 70% (v/v) trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng để

loại bỏ ethanol và nhúng mẫu trong trong dung dịch 10% (w/v) NaHCO3

trong 5 phút để ức chế nấm cộng sinh.

Sau khi khử trùng mẫu xong tiến hành phân lập mẫu trên môi trường

dinh dưỡng phân lập vi sinh vật bằng cách rắc mẫu trên bề mặt môi trường

phân lập và ủ ở 30oC trong 2-3 ngày. Theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc

đếm số lượng vi khuẩn có trong đĩa Petri. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi

sinh vật khác nhau ra các đĩa Petri có chứa môi trường MPA. Bước đầu nhận

dạng các loại vi sinh vật khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích

thước của khuẩn lạc (Aravind R. et al. 2009).

2.2.3. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật nội

sinh với nấm bệnh

Hoạt tính đối kháng được xác định theo Gong M et al., 2006 như sau: Sử

dụng phương pháp thử nghiệm kép, nấm bệnh và vi sinh vật nội sinh được

nuôi cách nhau 3 cm trên đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm) ở 27oC

trong 6 ngày. Nếu vi sinh vật nội sinh có có khả năng ức chế nấm bệnh se

thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi sinh vật nội sinh, sợi nấm bệnh không

sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu. Còn nếu vi sinh vật nội sinh không có khả

năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh se thấy nấm bệnh phát triển bình

thường. Từ đó sơ bộ lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng

nấm gây bệnh.

2.2.4. Xác định khả năng ức chế nấm bệnh của dịch lọc vi sinh vật

nội sinh

25

Xác định khả năng ức chế nấm bệnh được tiến hành bằng phương pháp

đục lỗ như sau: Dịch nuôi cấy các chủng vi sinh được lọc loại bỏ sinh khối và

nhỏ dịch lọc vào các lỗ thạch trên môi trường PDA đã cấy nấm gây bệnh (Lê

Gia Hy, 2012). Sau 48-72 giờ nuôi trong tủ ấm 30oC, xác định vòng ức chế

sinh trưởng của nấm. Từ đó lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối

kháng nấm gây bệnh.

2.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh được mô tả theo

phương pháp của Živković cùng cộng sự năm 2010 và Jeyaseelanet năm

2012. Tổng số VSVNS được cấy vệt trên môi trường thạch PDA, khoảng

cách vệt cấy xấp xỉ 1cm với mép đĩa petri. Nấm gây bệnh được cắt khoảng

1cm2 và đặt đối diện với vệt cấy VKNS, đĩa không có vệt VKNS là đối chứng.

Các mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3-5 ngày.

Phần trăm ức chế tăng trưởng nấm sợi (RI%) được tính như sau:

RI (%) = 𝐷1−𝐷2

𝐷1x 100%

D1: Chiều dài nấm sợi trên đĩa đối chứng.

D2: Chiều dài nấm sợi trên đĩa có VKNS.

Tỷ lệ ức chế tăng trưởng nấm sợi được đánh giá như sau: ˂ 30% = hoạt

động kháng nấm thấp; 30 - 50% = hoạt động kháng nấm vừa phải; 50 - 70% =

hoạt động kháng nấm cao; ≥ 70% = hoạt động kháng nấm rất cao.

Những VSVNS có kết quả tỷ lệ kháng nấm gây bệnh lớn hơn 30% được

lựa chọn và lưu giữ để nghiên cứu tiếp.

2.2.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng lựa

chọn (theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey, 1989)

Quan sát hình thái khuẩn lạc: Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ

các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình

dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, duới,

có khuếch tán ra môi trường hay không). Đặc điểm hình thái của các chủng vi

khuẩn được quan sát, so sánh trên môi trường MPA ở nhiệt độ 35-37°C. Sau

26

24-48 giờ lấy mẫu quan sát kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc trên môi

trường.

Nhuộm Gram: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế

bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất

khác nhau theo Trần Thanh Thủy, 1999.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey,

1989:

- Thử khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng vi sinh vật được

thể hiện khi nuôi trên môi truờng khoáng có bổ sung các nguồn carbon (1,0

%, w/v): D-glucose, D-maltose, Myo-inositol, D-mannitol, Saccharose,

Cellobiose, D-fructose, tinh bột tan. Sau 24 nuôi cấy, tiến hành đo OD dịch

nuôi vi khuẩn.

- Thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của chủng vi sinh vật được thể

hiện khi nuôi trên môi truờng khoáng có bổ sung các nguồn nitơ (1,0 %, w/v):

L-arginin, L-lysin, Methionin, Leusin, L-tryptophan, L-valine, L-alanine và

glycine. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh với môi

trường đối chứng âm (môi trường MPA).

Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên môi trường

MPA lỏng có pH môi trường trong khoảng từ pH 4,0 đến pH 8,0. Sau 24 giờ

tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh kết quả từ đó chọn ra pH tối

ưu nhất.

Xác định nhiệt độ, nồng độ NaCl thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên

môi trường MPA thạch ở các nhiệt độ khác nhau (20; 25; 30; 35; 45 và 45°C)

và trên môi trường MPA thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 0,5 -

2,0% (w/v) ở 37°C, sau 24 giờ tiến hành quan sát sự sinh trưởng của vi sinh

vật.

2.2.7. Phân loại vi sinh vật dựa trên phân tích trình tự gen

Trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng

PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R đối với vi khuẩn có trình tự như trong

bảng 2.1.

27

DNA tổng số của vi sinh vật và nấm được tách theo phương pháp của

Sambrook và Russell (2001). Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được

sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb Thermo

scientific, Mỹ. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA

Purification Invitrogen, Mỹ và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI

PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA,

Mỹ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam. Trình tự gen 16S rDNA được so sánh với các trình tự tương ứng trên

GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

khuếch đại gen 16S rDNA

Tên đoạn mồi Trình tự mồi

27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’

1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’

Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật

Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn

sinh học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn,

trong đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất.

2.2.8. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào

Phương pháp cấy chấm điểm trên thạch theo Mohd và các cộng sự

(2015) được tiến hành như sau: Cấy chấm điểm VKNS trên môi trường có 1%

cơ chất tương ứng. Ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC trong 18-24 giờ. Nhuộm màu bằng

thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng thủy phân trên đĩa thạch môi

trường.

Môi trường thử khả năng sinh protease; MPA + cơ chất (1% cazein),

thuốc nhuộm HgCl2 (5%) (Kateka et al., 2009).

Môi trường thử khả năng sinh cellulase: MPA + cơ chất (1% CMC),

thuốc nhuộm lugol (5%) Kasana et al., 2008).

28

Môi trường thử khả năng sinh chitinase: MPA + cơ chất (1% chitin),

thuốc nhuộm lugol (5%) (Usharani et al., 2011).

Đánh giá khả năng sinh enzyme: Hoạt tính enzyme = D-d (cm), trong đó:

D: Đường kính vòng phân giải; d: Đường kính khuẩn lạc.

2.2.9. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp

- Các môi trường được sử dụng để lựa chọn môi trường nuôi cấy thích

hợp: MPA, NA, TSA và. KB (xem thành phần môi trường)

- Nghiên cứu thay đổi nguồn cacbon và ni tơ của môi trường được tuyển

chọn: Nguồn (glucose, rỉ đường, saccaroza, dextriose, tinh bột tan và

manitol), nguồn nitơ (bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt,

cao thịt).

- Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp: Chủng được nuôi trên môi

trường tuyển chọn với thay đổi điều kiện lên men: các nhiệt độ khác nhau

20C; 25C; 30C; 35C; 40C; pH môi trường trong khoảng từ pH 5,0 đến

pH 8,0; tỷ lệ tiếp giống 1, 3, 5, 7 và 9%; độ thông khí 5; 10; 15; 20; 25%. Sau

72 giờ tiến hành quan sát mức độ sinh trưởng và hoạt tính kháng nấm.

2.2.10. Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici

Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici CNLM trên

cây hồ tiêu của chủng được tuyển chọn quy mô phòng thí nghiệm được tiến

hành như sau: Phun dịch tế bào của vi sinh vật (108 tế bào/ml), dịch bào tử

nấm (105 bào tử/ml) và nước vô trùng lên lá hồ tiêu trong 30’, lá hồ tiêu đặt

trên giấy lọc ẩm trong đĩa Petri đã được vô trùng. Dịch huyền phù bào tử của

nấm P. capsici chứa khoảng 105 bào tử/ml đã được chuẩn bị và phun lên lá đã

được phun vi sinh vật tuyển chọn. Ủ ở 20ᵒC trong 12 giờ sáng/tối trong 10

ngày. Mức độ của mầm bệnh được đánh giá dựa trên mức độ từ 0 đến 4: 0 là

không hiện tượng; 1:1-12% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen;

2: 13-25% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 3: 26-50% vùng

lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 4: 51-100% vùng lá bị bao phủ

bởi mầm bệnh màu nâu đen. Mỗi chủng nghiên cứu bao gồm 5 lá cắt rời thực

hiện 3 lần lặp lại (Lee và Hwang, 1996).

29

2.2.11. Xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên

phần mềm excel năm 2017. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên

công thức thống kê:

Giá trị trung bình(X): X = 1

𝑛∑ X𝑛

𝑖=1 I;

Độ lệch chuẩn (δ): δ = √∑ (𝑋𝑖−𝑋)2𝑛

𝑖=1

𝑛−1 ; Sai số (m): 𝑚 = ±

δ

𝑚

30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ HOẠT TÍNH

KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ các mẫu cây

hồ tiêu

Từ 9 mẫu cây hồ tiêu được khử trùng bề mặt theo phương pháp của

Aravind và cộng sự, 2009 và phân lập vi sinh vật nội sinh theo phương pháp

của theo Gazis và cộng sự, 2012 trên 4 loại môi trường MPA, TSA, NA và

KB. Sau thời gian nuôi cấy từ 1-3 ngày, đã phân lập và thuần khiết được 36

chủng vi sinh vật nội sinh được trình bày trên bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ các mẫu rễ, thân,

lá trên hồ tiêu tại Đắk Lắk

TT Ký hiệu

chủng

Vị trí

phân

lập

Môi

trường

phân lập

TT Ký hiệu

chủng

Vị trí

phân lập

Môi

trường

phân lập

1 HDL01 Rễ TSA 19 HDL19 Thân MPA

2 HDL02 Thân MPA 20 HDL20 Rễ NA

3 HDL03 Lá NA 21 HDL21 Rễ TSA

4 HDL04 Thân MPA 22 HDL22 Rễ NA

5 HDL05 Rễ MPA 23 HDL23 Thân MPA

6 HDL06 Thân TSA 24 HDL24 Rễ TSA

7 HDL07 Rễ MPA 25 HDL25 Rễ MPA

8 HDL08 Rễ KB 26 HDL26 Thân MPA

9 HDL09 Lá NA 27 HDL27 Rễ NA

10 HDL10 Rễ KB 28 HDL28 Thân KB

11 HDL11 Thân MPA 29 HDL29 Lá KB

12 HDL12 Thân NA 30 HDL30 Thân KB

13 HDL13 Lá MPA 31 HDL31 Lá MPA

14 HDL14 Rễ NA 32 HDL32 Thân TSA

15 HDL15 Rễ NA 33 HDL33 Thân MPA

31

16 HDL16 Thân KB 34 HDL34 Rễ TSA

17 HDL17 Lá TSA 35 HDL35 Thân KB

18 HDL18 Rễ MPA 36 HDL36 Rễ TSA

Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy, số lượng các chủng vi sinh vật nôi sinh

trên cây hồ tiêu khá phong phú, đa dạng và thu thập được cả 3 bộ phận của

cây. So sánh với kết quả nghiên cứu của Nascimento và cộng sự năm 2015,

nhóm nghiên cứu phân lập được 28 chủng VKNS từ các mẫu rễ, thân, lá trên

cây hồ tiêu (Piper nigrum L.), của Vijay và cộng sự, 2011, đã phân lập được

17 chủng VKNS từ rễ, thân, lá của 10 cây tiêu lốt (Piper Longum L.) cùng

thuộc họ Piperaceae . Tuy nhiên so sánh với kết quả của Toh và cộng sự,

2016 đã phân lập được 126 chủng VKNS từ rễ của các cây tiêu đen (Piper

nigrum L.) hoặc Aravind và cộng sự, 2008, đã phân lập được 74 chủng VKNS

từ 10 mẫu cây tiêu đen Ấn Độ (Piper nigrum L.) trong đó có 66 chủng phân

lập từ rễ và 8 chủng phân lập từ thân, thì cho thấy tỷ lệ các chủng vi sinh vật

nội sinh phân lập được từ cây hồ tiêu ở Cư Kuin, Đắk Lắk ở mức trung bình.

Điều này chứng tỏ, mức độ đa dạng của các chủng vi sinh vật trên mẫu phụ

thuộc vào phương pháp phân lập và vị trí địa lý vùng phân lập như khí hậu,

nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH môi trường (Bảng 3.1).

3.1.2. Sơ bộ phân nhóm vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu phân

lập được

Trên cơ sở 36 chủng vi sinh vật đã thu nhận được, chúng tôi tiến hành

phân tích, đánh giá mức độ phân bố theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu, được

thể hiện qua hình 3.1.

Hình 3.1: Vi sinh vật nội sinh theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu.

32

Kết quả Hình 3.2 cho thấy, vi sinh vật có mặt ở tất cả các bộ phận của

cây, trong đó vi sinh vật nội sinh từ rễ chiếm số lượng cao nhất với 16 chủng

(44,44%), tiếp theo là thân với 14 chủng (38,89%), số lượng được phân lập ít

nhất ở lá với 6 chủng chiếm 16,67%.

Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới, ví dụ như

Kollakkodan và cộng sự, 2015, phân lập từ các mẫu rễ, thân và lá của hai

giống tiêu là P. colubrinum và P. nigrum tại Ấn Độ đã thu được 47 chủng

VKNS có hình thái khác nhau, trong đó 17 chủng phân lập từ rễ, 22 chủng

phân lập từ thân và và 8 chủng phân lập từ lá và nhóm nghiên cứu Aravind

và cộng sự, 2009, đã phân lập được tổng số 110 chủng VKNS, trong đó có 49

chủng từ rễ, 28 chủng từ thân và 33 chủng còn lại từ các bộ phận khác trên

cây tiêu đen tại hai bang Karnataka và Kerala, Ấn Độ.

Trong nghiên cứu về đa dạng sinh học, kết quả trong nghiên cứu này có

thể khẳng định giả thuyết cho rằng rễ cây là vị trí đầu tiên vi sinh vật xâm

nhập và xâm nhiễm vào bên trong cây, tại các vùng rễ có bề mặt màng mỏng.

Ví dụ như vùng kéo dài của rễ và vùng lông hút và vùng rễ nền có các khe

nhỏ do sự xuất hiện của rễ thứ cấp. Do đó, số lượng vi sinh vật nội sinh ở rễ

thường chiếm số lượng cao nhất trong cây, sau đó thân cây thực hiện chức

năng vận chuyển thức ăn trên cơ thể thực vật theo các kênh dẫn truyền, đây có

thể phân lập được nhiều chủng vi sinh vật nội sinh, còn lá có chức năng quang

hợp, trao đổi khí, hô hấp và có sự xuất hiện vị sinh vật nội sinh bên trong các

mô lá.

3.1.3. Phân bố vi sinh vật nội sinh theo môi trường phân lập

Kết quả đánh giá phân bố các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên 4 loại

môi trường đặc hiệu được thể hiện trên bảng 3.2 cho thấy, trên môi trường

phân lập, số chủng vi sinh vật phân lập được phân bố đều trên các môi trường.

Cụ thể, môi trường MPA là môi trường phân lập được nhiều nhất (36,11%),

sau đó đến các môi trường NA và TSA 8 (22,22%) và thấp nhất là môi trường

KB (19,45%). Trong nghiên cứu phân bố môi trường phân lập, kết quả trong

nghiên cứu này có một chút khác biệt so với một số nghiên cứu, ví dụ như

nhóm Nascimento và công sự, 2015 nghiên cứu đã phân lập được 23 chủng

33

VSVNS trên 2 loại môi trường là TSA và NA, trong đó 14 chủng phân lập

trên môi trường NA (60,86%) và 9 chủng phân lập trên môi trường TSA

(39,1%). Nhìn chung, các nhóm nghiên cứu trên thế giới ưu tiên sử dụng các

phương pháp, lựa chọn các loại môi trường đặc hiệu nhằm phân lập các chủng

vi khuẩn mới.

Bảng 3.2: Số lượng chủng phân lập được trên các môi trường khác nhau

Môi trường dùng để phân

lập

Số chủng phân lập

được

Tỷ lệ (%) so với tổng số

chủng

MPA 13 36,11

NA 8 22,22

TSA 8 22,22

KB 7 19,45

3.1.4. Khả năng đối kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu của các

chủng vi sinh vật nội sinh

Từ 36 chủng VSVNS được phân lập tiến hành thí nghiệm đối kháng với

từng chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum CNLM,

Phytophthora capsici CNLM, Rhizoctonia solani CNLM được trình bày trên

bảng 3.3.

Bảng 3.3: Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh

trên cây hồ tiêu

STT Chủng

Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%)

Rhizoctonia

solani

Phytophthora

capsici

Fusarium

oxysporum

1 HDL01 0,23 (± 0,04) 74,36 (± 0,03) 0,23 (± 0,07)

2 HDL02 0,7 (± 0,03) 0,47 (± 0,06) 0,7 (± 0,08)

3 HDL03 47,67 (± 0,04) 46,15 (±0,02) 51,16 (± 0,04)

4 HDL04 0,23 (± 0,07) 0,7 (± 0,06) 0,47 (± 0,04)

5 HDL05 0,14 (± 0,07) 53,95 (± 0,07) 43,95 (± 0,02)

6 HDL06 0,23 (± 0,08) 57,21 (± 0,09) 55,12 (± 0,04)

7 HDL07 45,12 (± 0,03) 0,23 (± 0,05) 32,56 (± 0,06)

8 HDL08 0,47 (± 0,01) 0,23 (± 0,06) 0,7 (± 0,06)

34

9 HDL09 37,28 (± 0,03) 62,09 (± 0,08) 64,19 (± 0,03)

10 HDL10 45,09 (± 0,08) 71,4 (± 0,04) 63,95 (± 0,02)

11 HDL11 57,91 (± 0,07) 0,7 (± 0,01) 0,23 (± 0,06)

12 HDL12 0,7 (± 0,05) 40,93 (± 0,03) 76,67 (± 0,01)

13 HDL13 72,09 (± 0,09) 58,46 (± 0,08) 44,12 (± 0,03)

14 HDL14 0,7 (± 0,02) 0,7 (± 0,04) 0,47 (± 0,01)

15 HDL15 55,81 (± 0,03) 58,14 (± 0,08) 44,12 (± 0,04)

16 HDL16 21,95 (± 0,04) 61,63 (± 0,09) 30,23 (± 0,01)

17 HDL17 62,79 (± 0,07) 63,85 (± 0,03) 38,24 (± 0,06)

18 HDL18 38,01 (± 0,04) 0,47 (± 0,06) 0,27 (± 0,02)

19 HDL19 53,49 (± 0,09) 66,05 (± 0,05) 54,19 (± 0,04)

20 HDL20 28,32 (± 0,01) 48,84 (± 0,08) 48,14 (± 0,09)

21 HDL21 11,11 (± 0,05) 53,49 (± 0,06) 69,53 (± 0,02)

22 HDL22 31,92 (± 0,05) 88,6 (± 0,07) 66,74 (± 0,08)

23 HDL23 33,96 (± 0,08) 50 (± 0,03) 25 (± 0,02)

24 HDL24 5,66 (± 0,07) 0,47 (± 0,04) 12,56 (± 0,07)

25 HDL25 26,46 (± 0,06) 43,95 (± 0.01) 39,3 (± 0,03)

26 HDL26 35,84 (± 0,04) 55,81 (± 0,07) 47,91 (± 0,04)

27 HDL27 41,62 (± 0,08) 0,47 (± 0,02) 41,86 (± 0,03)

28 HDL28 0,43 (± 0,03) 0,23 (± 0,01) 66,67 (± 0,08)

29 HDL29 0,29 (± 0,07) 0,47 (± 0,06) 30,47 (± 0,03)

30 HDL30 34,1 (± 0,02) 41,4 (± 0,04) 47,67 (± 0,08)

31 HDL31 32,56 (± 0,06) 50,93 (± 0,01) 56,98 (± 0,08)

32 HDL32 34,68 (± 0,03) 0,7 (± 0,08) 51,86 (± 0,03)

33 HDL33 21,82 (± 0,07) 61,54 (± 0,03) 0,27 (± 0,07)

34 HDL34 40,61 (± 0,02) 75,35 (± 0,05) 65,12 (± 0,09)

35 HDL35 34,88 (± 0,03) 55,81 (± 0,04) 69,53 (± 0,02)

36 HDL36 44,19 (± 0,06) 60,23 (± 0,01) 0,93 (± 0,04)

Ghi chú: ˂30%: hoạt động kháng nấm thấp, 30 - 50%: hoạt động kháng nấm

trung bình, 50 - 70%: hoạt động kháng nấm cao, ≥70%: hoạt động kháng nấm rất

cao, (±): sai số.

Kết quả nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng chủng nấm kiểm định

(Bảng 3.3, Hình 3.2) của 36 chủng phân lập được cho thấy, 32 trên 36 chủng

35

thể hiện hoạt tính kháng ít nhất một loại nấm kiểm định. Trong đó, có 5 chủng

kháng được 1 loại nấm kiểm định, 9 chủng kháng hai loại nấm kiểm định và

18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định.

Tổng số 36 chủng vi sinh vật nội sinh được đánh giá dựa trên khả năng

ức chế nấm gây bệnh (RI) theo 4 nhóm: ˂30%; 30-50%; 50-70%; ≥70%. Kết

quả thống kê cho thấy, 26 chủng kháng nấm Rhizoctonia solani, trong đó

72,22% (n = 25) số chủng có RI (%) trên 30% tập trung đa số ở khoảng hoạt

động kháng nấm từ 30 – 50% (57,70% , n = 15); 24 chủng kháng nấm

Phytophthora capsici, trong đó 100% số chủng có RI (%) trên 30% tập trung

đa số ở khoảng hoạt động kháng nấm từ 50 – 70% (62,50% , n = 15) và 27

chủng kháng nấm Fusarium oxysporum trong đó 92,60% số chủng có RI (%)

trên 30% tập trung ở 2 khoảng hoạt động kháng nấm từ 30-50% và 50-70%

phần trăm với tỷ lệ bằng nhau (44,44%, n=12).

Hình 3.2: Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh phân

lập được: Đối chứng A là Rhizoctonia solani, B- Phytophthora capsici

và C- Fusarium oxyporum, D: Chủng HDL13 kháng nấm Rhizoctonia

solani, E: Các chủng HDL10, HDL21, HDL22, HDL34 kháng nấm

Phytophthora capsici, và F: Chủng HDL07 kháng nấm Fusarium

oxysporum.

36

Các chủng vi sinh vật nội sinh thể hiện đa dạng mức độ kháng nấm khác

nhau. Gần đây, Toh và cộng sự, 2016, thử nghiệm trên 129 chủng VKNS từ

cây hồ tiêu, sàng lọc được 19 chủng có kết quả kháng nấm cao, hai chủng

DB(2)7 và SB(2)6 thể hiện khả năng đối kháng cao nhất trên Phytophthora

capsicimycelia, phần trăm RI lần lượt là 47,63% và 43,33%. Năm 2015, nhóm

nghiên cứu của Nascimento đã sàng lọc được 28 chủng VKNS cây hồ tiêu thử

nghiệm đối kháng trên nấm Fusarium solani, kết quả thí nghiệm cho thấy

chủng Pt12 và Pt13 có khả năng ức chế 56,52% đối với chủng F. solani. Có

thể thấy, tỷ lệ kháng nấm của các chủng phân lập được khá cao so với các

nghiên cứu trước đây.

3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ KHẢ

NĂNG DIỆT NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU CAO Ở ĐẮK LẮK

3.2.1. Hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu của các chủng vi

sinh vật nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

Kết quả kiểm tra khả năng kháng các chủng nấm gây bệnh trên cây hồ

tiêu (Rhizoctonia solani CNLM, Phytophthora capsici CNLM và Fusarium

oxysporum CNLM) của 36 chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được (Bảng

3.3, mục 3.1.3) cho thấy, 32 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại nấm

kiểm định, 5 chủng kháng được 1 loại nấm kiểm định, 9 chủng kháng hai loại

nấm kiểm định và 18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định. Từ đó đã chọn

được 6 chủng của các chủng vi sinh vật nội sinh (Bảng 3.4, Hình 3.3) có hoạt

tính kháng cả 3 chủng nấm gây bệnh hồ tiêu đặc biệt là nấm gây bệnh thối

thân (Phytophthora capsici) và nấm gây bệnh thối cổ rễ (Fusarium

oxysporum).

Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu gần đây của Toh

và cộng sự (2016) tiến hành thử nghiệm 129 chủng vi sinh vật nội sinh từ cây

hồ tiêu, sàng lọc được 19 chủng có hiệu quả kháng nấm cao, 2 chủng DB(7)

và SB(2) thể hiện đối kháng cao nhất trên Phytophthora capsicimycelia với

phần trăm RI lần lượt là 47,63% và 43,33% (Toh SC and Lihan S, 2016).

Năm 2007, Dinu và cộng sự đã phân lập được một số chủng vi sinh vật nội

sinh có tỷ lệ ức chế dao động từ 4 - 72,5% trên nấm Phytophthora capsici,

37

trong số 19 chủng vi sinh vật nội sinh có 6 chủng (31,58%) được đánh giá là

gây ức chế tăng trưởng hơn 50% (Dinu A et al., 2007).

Bảng 3.4: Khả năng kháng nấm trên cây hồ tiêu của các chủng vi sinh

vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

STT Chủng

phân

lập

Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%)

Rhizoctonia

solani CNLM

Phytophthora

capsici CNLM

Fusarium

oxysporum CNLM

1 HDL10 45,09 ± 0,08 57,4 ± 0,04 63,95 ± 0,02

2 HDL19 53,49 ± 0,09 66,05 ± 0,05 54,19 ± 0,04

3 HDL20 28,32 ± 0,01 48,84 ± 0,08 48,14 ± 0,09

4 HDL21 11,11 ± 0,05 53,49 ± 0,06 69,53 ± 0,02

5 HDL22 31,92 ± 0,05 88,6 ± 0,07 66,74 ± 0,08

6 HDL34 40,61 ± 0,02 75,35 ± 0,05 65,12 ± 0,09

Hình 3.3: Khả năng đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi

sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu: (A) đối chứng chủng nấm

Phytophthora capsici, (B): HDL10, HDL21, HDL22 và HDL34

kháng nấm Phytophthora capsici.

3.2.2. Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội

sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

Vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm soát các bệnh do nấm thực vật gây

ra, điều này là do khả năng sinh một số enzym ngoại bào, chitinase ức chế sự

phát triển của nấm bằng cách thủy phân chitin trong thành tế bào nấm.

Protease và cellulase ức chế sự tăng trưởng của nấm như Phytophtora capsici

38

vì thành tế bào của chúng chứa chủ yếu cellulose, protein và một lượng nhỏ

chitin (Compant S et al., 2010).

Kết quả nghiên cứ khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh

vật nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk được trình bày trên bảng 3.5

và hình 3.4 cho thấy, các chủng được tuyển chọn có khả năng sinh enzyme

ngoại bào, đặc biệt chủng HDL34 sản sinh cả 3 loại enzym: Chitinase,

cellulase và protease và cho hoạt tính enzym cao nhất.

Bảng 3.5: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng vi sinh vật

nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

STT Chủng

phân lập

Đường kính phân giải cơ chất D (mm)

Chitinase Cellulase Protease

1 HDL10 4,0 ± 0,05 3,2 ± 0,06 2,2 ± 0,04

2 HDL19 0 1,3 ± 0,02 3,7 ± 0,05

3 HDL20 0 2,2 ± 0,06 0

4 HDL21 0 1,7 ± 0,05 1,3 ± 0,04

5 HDL22 1,3 ± 0,06 1,5 ± 0,03 0

6 HDL34 5,1 ± 0,04 3,0 ± 0,02 3,1 ± 0,04

(A)

(B)

(C)

Hình 3.4: Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội sinh.

(A): chitinase; (B): protease; (C): cellulase.

39

Số lượng chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng sinh enzym trong

nghiên cứu này khá cao so với một số nghiên cứu trên thế giới. Năm 2014,

Vinod và cộng sự đã phân lập được 45 chủng vi sinh vật nội sinh từ hạt cây

tiêu đen tại Ấn Độ cho thấy, 7 trên 45 chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng

sinh ít nhất một enzyme chiếm 15,5%. Năm 2008, Hardoim và cộng sự khảo

sát khả năng sinh enzyme của 4 chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ hạt tiêu

đen ở Malaysia cho thấy, cả 4 chủng vi sinh vật nội sinh đều sản sinh

cellulase ngoại bào, trong đó chỉ có chủng MPB không thể hiện khả năng sinh

protease và không có chủng nào sinh chitinase (Hardoim S et al., 2008).

Từ kết quả nghiên cứu khả năng đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu và khả

năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ

cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk, chủng HDL34 vừa có hoạt tính kháng nấm mạnh,

vừa có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao để nghiên cứu đặc tính sinh học,

phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học theo hướng tạo chế phẩm sinh

học trong phòng chống bệnh cho cây hồ tiêu.

3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN LOẠI VÀ AN TOÀN SINH HỌC CỦA

CHỦNG HDL34

3.3.1. Đặc điểm sinh học

1. Đặc điểm hình thái

Hình 3.5: Ảnh nhuộm Gram của chủng HDL34 (A) và hình ảnh

khuẩn lạc của chủng HDL34 (B) trên môi trường MPA.

Chủng vi khuẩn HDL34 sau khi tuyển chọn được nuôi cấy trên môi

trường thạch MPA để quan sát các đặc điểm hình thái khuẩn lạc cho thấy,

A

40

chủng này phát triển tốt trên môi trường MPA, khuẩn lạc tròn, bóng, đường

kính 3 - 5mm, dạng màng, bề mặt nhăn, khuẩn lạc có viền, viền khuẩn lạc

răng cưa không đều, không sinh sắc tố vào môi trường (Hình 3.5B). Kết quả

nhuộm Gram (Hình 3.5A) cho thấy, chủng HDL34 thuộc nhóm vi khuẩn

Gram dương, tế bào hình que.

2. Tính chất nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa

quan trọng đối với việc ứng dụng vi sinh vật trong lên men thu nhận sinh khối

để tạo chế phẩm có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả

nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng HDL34 ở các điều kiện thử

nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ được thể hiện trong bảng

3.6

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến khả

năng phát triển của chủng HDL34

Điều kiện Khả năng sinh trưởng của chủng HDL34

Dải sinh trưởng Sinh trưởng tối ưu

Nhiệt độ (°C) 20 - 40 30

Nồng độ muối (%) 0,5 - 2 1

pH 6 - 8 7

Kết quả trình bày trên bảng 3.6 cho thấy, chủng HDL34 phát triển ở dải

nhiệt từ 20 - 40°C, phát triển tối ưu ở 30°C; dải pH từ 6 – 8, tối ưu ở pH 7 và

dải nồng độ muối 0,5 - 2%, tốt nhất ở nồng độ 1%, còn khi nồng độ muối ≥

2,0% chủng này phát triển yếu hoặc không phát triển.

3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá

đặc điểm phân loại của chủng vi sinh vật nội sinh và giúp định hướng tìm

nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu

khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng vi sinh vật trình bày trên

bảng 3.7.

41

Bảng 3.7: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và nitơ chủng HDL34

Nguồn carbon

(1,0%, w/v)

Khả năng sinh

trưởng Nguồn nitơ

(1,0%, w/v)

Khả năng sinh

trưởng

HDL34 HDL34

D-glucose + L-methionin +

D-maltose + L-lysin -

D-saccharose ± L-leusin -

D-mannitol ± L-tryptophan -

Myo-inositol - L-valine ±

Cellobiose ± L-alanine -

D-fructose + L-arginine -

Tinh bột tan ± Glycine ±

Đối chứng - Đối chứng -

Ghi chú: (++) Sinh trưởng tốt; (+) Sinh trưởng bình thường; (±) Sinh trưởng kém; (-)

Không sinh trưởng.

Qua kết quả trên bảng 3.7 cho thấy, chủng HDL34 có khả năng đồng hóa

được nhiều nguồn carbon khác nhau, đồng hóa tốt các nguồn D-glucose, D-

maltose, D-fructose, đồng hóa kém các nguồn saccharose, D-mannitol,

cellobiose, tinh bột tan và không có khả năng đồng hóa Myo-inositol. Chủng

HDL34 có khả năng sinh trưởng với 3 trên 8 nguồn nitơ trong thử nghiệm là

L-methionin, L-valine và Glycine.

Từ các kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng

HDL34, dựa trên khóa Định loại vi sinh vật của Bergey (1989) có thể kết luận

sơ bộ, chủng HDL34 thuộc chi Bacillus.

3.3.2. Phân loại chủng HDL34 dựa trên phân tích trình tự gen 16S

rDNA

Kết quả DNA tổng số của chủng HDL34 được sử dụng làm vật liệu di

truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, được thể hiện ở hình 3.6

cho thấy, hai sản phẩm khuếch đại DNA của phản ứng PCR cho một băng rõ

nét và duy nhất có kích thước khoảng 1400 bp. Như vậy, sản phẩm của phản

42

ứng PCR thu được trong thử nghiệm là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh

sạch và giải trình tự gen 16S rDNA của chủng HDL34. Kết quả phân tích

trình tự 16S rDNA và so sánh với trình tự gen đã công bố trên Genbank bằng

công cụ BLAST (NCBI) cho thấy chủng DL34 thuộc chi Bacillus và có trình

tự tương đồng 100% với các loài Bacillus subtilis. Từ kết quả so sánh chủng

HDL34 được định danh là Bacillus subtilis HDL34 (Bảng 3.8).

Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S

rDNA trên gel agarose 1,0%. M: Thang DNA chuẩn 1 kb

(Thermo scientific, Mỹ); 1: chủng HD34.

Bảng 3.8: Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng chủng HDL34

Chủng vi

khuẩn

Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn

được so sánh

Độ tương đồng

(%)

HDL34

Bacillus subtilis IAM12118 (NR_112116.2) 100

Bacillus subtilis JCM1465 (NR_113265.1) 100

Bacillus subtilis NBRC13719 (NR_112629.1) 100

Bacillus subtilis BCRC10255 (NR_116017.1) 100

Bacillus subtilis DSM10 (NR_027552.1) 100

3.3.3. Độ an toàn sinh học của chủng HDL34

Theo một số công bố quốc tế, đa số các chủng vi sinh vật nội sinh có khả

năng kháng nấm gây bệnh cũng thuộc chi Bacillus (Kollakkodan N et al.,

2017), các loài thuộc Bacillus bài tiết các enzyme thủy phân có khả năng phá

43

vỡ vách tế bào (Chernin L and Chet I, 2002), sinh tổng hợp một loạt các loại

thuốc kháng sinh như iturin (Joshi R and M B Gardener, 2006), surfactin

(Tsuge K et al., 2001), fengycin (Phister T et al., 2004), bacillomycin và

mycosubtilin (Ramarathnam R et al., 2007).

Như vậy, chủng Bacillus subtilis HDL34 thuộc nhóm an toàn sinh học

cấp 1, có tiềm năng kiểm soát sinh học ứng dụng trong tạo chế phẩm vi sinh

nông nghiệp.

3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ

NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG CHỦNG HDL34

3.4.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng chủng HDL34

1. Lựa chọn môi trường lên men cơ sở

Chủng HDL34 sinh trưởng, phát triển tốt trên cả 4 môi trường thử

nghiệm (Hình 3.7), nhưng tốt nhất trên môi trường NB, sau đó đến môi

trường MPA, LB và KB, nhưng khả năng kháng nấm gây bệnh, thì môi

trường MPA, KB và LB có hoạt tính cao hơn môi trường NB. Từ đó, môi

trường MPA là môi trường thích hợp được lựa chọn cho sự sinh trưởng của

chủng này. Hơn nữa môi trường MPA có giá thành rẻ hơn môi trường LB.

Kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau.

Hình 3.7: Khả năng kháng nấm bệnh của chủng HDL34 trên các

môi trường khác nhau

44

2. Ảnh hường của thành phần môi trường đến khả năng sinh trưởng và

kháng nấm của chủng HDL34

a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Trên cơ sở môi trường MPA đã lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác

nhau. Glucose, rỉ đường, saccharose, dextriose, tinh bột tan và manitol để xác

định mức độ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh trưởng và hình

thành chất kháng nấm chủng vi sinh vật nội sinh HDL34.

Bảng 3.9: Ảnh hường của nguồn cacbon và nitơ đến khả năng sinh

chất kháng sinh của chủng HDL34

Nguồn

cacbon

Hoạt tính kháng

nấm (mm) Nguồn nitơ

Hoạt tính kháng

nấm (mm)

Glucose 15,0±0,15 Bột đậu tương 13,9±0,23

Rỉ đường 14,0±0,13 Cao nấm men 15,0±0,19

Saccharose 12,0±0,11 Pepton 12,5 ±0,12

Dextriose 13,7 ±0,18 Trypton 13,5 ±0,24

Tinh bột tan 12,0±0,22 Cao malt 14,0 ±0,15

Manitol 14,5±0,16 Cao thịt 12,9 ±0,18

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.9 cho thấy, trong các nguồn cacbon sử

dụng chủng HDL34 nội sinh phát triển và sinh chất kháng nấm cao nhất trong

môi trường có nguồn cacbon là glucose cho các nghiên cứu tiếp theo.

b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các 6 nguồn nitơ khác nhau như:

bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt, cao thịt. Kết quả

nghiên cứu thể hiện qua Bảng 3.9.

Chủng HDL34 phát triển tốt nhất trên môi trường tuyển chọn với nguồn

nitơ là cao nấm men, đường kính kháng nấm cao nhất. Như vậy, trong các

nguồn nitơ sử dụng chủng HDL34 phát triển và sinh chất kháng nấm cao nhất

trong môi trường có nguồn nitơ là cao nấm men cho các nghiên cứu tiếp theo.

45

3. Ảnh hường của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và kháng

nấm của chủng HDL34

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chất

kháng nấm của các chủng tuyển chọn, chúng tôi tiến hành lên men trong môi

trường thay thế với nhiệt độ ban đầu thay đổi từ 20-40˚C đối với vi khuẩn và

15-40˚C đối với vi nấm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh

tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34

Nhiệt độ (˚C) Hoạt tính kháng

nấm (mm) pH

Hoạt tính kháng

nấm (mm)

20 10,5±0,35 5 11,5±0,2

25 14,6±0,26 6 13±0,15

30 16,3±0,15 7 14,0 ±0,2

37 15,6±0,2 8 7,0 ±0,34

40 7,0 ±0,14

Kết quả thu được ở Bảng 3.10 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng

sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34 là 30°C, với

đường kính vòng kháng nấm lần lượt đạt tới 16.3 mm.

b. Ảnh hưởng của pH ban đầu

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng

khuẩn của chủng HDL34 được tiến hành lên men trong môi trường với pH

ban đầu thay đổi từ 5-8. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy, chủng

HDL34 nội sinh kháng nấm tốt nhất trên môi trường có pH 7, đường kính

vòng kháng nấm cao nhất, tuy nhiên ở pH 6 khả năng kháng nấm của các

chủng thấp hơn không đáng kể.

c. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống

46

Lượng giống được tiếp theo tỷ lệ: 1, 3, 5, 7 và 9 % theo thể tích dịch lên

men, sau khi lên men với thời gian 24 giờ, xác định hoạt tính kháng nấm đối

với Phytophthora capsici CNLM được thể hiện ở bảng 3.11.

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống và độ thông khí đến khả

năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34 nội sinh

Tỷ lệ tiếp giống

%

Hoạt tính kháng

nấm (mm)

Độ thông khí

(%, v/V)

Hoạt tính kháng

nấm (mm)

1 8,5±0,2 5 12,0±0,19

3 13±0,15 10 14,5±0,19

5 14,0 ±0,2 15 14,0 ±0,23

7 13,0 ±0,34 20 12,0 ±0,27

9 10,0 ±0,34 25 13,0 ±0,24

Kết quả trong trên cho thấy tỷ lệ tiếp giống cho quá trình lên men chủng

HDL34 thích hợp nhất là 5% với đường kính vòng kháng nấm Phytophthora

capsici CNLM đạt cao nhất.

d. Ảnh hưởng của độ thông khí

Độ thông khí được được khảo sát bằng cách lên men chủng HDL34

trong các bình tam giác 500 ml có tỷ lệ thể tích dịch lên men so với thể tích

bình khác nhau. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.10.

Hình 3.8: Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp

chất kháng nấm của chủng HDL34 (Trong đó: v: thể tích môi trường

lên men (ml); V: thể tích bình lên men (ml))

47

Kết quả trong hình 3.9 cho thấy, nhu cầu sử dụng oxy hòa tan của chủng

HDL34 cao, độ thông khí càng cao thì các chủng vi sinh vật nội sinh sinh

trưởng và phát triển càng tốt. Ở độ thông khí 10% chủng phát triển và sinh

chất kháng nấm Phytophthora capsici CNLM mạnh nhất, ở độ thông khí 10%

(v thể tích dịch/V thể tích bình) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4.2. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của chủng HDL34 ở quy

mô phòng thí nghiệm

Chủng B.subtilis HDL34 được nuôi trên môi môi trường và điều kiên lên

men đã lựa chọn, sau 24 giờ, dịch nuôi cấy được thử nghiệm sơ bộ khả năng

kháng nấm Phytophthora capsici.

Cách làm: Mẫu đối chứng được nhiễm nấm Phytophthora capsici và

mẫu thí nghiệm sau khi nhiễm nấm Phytophthora capsici được xử lý dịch

nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 (Hình 3.11).

1 4

Hình 3.9: Khả năng kháng nấm bệnh P. capsici VTN của chủng

HDL34. 1: Đối chứng (Nhiễm P. capsici VTN + nước khử

trùng); 2: Nhiễm P. capsici VTN + HDL34

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng B.subtilis

HDL34 (Hình 3.11) cho thấy, lá nhiễm nấm bệnh có xử lý bị nhiễm ở mức độ

3 (26-50% diện tích lá bị nhiễm nấm) so với mẫu đối chứng bị nhiễm 100%

diện tích lá. Như vậy, dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 có khả năng

kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh cho cây hồ tiêu.

48

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm

gây bệnh trên cây hồ tiêu ở Đắk Lắk, số chủng phân lập từ rễ là cao nhất

(44,44%), sau đó thân (38,89%) và thấp nhất ở lá (16,67%) và số chủng phân

lập được cao nhất trên môi trường MPA (36,11%), sau đó đến NA, TSA

chiếm tỷ lệ 22,22% và thấp nhất trên môi trường KB chiếm 19,45%.

2. Trong số 36 chủng phân lập được có 32 chủng có hoạt tính kháng ít

nhất một loại nấm kiểm định, trong đó, có 5 chủng kháng được 1 loại nấm

kiểm định, 9 chủng kháng hai loại nấm kiểm định và 18 chủng kháng ba loại

nấm kiểm định.

3. Đã nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh cây hồ tiêu có

hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cho thấy, cả 6 chủng vi sinh vật được

tuyển chọn đều có khả năng ức chế nấm R. solani, P. capsici và F. oxysporum

(RI%) trên 50%; 3/6 chủng có khả năng sinh chitinase, 4/6 chủng sinh

protease và cả 6 chủng sinh cellulase; chủng HDL34 được lựa chọn để nghiên

cứu tiếp vì vừa có khả năng ức chế mạnh lên sự phát triển sợi nấm, vừa có

khả năng sinh protease, cellulase và chitinase ngoại bào.

4. Chủng HDL34 phát triển tốt trên môi trường MPA; dải nhiệt độ từ 20-

40°C; pH 6-8; nồng độ NaCl từ 0,5-2%; tố ưu ở 30°C, pH 7 và nồng độ NaCl

thích hợp là 1%; là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que và sinh bào tử và

được định danh là Bacillus subtilis HDL34 và là chủng an toàn sinh học.

5. Đã nghiên cứu môi trường và điều kiên nuôi cấy thích hợp để lên men

sản xuất chế phẩm và thử nghiệm dịch lên men lên khả năng kháng nấm

Phytophthora capsici trên cây hồ tiêu cho thấy, chủng HDL34 có khả năng

ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng chống bệnh nấm cho cây hồ tiêu.

4.2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu quy trình công nghệ lên men sản xuất tạo chế

phẩm sinh học và thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh cho cây hồ tiêu.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT ngày 03/07/2014 của Bộ Nông nghiệp và

Phát triển nông thôn: Quy hoạch phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam đến

năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030

2. Phạm Văn Biên, Nguyễn Văn Tá, Mai Thị Vinh, Trần Minh Tú, Nghiêm

Bảo Tuấn, 1990, Kết quả nghiên cứu sâu bệnh hại tiêu (Piper nigrum),

Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, số 339: 544 - 548.

3. Phạm Văn Biên, 2005, Nghiên cứu các giải pháp khoa học công nghệ và

thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất

khẩu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước, 2005.

4. Đỗ Trung Bình, 2012, Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong

sản xuất cây tiêu theo hướng bền vững, Báo cáo tổng kết đề tài trọng điểm

cấp Bộ, 2012.

5. Nguyễn Ngọc Châu, 1995, Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu ở Quảng Trị.

Tạp chí Bảo vệ thực vật 1 (139): 14-18.

6. Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ. NXB

KHKT Hà Nội, 302 trang

7. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991, Kết quả bước đầu nghiên

cứu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita ở hồ tiêu”. Những thành

tựu khoa học kỹ thuật đưa vào sản xuất, số 1: 11 - 15.

8. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1993, Tuyến trùng ký sinh ở cây

hồ tiêu và các bệnh do chúng gây ra. Tuyển tập các công trình nghiên cứu

sinh thái và tài nguyên sinh vật (1990 – 1992, Nhà xuất bản Khoa học và

kỹ thuật. 265 - 270.

9. Đào Thị Lan Hoa, Phan quốc Sủng, Trần Thị Kim Loang, Tôn Nữ Tuấn

Nam, Nguyễn Xuân Hoà và Tạ Thanh Nam, 2003, Nghiên cứu bệnh vàng

lá chết chậm trên cây tiêu tại Tây Nguyên và biện pháp phòng trừ, Kỷ yếu

hội thảo khoa học bảo vệ thực vật phục vụ cho chủ trương chuyển đổi cơ

50

cấu cây trồng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên ngày 26-27/6/2003 tại

Vũng Tàu.

10. Lê Gia Hy, 2012, Công nghệ sản xuất kháng sinh, NXB Khoa học và Kỹ

thuật Hà Nội.

11. Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa, Lê Đăng Khoa, Hà Thị Mão, Lê Đình

Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, 2006, Nghiên cứu bệnh do

nấm Phytophthora trên một số cây công nghiệp và cây ăn quả”, Báo cáo

trọng điểm cấp Bộ 2001-2005, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

12. Trần Kim Loang, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh,

Nguyễn Thị Tiến Sĩ, Trần Thị Xê, 2008, Phòng trừ bệnh do nấm

Phytophthora trên cây hồ tiêu bằng chế phẩm sinh học Trichoderma

(Tricho-VTN) tại Tây Nguyên, Kết quả nghiên cứu khoa học năm 2008,

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 307-

315.

13. Phan Quốc Sủng, 2000, Tìm hiểu về Kỹ Thuật Trồng và Chăm Sóc Cây

Hồ Tiêu. Nhà Xuất Bản Nông nghiệp.

14. Phan Quốc Sủng, 2001, Tìm hiểu về kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hồ

tiêu, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 43tr.

15. Phạm Thị Thùy, 2013, Nông nghiệp hữu cơ ở Việt Nam- hiện trạng- tiêu

chuẩn sản xuất và hướng phát triển, Kỷ yếu Hội thảo “Nông nghiệp hữu

cơ-Thực trạng và định hướng phát triển” 2013.

16. Nguyễn Tăng Tôn, 2009, “Nghiên cứu các giải pháp quản lý tổng hợp

dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ,

2009.

17. Nguyễn Vĩnh Trường, 2008, Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh

Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ cây hồ tiêu ở trong đất, Tạp chí bảo vệ

thực vật. Số 4: 13 - 16.

51

18. Tuat Nguyễn Văn Tuất, 2012, Nghiên cứu nấm Phytophthora gây bệnh

chết nhanh cây hồ tiêu và biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp, Nxb NN,

Hà Nội, 2012.

19. Diệp Đông Tùng, Nguyễn Xuân Niệm, Chu Hữu Tín (1999). Điều tra-

giám định một số sâu bệnh hại chính trên cây tiêu tại Phú Quốc, Tạp Chí

Bảo vệ thực vật, số 6: 20 - 23.

20. Ngô thị Xuyên, 2002, Kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne bằng phương

pháp sinh học. Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, lần thứ nhất, Đại

học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh ngày 21/6/2002, Nhà xuất bản Nông

nghiệp, 113 - 119.

Tài liệu tiếng Anh

21. Anandaraj M. and Sarma IR, 1995, Dseases of black pepper (Piper nigrum

L.) and their management, J Spices and Aromatic Crops, 4: 17-23.

22. Anith, K.N., Radhakrishnan, N.V. and Manomohandas, T.P., 2003)\,

Screening of antagonistic bacteria for biologicalcontrol of nursery wilt of

black pepper (Piper nigrum L.), Microbiol Res 158: 91–97

23. Aravind R, Kumar A, Eapen S and Ramana K , 2009, Endophytic bacterial

flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype:

isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici,

Letters in applied microbiology 48(1): 58-64.

24. Augstburger, F., Berger, J., Censkowsky, U., Heid, P., Milz, J. and Streit,

C., 2001, Organic farming in thetropics and subtropics: Pepper (2nd ed.),

Germany: Naturlande. V.

25. Babadoost, M. (2005). Phytophthora blight of cucurbits.The Plant Health

Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2005-0429-01

26. Bacon and White 2000, Physiological adaptation in the evolution of

endophytism in the Clavicipitaceae. In: Bacon CW, White JF Jr, eds.

Microbial endophytes, New York: Marcel Dekker, Inc. 237–261.

52

27. Bell, C.R., Dickie, G.A., Harvey, W.L.G. and Chan, J.W.Y.F., 1995,

Endophytic bacteria in grapevine, Can J Microbiol 41: 46–53

28. Chanway, C.P., 1996, Endophytes: they’re not just fungi, Can J Bot 74:

321–322.

29. Chen, C., Bauske, E.M., Musson, G., Rodriguez-Cabana, R. and Kloepper,

J., 1995, Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of

endophytic bacteria. Biol Control 5: 83–91.

30. Chernin L and Chet I, 2002, “Microbial enzymes in biocontrol of plant

pathogens and pests”, Enzymes in the Environment: Activity, Ecology, and

Applications, 171-225.

31. Compant S., Clément C. and Sessitsch A., 2010, “Plant growth-promoting

bacterial in the rhizo and endosphere of plant: their role, colonization,

mechanisms involved and prospects for utilization”, Soil Biol Biochem, 42,

669-678.

32. Cook, J.R. and Baker, K.F., 1983, The Nature and Practice of Biological

Control of Plant Pathogens. American Phytopathological Society, St. Paul.

33. Diby, P., Saju, K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A. and Anandaraj,

M., 2005, Mycolytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens and

Trichoderma spp. Against Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of

black pepper (Piper nigrum L.). Ann. Microbiol 55: 129–133

34. Dinu A, Kumar A, Aravind R and Eapen SJ, 2007, “Novel in planta assay

for selection of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici on

black pepper (Piper nigrum L.)”, J Spices Aromatic Crops, 16, 1-7.

35. Drenth, A. and Guest, D.I. (Eds.)., 2004, Diversity andmanagement of

Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International

AgriculturalResearch. Monograph no. 114: 238p.

36. El-Deeb B, Fayez K and Gherbawy Y, 2013, Isolation and characterization

of endophytic bacteria from Plectranthus tenuiflorus medicinal plant in

53

Saudi Arabia desert and their antimicrobial activities. Journal of plant

interactions 8(1): 56-64.

37. Farhana, S.N.M.D., Bivi, M.R., Khairulmazmi, A.,Wong, S.K. and Sariah,

M., 2013, Morphologicaland molecular characterization of Phytophthora

capsici, the causal agent of foot rot disease of blackpepper in Sarawak,

Malaysia. International Journal ofAgriculture and Biology 15: 1083-1090.

38. Fisher, M.C., Henk, D.A., Briggs, C.J., Brownstein, J.S.,Madoff, L.C.,

McCraw, S.L., Gurr, S.J., 2012, Emergingfungal threats to animal, plant

and ecosystem health. Nature 484 (7393): 186-194.

39. Garbeva, P., Van Overbeek, L.S., Van Vuurde, J.W.L. and Van Elsas, J.D.,

2001, Analysis of endophytic bacterial communities of potato by planting

and denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE) of 16s rDNA based

PCR fragments. Microb Ecol 41: 369–383.

40. Gazis R., Miadlikowska J., Lutzoni F., Arnold A. E., Chaverri P., 2012,

Culturebased study of endophytes associated with rubber trees in Peru

reveals a new class of Pezizomycotina: Xylonomycetes, Molecular

Phylogenetics and Evolution, 65: 294-304.

41. Gevens, A.J., Donahoo, R.S., Lamour, K.H. and Hausbeck, M.K., 2008,

Characterization of Phytophthora capsicicausing foliar and pod blight of

snap bean in Michigan. Plant Disease 92(2): 201-209

42. Gong M., Wang J. D., Zhang J., Yang H., Lu X. F., Pei Y., Cheng J. Q.,

2006, Study of the Antifungal Ability of Bacillus subtilis Strain PY-1 in

Vitro and Identification of its Antifungal Substance (Iturin A). Acta

Biochimica et Biophysica Sinica, 38(4): 233-240.

43. Hallmann, J. Hallmann, A. Hallmann, W.F. Mahaffee, KloepperJ.W.,

1997, Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol, 43:

895–914.

44. Hamada M.; S. Kondo; T. Yokoyama; K. Miura; K. Iinuma; H.

Yamamoto; K. Maeda; T. Takeuchi; H. Umezawa, 1974,

54

Minosaminomycin, a new antibiotic containing myo-inosamine. J.

Antibiotics, 27: 81-93.

45. Hardoim S, Pablo R, Overbeek LS, Elsas Y and Jan Dirk van, 2008,

“Properties of bacteria endophytes and their proposed role in plant

growth”, Trends in Microbiology, 16(10), 463-471.

46. Hollis, J.P., 1951, Bacteria in healthy potato tissue. Phytopathology 41:

350–366

47. Holt JG, Williams ST and Holt, 1989, Bergey's manual of systematic

bacteriology, Vol. 4. 1989: Lippincott Williams & Wilkins.

48. Jatala, (1986). Biological control of plant parasitic nematodes, Annual

Review of phytopathology, Vol. 24: 453-489.

49. Jeyaseelan E. C. and Jashothan J. P., 2012,” In vitro control of

Staphylococcus aureus (NCTC 6571) and Escherichia coli (ATCC 25922)

by Ricinus communis L.”, Asian Pac J Trop Biomed, 2(9), pp. 717–721.

50. Joshi R. and M. B. Gardener , 2006, “Identification of genes associated

with pathogen inhibition in different strains B. subtilis phytopathology”,

Antagonistic Activity of Endophytic, 96, 145-154.

51. Kasana R. C., Salwan R., Dhar H., Dutt S. and Gulati A., 2008, “A rapid

and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates

using Gram’s iodine”, Current Microbiology, 57, pp.503-507.

52. Kateka D., Shannaphimon W., Phichaya T., Prapaporn B., Arunee A.,

Panupong S. and Ekachai C., 2009, “Comparative study of proteolytic

activity of protease-producing bacteria isolated from thuanao”, Journal of

Science and Technology, 3(02), pp. 269-276.

53. Kollakkodan N., Anith K. N. and Radhakrishnan N. V., 2017, “Diversity

of endophytic bacteria from Piper spp. with antagonistic property against

Phytophthora capsici causing foot rot disease in black pepper (Piper

nigrum L.)”, Journal of Tropical Agriculture, 9 (125), pp. 531-752.

55

54. Lamour, K.H., Stam, R., Jupe, J. and Huitema, E., 2012b, The oomycete

broad-host-range pathogenPhytophthora capsici. Molecular Plant

Pathology13(4): 329-337

55. Lee YK and Hwang BK , 1996, Differential induction and accumulation of

β‐1, 3‐glucanase and chitinase isoforms in the intercellular space and leaf

tissues of pepper by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria infection.

Journal of Phytopathology 144(2): 79-87.

56. Mahafee, W.F. and Kloepper, J.W., 1997, Bacterial communities of the

rhizosphere and endorhiza associated with fieldgrown cucumber plants

inoculated with a plant growth promoting rhizobacterium or its

genetically-modified derivative. Can J Microbiol 43, 344–353.

57. Marín, F., Diánez, F., Santos, M., Carretero, F., Gea, F.J., Castañeda, C.,

Navarro, M.J. and Yau, J.A., 2014, Control of Phytophthora capsici and

Phytophthoraparasitica on pepper (Capsicum annuum L.) with compost

teas from different sources, and theireffects on plant growth promotion.

Phytopathologia Mediterranea 53(2): 216-228

58. McInroy, J.A. and Kloepper, J.W., 1995, Survey of indigenous bacterial

endophytes from cotton and sweet corn. Plant Soil 173, 333–342.

59. Misaghi, I.J. and Donndelinger, C.R., 1990, Endophytic bacteria in

symptom-free cotton plants. Phytopathology 80: 808–811.Mohd F. K.

(2015), “In vitro antagonism of Phytophthora capsici and Fusarium solani

by bacterial isolates from Sarawak”, Malaysian Journal of Microbiology,

11(2), pp. 137-143.

60. Mundt, J.O. and Hinkle, N.F., 1976, Bacteria within ovules and seeds.

Appl Environ Microbiol 32: 694–698.

61. Munjal, A., Philipe, J.M., Munro, E., Lecuit, T., 2015, A self-organized

biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis.

Nature, 524 (7565): 351-355.

62. Nascimento, S.B., Lima, A.M., Borges B.N. and de Souza C.R.B., 2015,

Endophytic bacteria from Piper tuberculatumJacq.: isolation, molecular

56

characterization, and in vitro screening for the control of Fusarium solani

f. sp piperis, the causalagent of root rot disease in blackpepper (Piper

nigrum L.). Genetics and molecular research, 14 (3): 7567-7577.

63. Nazeem P.A., C.R. Achuthan, T.D. Babu, G.V. Parab, D. Girija, R.

Keshavachandran, and R.Samiyappan, 2008, Expression of pathogenesis

related proteins in black pepper (Piper nigrum L.) in relation to

Phytophthora foot rot disease, Journal of Tropical Agriculture 46 (1-2):

45–51.

64. Nguyen Tang Ton and Bui Chi Buu, 2012, How to prevent the most

serious diseases of black pepper (Piper nigrum L.)- a case study of

Vietnam, Institute of Agricultural Sciences for Southern Vietnam

65. Nguyen, V.L., 2015, Spread of Phytophthora capsici in Black Pepper

(Piper nigrum) in Vietnam. Engineering 7: 506-513.

66. Ou S.H., 1972, Rice Disease. Commonwealth Mycological Institute. Kew,

Surrey, UK, 380 pp

67. Patriquin, D.G. and Do ¨bereiner, J., 1978, Light microscopyobservations

of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other

grasses in Brazil. Can JMicrobiol 24: 734–742.

68. Phister T., D. J. O’sullivam and L. L. Mckay, 2004, “Identification of

Bacilysin, Chlorotetaine, and Iturin A Produced by Bacillus sp. Strain

CS93 Isolated from Pozol, a Mexican Fermented Maize Dough”, Appl

Environ Microbiol, 70(1), 631-634

69. Ramarathnam R, Bo S, Chen Y, Fernando WG, Xuewen G and Kievit T,

2007, “Molecular and biochemical detection of fengycin- and

bacillomycin D-producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens

of canola and wheat”, Can J Microbiol, 53(7), 901-912.

70. Ravindran , S. S., 2000, A reduced‐order approach for optimal control of

fluids using proper orthogonal decomposition, International Journal for

Numerical Methods in Fluids, 34 (5): 425-448.

https://onlinelibrary.wiley.com/journal/10970363

https://onlinelibrary.wiley.com/journal/10970363

57

71. Samish, Z., Etinger-Tulczynska, R. and Blick, M., 1961, Microflora within

healthy tomatoes. Appl Environ Microbiol 9:, 20–25.

72. Sampson R A, 1994, Current systematics of the genus Aspergillus. In: The

genus Aspergillus. From taxonomy and genetics to industrial application.

Plenum Press, New York, N.Y: 261-276.

73. Sarma, Y.R., Manohara, D., Premkumar, T. and Eapen, S.J.(Eds.), 2013,

Diseases and insect pests of black pepper (Piper nigrum L.), Jakarta,

Indonesia: InternationalPepper Community (IPC).

74. Sivaraman, K., Kandiannan, K., Peter, K.V. andThankamani, C.K., 1999,

Agronomy of black pepper(Piper nigrum L.) - A review. Journal of Spices

andAromatic Crops 8(1): 1-18.

75. Smith GE, 1957, Inhibition of Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici by

a species of Micromonospora isolated from tomato. Phytopathology, 47:

429-432.

76. Stanley T. Williams ME. Sharpe and Holt JG. (1989), “Bergey’s Mannual

of Systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, 4, 2452-2492.

77. Sturz, A.V., Christie, B.R., Matheson, B.G., Arsenault, W.J. and

Buchanan, N.A., 1999, Endophytic bacterial communities in the periderm

of potato tubers and their potential to improve resistance to soil-borne

pathogens. Plant Pathol 48: 360–369.

78. Toh SC and Lihan S, 2016, “Screening for antifungal-producing bacteria

from Piper nigrum plant against Phytophthora capsici”, International

Food Research Journal, 23(6), 2616-2622.

79. Trivedi P, Spann T and Wang N, 2011, Isolation and characterization of

benefcial bacteria associated with citrus roots in Florida. Microb. Ecol. 62:

324-336.

80. Tsuge K., T. Akiyama and M. Shoda, 2001, “Cloning, Sequencing, and

Characterization of the Iturin A Operon”, Journal of bacteriology,

183(21), 6265-6273.

58

81. Usharani T. R. and Gowda T. K., 2011, “Cloning of chitinase gene from

Bacillus thuringiensis”, Indian Journal of Biotechnology, 10, pp. 264-269.

82. Van Buren, A.M., Andre, C. and Ishimaru, C.A., 1993, Biological control

of the bacterial ring spot pathogen by endophytic bacteria isolated from

potato. Phytopathology 83: 1406.

83. Victor R. Preedy (Editer) Essential Oils in food preservation, Flaver and

safety, Elsevier Inc., 2016.

84. Zinniel, D.K., Lambrecht, P.N., Harris, B., Zhengyu, F., Daniel,K.,

Phyllis, H., Carol, A.I., Alahari, A. et al. ,2002, Isolation and

characterization of endophytic colonizing bacteriafrom agronomic crops

and prairie plants. Appl Environ Microbiol 68: 2198–2208.

85. Živković S, Stojanović S, Ivanović Ž, Gavrilović V, Popović T and Balaž

J, 2010, “Screening of antagonistic activity of microorganisms against

Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides”. Archives

of Biological Sciences, 62(3), 611-623.

Documents

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY …gust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26974.pdf · 2.2.4. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng