NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH …lib.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19848/1/Le-Bao-Quynh...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA –

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA – VŨNG TÀU

BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT

TÁCH CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY NGẢI CỨU

TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU

Chủ nhiệm đề tài: Lê Bảo Quỳnh Hương

Hướng dẫn khoa học: Th.S Nguyễn Quang Thái

Bà Rịa – Vũng Tàu, tháng 08 năm 2019

Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu

Viện Kỹ thuật – Kinh tế biển Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường

Chủ nhiệm đề tài: Lê Bảo Quỳnh Hương Hướng dẫn khoa học: Th.S Nguyễn Quang Thái

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về cây ngải cứu [1], [19] .................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc cây ngải cứu ......................................................................... 3

1.1.2. Đặc tính sinh thái .................................................................................... 3

1.1.3. Đặc tính thực vật ..................................................................................... 4

1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và dinh dưỡng của cây ngải cứu. [1], [18]………………………………………………………………...……………….6

1.2.2. Thành phần dinh dưỡng .......................................................................... 6

1.2.3. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học của lá ngải cứu [18] ..................... 6

1.3. Vi khuẩn [13] ..................................................................................................... 7

1.3.1. Nhóm vi khuẩn Gram dương (Gr+) ........................................................ 7

1.3.2. Nhóm vi khuẩn Gram âm (Gr-) ............................................................ 11

1.4. Giá trị sử dụng của cây ngải cứu [7], [13] ....................................................... 16

1.4.1. Y dược dân gian .................................................................................... 16

1.4.2. Các nghiên cứu dược học về ngải cứu ................................................. 17

1.4.3. Dược tính lá ngải cứu ........................................................................... 18

1.4.4. Thu hái và chế biến [7] ........................................................................... 19

1.4.5. Một số chế phẩm từ ngải cứu [20] .......................................................... 19

1.5. Xây dựng quy trình chiết [6], [10] .................................................................... 21

1.5.1. Phương pháp chiết xuất ........................................................................ 21

1.5.2.Phương pháp siêu tới hạn [23] ................................................................. 22

1.5.3. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) [3], [4], [6] ...................... 22




1.5.4. Phương pháp phân tích trọng lượng .................................................... 26

1.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học kháng viêm [24] ........................ 27

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 31

2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất .................................................................... 31

2.1.1. Thu gom nguyên liệu ............................................................................ 31

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất .............................................................. 31

2.1.3. Vi khuẩn thí nghiệm [21] ....................................................................... 32

2.1.4. Các phương pháp nghiên cứu ............................................................... 32

2.2. Xử lý nguyên liệu .......................................................................................... 33

2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá ngải cứu [19] ........................................... 34

2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 34

2.3.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................... 35

2.4. Mô hình chiết xuất dịch chiết thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. .......... 35

2.5. Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý. ................................................ 35

2.5.1 Xác định độ ẩm: ................................................................................... 35

2.5.2. Xác định hàm lượng tro: ...................................................................... 36

2.6. Khảo sát điều kiện chiết ............................................................................... 37

2.6.1. Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi [3;4] ........................................... 37

2.6.2. Khảo sát thời gian chiết ........................................................................ 38

2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết từ lá ngải cứu .................. 39

2.8. Xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết lá ngải cứu bằng phương

pháp GC/MS ......................................................................................................... 39

2.9. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng

kháng khuẩn [13], [24] .............................................................................................. 39




CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 41

3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá ngải cứu ........................... 41

3.1.1. Độ ẩm ................................................................................................... 41

3.1.2. Hàm lượng tro ...................................................................................... 41

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện chiết lá ngải cứu.............................................. 42

3.2.1. Tỉ lệ dung môi ...................................................................................... 42

3.2.2. Thời gian chiết ..................................................................................... 43

3.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết lá ngải cứu ......... 44

3.4. Kết quả định danh các thành phần hóa học có trong dịch chiết cao ngải

cứu bằng phương pháp GC/MS ......................................................................... 45

3.5 Kết quả thăm dò hoạt tính sinh học của cao lá ngải cứu ........................... 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53

PHỤ LỤC………………………………………………………………………….50




DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

GC-MS Gas chromatography–mass

spectrometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

DMSO Dimethyl sulfoxit Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh

MHA Mueller Hinton Agar Môi trường

MHB Mueller Hinton Broth Môi trường

GC Gas chromatography Sắc ký khí

MS Mass spectrometry Quang phổ khối

TSB Trypic Soy Borth Môi trường dinh dưỡng

MP Môi trường dinh dưỡng

cao thịt peptone

CFU Colony Forting Unit Đơn vị hình thành khuẩn




DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Thành phần dinh dưỡng của lá ngải cứu tươi ............................................ 6

Bảng 2. 1 Bảng danh sách thiết bị ............................................................................. 31

Bảng 2. 2 Bảng danh sách dụng cụ ........................................................................... 32

Bảng 3. 1 Bảng xác định độ ẩm trung bình lá ngải cứu ............................................ 41

Bảng 3. 2 Hàm lượng tro trung bình lá ngải cứu ...................................................... 42

Bảng 3. 3 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi ................................................................ 42

Bảng 3. 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết ............................................................... 43

Bảng 3. 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mẫu ................................... 44

Bảng 3. 6 Kết quả GC-MS của cao lá ngải cứu ........................................................ 46

Bảng 3. 7 Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao ngải cứu ........................................... 49




DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Hình 1. 1. Cây ngải cứu............................................................................................... 4

Hình 1. 2 Các bộ phận của cây ngải cứu ..................................................................... 5

Hình 1. 3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus trên kính hiển vi .................................... 9

Hình 1. 4. Vi khuẩn Bacillius cereus trên kính hiển vi ............................................. 10

Hình 1. 5. Vi khuẩn Bacillius cereus trên kính hiển vi ............................................. 13

Hình 1. 6. Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi ............................................. 14

Hình 1. 7. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi .............................. 16

Hình 1. 8. Tinh dầu ngải cứu ..................................................................................... 19

Hình 1. 9. Mặt nạ chiết xuất từ ngải cứu .................................................................. 20

Hình 1. 10. Kem dưỡng dạng gel chiết xuất từ ngải cứu .......................................... 20

Hình 1. 11. Trứng gà ngải cứu .................................................................................. 20

Hình 1. 12. Gà hầm ngải cứu .................................................................................... 21

Hình 1. 13. Sơ đồ thiết bị sắc ký ghép khối phổ ....................................................... 24

Hình 1. 14 Đĩa Petri có sẵn môi trường và vi khuẩn ................................................. 29

Hình 2.1. Cây ngải cứu ............................................................................................. 31

Hình 2. 2 Cây ngải cứu sau khi thu hái ..................................................................... 33

Hình 2. 3 Lá ngải cứu sau khi được rửa sạch ............................................................ 33

Hình 2. 4 Lá ngải cứu đã được phơi khô ................................................................... 34

Hình 2.5 Mô hình chiết xuất dịch chiết lá ngải cứu tại phòng thí nghiệm ................ 35

Hình 2. 6 Hình ảnh minh họa về xác định đường kính vòng vô khuẩn .................... 40

Hình 2. 7 Mueller Hinton Agar - MHA ................................................................... 40

Hình 3. 1 Hình ảnh mẫu sau khi được xác định độ ẩm ............................................. 41

Hình 3. 2 Hình ảnh mẫu sau khi được tro hóa .......................................................... 42

Hình 3. 3 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi ...................................... 43

Hình 3. 4 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát thời gian chiết ...................................... 43

Hình 3. 5 Cao chiết lá ngải cứu ................................................................................. 44

Hình 3. 6 Kết quả GC-MS cao chiết lá ngải cứu ...................................................... 45

Hình 3. 7 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Bacilus cereus .. 49




Hình 3. 8 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Escherichia coli

................................................................................................................................... 50

Hình 3. 9 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Salmonella Spp 50

Hình 3. 10 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Staphylococcus

aureus………………………………………………………………………………………..50

Hình 3. 11 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Pseudomonas

Aeruginosa…………………………………………………………………………51



Chủ nhiệm đề tài: Lê Bảo Quỳnh Hương 1 Hướng dẫn khoa học: Th.S Nguyễn Quang Thái

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

- Trong nhiều thế kỷ liên tục, ở bất cứ quốc gia nào, từ Đông sang Tây, đều có niềm tự

hào riêng về kinh nghiệm áp dụng dược liệu thiên nhiên. Cây thuốc, dù là rễ, thân, lá,

hoa hay bất cứ bộ phận nào có thể dùng làm thuốc đều được con người áp dụng. Đặc

biệt là những loại cây gần gũi với đời sống hằng ngày.

- Từ hai thập niên gần đây, dược phẩm với hoạt chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên trở

thành đề tài nghiên cứu hàng đầu của các nhà khoa học trong kỹ nghệ làm thuốc. Ngay

cả khi phối hợp nhiều cây thuốc trong một chế phẩm thì tính chất tương tác giữa các

vị thuốc kế thừa từ kinh nghiệm dân gian vẫn dễ kiểm soát hơn giữa nhiều loại hóa

chất tổng hợp trong cơ thể con người.

- Đất nước Việt Nam có một thảm thực vật phong phú, đa dạng bao gồm nhiều cây thuốc

quý với đầy đủ chủng loại và số lượng lớn. Một trong số đó chính là cây ngải cứu. Các

thành phần trong lá ngải cứu được sử dụng để chữa kinh nguyệt không đều, khí hư,

động thai, băng huyết, đau bụng, đau dây thần kinh, thấp khớp, dưỡng da, trị mụn,

giảm mỡ, giảm nhăn,…

Tuy ngải cứu có nhiều ứng dụng và được sử dụng nhiều như vậy nhưng các thành

phần hóa học chưa được khảo sát kỹ do đó việc nghiên cứu để xây dựng một qui trình

xác định một số thành phần từ lá ngải cứu là một vấn đề cần thiết cũng như mong

muốn được góp phần tìm hiểu sâu hơn về ngải cứu. Vì lý do trên tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách cao chiết từ lá cây ngải cứu trên địa

bàn tỉnh bà rịa – vũng tàu”. 2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết cao từ lá cây ngải cứu.

- Định danh các thành phần hoá học có trong cao chiết lá ngải cứu.

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn có trong cao chiết lá ngải cứu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Lá của cây ngải cứu được trồng tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.

Phạm vi nghiên cứu:

- Chiết, xác định thành phần hoá học trong dịch chiết cao lá ngải cứu.

- Thăm dò hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu đối với năm chủng vi khuẩn.




4. Một số phương pháp:

Nghiên cứu lý thuyết: Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần

hoá học, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng của cây ngải cứu.

Phương pháp thực nghiệm:

- Chuẩn bị mẫu: lá được thu hái, rửa thật sạch bằng nước sau đó phơi khô, xay

nhuyễn.

- Phương pháp xác định một só chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro.

- Phương pháp chiết soxhlet để lấy dịch chiết lá ngải cứu và đem cô quay thành

cao.

- Phương pháp GC – MS để định danh, định danh các hợp chất có trong cao chiết

lá ngải cứu.

- Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá ngải cứu.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa về mặc khoa học:

- Cung cấp những thông tin khoa học một số chỉ tiêu hóa lý, khảo sát quy trình

chiết, xác định thành phần hóa học của một số hợp chất chính trong lá ngải cứu.

- Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này.

Ý nghĩa về mặt thực tiễn:

- Nhằm giúp cho việc ứng dụng ngải cứu ở phạm vi rộng một cách khoa học hơn.

- Giải thích một cách khoa học một số kinh nghiệm dân gian về ứng dụng của ngải

cứu.

6. Bố cục đề tài

Đề tài gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Nguyên liệu và các phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây ngải cứu [1], [19]

1.1.1. Nguồn gốc cây ngải cứu

Theo dân gian: cái tên "ngải cứu" cũng đã gợi cho nhiều người về ý nghĩa của nó. Theo

sách "Thảo mộc dược Đông y", ngải cứu có nghĩa là "cứu vãn tình nghĩa" và có một sự

tích kể về nguồn gốc của loài ngải cứu. Ngày xưa, ở vùng Nội Mông (Trung Quốc), có

cô gái dáng hình thắt đáy lưng ong, nhan sắc kiêu sa, tên là Kim Tuyến. Ở độ tuổi 20,

nàng đã kết duyên cùng chàng kỵ sĩ. Một hôm, nhân buổi du xuân, có vị đại thần nhác

trông thấy Kim Tuyến đã sinh lòng thèm muốn và tìm cách sát hại kỵ sĩ. Ông ta bèn vu

cho chàng kỵ sĩ là đã bắn chết con ngựa của mình, nếu muốn được tha tội, chàng phải

nộp cho quan một đoạn dây thừng bện bằng tro cỏ, bằng không, sẽ bị đầy biệt xứ. Hiểu

được dã tâm của vị quan, Kim Tuyến ra vườn nhổ những cây thuốc già, héo khô về bện

thành đoạn thừng, đặt lên chiếc mâm đồng, rồi đốt cháy dần thành tro đem cho chồng

bê "mâm thừng" đến nộp cho quan. Thoạt trông thấy, quan phủ ngớ người nhìn mà

không nói năng gì! Hiểu được tài trí của đôi vợ chồng nọ, đại quan đành tuyên bố tha

tội cho chàng kỵ sĩ, và từ bỏ ý muốn chiếm đoạt Kim Tuyến. Vậy là loại cây thuốc trồng

ở vườn kia đã cứu vãn sự cách chia tình nghĩa vợ chồng. Dân làng biết chuyện, gọi cây

ấy là cây "ngải cứu". Từ đó, người ta còn phát hiện ra nhiều công dụng của ngải cứu với

mùi hương thơm nồng, hăng hắc không lẫn vào đâu được.

Theo nghiên cứu khoa học:

- Ngải cứu được biết đến từ thời cổ đại và đã từng được xem như một loài cỏ dại.

- Có nguồn gốc từ các vùng ôn đới ấm ở Bắc Mỹ, châu Âu, châu Á; vùng nhiệt đới Bắc

Phi và vùng hàn đới Alaska.

- Tên khoa học hiện nay Artemisia Vulgaris L. xuất phát từ tên Latin, tên của nữ thần

Artémis, người hiện diện để bảo vệ người phụ nữ khỏi bệnh tật.

1.1.2. Đặc tính sinh thái

a) Tên gọi

Tên thường gọi : Ngải cứu, ngải diệp, nhả ngải (tiếng Tày), quá sú (tiếng H'mông), co

linh li (tiếng Thái),…




Tên khác : Motherwort, Maiden wort, Mugwort (Anh), Cordon de S. Jose (Tây Ban

Nha), Armoise commune (Pháp),…

Tên khoa học : Artemisia Vulgaris L.

b) Phân loại khoa học

Giới: Plantea Bộ: Asterales

Họ: Asteraceae Ngành: Angiospermae

Loài: A.vulgaris Chi: Artemisia

Lớp: Asterids

c) Phân bố

- Ngải cứu phân bố rộng khắp thế giới, phát triển nhất ở vùng nhiệt đới Nam Á, các nước

Ðông Nam Á, Ấn Độ, Pakistan, Srilanca, Banglades và Trung Quốc.

- Ở nước ta, ngải cứu được trồng từ lâu đời trên khắp các vùng miền từ Nam chí Bắc và

mọc hoang nhiều nơi chẳng hạn như lề đường.

- Ngải cứu được trồng trên các loại đất không có nhiều đạm, giống như các khu vực đồng

cỏ và hoang hóa. Các hộ gia đình trồng ngải cứu xung quanh nhà với quy mô nhỏ, chưa

thấy trồng quy mô lớn.

1.1.3. Đặc tính thực vật

- Ngải cứu là cây thân thảo, sống lâu năm, thân cây cao khoảng từ 30 cm – 1,5 m (hiếm

khi cao trên 2m)

Hình 1. 1. Cây ngải cứu




- Các lá dài 5 – 20 cm, màu xanh lá cây thẫm, hình mũi giáo, xẻ thùy lông chim, với các

sợi lông trắng dày đặc 2 mặt trên, dưới.

- Lá ngải thường có mùi thơm nồng và có vị hơi đắng hoặc rất đắng tùy theo mùa.

- Những bông hoa nhỏ (dài ~ 5 mm) đối xứng với nhiều cánh hoa màu vàng hoặc màu

hồng. Cụm hoa hẹp và rất nhiều, sinh thành chùm. Hoa trổ từ tháng 7 – 10.

- Ngải cứu là cây ưa ẩm, dễ trồng bằng cách giâm cành những đoạn gốc thân già.

Hình 1. 2 Các bộ phận của cây ngải cứu

1.2 .Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và dinh dưỡng của cây ngải cứu. [1], [18]

1.2.1. Thành phần hóa học

- Lá chứa nhiều flavonoid loại tri và tetra hydroxyflavone; dẫn xuất coumarin,….

- Dịch chiết từ thân cây và rễ cây chứa nhiều lactone sesquiterpen như dehydromatricarin

và artevulgarin,… Trong đó artevulgarin là một chất mới chưa được tỉm thấy trong tự

nhiên.

- Cả cây có chứa tinh dầu với lượng nhỏ từ 0,20 – 0,34%, trong đó chiếm đến 90% là 1,8

– cineole, thuyone.

- Ngoài ra trong ngải cứu còn có hợp chất của indole, xeton, dehydro matricaria este,

tetradecatrilin, tricosanol, arachyl alcol, chất màu, vulgarin, profilin, các acid amin như

adenin, cholin.




- Trong ngải cứu Việt Nam có nhiều chất màu Indigo – base, gần 50 hợp chất đã phân

tích và xác định có trong lá ngải cứu và chủ yếu là caryophylen 24%, cuberene 12%

1.2.2. Thành phần dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng trong 100g lá ngải cứu tươi được thể hiện ở bảng 1.1.

Bảng 1. 1: Thành phần dinh dưỡng của lá ngải cứu tươi

Thành phần Hàm lượng (g)

Calories 50 – 60

Protein 5

Chất béo 0

Carbohydrates 8

Chất xơ 3.5

Vitamin B6 & C 0.028

1.2.3. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học của lá ngải cứu [18]

1-8-Cineol

-pinen

C10H18O (Eucalyptol): là một hợp chất hữu cơ tự nhiên,

trong điều kiện nhiệt độ phòng là một chất lỏng không

màu. Nó là một ete vòng đồng thời là một monotecpenoit.

Được sử dụng trong các chất tạo mùi, tạo vị và trong mỹ

phẩm, là thành phần trong nhiều loại nước súc miệng và

thuốc ho.

C10H16: -pinen là một đồng phân của pinene với liên

kết đôi ngoại bào. Nó là một thành phần của tinh dầu

từ nhiều loại thực vật. Nó có vai trò như một chất

chuyển hóa thực vật. -pinen là một thành phần

hương vị.

https://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%A3p_ch%E1%BA%A5t_h%E1%BB%AFu_c%C6%A1

https://vi.wikipedia.org/wiki/Ete

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Monotecpen&action=edit&redlink=1

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/pinene




2-methylenebicyclo[3.1.1]heptane

1,7,7 trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-ol

1.3. Vi khuẩn [13]

Khả năng kháng khuẩn của cao lá ngải cứu đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác

nhau (200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba

chủng Gram âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi - ATCC

14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương

(Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).

1.3.1. Nhóm vi khuẩn Gram dương (Gr+)

a) Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn)

- Staphylococcus aureus được phân lập từ da, màng nhày của người và động

vật máu nóng (Trần Linh Thước, 2006).

- Những nhiễm trùng do Staphylococcus aureus có thể gây nên nhiều biểu

hiện khác nhau như: nhiễm trùng da, tổ chức dưới da hay các cơ quan nội tạng, gây mưng

mủ điển hình, nhiễm trùng huyết và bại huyết. Staphylococcus aureus còn có khả năng

hình thành độc tố đường ruột trong thực phẩm (Nguyễn Như Thanh và ctv,1997).

- Đặc điểm: Staphylococcus aureus hình cầu, tụ lại thành đám giống chùm nho, đường kính

từ 0,7 – 1µm, bắt màu Gr+, không có lông, không di động, không sinh nha bào, không có

giáp mô, tuy nhiên cũng có 1 số chủng có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

- Sức đề kháng: Staphylococcus aureus không có nha bào nên đề kháng kém đối với nhiệt

độ và hóa chất: ở 70oC vi khuẩn bị diệt trong 1 giờ, ở 80oC chết trong 10 – 30 phút, đun

sôi ở 100oC chết trong vài phút. Staphylococcus aureus dễ bị tiêu diệt bởi các loại thuốc

Borneol C10H18O: Borneol là một hợp chất hữu cơ bicyclic và

một dẫn xuất terpene . Nhóm hydroxyl trong hợp chất

này được đặt ở vị trí endo . Có hai chất đối kháng khác

nhau củaborneol. Cả d - (+) - borneol và l - (-) -borneol

đều được tìm thấy trong tự nhiên. Borneol dễ bị oxy

hóa thành ketone ( long não )

https://en.wikipedia.org/wiki/Organic_compound

https://en.wikipedia.org/wiki/Organic_compound

https://en.wikipedia.org/wiki/Terpene

https://en.wikipedia.org/wiki/Hydroxyl

https://en.wikipedia.org/wiki/Endo-exo_isomerism

https://en.wikipedia.org/wiki/Enantiomer

https://en.wikipedia.org/wiki/Organic_oxidation

https://en.wikipedia.org/wiki/Organic_oxidation

https://en.wikipedia.org/wiki/Ketone

https://en.wikipedia.org/wiki/Camphor




sát trùng thông thường: acid fenic 3 – 5% giết vi khuẩn trong 3 – 15 phút, formol 1% tiêu

diệt vi khuẩn trong 1 giờ, cồn nguyên chất không có tác dụng đối với Staphylococcus

aureus nhưng cồn 70% diệt vi khuẩn trong vài phút. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

- Tính sinh độc tố: Staphylococcus aureus có thể sản sinh ra các loại độc tố sau: độc tố

dung huyết, độc tố diệt bạch cầu, độc tố gây hoại tử da, độc tố gây chết, độc tố đường ruột,

các yếu tố độc lực ngoại bào. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn hình thành những nhân

tố gây bệnh sau: chất làm tan tơ huyết, men làm đông huyết tương, nhân tố khuếch tán

(Trần Thị Phận, 2004).

- Tính kháng thuốc:

Staphylococcus aureus là vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện rất phổ biến, và người ta

đã nghiên cứu được nó có khả năng đề kháng với một số kháng sinh. Tuy nhiên loại kháng

sinh và mức độ kháng tùy thuộc vào điều kiện địa lý. Sự kháng thuốc ở Staphylococcus

aureus là 1 đặc điểm rất đáng lưu ý. Đa số Staphylococcus aureus kháng lại các nhóm

kháng sinh nhóm -lactams nhờ men -lactamase (Nguyễn Thanh Bảo, 2003).

Một số còn kháng được methicillin gọi là methicillin resistant Staphylococcus aureus

(MRSA), do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh. Hiện nay

một số rất ít các tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ. Trong trường

hợp này, vancomycin được dùng thay thế (Lê Huy Chính, 2007).

- Tính gây bệnh:

+ Trong tự nhiên:

Nhiễm khuẩn ngoài da: Staphylococcus aureus làm mưng mủ các vết thương, nơi sây sát

trên da, làm các tổ chức bị sưng, tạo thành áp se (Trần Thị Phận, 2004).

Nhiễm khuẩn huyết: từ các ổ nhiễm trùng ngoài da, tụ cầu khuẩn xâm nhập vào máu gây

chứng huyết nhiễm mủ và theo máu đi tới các cơ quan gây nên các ổ áp se. Tụ cầu khuẩn

là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amygdale, viêm vú cho người (Trần Thị Phận,

2004). Ngoài ra tụ cầu khuẩn gây viêm vú ở bò sữa, viêm da có mủ ở chó (Nguyễn Như

Thanh và ctv, 1997; Lưu Hữu Mãnh, 2009).

Trong các loài vật, ngựa dễ cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, lợn, cừu. Gà vịt có sức đề

kháng cao nhất đối với Staphylococcus aureus (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).




Trong phòng thí nghiệm: Theo Trần Thị Phận (2004), thỏ cảm nhiễm nhất. Nếu tiêm canh

trùng Staphylococcus aureus vào tĩnh mạch thỏ thì thỏ sẽ chết trong vòng 1 – 2 ngày vì

chứng huyết nhiễm mủ. mổ khám thấy có nhiều ổ áp se ở tim, thận, xương và bắp

thịt…Nếu tiêm canh trùng Staphylococcus aureus vào dưới da cho thỏ sẽ gây áp se dưới

da.

Hình 1. 3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus trên kính hiển vi

b) Bacillus cereus

- Bacillius cereus là vi khuẩn Gram dương khi chưa trưởng thành nhưng có thể thành Gram

âm khi chúng già, hình que, sinh bào tử, kị khí, có khắp nơi trong tự nhiên.

- Vi khuẩn Bacillus cereus là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng ngộ độc thực

phẩm, trong khi một số chuẩn lại có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật. Một

nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tác nhân gây bệnh tinh vi này sản xuất ra 19 biến thể

khác nhau của một loại chất độc gây buồn nôn và ói mửa ở người. Khả năng phân lập đa

dạng này có thể giải thích cho tình huống tại sao một số trường hợp ngộ độc tương đối

lành tính trong khi một số trường hợp khác có thể dẫn đến tử vong.

- Đặc điểm:

Liều lượng nhiễm khuẩn ban đầu trong các loại thực phẩm có Bacillius cereus ở hầu

hết các trường hợp là rất thấp (< 102 – 103 CFU/g). Theo ngưỡng đặt ra, tổng số vi

khuẩn từ 105 đến 108 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi gram (CFU/g) là định

lượng của độc tố hình thành trong thực phẩm hoặc trong ruột non.

Dạng sinh dưỡng của Bacillius cereus phát triển trong khoảng từ 10 – 50°C, với nhiệt

độ tối đa từ 30 – 40°C. Tuy nhiên, các chủng chịu lạnh cũng có thể nhân bản ở nhiệt




độ từ 4 – 6°C; trong những trường hợp này, thời gian nhân bản thường dài hơn đáng

kể.

Dưới độ pH 4,8 các dòng Bacillius cereus không thể nhân bản được. Tuy nhiên, sự

dung nạp axit giữa các chủng thay đổi đáng kể. Giá trị giá trị aw (sinh sôi trong nước)

tối thiểu cho phép nhân bản là xấp xỉ 0,92.

Nhiệt độ dưới 100°C cho phép các bào tử tồn tại. Do đó, các phương pháp làm

nguội nhanh chóng sau khi xử lý nhiệt là cần thiết để ngăn chặn sự nảy mầm của bào

tử.

- Tính sinh độc tố: Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau

như: nhiễmtrùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.

+ Vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố:

Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin.Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau

quả, gia vị.Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu

chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.

Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vikhuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội,

đậu các loại. ản chất độc tố là phospholipid có tính ổn định cao không bị phân hủy ở

nhiệtđộ cao và dịch dạ dày.

+ Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây

chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã

góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng

và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.

- Tính gây bệnh: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các

loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.

-

Hình 1. 4. Vi khuẩn Bacillius cereus trên kính hiển vi




1.3.2. Nhóm vi khuẩn Gram âm (Gr-)

a) Salmonella spp

- Salmonella là vi khuẩn đường ruột, Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae.

Những chủng vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong môi trường, có thể tìm thấy

trong đất, nước, thực phẩm và đường ruột của người và súc vật (Marcel Dekker,

2001).

- Năm 1934, theo đề nghị của hội sinh vật học quốc tế để kỉ niệm người đầu

tiên tìm ra vi khuẩn, tên chính thức của vi khuẩn này được đặt là: Salmonella

(Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).

- Đặc điểm:

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích

thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3µm, không hình thàn nha bào và giáp mô. Phần lớn các loài

thuộc giống Salmonella có thể di động mạnh do thân trên có lông (7 đến 12 lông xung

quanh thân), trừ Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum. (Nguyễn Vĩnh Phước,

1977).

Salmonella là vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy nghi, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp là

37oC nhưng vẫn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 – 42oC, pH thích hợp 7,2 – 7,6 (Nguyễn

Vĩnh Phước, 1977). Khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng hơi lồi lên ở giữa,

nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của Escherichia coli (đường kính 1 – 1,5mm) (Nguyễn Như

Thanh và ctv, 1997).

Theo Trần Linh Thước (2006), phần lớn các loài Salmonella có đặc điểm: lên men sinh

hơi glucose và manitol nhưng không lên men đường lactose và succharose, không sinh

hơi indol, không phân giải urê, không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan, sinh

H2S, khử nitrate thành nitrite (NO3- thành NO2

-).

- Sức đề kháng:

Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại 1 tuần, trong nước đá

có thể sống 2 – 3 tháng. Trong xác động vật chết chôn ở bùn hoặc cát khô có thể sống

từ 2 – 3 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).

Salmonella đề kháng yếu với nhiệt độ, ở nhiệt độ 60oC bị diệt trong 1 giờ,

70oC trong 20 phút, 75oC trong 5 phút. Có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở




nhiệt độ 10oC trong 115 ngày. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn

trong nước trong 5 giờ, nước đục trong 9 giờ.

- Tính sinh độc tố:

Nội độc tố: rất mạnh, với liều thích hợp tiêm tĩnh mạch vi khuẩn có thể giết

chết chuột bạch, chuột lang trong vòng 48 giờ với các triệu chứng: ruột non sung

huyết, phù nề, đôi khi hoại tử. độc tố gây độc thần kinh, gây hôn mê, co giật. Nội độc

tố có 2 loại: loại sung huyết và mụn loét.

Ngoại độc tố: tác động vào thần kinh và ruột, và chỉ hình thành trong điều

kiện invivo và trong môi trường nuôi cấy yếm khí (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).


Theo Bùi Thị Tho (2003), Salmonella có khả năng đề kháng với các kháng

sinh sau: chloramphenicol (37,4 – 68,1%), tetracycline (33,4 – 59,6%), streptomycin

(74,6 – 89,24%). Những kháng sinh dùng nhiều và rộng rãi thì tỷ lệ kháng thuốc cao

như: streptomycin, sulfonamid, chlortetracyclin…

Năm 2001, tại Đồng Bằng Sông Cửu Long, Trần Thị Phận và ctv đã nghiên

cứu về sự nhạy cảm đối với kháng sinh của 30 chủng Salmonella phổ biến và phát

hiện được các chủng kháng kháng sinh với tỷ lệ: ampicillin (54,5%), chloramphenicol

(36%), tetracycline (36%) và cephalexin (9%).

Theo Natsue Ogasawara et al. (2001), giá trị MIC50 MIC90 của các chủng

Salmonella spp. Được phân lập tại Đồng Bằng Sông Cửu Long đối với

oxytetracycline (MIC50 = 2µg/ml và MIC90 = 128µg/ml), streptomycin (MIC50 và

MIC90 = 8µg/ml ), kanamaycin (MIC50 và MIC90 = 2µg/ml), ampicillin (MIC50 = 1

µg/ml và MIC90 = 2 µg/ml), cefazolin (MIC50 và MIC90 = 1 µg/ml).


Trên động vật vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn và phó thương hàn cho gia súc,

gia cầm. Bình thường có thể phát hiện Salmonella trong ruột của bò, heo, gà… và một

số động vật khỏe mạnh khác. Khi sức đề kháng của động vật giảm sút, vi khuẩn sẽ xâm

nhập vào nội tạng và gây bệnh. Trâu bò đang cho sữa bị nhiễm Salmonella thì lượng sữa

sẽ giảm hoặc mất.




Trong phòng thí nghiệm, chuột bạch cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể

dùng chuột lang hay thỏ. Sau khi tiêm vi khuẩn Salmonella vào dưới da hoặc phúc mạc

thì ở chỗ tiêm phát sinh thuỷ thủng, sưng, mưng mủ loét. Sau 4 – 5 ngày hoặc 8 – 10

ngày con vật gầy ốm dần rồi chết (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).

Ngoài ra, Salmonella còn gây bệnh nhiễm trùng huyết ở bò cái đẻ và gây còi cọc ở bò

trưởng thành đang cho sữa (Sojka et al., 1974).

Hình 1. 5. Vi khuẩn Samonella spp trên kính hiển vi

b) Escherichia coli

- Vi khuẩn Escherichia coli được phát hiện đầu tiên vào những năm 1885

với tên gọi Bacterium coli commune từ các chủng vi khuẩn đường ruột. Escherichia coli

thuộc họ Enterobacteriaceae, loài Escherichia (Đào Trọng Đạt và ctv, 1999).

- Đặc điểm: Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), Escherichia coli là một trực

khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 2 – 3µ x 6µ. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn,

đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn Escherichia coli di động do có lông

ở xung quanh thân, nhưng một số không thấy di động, không sinh nha bào, có thể có giáp

mô. Escherichia coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một

số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản.

- Sức đề kháng: Escherichia coli bị diệt ở nhiệt độ 55oC trong 1 giờ. Ở 60oC bị diệt trong

vòng 15 – 30 phút, chết ngay ở 100oC. Các chất sát trùng acid phenic, clorua thủy ngân

(II), formon… có thể diệt Escherichia coli trong 5 phút. Escherichia coli đề kháng với sự

sấy khô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

- Tính sinh độc tố: Escherichia coli tiết 2 loại độc tố: ngoại độc tố và nội độc tố.




Ngoại độc tố: Phá hủy thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và

gây nhiễm độc thần kinh.

Nội độc tố: Phá hủy thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh và biểu

hiện nhiều triệu chứng khác.


Escherichia coli nhạy cảm tuyệt đối với ciprofloxacin, gentamycin, neomycin, ofloxacin

và kanamycin (100%). Riêng đối với ampicillin là 86,67% và bactrim là 80% (Nguyễn

Ngọc Thanh Hà, 2004).

Tuy nhiên, theo Phan Trọng Hổ và ctv (2001) thì Escherichia coli đề kháng

cao với chloraphenicol (86,79%), penicillin (83,02%). Kháng thấp với neomycin

(11,32%), polymycin B (13,21%), furazolidon (15,09%).


Hầu hết các loài gia súc, gia cầm, chim muông, bò sát đều có thể cảm nhiễm Escherichia

coli (Đào Trọng Đạt và ctv, 2001).

Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), Escherichia coli có sẵn trong ruột

động vật nhưng chỉ có tác động gây bệnh khi sức đề kháng trong cơ thể con vật giảm (do

chăm sóc, nuôi dưỡng, do cảm lạnh hoặc cảm nắng). Bệnh do Escherichia coli gây ra có

thể như một bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin và mắc các bệnh virus,

kí sinh trùng. Escherichia coli thường gây bệnh cho súc vật mới sinh từ 2 – 3 ngày hoặc

4 – 8 ngày.

Người ta thường gọi Colibacillosis là một bệnh đường ruột của ngựa, bê,

cừu, heo và gia cầm non do Escherichia coli gây ra.

Hình 1. 6. Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi

c) Pseudomonas aeruginosa

- Giới: Bacteria




- Ngành: Proteobacteria

- Lớp: GammaProteobacteria

- Bộ: Pseudomonadales

- Họ: Pseudomonadaceae

- Chi: Pseudomonas

- Loài: aeruginosa

- Tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa.

+ P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo

chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực Pseudomonas aeruginosa.

là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu

có NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C.

+ P. aeruginosa cho phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, urease nhưng lại

cho kết quả âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer) và

indole. Ngoài ra, Pseudomonas aeruginosa có khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng

dung dịch có chứa gelatin. Chúng có khả năng thủy phân casein và tạo enzyme lipase

nhưng lại không thủy phân được tinh bột. Pseudomonas aeruginosa cũng không có khả

năng lên men glucose và lactose để tạo acid.

+ Loài này hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt cơ thể động thực vật, là loài vi khuẩn

gây bệnh cơ hội trên người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu

hệ bảo vệ của tế bào chủ. Pseudomonas aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau ở

người: gây viêm màng trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp

ở những người có đường hô hấp hoặc hệ thống tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm phổi ở

những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết tim; gây nhiễm trùng

đường máu, đường tiết niệu ở những bệnh nhân suy giảm hệ thống miễn dịch như AIDS,

giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường, bỏng nặng; gây viêm màng não mủ và áp xe não;

gây viêm tai; gây bệnh hóa sừng ở mắt ở những người có hệ thống bảo vệ suy yếu; gây

viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da, mô mềm; ... Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn

kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một số ít các kháng

sinh có tác dụng đối với giống Pseudomonas là fluoroquinolone, gentamycin và

imipenem.




Hình 1. 7. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi

1.4. Giá trị sử dụng của cây ngải cứu [7], [13]

1.4.1. Y dược dân gian

- Trong y học Nhật Bản và Trung Quốc, người ta sử dụng liệu pháp đốt ngải cứu trong ngành

châm cứu để khôi phục lại sức khỏe, cân bằng năng lượng.

- Ngải cứu được cuộn lại thành bó hoặc gắn với các kim châm cứu, đặt trực tiếp lên da và

đốt gần các huyệt đạo để hâm nóng huyệt đạo.

- Làm thuốc điều kinh:

+ Một tuần trước ngày kinh dự kiến, mỗi ngày lấy ngải cứu sắc với nước hoặc pha với

nước sôi như trà, uống trong ngày. Nếu kinh nguyệt không đều thì hàng tháng đến ngày

bắt đầu kỳ kinh và cả những ngày đang có kinh, lấy ngải cứu khô sắc với nước, thêm chút

đường để uống.

+ Hiệu quả rõ rệt, người đỡ mệt, máu kinh đỏ và ít hơn.

- Giúp an thai:

+ Bài thuốc này có tác dụng an thai. Ngải cứu không có tác dụng kích thích với tử cung

có thai nên không gây sảy thai.

+ Những người đang mang thai, nếu thấy có hiện tượng đau bụng, ra máu, dùng lá ngải

cứu, lá tía tô, sắc cùng với nước, uống trong ngày.

- Sơ cứu vết thương:

+ Cầm máu nhanh, giảm đau nhức.

+ Lấy lá ngải cứu tươi giã nát, thêm một ít muối rồi đắp lên vết thương.

- Trị mụn, mẩn ngứa: Lấy lá ngải cứu tươi giã nát, đắp lên mặt, làm liên tục như vậy một

thời gian sẽ có làn da trắng sáng hồng. Với trẻ em thường hay bị rôm sảy thì lấy lá ngải

cứu xay nát rồi lọc lấy nước cho trẻ tắm.




- Đau thần kinh tọa, nhức buốt khớp xương, đau đầu hoa mắt: Lấy ngải cứu rửa sạch, giã

nát, thêm mật ong, vắt lấy nước uống.

- Cảm cúm, ho, đau cổ họng, đau đầu, đau dây thần kinh: Lấy ngải cứu, lá khuynh diệp, lá

bưởi (hoặc quýt) nấu với nước. Uống mỗi lúc khát, liên tục trong 3 – 5 ngày.

1.4.2. Các nghiên cứu dược học về ngải cứu

- Từ xa xưa, nhân dân các nước vùng Đông Nam Á cũng như Trung Quốc, Nhật Bản đã biết

dùng lá ngải cứu để điều trị một số bệnh.

- Ngày nay, các nhà khoa học cũng tiến hành nghiên cứu và phát hiện thêm một số đặc tính

quý báu nữa:

+ Làm tăng cơ bắp và tăng cường sức khỏe: trong thành phần ngải cứu có chứa glucose,

absinthine, tannin, axit malic, azulene và cadinene.

+ Giúp tăng sức lực mạnh mẽ, sát khuẩn, trị tiêu chảy, hạ sốt, điều hòa kinh nguyệt bởi

trong thành phần ngải cứu chứa vitamin B6 và vitamin C.

+ Ngải cứu còn được biết đến là một loại thuốc thảo mộc rất tốt cho sự tiêu hóa vì nó

quản lý tăng tiết mật, tăng cường khả năng giải độc của gan.

+ Ngải cứu cũng là liều thuốc tốt giúp phòng chống bệnh dạ dày: các chất đắng như

santonin (lacton của axit santoninic) và các thành phần tinh dầu dễ bay hơi trong ngải

cứu khi tiết qua dạ dày sẽ trở thành một chất kháng viêm dạ dày hiệu quả và cũng là

liều thuốc chống giun sán. Theo nghiên cứu, nếu có giun trong đường ruột, có thể sử

dụng ngải cứu liên tục trong 9 ngày để loại bỏ giun.

+ Được sử dụng như thuốc nhuận tràng, tăng việc đi tiểu nhiều, giải thoát nhiệt ra khỏi

cơ thể.

+ Giúp vết sẹo nhanh liền, chữa lành các vết thương, trị mụn, mẩn ngứa: Ngải cứu có

khả năng kháng histamin cũng như các chứng viêm. Dùng lá ngải cứu tươi giã nát, đắp

lên chỗ cần điều trị sẽ có làn da trắng sáng, hồng hào.

+ Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy ngải cứu có khả năng giúp điều trị bệnh trĩ và

viêm âm đạo.

- Ngải cứu được coi là tốt cho sức khỏe nhưng nếu dùng quá nhiều cũng có thể gây ra ngộ

độc. Độc tính của ngải cứu khi dùng quá liều là làm cho thần kinh trung ương bị hưng

phấn quá mức, dẫn tới chân tay run giật, sau đó cục bộ hoặc toàn thân co giật. Sau vài lần




có thể dẫn đến co cứng, thậm chí tê liệt. Kiểm tra bằng kính hiển vi có thể phát hiện các

tổn thương ở tế bào não. Sau khi khỏi bệnh, vẫn thường để lại những di chứng như hay

quên, ảo giác, viêm thần kinh,…

1.4.3. Dược tính lá ngải cứu

- Trên thế giới, một nghiên cứu đã phân lập được trong lá ngải cứu hơn hai mươi flavonoid

được biết đến, nhiều nhất là Jaceosidine, Leuteolin, Quercetin và Eupafoline. Các chất

này là những flavonoid có hoạt tính mạnh, có tác dụng chống viêm, làm giảm sự tăng

sinh các tế bào gây chết. Chúng có tác dụng hiệp đồng với thuốc hóa dược trị ung thư

tiazofurin trên các tế bào ung thư biểu mô buồng trứng của người. Có thể dùng liều

tiazofurin thấp hơn trong liệu pháp kết hợp, do đó làm giảm các tác dụng không mong

muốn. Bốn flavonoid này cũng làm tăng tác dụng của thuốc hóa dược trị ung thư

carboxytriazol trên tế bào ung thư biểu mô vú người và làm tăng hoạt tính chống tăng

sinh các tế bào gây hại của thuốc hóa dược busulfan.

- Giảm thiếu máu: các chất chiết xuất từ lá ngải cứu ức chế sự tạo thành cụm tế bào bạch

cầu, cải thiện lưu lượng máu một cách đáng kể.

- Chống bệnh giun xoắn: bệnh giun xoắn có thể gây ra tiêu chảy, sốt, phù quanh hốc mắt

và viêm cơ ở người. Nghiên cứu về các chất chiết xuất của methanol với lá ngải cứu cho

thấy tỷ lệ ấu trùng đã giảm một lượng lớn trong hệ thống đường ruột người.

- Chống tăng huyết áp: huyết áp cao là một trong những nguyên nhân dẫn đến chứng xơ

vữa động mạch, khiến gia tăng nguy cơ bị đau tim và đột quỵ. Nghiên cứu cho thấy các

chất chiết xuất của nước và cloroform với lá ngải cứu có khả năng chống tăng huyết áp

nhưng không đáng kể.

- Tác dụng chống oxy hóa: trong ngải cứu chứa nhiều loại chất chống oxy hóa như

glutathione (chất chống oxy hóa mạnh nhất), vitamin C, superoxide dismutase; các chất

này ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa các chất khác bằng cách khử đi các gốc

tự do, kìm hãm quá trình oxy hóa. Kết quả cho thấy ngải cứu là một nguồn tiềm năng của

chất chống oxy hóa tự nhiên.

- Tác dụng chống co giật: trong một nghiên cứu dịch chiết từ lá và thân ngải cứu với nước

cho thấy các chất chiết xuất này giúp trì hoãn việc khởi phát các cơn động kinh và giảm tỷ

lệ tử vong.




- Tác dụng chống co thắt phế quản: lá ngải cứu có tác dụng diệu kỳ trong việc điều trị rối

loạn đường hô hấp, ho cũng như hen suyễn.

- Tác dụng hỗ trợ miễn dịch và giúp cân bằng các hormone: trong cơ thể, các hợp chất

indole có tác động tích cực đến sức khỏe tế bào, thúc đẩy các tế bào khỏe mạnh, giúp ngăn

ngừa ung thư (Theo nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Đại học Vanderbilt – Hoa Kỳ,

thanhnienonline.com, 02/05/2012).

- Tác dụng sát trùng: các thành phần tinh dầu như: 1,8 – cineole, thuyone, sabinene,.. khi

bay hơi sẽ tạo cảm giác mát mắt, có tính sát trùng nhẹ. Tuy nhiên, vì tinh dầu có chứa hàm

lượng đáng kể của thuyone, nếu dùng quá liều có thể dẫn tới ngộ độc cấp, gây cảm giác

quầng nhiều màu sắc, nhìn mờ, lú lẫn, giảm cảm giác và hoang tưởng.

1.4.4. Thu hái và chế biến [7]

- Thu hái lá vào hai mùa xuân, hạ (thường hái vào dịp Tết Đoan ngọ, mồng 5 tháng 5 âm

lịch). Khi hoa chưa nở, lá đang tươi tốt, cắt lấy lá đem phơi khô trong râm thì được ngải

diệp.

- Loại lá ngải khô, mặt dưới màu vàng trắng tro; lá có nhiều lông nhung, mùi thơm đậm,

không lẫn cành già, không lẫn tạp chất, không mốc vụn là tốt. Lá ngải phải là toàn lá hoặc

chỉ lẫn ít cành non, nhỏ, đường kính dưới 2 mm. Theo kinh nghiệm nhân dân, lá ngải cứu

càng để lâu càng tốt.

1.4.5. Một số chế phẩm từ ngải cứu [20]

- Tinh dầu ngải cứu: thư giãn, xông trị cảm cúm, suy nhược cơ thể

Hình 1. 8. Tinh dầu ngải cứu

- Mặt nạ chiết xuất từ ngải cứu: thư giãn, kháng khuẩn cho da mụn hoặc viêm lỗ chân

lông, dạng scrub nhỏ giúp tẩy tế bào chết vật lí nhẹ nhàng.




Hình 1. 9. Mặt nạ chiết xuất từ ngải cứu

- Kem dưỡng dạng gel chiết xuất từ ngải cứu: cung cấp nước cho da, giúp da căng bóng

đủ độ ẩm, kháng khuẩn và điều trị mụn tốt. Dạng gel giúp thẩm thấu nhanh hơn dạng

cream, phù hợp cho da hỗn hợp đến da dầu

Hình 1. 10. Kem dưỡng dạng gel chiết xuất từ ngải cứu

- Trứng gà ngải cứu: giúp lưu thông máu lên não, trị bệnh đau đầu.

Hình 1. 11. Trứng gà ngải cứu

- Gà hầm ngải cứu: bồi bổ sức khỏe, hoạt huyết, giúp xương cốt dẻo dai.




Hình 1. 12. Gà hầm ngải cứu

1.5. Xây dựng quy trình chiết [6], [10]

1.5.1. Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô

và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Có thể chiết từ hỗn

hợp dung dịch hay từ chất rắn. Sau đó loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt

độ và áp suất thích hợp.

a) Chiết đơn giản, một lần

Đun nóng hợp chất với dung môi trong bình cầu có sinh hàn hồi lưu, lọc nóng hoặc

để lắng cho trong rồi chắt.

b) Chiết đơn giản, nhiều lần

- Nói chung, muốn làm cho quá trình chiết lặp đi, lặp lại nhiều lần ta nên dùng những

bộ dụng cụ công tác tự động. Những bộ công cụ như vậy bao gồm một bình cầu, một

thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lưu. Dung môi ở trong bình cầu được làm bốc

hơi từng phần, dung môi ngưng tụ nhỏ vào mẫu được chiết đựng trong một cái túi

bằng giấy lọc và sau đó lại chảy vào bình. Trong quá trình đó cấu tử cần tách được

làm giàu thêm trong dung môi.

+ Phương pháp này được Soxhlet đưa ra năm 1879, được sử dụng như một ví dụ của

phương pháp chiết liên tục áp dụng để chiết chất lỏng từ thực phẩm.

+ Trong phương pháp này, mẫu được làm khô, được nghiền thành những mẫu nhỏ

và đặt trong túi vải dễ thấm. Sau đó cho vào bộ chiết soxhlet gồm một bình cầu,

một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Bình cầu được đun nóng, dung môi bay




hơi rồi được ngưng tụ bằng ống sinh hàn, chuyển thành dạng lỏng và nhỏ giọt vào

ống chiết chứa mẫu. Ống chiết được thiết kế có một ống xi-phông đặt ở bên cạnh

sao cho khi dung môi bao quanh mẫu vượt quá khuỷu trên của ống xiphông, nó sẽ

chảy tràn qua rồi từ từ chảy xuống trở lại vào bình cầu đang sôi.

+ Cuối quá trình chiết, bình cầu chứa dung môi và chất lỏng được lấy ra.

+ Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quả tương đối cao.

1.5.2.Phương pháp siêu tới hạn [23]

Đây là phương pháp chiết tách bằng cách sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn.

Nguyên lý:

Bất kỳ dung môi nào cũng sẽ ở trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ và áp suất

trên giá trị tới hạn. Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định

chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng và khí. Nếu nén chất

khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở

đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi

vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở

trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó

mang tính trung gian giữa khí và lỏng. Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất

cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạn của nó (trên TC = 31oC, PC = 73,8 bar), CO2 sẽ chuyển

sang trạng thái siêu tới hạn. Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân

tách của quá trình trích ly và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất. Nó có khả năng

hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá

trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2

chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được tháo ra ở bình hứng. Ở mỗi điều kiện

nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi một đối tượng cần chiết tách khác

nhau.

1.5.3. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) [3], [4], [6]

1.5.3.1. Phương pháp sắc ký khí (GC)

- Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định

lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các

hợp chất hữu cơ.




- Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hoá hơi để đưa vào

cột sắc ký, thường hoá hơi dưới 250C

- Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lên trên bề mặt

chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột

(cột mao quản). Tuỳ thuộc vào bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí :

+ Sắc ký khí rắn (Gas Solid Chromatography – GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực

tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.

+ Sắc ký khí lỏng (Gas Liquid Chromatography – GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không

bay hơi. Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân

huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi. Có 2 loại

kĩ thuật phân tích:

Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách

hoàn toàn.

Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng

triệt để.

Nguyên tắc hoạt động:

- Nhờ có khí mang trong chứa trong bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi

được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau

khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại

đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển

sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lí ở đó rồi chuyển sang

bộ phận in và lưu kết quả (bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi). Trên sắc đồ nhận được, sẽ

có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic.

- Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích. Diện tích pic là

thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.

- Sắc đồ là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào thời gian lưu ta

có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định được thành phần mỗi

chất trong hỗn hợp.

1.5.3.2. Phương pháp sắc ký khối phổ




- Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu được ion hoá trong

pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không bằng những phương pháp thích hợp thành

những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này được

phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối

trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi

lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi

là khối phổ đồ.

- Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cường độ các vạch

được đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường đọ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thường là

đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát.

- Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng, mà căn cứ

vào các mảnh phân tử tạo thành, ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử. Xác suất tạo thành

mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết trong phân tử cũng như vào khả năng bền hoá

các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau. Các mảnh có độ bền lớn sẽ ưu tiên tạo

thành, các liên kết yếu nhất dễ bị đứt nhất. Có những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi

là mảnh chìa khoá, chúng cho phép phân tích các phổ khối lượng dễ dàng.

1.5.3.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)

Hình 1. 13. Sơ đồ thiết bị sắc ký ghép khối phổ




- Phương pháp GC – MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc ký khí (GC) với máy phổ

khối lượng (MS)

- Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu

hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận

dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định được nồng độ của mỗi thành

phần hóa chất.

- Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp

như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận

dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay). Cấu trúc của

chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết. Nếu không tìm

ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới

tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên cứu

thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến

hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này.

a) Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:

- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ

được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ,

thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành

dạng khí.

- Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. nhiệt độ của

lò này dao động từ 40 – 320 oC.

- Cột (cloumn):

Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt

trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân

tách bằng cách chạy dọc theo cột này.




Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây

chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ

lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi

qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông

tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ

là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.

- Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp

và đưa ra kết quả khối phổ.

b) Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ:

- Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị

xuất hiện trong phổ đồ.

- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion

phân tử cũng như ion mảng.

- Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.

1.5.4. Phương pháp phân tích trọng lượng

a) Bản chất của phương pháp

- Bản chất của phương pháp Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phương

pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân khối lượng của sản phẩm, hình thành sau

phản ứng kết tủa bằng phương pháp hóa học hay phương pháp vật lý. Do chất phân tích

chiếm một tỉ lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối lượng của sản phẩm

đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phân tích.

- Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng:

+ Chọn mẫu và gia công mẫu.

+ Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm phân tích

dưới trạng thái tinh khiết hóa học hay dạng hợp chất có thành phần xác định bằng

phản ứng kết tủa hay điện phân.

+ Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy...) rồi đem cân

để tính kết tủa.

b) Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm:




- Cho phép xác định hàm lượng của các cấu tử riêng biệt với độ chính xác cao (đạt tới

0,01÷ 0,005 %, vượt xa độ chính xác các phương pháp chuẩn độ).

- Được dùng để xác định rất nhiều kim loại (các cation) và các phi kim (anion), thành

phần của hợp kim, của quặng silicat, các hợp chất hữu cơ,...

Nhược điểm: Thời gian xác định kéo dài. Vì nguyên nhân này mà các phương pháp

phân tích trọng lượng bị mất đi giá trị trước kia của mình và trong thực tiễn người ta

thay thế bằng các phương pháp phân tích hóa học và hóa lý hiện đại nhanh hơn nhiều.

1.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học kháng viêm [24]

Phương pháp 1:

Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người thường được sử dụng:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây

bệnh..

- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): Cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương,

vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng;

- Escherichia coli (ATCC 25922): Gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như

viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): Gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm

trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng

não, màng trong tim, viêm ruột.

- Candida albicans (ATCC 10231): Là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và

các bệnh phụ khoa.

- Lactobacillus fermentum (Lp B14): Gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có

ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.

- Enterococcus faecium (B650): Gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu,

viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.

Cách tiến hành: Thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên môi trường lỏng.

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá

mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính

là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt

khuẩn tối thiểu).




- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05

nồng độ là 128 μg/ml, 32 μg/ml, 8μg/ml, 2μg/ml, 0,5μg/ml

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử.

- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong nước cất theo

nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22μm; tiến hành các bước thì

nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác. Mẫu đối chứng (-) chất thử được thay

thế bằng nước cất vô trùng.

- Sau 24h đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng

độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ bước

sóng λ = 492nm và phần mềm xử lý chuyên dụng.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

Phương pháp 2: Thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa

thạch

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000).

- Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một

khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ

37C .

- Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μL dịch khuẩn, nồng độ tương

đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và

đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm.

- Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của các mẫu thực vật

trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50 μL dịch

chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng

trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn;

sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 37C trong 24 giờ.

- Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coli và P.

mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S. aureus và P. vulgaris)

- Đối chứng âm là DMSO.




- Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh

vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d =

đường kính lỗ khoan thạch.

- Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.

Hình 1. 14 Đĩa Petri có sẵn môi trường và vi khuẩn

Phương pháp 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration) là

thuật ngữ chỉ nồng độ tối thiểu của dung dịch thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn. MIC

được sử dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của dịch thử.

- Phương pháp môi trường lỏng

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dung

dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi

cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng theo cấp độ giảm 1 2 ⁄ trong môi trường nước

thịt. Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng tới mật độ xác định và được nuôi với thờ i

gian, nhiệt độ thích hợp cùng với sự hiện diện của kháng sinh trong môi trường nước

thịt. Với nồng độ thấp nhất của kháng sinh khi không thấy sự phát triển của vi khuẩn

(trong như ban đầu) được ghi nhận là giá trị MIC của dung dịch thử đó trên chủng vi

khuẩn đó.

Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm thứ nhất a ml dung dịch thử, thêm đồng thể tích

(a ml) dung dịch môi trường (pha loãng gấp 2 lần). Từ ống thứ nhất lắc đều lấy a ml

chuyển sang ống thứ hai đã có a ml môi trường (pha loãng gấp 4), cứ tiếp tục sang các




ống nghiệm sau cho hết các ống đã định, cuối cùng lấy a ml dung dịch ở ống cuối bỏ đi.

Như vậy ta có một dãy đã pha loãng dần. Một ống làm chứng thì chứa a ml môi trường,

thêm vào mỗi ống một lượng hỗn dịch vi khuẩn như nhau rồi để tất cả trong tủ ấm trong

một thời gian thích hợp. Nếu với mục đích định lượng thì tiến hành song song với một

dãy ống khác có những nồng độ đã biết của chất kháng khuẩn. Muốn đánh giá kết quả

ta đọc độ pha loãng lớn nhất mà vi khuẩn không mọc được. Muốn biết với độ pha loãng

đó vi khuẩn bị diệt hay chỉ bị kìm hãm thì từ ống có độ pha loãng đó ta lấy một phần và

chuyển vào một ống nghiệm khác có chứa môi trường vô trùng. Nếu sau khi ở tủ ấm mà

vi khuẩn mọc tức là kìm hãm, nếu vi khuẩn không mọc tức là diệt.

- Phương pháp môi trường đặc

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dung

dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi

cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng trong môi trường thạch theo cấp độ giảm ½.

Vi khuẩn được cấy trên đĩa kháng sinh và được ủ ấm cho phát triển. Nồng độ thấp

nhất khi quan sát bằng mắt thường với khuẩn lạc ≤ 3 được xác định.




CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất

2.1.1. Thu gom nguyên liệu

- Cây ngải cứu được thu hái từ xã Hòa Long, Thành Phố Bà Rịa, Tỉnh Bà Rịa – Vũng

Tàu.

Hình 2.1. Cây ngải cứu

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất

a. Thiết bị - Dụng cụ

Bảng 2. 1 Bảng danh sách thiết bị

Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng

Máy xay 1 Cân phân tích (0.0001g) 1

Tủ sấy 1 Bếp điện bình cầu 1

Lò nung 1 Máy sắc kí khối phổ 1

Máy cô quay chân không 1 Nồi hấp khử trùng 1




Bảng 2. 2 Bảng danh sách dụng cụ

Dụng cụ Số lượng Dụng cụ Số lượng

Bộ soxhlet 1 Cốc sứ 5

Bình cầu hai cổ 500ml 1 Đĩa petri 18

Bình cầu hai cổ 250 ml 1 Que cấy đầu nhọn 3

Nhiệt kế 1 Đèn cồn 1

Đũa thủy tinh 1 Que cấy đầu tròn 1

Muỗng inox 1 Que trang 1

Pipet (10ml, 5ml, 2ml) 3 Ống đong 500ml 1

Bóp cao su 1 Ống đong 250ml 1

Erlen 250 1 Cốc thủy tinh 250 2

Cốc thủy tinh 500 1

b. Hóa chất

- Cồn 96 - MHA

- Dimethyl sulfoxit (DMSO) - MHB

- Agar - Tetracylin

- Ampicillin

2.1.3. Vi khuẩn thí nghiệm [21]

Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại trường Đại học Công Nghiệp,

Thành phố Hồ Chí Minh bao gồm:

Chủng Staphylococcus aureus

Chủng Escherichia coli

Chủng Salmonella Spp

Chủng Bacilus cereus

Chủng Pseudomonas aeruginosa

2.1.4. Các phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu lý thuyết: nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu về đặc

điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của lá ngải cứu.

Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm




- Nghiên cứu chiết tách dịch chiết bằng phương pháp soxhlet với điều kiện khảo sát: tỉ lệ

nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết.

- Nghiên cứu phân tích trọng lượng: độ ẩm, hàm lượng tro hóa.

- Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong dịch chiết lá ngải cứu bằng phương pháp

sắc ký khối phổ GC/MS.

- Thử hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng năm vi khuẩn.

2.2. Xử lý nguyên liệu

- Thu hái toàn bộ lá ngải cứu tươi, nhặt nhọn những lá tươi không sâu bệnh, nấm mốc. Đem

đi rửa sạch sau đó phơi nắng đến khô.

- Khi tiến hành chiết tách mới xay nhỏ nguyên liệu cho vào túi nhằm đảm bảo độ chính xác

hàm lượng dịch chiết ra.

Hình 2. 2 Cây ngải cứu sau khi thu hái

Hình 2. 3 Lá ngải cứu sau khi được rửa sạch




Hình 2. 4 Lá ngải cứu đã được phơi khô

2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá ngải cứu [19]

2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ 2. 1 Quy trình công nghệ chiết cao lá ngải cứu

Dịch chiết

Cao chiết

Chiết bằng phương

pháp soxhlet

Lá ngải cứu

đã xử lý(10g) Lá tươi rửa sạch,

phơi khô, xay nhuyễn

Xác định một số chỉ

tiêu hóa lý: độ ẩm,

hàm lượng tro

Khảo sát điều kiện chiết:

nguyên liệu/dung môi

với thời gian

Cô quay

Đánh giá cảm quan

Thử hoạt tính sinh học

Xác định thành phần hóa

học bằng phương pháp

GC/MS




2.3.2. Thuyết minh quy trình

- Bước 1: Ngải cứu sau khi thu hái, nhặt phần lá tươi và không bị mốc, sâu bệnh. Sau đó

đem đi rửa sạch rồi phơi khô. Xay nhuyễn rồi cân chính xác 10g (± 0,1g). Chuyển toàn

bộ nguyên liệu đã được chuẩn bị vào túi lọc (10 x 5 cm)

- Bước 2: Đong 250ml cồn cho vào bình cầu 2 cổ đem lắp vào hệ thống soxhlet. Đun duy

trì hệ thống trong 7 giờ với nhiệt độ 85C.

- Bước 3: Thu dịch chiết, đem đi cô quay chân không thời gian 40- 45 phút. Dịch sau cô

quay được cho vào lọ 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su và được bảo quản trong tủ lạnh

ở nhiệt độ 5C.

- Bước 4: Đem dịch chiết đi phân tích GC/MS để định danh các hợp chất và thử hoạt tính

sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Salmonella Spp, Bacilus

cereus, Pseudomonas aeruginosa.

2.4. Mô hình chiết xuất dịch chiết thực nghiệm tại phòng thí nghiệm.

Hình 2.5 Mô hình chiết xuất dịch chiết lá ngải cứu tại phòng thí nghiệm

2.5. Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý.

2.5.1 Xác định độ ẩm: Phương pháp phân tích trọng lượng

- Nguyên tắc: Sấy ở nhiệt độ 100C đến khối lượng không đổi (± 0,1)




+ Độ ẩm của mỗi mẫu:

𝑾% = (𝒎𝟏 + 𝒎𝟐) − 𝒎𝟑

𝒎𝟐

× 𝟏𝟎𝟎

+ Độ ẩm trung bình:

𝑾𝒕𝒃(%) =∑ 𝑾(%)𝒏

𝟏

𝒏

Trong đó:

m1: khối lượng cốc sứ (g)

m2: khối lượng mẫu ban đầu (g)

m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g)

n: số lần xác định W%

2.5.2. Xác định hàm lượng tro: Phương pháp phân tích trọng lượng

- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò

nung ở nhiệt độ 550C đến khi thu được tro trắng hoàn toàn.

- Các mẫu bột lá ngải cứu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng

để tro hóa. Các mẫu trên được cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ

550C trong thời gian 6 tiếng (thu được tro trắng).

- Cứ mỗi 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

đến khối lượng không đổi (± 0,1), có khối lượng m4.

+ Xác định hàm lượng tro:

% 𝒕𝒓𝒐 = 𝒎𝟒 − 𝒎𝟏

𝒎𝟐

× 𝟏𝟎𝟎

+ Xác định hàm lượng tro trung bình:

% 𝒕𝒓𝒐 𝒕𝒓𝒖𝒏𝒈 𝒃ì𝒏𝒉 = ∑ % 𝒕𝒓𝒐𝒏

𝟏

𝒏

Trong đó:

m1: khối lượng cốc sứ (g)

m2: khối lượng mẫu ban đầu (g)

m4: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hóa (g)

n: số lần xác định % tro




2.6. Khảo sát điều kiện chiết

2.6.1. Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi [3;4]

Mục đích: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng trực tiếp đến khối lượng cao thu được, vì vậy ta cần xác định được đối với 10g

mẫu đã xác định thì cần bao nhiêu ml cồn 96 để thu được khối lượng cao tốt nhất mà

vẫn tiết kiệm được dung môi.

Thực nghiệm:

- Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu 10g lá ngải cứu (đã được xử lí). Tiến hành mang mẫu đi

chiết soxhlet ở nhiệt độ 76C trong 7 giờ với các thể tích cồn tuyệt đối khác nhau: 250ml,

300ml, 350ml, 400ml.

- Dịch sau khi chiết sẽ được đem đi cô quay sau đó cân khối lượng cao thu được. Dựa

vào khối lượng cao thu được với mỗi thể tích dung môi khác nhau, cùng thời gian chiết

ta sẽ xác định được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nào là phù hợp nhất.

- Khối lượng cao được tính bằng cách cân bình cầu rỗng trước khi cô quay (m1) và khối

lượng bình cầu sau khi cô quay (m2). Sau đó ta lấy m2 – m1 sẽ ra khối lượng cao thu

được.

250ml 300ml 350ml 400ml

Sơ đồ 2. 2 Thực nghiệm khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

Mẫu lá ngải cứu

Cho vào túi lọc đã

may sẵn

Đem chiết với các thể

tích dung môi khác

nhau, thời gian 7 giờ

4 mẫu, mỗi mẫu

10g

Cô quay dịch chiết

vừa thu được

Ghi nhận kết quả và

đánh giá thể tích

dung môi phù hợp

Cân khối lượng

bình cầu trước và

sau khi cô quay




2.6.2. Khảo sát thời gian chiết

Mục đích: Thời gian chiết cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực

tiếp đến khối lượng cao thu được, vì vậy ta cần xác định được đối với 10g mẫu đã xác

định thì cần chiết trong bao nhiêu thời gian để thu được khối lượng cao nhiều nhất.

Thực nghiệm:

- Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10g lá ngải cứu (đã được xử lí). Tiến hành mang

mẫu đi chiết soxhlet với 250ml cồn tuyệt đối, nhiệt độ 76C ở thời gian khác nhau: 4

giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ.

- Dịch sau khi chiết sẽ được đem đi cô quay sau đó cân khối lượng cao thu được. Dựa vào

khối lượng cao thu được với mỗi thời gian chiết khác nhau, cùng thể tích dung môi ta

sẽ xác định được thời gian nào là tối ưu nhất.

- Khối lượng cao được tính bằng cách cân bình cầu rỗng trước khi cô quay (m1) và khối

lượng bình cầu sau khi cô quay (m2). Sau đó ta lấy m2 – m1 sẽ ra khối lượng cao thu

được.

4h 5h 6h 7h

Sơ đồ 2. 3 Thực nghiệm khảo sát thời gian chiết

Mẫu lá ngải cứu

Cho vào túi lọc đã

may sẵn

Đem chiết với thời

gian khác nhau

4 mẫu, mỗi mẫu

10g

Cô quay dịch chiết

vừa thu được

Ghi nhận kết quả

và đánh giá tời gian

tối ưu.

Cân khối lượng

bình cầu trước và

sau khi cô quay




2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết từ lá ngải cứu

Mục đích: Khảo sát được mẫu có thể bảo quản trong điều kiện nào là tốt nhất.

Thực nghiệm: Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối bảo quản trong các

điều kiện khác nhau: vừa mới chiết, để ở nhiệt độ phòng, để trong tủ lạnh.

2.8. Xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết lá ngải cứu bằng phương pháp

GC/MS

Dịch chiết lá ngải cứu được tiến hành cô quay nhằm thu hồi dung môi cho tới khi được chất

đặc (cao thô). Sau đó gửi mẫu đến: CHI CỤC KIỂM ĐỊNH HẢI QUAN 4, số 10, đường

Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.

2.9. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng

khuẩn [13], [24]

Chuẩn bị:

- Đĩa petri được rửa sạch sau đó được bọc giấy và đem sấy ở 120C trong 2 tiếng.

- Cắt giấy lọc có đường kính 6mm (15 đĩa), hấp ở 121ºC trong 15 phút, sấy ở 150oC trong

10 phút.

- Pha môi trường thạch MHA – aga - nước cất theo tỷ lệ 38g - 14g - 1000ml. Sau đó đun

sôi đến hơi đặc.

- Đem môi trường vừa pha đi đo và điều chỉnh độ PH 7.3 và mang đi hấp.

+ Dùng HCl 10% hoặc NaOH 10% để điều chỉnh pH.

+ Muốn kiểm tra độ pH, ta sử dụng máy đo pH vì nó nhạy và cho độ chính xác cao.

Nếu không có máy, ta có thể sử dụng giấy quỳ để đo pH nhưng không có độ chính xác

cao.

Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:

Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA,

đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn

được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong

môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Môi trường

trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.




Tiến hành thí nghiệm:

- Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến

hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1

đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch Aloin hoặc Cao đã được pha

theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã

cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml),

đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline

và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6:

Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).

- Sau đó đem nuôi ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24

giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn.

Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn: Đường kính vòng vô khuẩn (D

– d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy.

Hình 2. 6 Hình ảnh minh họa về xác định đường kính vòng vô khuẩn

Hình 2. 7 Mueller Hinton Agar - MHA




CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá ngải cứu

3.1.1. Độ ẩm

- Lá ngải cứu được tiến hành xác định độ ẩm. Số lượng mẫu được xác định là 3, độ ẩm

chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu.

- Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mỗi mẫu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3. 1 Bảng xác định độ ẩm trung bình lá ngải cứu

Stt m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%)

1 28,218 2,002 30,128 4,59

2 26,232 2,000 28,122 5,50

3 26,858 2,000 28,765 4.65

Độ ẩm trung bình 4,91

Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của lá ngải cứu là 4,91 %

Hình 3. 1 Hình ảnh mẫu sau khi được xác định độ ẩm

3.1.2. Hàm lượng tro

- Lấy 4 mẫu lá ngải cứu đã được xác định độ ẩm ở trên mang đi tro hóa ở nhiệt độ 550C.

Hàm lượng tro trung bình là hàm lượng tro chung của cả 3 mẫu trên.

- Kết quả xác định hàm lượng tro trung bình của mỗi mẫu được trình bày ở bảng 3.2




Bảng 3. 2 Hàm lượng tro trung bình lá ngải cứu

Stt m1 (g) m2 (g) m4 (g) tro (%)

1 28,218 2,002 28,511 14,64

2 26,232 2,000 26,425 9,65

3 26,858 2,000 27,045 9,35

Hàm lượng tro trung bình 11,21

Từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trung bình của lá ngải cứu là 11,21 %

Hình 3. 2 Hình ảnh mẫu sau khi được tro hóa

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện chiết lá ngải cứu

3.2.1. Tỉ lệ dung môi

Bảng 3. 3 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi

Stt Khối lượng

mẫu

Thể tích dung môi Thời gian

chiết

Khối lượng cao thu

được

1 10g 250ml 7 giờ 3,181g

2 10g 300ml 7 giờ 2,815g

3 10g 350ml 7 giờ 2,253g

4 10g 400ml 7 giờ 2,221g




Hình 3. 3 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi

Qua việc chiết với các tỷ lệ dung môi nhận thấy mẫu sau khi thu hồi đều có độ sánh

mịn và màu như nhau, ở thể tích 250ml lượng cao sau khi cô quay thu được nhiều hơn.Vì

vậy, nên chọn chiết tách trong 250ml để tiết kiệm được kinh phí.

3.2.2. Thời gian chiết

Bảng 3. 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết

Stt Khối

lượng mẫu

Thể tích dung

môi

Thời gian

chiết

Khối lượng cao thu

được

1 10g 250ml 4 giờ 0,95g

2 10g 250ml 5 giờ 1,57g

3 10g 250ml 6 giờ 2,21g

4 10g 250ml 7 giờ 3,19g

Hình 3. 4 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát thời gian chiết

0

1

2

3

4

250 300 350 400

0

1

2

3

4

4 5 6 7

ml

g

g

ml




Vậy thời gian chiết tốt nhất ở điều kiện khảo sát này là 7 giờ. Vì ở thời gian này khối

lượng cao thu được là nhiều nhất.

Kết luận: Với khối lượng mẫu là 10g ta sẽ chọn thể tích dung môi là 250ml và thời

gian chiết là 7 giờ.

Hình 3. 5 Cao chiết lá ngải cứu

3.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết lá ngải cứu

Bảng 3. 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mẫu

Mẫu Điều kiện bảo

quản

Hiện tượng

1 Mới chiết xong Mẫu bình thường

2 Để ở nhiệt độ

phòng

Mẫu hư sau 120 giờ (có mùi lạ)

3 Để trong tủ lạnh Mẫu được bảo quản tốt nhất, không bị hư hao.

Như vậy ta sẽ chọn bảo quản mẫu cao sau chiết ở trong tủ lạnh ngăn mát 5C để mẫu

được bảo quản tốt nhất.




3.4. Kết quả định danh các thành phần hóa học có trong dịch chiết cao ngải cứu bằng

phương pháp GC/MS

Hình 3. 6 Kết quả GC-MS cao chiết lá ngải cứu

Nhận xét: Từ phổ đồ hình 3.6, ta thấy có 25 cấu tử có thời gian lưu khác nhau, nhưng

phổ nền vẫn còn bị nhiễu khá nhiều chứng tỏ mẫu cao chiết chưa được tối ưu hoàn toàn.

Tuy vậy, sự nhiễu lại không cao nên không ảnh hưởng nhiều đến kết quả, nhất là các

cấu tử chiếm nhiều phần trăm.

- Dựa vào phổ đồ, ta có thể tính được hàm lượng của các chất theo công thức sau:

%𝐇 = 𝐬𝟏

𝐬 . 𝟏𝟎𝟎

Trong đó:

%H: hàm lượng % chất cần tính

s: diện tích chất cần tính




s1: diện tích tổng các peak

Bảng 3. 6 Kết quả GC-MS của cao lá ngải cứu

STT Thời

gian

lưu

(phút)

Hàm

lượng

(%)

Định danh Công thức

phân tử

Công thức cấu tạo

1 5.293 6.13 Nonane C9H20

2

6.686

3.47

Heptane

C12H26

3

7.71

2.48

Tetradecane,

2,6,10-

trimethyl

C17H36

4

8.40

0.45

Octadecane,

3-ethyl-5-(2-

ethylbutyl)-

C26H54

5

9.148

5.85

Bicyclo[2.2.

1]heptan-2-

one, 1,7,7-

trimethyl

C10H16O




6

9.375

4.52

Benzene, 1-

methyl-2-

nitro

C7H7NO2

7

9.46

1.85

Borneol

C10H28O

8

11.63

0.78

Cyclopropan

etetradecano

ic acid, 2-

octyl-,

methyl ester

C26H50O2

9

13.049

1.63

Caryophylle

ne

C15H24

10

13.271

7.56

2H-1-

Benzopyran-

2-one

C9H6O2

11

14.578

43.44

Dodecanoic

acid

C12H24O2




12

17.813

9.30

Phytol

C20H40O

13

18.393

2.48

5-

Nonadecen-

1-ol

C19H38O

14

19.574

2.86

n-

Hexadecano

ic acid

C16H32O2

15

22.385

7.2

Oleic Acid

C18H34O2

Nhận xét:

Dựa theo phổ đồ và kết quả định danh GC-MS các chất có trong cao chiết lá ngải cứu,

ta có thể thấy được:

- 15 cấu tử đã được định danh trong số 25 cấu tử và chiếm phần trăm cao nhất là

Dodecanoic acid (C12H24O2) với 43.44%. Chất này còn có tên gọi khác là Acid lauric là

loại acid béo bão hòa, có lợi cho sức khỏe, được sử dụng nhiều trong các sản phẩm làm

đẹp, dầu gội đầu. Loại acid này có đuôi hydrocacbon không phân cực và phân cực một

vùng đầu cực của acid cacbonxylic, giúp tương tác với dung môi phân cực và chất béo,

cho phép nước hòa tan được chất béo.

- Ngoài ra còn xác định được các hoạt chất tinh dầu là Borneol (C10H28O), Caryophyllene

(C15H24) cùng các thành phần hóa học khác (bảng 3.6).

- So sánh kết quả GC – MS về thành phần hóa học trong cao lá ngải cứu tại thành phố

Vũng Tàu & Thành phố Đà Nẵng cho ta thấy được trong thành phần lá ngải cứu của cả

hai nơi đều có Borneol. Nhưng chất chiếm phần trăm nhiều nhất tại Tỉnh Bà Rịa –

Vũng Tàu là Dodecanoic acid với 43,44%, còn ở Thành phố Đà Nẵng thì Naphtho[1,2

- b]furan - 2,6(3H,4H) -dione, 3a,5,5a,9,9a,9b - hexahydro - 9 - hydroxy -3,5a,9 -




trimethyl – chiếm 5,19 %. Như vậy, ta có thể thấy được ngải cứu được trồng ở mỗi

vùng khác nhau có sự khác biệt về thành phần hóa học.

3.5 Kết quả thăm dò hoạt tính sinh học của cao lá ngải cứu

Bảng 3. 7 Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao ngải cứu

Chủng vi

khuẩn

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

1600

mg/m

l

800

mg/m

l

400

mg/m

l

200

mg/m

l

Tetracycli

n 30 µg

Ampicilli

n 10 µg.

DMS

O 5%

Staphylococcu

s aureus

- - - - - - -

Escherichia

coli

- - - - - - -

Salmonella

typhi

- - - - - - -

Bacilus

cereus

- - - - - - -

Pseudomonas

aeruginosa

- - - - - - -

Hình 3. 7 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Bacilus cereus




Hình 3. 8 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Escherichia coli

Hình 3. 9 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng Salmonella Spp

Hình 3. 10 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng

Staphylococcus aureus




Hình 3. 11 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng

Pseudomonas aeruginosa

Như vậy ta có thể thấy được việc khảo sát hoạt tính sinh học của cao lá ngải cứu trên

địa bàn tình Bà Rịa – Vũng Tàu mang lại kết quả chưa khả quan và cần được thực

nghiệm thêm để cho ra kết quả tốt nhất.




CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ kết quả nghiên cứu cao lá ngải cứu tôi rút ra được một số kết luận sau:

a/ Qua quá trình thực nghiệm, xây dựng quá trình thu cao ngải cứu bằng phương

pháp chiết soxhlet và cô quay chân không nhằm thu được cao lá ngải cứu phù hợp với

điều kiện nhất:

- Dung môi : cồn 96

- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/25

- Thời gian chiết tối ưu: 7 giờ

- Độ ẩm trung bình: 4,91 %

- Hàm lượng tro trung bình: 11,21 %

b/ Màu sắc cao ngải cứu sau khi thu được: xanh lục đậm, sánh đặc, mịn và hơi

dính đúng với đặc đính của cao, có mùi hương đặc trưng của ngải cứu tuy vậy lại

dễ chịu và không quá nồng.

c/ Bằng phương pháp sắc ký khối phổ (GC/MS) xác định được có 15 cấu tử chính

trong cao, thành phần chính là Dodecanoic acid (C12H24O2) với 43.44%.

d/ Thử hoạt tính sinh học của cao lá ngải cứu trên 5 chủng vi khuẩn cho ra kết

quả không kháng được khuẩn. Nên cần được khảo sát lại đối với các giống ngải

cứu ở những địa bàn khác và tối ưu hóa mẫu cao hơn nữa.

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục chiết khảo sát thêm sự khác biệt giữa mùi hương, thành phần hóa học

của ngải cứu ở nhiều địa bàn khác nhau.

- Tìm hiểu về quá trình làm sạch, tối ưu hóa cao lá ngải cứu.

- Khảo sát sâu hơn về thử nghiệm hoạt tính sinh học để ứng dụng làm hoạt chất

trong công nghệ hóa dược.




TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống

một số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.

[2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và các tác giả (2004), Cây

thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

[3] Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1996), Cơ sở lý thuyết hóa

học phân tích, Dùng cho sinh viên ngành hóa các trường đại học, In lần thứ 3, Nhà xuất

bản giáo dục.

[4] Nguyễn Tinh Dung (2002), Các phương pháp định lượng hóa học (Phần 3), NXB

Giáo dục, trang 62.

[5] Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học quốc

gia TP. Hồ Chí Minh.

[6] Trần Tứ Hiếu (2001), Hoá học phân tích, NXB Đại học quốc gia Hà Nội.

[7] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ.

[8] Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học tập II, NXB Y học, Hà Nội.

[9] Đỗ Tất Lợi (1968 – 1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội, , trang 36,37.

[10] Hồ Viết Quý (1998), Các phương pháp phân tích hiện đại và ứng dụng trong hóa

học, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội.

[11] Hoàng Thị Sản (2003), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội.

[12] Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu tập I, NXB Y học, Hà Nội.

[13] Tài liệu thí nghiệm hóa dược tại Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu.

Tiếng Anh

[14] Sang-Jun Lee, Ha-Yull Chung, In-Kyung Lee, Seung-Uk Oh, Ick-Dong Yoo

(2000), Pharmaceutical & Health Research Institute, Pacific Coporation/ R&D Center,

Department of Food Science & Technology, Hankyong National University, Korea

Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Phenolics with Inhibitory Activity

on Mouse Brain Monoamine Oxidase (MAO) from Whole Parts of Artemisia vulgaris

L (Mugwort). 50




[15] Lee, S.J, Chung, H.Y, Lee, I.K, and Yoo, I.D (1999), Isolation and identification

of flavonoids from ethanol extracts of Artemisia vulgaris and their antioxidant activity,

Korean J. Food Sci. Technolol. 31: 815-822

[16] Lee, S.J., Chung, H.Y., Maier, C.G.A., Wood, A.R., Dixon, R and Mabry, T.J.

(1998), Estrogenic flavonoids from Artemisia vulgaris L., J. of Agric. Food Chem. 46:

3325-3329

[17] Harborne, J.B. (1994), The Flavonoids adevances in research, published by

Chapman & Hall, 2-6 Boundary Row, London, SE18HN, UK

Trang web

[18] https://opcpharma.com/vuon-duoc-lieu/ngai-cuu.html

[19] Xemtailieu-nghien-cuu-chiet-tach-xac-dinh-thanh-phan-hoa-hoc-trong-dich-

chiet-la-ngai-cuu-o-quan-cam-le-thanh-pho-da-nang.pdf

[20] http://www.afamily.vn/suc-khoe/2008102102181925/Mon-an-bai-thuoc-tucay-

ngai-cuu.chn

[21] http://www.phununet.com/WikiPhununet

[22].https://www.researchgate.net/profile/Trinh_Phan_Canh/publication/325100232_S

creening_of_medicinal_herbs_in_Asteraceae_for_antimicrobial_and_antioxidant_acti

vities/links/5af641e4a6fdcc0c030c62ea/Screening-of-medicinal-herbs-in-Asteraceae-

for-antimicrobial-and-antioxidant-activities.pdf

[23].http://kkhtn.duytan.edu.vn/uploads/97f57192-aa16-4b61-9275-

60426110db44_congnghechiettachbangphuongphapco2otrangthaisieutoihan.pdf

[24] https://tailieu.vn/doc/bai-so-3-chuan-bi-moi-truong-nuoi-cay-vi-sinh-vat-i-muc-

972153.html

[25] http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danh-gia-

hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html

https://opcpharma.com/vuon-duoc-lieu/ngai-cuu.html

http://www.phununet.com/WikiPhununet

https://www.researchgate.net/profile/Trinh_Phan_Canh/publication/325100232_Screening_of_medicinal_herbs_in_Asteraceae_for_antimicrobial_and_antioxidant_activities/links/5af641e4a6fdcc0c030c62ea/Screening-of-medicinal-herbs-in-Asteraceae-for-antimicrobial-and-antioxidant-activities.pdf




http://kkhtn.duytan.edu.vn/uploads/97f57192-aa16-4b61-9275-60426110db44_congnghechiettachbangphuongphapco2otrangthaisieutoihan.pdf

http://kkhtn.duytan.edu.vn/uploads/97f57192-aa16-4b61-9275-60426110db44_congnghechiettachbangphuongphapco2otrangthaisieutoihan.pdf

https://tailieu.vn/doc/bai-so-3-chuan-bi-moi-truong-nuoi-cay-vi-sinh-vat-i-muc-972153.html

https://tailieu.vn/doc/bai-so-3-chuan-bi-moi-truong-nuoi-cay-vi-sinh-vat-i-muc-972153.html

http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danh-gia-hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html

http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danh-gia-hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html




PHỤ LỤC

1. Bài làm thực nghiệm tại trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu

Hình ảnh phổ GC-MS

2. Lê Thị Kim Hậu, trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng. Đề tài “Nghiên cứu

chiết tách, xác định thành phần hóa học trong dịch chiết lá ngải cứu ở quận

Cẩm Lệ, thành phố Đà Nẵng”




Hình ảnh phổ GC - MS

Bảng định danh các thành phần có trong cao chiết lá ngải cứu

Stt Thời

gian

lưu

Định danh CTCT Hàm

lượn

g (%)

1 6,846 Azulene

0,43

2 7,380 4-methoxy-6-methyl6,7-

dihydro-4Hfuro[3,2-

c]pyran

0,38




3 7,737 4H-pyran-4-one, 2,3-

dihydro-3,5- dihydroxy-6-

methyl

1,59

4 8,087 Borneol

2,47

5 8,924 furancarboxaldehyde , 5-

(hydroxymethy)-

2,76

6 10,61

5

3 - methylenecyclohexene

0,47

7 15,70

4

Scopoletine

0,09

8 16,62

2

Cyclohexane, 1 - ethenyl -

1 -methyl -2,4 -bis(1 -

methylethenyl) -

0,46

9 17,79

4

Tricine

1,36




10 19,16

7

1H -indole - 3 -

carbaldehyde, 1,5 -

dimethyl -

0,52

11 20,40

2

Naphtho[1,2 - b]furan -

2,6(3H,4H) -dione,

3a,5,5a,9,9a,9b -

hexahydro - 9 - hydroxy -

3,5a,9 - trimethyl -

5,19

12 20,80

1

Propanenitrile, 3 -[1 - (3 -

diethylaminopropyny l) -

1 -cyclohexyloxy] -

2,43

13 21,02

8

Azuleno[6,5 -b] furan -2,5

-dione, decahydro -4a, 8 -

dimethyl - 3 - methylene -

, [3aR -(3a.alpha.,

4a.beta., 7a.alpha.,

8.beta., 9a.alpha.)]-

14 25,35

3

Jaceocidine

0,12

15 29,47

4

Eupafoline

0,01

Documents

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH …lib.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19848/1/Le-Bao-Quynh...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA –