ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU

(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)

VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU

(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)

VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hƣớng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với

GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa và TS. Nguyễn Thị Hồng Loan đã tận tình hƣớng dẫn,

đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và

thực hiện luận văn này. Tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều ở thầy, cô từ kiến thức,

phƣơng pháp nghiên cứu khoa học cũng nhƣ cách xử lý công việc.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo của Khoa

Sinh học cũng nhƣ các thầy, cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa

Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức

nền tảng bổ ích.

Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh

viên Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và

Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt

nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, ông bà và những ngƣời thân trong

gia đình đã luôn dành tình cảm và động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập.

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn

thành luận văn.

Luận văn đƣợc thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí của đề tài độc

lập cấp Nhà nƣớc mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/02.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Hồng Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 ............... 3

1.1.1. Giới thiệu chung về HIV ......................................................................... 3

1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 ............................................ 4

1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1..................................................... 8

1.2. CÁC CHẤT ỨC CH PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG

ĐIỀU TRỊ AIDS ................................................................................... 11

1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học .............................. 12

1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên ............................. 14

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23

2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................... 23

2.1.1. Mẫu dƣợc liệu ....................................................................................... 23

2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ............................................................. 23

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ ..................................................... 23

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 24

2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật ....................................... 24

2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách ........................................... 24

2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán

trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin ........................................... 25

2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến .... 26

2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu .. 26

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 28

3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CH PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH

CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM

GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.) ............ 28

3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây

Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ........................................ 28

3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Ổi

(Psidium guajava L.) ............................................................................. 30

3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân

cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) .................................................. 32

3.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CH PROTEASE

HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHI T LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM

GUAJAVA L.) ....................................................................................... 33

3.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease

HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi ..................................................................... 34

3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1

của hợp chất LO-I.................................................................................. 37

3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I ........................................................... 39

3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC ............ 40

3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic ................... 40

3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic .................................... 41

3.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic ............................................. 43

K T LUẬN ............................................................................................................... 46

KI N NGHỊ .............................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 48

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

(Acquired Immunodeffiency Syndrome)

ART

CBB

Liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus ( Antiretroviral Treatment)

Coomassie brilliant blue

DABCYL 4 - [4 '- (dimetylamino) phenyl] azo acid -benzoic

DEPT Detortionless enhancement by polarization transfer

DMSO Dimethyl sulphoxide

EDANS 5 - [(2'aminoethyl) -amino] acid naphtalenesulfonic

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ

(Food and Drug Administration)

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời

(Human Immunodeficiency Virus)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High-Performance Liquid Chromatography)

IC Nồng độ ức chế (Inhibitory Concentration)

kDa kilo Dalton

MS Phƣơng pháp khối phổ (Mass spectrometry)

NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

13C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

1H-NMR Phổ cộng hƣởng từ proton

PI Chất ức chế protease (Protease Inhibitor)

SDS -PAGE Điện di gel polyacrylamide có SDS (Sodium Dodecyl Sulfate

Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

TMS Tetramethyl silan

UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hợp quốc (United Nations

Programme on HIV/AIDS)

UPLC Sắc kí lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol ..... 9

Bảng 1.2. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các triterpen .................................. 18

Bảng 2.1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo đƣờng kính

vòng phân giải ........................................................................................................... 25

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sử dụng cơ chất

peptide đặc hiệu L6525 ............................................................................................. 27

Bảng 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Thạch châu .................. 30

Bảng 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi .................................. 31

Bảng 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ thân Ma hoàng ................. 33

Bảng 3.4. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn từ cao Hx lá cây Ổi ............. 35

Bảng 3.5. Khả năng ức chế pepsin của hợp chất LO-I từ lá cây Ổi ......................... 38

Bảng 3.6. Sự thay đổi Km và Vmax của protease HIV-1 khi có và không có acid ursolic ... 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc dạng dimer (A) và cấu trúc chi tiết (B) của protease HIV-1 .............. 5

Hình 1.2. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol ...................... 7

Hình 1.3. Nguyên tắc hoạt động cơ chất huỳnh quang của protease HIV-1 .................. 11

Hình 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Thạch châu ......................... 29

Hình 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi ................................. 31

Hình 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ cây Ma hoàng ......................... 32

Hình 3.4. Sắc ký đồ SKLM định tính các phân đoạn của dịch chiết lá cây Ổi .............. 34

Hình 3.5. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của lá Ổi ... 35

Hình 3.6. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của dịch chiết phân đoạn PĐ2 ................... 36

Hình 3.7. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn PĐ2 ..................................................... 37

Hình 3.8. Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi ...... 37

Hình 3.9. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1 khi có và không có LO-I ..... 39

Hình 3.10. Công thức cấu tạo hợp chất acid ursolic (LO-I) ............................................ 40

Hình 3.11. Hoạt tính ức chế của acid ursolic với protease HIV-1 (A) và pepsin (B) .... 41

Hình 3.12. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng phân giải cơ chất của protease HIV-1

vào nồng độ cơ chất trong điều kiện có và không có chất ức chế theo phƣơng trình

Lineweaver Burk ................................................................................................................ 42

Hình 3.13. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dạng chế phẩm acid ursolic ........ 45

1

MỞ ĐẦU

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm

miễn dịch ở ngƣời (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type chính là

HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra

AIDS ở ngƣời. Cho đến nay, dù đã có những chƣơng trình hành động toàn cầu cùng

với sự phát triển của các phƣơng pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại

và cần thiết phải tăng cƣờng các biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu quả.

Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó khăn

và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thƣờng xuyên xảy ra đột biến

ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Vì vậy, cho đến hiện nay, ngƣời nhiễm HIV-1

muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là sử dụng liệu pháp dùng thuốc

kháng retrovirus (ART) [39].

Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt

các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng

trong quá trình trƣởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây

đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhƣng không

đƣợc đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng

xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [26]. Vì vậy, một số chất ức chế protease HIV-1 (PI)

đã đƣợc phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, việc sử

dụng thuốc trong thời gian dài với nồng độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của

HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những

nguyên nhân chính gây thất bại điều trị với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn

nữa, việc thiết kế các chất PI mới không phải dễ dàng, không định hƣớng, phải sàng

lọc trên số lƣợng khá lớn các hợp chất thiết kế tƣơng tự nhau trên cơ sở hiểu biết về

cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Mặt khác, những chất này nhiều khi

không thân thiện với con ngƣời, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm. Chính vì vậy,

bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học trên thế giới cũng không

ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức

chế protease của HIV-1 (protease HIV-1).

2

Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc có

giá trị lớn với sức khỏe con ngƣời. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam

có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc

trong y học dân gian và y học cổ truyền. Nhƣ vậy, thực vật Việt Nam cũng s là

nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế

protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân

HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chƣa khai thác nguồn tài nguyên

phong phú của đất nƣớc theo hƣớng này.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch

châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra

distachya)” nhằm thu nhận đƣợc chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ

dƣợc liệu Việt Nam.

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Trần Thị Chung Chiến (2012), Nghiên cứu một số chế phẩm hỗ trợ điều trị

HIV/AIDS từ dược liệu, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp nhà

nƣớc, Bộ Khoa học và Công Nghệ - Bộ Quốc Phòng.

2. Nguyễn Văn Dũng, Lƣơng Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị

Phƣơng, Phƣơng Thiện Thƣơng, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phƣơng Thuận (2015),

“Hoạt tính ức chế Pepsin và Protease HIV-1 của các dịch chiết và hoạt chất

Acid maslinic từ dƣợc liệu”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN. 31(2), tr. 18-27.

3. Đỗ Thế Lộc, Phạm Viết Dự (2012), “Đánh giá tác dụng bài thuốc y học cổ

truyền MD 07 trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân HIV/AIDS”. Tạp chí Y Dược

học cổ truyền Quân sự, 1, tr. 1-8.

4. Trần Thanh Lƣơng, Lê Vũ Thanh Hà, Pham Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị

Thanh Thuý, Hồ Thị Thu Hồng (2007), “Khảo sát thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của tinh dầu lá ổi xá lị (Psidium guajava L.)”, Tạp chí

Dược liệu, 12, tr. 92.

5. Lã Đình Mỡi, Đái Duy Ban (2007),“Một số kết quả nghiên cứu điều tra các thảo

dƣợc Việt Nam có hoạt tính chống virus HIV và tăng cƣờng miễn dịch”, Tạp

chí Y dược học Việt Nam, 4, tr. 19.

6. Đỗ Thị Phƣơng, Lại Lan Phƣơng (2006), “Đánh giá bƣớc đầu sử dụng của

thuốc BSP1 trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS”, Tạp chí Dược

học, 4, tr. 19.

7. Đỗ Thị Phƣơng, Lê Thị Minh Phƣơng (2010), “Đánh giá tác dụng của viêm

nang Brishamin trong điều trị hỗ trợ bệnh nhân HIV/AIDS”, Tạp chí Nghiên

cứu Y học, 1, tr. 90-97.

8. Đinh Gia Thiện, Trần Văn Chiến, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trần Văn Sung

(2011), “Nghiên cứu thành phần hoá học lá cây Sơn Trà Poilane (Eriobotrya

poilanei J.E. VID. họ Hoa Hồng (Rosaceae)”, Tạp chí Hoá học, 49(2), tr. 223.

49

Tài liệu tiếng Anh

9. Alastair J. J., Wood M. D. (1998), “HIV-Protease Inhibitors”, The New England

Journal of Medicine, 338(18), pp. 1281-1293.

10. Ali A., Bandaranayake R. M., Cai Y., King N. M., Kolli M., Mittal S.,

Murzycki J. F., Nalam M. N., Nalivaika E. A., Ozen A. (2010), “Molecular

basis for drug resistance in HIV-1 protease”, Viruses, 2(11), pp. 2509-2535.

11. Babalola I. T., Shode F. O. (2013), “Ubiquitous ursolic acid: A potential

pentacyclic triterpen natural product”, Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry, 2(2), pp. 214.

12. Belding R. D., Blankenship S. M., Young E. (1998), “Composition and

variability of epicuticular waxes in apple cultivars”, Journal of the American

Society for Horticultural Science, 123(3), pp. 348-356.

13. Billich S., Knoop M. T., Hansen J., Strop P., Sedlacek J., Mertz R., Moelling K.

(1988), “Synthetic Peptides as Substrates and Inhibitors of Human Immune

Deficiency Virus- 1 Protease”, The Journal of Biological Chemistry,

263(34), pp. 17905-17908.

14. Blanco R., Carrasco L., Ventoso I. (2003), “Cell killing by HIV-1 protease”,

The Journal of Biological Chemistry, 278(2), pp. 1086-1093.

15. Blundell T., Pearl L. A. (1989), “Retroviral proteinases. A second front against

AIDS”, Nature, 337(6208), pp. 596-597.

16. Brik A., Wong C. H. (2003), “HIV-1 protease: mechanism and drug discovery”,

Organic & Biomolecular Chemistry, 1(1), pp. 5-14.

17. Buckheit R. W. Jr., Russell J. D., Xu Z. Q., Flavin M. (2000), “Anti-HIV-1

activity of calanolides used in combination with other mechanistically

diverse inhibitors of HIV-1 replication”, Antiviral Chemistry and

Chemotherapy, 11(5), pp. 321-327.

18. Cheenpracha S., Karalai C., Ponglimanont C., Subhadhirasakul S., Tewtrakul S.

(2006), “Anti-HIV-1 protease activity of compounds from Boesenbergia

pandurata”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14(6), pp. 1710-1714.

50

19. Chen S. X., Wan M., Loh B. N. (1996), “Mangosteen demonstrates potent

inhibitory activity against HIV-1”, Planta Medica Journal, 62(4), pp. 381-382.

20. Chen M., Kilgore N., Lee K. H., Chen D. F. (2006), “Rubrisandrins A and B,

lignans and related anti-HIV compounds from Schisandra rubriflora”,

Journal of Natural Products, 69(12), pp. 1697-1701.

21. Chen H., Xu Z., Yin X., Cen P. (2007), “Cloning and expression of the HIV

protease in Escherichia coli cell-free system”, Applied Microbiology and

Biotechnology, 77(2), pp. 347-354.

22. Choudhury S., Everitt L., Pettit S. C., Kaplan A. H. (2003), “Mutagenesis of the

dimer interface residues of tethered and untethered HIV-1 protease result in

differential activity and suggest multiple mechanisms of

compensation”, Virology, 307(2), pp. 204-212.

23. Chu Q. C., Tian X. H., Lin M., Ye J. N. (2006), “Electromigration profiles of

Cynomorium songaricum based on capillary electrophoresis with

amperometric detection”, Journal of Agricultural and Food Chemistry,

54(21), pp. 7979-7983.

24. Dao T. T., Le T. V., Nguyen P. H., Thuong P. T., Minh P. T., Woo E. R., Lee

K. Y., Oh W. K. (2010a), “SIRT1 Inhibitory diterpenoids from the

Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, Planta Medica Journal,

76(10), pp. 1011-1014.

25. Dao T. T., Tung B. T., Nguyen P. H., Thuong P. T., Yoo S. S., Kim E. H., Kim

S. K., Oh W. K. (2010b), “C-methylated flavonoids from Cleistocalyx

operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1)

neuraminidase”, Journal of Natural Products, 73(10), pp. 1636-1642.

26. Darke P. L., Leu C. T., Davis L. J., Heimbach J. C., Diehl R. E., Hill W. S.,

Dixon R. A. F., Siga I. S. (1989), “Human immunodeficiency virus protease

bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”,

The Journal of Biological Chemistry, 264(4), pp. 2307-2312.

51

27. Das A., Prashar V., Mahale S., Serre L., Ferrer J. L., Hosur M. V. (2006),

“Crystal structure of HIV-1 protease in situ product complex and observation

of a low-barrier hydrogen bond between caralytic aspartates”, Proceedings of

the National Academy of Sciences, 103(49), pp. 18464-18469.

28. EL Dine R. S., El Halawany A. M., Nakamura N., Ma C. M., Hattori M. (2008),

“New lanostane triterpen lactones from the Vietnamese mushroom

Ganoderma colossum (FR.) C. F. BAKER”, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 56(5), pp. 642-646.

29. EL Dine R. S., El Halawany A. M., Ma C. M., Hattori M. (2008), “Anti-HIV-1

protease activity of Lanostane triterpens from the Vietnamese mushroom

Ganoderma colossum”, Journal of Natural Products, 71(6), pp. 1022-1026.

30. EL Dine R. S., El Halawany A. M., Ma C. M., Hattori M. (2009), “Inhibition

of the dimerization and the active site of HIV-1 protease by secondary

metabolites from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum”,

Journal of Natural Products, 72(11), pp. 2019-2023.

31. Emini E. A., Schleif W. A., Deutsch P., Condra J. H. (1996), “In vivo resistance

of HIV-1 variants with reduced susceptibility to the protease inhibitor L-735,

524 and related compounds”, Advances in Experimental Medicine and

Biology, 394, pp. 327-331.

32. Fun A., Wensing A. M., Verheyen J., Nijhuis M. (2012), “Human

Immunodeficiency Virus gag and protease: partners in resistance”,

Retrovirology, 9, pp. 9-63.

33. Gao X. M., Pu J. X., Huang S. X., Yang L. M., Huang H., Xiao W. L., Zheng

Y. T., Sun H. D. (2008),” Lignans from Kadsura angustifolia”, Journal of

Asian Natural Products Research, 1(2), pp. 125-131.

34. Gutiérrez O. A., Salas E., Hernández Y., Lissi E. A., Castrillo G., Reyes O., Garay

H., Aguilar A., García B., Otero A., Chavez M. A., Duarte C. A. (2002), “An

immunoenzymatic solid-phase assay for quantitative determination of HIV-1

protease activity”, Analytical Biochemistry, 307(1), pp. 18-24.

52

35. Han B., Peng Z. (2014), “Anti-HIV triterpenoid components”, Journal of

Chemical and Pharmaceutical Research, 6(4), pp. 438-443.

36. Hinay Jr. A. A., Sarol L. D. (2014), “Screening of Mentha cordifolia Opiz (Yerba

Buena) buffer crude extract for aspartyl protease pepsin inhibitory activity”,

International Journal of Research in Phytochemistry, 3(1), pp. 28-39.

37. Heal J. W., Jimenez-Roldan J. E., Wells S. A., Freedman R. B., Römer R. A.

(2011), “Inhibition of HIV-1 protease: the rigidity perspective”,

Bioinformatics, 28(3), pp. 350-357.

38. Hattori M., Ma C. M., Wei Y., El Dine R. S., Sato N. (2013), “Survey of Anti-HIV

and Anti-HCV Compounds from Natural Sources”, Canadian Chemical

Transactions, 1(2), pp. 116-140.

39. Hoffmann C., Rockstroh J. K., Kamps B. S. (2007), HIV Medicine 2007, 15th

Edition.

40. Hou T., McLaughlin W. A., Wang W. (2007), “Evaluating the potency of HIV-

1 protease drugs to combat resistance”, Proteins, 71(3), pp. 1163 - 1174.

41. Ibragic S., Sofić E. (2015), “Chemical composition of various Ephedra

species”, Bosnian journal of basic medical sciences, 15(3), pp. 21-27.

42. Ido E., Han H. P., Kezdy F. J., Tang J. (1991), “Kinetic studies of human

immunodeficiency virus type 1 protease and its active-site hydrogen bond

mutant A28S”, The Journal of Biological Chemistry, 266(36), pp. 24359-24366.

43. Ingr M., Uhlíková T., Strísovský K., Majerová E., Konvalinka J. (2003),

“Kinetics of the dimerization of retroviral proteases: The “fireman’s grip”

and dimerization”, Protein Science, 12(10), pp. 2173-2182.

44. Iyidogan P., Anderson K. S. (2014), “Current Perspectives on HIV-1

Antiretroviral Drug Resistance”, Viruses, 6(10), pp. 4095-4139.

45. Jacobsen H., Yasargil K., Winslow D. L., Craig J. C., Kröhn A., Duncan I. B.,

Mous J. (1995), “Characterization of human immunodeficiency virus type 1

mutants with decreased sensitivity to proteinase inhibitor Ro 31-8959”,

Virology, 206(1), pp. 527-534.

53

46. Jiang Z. H., Tanaka T., Sakamoto M., Jiang T., Kouno I. (2001), “Studies on a

medicinal parasitic plant: Lignans from the stems of Cynomorium

songaricum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49(8), pp. 1036-1038.

47. Kaldor S. W., Kalish V. J., Davies J. F., Shetty B. V., Fritz J. E., Appelt K.,

Burgess J. A., Campanale K. M., Chirgadze N. Y., Clawson D. K., Dressman

B. A., Hatch S. D., Khalil D. A., Kosa M. B., Lubbehusen P. P., Muesing M.

A., Patick A. K., Reich S. H., Su K. S., Tatlock J. H. (1997), “Viracept

(nelfinavir mesylate, AG1343): a potent, orally bioavailable inhibitor of

HIV-1 protease”, Journal of Medicinal Chemistry, 40(24), pp. 3979-3985.

48. Kim M. H., Kim J. N., Han S. N., Kim H. K. (2015), “Ursolic acid isolated

from guava leaves inhibits inflammatory mediators and reactive oxygen

species in LPS-stimulated macrophages”, Immunopharmacology and

Immunotoxicology, 37(3), pp. 228-235.

49. King N. M., Melnick L., Prabu-Jeyabalan M., Nalivaika E. A., Yang S. S.,

Gao Y., Nie X., Zepp C., Heefner D. L., Schiffer C. A. (2000),“Lack of

synergy for inhibitors targeting a multi-drug-resistant HIV-1 protease”,

Protein Science, 11(2), pp. 418-29.

50. Konoshima T., Yasuda I., Kashiwada Y., Cosentino L. M., Lee K. H. (1995),

“Anti-AIDS agents, 21. Triterpenoid saponins as anti-HIV principles from

fruits of Gleditsia japonica and Gymnocladus chinensis, and a structure-

activity correlation”, Journal of Natural Products, 58(9), pp. 1372-1377.

51. Kuroda M. J., El-Farrash M. A., Cloudhury S., Harada S. (1995), “Impaired

infectivity of HIV-1 after a single point mutation in the pol gene to escape

the effect of a protease inhibitor in vitro”, Virology, 210(1), pp. 212-216.

52. Lozano-Mena G., Sánchez-Gonzalez M., Juan M. E., Planas J. M. (2014),

“Maslinic Acid, a Natural Phytoalexin-Type Triterpen from Olives - A

Promising Nutraceutical?”, Molecules, 19(8), pp. 11538-11559.

53. Ma C. M., Nakamura N., Miyashiro H., Hattori M., Shimotohno K. (1999),

“Inhibitory effects of constituents from Cynomorium songaricum and

54

related triterpen derivatives on HIV-1 protease”, Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 47(2), pp. 141-145.

54. Mekkawy E. S., Meselhy M. R., Nakamura N. (1998), “Anti-HIV-1 and anti-

HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum”, Phytochemistry,

49(6), pp. 1651-1657.

55. Mishra T., Shrivastav P. S. (2014), “Validation of Simultaneous Quantitative

Method of HIV Protease Inhibitors Atazanavir, Darunavir and Ritonavir in

Human Plasma by UPLC-MS/MS”, The Scientific World Journal, 2014(3),

pp. 1-12.

56. Nguyen T. H. L., Phan T. N. (2012), “Some new inhibitors of protease of

human immunodefficiency virus type 1 (HIV-1)”, VNU Journal of Science,

28, pp. 156.

57. Novotý L., Vachálková A., Bigg D. (2000), “Ursolic acid: An anti-tumorigenic

and chemopreventive activity”, Neoplasma, 48(4), pp. 241-246.

58. Otake T., Mori H., Morimoto M., Ueba N., Sutardjo S., Kusumoto I. T.,

Hattori M., Namba T. (1995), “Screening of Indonesian plant extracts for

anti-human immunodeficiency virus - type 1 (HIV-1) activity”,

Phytotherapy Research, 9(1), pp. 6-10.

59. Partaledis J. A., Yamaguchi K., Tisdale M., Blair E. E., Falcione C., Maschera B.,

Myers R. E., Pazhanisamy S., Futer O., Cullinan A. B., Stuver C. M., Byrn R.

A., Livingston D. J. (1995), “In vitro selection and characterization of human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolates with reduced sensitivity to

hydroxyethylamino sulfonamide inhibitors of HIV-1 aspartyl protease”,

Virology, 69(9), pp. 5228-5235.

60. Patick A. K., Boritzki T. J., Bloom L. A. (1997), “Activities of the human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease inhibitor nelfinavir

mesylate in combination with reverse transcriptase and protease inhibitors

against acute HIV-1 infection in vitro”, Antimicrobial agents and

chemotherapy, 41(10), pp. 2159-2164.

55

61. Pengsuparp T., Cai L., Constant H., Fong H. H., Lin L. Z., Kinghorn A. D.,

Pezzuto J. M., Cordell G. A., Ingolfsdóttir K., Wagner H. (1995),

“Mechanistic evaluation of new plant-derived compounds that inhibit HIV-1

reverse transcriptase”, Journal of Natural Products, 58(7), pp. 1024-1031.

62. Rege A., Chowdhary A. (2014), “Evaluation of Ocimum sanctum and Tinospora

cordifolia as Probable HIV-Protease Inhibitors”, International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review and Research, 25(1), pp. 315-318.

63. Rege A., Dahake R., Roy S., Chowdhary A. (2015), “Screening of Natural

Products for Anti HIV Potential: An In vitro Approach”, Journal of Virology

and Current Research, 1(2), pp. 1-7.

64. Richards A. D., Phylip L. H., Farmerie W. G., Scarborough P. E., Alvares A.,

Dunn B. M., Hirel H., Konvalinka J., Strop P., Pavlickova L., Kostla J., Kay

V. (1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV-1 proteinase”,

The Journal of Biological Chemistry, 265(14), pp. 7733-7736.

65. Roberts N. A., Martin J. A., Kinchington D., Broadhurst A. V., Craig J. C.,

Duncan I. B., Galpin S. A., Handa B. K., Kay J., Kröhn A., Lambert R. W.,

Merett J. H., Mills J. S., Parkes K. E. B., Redshaw S., Ritchie A. J., Taylor

D. L., Thomas G. J., Machin P. J. (1990), “Rational design of peptide-based

HIV proteinase inhibitors”, Science, 248(4953), pp. 358-361.

66. Sato N., Ma C. M., Komatsu K., Hattori M. (2009), “Triterpen-farnesyl

hydroquinone conjugates from Ganoderma sinense”, Journal of Natural

Products, 72(5), pp. 958-961.

67. Sato N., Zhang Q., Ma C. M., Hattori M. (2009), “Anti-HIV-1 protease activity

of new lanostane-type triterpenoids from Ganoderma sinense”, Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 57(10), pp. 1076-1080.

68. Seelmeier S., Schmidt H., Turk V., Helm K. V. D. (1998), “Human

immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited

by pepstatin A”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(18),

pp. 6612-6616.

56

69. Singh I. P., Bharate S. B., Bhutani K. K. (2005), "Anti-HIV natural products”,

International Journal of Current Science, 89(2), pp. 269-290.

70. Singh K. P., Kumar A., Prasad R. (2013), “Pepsin assay one of the easiest

approach for prescreening of HIV-protease inhibitors”, Journal of

Pharmaceutical and Scientific Innovation, 2(1), pp. 53-56.

71. Shetty B. V., Kosa M. B., Khalil D. A., Webber S. (1996), “Preclinical

pharmacokinetics and distribution to tissue of AG1343, an inhibitor of

human immunodeficiency virus type 1 protease”, Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 40(1), pp. 110-114.

72. Sun I. C., Chen C. H., Kashiwada Y., Wu J. H., Wang H. K., Lee K. H. (2002),

“Anti-AIDS agents 49. Synthesis, anti-HIV, and anti-fusionactivities of

IC9564 analogues based on betulinic acid”, Journal of Medicinal Chemistry,

45(19), pp. 4271-4275.

73. Sun Q. Z., Chen D. F., Ding P. L., Ma C. M., Kakuda H., Nakamura N.,

Hattori M. (2006), “Three new lignans, longipedunins A—C, from

Kadsura longipedunculata and their inhibitory activity against HIV-1

protease”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 54(1), pp. 129-132.

74. Shruthi S. D., Roshan A., Timilsina S. S., Sunita S. (2013), “A review on the

medicinal plant Psidium guajava Linn. (Myrtaceae)”, Drug Development

and Therapeutics, 3(2), pp. 162-168.

75. Sukirtha K., Growther J. L. (2012), “Antibacterial, antifungal and

phytochemical analysis of selected medicinal plants”, Journal of Natural

Product and Plant Resources, 2(6), pp. 644-648.

76. Taylor A., Brown P. D., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner E. W., Weigl D.,

Turon C. M., Katz L. (1992), “High-level expression and purification of

mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD

promoter”, Applied Microbiology and Biotechnology, 37(2), pp. 205-210.

77. Tewtrakul S., Subhadhirasakul S., Kummee S. (2003), “HIV-1 protease inhibitory

effects of medicinal plants used as self medication by AIDS patients”,

Songklanakarin Journal of Science and Technology; 25(2), pp. 239-243.

57

78. Tie Y. (2006), Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease

and drug-resistant mutants, Chemistry Dissertations, Department of

Chemistry, Georgia State University, p. 2.

79. Thuong P. T., Lee C. H., Dao T. T., Nguyen P. H., Kim W. G., Lee S. J., Oh W.

K. (2008), “Triterpenoids from the leaves of Diospyros kaki (persimmon)

and their inhibitory effects on protein tyrosine phosphatase 1B”, Journal of

Natural Products, 71(10), pp. 1775-1778.

80. Thuong P. T., Su N. D., Ngoc T. M., Hung T. M., Dang N. H., Thuan N. D.,

Bae K. H., Oh W. K. (2009a), “Antioxidant activities and principles of

Vietnamese bitter tea Ilex kudingcha”, Food Chemistry, 113(1), pp. 139-145.

81. Thuong P. T., Dao T. T., Pham T. H. M., Nguyen P. H., Le T. V. T., Lee K. Y.,

Oh W. K. (2009b), “Crotonkinensins A and B, new diterpenoids from the

Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, Journal of Natural

Products, 72(11), pp. 2040-2042.

82. Valer L., De Mendoza C., De Requena D. G., Labarga P., García-Henarejos A.,

Barreiro P., Guerrero F., Vergara A., Soriano V. (2002), “Impact of HIV

genotyping and drug levels on the response to salvage therapy with

saquinavir/ritonavir”, AIDS, 16(14), pp. 1964-6.

83. Weber I. T., Agniswamy J. (2009), “HIV-1 protease: structural perspectives on

drug resistance”, Viruses, 1(3), 1110-1136.

84. Wei Y., Ma C., Chen D., Hattori M. (2008), “Anti-HIV-1 protease triterpenoids

from Stauntonia abovatifoliola Hayata subsp. Intermedia”, Phytochemistry,

69(9), pp. 1875-1879.

85. Wlodawer A., Vondrasek J. (1998), “Inhibitors of HIV-1 protease:a major

success of structure-assisted drug design”, Annual review of biophysics and

biomolecular structure, 27, pp. 249-284.

86. Watson L., Dallwitz M. J. (1994), “The Families of Flowering Plants”, Nordic

Journal of Botany, 14(5), pp. 486.

58

87. Xu H. X., Zeng F. Q., Wan M., Sim K. Y. (1996), “Anti-HIV Triterpen Acids

from Geum japonicum”, Journal of Natural Products, 59(7), pp. 643-645.

88. Yang H., Nkeze J., Zhao R. Y. (2012), “Effects of HIV-1 protease on cellular

functions and their potential applications in antiretroviral therapy”, Cell &

bioscience, 2(1), pp. 2-32.

89. Yu Y. B., Miyashiro H., Nakamura N., Hattori M., Park J. C. (2007), “Effects

of triterpenoids and flavonoids isolated from alnus firma on HIV-1 viral

enzymes”, Archives of pharmacal research, 30(7), pp. 820-826.

90. Zhang C. Z., Xu X. Z., Li C. (1996), “Fructosides from Cynomorium

songaricum”, Phytochemistry, 41(3), pp. 975-976.

Tài liệu trang web

91. http://www.unaids.org/en/resources/campaigns/HowAIDSchangedeverything

/factsheet

92. https://prosper.erc.monash.edu.au/methodology.html

93. https://www.thermofisher.com/vn/en/home/references/molecular-probes-the-

handbook/enzyme-substrates/detecting-peptidases-and-proteases.html

94. http://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/protocols/biology/enzymatic

-assay-of-pepsin.html