D o k t o r i é r t e k e z é s

NITROGÉN-MONOXID SZEREPE T LIMFOCITA

AKTIVÁCIÓBAN

Dr. Koncz Ágnes

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, orvostudományok doktora

Hivatalos bírálók: Dr. Bajtay Zsuzsanna Ph.D., tudományos munkatárs

Dr. Igaz Péter Ph.D., egyetemi tanársegéd Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Füst György egyetemi tanár, orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Sipka Sándor egyetemi tanár,

orvostudományok doktora Dr. Pállinger Éva Ph.D., tudományos munkatárs

Budapest

2008.

2

T A R T A L O M J E G Y Z É K I.RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉK ……………………………………………………….4

II.BEVEZETÉS …………………………………………………………………5

A. T limfociták jellemzői ……………………………………………………....5

B. T limfocita aktiváció és nitrogén-monoxid ………………………………….6

C. Nitrogén-monoxid …………………………………………………………8

D. Nitrogén-monoxid szerepe a mitokondrium bioszintézisben……………..11

E. Nitrogén-monoxid szerepe az immunregulációban ………………………13

F. Reaktív oxigén intermedierek és szerepük T limfociták aktivációjában…...15

G. Hisztamin ………………………………………………………………….19

H. Hisztamin hatása a T limfociták citokintermelésére és érésére…………….22

III. CÉLKITŰZÉSEK ……………………………………………………………….26

IV. MÓDSZEREK …………………………………………………………………27

A. T limfocita aktiváció mérése ……………………………………………..27

B. Hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC-KO) állat………………………27

C. Áramlás citometriás mérések …………………………………………...28

D. Western-blot módszer ……………………………………………………..30

E. ELISPOT módszer ………………………………………………………31

F. Nitrit/nitrát mérés ……………………….......................................32

G. PCR alapú technikák ……………………………………………………...32

H. Statisztikai elemzések ……………………………………………………33

V. EREDMÉNYEK ……………………………………….........................................34

A. Nitrogén-monoxid szerepének vizsgálata T limfociták aktivációjában …….34

B. HDC-KO egér eltérő citokintermelése………………………………………42

C. Hisztamin hatása a limfociták nitrogén-monoxid termelésére ..…………….44

D. Eltérő T limfocita aktiváció a HDC-KO egerekben ………………………..46

3

E. Nitrogén-monoxid hatása az IFN-γ termelésre .…………………………….48

VI. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ……………………………50

VII. ÖSSZEFOGLALÁS …………………………………………………………56

VIII. SUMMARY …………………………………………………………………...58

IX. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA …………………………………………….59

X. KÖSZÖNTENYILVÁNÍTÁS …………………………………………………. 61

X. IRODALMI JEGYZÉK ……………………………………………………….62

4

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

TCR: T sejt receptor

Th: T helper sejtek

NO: nitrogén-monoxid

ZAP-70: ζ-associated protein-70

LAT: linker for activation of T cells

IP3: inozitol-1,4,5-trifoszfát

ROI: reaktív oxigén intermedierek

NOS: nitrogén-monoxid szintetáz; nNOS, neuronális NOS; eNOS, endotheliális NOS;

iNOS, indukálható NOS

2-APB: 2-aminoetoxidifenil borát

MnTBAP: mangán (III) tetrakis (4-benzoesav)porfirin klorid

C-PTIO: carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid

HE: hidroetidin

TMRM: tetrametilrhodamin metil észter

DAF-FM: 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofloureszcein diacetát

Fluo-3: fluoro-3 acetoximetil-észter

NOC-18: (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioetil)amino]diazen-1-ium-1,2-diolát

dietilenetriamin

ConA: Concavalin A

CFA: komplett Freund’s adjuváns

HDC: hisztidin dekarboxiláz

IL: interleukin

IFN: interferon

5

II. BEVEZETÉS

A. T limfociták jellemzői

T limfociták központi szerepet játszanak az adaptív immunválaszban. A sejtfelszínükön

expresszálódó T sejt receptor (TCR) az antigén prezentáló sejt (APC) felszínén

exresszálódó fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) által bemutatott antigénepitóp

specifikus felismerésére képes. T limfociták érése a thymusban történik, melynek során

az autoreaktív T limfociták kiszelektálódnak. A thymusból perifériára kerülő T sejtek

jellegzetes sejtfelszíni receporaik alapján több típusba sorolhatók.

A CD8 sejtfelszíni receptorral rendelkezőket citotoxikus T sejteknek (Tc) nevezzük.

Mint nevük is mutatja sejtkárosító hatással rendelkeznek, fontos szerepük van az

intracelluláris parazitával, vírussal fertőzött sejtek és a tumor sejtek elpusztításában,

illetve fő mediátorai a traszplantáció után fellépő kilökődési mechanizmusnak.

A CD4 sejtfelszíni receptort viselő sejteket T helper (Th) sejteknek nevezzük.

Jellemzőjük, hogy aktiváció során immunválaszt befolyásoló citokineket termelnek.

Ezeket a sejtek citokintermelése alapján több alcsoportba sorolhatjuk: Th1, Th2, Th17.

Th1 sejtek elsősorban IL-2, IFN-γ, és IL-12 citokineket termelnek, jellemző

transzkripciós faktoruk a T-bet. A Th2 sejtek által termelt citokinek az IL-4, IL-5, IL-6,

IL-10, IL-13; jellegzetes transzkripciós faktoruk a GATA-3. Az újabban leírt Th

alcsoport a Th17, melynek jellemző citokinje az IL-17, transzkripciós faktora pedig a

ROR-γ, irodalmi adatok szerint fontos szerepe van egyes autoimmun betegségek

patomechanizmusában. A CD4 sejtfelszíni receptorral rendelkező T limfociták egy

további csoportját alkotják az un. regulatorikus T sejtek (Treg). Ezeket a sejteket

szupresszor T sejteknek is nevezik mert legfontosabb feladatuk a T sejt által közvetített

immunválasz gátlása illetve a thymusból a perifériára kerülő autoreaktív T sejtek gátlása.

Az irodalom a Treg limfociták két csoportját különbözteti meg; a természetes Treg és az

adaptív Treg populációt. A természetes Treg sejtek jellemzője a sejtfelszínen

expresszálódó CD4 mellett magas CD25 (IL2Rα) receptor expresszió illetve a foxp3

transzkripciós faktor kifejeződése. Ezen sejtek érése a thymusban történik, míg az

adaptív Treg sejtek a periférián alakulnak ki az immunválasz során [1.]

6

A T limfociták felszínén expresszálódó molekulák valamint a sejtek

mikrokörnyezetében jelenlévő citokinek és szolubilis molekulák fontos részét képezik a

T sejt aktivációnak és érésnek. Munkánk során vizsgáltuk hogy két bioaktív molekula, a

nitrogén monoxid (NO) és a hisztamin milyen szerepet játszik a T sejtek aktivációjában,

jelátviteli folyamataiban és citokin termelésében.

B. T limfocita aktiváció és nitrogén monoxid

Az antigén kötődése a T sejt receptorhoz (TCR) Lck és Fyn tirozin kinázok

aktiválódásához vezet. Ezen tirozin kinázok felelősek a TCR ζ lánc és a CD3 alegység

foszforilációjáért, melyek ilyen formában a ζ- associated protein-70 (ZAP-70)

molekulát képesek lehorgonyozni és ezáltal aktiválni. A ZAP-70 protein foszforilálja

a ’linker for activation of T cells’ (LAT) proteint, mely direkt módon kötődik többek

között a foszfolipáz C-γ1-hez. A foszfolipáz C-γ1 katalizálja a foszfatidol-inozitol-4,5-

bifoszfát hidrolízisét inozitol-1,4,5-triszfoszfáttá (IP3) és diacilglicerollá (DAG). Az IP3

kötődése belső Ca2+ raktárakon lévő receptorához Ca2+-ot mobilizál, létrehozva ezzel a

citoplazmatikus Ca2+-szignált. A DAG protein kináz-C aktivációt okoz. Ezek a

útvonalak továbbiakban traszkripciós faktorok aktiválásáért, citokintermelés

beindításáért, T sejt proliferációért felelősek [2;3]. (1. ábra) A T sejt aktivációhoz

azonban a T sejt receptor (TCR) által közvetített folyamat mellett kostimulációs

szignálokra (CD28, CD40 ligand, LFA-1, CD2) is szükség van.

A T sejt aktiválással párhuzamosan jelentős strukturális változások is bekövetkeznek,

ami szintén nélkülözhetetlen részjelensége a hatékony T sejt aktivációnak. A T limfocita

antigénprezentáló sejt felé eső részén kialakuló szupramolekuláris aktivációs komplex

(SMAC) aktivált enzimeket, adaptor proteineket, szignáltranszdukcióban részvevő

proteineket tartalmaz és szabályozza ezek konformációváltozását. Ezen kívül a T sejt

membránja ezen a részen koleszterolban és szfinglipidben gazdaggá válik, un. lipid-

tutajok (raftok) alakulnak ki. A T sejt aktiváció során tehát létrejön az immunológiai

szinapszis, melyben a sejt polarizálttá válik [4;5;6].

7

1. Ábra: T sejt receptor aktivációt követő jelátviteli folyamatok sematikus rajza.

A T sejt immunszinapszisban történő polarizációjának részjelensége az az újabban leírt

szubcelluláris megfigyelés, miszerint a T sejt antigénprezentáló sejttel kapcsolódó

részében kétszer nagyobb mennyiségű NO termelődik mint a citoplazma többi részében.

Ennek hátterében az eNOS megváltozott lokalizációja áll. Az immunológiai

szinapszisban fokozott NO termelés új megvilágításba helyezi a T sejt aktiváció

folyamatát, a helyileg nagyobb mennyiségben termelődő NO ugyanis befolyásolja a

CD3 ζ lánc és a ZAP-70 foszforilációt [7]. Ezen eredmények is alátámasztják a NO T

sejt aktivációban betöltött szerepét [8].

Lck/Fyn

γ

ZAP-70

α β

ζζε

PP

P

P

kostimulációs szignálok

P P

P

LATP PP

PLCγ1 PIP2

IP3 DAG

CD3

ANTIGÉN

+

T sejt aktiváció, proliferáció

NO

Ca2+ szignál PKC aktiváció

8

C. Nitrogén-monoxid

A nitrogén-monoxid (NO) a sejtfunkciók fontos és sokrétű fiziológiás szabályozója.

NO-t emittáló gyógyszereket használunk egyes betegségek gyógyítására, továbbá az NO

a környezetünkben is jelentős mennyiségben megtalálható. Molekuláris oxigénből és

nitrogénből igen magas hőmérsékleten, például a légkörben villámlás során keletkezhet.

NO termelődik továbbá a belső égésű motorok, erőművek működése során is. NO és

ózon kemiluminescens reakciója során oxigén és nitrogén dioxid keletkezik, a

folyamatot kísérő fény fotodetektorral laboratóriumi körülmények között mérhető, ez

képezi a NO mérésére használható egyik módszer alapját is. Az ózonnal történő

reakciója miatt a NO az ózonréteg elvékonyodásában, továbbá a savas esők

kialakulásában is szerepet játszik.

A NO fontos intra-, trasz- és intercelluláris hírvivő molekula mely számos fiziológiás és

patológiás folyamatban szerepet játszik. A NO egyik legjobban ismert funkciója az

értónus szabályozása, vazodilatációt okoz, növeli az oxigén szükségletet [9;10].

A NO élettani hatásainak kutatásában elért eredményeiért Robert F Furchgott, Louis J

Ignarro és Ferid Murad 1998-ban Nobel díjat kapott, fő kutatási területük a NO szív és

érrendszeri szerepének vizsgálata volt. Megfigyeléseik szerint a NO számos jelátviteli

útvonalat szabályozó gáz, mely a legtöbb jelátvitelt szabályozó anyaggal szemben,

szabadon átjut a biológiai membránokon. A NO egyik fontos intracelluláris hatása tiol

és cisztein csoportok S-nitrozilációja. Ez a poszttranszlációs módosulás reverzibilis

módon befolyásolja a proteinek funkcióját. A másik ismert hatásmechanizmusa a guanil

cikláz aktivitásának befolyásolása révén a cGMP szint emelkedése [11].

Szervezetünkben NO L-argininből képződik, nitrogén monoxid szintetáz (NOS)

enzimek által katalizált folyamatban, melyhez NAPH és tetrabiopterin kofaktor jelenléte

szükséges [12]. Három NOS izoformát ismerünk: a neuronális NOS-t (nNOS, NOS1),

az indukálható NOS-t (iNOS, NOS2) és az endoteliális NOS-t (eNOS, NOS3). A három

izoforma génjei különböző kromoszómán helyezkednek el, nNOS a 12. kromoszóma

9

24.1-31 régiójában; az iNOS a 17. kromoszóm 11.2-12 régiójában; az eNOS pedig a 7.

kromoszóma 35-36 régiójában. Ghafourifar és Cadenas 2005-ben leírt a mitokondrum

belső membránjában elhelyezkedő, Ca2+ függő módon működő NOS izoformát, melyről

még kevés, ellentmondásos irodalmi adattal rendelkezünk [13]. Az eNOS és nNOS

folyamatosan expresszálódik, aktivációja Ca-calmodulin függő. Ezek az izoformák

felelősek a sejtek kis mennyiségű, alap szintű NO termelésért. Ezzel ellentétben az

iNOS működése transzkripciós szinten szabályozott és ez az izoforma nagy mennyiségű

NO termelésért felelős. eNOS érendothel sejtekben történő expressziója szerepet játszik

az értónus fenntartásában és a trombocita aggregáció gátlásban illetve endothel

sejtekhez történő adhéziójának megakadályozásában. Az idegsejtekben folyamatosan

expresszálódó nNOS által termelt NO a ’non-adrenerg non-cholinerg’ (NANC)

idegvégződések fontos neuromodulátora. Makrofágokban az iNOS elsősorban a

mikrobiális endotoxinok és proinflammatórikus citokinek hatására indukálódik [14]. A

NO élettani és patológiás folyamatokban betöltött szerepének tanulmányozásához a

különböző genetikailag módosított állatmodellek jelentős segítséget nyújtanak. Az

nNOS génkiütött állat jellemző betegsége a pylorus sphincter hipertrófia, az agresszív

magatartásforma és fokozott védelem az agyi ischemiával szemben. Az eNOS knock-

out állat jellemzői közé tartoznak a vasculáris léziók, hipertenzió és a fogékonyság az

agyi ischemiára. Az iNOS génkiütött állat legjellemzőbb fenotípusos elváltozása pedig a

fertőzésekkel szembeni fokozott érzékenység és a bakteriális lipopoliszacharidokra

adott csökkent hipotenzív válasz [15].

A NO rövid féléletidejű, (3-15 másodperc) szuperoxiddal (O2-) reagálva spontán

peroxinitritté (ONOO-) alakul. A peroxinitrit maga is oxidálószer, vagy átalakul nitráttá,

mely stabil, jól mérhető, a NO termeléssel arányos mennyiségben termelődő vegyület

[16] (2. ábra).

10

2. Ábra: Nitrogén monoxid képződés és bomlás vázlata

L-Arginin

NONNOOSS

Citrullin

Nitrit/Nitrat

Peroxinitrit++sszzuuppeerrooxxiidd

11

D. Nitrogén-monoxid szerepe a mitokondrium működésben és

bioszintézisében

A mitokondriumok képezik az oxidatív foszforiláció és a terminális oxidáció színhelyét

ahol a szervezetünk működéséhez energiát szolgáltató ATP több mint 90 százaléka

termelődik. Az oxidatív foszforiláció tulajdonképpen elektrontranszfer az elektron

donor (pl. NADH) és az elektron akceptor (oxigén) között. Az elektron transzfer redox

reakciók során valósul meg, amit a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő

protein-komplexek biztosítanak. Alapvetően öt protein komplex vesz részt a

folyamatban, melyek a következők: NADH-koenzim Q oxidoreduktáz (komplex I),

szukcinát-Q oxidoreduktáz (komplex II), elektron transzfer flavoprotein-Q

oxidoreduktáz, Q-citokróm-c oxidoreduktáz (komplex III), citokróm-c oxidáz (komplex

IV). Az elektron transzportláncon történő végighaladása során felszabaduló energia a

mitokondrium belső membránján keresztüli protontranszportra használódik. Ezt a

folyamatot kemiozmózisnak nevezzük, melynek során a membrán két oldala között

elektrokémiai gradiens alakul ki. Ez a grádiens két részből áll, pH grádiensből és

elektromos potenciál különbségből [17]. A mitokondrium belső membránján át mérhető

elektromos potenciálkülönbség mértéke 180-200 mV, negatív belül és potenciál-

szenzitív fluoreszcens festékekkel jól detektálható.

A kemiozmózis formájában tárolt energia végül ATP szintézist eredményez, a

mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő ATP szintáz enzim segítségével. Ez

az enzim a fennálló proton gradiens rovására felszabaduló energiát ATP szintézisre

használja:

12

ADP + Pi + 4H+→ ATP 4H+mitok.matrix

Az utóbbi években derült fény arra hogy a NO a mitokondriális légzés fiziológiás

szabályozója. Szabályozza a mitokondriumok ATP szintézisét és oxigén felhasználását

azáltal hogy alacsony koncentrációban reverzibilisen gátolja a citokróm-c oxidázt. A

citokróm-c oxidáz az elektron transzportlánc utolsó enzimje, mely a sejt csaknem teljes

oxigén fogyasztásáért felelős. Alacsony koncentrációban a NO az oxigénnel

versenyezve reverzibilisen gátolja az enzimet, ATP depléciót okozva [18].

Ezenkívül a NO a mitokondrium bioszintézis fő regulátora is, hatását a cGMP- függő

peroxiszóma proliferator-activating receptor γ coactivator-1 molekulán (PPAR-γ

coactivator-1) keresztül fejti ki. Jelenlegi ismereteink szerint a barna zsírsejtek, U937

sejtek, HeLa sejtek és humán limfociták mitokondrium bioszintézise befolyásolható

NO-val[19].

A sejt pillanatnyi állapotától függően a NO egyaránt gátolhatja, vagy stimulálhatja a

programozott sejthalál folyamatát. A NO szuperoxiddal (O2-) reagálva spontán

peroxinitritté (ONOO-) alakul. A peroxinitrit erélyes oxidálószer, igen toxikus, nagyobb

mennyiségben apoptózist vagy nekrózist okoz, kisebb mennyiségben jelátviteli

útvonalak szabályozásában vesz részt. Ezenkívül a NO mitokondriális hiperpolarizációt

és ATP depléciót okoz astrocitákon, Jurkat sejteken. NO-t emittáló vegyületekkel (NO

donor) mitokondriális és citoplazmatikus Ca2+ szignál váltható ki. Jurkat sejteken a

FAS indukálta apoptózis során NO termelés mérhető [20;21].

13

E. Nitrogén-monoxid szerepe az immunregulációban

A NO sokrétű szabályozója az immunfolyamatoknak is. Az irodalomból jól ismert,

hogy az iNOS nagy mennyiségű NO termelése révén citotoxikus hatással rendelkezik.

Számos tanulmány foglalkozik a makrofágokban az iNOS által termelt NO

antimikrobiális és tumor sejt károsító hatásával. A sejtkárosító hatást különböző

enzimek gátlása révén fejti ki. A NO gátolja például a célsejtek mitokondriális légzési

láncának I, IV komplexét, a ribonukleotid reduktázt, gliceraldehid-3-foszfát

dehidrogenázt ezen kívül DNS-t módosító hatása is van. A makrofágok iNOS

termelését elsősorban a Th1 immunválasz citokinjei (INF-γ, TNF-α, IL-1β) valamint

bakteriális termékek (LPS, Staphylococcus enterooxin B) indítják be [22]. Mivel az

iNOS transzkripció órákon át tartó nagy mennyiségű NO termelést eredményez,

transzkripciója pontosan szabályozott. Az iNOS expresszió NF-κB útvonalon keresztül

szabályozott [23;24]. Az NF-κB transzkripciós faktor, homo- és heterodimer formában

fordul elő a citoplazmában, gátló proteinekhez, az IκB-hez kötődve. Megfelelő stimulus

hatására (citokinek, mikrobiális termékek, UV sugárzás) IκB kináz aktiválódik és az

IκB-k foszforilálódnak. Foszforilált IκB gyors proteolízisen megy keresztül aminek

eredményeként NF-κB felszabadul a komplexből és specifikus szekvenciájának

köszönhetően (5’-GGGRNNYYCC-3’) kötődni tud megfelelő DNS szekvenciához. Az

NF-κB kötő DNS szekvencia az indukálható gének promóter régiójában található mint

pl. citokinek, adhéziós molekulák, antioxidáns enzimek és iNOS. Érdekes módon az

NF-κB útvonalat maga a NO is befolyásolja. Citokin aktivált asztroglia és mikroglia

sejteken NO donorral gátolható az iNOS expresszió. Ennek hátterében több

mechanizmust írtak le, egyik szerint NO hatására nitrozilálódik az NF-κB DNS

kapcsolódásban szerepet játszó p50-es alegység 62 ciszteinje, így nem tud léterjönni a

DNS - NF-κB komplex [25]. Ezenkívül ismert az is hogy NO hatására fokozódik az

IκBα inhibitor protein stabilitása, szintén gátolva ezzel a NF-κB útvonalat. Ezek a

hatások azonban függnek a sejt pillanatnyi redox állapotától, nagy koncentrációjú

glutation és redox aktivitással rendelkező proteinek (thioredoxin) kivédik a NO ezen

hatásait [26]. Ugyanakkor bizonyos körülmények között NO fokozza a NF-κB által

szabályozott gének expresszióját, mint a COX-2, TNF-α, gluthation szintetáz [27;28].

Az NF-κB útvonalra kifejtett serkentő hatás molekuláris mechanizmusa kevésbé ismert.

14

Feltehetően az oxidatív stresszre aktiválódó p21ras nitrozilációja játszik szerepet ebben a

folyamatban [29;30]. Ezek az eredmények arra engednek következtetni hogy a NO

génexpresszió szabályozásban gátló és serkentő módon egyaránt részt vesz.

Egér makrofágokon végzett kísérlet szerint a NO koncentráció függő módon gátolni és

serkenteni is tudja az NF-κB útvonalat, ezáltal számos proinflammatorikus gén (pl.

citokinek, COX-2, iNOS) expresszióját ki- illetve bekapcsolja. Kis koncentrációjú NO

(30 nM – 3 μM) NF-κB-t aktiváló hatása érvényesül, míg nagy koncentrációban (30 –

300 μM) NF-κB útvonalat gátolja. A kis koncentrációjú NO termelésért eNOS és nNOS

izoformák felelősek, míg a nagy koncentrációjú NO termelés az iNOS izoformára

jellemző. A NO NF-κB útvonalra kifejtett kettős hatása magyarázatot ad az

irodalomban ellentmondásosnak ismert olyan eredményekre mint a Th1 sejtekre,

osteoclastokra, apoptózisra kifejtett serkentő és gátló hatás [31].

15

F. Reaktív oxigén intermedierek és szerepük a T limfociták

aktivációjában

Reaktív oxigén intermedierek (ROI) közé tartoznak: a szuperoxid anion, a

hidrogénperoxid, a hidroxil gyökök és a szabad gyökök (3. ábra). Jellemezőjük az

extrém mértékű instabilitás, mely a külső elektronpályán elhelyezkedő páratlan

elektronnak köszönhető. Instabil konfigurációjuk következtében gyorsan reagálnak más

molekulákkal vagy gyökökkel, miközben stabil molekulák képződnek. A szervezetben

többféle módon keletkezhetnek ROI-k. Képződhetnek külső ionizáló sugárzás hatására,

vagy a sejtlégzés melléktermékeként, mikor ez elektronok az elektron transzportláncon

történő áthaladásuk során direkt módon reakcióba lépnek az oxigénnel [32]. Ezeken

kívül, bizonyos sejtek ROI szintézisre is képesek NADPH oxidáz (makrofágok) vagy

mieloperoxidáz (neutrofil granulociták) enzimjeik révén.

3. Ábra: Legfontosabb reaktív oxigén intermedierek sematikus rajza, a külső

elekronhéjon lévő elektronok ábrázolásával.

o H o o - o H

H o oH

Szuperoxid anion Hidroxil gyök Hidroxil ion (OH-)

Hidrogén peroxid

16

A ROI-k erőteljes oxidáló hatásuknál fogva jól ismert sejtkárosítók, oxidálják a

proteineket, lipideket és a DNS-t. Sejtkárosító hatásaik közül legismertebb a lipid

peroxidációt okozó hatásuk. Lipidperoxidációs folyamatban a többszörösen telítetlen

zsírsavak kettős kötés mellet elhelyezkedő metilén csoporton (-CH2) lévő reaktív

hidrogén vesz részt [33] (4. ábra).

4. Ábra: Lipidperoxidáció folyamata.

A sejtek képesek védekezni a ROI károsító hatásaival szemben illetve képesek a ROI

által okozott károsodások helyreállítására. Egyik védekezési mechanizmus antioxidáns

enzimek segítségével történik. Ilyen enzimek a szuperoxid dizmutáz és a kataláz. A

szuperoxid dizmutáz (SOD) a következő reakciót katalizálja:

2 O2- + 2 H+ → O2 + H2 O 2

iniciáció

prolongáció

termináció

Molekuláris áterndeződés

Lipid gyök

17

A SOD a sejtekben kétféle lokalizációban található, a mitokondrium mátrixban, és

citoplazmában. A mitokondriális forma mangánt, a citoplazmatikus forma cinket és

rezet tartalmaz. A kataláz enzim a hidrogén peroxidot oxigénné és vízzé bontja:

2 H2O2 → 2 H2O + O2

A szervezetben ezenkívül számos antioxidáns hatással rendelkező molekula

megtalálható, mint például az E vitamin (alfa-tokoferol), C-vitamin, glutation, melanin.

Az antioxidánsok gyökfogó molekulák, melyek redukáló tulajdonságuknál fogva a ROI

oxidatív hatását kivédik.

Abban az esetben, ha a sejtekben az oxidatív és antioxidatív egyensúlya felborul

oxidatív stressz állapota alakul ki.

1950-es években Dehman Harman írta le először az ún. „free radical theories” (FRTA)

elméletet [34]. Lényege, hogy a normál sejtlégzés során termelődő szabad gyökök által

létrehozott károsodások a szervezetben évek során felhalmozónak és az öregedés

folyamatát eredményezik. Ez az elmélet később tovább bővült, ma már jól ismert a ROI

szomatikus mutációt, protein károsodást és lipidperoxidációt okozó hatása, melyek

mind részét képezik az öregedés folyamatának. Elsősorban a lassan bomló proteinek

(mint a kollagén, elasztin) reaktív aminosavainak oxidációja illetve glikozilációja tehető

felelőssé ezért a folyamatért. Ma már ismert az is, hogy a ROI által okozott oxidatív

károsodás nemcsak az öregedésben, hanem a neurodegeneratív betegségek

kialakulásában is szerepet játszik, mint például Alzheimer-kór, Parkinson kór, de

szerepe van más betegségek patomechanizmusában is (pl. atherosclerosis, diabetes

szövődményei, arthritis, tumoros betegségek) [35;36].

A ROI előbb ismertetett sejtkárosító hatásán túl nélkülözhetetlen szabályozója számos

fiziológiás folyamatnak. Hidrogén peroxid keletkezése szükséges a pajzsmirigy által

termelt tiroxin hormon szintéziséhez. Szintén ROI termelődik a makrofágokban és a

neutrofil granulocitákban a baktériumok fagocitózisa során, mely a sejtek antibakteriális

hatásához szükségesek. A makrofágok baktériumölő hatásában a NADPH oxidáz enzim

működése biztosítja ROI termelődését. NADPH oxidáz a következő reakciót katalizálja:

NADPH – 2e- + 2 O2 → NADP+ + H+ + 2 •O2-

18

Ha az enzim genetikai károsodás miatt nem működik az X kromoszómához kötött

chronicus granulomatosus betegség alakul ki. A betegség jellemzője a bakteriális

infekció, melyet elsősorban azok a baktériumok okoznak, melyek katalázt termelnek,

például E. coli, Salmonella, Staphylococcus törzsek.

A ROI ezenkívül a sejtek szignálfolyamataiban is részt vesz. Fontos szabályozója

például a programozott sejthalál, az apoptózis beindításának és folyamatának. A T

limfociták TCR-nek megfelelő specifikus antigénnel történő találkozásuk során

aktiválódnak, differenciálódnak és osztódnak. Ezen hatások eredménye az lesz, hogy

kialakul egy aktivált effektor T sejt populáció. Az aktivált T sejtek egy része memória T

sejtté alakul és a limfoid szövetet elhagyva a keringés segítségével nem limfoid

szövetekbe vándorol. Másik részük apoptózissal elpusztul, ezt a folyamatot aktiváció

indukálta sejthalálnak (AICD) nevezzük. Az AICD molekuláris mechanizmusának

hátterében a TCR aktivációt követő Fas és Fas ligand (FasL) expresszió áll. Számos

irodalmi adat támasztja alá a ROI központi szerepét a T limfocita aktiváció során

bekövetkező fokozott Fas és FasL expresszióban [37; 38; 39]. A TCR aktivációt követrő

15 percen belül fokozott ROI termelés detektálható [ 40 ]. Bár a TCR aktivációra

bekövetkező ROI szignálhoz vezető útvonal kevésbé ismert, a legújabb eredmények azt

mutatják hogy a ZAP-70, LAT, PLCγ1 deficiens sejtvonalon a TCR aktiváció indukálta

ROI szignál nem váltható ki. Kiváltható ugyanakkor a DAG mimetikus hatással

rendelkező phorbol 12-miristát 13-acetáttal (PMA), továbbá a PKC siRNS-el történő

blokkolása gátolta a TCR aktivációt követő ROI szignált és a Fas, FasL expresszió

fokozódását [41].

Ezek az eredmények arra utalnak hogy a T sejt aktiváció következtében kialakuló ROI

szignál fontos részét képezi a normál T limfocita funkciónak.

19

G. Hisztamin

A hisztamin (β-imidazolylethylamin) különböző fiziológás folyamatok és patológiás

állapotok fontos mediátora. Szerepet játszik az idegrendszer ingerület átviteli

folyamataiban, hipofizis hormonok szekréciójában, a gyomor-bélrendszer és a

kardiovaszkuláris rendszer működésében. Irodalmi adatok szerint a melanóma sejtek

proliferációját közvetlenül befolyásolja, ezáltal hatása van a melanóma progressziójára

[42;43]. Ezenkívül jól ismert immunregulátor, fő mediátora az allergiás reakciónak,

részt vesz a fertőzésekben, gyulladásos reakciókban.

Hisztamin L-hisztidinből keletkezik hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) által katalizált

folyamatban (5. ábra).

5. Ábra: Hisztamin képződés

Hisztidin dekarboxiláz (HDC)

L-Hisztidin Hisztamin

20

A hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) csaknem minden szöveti sejtben expresszálódik

[ 44 ], legnagyobb mértékben a hízósejtekben és bazofil granulocitákban, melyek a

hisztamint nagy mennyiségben tárolni is képesek granulumaikban. Lebontásáért a

diamin oxidáz és a hisztamin N-methyltraszferáz enzimek felelősek. A hisztamin

metabolizmusban illetve a hisztamin által kiváltott jelátviteli folyamatokban szerepet

játszó gének polimorfizmusa összefügg különböző patológiás folyamatok kialakulásával,

lezajlásával és a terápiára adott válasszal [45].

Számos irodalmi adat utal a hisztamin immunregulációban betöltött szerepére.

Különböző kísérletek eredményei a hisztamin mind gyulladást serkentő, mind

gyulladást gátló hatását leírják. A hisztamin farmakológiai hatását négy különböző

receptoron (HR) keresztül fejti ki: 1-es típusú hisztamin receptor (H1R), 2-es típusú

hisztamin receptor (H2R), 3-as típusú hisztamin receptor (H3R) és a legújabban

felfedezett 4-es típusú hisztamin receptor (H4R) (1. táblázat).

Hisztamin

receptor Sejttípus Intracelluláris szignál

H1R

simaizomsejtek, májsejtek, porcsejtek,

endotélsejtek, idegsejtek, granulociták,

monociták, dendritikus sejtek, T és B

sejtek

intracelluláris Ca2+ ↑

H2R

idegsejtek, simaizomsejtek, májsejtek,

porcsejtek, endotélsejtek, granulociták,

monociták, dendritikus sejtek, T és B

sejtek,

cAMP ↑

H3R

Hisztaminerg neuronok, eozinofil

granulociták, dendritikus sejtek,

monociták

cAMP ↓

H4R

Eozinofil, neutrofil, bazofil granulociták,

dendritikus sejtek, T sejtek (helper),

hízósejt

cAMP

1. táblázat: Összefoglaló táblázat a hisztamin receptorok sejt-specificitásáről illetve fő jelátviteli mechanizmusairól

A hisztamin receptorok G-protein kapcsolt receptorok, H1R és H2R stimulácója

elsősorban a Gq és Gs proteinek aktivációját, míg a H3R és H4R stimuláció Gi/0 protein

aktivációt okoz. A hisztamin egyaránt kialakíthat gátló és serkentő hatást attól függően

hogy milyen típusú hisztamin receptor, milyen mértékben expresszálódik az adott sejten.

A T limfocitákban a H1R által közvetített jelátviteli folyamat a Gq/11 G protein család

tagjain keresztül kommunikál a T sejt receptor (TCR) által közvetített jelátviteli

folyamatokkal [46].

22

H. Hisztamin hatása a T limfociták citokin termelésre és

érésére

A hisztamin immunfolyamatok szabályozásában betöltött szerepét bizonyítják azok az

eredmények is, melyek a citokin termelést befolyásoló hatásáról szólnak. Perifériás

humán mononukleáris sejteken és a CD19 depletált alpopulációban a hisztamin gátolja a

lipopoliszacharid (LPS) által okozott interferon-γ (IFN- γ) szintézist mRNS és protein

szinten egyaránt [ 47 ]. Ugyanakkor a hisztamin H2R-on keresztül fokozza az

interleukin-6 (IL-6) [48], interleukin-1 (IL-1) termelést [49],dózis függő módon pedig

gátolja a humán monociták interleukin-12 (IL-12) termelést [50]. A H2R-on keresztül

kifejtett hatása szelektív H2R antagonistával gátolható, míg szelektív H1R illetve H3R

antagonistával ez a hatás nem befolyásolható. A hisztamin T sejtek IL-2 termelésére

gyakorolt hatása kettős, gátló vagy serkentő hatás egyaránt lehetséges. Ez a kettős hatás

függ egyrészt a hisztaminnal történő kezelés módjától, a kezelt sejtek típusától, másrészt

a T sejt aktiváció időbeli lefutásától. Abban az esetben például, ha perifériás

mononukleáris sejtek vagy T sejtvonalak hisztaminnal történő kezelése az aktiváció

kezdeti szakaszában történik, erőteljes IL-2 és IFN-γ expresszió fokozódás jön létre, az

aktiváció későbbi szakaszában viszont ezen citokinek termelésére a hisztamin gátló

hatást fejt ki. [51].

A perifériás szövetekben elhelyezkedő éretlen dendritikus sejtek antigénnel történő

találkozásuk után érési folyamaton mennek keresztül, ezalatt történik az antigén

feldolgozása, miközben megváltozik a sejtfelszíni molekulák expressziós mintázata és a

sejtek citokineket kezdenek termelni. Ezután az érett dendritikus sejtek a

nyirokszövetekbe vándorolnak, ahol naiv T sejteknek bemutatják a feldolgozott antigént.

A dendritikus sejtek érésében szerepe van a sejtek mikrokörnyezetének is. Abban az

esetben, ha a dendritikus sejtek érése az elsősorban hízósejtek és bazofilek

degranulációjából származó hisztamin jelenlétében történik, csökken a dendritikus

sejtek IL-12 termelése, ugyanakkor fokozódik az IL-10 termelésük. Abban az esetben

viszont, ha az érés során hisztamin nincs jelen, a dendritikus sejtek IL-12 termelése

fokozódik. Antigén prezentáció során a dendritikus sejtek által termelt IL-12 fontos

szerepet tölt be a naív T sejtek T helper sejtekké érésében. Az elsősorban dendritikus

sejtekből származó IL-12 jelenlétében ugyanis a naív T sejtek T helper 1 típusú sejtekké

23

(Th1) érnek, melyek jellemző citokinjei az IFN-γ, TNF-β, IL-2; jellemző transzkripciós

faktoruk a T-bet. Ha az antigén prezentáció során gátolt a dendritikus sejtek IL-12

termelése, a T sejtek T helper 2 típusú sejtekké (Th2) érnek, melyek jellemző citokinjei

az IL-4, IL-5, IL-10, IL-13; jellemző transzkripciós faktoruk pedig a GATA-3 [52] (6.

ábra).

24

STAT1

Ca2+ signal

TCR

Antigen

MHC

PKC

T-bet

IFN-γ

cAMP

IL-2

GATA3 IL-4 IL-13

IL-5

p38 MAPK

PKA

H2R

IL-4R

IL-4

STAT6

IL-12

IL-12R

IL-12

STAT4

6. Ábra: T helper sejtek érését befolyásoló tényezők és jelátviteli útvonalak egyszerűsített rajza.(Szaggatott nyíl: gátlást jelöl)

25

A hízósejtek degranulációja során felszabaduló hisztamin tehát fontos szabályozója a

naiv T sejtek T helper 2 sejtekké történő differenciálódásának. Az allergén által

keresztkötött IgE molekula kapcsolódva a hízósejt felszínén expresszálódó FcεRI

receptorhoz a hízósejt granulumainak plazmamembránnal való összeolvadását idézi elő,

azaz létrejön a degranuláció folyamata [53].

Jól ismert hogy az allergiás, atópias betgségek Th2 túlsúllyal járnak. Allergiás

egyénekben a fokozott Th2 típusú immunválasz beindítójának az allergén által

keresztkötött IgE sejtfelszíni receptorhoz való kapcsolódását teszik felelőssé.

Összehasonlítva az egészséges egyének és allergiás egyének allergének által kiváltott T

sejt mintázatát, Akdis és munkatársai azt találták, hogy az egészséges egyénekben az

allergén- specifikus regulatorikus T (Treg) sejtek szubpopulációja dominál, míg

allergiásokban az allergén-specifikus IL-4 termelő Th2 sejtek jelenléte a meghatározó.

Ezek az eredmények azt mutatják hogy az allergén-specifikus Treg és Th2 sejtek

megváltozott egyensúlya fontos szerepet játszik az allergiás betegségek kialakulásában

[54]. Az újabban alkalmazott allergén-specifikus immunterápia (SIT) éppen a fokozott

Th2 immunválasz megfékezését célozza meg azáltal, hogy serkenti az allergén-

specifikus Treg sejtek által közvetített immunválaszt. Az allergén-specifikus

immunterápia hatására megjelenő Treg sejtek többféle szupresszor mechanizmus (IL-10,

TGF-β citokin termelés illetve a sejtfelszínükön megjelenő citotoxikus T-limfocita

antigen 4 és programmed death-1) révén csökkentik az IL-4, IL-5, IL-13-at termelő

CD4+ T sejtek (Th2) számát, létrehozva ezzel a perifériás T sejt toleranciát. Ezenkívül a

megnövekedett IL-10 és TGF-β termelés hatására megváltoztatják a ’pro-allergén’-IgE

és a ’protektív’-IgG4 arányt is [ 55 ; 56 ; 57 ]. Az allergén-specifikus immunterápia

legújabb eredményei szerint a hisztamin által közvetített jelátviteli folyamat interferál a

perifériás T sejt toleranciával. A terápia során adott H1R antagonista fokozza a

specifikus tolerancia mechanizmust és a vakcináció gyulladást gátló hatását [58].

26

II. CÉLKITŰZÉSEK

Célunk volt humán T limfociták CD3/CD28 aktivációra kialakuló intracelluláris

Ca2+ szignállal párhuzamosan végbemenő NO és ROI termelés mérése illetve a

mitokondriális membránpotenciál detektálása és vizsgálata.

Vizsgáltuk hogy az IP3 receptor antagonista 2-ABP és a NO kelátor C-PTIO és

a szuperoxid dizmutáz gátló MnTBAP önmagában alkalmazva hogyan

befolyásolja a CD3/CD28 stimuláció során létrejövő szignálfolyamatokat.

Választ kerestünk arra a kérdésre is, hogy a NO donor NOC-18 hogyan

befolyásolja az intracelluláris és mitokondriális Ca2+ szignált, ROI termelést és a

mitokondriális hiperpolarizációt.

Vizsgáltuk melyik NOS izoforma expresszálódik T limfocitákban nyugalmi

állapotban illetve CD3/CD28 stimulációra.

Vizsgáltuk továbbá a NO T sejt aktivációban és citokin termelésben betöltött

szerepét olyan genetikailag módosított állatmodellben, melyben hiányzik a T sejt

érésben és aktivációban szintén fontos szerepet játszó molekula, a hisztamin.

Összehasonlítottuk a HDC-KO egér és a vad típusú egerek limfocitáinak

citokin- és NO termelését, a Con-A stimulációra fellépő intracelluláris Ca2+

szignált, a ROI termelést és mitokondriális membránpotenciál változást.

Mivel szignifikáns eltérést találtunk a HDC-KO és vad típusú egér limfocitáinak

IFN-γ és NO termelésében, megvizsgáltuk hogy a NO és a hisztamin hogyan

befolyásolja a sejtek IFN-γ termelését.

27

III. MÓDSZEREK

A. Humán T limfocita aktiváció mérés Humán perifériás mononukleáris sejteket (PBMC) alvadásgátolt vénás vérből Ficoll-

Hypaque grádiensen centrifugálva nyertünk, majd a perifériás limfociták (PBL)

izolálása céljából autológ szérummal fedett Petri csészében tenyésztettük. Ezután a

perifériás limfocitákat 106/ml sejtkoncentrációban RPMI 1600-as médiumban vettük fel,

ami 10% fetal bovin szérumot (FBS), 2 mM L-glutamint, 100 IU/ml penicillint, 100

μg/ml gentamicint tartalmazott. A sejteket 37˚C-os 5% CO2-t tartalmazó termosztátban

tartottuk.

T sejt aktivációhoz a sejtek tenyésztése olyan plate-en történt, melyet először CD3

ellenes OKT3 monoklonális antitesttel (CRL 8001; American Type Culture Collection,

Manassas, VA) 1 órán keresztül inkubáltuk, majd PBS-el mostuk.. Az így előkezelt

lemezekre 106/ml koncentrációban limfocitákat helyeztünk. A CD28 kostimulációhoz

500 ng/ml monoklonális CD28 antitestet használtunk (BD PharMingen, San Diego, CA).

A sejteket a kísérlettől függően 4, 12, 24 vagy 48 órán keresztül stimuláltuk.

B. Hisztidin dekarboxkáz génkiütött (HDC-KO) állat

A genetikailag módosított HDC-KO egértörzset intézetünkkel együttműködésben Ohtsu

és társai homológ rekombinációval hozták létre. A HDC-KO CD1 egereket kilenc

generáción keresztül kereszteztük BALB/C egértörzsbe [59]. Az állatokat intézetünk

állatházában SPF körülmények között tarottuk. Kísérletekeinkhez 8-10 hetes hím

egereket használtunk, melyek legalabb két héttel a kísérletek megkezdése előtt

hisztamin mentes tápot (Altromin Gmbh., Németország) kaptak. Mivel a hisztamin

termelésért felelős egyetlen enzim, a hisztidin dekarboxiláz nem működik az állatokban,

illetve a hisztamin-mentes diéta az exogén hisztamin bevitel lehetőségét is

megakadályozza, az állatok immunfolyamatai hisztamin mentesen zajlanak.

Kísérleteinkhez HDC-KO és vad típusú egerek lépéből izolált sejteket használtuk.

Bizonyos kísérletekhez az állatokat CFA-val oltottuk, majd kilenc nap elteltével

28

izoláltuk a lépsejteket. A sejteket RPMI 1640 komplett médiumban vettük fel 106

sejt/ml koncentrációban. A sejtek stimulálásához 2 μg/ml ConA-t használtunk.

C. Áramlási citometriás mérések

Az intracelluláris és mitokondrális Ca2+ koncentráció, NO termelés, ROI termelés,

mitokondriális membránpotenciál, intracelluláris IFN-γ, sejtfelszíni CD markerek

mérését áramlási citometriával végeztük, BD FACS Calibour készülékeken. A műszer

20mV argon lézerrel (emisszió maximum: 488 nm) és 16 mV hélium-neon lézerrel

(emisszió max.: 634 nm) van felszerelve. Az elpusztult sejteket és sejttörmelékeket a

vizsgálatból forward- és side scatter mintázatuk alapján kizártuk. Mérésenként 10.000

sejtet számoltunk meg, kivétel a gyors Ca2+ szignál mérés, ebben az esetben a mérési

idő a stimulációt követő 10 percig tartott.

Intracelluláris Ca2+ koncentráció mérés

A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció méréshez 1 μM Fluo-3-acetoxymthyl észter

(Molecular Probes) fluoreszcens festéket használtunk. A festék lipidoldékony, így a

sejtek könnyen felveszik. Miután a sejtekbe került, a citoplazmában lévő észterázok

hatására az észter csoport lehasad, miáltal vízoldékonnyá válik, így a sejtben marad. A

festékhez ilyen formában kötődik a Ca2+. A Ca2+-ot kötött festék fluoreszencia intezitása

sokszorosára fokozódik (excitációs hullámhossz maximuma: 506 nm, emissziós

hullámhossz maximuma: 526 nm) amit az áramlási citométer FL-1 csatornáján

detektálunk. T sejt aktiváció hatására kialakuló gyors Ca2+ szignál mérésénél a sejteket

25 percig inkubáltuk 37˚C-on 1 μM Fluo-3 festéket tartalmazó komplett RPMI 1600

médiumban, majd 3 percen keresztül mértük az alap fluoreszcencia intenzitást áramlási

citométeren. Ezután ConA-val, vagy CD3/28-al stimuláltuk a sejteket és további 10

percen át rögzítettük a fluoreszcencia intenzitást. Fenntartott Ca2+ szignált 4 órás, 24

órás és 48 órás stimuláció után mértünk.

A Ca2+ szignál gátlását a membrán permeábilis 2-ABP-t 10 μM és 1 mM

koncentrációkban teszteltük. Eredményes Ca2+ szignál gátlást 100 μM

végkoncentrációban kaptunk, így a kísérletek során ebben a koncentrációban használtuk.

29

Az egér limfocitákon végzett kísérletekben Ca2+ kelátor BAPTA-AM-el (Molecular

Probes) gátoltuk a Ca2+ szignált, 10 μM koncentrációban.

Mitokondriális membránpotenciál és tömeg mérés

A mitokondriális membránpotenciál mérésére a kationos lipidoldékony

tetramethylrhodamine-methylester-perchlorate (TMRM) fluoreszcens festéket

(excitációs hullámhossz 543 nm, emissziós hullámhossz 567 nm) használtunk 1 μM-os

koncentrációban (Molecular Probes). TMRM anélkül kötődik szelektíven az aktívan

működő mitokondrium membránhoz, hogy bármilyen citotoxikus hatást kifejtene. A

membránkötött forma fluoreszcencia intenzitása a mitokondriális membránpotenciállal

korrelál. Mérés megkezdése előtt a sejteket 15 percig inkubáltuk a festékkel 37˚C- os

CO2 termosztátban. Az áramlási citométer FL-2 csatornáján mért fluoreszcencia

intenzitás a mitokondriális membránpotenciállal korrelál.

A mitokondrium mennyiség meghatározásához membránpotenciáltól független

fluoreszcens festéket, nonyl acridine orange (NAO) használtunk 50 nM

végkoncentrációban. NAO a mitokondriumok kardiolipinjéhez kötődik függetlenül a

sejt energiaállapotától. Sejteket 15 percig inkubáltuk a festékkel 37˚C- os CO2

termosztátban, sötétben. A NAO excitációs hullámhossza 490 nm, emissziós

hullámhossza 540 nm, mely az áramlási citométer FL-1 csatornáján detektálható.

ROI termelés mérése

A reaktív oxigén intermedierek (ROI) termelésének mérésére hidroetidin (HE)

(Molecular Probes) oxidációra érzékeny fluoreszcens festéket használtunk. A sejtek 1

μM HE-el inkubáltuk 37˚C-os termosztátban 15 percig, majd áramlási citométerrel

megmértük a sejtek fluoreszcencia intenzitását (az oxidált HE emmissziós

hullámhossza: 605 nm; FL-2). A fluoreszcencia intenzitás a termelődött ROI

mennyiségével arányos. A ROI termelés gátlására illetve a T sejt aktivációra

bekövetkező ROI szignál gátlására szuperoxid-dizmutáz gátlót (superoxide dismutase

mimic manganese (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride) (MnTBAP) 300

μM-os koncentrációban használtunk.

30

NO termelés mérése

Limfociták NO termelésének méréséhez 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluoro-

fluorescein diacetát (DAF-FM) festéket használtunk (Molecular Probes). DAF-FM

passzív diffúzióval átjut a sejtmembránon, majd az intracelluláris észterázok

deacetilálják, így lipidoldékonyságát elveszti, a sejtből nem tud kijutni. A festék

fluoreszcens tulajdonságai megváltoznak mikor NO-hoz kötődik. NO kötődés hatására

benzotriazollá alakul, melynek excitációs hullámhossza 495 nm, emiszziós

hullámhossza 515 nm. A festék fluoreszcencia intenzitása arányos a sejt által termelt

NO koncentrációjával. A sejteket 2 órán keresztül inkubáltuk 1 μM DAF-FM festéket

tartalmazó komplett RPMI 1640 médiumban, 37˚C- on CO2 termosztátban.

Intracelluláris IFN-γ mérés és T sejt szubpopuláció meghatározás

A HDC-KO és a vad típusú egerek lépéből izolált sejteket 48 órán át 2 μg/ml ConA-val

stimuláltunk, majd GolgiPlug Protein Transpot inhibitorral (BD Biosciences) kezeltük 5

órán át 37˚C -os CO2 termosztátban. Ezután 0,5 μg/ml fluoreszcens festékkel konjugált

monoklonális antitesttel megfestettük a vizsgálni kívánt sejtfelszíni CD markerekkel, 30

percig 4˚C-on. Az antitestek a következők voltak: CD3-PE, CD8-PerCP, CD45-Per-CP

vagy CD25-PerCP-Cy5 (BD Biosciences). Mosási lépés után a sejteket fixáltuk és

permeabilizáltuk Fixation/permeabilization (BD Boisciences) oldattal 20 percig 4˚C-on.

Az újabb mosási lépés után (Perm/Wash Buffer BD Biosciences) 0,5 μg/ml FITC-el

konjugált monoklonális IFN-γ antitesttel (BD Biosciences) inkubáltuk 30 percig 4˚C-on,

sötétben. Végül a sejteket PBS-ben mostuk és analizáltuk három vagy négy csatornán az

előzőekben említett áramlási citométeren.

D. Western-blot módszer

NOS izoformák expresszióját humán perifériás limfocitákban Western-blot módszerrel

vizsgáltuk. A sejteket NOS szolubilizáló oldatban vettük fel, mely 10 mM HEPES-t (pH

7.4), 320 mM szacharózt, 100 μM EDTA-t, 1.5 mM DTT-t, 10 μg/ml leupeptint, 10

31

μg/ml aprotinint, 1 mg/ml PMSF-t, és 10 μM tetrahydrobiopterint tartalmazott. Ebben

az oldatban háromszori fagyasztás-olvasztás során lizáltuk a sejteket, majd 15000xg

sebességgel centrifugáltuk. A centrifugálás után a felülúszó proteinkoncentrációját

Bradford- módszerrel (Bio-Rad) határoztuk meg, majd 20 μg protein-lizátumot 7,5%

SDS- polyacrylamid gélen szétválasztottunk. A szétválasztás után a proteineket

nitrocellulóz membránra blottoltuk. A nitrocellulóz membránokat a három NOS

izoformának megfelelő monoklonális antitesttel detektáltuk, kontollként β-aktin ellenes

monoklonális antitestet használtunk. NOS izoformák detektálása ECL (Western

Lightning Chemiluminescence Reagent Plus; PerkinElmer) reagenssel, β-aktin

detektálása 4-chloronaphthol szubszráttal történt. Az egyes izoformák relatív

mennyiségét Kodak Image Station 440CF készüléken, Kodak 1D Image Analysis

software (Eastman Kodak) automatikus denzitometrás programjával határoztuk meg.

E. ELISPOT módszer

T sejteket egér lépszuszpenzióból negatív szelekcióval mágneses gyöngyökkel

(Miltenyi Biotech) szeparáltunk. 96 lyukú ELISPOT lemezt (MultiScreen; Millipore)

anti-IFN-γ, vagy anti-IL-10 vagy anti-IL-4 capture monoklonális antitestekkel (Duoset;

R&D Systems) inkubáltuk egy éjszakán át, majd 1% FCS-t tartalmazó PBS-el

blokkoltuk 1 órán át 37°C-on, CO2 termosztátban. Ezután helyeztük rá a szeparált

sejteket 105 sejt/lyuk koncentrációban, duplikátumban. A sejtek 2 μg/ml ConA- val

stimuláltuk, egyes kísérletekben a ConA- val történő stimulálással együtt NO donorral

60 μM [(Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate-

diethylenetriamine] (NOC-18) vagy NOS gátlószerekkel (600 μM 7-nitronidazolide

vagy 100 μM NG-mono-methyl – L-arginine) (Moleculáar Probes) is kezeltük a sejteket.

A stimuláció minden esetben 24 órán át tartott, 37°C-on, 5% CO2 termosztátban. Utána

a lemezeket PBS Tween-20-al 10-szer mostuk, majd streptavidin-HRP-vel konjgált

detektáló antitesttel inkubáltuk 1 órán át. Újabb 10 mosási lépés után hozzáadtuk a

kromogén szubsztrátot (aminoethyl carbazole és H2O2,Sigma-Aldrich), mellyel 20

percen át inkubáltuk, majd desztillált vízzel mostuk. A kiszáradt membránokon a spot-

számot ELISPOT reader (CTL) segítségével határoztuk meg.

32

F. Nitrit/nitrát mérés

A HDC-KO és vad típusú egerektől nyert szérumból nitrát/nitrit meghatározára High-

Sensity Nitrit Assay Kitet (Molecular probes) használtunk.

G. PCR alapú technikák

Reverz transzkritpáz PCR (RT-PCR)

Az RT-PCR vizsgálatokat CFA-val oltott HDC-KO és vad típusú egerek lépsejtjein

végeztük. A lépből teljes RNS-t preparáltuk TRI reagenssel (Sigma- Aldrich), majd

random hexamerekkel (Promega) cDNS-be írtuk át. Az RT-PCR reakció során a

következő primereket használtuk: egér IFN-γ szenz: CCT CAG ACT CTT TGA CT,

antiszenz primer: CAG CGA CTC CTT TTC CTC TT, (54°C, 35 ciklus); egér GADPH

szenz primer: CTG GTG CTG AGT ATG TCG TG, antiszenz primer: CAG TCT TCT

GAG TGG CAG TG (57°C, 30 ciklus). A PCR Perkin-Elmer thermal cycler készüléken

végeztük, a PCR terméket 3%-os agaróz gélen futtattuk.

Kvantitatív RT-PCR

T sejteket az egér lépszuszpenzióból negatív szelekcióval mágneses gyöngyök

segítségével (Miltenyi Biotech) szeparáltunk. Az így szeparált sejtekből RNS-t

prepaláltunk Rneasy Mini Kit (Qiagen) felhasználásával. A preparált RNS-t random

primerekkel (Promega) cDNS-be írtuk át. A NOS enzim mindhárom izoforma relatív

mennyiségének meghatározásához standard TaqMan real-time RT-PCR technikát

alkalmaztunk. A kvantitatív mérést ABI Prism 7000 Sequence Detector (Applied

Biosystems) készüléken mértük. A mennyiségi analízist a küszöbciklusok

összehasonlításával végeztük. A NOS enzimek mRNS-ének mennyiségét a mintákkal

párhuzamosan megmért hypxanthine phosphoribosyl transferase (HGPRT)

mennyiségének arányában adtuk meg.

33

H. Statisztikai elemzések

Az eredmények értékeléséhez Student t tesztet hasznaltunk, nem parametrikus eloszlást

mutató adatok esetén Mann-Whitney tesztet alkalmaztuk. Az eredményeket

szignifikánsnak tekintettük, ha p<0,05.

34

V. EREDMÉNYEK

A. Nitrogén-monoxid szerepének vizsgálata T limfociták

aktivációjában

Humán T limfociták CD3/CD28 antitesttel történő 4 órás és 24 órás stimuláció hatására:

• Ca2+ szignál (4 óránál 3,9 ± 0,75-szeres Ca2+cc. emelkedés p=0,001; 24 óránál

2.77+/-0.75-szeres Ca2+cc. emelkedés p= 0.0043 a nyugalmi szinthez képest)

• mitokondriális membránpotenciál szignál (4 óránál 1,73±0.44-szeres membrán-

potenciál emelkedés p=0,001; 24 óránál 1,53± 0.17-szeres membránpotenciál

emelkedés p=0,001 a nyugalmi szinthez képest)

• fokozott ROI termelés (4 óránál 1,53±0.36-szoros emelkedés p= 0.002; 24 óránál

4.57±1.75-szeres emelkedés p= 0.001 a nyugalmi szinthez képest)

• illetve ezekkel a folyamtokkal párhuzamosan NO szignál (4 óránál 6.09±2.98-szeres

p= 0.001; 24 óránál 4.9±1.8-szeres emelkedés) mérhető (7. ábra).

35

7. Ábra: A humán perifériás limfociták CD3/CD28 antitesttel történő stimuláció hatására bekövetkező citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitokondriális membránpotenciál és nitrogén monoxid termelés változásának mérése áramlási citometriás módszerrel (n=6) .

IP3 receptor antagonista hatása T limfocita aktivációra

Jól ismert hogy TCR aktiváció során keletkező inozitol-1,4,5-tiszfoszfát (IP3)

intracelluláris receptorhoz (IP3R) történő kapcsolódása az endoplazmatikus retikulum

raktáraiból Ca2+ felszabadulást eredményez, ami fontos része a T sejt aktiváció hatására

bekövetkező Ca2+ szignálnak. Ezért megvizsgáltuk, hogy a membrán permeábilis IP3

receptor antagonista 2-aminoetoxidifenil borát (2-APB) hogyan befolyásolja a fent leírt

szignálfolyamatokat. Azt találtuk, hogy a 2-APB csökkenti a CD3/CD28 kostimulációra

fellépő Ca2+ szignált, NO szignált, továbbá csökkenti a mitokondriális hiperpolarizáció

mértékét, illetve csökkent ROI termelést is eredményez.

DAF-FM

266

DAF-FM

283

DAF-FM

50

497

788

952

965

115

358

Fluo3 Fluo3 Fluo3

CD3/CD28 24óra CD3/CD28 4 óra Kontroll

NITROGÉN MONOXID NITROGÉN MONOXID NITROGÉN MONOXID

36

Szuperoxid dizmutáz hatása a T limfocita aktivációra

A szuperoxid dizmutáz (MnTBAP) jelentősen csökkentette a CD3/CD28 stimulációra

fellépő ROI szignált, hatására kis mértékben csökken a Ca2+- és NO jel.

NO kelátor hatása a T limfocita aktivációra

A specifikus NO kelátor carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid (C-

PTIO) viszont gátolja a CD3/CD28 kostimulációra fellépő intracelluláris Ca2+ szignált,

mitokondriális hiperpolarizációt, a ROI szignált és természetesen a NO szignált is. (8.

ábra)

8. Ábra: A humán perifériás limfocitákban CD3/CD28 + NO kelátor C-PTIO kezelés hatására bekövetkező citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitkondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelés mérése áramlási citometriás módszerrel. (n=9)

NITROGÉN MONOXID NITROGÉN MONOXID

Kontroll CD3/CD28 4 óra

C-PTIO CD3/CD28 20 perc

C-PTIO

37

Thapsigargin, ionomycin hatása a T limfocita aktivációra

Mivel a CD3/CD28 kostimuláció hatására létrejövő mitokondriális hiperpolarizáció

gátolható 2-ABP-vel és C-PTIO-val, ezért megvizsgáltuk hogy az intracelluláris Ca2+

emelkedés önmagában hogyan hat a mitokondriális folyamatokra. Humán perifériás

limfocitákat Ca2+ ATPáz gátló thapsigarginnal illetve kalcium ionofor ionomycinnel

kezelve TCR aktivációtól független intracellulális Ca2+ koncentráció emelkedés jön

létre. Eredményeink szerint sem a thapsigargin sem az ionomycin hatására létrejövő

Ca2+ koncentráció emelkedés nem okoz mitokondriális memránpotenciál változást és

NO szignált, önmagában tehát nem elégséges a hatásos T sejt aktivációhoz (9.A, B.

ábra).

9A. Ábra: Ionomycin hatása a humán perifériás limfociták citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, a mitokondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelés változására. A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják. (n=9)

38

9B. Ábra: Thapsigargin hatása a humán perifériás limfociták citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitokondriális membránpotenciál és nitrogén monoxid termelésre. . A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják (n=9).

NO-donor hatása a T limfociták aktivációjára

A NO mitokondriális membránpotenciálra kifejtett hatásának vizsgálatához humán

perifériás limfocitákat NO donor - NOC-18 – molekulával kezeltünk. 60 μM NOC-18

hatására intracelluláris NO termelés figyelhető meg, mely a kezelést követő 4 óra múlva

3,13±0,8-szoros (p=0,04), 24 óra múlva pedig 3,7±0,6-szeres (p=0,003) emelkedést

mutat, a sejtek életképességét nem befolyásolva. Kísérleteink során azt találtuk, hogy 24

órán át 60 μM NOC-18-al történő kezelés hatására a limfociták mitokondriális

membránpotenciálja 3,5± 0,79-szörösére emelkedik (p=0,002). Ezzel párhuzamosan,

emelkedett intracelluláris, Ca2+ koncentrációt és ROI szintet mértünk (10. ábra).

39

10. Ábra: A NO donor (NOC-18) hatása a humán perifériás limfociták a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, a mitkondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelésre. A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják. (n=9)

NOS izoformák detektálása

Eredményeink szerint tehát NO szükséges a fiziológiás T sejt aktivációhoz,

megvizsgáltuk tehát milyen NOS izoforma felelős a megnövekedett NO termelésért.

Western-blot analízissel azt találtuk hogy humán perifériás limfocitákban eNOS és

nNOS izoforma expresszálódik. Ezen izoformák szintje 15-szörösére növekszik 24 órás

CD3/CD28 antitestekkel történő aktiváció során. Az iNOS izoforma nem detektálható

limfocitákban, még CD3/CD28 stimuláció hatására sem. (11.A és 11.B ábra) Az eNOS

és nNOS expresszió mértéke ugyanakkor fokozható 4 órán át 100 μM H2O2 –dal történő

kezeléssel.

40

11.A. Ábra: Humán perifériás T sejtek eNOS és nNOS proteinszintek változása 4 órás és

24 órás CD3/CD28 kostimulációra illetve 100 μM H2O2 hatására, Wsterd-blot

mószerrel. Konrollként aktint használtunk. A számok az aktinra normalizált

denzitometriás értékek.

41

11.B. Ábra: Humán perifériás T sejtek iNOS protein expressziója. CC: porcsejt mint

pozitív kontroll, C: stimulálatlan sejtek, S: 24 órás CD3/CD28 kostimuláció.

42

B. HDC-KO egér eltérő citokintermelése

Munkánk során összehasonlítottuk a HDC-KO és vad típusú egerek lépsejtjeinek ConA

stimulációra bekövetkező citokintermelését. Megmértük az IFN-γ, IL-4, IL-10 proteinek

szintjét. Eredményeink szerint a HDC-KO állat lépsejtjei több IFN-γ-t termelnek mind

mRNS mind protein szinten a vad típusú állatokéhoz képest. Az IL-4, IL-10 proteinek

szintjében nem találtunk szignifikáns különbséget (12.A. és B. ábra).

12.A. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat lépsejtjeiből készült reprezentatív interferon-γ

RT-PCR. (n=3)

HDC-KO

interferon-γ

GADPH

VAD TÍPUS

43

12.B. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat lépsejtjeiből készült interferon-γ ELISPOT.

(n=6)

Intracelluláris áramlási citometriás módszerrel megnéztük hogy az IFN-γ melyik T sejt

szubpopulációban mutat eltérést. Azt találtuk hogy a CD4 pozitív, CD8 pozitív, CD45

pozitív és CD4/CD25 kettős pozitív alpopulációkban nincs különbség a HDC-KO és

vad egerek limfocitáinak intracelluláris IFN-γ mennyiségében, valószínűleg a

megváltozott IFN-γ termelésért a teljes T sejt populáció eltolódása felelős (nem

ábrázoltuk).

0

1

2

3 p=0.001 Rel. spot szám

VAD TÍPUS HCD-KO

44

C. Hisztamin hatása a limfociták nitrogén-monoxid

termlésére

Előző eredményeinkből ismert hogy a NO fontos szerepet játszik a T sejt aktivációban

és érésben, megmértük tehát a limfociták NO termelését. A T limfociták NO termelése

szignifikánsan különbözött a HDC-KO és a vad típusú egerek limfocitáiban. A HDC-

KO egér sejtjei 2,5-ször több NO termelnek (p=0,0009) mint a vad típusú egerek

limfocitái. A ConA stimuláció hatására bekövetkező NO szignál is nagyobb mértékű a

HDC-KO egerek limfocitáiban.(13.A. és B. ábra)

13.A. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak NO termelése. (n= 9)

0

1

2

3

p=0.0009

VAD típus HDC-KO

Rel. DAF-FM fluoresc. int.

(NO)

45

13.B. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációra bekövetkező

NO szignálja.(n=6)

A következőkben vizsgáltuk melyik NOS izoforma expresszálódik a CD3 pozitív

limfocitákban. Azt találtuk hogy mindhárom NOS izoforma (eNOS, nNOS, és iNOS)

mRNS-e megtalálható a limfocitákban, legnagyobb mértékű expressziót azonban a

nNOS mutat. Mindhárom izoforma nagyobb mennyiségben expresszálódik a HDC-KO

egerekből származó limfocitában, bár külön-külön vizsgálva az izoformákat nem

kaptunk szignifikáns különbséget.

Mivel a hisztamin hiányos állat limfocitái több NO-t termelnek és a ConA stimunációra

adott NO szignál is eltér a vad típusú állatokéhoz képest, megvizsgáltuk hogy a

hisztamin hogyan befolyásolja a limfociták NO termelését. Azt az eredményt kaptuk,

hogy mind a vad mind a HDC-KO limfociták NO termelése szignifikánsan csökkent, ha

a 24 órás ConA stimuláció 10-6 M hisztamin jelenlétében történt (p=0,004 HDC-KO

egérben, p=0,001 vad típus esetén).

A NO féléletideje nagyon rövid, stabil végtermékei a nitrit és nitrát. Az egerek

szérumának nitrit és nitrát szintjét megmértük, eredményünk szerint nincs szignifikáns

különbség a HDC-KO és vad típusú egerek szérum nitrit és nitrát szinjében.

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 óra 4 óra 24 óra idő

HDC KO

VAD típus

p=0.00086

p=0.00024

p=0.093

Rel. DAF-FM fluoresc. int.

46

D. Eltérő T limfocita aktiváció a HDC-KO egerekben

Előző munkánk eredményeiből ismert hogy T sejt aktiváció hatására Ca2+ szignál,

mitokondriális membránpotenciál szignál és ROI szignál mérhető, melyeket a NO

befolyásol. A HDC-KO egerek limfocitáiban a T sejt aktivációra bekövetkező gyors

Ca2+ szignál eltér a vad típusétól. Eredményeink szerint mind a nyugalmi, mind a ConA

stimuláció hatására bekövetkező gyors Ca2+ szignál szignifikánsan magasabb volt a

génkiütött állat limfocitáiban (p=0,02; p=0,04), bár a ConA hatására létrejövő gyors

Ca2+ szignál változásban (ΔCa2+) és a fenntartott Ca2+ szignálban nem találtunk

különbséget (14. Ábra).

14. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációjára bekövetkező

gyors Ca2+ szignál.(n=3)

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vad típus

HDC KO

perc

ConA stimuláció

p=0.02

p=0.04 p=0.05

p=0.03

p=0.02 p=0.04

Rel. Fluo-3 fluoresc. int.

47

Mivel a HDC-KO egerek limfocitái szignifikánsan több NO-t termelnek, megvizsgáltuk

hogy a fokozott NO termelés hogyan befolyásolja a mitokondrium biogenezist. Azt

találtuk hogy a mitokondriális membránpotenciál nem különbözik a két állat

limfocitáiban. A ConA hatására létrejövő ROI szignál viszont 24 órás stimuláció után

szignifikánsan kisebb volt a HDC-KO egerek limfocitáiban.

48

E. Nitrogén-monoxid hatása az IFN-γ termelésre

Az eddig bemutatott eredmények szerint a HDC-KO egér limfocitái több IFN-γ –t

termelnek, ami együtt jár fokozott NO termeléssel is. Ismert, hogy a NO transzkripciós

szinten befolyásolja a citokinek termelését, ezért megvizsgáltuk hogyan hat a limfociták

IFN-γ termelésére. Vad típusú egerek limfocitáit ConA-val stimuláltuk NO donor (60

μM NOC-18) jelenlétében és jelenléte nélkül. ELISPOT módszerrel összehasonlítottuk

a NO donorral és az NO donor nélkül 24 órán át stimulált IFN-γ-t termelő sejetek

számát. Azt találtuk hogy 60 μM NOC-18 hatására az IFN-γ-t termelő sejtek száma

szignifikánsan megnő (p=0,0002) (15. ábra).

15. Ábra: Vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációra illetve ConA + 60 μM

NOC-18 (NO donor) hatására bekövetkező INF-γ termelő sejtek relatív mennyisége,

ELISPOT módszerrel mérve.(n=6)

0,4

0,8

1,2

1,6 p=0.0002

ConA 24 óra ConA + 60μM NOC-18 24h

Rel. spot szám

49

Megmértük a sejtek IFN-γ termlését NOS inhibitorokkal történő kezelés után is. Kétféle

NOS gátlót alkalmaztunk (600 μM 7-nitronidazolide és 100 μM NG-mono-methyl – L-

arginine), mindkettőt olyan koncentrációban hogy mindhárom NOS izoformát gátolja.

Eredményeink szerint a NOS gátlóval történt kezelés szignifikánsan csökkentette a

sejtek IFN-γ termelését (p=0,01 és p=0,002) (16. ábra).

16. Ábra: Reprezentatív ELISPOT ábra a vad típusú állat limfocitáinak ConA

stimulációra illetve ConA + nitronidazole vagy ConA + monomethyl- L-arginine (NOS

gátlók) hatására bekövetkező INF-γ termeléséről. (n=6)

10-6 M hisztaminnal történt kezelés a limfociták IFN-γ termelését nem befolyásolta,

szignifikánsan csökkentette viszont a NO termelésüket. A HDC-KO egér limfocitái

hisztamin hiányában több NO-t termelnek, a fokozott NO termelés pedig befolyásolja a

sejtek IFN-γ termelését. Így eredényeink szerint elmondható hogy a hisztamin a NO

termelés befolyásolásával is szerepet játszik a T sejt citokintermelés szabályozásában.

Nem stimulált ConA stimuláció ConA + 600 μM 7-nitronidazole stimuláció

ConA + 100 μM NG-Monomethyl-L-arginine

stimuláció

p=0,01

p=0,002

50

V I. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

A T sejt receptor (TCR) aktiváció ZAP-70 protein aktiválódásához vezet, mely felelős a

LAT foszforilációért aminek hatására a kialakuló aktivált PLCγ1 katalizálja az inozitol

1,4,5-trifoszfát (IP3) és diacilglicerol (DAG) keletkezését. Az IP3 továbbiakban a

citoplasmatikus Ca2+ szignálért, a DAG a protein kináz-C (PKC) aktivációért felelős

[ 60 ](1. ábra). A citoplazmatikus Ca2+ szignál korai jele a T sejt aktivációnak és

nélkülözhetetlen a transzkripciós faktorok (NF-AT) aktiválódásában. A TCR stimuláció

után perceken belül regisztrálható a gyors citoplazmatikus Ca2+ szignál, mely 5-10

percen át tart, illetve TCR aktiváció után 24-48 óra múlva a nyugalmi állapothoz képest

emelkedett Ca2+ koncentráció mérhető [61]. A tartósan emelkedett Ca2+ szignál a T sejt

proliferáció és differenciálódás jele.

Megfelelő antigénepitóppal történő találkozás során a T limfocita tehát nyugvó

állapotából egy nagyobb energiaigényű, aktivált állapotba kerül. A megnövekedett

energiaszükségletet a sejt fokozott ATP termeléssel biztosítja, aminek egyrészt fokozott

glukóz felhasználás, másrészt fokozott mitokondriális működés a következménye

[62;63]. Mitokondriális hiperpolarizáció ismert korai jele a T sejt aktivációnak [64].

Oxidatív foszforiláció során az elektronok egy része az oxigénnel direkt módon

reakcióba lép, ROI képződik. Több tanulmány is foglalkozik a T limfociták aktivációja

során keletkező ROI szignál jelentőségével [39; 40], ugyanakkor a fokozott ROI

termeléshez vezető útvonal kevésbé tisztázott. Egyik elmélet szerint a T sejt aktivációra

bekövetkező ROI szignálért a mitokondriumok fokozott oxidatív foszforilációs

tevékenysége tehető felelőssé. Ezt támasztja alá az az eredmény, miszerint a

mitokondrium elektrontranszportlánc I. komplexét gátolva – mely a ROI termelésben

részt vesz - TCR stimuláció indukálta ROI szignál nem jön létre [41]. Saját

eredményeink szerint a CD3/CD28 aktivációra fellépő ROI szignál kismértékben

csökkenthető ha a stimulációval párhuzamosan IP3 receptor antagonista 2-

aminoetoxidifenil boráttal (2-APB) is kezeltük a sejteket. Tehát a TCR felől érkező

szignálfolyamatok befolyással vannak a ROI szignál mértékére. Újabb irodalmi adatok

szerint ZAP-70, LAT, PLCγ1 deficiens sejtvonalon TCR aktiváció indukálta ROI

szignál nem váltható ki. Abban az esetben, ha limfociták intracelluláris Ca2+

51

koncentráció emelkedését tapsigarginnal vagy ionomycinnel idéztük elő, nem jött létre

ROI szignál. Ez az eredmény azt mutatja, hogy Ca2+ szignál önmagában nem elégséges

a ROI termelés kiváltásához. Mások eredményei szerint a TCR stimuláció során

aktiválódó PKC útvonal viszont jelentős szerepet tölt be a ROI szignál kialakulásában, a

PKC Ca2+ szignáltól független aktivációja során ugyanis kiváltható ROI szignál a T

limfocitákban [41].

Saját és irodalmi adatok alapján elmondhatjuk, hogy TCR stimuláció hatására kialakuló

ROI szignál és a fokozott mitokondrium működés szoros kapcsolatban áll. Az utóbbi

években a NO mitokondrium működés szabályozásában betöltött fiziológiás szerepének

egyre bővülő irodalma van [19]. Saját eredményeink szerint humán limfociták eNOS-t

és nNOS-t expresszálnak, iNOS izoformát nem. Az irodalomból ismert, hogy ezen

konstitutív NOS izoformák szabályozása Ca2+-calmodulin szignálon keresztül történik.

Érdekes módon eredményeink szerint az eNOS, nNOS proteinek szintje a humán T

sejtek 24 órás CD3/CD28 stimulálása során többszörösére fokozódott, ami ezeknek az

izoformáknak transzkripciós szinten történő szabályozását mutatja. Az iNOS izoformát

viszont a T limfociták aktivációja során sem tudtuk detektálni Western-bolt módszerrel.

Ugyancsak többszörösére fokozza az eNOS és nNOS expressziót, ha a sejteket 100 μM

H2O 2-vel kezeltük.

Megmérve a limfociták NO termelését, azt találtuk hogy TCR stimuláció hatására NO

szignál detektálható, mely a csúcsát 24 órás stimulációnál éri el és párhuzamos a

mitokokndriális hiperpolarizációval és a ROI szignállal. Részletesebben megvizsgálva a

NO mitokondriális és oxidatív folyamatokra kifejtett hatását T limfociták aktivációja

során, NO kelátor C-PTIO-t adtunk a sejtekhez. A NO gátlása során nem jön létre a T

sejt aktivációra jellemző Ca2+ szignál, ROI szignál és a mitokondriális változások.

Abban az esetben viszont, ha NO donorral kezeljük a sejteket, kialakul egy

sejtpopuláció melyben Ca2+ szignál, NO szignál és mitokondriális hiperoplarizáció

illetve ROI szignál mérhető.

52

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TCR stimuláció hatására fellépő NO szignál

nélkülözhetetlen része a hatékony T sejt aktivációnak és szoros összefüggésben áll a

mitokondriális és oxidatív szignáltranszdukciós folyamatokkal (17 ábra).

17. Ábra. Sematikus ábra a NO T sejt aktivációban betöltött szerepéről.

T sejt aktiváció

Ca2+ szignál

NO szintézis

Emelkedett O2-

eNOS mitokondriumból T sejt szinapsziba

történő transzlokációja

SejthalálSejt túlélés

H2O2 MMaaggaass cccc..NNOO Szuperoxid dizmutáz

AAllaaccssoonnyy cccc..NNOO iNOS

Emelkedett O2-

OONO

AG

Monocita / Dendritikus sejt

TT sseejjtt NNOO NNOO

CD 80

CD 28

NNOO

NNOO

NNOO

Mitokondriális hiperpolarizáció és

bioszintézis

Mitokondriális hiperpolarizáció és

bioszintézis

transzkripció és protein szintézis

(IL-2)

53

Az irodalomban szintén jól ismert, hogy a hisztaminnak fontos szerepe van T limfociták

aktivációjában és érésében. A hisztamin immunfolyamatok szabályozásában betöltött

szerepének vizsgálatához jó modell a hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC-KO)

egérmodell, mivel hisztamin termelésért csak a HDC enzim felelős. Abban az esetben

ha az állatokat hisztamin mentes diétán tartjuk, az immunfolyamatok in vivo hiszatamin

mentesen zajlanak. Laboratóriumunk előző eredményeiből ismert hogy a HDC-KO

egerek lépéből szeparált dendritikus sejtek fokozott antigénprezentáló képességgel

rendelkeznek illetve LPS stimulációt követően szignifikánsan több IFNγ-t és IL-12-t

termelnek [65]. Ezek az eredmények alátámasztják azt az irodalmi adatot miszerint a

hisztamin a naiv Th sejtek Th2 sejtekké történő differenciálódásában játszik szerepet.

Ugyanakkor az is ismert, hogy alacsony koncentrációjú NO a naiv Th sejtek Th1

irányban történő érését segíti elő. A NO cGMP útvonalat befolyásoló hatása révén

fokozza a naiv Th sejtek IL-12 receptor β2 (IL-12Rβ2) sejtfelszíni expresszióját, de

nincs hatással az IL-4 receptor expresszió mértékére [66]. Saját eredményeink szerint a

HDC-KO egerek limfocitái szignifikánsan több INF-γ-t termelnek mind mRNS, mind

protein szinten. Az IL-10 és IL-4 citokinek termelésében nem találtunk különbséget. A

fokozott IFN-γ termelésért a T sejt szubpopulációk eltolódása tehető felelőssé, mivel az

intracelluláris IFN-γ mennyiség nem különbözik a CD4, CD8, CD45 és CD4/CD25

pozitív szubpopulációkban. Ezek az eredmények is azt mutatják, hogy a HDC-KO egér

immunválasza hiszamin hiány következtében Th1 irányba tolódik el.

Kíváncsiak voltunk arra, hogy a HDC-KO állat Th1 irányban eltolt immunválaszában

szerepet játszik-e a NO, ezért megmértük a limfociták NO termelését. HDC-KO egér

lépéből szeparált T sejtek 2,5-ször több NO-t termelnek a vad típusú egér limfocitáihoz

képest. Ezenkívül a HDC-KO egerek limfocitái ConA stimuláció hatására fokozott NO

szignállal válaszolnak. Tovább vizsgálva a hisztamin NO termelésre kifejtett hatását, azt

találtuk, hogy mind a vad, mind a HDC-KO limfociták NO termelése csökkenthető

hisztaminnal történő kezeléssel.

Mivel a hisztaminkezelés nem befolyásolta a sejtek IFN-γ termelését, megvizsgáltuk a

NO termelés hogyan hat a limfociták citokintermelésére. Azt az eredményt kaptuk,

hogy NO donor hatására a sejtek IFN-γ termelése szignifikánsan nagyobb a kontroll,

54

csak ConA-val stimulált sejtekhez képest. Abban az estben viszont, ha a sejteket ConA

stimulációval párhuzamosan NOS inhibitorral kezeltük, az IFN-γ termelés

szignifikánsan csökkenthető volt. Ezen eredményeink szerint elmondhatjuk, hogy a

hisztamin irodalomból ismert citokintermelésre gyakorolt direkt hatásán túl, a NO

termelés befolyásolása révén is részt vesz a T sejt citokintermelés szabályozásában (18.

ábra).

55

18. Ábra. Sematikus ábra a hisztamin és a NO szerepéről a T helper sejtek érésében.

STAT1

Ca2+ szignál

TCR

Antigén

MHC

PKC

T-bet

IFN-γ

cAMP

IL-2

GATA3 IL-4 IL-13

IL-5

p38 MAPK PKA

H2R

IL-4R

IL-4 STAT6

IL-12

IL-12

NOS

IL-12R

ROI

-

-

56

VII. ÖSSZEFOGLALÁS

T limfociták aktivációjában, proliferációjában illetve a programozott

sejthalálban a mitokondriális membránpotenciál illetve reaktív oxigén intermedierek

(ROI) termelődése fontos szerepet játszik. A mitokondriális hiperpolarizáció egyik korai,

reverzibilis jele a T sejt aktivációnak. Munkánk során vizsgáltuk a humán T limfociták

CD3/CD28 kostimulációra bekövetkező citoplazmatikus és mitokondriális Ca2+ szignált,

a ROI és nitrogén-monoxid (NO) termelést illetve a mitokondriális membránpotenciál

változás mértékét. Abban az esetben, ha inozitol 1,4,5-trifoszfát receptor (IP3R)

antagonistával vagy a szuperoxid dizmutáz hatását utánzó szerrel kezeltük a sejteket a

citoplazmatikus Ca2+ szignál, a ROI szignál és a NO szignál mértéke csökkent.

Specifikus NO kelátorral történő kezelés hatására viszont a stimulált sejtekben nemcsak

az előbb említett szignálok mértéke csökkent, hanem a mitokondriális hiperpolarizáció

is gátolható volt. Ugyanakkor NO donor hatására ROI szignál, Ca2+ szignál, átmeneti

ATP depléció és markáns mitokondriális hiperpolarizáció detektálható. Az önmagában

adott ionomycinnel vagy thapsigarginnal létrehozott Ca2+ koncentráció emelkedés

azonban nem járt együtt sem a NO termelés fokozódásával, mitokondriális

membránpotenciál változással, sem a ROI szignállal. Western-blot analízissel humán

perifériás limfocitákban a NO szintetáz enzim (NOS) izoformái közül az endotheliális

és a neuronális izoformákat lehetett detektálni, ezekből a sejtekből hiányzik a Ca2+-

független indukálható NOS izoforma. CD3/CD28 kostimuláció hatására az eNOS és

nNOS izoformák expressziója többszörösére fokozódik. Eredményeink azt mutatják,

hogy a T limfociták aktivációja során bekövetkező mitokondriális hiperpolarizációban

és az oxidatív szignálfolyamatokban a Ca2+ -függő NO termelésnek fontos szerepe van.

Munkánk során szintén vizsgáltuk a hisztamin T sejt aktivációban és

citokintermelés befolyásolásában betöltött szerepét hisztidin dekarboxiláz génkiütött

(HDC-KO) és vad típusú állatmodellen. Eredményeink szerint hisztamin hiányában a

HDC-KO egerek lépsejtjeinek interferon-γ (IFN-γ) termelése mind protein, mind mRNS

szinten szignifikánsan nagyobb mértékű. A sejtek fokozott IFN-γ termelése ugyanakkor

fokozott NO termeléssel társul. Eredményeink szerint hisztaminnal történő kezelés a

limfociták NO termelését csökkenti mind a HDC-KO mind a vad típusú egérben. NO

donor hatására viszont a limfociták fokozott IFN-γ termeléssel válaszoknak, míg NOS

57

gátlószerek, (NG-monomethyl-L-arginine és nitronidazole) hatására a sejtek

szignifikánsan kevesebb IFN-γ-t termelnek, mely a NO IFN-γ termelés szabályozásában

betöltött szerepére utal. Eredményeink szerint tehát a hisztamin T limfocitákra

gyakorolt direkt hatásán túl, az NO termelés befolyásolása révén is szabályozza a T

sejtek citokintermelését és jelátviteli folyamatait.

58

VIII. SUMMARY

Activation, proliferation, or programmed cell death of T lymphocytes is

regulated by the mitochondrial transmembrane potential through controlling ATP

synthesis, production of reactive oxygen intermediates (ROI). Mitochondrial

hyperpolarization is an early and reversible event associated with T cell activation.

CD3/CD28 costimulation of human PBL elevated cytoplasmic and mitochondrial Ca2+

levels, ROI production, and NO production, and elicited mitochondrial

hyperpolarization. Although T cell activation-induced Ca2+ release, ROI levels, and NO

production were diminished by inositol 1,4,5-triphosphate receptor antagonist,

superoxide dismutase mimic and NO chelator, mitochondrial hyperpolarization was

selectively inhibited by NO chelator. Moreover, NO precursor NOC-18 elicited NO and

ROI production, Ca2+ release, transient ATP depletion, and robust mitochondrial

hyperpolarization. Ca2+ influx by ionomycin or Ca2+ release from intracellular stores by

thapsigargin alone failed to induce NO synthase expression, NO production, or

mitochondrial membrane potential elevation. Western blot analysis revealed expression

of Ca-dependent endothelial NO synthase and neuronal NO synthase isoforms and

absence of Ca-independent inducible NO synthase in PBL. CD3/CD28 costimulation

elicited severalfold elevations of endothelial NO synthase and neuronal NO synthase

expression.. The results suggest that T cell activation-induced mitochondrial

hyperpolarization is mediated by ROI- and Ca2+ dependent NO production.

In order to study the role of histamine in T cell activation, we investigated

cytokine production and T cell signal transduction in HDC-KO and wild type mice. In

the absence of histamine, an elevated INF-γ mRNA and protein levels of splenocytes

were associated with a markedly increased NO production, compared to wild type

animals. Furthermore, histamine treatment decreased the NO production of splenocytes

from both wild type and HDC-KO mice. NO precursor NOC-18 elicited IFN-γ

production, while NO synthase inhibitors, NG-monomethyl-L-arginine and nitronidazole

both inhibited IFN-γ production, suggesting the role of NO in regulating IFN-γ

synthesis. Our present data indicate that in addition to its direct effects on T lymphocyte

function, histamine regulates cytokine production and T cell signal transduction through

regulating NO production.

59

IX. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA

Ph.D. értekezés témájában megjelent publikációk

Koncz A, Pasztoi M, Mazan M, Fazakas F, Buzas E, Falus A, Nagy G. Nitric oxide

mediates T cell cytokine production and signal transduction in histidine dexarboxylase

knockout mice. J Immunol 2007 Nov. 15;179(10):6613-9. IF: 6,3

Nagy G, Koncz A, Fernandez D, Perl A.Nitric oxide, mitochondrial hyperpolarization,

and T cell activation. Free Radic Biol Med. 2007 Jun 1; 42(11): 1625-31. IF:5,4

Nagy G, Koncz A, Perl A Mitochondrial T cell signal transduction abnormalities in

systemic lupus erythematosus Curr Immunol Rev 2005, 1, 62-68.

Perl A, Gergely P Jr, Nagy G, Koncz A, Banki K. Mitochondrial hypepolarization: a

checkpoint of T-cell life, death and autoimmunoty. Trends Immunol 2004, 25, 360-7.

IF:13,1

Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation induced mitochondrial hyperpolarization is

mediated by Ca2+ and redox dependent production of nitric oxide. J Immunol 2003,

171, 5188-97. IF: 6,7

A Ph.D. értekezés témájában megjelent közlemények összesített impakt faktora: 31,5

Ph.D. értekezés témájához nem kapcsolódó publikációk

Nagy G, Ward J, Mosser DD, Koncz A, Gergely P Jr, Stancato C, Qian Y, Fernandez D,

Niland B, Grossman CE, Telarico T, Banki K, Perl A.Regulation of CD4 expression via

recycling by HRES-1/RAB4 controls susceptibility to HIV infection. J Biol Chem.

2006 Nov 10; 281(45):34574-91 IF: 5,8

60

Nagy G, Koncz A, Perl A. T- and B-cell abnormalities in systemic lupus

erythematosus. Crit Rev Immunol. 2005, 25(2),123-40. IF: 3,2

Gergely P Jr, Pullmann R, Stancato C, Otvos L Jr, Koncz A, Blazsek A, Poor G, Brown

KE, Phillips PE, Perl A. Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and

cross-reactivity with immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous

retroviral autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus.Clin Immunol.

2005 Aug;116(2):124-34. IF: 3,2

Nagy G, Clark J M, Buzas E, Gorman C, Pasztoi M, Koncz A, Falus A and Cope A P.

Nirtic oxide production of T lymphocytes is increased in rheumatoid arthritis.

Immunology Letters 2008 in press. IF: 2,3

Koncz A, Nagy G, Perl A. Nitrogén monoxid függő mitokondrium bioszintézis

systemas lupus erythematosusban Klinikai és kísérletes laboratóriumi medicina 2005.

szeptember

Nagy G, Géher P, Koncz A, Perl As. Jelátviteli defektusok systemás lupus

erythematosusban. Orvosi Hetilap. 2005 Jul 31.

Kumulatív impakt faktor: 46

61

X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönettel és hálával tartozom Falus András Professzor Úrnak és Dr. Buzás Editnek,

amiért lehetőséget adtak munkatervem és kísérleteim megvalósítására és mindenben

támogatták munkámat. Kutatómunkával a syracues-i egyetemen a Perl András

Professzor Úr által vezetett laboratóriumban ismerkedtem meg, köszönettel tartozom

azért, hogy számos laboratóriumi módszer elsajátításában segítséget és lehetőséget

kaptam tőle. Szintén ezúton szeretném megköszönni a Heim Pál Gyermekkórházban

dolgozó munkatársaimnak hogy türelmükkel és megértésükkel támogatták Ph.D.

munkám befejezését, Simonné Sebestyén Piroskának pedig külön köszönetet szeretnék

mondani bíztatásáért és lelkesítéséért.

Szerencsésnek érzem magam, hogy férjemmel, Nagy Györggyel együtt dolgozhattam. A

közösen végzett munka általa történő szakmai, szellemi irányítása nagymértékben

elősegítette fejlődésemet és fontos részét képezi Ph.D. munkámnak. Köszönet illeti

azért is, mert családfőként lehetőséget biztosított munkám végzéséhez és a legnehezebb

pillanatokban is mellettem állt, támogatására folyamatosan számíthattam.

Szeretnék köszönetet mondani Édesanyámnak is, aki gondoskodásával, szeretetével és

állandó segítőkészségével járult hozzá munkám eredményességéhez.

62

XI. IRODALOMI JEGYZÉK

1 . Falus A, Buzás E, Rajnavölgyi É. Az immunológia alapjai. Semmelweis

Kiadó 2007

2. Wange, R. L., and L. E. Samelson. Complex complexes: signaling at the TCR.

Immunity 1996. 5:197-205

3. Weiss, A., and D. R. Littman. Signal transduction by lymphocyte antigen

receptors. Cell 1994. 76:263-274.

4. Dustin, M. L., and J. A. Cooper. The immunological synapse and the actin

cytoskeleton: molecular hardware for T cell signaling. Nat. Immunol. 2000. 11:23

5. Bromley, S. K., W. R. Burack, K. G. Johnson, K. Somersalo, T. N. Sims, C.

Sumen, M. M. Davis, A. S. Shaw, P. M. Allen, and M. L. Dustin. The immunological

synapse. Annu. Rev. Immunol. 2001. 19:375

6. Grakoui A, Bromley SK, Sumen C, Davis MM, Shaw AS, Allen PM, Dustin

ML. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.

Science 1999;285:221–227.

7. Ibiza S, Victor VM, Bosca I, Ortega A, Urzainqui A, O'Connor JE, Sanchez-

Madrid F, Esplugues JV, Serrador JM. Endothelial nitric oxide synthase regulates T cell

receptor signaling at the immunological synapse. Immunity 2006;24:753–765

8. Vincenzo Di Bartolo1 Benjamin Montagne, Mogjiborahman Salek, Britta

Jungwirth1 Florent Carrette, Julien Fourtane, Nathalie Sol-Foulon, Frédérique Michel1

Olivier Schwartz2 Wolf D. Lehmann, and Oreste Acuto. A novel pathway down-

modulating T cell activation involves HPK-1–dependent recruitment of 14-3-3 proteins

on SLP- J Exp Med. 2007. March 19; 204(3): 681–691)

63

9. Brown-CG: Nitric oxide and mitochondrial respiration. Biochem Biophys

Acta.1999. 1411:351-369

10. Beltran-B, Mathur-A, Duchen-MR, Erusalimsky-JD and Moncada-S: The

effect of nitric oxide on cell respiration: a key to undertanding its role in cell survival, or

death. PNAS 2000. 26:14602-14607

11. Ignarro LJ. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular

system: a historical overview J Physiol Pharmacol. 2002. Dec. 53(4 Pt 1):503-14.

12 . Bredt-DS: Endogenous nitrice oxide synthesis: biological functions and

pathophysiology. Free Radic Res 1999. 31:577-596

13 . Ghafourifar P, Cadenas E Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends

Pharmacol Sci. 2005. Apr;26(4):190-5.

14. T.J. Guzik, R. Korbut, T. Adamek-Guzik. Nitric oxide and superoxide in

inflammation and immune regulation. Journal of Phisiology AND Pharmacology 2003.

54, 4,469-487

15 Masato Tsutsui, Hiroaki Shimokawa, Tsuyoshi Morishita, Yasuhide

Nakashima, and Nobuyuki Yanagihara. Development of Genetically Engineered Mice

Lacking All Three Nitric Oxide Synthases. J Pharmacol Sci 102, 147 – 154

16 . Chung-HT, Pae-HO, Choi-BM, Billiar-TR, Kim-YM: Nitric oxide as a

bioregulator of apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2001. 282:1075-1079

17.Mitchell P, Moyle J "Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation".

Nature 1967. 213 (5072): 137–9.)

64

18 . Félix Rodríguez-Juárez, Enara Aguirre, and Susana Cadenas. Relative

sensitivity of soluble guanylate cyclase and mitochondrial respiration to endogenous

nitric oxide at physiological oxygen concentration. Biochem J. 2007 July 15; 405(Pt 2):

223–231.

19 . Nisoli E, Carruba MO. Nitric oxide and mitochondrial biogenesis. J. Cell

Sci. 2006. 119:2855–2862

20. Beltran-B, Quintero-M, Gracia-Zaragoza-E, O'Connor-E, Esplugues-JV and

Moncada-S: Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: a

critical step in Fas signalling. PNAS 2002. 13:8892-8897

21 . Kim-YM, B Ombeck-CA, Billiar-TR: Nitric oxide as a bifunctional

regulator of apoptosis. Circ Res 1999. 19: 253-256

22. MacMicking, J., Q. W. Xie, and C. Nathan. Nitric oxide and macrophage

function. Annu. Rev. Immunol. 1997. 15:323–350.

23 . Kleinert, H., C. Euchenhofer, I. Ihrig-Biedert, and U. Forstermann.

Glucocorticoids inhibit the induction of nitric oxide synthase II by down-regulating

cytokine-induced activity of transcription factor nuclear factor-kB. Mol. Pharmacol.

1996. 49:15

24. Liu, S. F., X. Ye, and A. B. Malik. In vivo inhibition of nuclear factor-kB

activation prevents inducible nitric oxide synthase expression and systemic

hypotensionin a rat model of septic shock. J. Immunol. 1997. 159:3976.

25. Song Kyu PARK, Hsin Lee LIN and Sean MURPHY. Nitric oxide regulates

nitric oxide synthase-2 gene expression by inhibiting NF-κB binding to DNA Biochem.

J. 1997. 322,

65

26. Peng, H. B., P. Libby, and J. K. Liao. Induction and stabilization of IκBα by

nitric oxide mediates inhibition of NF-kB. J. Biol. Chem. 1995. 270:14214

27. Habib, A., C. Bernard, M. Lebret, C. Creminon, B. Esposito, A. Tedgui, and

J. Maclouf. Regulation of the expression of cyclooxygenase-2 by nitric oxide in rat

peritoneal macrophages. J. Immunol. 1997. 158:3845;

28. Moellering, D., A. J. Mc, R. P. Patel, H. J. Forman, R. T. Mulcahy, H. Jo,

and V. M. Darley-Usmar. The induction of GSH synthesis by nanomolar concentrations

of NO in endothelial cells: a role for g-glutamylcysteine synthetase and g-glutamyl

transpeptidase. FEBS Lett. 1999. 448:292.

29. Lander, H. M., D. P. Hajjar, B. L. Hempstead, U. A. Mirza, B. T. Chait, S.

Campbell, and L. A. Quilliam. A molecular redox switch on p21ras: structural basis for

the nitric oxide-p21ras interaction. J. Biol. Chem.1997. 272:4323.

30. Sheffler, L. A., D. A. Wink, G. Melillo, and G. W. Cox. Exogenous nitric

oxide regulates IFN-g plus lipopolysaccharide- induced nitric oxide synthase expression

in mouse macrophages. J. Immunol. 1995. 155:886.

31. L. Connelly, M. Palacios-Callender, C. Ameixa, S. Moncada, and A. J.

Hobbs. Biphasic Regulation of NF-kB Activity Underlies the Pro- and Anti-

Inflammatory Actions of Nitric Oxide. The Journal of Immunology, 2001, 166: 3873–

3881

32. Han, D., Williams, E. and Cadenas, E. Mitochondrial respiratory chain-

dependent generation of superoxide anion and its release into the intermembrane space.

Biochem. J. 2001. 353, 411-416.

66

33 . Kappus, H. and Sies, H., Toxic drug effects associated with oxygen

metabolism: redox cycling and lipid peroxidation, Experientia, 37, 1233, 1981

34. Harman, D. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry".

J Gerontology 1956. 11 (3): 298-300

35 . Tuppo EE, Forman LJ. Free radical oxidative damage and Alzheimer's

disease. J Am Osteopath Assoc. 2001 Dec;101(12 Suppl Pt 1):S11-5

36 . Kowluru RA, Chan PS. Oxidative stress and diabetic retinopathy. Exp

Diabetes Res. 2007: 43603

37 . Bauer, M. K., M. Vogt, M. Los, J. Siegel, S. Wesselborg, and K. Schulze-

Osthoff. Role of reactive oxygen intermediates in activation-induced CD95 (APO-

1/Fas) ligand expression. J. Biol. Chem. 1998. 273:8048–8055.

38 . Gulow, K., M. Kaminski, K. Darvas, D. Suss, M. Li-Weber, and P. H.

Krammer. HIV-1 trans-activator of transcription substitutes for oxidative signaling in

activation-induced T cell death. J. Immunol. 2005. 174:5249–5260.

39 . Peter, M.E, and Krammer, P.H. Mechanisms of CD95 (APO-1/Fas)-

mediated apoptosis. Curr. Opin. Immunol. 1998. 10:545–551.

40. Devadas S, Zaritskaya L, Rhee S. G, Oberley L and Williams M.S. Doscrete

genetation of superoxide and hydrogen peroxide by T cell receptor stimulation:

selective regulation of mitogen-activated protein kinase activation and fas ligand

expression. J. Exp. Med. 2002. 195:59-70

41 . Marcin Kaminski, Michael Kießling, Dorothee Su¨ss, Peter H. Krammer,

and Karsten Gulow. Novel Role for Mitochondria: Protein Kinase C -Dependent

Oxidative Signaling Organelles in Activation-Induced T-Cell Death. Molecular And

Cellular Biology, 2007 May, p. 3625–3639

67

42. Falus A, Hegyesi H, Lazar-Molnar E, Pos Z, Laszlo V, Darvas Z. Paracrine

and autocrine interactions in melanoma: histamine is a relevant player in local

regulation. Trends Immunol. 2001. 22(12):648-52.

43. Pos Z, Safrany G, Muller K, Toth S, Falus A, Hegyesi H. Phenotypic

profiling of engineered mouse melanomas with manipulated histamine production

identifies histamine H2 receptor and rho-C as histamine-regulated melanoma

progression markers. Cancer Res.2005. 65(10):4458-66.

44. Laszlo V, Falus A. Yet unrevealed aspects of histamine: questions from

outside--answers at inside? Semin Cancer Biol. 2000. 10(1):1-2.

45. Igaz P, Fitzimons CP, Szalai C, Falus A. Histamine genomics in silico:

polymorphisms of the human genes involved in the synthesis, action and degradation of

histamine.Am J Pharmacogenomics. 2002. 2(1):67-72

46. Kehrl JH: Heterotrimeric G protein signaling: roles in immune function and

fine-tuning by RGS proteins.Immunity. 1998. Jan;8(1):1-10

47. Horvath B, Szalai Cs, Mandi Y, Laszlo v, Radvanyi Zs, Darvas Zs, Falus A:

Histamine and histamine-receptor antagonists modify gene expression and biosynthesis

of interferon γ in priferial human blood mononuclear cells and in CD19-depleted cell

subsets. Immunol Let. 1999. 70: 95-9..

48. Mor S, Nagler A, Barak V, Handzel ZT, Geller-Bernstein C, Fabian I.

Histamine enhances granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-

6 production by human peripheral blood mononuclear cells. J Leukoc Biol. 1995

Oct;58(4):445-50

68

49. E Vannier and C A Dinarello Histamine enhances interleukin (IL)-1-induced

IL-1 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood

mononuclear cells. Comparison with IL-1 receptor antagonist.J Clin Invest. 1993 July;

92(1): 281–287.

50. van der Pouw Kraan TC, Snijders A, Boeije LC, de Groot ER, Alewijnse AE,

Leurs R, Aarden LA. Histamine inhibits the production of interleukin-12 through

interaction with H2 receptors. J Clin Invest. 1998 Nov 15;102(10):1866-73

51. Igaz P, Novák I, Lázaár E, Horváth B, Héninger E, Falus A. Bidirectional

communication between histamine and cytokines. Inflamm Res. 2001 Mar;50(3):123-8.

52 . Mazzoni A, Young HA, Spitzer JH, Visintin A, Segal DM. Histamine

regulates cytokine production in maturing dendritic cells, resulting in altered T cell

polarization. J Clin Invest. 2001. 108(12):1865-73.

53. Mazzoni A, Siraganian RP, Leifer CA, Segal DM. Dendritic cell modulation

by mast cells controls the Th1/Th2 balance in responding T cells.J Immunol. 2006 Sep

15;177(6):3577-81.

54. Mübeccel Akdis, Johan Verhagen,Alison Taylor, Fariba Karamloo, Christian

Karagiannidis, Reto Crameri, Sarah Thunberg, Günnur Deniz, Rudolf Valenta,Helmut

Fiebig, Christian Kegel, Rainer Disch, Carsten B. Schmidt-Weber, Kurt Blaser, and

Cezmi A. Akdis. Immune Responses in Healthy and Allergic Individuals Are

Characterized by a Fine Balance between Allergen-specific T Regulatory 1 and T

Helper 2 Cells J. Exp. Med. June 7, 2004 Volume 199, Number 11,

55. Jayasekera NP, Toma TP, Williams A, Rajakulasingam K. Mechanisms of

immunotherapy in allergic rhinitis. Biomed Pharmacother. 2007 Jan;61(1):29-33

69

56. Jutel M, Akdis M, Blaser K, Akdis CA. Mechanisms of allergen specific

immunotherapy--T-cell tolerance and more Allergy. 2006 Jul;61(7):796-807

57. Alison Taylor, Johan Verhagen, Kurt Blaser, Mu¨beccel Akdis and Cezmi A.

Akdis Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 andtransforming growth

factor-b: the role of T regulatory cells. Immunology, 2005 117, 433–442

58. Jutel M, Blaser K, Akdis CA Histamine receptors in immune regulation and

allergen-specific immunotherapy Immunol Allergy Clin North Am. 2006

May;26(2):245-59

59 . Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G,

Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzas E, Kovacs

P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki

S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T, Nagy A. Mice lacking histidine

decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett. 2001;502:53-56

60. Williamson, J. R. 1986. Role of inositol lipid breakdown in the generation of

intracellular signals. State of the art lecture. Hypertension 8(Part II):140–156.

61. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol.

Rev.2002. 82:47–95.

62. Aulwurm, U.R., and Brand, K.A. 2000. Increased formation of reactive

oxygen species due to glucose depletion in primary cultures of rat thymocytes inhibits

proliferation. Eur. J. Biochem. 2000. 267:5693–5698.

63. Hildeman, D.A., et al. Reactive oxygen species regulate activation induced T

cell apoptosis. Immunity. 1999. 10:735–744.

70

64 . Banki K, Hutter E, Gonchoroff N, Perl A. Elevation of mitochondrial

transmembrane potential and reactive oxygen intermediate levels are early events and

occur independently from activation of caspases in Fas signaling. J.Immunol.

1999;162:1466–1479

65. Jelinek I, Laszlo V, Buzas E, Pallinger E, Hangya B, Horvath Z, Falus A.

Increased antigen presentation and T(h)1 polarization in genetically histamine-free mice.

Int Immunol. 2007;19:51-58.

66. Wanda Niedbala, Xiao-qing Wei, Carol Campbell, Duncan Thomson, Mousa

Komai-Koma, and Foo Y. Liew. Nitric oxide preferentially induces type 1 T cell

differentiation by selectively up-regulating IL-12 receptor β2 expression via cGMP.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 10;99(25):16186-91.