NK buňkyNK buňky

InterferonyInterferony

NK buňkyNK buňky

Nemají antigenně specifické receptory

Rozeznávají bb., které mají abnormálně málo MHCgpI (některé nádorové a virem infikované bb.)

Jsou schopny zabíjet rychle – bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace

Aktivátory NK bb. – IFNIFN

Stimulační receptory NK bb.Stimulační receptory NK bb. - některé povrchové lektiny, Fc receptor CD16

ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) cytotoxická reakce závislá na protilátkách; NK b. prostřednictvím Fc receptorů CD16 rozpozná buňku opsonizovanou protilátkami třídy IgG, to vede k aktivaci cytotoxických mechanismů (degranulaci NK bb.)

Inhibiční receptory NK bb.Inhibiční receptory NK bb. – signály poskytnuté prostřednictvím těchto receptorů inhibují cytotoxické mechanismy

Imunoglobulinová skupina – tzv. KIR (killer inhibitor receptors)

C-lektinová skupina – např. CD94/NKG2

Aktivace NK buněkAktivace NK buněk

Výsledná reakce NK b. po setkání s jinou buňkou závisí na tom, zda převáží stimulační nebo inhibiční signály

Cytotoxická granula obsahující perforin a granzymy (perforin vytváří póry v cytoplazmatické membráně napadené buňky,v některých případech může dojít k osmotické lýze napadené buňky, vytvořenými póry se do buňky dostávají granzymy, které aktivují caspázy, což vede k apoptóze napadené buňky

Fas-ligand (FasL) – který se váže na apoptotický receptor Fas (CD95) přítomný na povrchu mnoha různých bb.

TNFa

Cytotoxické mechanismy NK buněkCytotoxické mechanismy NK buněk

ADCC ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity)

InterferonyInterferony Patří k humorální složce nespecifických mechanismů

IFN - produkován virem napadenými lymfocyty, monocyty a makrofágy

IFN - produkován virem infikovanými fibroblasty a epiteliemi

IFNaIFN– váží se na receptory na povrchu infikovaných a zdravých bb. a navozují v nich antivirový stav (syntéza enzymů, které blokují replikaci viru v buňce)

IFN – produkován TH1 buňkami, má regulační funkci, aktivuje makrofágy a stimuluje expresi MHCgp

Bazofily a mastocyty a Bazofily a mastocyty a jejich význam v jejich význam v

imunitních reakcíchimunitních reakcích

Mastocyty ( žírné buňky)Mastocyty ( žírné buňky)

Slizniční mastocyty – ve sliznicích dýchacího a gasrtointestinálního traktu, produkují histamin, serotonin, heparin, tryptázu,leukotrien C4…, účastní se při parazitózách a při alergiích

Pojivové mastocyty – v pojivové tkáni, produkují tryptázu, chymázu, PGD2…, jsou zmnoženy při fibróze, při parazitózách a alergiích se neúčastní

Funkce mastocytůFunkce mastocytů obrana proti parazitárním infekcím za patologických okolností jsou zodpovědné za časný

typ přecitlivělosti (imunopatologická reakce typu I) regulace imunitní odpovědi uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při

remodelaci tkání podílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznic přispívají k normálnímu metabolismu pojivových

tkání komunikace mezi imunitním a nervovým systémem

Aktivace mastocytůAktivace mastocytů

Žírné buňky mohou být stimulovány k Žírné buňky mohou být stimulovány k degranulaci prostřednictvím - degranulaci prostřednictvím - přímého poškozenípřímého poškození (opiáty, alkohol (opiáty, alkohol a některá antibiotika) a některá antibiotika)

- - propojením Fc receptorů pro IgEpropojením Fc receptorů pro IgE -- anafylatoxiny anafylatoxiny (C3a, C5a) (C3a, C5a)

Aktivace mastocytů Aktivace mastocytů prostřednictvím IgEprostřednictvím IgE

Po navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného parazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI) dojde k agregaci několika molekul FcRI

Iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu)

Aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)

Zahájení produkce cytokinů (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

Aktivace mastocytů prostřednictvím IgEAktivace mastocytů prostřednictvím IgE

Sekreční produkty mastocytůSekreční produkty mastocytů cytoplazmatická granulacytoplazmatická granula: hydrolytické enzymy, : hydrolytické enzymy,

proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát), biogenní proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát), biogenní aminy (histamin,serotonin) aminy (histamin,serotonin)

Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu a GITu (napomáhá eliminaci parazita)a GITu (napomáhá eliminaci parazita)

Metabolity kys. arachidonovéMetabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)prostaglandin PGD2)

CytokinyCytokiny (TNF, TGF (TNF, TGF, IL-4,5,6…) , IL-4,5,6…)

Úloha mastocytů při rozvoji alergické reakceÚloha mastocytů při rozvoji alergické reakce

BazofilyBazofily

diferencují se z myeloidního prekurzoru

bývají považovány za cirkulující formu mastocytů

receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi podobné mastocytům

jsou zodpovědné za vznik anafylaktického šoku

HLA systémHLA systém

(MHC glykoproteiny)(MHC glykoproteiny)

MHC glykoproteiny I. třídy MHC glykoproteiny I. třídy (major histocompatibility complex)(major histocompatibility complex)

Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou (včetně virových, pokud jsou přítomny), na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými CD8)

Přítomny na všech jaderných buňkách organismu

3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C )

3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)

Prezentace peptidového fragmentu pomocí MHC gp I. třídy cytotoxickému T lymfocytu

Struktura MHC gp IStruktura MHC gp I

MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce a nekovalentně asociovaného mikrotubulinu

Řetězec má 3 domény, 2 N-terminální (– vazebné místo pro peptidya 1 C-terminální doménu (– zakotvena v cytoplazmatické membráně)

Vazebné místo pro peptid je rýha, jejíž dno je tvořeno strukturou a boky jsou ohraničeny 2 šroubovicemi

Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů na MHC gp IVazba peptidů na MHC gp I MHC gp I váží peptidy o délce 8 až 10 AK

Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv (rozhodující jsou AK poblíž konců peptidu)

K vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém retikulu během biosyntézy MHC gp.

Po vytvoření řetězce amikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchu

Navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump

Vazba peptidů na MHC gp IVazba peptidů na MHC gp I

Vazba peptidů na MHC gp IVazba peptidů na MHC gp I

Neklasické MHC gp. INeklasické MHC gp. I

HLA – E, -F, -G; molekuly CD1HLA – E, -F, -G; molekuly CD1

Strukturně podobné klasickým MHC gpStrukturně podobné klasickým MHC gp

Jsou méně polymorfníJsou méně polymorfní

Vyskytují se jen na některých buňkáchVyskytují se jen na některých buňkách

Specializují se na vazbu zvláštních ligandůSpecializují se na vazbu zvláštních ligandů

HLA-EHLA-E a a HLA-GHLA-G - vyskytují se na buňkách - vyskytují se na buňkách trofoblastutrofoblastu

Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v dělozepřispívají k toleranci plodu v děloze

Molekuly CD1Molekuly CD1 - váží glykolipidy či jiné silně - váží glykolipidy či jiné silně hydrofobní látky, tyto komplexy jsou hydrofobní látky, tyto komplexy jsou rozpoznávány specializovanými rozpoznávány specializovanými T lymfocyty T lymfocyty (NK-T lymfocyty)(NK-T lymfocyty)

MHC glykoproteiny II. třídyMHC glykoproteiny II. třídy

Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4)rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4)

Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) monocyty, makrofágy, B lymfocyty)

3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

Struktura MHC gp IIStruktura MHC gp II

MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových asociovaných transmembránových podjednotek podjednotek a a

Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami terminálními doménami 11 a a 11

Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchuprezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů na MHC gp IIVazba peptidů na MHC gp II MHC gp II váží peptidy o délce MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK15 až 35 AK (ale i delší - (ale i delší -

vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené) vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené)

Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - strukturní rysy - vazebný motivvazebný motiv

Po vytvoření řetězce Po vytvoření řetězce aav ER dochází k poskládání do v ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního invariantního řetězceřetězce, který blokuje vazebné místo pro peptid, tento , který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s váčky oddělené od GA fúzují s endozómyendozómy, poté se , poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchupovrchu

Vazba peptidů na MHC gp IIVazba peptidů na MHC gp II

Antigenní prezentaceAntigenní prezentace

Prezentace antigenu T lymfocytům1. Signál TCR – MHC gp I(II)+Ag peptid (APC)2. Signál kostimulační CD 28 (Tlymfocyt) – CD 80, CD 86 (APC)

Polymorfismus MHC glykoproteinůPolymorfismus MHC glykoproteinů HLA komplex se nachází na chromozómu 6HLA komplex se nachází na chromozómu 6 U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují až U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují až

stovky různých alelických forem jednotlivých stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce řetězce ))

Kodominantní dědičnost alelických foremKodominantní dědičnost alelických forem(jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy (jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách)ve 2 různých alelických formách)

Polymorfismus má ochranný význam na úrovni Polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince jedince i na úrovni populacei na úrovni populace

Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při transplantacíchtransplantacích

HLA typizaceHLA typizace = určení HLA antigenů na povrchu = určení HLA antigenů na povrchu lymfocytůlymfocytůProvádí se při předtransplantačním vyšetření a při Provádí se při předtransplantačním vyšetření a při určení paternityurčení paternity1) Sérologická typizace1) Sérologická typizace mikrolymfocytotoxický testmikrolymfocytotoxický test allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po

porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky))sety typizačních sér (monoklonální protilátky))

princip princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) séra (síly a titru antileukocytárních protilátek)

za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb.za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)(sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

2) Molekulárně genetické metody2) Molekulárně genetické metody Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu

genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genůpoužívá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů

2a) PCR-SSP2a) PCR-SSP = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními

specifickými primeryspecifickými primery extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcíextrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro

určitou alelu (resp. skupinu alel)určitou alelu (resp. skupinu alel) pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézoupozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický

obrazobraz

2b) PCR-SSO2b) PCR-SSO = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy= PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLAnamnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými

DNA sondami specifickými pro jednotlivé alelyDNA sondami specifickými pro jednotlivé alely

2c) PCR- SBT2c) PCR- SBT = sequencing based typing; sekvenování= sequencing based typing; sekvenování nejpřesnější metodika HLA typizacenejpřesnější metodika HLA typizace získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s

databází známých sekvencí HLA aleldatabází známých sekvencí HLA alel

ImunoglobulinyImunoglobuliny

Struktura imunoglobulinůStruktura imunoglobulinů 2 těžké (H) řetězce2 těžké (H) řetězce kovalentně spojeny kovalentně spojeny

cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovým můstkem připojen cystinovým můstkem připojen lehký (L) řetězeclehký (L) řetězec

H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, 3-4 konstantní)3-4 konstantní)

L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových domén domén (1 variabilní, 1 konstantní)(1 variabilní, 1 konstantní)

Typy L řetězců - Typy L řetězců - Typy H řetězců – Typy H řetězců –

Variabilní domény L a H řetězce tvoří Variabilní domény L a H řetězce tvoří vazebné místo vazebné místo pro Agpro Ag

Pantová oblastPantová oblast = místo, kde jsou těžké řetězce spojeny = místo, kde jsou těžké řetězce spojeny cystinovými můstkycystinovými můstky

Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží se na Fc receptoryse na Fc receptory

J řetězecJ řetězec

Sekreční komponentaSekreční komponenta

Funkce imunoglobulinůFunkce imunoglobulinů

Neutralizace AgNeutralizace Ag

Aglutinace AgAglutinace Ag

Aktivace komplementuAktivace komplementu

Opsonizace Opsonizace

Aktivace mastocytů prostřednictvím IgEAktivace mastocytů prostřednictvím IgE

ADCCADCC

Funkce imunoglobulinůFunkce imunoglobulinů

Třídy imunoglobulínů a jejich funkceTřídy imunoglobulínů a jejich funkce Rozlišujeme podle konstantní části H řetězceRozlišujeme podle konstantní části H řetězce IgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgEIgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgE

IgMIgM -- jako monomer tvoří BCRjako monomer tvoří BCR - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na Fc receptory fagocytů Fc receptory fagocytů - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů)

IgDIgD - jako monomer tvoří BCR- jako monomer tvoří BCR - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci

- (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)- (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)

IgG IgG - - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností aktivovat komplement a vázat se na Fc aktivovat komplement a vázat se na Fc receptory receptory fagocytů (opsonizace) fagocytů (opsonizace)

- funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace - funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace komplementu komplementu

- přestupuje placentou- přestupuje placentou - tvořen při sekundární imunitní odpovědi- tvořen při sekundární imunitní odpovědi

- (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů) - (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů)

IgAIgA - - slizniční IgA slizniční IgA -- ochrana sliznic, neutralizace, ochrana sliznic, neutralizace, opsonizace, neaktivuje opsonizace, neaktivuje komplementkomplement - dimér se sekreční komponentou - dimér se sekreční komponentou - sliny, slzy, mateřské mléko - sliny, slzy, mateřské mléko - - sérový IgA sérový IgA – monomer, dimer či trimer– monomer, dimer či trimer - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů)

IgEIgE - uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným - uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným parazitům parazitům - je hlavní příčinou alergických reakcí - je hlavní příčinou alergických reakcí

- (koncentrace 3- (koncentrace 3xx1010-4-4 g/l; biol. poločas 2 dny) g/l; biol. poločas 2 dny)

Genetický základ tvorby Genetický základ tvorby imunoglobulinůimunoglobulinů

Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14 V V (variabilita) - několik set(variabilita) - několik set D D (diversita) - asi 50(diversita) - asi 50 JJ (joining) – 9 (joining) – 9 CC konstantní části H řetězce konstantní části H řetězce

Genové segmenty pro L řetězce - Genové segmenty pro L řetězce - chromozóm 2chromozóm 2 - - chromozóm 22 chromozóm 22

V V (variabilita)(variabilita) JJ (joining) (joining) CC konstantní části L řetězce konstantní části L řetězce

Na koncích V, D, J úsekůNa koncích V, D, J úseků jsou signální sekvencejsou signální sekvence, , které jsou rozpoznávány enzymy které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázamirekombinázami, které , které provádějí přeskupování těchto genůprovádějí přeskupování těchto genů

Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázamirekombinázami, které provádějí izotypový přesmyk, které provádějí izotypový přesmyk

Přeskupování genů kódujících H řetězcePřeskupování genů kódujících H řetězce

1.1. D-J přeskupeníD-J přeskupení - vyštěpení úseku IgH mezi některým- vyštěpení úseku IgH mezi některým DD aa JJ segmentem (probíhá na obou chromozómech)segmentem (probíhá na obou chromozómech)

2.2. V-D přeskupení V-D přeskupení – vyštěpení úseku mezi některým– vyštěpení úseku mezi některým VV segmentem asegmentem a DJDJ;; pokud je přeskupení na některém pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. druhém chromozómu – tzv. alelická exkluzealelická exkluze ( to platí ( to platí i pro L řetězce) i pro L řetězce) Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce ..

Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

Přeskupování genů kódujících L řetězcePřeskupování genů kódujících L řetězce1.1. Nejprve se přeskupují geny kódující Nejprve se přeskupují geny kódující L řetězec L řetězec , ,

dochází k vyštěpování úseků mezi některým V a J dochází k vyštěpování úseků mezi některým V a J segmentem (souběžně na obou chromozómech), segmentem (souběžně na obou chromozómech), pokud je přeskupení na některém z chromozómů pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. chromozómu – tzv. alelická exkluze.alelická exkluze.

2.2. Jestliže není přeskupování Jestliže není přeskupování genů úspěšné, genů úspěšné, zahájí se přeskupování genů zahájí se přeskupování genů . .

3.3. Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit stabilní dimery.stabilní dimery.

Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

Variabilita imunoglobulinůVariabilita imunoglobulinůVariabilita imunoglobulinů je dána:Variabilita imunoglobulinů je dána:

1.1. RůznorodostíRůznorodostí kombinací V(D)J segmentůkombinací V(D)J segmentů

2.2. Spojovací variabilitouSpojovací variabilitou – po vyštěpení genových – po vyštěpení genových úseků nejsou konce odstřiženy zcela přesněúseků nejsou konce odstřiženy zcela přesně

3.3. EnzymEnzym terminální transferázaterminální transferáza – prodlužuje – prodlužuje odstřižené konce o krátké náhodné tzv. odstřižené konce o krátké náhodné tzv. N-N-sekvencesekvence

4.4. Somatické mutaceSomatické mutace V segmentů přeskupených V segmentů přeskupených genů po kontaktu s Ag na povrchu FDCgenů po kontaktu s Ag na povrchu FDC

Izotypový přesmyk (class switch)Izotypový přesmyk (class switch) Dochází k němu během terminální diferenciace B Dochází k němu během terminální diferenciace B

lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný kostimulační signál přes CD40)kostimulační signál přes CD40)

Enzymy Enzymy rekombinázyrekombinázy rozpoznávají rozpoznávají switch sekvenceswitch sekvence lokalizované po stranách C segmentů (tato sekvence lokalizované po stranách C segmentů (tato sekvence není mezi Cnení mezi C a C a C segmenty – B buňka může před segmenty – B buňka může před izotypovým přesmykem produkovat IgM i IgD izotypovým přesmykem produkovat IgM i IgD zároveň)zároveň)a vyštěpují úseky genůa vyštěpují úseky genů

Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán ten Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán ten

segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po sestřihu sestřihu a translaci vzniká příslušný a translaci vzniká příslušný izotyp H řetězceizotyp H řetězce

Izotypový přesmyk (class switch) - Izotypový přesmyk (class switch) - pokračovánípokračování

CytokinyCytokiny regulují k jakému izotypovému přesmyku regulují k jakému izotypovému přesmyku dojde:dojde:

IL-4IL-4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 TGFTGF stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA

Regulace, zda půjde o Regulace, zda půjde o sekretovanou či membránovou sekretovanou či membránovou formuformu probíhá na úrovni mRNA (na 3´konci C probíhá na úrovni mRNA (na 3´konci C segmentu jsou za sekvencemi kódujícími segmentu jsou za sekvencemi kódujícími secernovanou formu sekvence pro membránovou secernovanou formu sekvence pro membránovou formu)formu)

Antiidiotypové Antiidiotypové protilátkyprotilátky

IDIOTOP = každá determinanta variabilní části IDIOTOP = každá determinanta variabilní části protilátky, může být součástí paratopu,protilátky, může být součástí paratopu, či může ležet mimo paratop či může ležet mimo paratop

IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických vazebných struktur pro Ag vazebných struktur pro Ag na protilátkách stejné specifity na protilátkách stejné specifity

Idiotypické struktury protilátek 1. generace jsouIdiotypické struktury protilátek 1. generace jsou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou se proti nim tvořit tzv. se proti nim tvořit tzv. antiidiotypové protilátkyantiidiotypové protilátky (protilátky 2. generace; (protilátky 2. generace; některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu protilátek 1. generace) protilátek 1. generace)

Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace (anti-antiidiotypové protilátky) (anti-antiidiotypové protilátky)

Tato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědiTato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědi

B lymfocytyB lymfocyty

B lymfocytyB lymfocyty B-lymfocytyB-lymfocyty ( (B buňkyB buňky) jsou buňky zodpovědné především ) jsou buňky zodpovědné především

za specifickou, za specifickou, protilátkamiprotilátkami zprostředkovanou imunitní zprostředkovanou imunitní odpověď. Mají rovněž velký význam pro odpověď. Mají rovněž velký význam pro imunitní paměťimunitní paměť (využívá se při očkování). (využívá se při očkování).

B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí BCR B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí BCR (B cell receptor)(B cell receptor)

Příslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo k vazbě Příslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo k vazbě antigenu, je stimulován k pomnožení a diferenciaci na antigenu, je stimulován k pomnožení a diferenciaci na efektorové neboli efektorové neboli plazmatické bbplazmatické bb., které produkují velké ., které produkují velké množství množství protilátekprotilátek stejné specifity, jako je BCR (jde vlastně stejné specifity, jako je BCR (jde vlastně o tentýž protein v rozpustné formě), vážou se tedy na stejný o tentýž protein v rozpustné formě), vážou se tedy na stejný antigen. Z části stimulovaných B-lymfocytů se diferencují antigen. Z části stimulovaných B-lymfocytů se diferencují paměťové buňkypaměťové buňky. .

Povrchové znaky B lymfocytůPovrchové znaky B lymfocytů

CD 10CD 10 - nezralý B lymfocyt - nezralý B lymfocyt

CD 19CD 19 - charakteristický povrchový znak B lymfocytů - charakteristický povrchový znak B lymfocytů

CD 20 CD 20 - na povrchu Ig-pozitivních B lymfocytů- na povrchu Ig-pozitivních B lymfocytů

IgM, IgDIgM, IgD - BCR - BCR

MHC gp II.třídyMHC gp II.třídy - Ag prezentující molekuly - Ag prezentující molekuly

CD 40 – kostimulační receptorCD 40 – kostimulační receptor

Vývoj B lymfocytůVývoj B lymfocytů Vývoj B lymfocytů probíhá v kostní dřeni a dokončuje se posetkání s Vývoj B lymfocytů probíhá v kostní dřeni a dokončuje se posetkání s

Ag v sekundárních lymfatických orgánech.Ag v sekundárních lymfatických orgánech.

Pluripotentní hematopoetická kmenová buňkaPluripotentní hematopoetická kmenová buňka

Progenitor B lymfocytuProgenitor B lymfocytu → zahájení rekombinačních procesů, které → zahájení rekombinačních procesů, které vedou ke vzniku velkého množství klonů vedou ke vzniku velkého množství klonů B lymfocytů s individuálně specifickými BCR B lymfocytů s individuálně specifickými BCR

Pre B lymfocytPre B lymfocyt → exprese → exprese pre-B receptorupre-B receptoru (tvořen H( (tvořen H()) řetězcem řetězcem a náhradním L řetězcem) a náhradním L řetězcem)

Nezralý B lymfocytNezralý B lymfocyt → exprese povrchového → exprese povrchového IgMIgM (BCR); v této fázi (BCR); v této fázi vývoje dochází k eliminaci autoreaktivních klonů vývoje dochází k eliminaci autoreaktivních klonů

Zralý B lymfocytZralý B lymfocyt → exprese povrchového → exprese povrchového IgM a IgDIgM a IgD (BCR) (BCR)

Kritické momenty při vývoji B lymfocytůKritické momenty při vývoji B lymfocytů

1.1. Dokončení přeskupování genů pro H řetězce a Dokončení přeskupování genů pro H řetězce a povrchová exprese pre-BCRpovrchová exprese pre-BCR

2.2. Úspěšné přeskupení genů pro L řetězec a Úspěšné přeskupení genů pro L řetězec a povrchová exprese IgM (BCR)povrchová exprese IgM (BCR)

3.3. Testování nezralých B lymfocytů, zda nejsou Testování nezralých B lymfocytů, zda nejsou autoreaktivníautoreaktivní

4.4. Dalším kritickým stádiem procházejí při zahájení Dalším kritickým stádiem procházejí při zahájení somatických mutací a afinitní maturaci, kdy somatických mutací a afinitní maturaci, kdy přežívají pouze B lymfocyty s nejvyšší afinitou k přežívají pouze B lymfocyty s nejvyšší afinitou k antigenu.antigenu.

BCRBCR BCR se skládá z BCR se skládá z povrchového povrchového

imunoglobulinuimunoglobulinu (IgM, IgD – (IgM, IgD – H řetězce jsou transmembránové ; H řetězce jsou transmembránové ; rozeznává Ag) a asociovaných rozeznává Ag) a asociovaných signalizačních molekul signalizačních molekul (Ig(Ig a Ig a Ig), ), které jsou asociovány které jsou asociovány s cytoplazmatickými s cytoplazmatickými protein protein tyrosin-kinázamityrosin-kinázami (PTK) skupiny Src (PTK) skupiny Src

Po současném navázání Ag na 2 či Po současném navázání Ag na 2 či více BCR dojde k přiblížení PTK, více BCR dojde k přiblížení PTK, vzájemné fosforylaci a fosforylaci vzájemné fosforylaci a fosforylaci dalších cytoplazmatických dalších cytoplazmatických proteinů, což vede ke změnám proteinů, což vede ke změnám transkripce genů, proliferaci, transkripce genů, proliferaci, diferenciaci a sekreci protilátekdiferenciaci a sekreci protilátek

Signály spuštěné vazbou Ag na Signály spuštěné vazbou Ag na BCR mohou být zesíleny spoluprací BCR mohou být zesíleny spoluprací s CR2, který váže C3dg (opsonin)s CR2, který váže C3dg (opsonin)

Eliminace autoreaktivních klonů B Eliminace autoreaktivních klonů B lymfocytůlymfocytů

Při náhodném přeskupováním genů, spojovacích Při náhodném přeskupováním genů, spojovacích nepřesnostech, párování H-L a somatických mutací mohou nepřesnostech, párování H-L a somatických mutací mohou vzniknout i klony B lymfocytů nesoucí vzniknout i klony B lymfocytů nesoucí autoreaktivní autoreaktivní receptoryreceptory a produkující a produkující autoreaktivní protilátky.autoreaktivní protilátky.

Většina autoreaktivních B lymfocytů je eliminována na Většina autoreaktivních B lymfocytů je eliminována na úrovni nezralých B lymfocytů (v kostní dřeni), jestliže svým úrovni nezralých B lymfocytů (v kostní dřeni), jestliže svým BCR váží autoantigen s dostatečnou afinitou, obdrží signál BCR váží autoantigen s dostatečnou afinitou, obdrží signál vedoucí k vedoucí k apoptotické smrti.apoptotické smrti.

Pokud touto eliminací projdou některé autoreaktivní klony, Pokud touto eliminací projdou některé autoreaktivní klony, jejich autoreaktivita se většinou neprojeví, protože k jejich jejich autoreaktivita se většinou neprojeví, protože k jejich aktivaci chybí příslušné Taktivaci chybí příslušné THH lymfocyty, mnohé autoantigeny lymfocyty, mnohé autoantigeny jsou kryptické, či se vyskytují v malé koncentraci a jsou jsou kryptické, či se vyskytují v malé koncentraci a jsou imunitním systémem ignorovány.imunitním systémem ignorovány.

Setkání B lymfocytu s Ag v Setkání B lymfocytu s Ag v sekundárních lymfatických orgánechsekundárních lymfatických orgánech

Ontogeneze tvorby protilátekOntogeneze tvorby protilátek

Syntéza Syntéza specifických protilátekspecifických protilátek začíná kolem 20.- začíná kolem 20.-24.týdne gestace, celková koncentrace IgA a IgM 24.týdne gestace, celková koncentrace IgA a IgM zůstává až do porodu neměřitelná, IgG se začínají zůstává až do porodu neměřitelná, IgG se začínají tvořit až po porodutvořit až po porodu

B lymfocyty na imunizaci reagují převážně tvorbou B lymfocyty na imunizaci reagují převážně tvorbou IgM, přesmyk na jiné izotypy je pomalejšíIgM, přesmyk na jiné izotypy je pomalejší

Pozvolný nárůst tvorby vlastních IgG za poklesu Pozvolný nárůst tvorby vlastních IgG za poklesu mateřských IgG (kolem 3.-6.měs.)mateřských IgG (kolem 3.-6.měs.)

Ontogeneze tvorby protilátekOntogeneze tvorby protilátek

Koncentrace IgM dosahuje hodnot srovnatelných Koncentrace IgM dosahuje hodnot srovnatelných s dospělými v 1.-3.roce života, IgG+A mezi 10.-s dospělými v 1.-3.roce života, IgG+A mezi 10.-15.r. 15.r.

Protilátková reakce na polysacharidové antigeny Protilátková reakce na polysacharidové antigeny se objevuje až kolem 2.roku životase objevuje až kolem 2.roku života

Ve stáří Ve stáří je slabší protilátková odpověď na nové je slabší protilátková odpověď na nové podněty podněty a vyšší produkce autoprotiláteka vyšší produkce autoprotilátek