NK buňkyNK buňky

InterferonyInterferony

NK buňkyNK buňky

Součást antigenně nespecifických mechanismůSoučást antigenně nespecifických mechanismů

Nemají antigenně specifické receptoryNemají antigenně specifické receptory

Rozeznávají bb., které mají abnormálně málo MHCgpI Rozeznávají bb., které mají abnormálně málo MHCgpI (některé nádorové a virem infikované bb.)(některé nádorové a virem infikované bb.)

Jsou schopny zabíjet rychle – bez předchozí stimulace, Jsou schopny zabíjet rychle – bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciaceproliferace a diferenciace

Aktivátory NK bb. – IFNAktivátory NK bb. – IFNIFNIFN

Stimulační receptory NK bb.Stimulační receptory NK bb. - některé povrchové - některé povrchové lektiny, lektiny, Fc receptor CD16 Fc receptor CD16

ADCCADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) (antibody-dependent cellular cytotoxicity) cytotoxická reakce závislá na protilátkách; cytotoxická reakce závislá na protilátkách; NK b. prostřednictvím Fc receptorů NK b. prostřednictvím Fc receptorů CD16CD16 rozpozná rozpozná buňku opsonizovanou protilátkami třídy buňku opsonizovanou protilátkami třídy IgGIgG, to vede , to vede k aktivaci cytotoxických mechanismů (degranulaci NK k aktivaci cytotoxických mechanismů (degranulaci NK bb.)bb.)

Inhibiční receptory NK bb.Inhibiční receptory NK bb. – signály poskytnuté – signály poskytnuté prostřednictvím těchto receptorů inhibují cytotoxické prostřednictvím těchto receptorů inhibují cytotoxické mechanismymechanismy

Imunoglobulinová skupina Imunoglobulinová skupina – tzv. KIR (killer – tzv. KIR (killer inhibitor receptors)inhibitor receptors)

C-lektinová skupina C-lektinová skupina – např. CD94/NKG2– např. CD94/NKG2

Výsledná reakce NK b. po setkání s jinou buňkou Výsledná reakce NK b. po setkání s jinou buňkou závisí na tom, zda převáží stimulační nebo inhibiční závisí na tom, zda převáží stimulační nebo inhibiční signálysignály

Cytotoxická granulaCytotoxická granula obsahující obsahující perforinperforin a a granzymygranzymy (perforin vytváří póry v cytoplazmatické membráně (perforin vytváří póry v cytoplazmatické membráně napadené buňky,v některých případech může dojít k napadené buňky,v některých případech může dojít k osmotické lýze napadené buňky, vytvořenými póry se osmotické lýze napadené buňky, vytvořenými póry se do buňky dostávají granzymy, které aktivují caspázy, do buňky dostávají granzymy, které aktivují caspázy, což vede k což vede k apoptózeapoptóze napadené buňky napadené buňky

Fas-ligand (FasL)Fas-ligand (FasL) – který se váže na apoptotický – který se váže na apoptotický receptor Fas (CD95) přítomný na povrchu mnoha receptor Fas (CD95) přítomný na povrchu mnoha různých bb.různých bb.

TNFTNF

Cytotoxické mechanismy NK buněkCytotoxické mechanismy NK buněk

InterferonyInterferony Patří k humorální složce nespecifických mechanismůPatří k humorální složce nespecifických mechanismů IFNIFN - produkován virem napadenými lymfocyty, - produkován virem napadenými lymfocyty,

monocyty a makrofágymonocyty a makrofágy IFNIFN - produkován virem infikovanými fibroblasty a - produkován virem infikovanými fibroblasty a

epiteliemiepiteliemi IFNIFNaaIFNIFN– váží se na receptory na povrchu – váží se na receptory na povrchu

infikovaných a zdravých bb. a navozují v nich infikovaných a zdravých bb. a navozují v nich antivirový stav (syntéza enzymů, které blokují antivirový stav (syntéza enzymů, které blokují replikaci viru v buňce)replikaci viru v buňce)

IFNIFN – produkován T – produkován THH1 buňkami, má regulační 1 buňkami, má regulační funkci, aktivuje makrofágy a stimuluje expresi funkci, aktivuje makrofágy a stimuluje expresi MHCgpMHCgp

Bazofily a mastocyty a Bazofily a mastocyty a

jejich význam v jejich význam v

imunitních reakcíchimunitních reakcích

Mastocyty ( žírné buňky)Mastocyty ( žírné buňky)

Slizniční mastocytySlizniční mastocyty – ve sliznicích dýchacího a – ve sliznicích dýchacího a

gasrtointestinálního traktu, produkují histamin, gasrtointestinálního traktu, produkují histamin,

serotonin, heparin, tryptázu,leukotrien C4…, účastní se serotonin, heparin, tryptázu,leukotrien C4…, účastní se

při parazitózách a při alergiíchpři parazitózách a při alergiích

Pojivové mastocytyPojivové mastocyty – v pojivové tkáni, produkují – v pojivové tkáni, produkují

tryptázu, chymázu, PGD2…, jsou zmnoženy při fibróze, tryptázu, chymázu, PGD2…, jsou zmnoženy při fibróze,

při parazitózách a alergiích se neúčastnípři parazitózách a alergiích se neúčastní

Funkce mastocytůFunkce mastocytů obrana proti parazitárním infekcímobrana proti parazitárním infekcím

za patologických okolností jsou zodpovědné za za patologických okolností jsou zodpovědné za časný typ přecitlivělosti (imunopatologická reakce časný typ přecitlivělosti (imunopatologická reakce typu I)typu I)

regulace imunitní odpovědiregulace imunitní odpovědi

uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při remodelaci tkáníremodelaci tkání

podílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznicpodílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznic

přispívají k normálnímu metabolismu pojivových přispívají k normálnímu metabolismu pojivových tkánítkání

komunikace mezi imunitním a nervovým systémemkomunikace mezi imunitním a nervovým systémem

Schema aktivace mastocytuSchema aktivace mastocytu Žírné buňky mohou být stimulovány k degranulaci Žírné buňky mohou být stimulovány k degranulaci

prostřednictvím přímého poškození (opiáty, alkohol, a prostřednictvím přímého poškození (opiáty, alkohol, a některá antibiotika), propojením Fc receptorů pro IgE, nebo některá antibiotika), propojením Fc receptorů pro IgE, nebo anafylatoxiny (C3a, C5a) anafylatoxiny (C3a, C5a)

Po navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného Po navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného parazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (Fcparazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI) RI) dojde k agregaci několika molekul Fcdojde k agregaci několika molekul FcRIRI

Iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s Iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu)povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu)

Aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, Aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)prostaglandin PGD2)

Zahájení produkce cytokinů (TNF, TGFZahájení produkce cytokinů (TNF, TGF, IL-4,5,6…) , IL-4,5,6…)

Receptor pro komplementový fragment C5a (aktivace degranulace Receptor pro komplementový fragment C5a (aktivace degranulace nezávislé na IgE)nezávislé na IgE)

Sekreční produkty mastocytůSekreční produkty mastocytů cytoplazmatická granulacytoplazmatická granula: hydrolytické enzymy, : hydrolytické enzymy,

proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát), biogenní proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát), biogenní aminy (histamin,serotonin) aminy (histamin,serotonin)

Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu respiračním traktu a GITu (napomáhá eliminaci parazita)a GITu (napomáhá eliminaci parazita)

Metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, Metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)prostaglandin PGD2)

Cytokiny (TNF, TGFCytokiny (TNF, TGF, IL-4,5,6…) , IL-4,5,6…)

Úloha mastocytů při rozvoji alergické reakceÚloha mastocytů při rozvoji alergické reakce

BazofilyBazofily

diferencují se z myeloidního prekurzorudiferencují se z myeloidního prekurzoru

bývají považovány za cirkulující formu mastocytůbývají považovány za cirkulující formu mastocytů

receptorovou výbavou, obsahem granul, receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi podobné mastocytůmpodobné mastocytům

jsou zodpovědné za vznik anafylaktického šokujsou zodpovědné za vznik anafylaktického šoku

HLA systémHLA systém

(MHC glykoproteiny)(MHC glykoproteiny)

MHC glykoproteiny I. třídy MHC glykoproteiny I. třídy

(major histocompatibility complex)(major histocompatibility complex)

Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových fragmentů, Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou (včetně virových, které jsou produkovány buňkou (včetně virových, pokud jsou přítomny), na buněčném povrchu tak, aby pokud jsou přítomny), na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými CD8) byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými CD8)

Přítomny na všech jaderných buňkách organismuPřítomny na všech jaderných buňkách organismu

3 izotypy klasických lidských MHC gp.3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C ( HLA - A, -B, -C ))

3 izotypy neklasických MHC gp.3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)molekuly CD1)

Struktura MHC gp IStruktura MHC gp I

MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce řetězce a nekovalentně asociovaného a nekovalentně asociovaného mikrotubulinumikrotubulinu

Řetězec Řetězec má 3 domény, 2 N-terminální ( má 3 domény, 2 N-terminální (– – vazebné místo pro peptidyvazebné místo pro peptidya 1 C-terminální doménu a 1 C-terminální doménu ((– zakotvena v cytoplazmatické membráně, – zakotvena v cytoplazmatické membráně, struktura podobná imunoglobulinové doméně)struktura podobná imunoglobulinové doméně)

Vazebné místo pro peptid je strukturně význačná rýha, Vazebné místo pro peptid je strukturně význačná rýha, jejíž dno je tvořeno jejíž dno je tvořeno strukturou a boky jsou strukturou a boky jsou ohraničeny 2 ohraničeny 2 šroubovicemi šroubovicemi

Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchuna buněčném povrchu

Vazba peptidů na MHC gp IVazba peptidů na MHC gp I MHC gp I váží peptidy o délce MHC gp I váží peptidy o délce 8 až 10 AK8 až 10 AK

Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - strukturní rysy - vazebný motivvazebný motiv (rozhodující jsou AK poblíž (rozhodující jsou AK poblíž konců peptidu)konců peptidu)

K vazbě endogenních peptidů dochází v K vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém endoplazmatickém retikuluretikulu během biosyntézy MHC gp. během biosyntézy MHC gp.

Po vytvoření řetězce Po vytvoření řetězce aamikrotubulinu dochází v ER k mikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchubuněčném povrchu

Navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných Navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómemproteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené , který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump membránových pump

Neklasické MHC gp. INeklasické MHC gp. I

HLA – E, -F, -G; molekuly CD1HLA – E, -F, -G; molekuly CD1

Strukturně podobné klasickým MHC gpStrukturně podobné klasickým MHC gp

Jsou méně polymorfníJsou méně polymorfní

Vyskytují se jen na některých buňkáchVyskytují se jen na některých buňkách

Specializují se na vazbu zvláštních ligandůSpecializují se na vazbu zvláštních ligandů

HLA-EHLA-E a a HLA-GHLA-G - vyskytují se na buňkách - vyskytují se na buňkách trofoblastutrofoblastu

Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v dělozepřispívají k toleranci plodu v děloze

Molekuly CD1Molekuly CD1 - váží glykolipidy či jiné silně - váží glykolipidy či jiné silně hydrofobní látky, tyto komplexy jsou hydrofobní látky, tyto komplexy jsou rozpoznávány specializovanými rozpoznávány specializovanými T lymfocyty T lymfocyty (NK-T lymfocyty)(NK-T lymfocyty)

MHC glykoproteiny II. třídyMHC glykoproteiny II. třídy

Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4)rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4)

Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) monocyty, makrofágy, B lymfocyty)

3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

Struktura MHC gp IIStruktura MHC gp II

MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových asociovaných transmembránových podjednotek podjednotek a a

Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami terminálními doménami 11 a a 11

Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchuprezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů na MHC gp IIVazba peptidů na MHC gp II

MHC gp II váží peptidy o délce MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK15 až 35 AK (ale i delší - (ale i delší - vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené)vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené)

Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - strukturní rysy - vazebný motivvazebný motiv

Po vytvoření řetězce Po vytvoření řetězce aav ER dochází k poskládání v ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního řetězceinvariantního řetězce, který blokuje vazebné místo pro , který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s endozómyendozómy, poté se rozštěpí invariantní řetězce a do , poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchuna buněčném povrchu

Polymorfismus MHC glykoproteinůPolymorfismus MHC glykoproteinů

HLA komplex se nachází na chromozómu 6HLA komplex se nachází na chromozómu 6

U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují až stovky různých alelických forem jednotlivých až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce DR řetězce ))

Kodominantní dědičnost alelických foremKodominantní dědičnost alelických forem(jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy (jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách)ve 2 různých alelických formách)

Polymorfismus má ochranný význam na úrovni Polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince jedince i na úrovni populacei na úrovni populace

Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při transplantacíchtransplantacích

HLA typizaceHLA typizace = určení HLA antigenů na povrchu = určení HLA antigenů na povrchu lymfocytůlymfocytůProvádí se při předtransplantačním vyšetření a při Provádí se při předtransplantačním vyšetření a při určení paternityurčení paternity1) Sérologická typizace1) Sérologická typizace mikrolymfocytotoxický testmikrolymfocytotoxický test

allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky))připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky))

princip princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) séra (síly a titru antileukocytárních protilátek)

za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb.za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb.

(sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)(sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

2) Molekulárně genetické metody2) Molekulárně genetické metody Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu

genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genůpoužívá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů

2a) PCR-SSP2a) PCR-SSP = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními

specifickými primeryspecifickými primery extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcíextrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro

určitou alelu (resp. skupinu alel)určitou alelu (resp. skupinu alel) pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézoupozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický

obrazobraz

2b) PCR-SSO2b) PCR-SSO = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy= PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLAnamnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými

DNA sondami specifickými pro jednotlivé alelyDNA sondami specifickými pro jednotlivé alely

2c) PCR- SBT2c) PCR- SBT = sequencing based typing; sekvenování= sequencing based typing; sekvenování nejpřesnější metodika HLA typizacenejpřesnější metodika HLA typizace získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s

databází známých sekvencí HLA aleldatabází známých sekvencí HLA alel

ImunoglobulinyImunoglobuliny

Struktura imunoglobulinůStruktura imunoglobulinů

2 těžké (H) řetězce2 těžké (H) řetězce kovalentně spojeny kovalentně spojeny cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovým můstkem připojen cystinovým můstkem připojen lehký (L) řetězeclehký (L) řetězec

H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, 3-4 konstantní)3-4 konstantní)

L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových domén domén (1 variabilní, 1 konstantní)(1 variabilní, 1 konstantní)

Typy L řetězců - Typy L řetězců -

Typy H řetězců – Typy H řetězců –

Variabilní domény L a H řetězce tvoří Variabilní domény L a H řetězce tvoří vazebné místo vazebné místo pro Agpro Ag

Pantová oblastPantová oblast = místo, kde jsou těžké řetězce = místo, kde jsou těžké řetězce spojeny cystinovými můstkyspojeny cystinovými můstky

Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží se na Fc receptoryse na Fc receptory

J řetězecJ řetězec

Sekreční komponentaSekreční komponenta

Protilátka štěpená papainem Protilátka štěpená Protilátka štěpená papainem Protilátka štěpená pepsinem pepsinem

Funkce imunoglobulinůFunkce imunoglobulinů

Neutralizace AgNeutralizace Ag

Aglutinace AgAglutinace Ag

Aktivace komplementuAktivace komplementu

Opsonizace (IgM, IgG, IgE)Opsonizace (IgM, IgG, IgE)

Aktivace mastocytů prostřednictvím IgEAktivace mastocytů prostřednictvím IgE

ADCCADCC

Třídy imunoglobulínů a jejich funkceTřídy imunoglobulínů a jejich funkce

Rozlišujeme podle konstantní části H řetězceRozlišujeme podle konstantní části H řetězce IgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgEIgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgE

IgMIgM - jako monomer tvoří BCR - jako monomer tvoří BCR - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na Fc receptory fagocytů Fc receptory fagocytů - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů)

IgDIgD - jako monomer tvoří BCR - jako monomer tvoří BCR - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci

- (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)- (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)

IgG IgG - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností

aktivovat komplement a vázat se na Fc aktivovat komplement a vázat se na Fc

receptory receptory

fagocytů (opsonizace) fagocytů (opsonizace)

- funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace - funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace

komplementu komplementu

- přestupuje placentou- přestupuje placentou

- tvořen při sekundární imunitní odpovědi- tvořen při sekundární imunitní odpovědi

- (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů) - (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů)

IgAIgA - - slizniční IgA slizniční IgA -- ochrana sliznic, neutralizace, ochrana sliznic, neutralizace, opsonizace, neaktivuje opsonizace, neaktivuje komplementkomplement - dimér se sekreční komponentou - dimér se sekreční komponentou - sliny, slzy, mateřské mléko - sliny, slzy, mateřské mléko - - sérový IgA sérový IgA – monomer, dimer či trimer– monomer, dimer či trimer - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů)

IgEIgE - uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným - uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným parazitům parazitům - je hlavní příčinou alergických reakcí - je hlavní příčinou alergických reakcí

- (koncentrace 3- (koncentrace 3xx1010-4-4 g/l; biol. poločas 2 dny) g/l; biol. poločas 2 dny)

Genetický základ tvorby Genetický základ tvorby imunoglobulinůimunoglobulinů

Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14 V V (variabilita) - několik set(variabilita) - několik set D D (diversita) - asi 50(diversita) - asi 50 JJ (joining) – 9 (joining) – 9 CC konstantní části H řetězce konstantní části H řetězce

Genové segmenty pro L řetězce - Genové segmenty pro L řetězce - chromozóm 2chromozóm 2 - - chromozóm 22 chromozóm 22

V V (variabilita)(variabilita) JJ (joining) (joining) CC konstantní části L řetězce konstantní části L řetězce

Na koncích V, D, J úsekůNa koncích V, D, J úseků jsou signální sekvencejsou signální sekvence, , které jsou rozpoznávány enzymy které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázamirekombinázami, které , které provádějí přeskupování těchto genůprovádějí přeskupování těchto genů

Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázamirekombinázami, které provádějí izotypový přesmyk, které provádějí izotypový přesmyk

Přeskupování genů kódujících H řetězcePřeskupování genů kódujících H řetězce

1.1. D-J přeskupeníD-J přeskupení - vyštěpení úseku IgH mezi některým - vyštěpení úseku IgH mezi některým DD a a JJ segmentem (probíhá na obou chromozómech) segmentem (probíhá na obou chromozómech)

2.2. V-D přeskupení V-D přeskupení – vyštěpení úseku mezi některým – vyštěpení úseku mezi některým VV segmentem a segmentem a DJDJ; pokud je přeskupení na některém ; pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. druhém chromozómu – tzv. alelická exkluzealelická exkluze ( to platí ( to platí i pro L řetězce) i pro L řetězce) Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce ..

Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

Přeskupování genů kódujících L řetězcePřeskupování genů kódujících L řetězce1.1. Nejprve se přeskupují geny kódující Nejprve se přeskupují geny kódující L řetězec L řetězec ,,

dochází k vyštěpování úseků mezi některýmdochází k vyštěpování úseků mezi některým V V a a JJ segmentem (souběžně na obou chromozómech), segmentem (souběžně na obou chromozómech), pokud je přeskupení na některém z chromozómů pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. chromozómu – tzv. alelická exkluze.alelická exkluze.

2.2. Jestliže není přeskupování Jestliže není přeskupování genů úspěšné, genů úspěšné, zahájí se přeskupování genů zahájí se přeskupování genů . .

3.3. Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit stabilní dimery.stabilní dimery.

Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

Variabilita imunoglobulinůVariabilita imunoglobulinů

Variabilita imunoglobulinů je dána:Variabilita imunoglobulinů je dána:

1.1. RůznorodostíRůznorodostí kombinací V(D)J segmentůkombinací V(D)J segmentů

2.2. Spojovací variabilitouSpojovací variabilitou – po vyštěpení genových – po vyštěpení genových úseků nejsou konce odstřiženy zcela přesněúseků nejsou konce odstřiženy zcela přesně

3.3. EnzymEnzym terminální transferázaterminální transferáza – prodlužuje – prodlužuje odstřižené konce o krátké náhodné tzv. odstřižené konce o krátké náhodné tzv. N-N-sekvencesekvence

4.4. Somatické mutaceSomatické mutace V segmentů přeskupených V segmentů přeskupených genů po kontaktu s Ag na povrchu FDCgenů po kontaktu s Ag na povrchu FDC

Izotypový přesmyk (class switch)Izotypový přesmyk (class switch)

Dochází k němu během terminální diferenciace B Dochází k němu během terminální diferenciace B lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný kostimulační signál přes CD40)(nezbytný kostimulační signál přes CD40)

Enzymy Enzymy rekombinázyrekombinázy rozpoznávají rozpoznávají switch switch sekvencesekvence lokalizované po stranách C segmentů lokalizované po stranách C segmentů (tato sekvence není mezi C(tato sekvence není mezi C a C a C segmenty – B segmenty – B buňka může před izotypovým přesmykem buňka může před izotypovým přesmykem produkovat IgM i IgD zároveň)produkovat IgM i IgD zároveň)a vyštěpují úseky genůa vyštěpují úseky genů

Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán

ten segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po ten segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po sestřihu sestřihu a translaci vzniká příslušný a translaci vzniká příslušný izotyp H řetězceizotyp H řetězce

Izotypový přesmyk (class switch) - Izotypový přesmyk (class switch) - pokračovánípokračování

CytokinyCytokiny regulují k jakému izotypovému přesmyku regulují k jakému izotypovému přesmyku dojde:dojde:

IL-4IL-4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 TGFTGF stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA

Regulace, zda půjde o Regulace, zda půjde o sekretovanou či sekretovanou či membránovou formumembránovou formu probíhá na úrovni mRNA (na 3 probíhá na úrovni mRNA (na 3´konci C segmentu jsou za sekvencemi kódujícími ´konci C segmentu jsou za sekvencemi kódujícími secernovanou formu sekvence pro membránovou secernovanou formu sekvence pro membránovou formu)formu)

Antiidiotypové Antiidiotypové protilátkyprotilátky

IDIOTOP = každá determinanta variabilní části IDIOTOP = každá determinanta variabilní části protilátky, může být součástí paratopu,protilátky, může být součástí paratopu, či může ležet mimo paratop či může ležet mimo paratop

IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických vazebných struktur pro Ag vazebných struktur pro Ag na protilátkách stejné specifity na protilátkách stejné specifity

Idiotypické struktury protilátek 1. generace jsouIdiotypické struktury protilátek 1. generace jsou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou se proti nim tvořit tzv. se proti nim tvořit tzv. antiidiotypové protilátkyantiidiotypové protilátky (protilátky 2. generace; (protilátky 2. generace; některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu protilátek 1. generace) protilátek 1. generace)

Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace (anti-antiidiotypové protilátky) (anti-antiidiotypové protilátky)

Tato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědiTato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědi

B lymfocytyB lymfocyty

B lymfocytyB lymfocyty B-lymfocytyB-lymfocyty ( (B buňkyB buňky) jsou buňky zodpovědné především ) jsou buňky zodpovědné především

za specifickou, za specifickou, protilátkamiprotilátkami zprostředkovanou imunitní zprostředkovanou imunitní odpověď. Mají rovněž velký význam pro odpověď. Mají rovněž velký význam pro imunitní paměťimunitní paměť (využívá se při očkování). (využívá se při očkování).

B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí BCR B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí BCR (B cell receptor)(B cell receptor)

Příslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo k vazbě Příslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo k vazbě antigenu, je stimulován k pomnožení a diferenciaci na antigenu, je stimulován k pomnožení a diferenciaci na efektorové neboli efektorové neboli plazmatické bbplazmatické bb., které produkují velké ., které produkují velké množství množství protilátekprotilátek stejné specifity, jako je BCR (jde vlastně stejné specifity, jako je BCR (jde vlastně o tentýž protein v rozpustné formě), vážou se tedy na stejný o tentýž protein v rozpustné formě), vážou se tedy na stejný antigen. Z části stimulovaných B-lymfocytů se diferencují antigen. Z části stimulovaných B-lymfocytů se diferencují paměťové buňky. paměťové buňky.

Povrchové znaky B lymfocytůPovrchové znaky B lymfocytů

CD 10CD 10 - nezralý B lymfocyt - nezralý B lymfocyt

CD 19CD 19 - charakteristický povrchový znak B lymfocytů - charakteristický povrchový znak B lymfocytů

CD 20 CD 20 - na povrchu Ig-pozitivních B lymfocytů- na povrchu Ig-pozitivních B lymfocytů

IgM, IgDIgM, IgD - BCR - BCR

MHC gp II.třídyMHC gp II.třídy - Ag prezentující molekuly - Ag prezentující molekuly

CD 40 – kostimulační receptorCD 40 – kostimulační receptor

Vývoj B lymfocytůVývoj B lymfocytů

Vývoj B lymfocytů probíhá v kostní dřeni a dokončuje se posetkání s Vývoj B lymfocytů probíhá v kostní dřeni a dokončuje se posetkání s Ag v sekundárních lymfatických orgánech.Ag v sekundárních lymfatických orgánech.

Pluripotentní hematopoetická kmenová buňkaPluripotentní hematopoetická kmenová buňka

Progenitor B lymfocytuProgenitor B lymfocytu → zahájení rekombinačních procesů, které → zahájení rekombinačních procesů, které vedou ke vzniku velkého množství klonů vedou ke vzniku velkého množství klonů B lymfocytů s individuálně specifickými BCR B lymfocytů s individuálně specifickými BCR

Pre B lymfocytPre B lymfocyt → exprese → exprese pre-B receptorupre-B receptoru (tvořen H( (tvořen H()) řetězcem řetězcem a náhradním L řetězcem) a náhradním L řetězcem)

Nezralý B lymfocytNezralý B lymfocyt → exprese povrchového → exprese povrchového IgMIgM (BCR); v této fázi (BCR); v této fázi vývoje dochází k eliminaci autoreaktivních klonů vývoje dochází k eliminaci autoreaktivních klonů

Zralý B lymfocytZralý B lymfocyt → exprese povrchového → exprese povrchového IgM a IgDIgM a IgD (BCR) (BCR)

Kritické momenty při vývoji B lymfocytůKritické momenty při vývoji B lymfocytů

1.1. Dokončení přeskupování genů pro H řetězce a Dokončení přeskupování genů pro H řetězce a povrchová exprese pre-BCRpovrchová exprese pre-BCR

2.2. Úspěšné přeskupení genů pro L řetězec a Úspěšné přeskupení genů pro L řetězec a povrchová exprese IgM (BCR)povrchová exprese IgM (BCR)

3.3. Testování nezralých B lymfocytů, zda nejsou Testování nezralých B lymfocytů, zda nejsou autoreaktivníautoreaktivní

4.4. Dalším kritickým stádiem procházejí při zahájení Dalším kritickým stádiem procházejí při zahájení somatických mutací a afinitní maturaci, kdy somatických mutací a afinitní maturaci, kdy přežívají pouze B lymfocyty s nejvyšší afinitou k přežívají pouze B lymfocyty s nejvyšší afinitou k antigenu.antigenu.

BCRBCR BCR se skládá z BCR se skládá z povrchového povrchového

imunoglobulinuimunoglobulinu ( (IgMIgM,, IgD IgD – – H řetězce jsou H řetězce jsou transmembránové ; rozeznává transmembránové ; rozeznává Ag) a asociovaných Ag) a asociovaných signalizačních signalizačních molekul molekul ((IgIg a a IgIg), které jsou ), které jsou asociovány asociovány s cytoplazmatickými s cytoplazmatickými protein protein tyrosin-kinázamityrosin-kinázami (PTK) skupiny (PTK) skupiny SrcSrc

Po současném navázání Ag na 2 či Po současném navázání Ag na 2 či více BCR dojde k přiblížení PTK, více BCR dojde k přiblížení PTK, vzájemné fosforylaci a fosforylaci vzájemné fosforylaci a fosforylaci dalších cytoplazmatických dalších cytoplazmatických proteinů, což vede ke změnám proteinů, což vede ke změnám transkripce genů, proliferaci, transkripce genů, proliferaci, diferenciaci a sekreci protilátekdiferenciaci a sekreci protilátek

Signály spuštěné vazbou Ag na Signály spuštěné vazbou Ag na BCR mohou být zesíleny BCR mohou být zesíleny spoluprací s CR2, který váže C3dg spoluprací s CR2, který váže C3dg (opsonin)(opsonin)

Eliminace autoreaktivních klonů B Eliminace autoreaktivních klonů B lymfocytůlymfocytů

Při náhodném přeskupováním genů, spojovacích Při náhodném přeskupováním genů, spojovacích nepřesnostech, párování H-L a somatických mutací mohou nepřesnostech, párování H-L a somatických mutací mohou vzniknout i klony B lymfocytů nesoucí vzniknout i klony B lymfocytů nesoucí autoreaktivní autoreaktivní receptoryreceptory a produkující a produkující autoreaktivní protilátky.autoreaktivní protilátky.

Většina autoreaktivních B lymfocytů je eliminována na Většina autoreaktivních B lymfocytů je eliminována na úrovni nezralých B lymfocytů (v kostní dřeni), jestliže svým úrovni nezralých B lymfocytů (v kostní dřeni), jestliže svým BCR váží autoantigen s dostatečnou afinitou, obdrží signál BCR váží autoantigen s dostatečnou afinitou, obdrží signál vedoucí k vedoucí k apoptotické smrti.apoptotické smrti.

Pokud touto eliminací projdou některé autoreaktivní klony, Pokud touto eliminací projdou některé autoreaktivní klony, jejich autoreaktivita se většinou neprojeví, protože k jejich jejich autoreaktivita se většinou neprojeví, protože k jejich aktivaci chybí příslušné Taktivaci chybí příslušné THH lymfocyty, mnohé autoantigeny lymfocyty, mnohé autoantigeny

jsou kryptické, či se vyskytují v malé koncentraci a jsou jsou kryptické, či se vyskytují v malé koncentraci a jsou imunitním systémem ignorovány.imunitním systémem ignorovány.

Setkání B lymfocytu s Ag v Setkání B lymfocytu s Ag v sekundárních lymfatických orgánechsekundárních lymfatických orgánech

Ontogeneze tvorby protilátekOntogeneze tvorby protilátek

Syntéza Syntéza specifických protilátekspecifických protilátek začíná kolem 20.- začíná kolem 20.-24.týdne gestace, celková koncentrace IgA a IgM 24.týdne gestace, celková koncentrace IgA a IgM zůstává až do porodu neměřitelná, IgG se začínají zůstává až do porodu neměřitelná, IgG se začínají tvořit až po porodutvořit až po porodu

B lymfocyty na imunizaci reagují převážně tvorbou B lymfocyty na imunizaci reagují převážně tvorbou IgM, přesmyk na jiné izotypy je pomalejšíIgM, přesmyk na jiné izotypy je pomalejší

Pozvolný nárůst tvorby vlastních IgG za poklesu Pozvolný nárůst tvorby vlastních IgG za poklesu mateřských IgG (kolem 3.-6.měs.)mateřských IgG (kolem 3.-6.měs.)

Ontogeneze tvorby protilátekOntogeneze tvorby protilátek

Koncentrace IgM dosahuje hodnot srovnatelných Koncentrace IgM dosahuje hodnot srovnatelných s dospělými v 1.-3.roce života, IgG+A mezi 10.-s dospělými v 1.-3.roce života, IgG+A mezi 10.-15.r. 15.r.

Protilátková reakce na polysacharidové antigeny Protilátková reakce na polysacharidové antigeny se objevuje až kolem 2.roku životase objevuje až kolem 2.roku života

Ve stáří Ve stáří je slabší protilátková odpověď na nové je slabší protilátková odpověď na nové podněty podněty a vyšší produkce autoprotiláteka vyšší produkce autoprotilátek