NNG MINH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN … (282).pdf · ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi trƢỜng ĐẠi hỌc khoa hỌc tỰ nhiÊn----- nng minh tuẤn

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NÔNG MINH TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU

VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM

CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

Lyn.k

Rectangle

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NÔNG MINH TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU

VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM

CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHẠM THẾ HẢI

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thế Hải, giảng viên bộ môn Vi sinh vật

học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Đồng thời em cũng xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thu Thủy, phòng Vi sinh vật học môi

trường, và KTV Đỗ Minh Phương, phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học đã giúp đỡ

trong thời gian em làm luận văn ở phòng.

Em cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong Khoa sinh học-

Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội, đã tận tình giảng dạy,

truyền đạt những kiến thức chuyên môn, bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập tại

Trường.

Tôi cũng vô cùng cảm ơn các bạn trong lớp và các em sinh viên phòng Vi sinh vật

học môi trường đã động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và làm đề tài.

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, con xin gửi lời cảm ơn tới

Bố, Mẹ và những người thân trong gia đình đã nuôi nấng, dậy dỗ, và luôn ủng hộ, động

viên con trong suốt quá trình học làm người.

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu mã số 08/HĐ -

ĐT.08.14/CNMT thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học, ứng dụng và chuyển giao công

nghệ phát triển ngành công nghiệp môi trường” của Bộ Công thương.

Hà Nội, ngày….tháng….năm 2014

Học Viên

Nông Minh Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................

MỤC LỤC .....................................................................................................................

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................

DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1 Ô NHIỄM NƢỚC TẠI VIỆT NAM ................................................................. 3

1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ . 5

1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU

XỬ LÝ..................................................................................................................... 7

1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật ........................................... 7

1.3.2 Cảm biến sinh học vi sinh vật ........................................................................ 9

1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT .................................................................. 12

1.4.1 Các loại Thiết kế MFC ................................................................................. 15

1.4.2 Vật liệu cấu tạo MFC ................................................................................... 17

1.4.2.1 Vật liệu cho điện cực ................................................................................. 17

1.4.2.2 Màng trao đổi ion ...................................................................................... 19

1.4.3 Vật liệu tạo khung cho MFC ........................................................................ 22

1.4.4 Ứng dụng của MFC ...................................................................................... 23

1.5 HỆ VI SINH VẬT TRONG MFC .................................................................. 24

1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG MFC ........ 27

Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 29

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................ 29

2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 29

2.1.2 Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 30

2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 31

2.2.1 Lựa chọn thiết kế tối ƣu cho MFC ............................................................... 31

2.2.2 Thiết kế, lắp đặt hệ thống MFC ................................................................... 31

2.2.3 Quy trình làm giầu vi sinh vật trong các MFC: ........................................... 32

2.2.4 Vận Hành Hệ Thống MFC ........................................................................... 33

2.2.5 Đo đạc và xử lý số liệu ................................................................................. 35

2.2.7 Phƣơng pháp DGGE .................................................................................... 38

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 43

3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ MFC PHÙ HỢP ...................................................... 43

3.1.1 Lựa chọn vật liệu cho MFC ......................................................................... 43

3.1.2 Lựa chọn thiết kế MFC nhằm phát triển cảm biến sinh học ........................ 44

3.1.3 Thử nghiệm để chọn lựa thiết kế thiết kế ƣu việt hơn ................................. 47

3.1.3.1 Kết quả làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC ............................... 47

3.1.3.2 So sánh các MFC với dạng thiết kế khác nhau ......................................... 48

3.2 LỰA CHỌN NGUỒN VI SINH VẬT PHÙ HỢP ĐỂ LÀM GIÀU HỆ VI

SINH VẬT ĐIỆN HÓA TRONG CÁC MFC ...................................................... 53

3.2.1 Dòng điện phát sinh bởi các MFC trong giai đoạn làm giàu hệ vi sinh vật

điện hóa ................................................................................................................. 53

3.2.2 Độ ổn định của dòng điện phát sinh trong MFC sau khi làm giàu thành công

hệ vi sinh vật điện hóa ........................................................................................... 55

3.2.3 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật trong điện cực anode của MFC sau khi làm

giàu thành công ..................................................................................................... 57

3.2.4 Kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phƣơng pháp DGGE ................. 60

3.2.5 Kết quả phân tích trình tự các băng DNA thu đƣợc từ các quần xã trên

DGGE .................................................................................................................... 63

3.3 BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM HỆ THỐNG MFC VỚI DUNG DỊCH MÔ

PHỎNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM ............. 66

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 68

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 70

PHỤ LỤC ......................................................................................................................

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ Tên tiếng anh Tên tiếng việt

AEM Anion exchange membrane Màng anion

BH - Nguồn quần xã từ bùn hoạt tính

BOD Biochemical oxigen demand Nhu cầu oxy sinh hóa

BPM Bipolar membrane Màng phân cực

BT - Nguồn quần xã từ bùn tự nhiên

CEM Cation exchange membrane Màng cation

COD Chemical oxigen demand Nhu cầu oxy hóa học

DGGE Denaturing gradient gel

electrophoresis

Điện di gradient gel biến tính

ĐT - Nguồn quần xã từ đất tự nhiên

HH - Nguồn quần xã từ hỗn Hợp

MFC Microbial fuel cell Pin nhiên liệu vi sinh vật

NT - Nguồn quần xã từ nƣớc thải

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Rint Internal resistance Điện trở trong

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC ............................................................ 12

Hình 2: (a) Thiết kế MFC sử dụng chổi than chì là điện cực anode nhƣ là một bề

mặt cho vi sinh vật phát triển và với điện cực cathode sử dụng vải carbon.. (b) Biểu

diễn phƣơng thức truyền điện tử của trong màng biofilm: sản sinh nanowires, chất

truyền điện tử trung gian, và tiếp xúc qua bề mặt tế bào ......................................... 13

Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC ................................................................................ 14

Hình 4: Vật liệu carbon sử dụng cho điện cực anodes: (A) giấy carbon, (B) vải các

bon, (C) lƣới carbon ................................................................................................. 18

Hình 5: Một vài vật liệu dùng làm điện cực cho MFC (A) Thanh than chì (B; C; D)

Tấm than chì ............................................................................................................. 18

Hình 6: (A) Hạt than chì, (B; C) Chổi than chì (D) Sợ than chì .............................. 19

Hình 7: Các loại màng đƣợc sử dụng trong MFC .................................................... 21

Hình 8: Cơ chế hoạt động của các loại màng phân tách ........................................... 21

Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy tinh ............................................................... 22

Hình 10: MFC một khoang-khung thủy tinh ............................................................ 22

Hình 11: MFC một khoang- khung polyacrylic ....................................................... 23

Hình 12: MFC hai khoang- khung polyacrylic ......................................................... 23

Hình 13: MFC dạng ống- khung polypropylen ......................................................... 23

Hình 14: MFC một khoang- khung Plexiglas ........................................................... 23

Hình 15 : MFC khoang chữ nhật ............................................................................... 32

Hình 16 : MFC khoang trụ ........................................................................................ 32

Hình 17: Sơ đồ hoạt động hệ thống MFC ................................................................. 34

Hình 18: Hệ thống MFC vận hành trong phòng thí nghiệm ..................................... 34

Hình 19: Biểu đồ hiệu điện thế MFC trong quá trình làm giàu (BOD 50 ppm) ....... 47

Hình 20: Hiệu điện thế MFC khoang hình hộp chữ nhật sau quá trình làm giàu

(BOD 50 ppm) ........................................................................................................... 49

Hình 21: Hiệu điện thế MFCs khoang hình trụ sau quá trình làm giàu .................... 49

Hình 22: MFC khoang hình hộp chữ nhất ................................................................ 51

Hình 23: MFC khoang hình trụ ................................................................................. 51

Hình 24: MFC khoang hình hộp chữ nhất ................................................................ 52

Hình 25: MFC khoang hình trụ ................................................................................. 52

Hình 26: Quá trình làm giàu MFC với nguồn quần xã khác nhau ............................ 54

Hình 27: So sánh dòng điện sau quá trình làm của MFC tại hai thời điểm có khoảng

là cách 20 ngày .......................................................................................................... 56

Hình 28: Ảnh phân lập mẫu điện cực anode từ MFC đã đƣợc làm giàu thành công 57

Hình 29: Tỷ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ điện cực anode tại

các MFC .................................................................................................................... 59

Hình 30: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR gen 16s rRNA và vùng V3 .................... 60

Hình 31: Kết quả phân tích gen 16S rRNA bằng DGGE của các mẫu quần xã vi

khuẩn trong các nguồn khác nhau và các mẫu quần xã vi khuẩn từ điện cực anode

của các MFC làm giàu từ các nguồn ......................................................................... 62

Hình 32: Kết quả phân tích tƣơng quan của các quần xã vi khuẩn đƣợc nghiên cứu

dựa trên kêt quả DGGE (bằng cách sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0) .................. 63

Hình 33: Biểu đồ dòng điện trung bình của MFC thử nghiệm với các nồng độ BOD

khác nhau trong dung dịch nƣớc thải mô phỏng ở anode ......................................... 67

Hình 34: Vị trí các băng DNA trên DGGE đƣợc thôi gel và đem giải trình tự .......... 1

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Đặc trƣng thành phần nƣớc thải của một số ngành công nghiệp .................. 3

Bảng 2: Tổng lƣợng nƣớc thải và lƣợng thải các chất ô nhiễm trong nƣớc thải từ

một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng ........................................................... 4

Bảng 3: Một số thông số ô nhiễm nƣớc thải trong công nghiệp theo tiêu chuẩn ....... 5

Bảng 4: Theo dõi sự thay đổi hành vi của cá liên kết với điều kiện stress ................. 8

Bảng 5: Tổng hợp nghiên cứu về cảm biến sinh học vi sinh vật quang học ............. 10

Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC không sử dụng chất truyền điện tử

trung gian .................................................................................................................. 26

Bảng 7: Môi trƣờng LB ............................................................................................. 35

Bảng 8: Môi trƣờng C ............................................................................................... 36

Bảng 9: Môi trƣờng PDA ......................................................................................... 36

Bảng 10: Môi trƣờng Hansen .................................................................................... 37

Bảng 11: Môi trƣờng BG 11 ..................................................................................... 37

Bảng 12: Thành phần của dung dịch Trace metal mix A5........................................ 38

Bảng 13: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen16s rRNA .......... 39

Bảng 14: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng V3 thuộc gen16s

rRNA ......................................................................................................................... 40

Bảng 15: Thành phần của dung dịch biến tính 0% và 60% ...................................... 41

Bảng 16: Thành phần của “Working solution” ......................................................... 41

Bảng 17: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các vật liệu cấu tạo MFC ........................... 43

Bảng 18: Phân tích ƣu nhƣợc điểm vật liệu cấu tạo khung MFC ............................. 44

Bảng 19: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các loại màng phân tách ............................. 44

Bảng 20: Phân tích ƣu nhƣợc điểm các loại thiết kế MFC ....................................... 45

Bảng 21: Tổng hợp các nghiên cứu về dạng MFC biosensor ................................... 46

Bảng 22: Bảng so sánh trình tự các băng DNA đƣợc thôi gel từ gel DGGE với dữ

liệu trình tự DNA trên NCBI .................................................................................... 64

1

MỞ ĐẦU

Nƣớc là một phần thiết yếu trong quá trình sinh hoạt–sản xuất của con ngƣời.

Tuy nhiên, với sự phát triển của dân số, quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa,

lƣợng nƣớc do con ngƣời sử dụng đang ngày càng gia tăng, đi kèm với nó là hậu

quả gây ô nhiễm nƣớc nghiêm trọng. Ảnh hƣởng của ô nhiễm nƣớc đối với sức

khỏe con ngƣời có thể thông qua hai con đƣờng: (i) ăn-uống phải nƣớc bị ô nhiễm

hay các loại rau quả và thủy sản đƣợc nuôi trong môi trƣờng nƣớc ô nhiễm, (ii) do

tiếp xúc với môi trƣờng nƣớc trong quá trình lao động và sinh hoạt. Ngoài ra ô

nhiễm nƣớc còn kéo theo các thiệt hại về kinh tế do bệnh tật, thiệt hại về thủy sản

và nông nghiệp, và ảnh hƣởng tới nguồn cung cấp nƣớc sạch [2, 4, 5].

Một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm nguồn nƣớc hiện nay là

tình trạng nƣớc thải chƣa qua xử lý hoặc xử lý kém đƣợc trực tiếp xả vào môi

trƣờng. Để ngăn chặn nguy cơ này thì cần phải có các phƣơng pháp hợp lý để đánh

giá nhanh chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý, nhằm đáp ứng nhu cầu của ngƣời sản xuất

cũng nhƣ ngƣời quản lý [2].

Phƣơng pháp phân tích hóa-lý là phổ biến hiện nay đƣợc sử dụng cho việc

phân tích-đánh giá chất lƣợng nƣớc thải. Phƣơng pháp này sử dụng mối tƣơng tác

giữa chất cần phát hiện trong nƣớc với một loại hóa chất đƣợc thêm vào dùng làm

chỉ thị để định tính cũng nhƣ định lƣợng chất cần kiểm tra, hoặc áp dụng các kỹ

thuật nhƣ: sắc ký lỏng cao áp (HPCL), sắc ký phối khổ (GC – MS), hay phƣơng

pháp so màu... Tuy nhiên, tất cả các kỹ thuật này đòi hỏi ngƣời phân tích phải có tay

nghề chuyên môn cao, tốn kém trong sử dụng, và thời gian phân tích dài. [1].

Những nghiên cứu gần đây đã tập trung phát triển phƣơng pháp sử dụng tác

nhân sinh học nhƣ một cảm biến hay một hệ thống cảnh báo sớm chất lƣợng nƣớc.

Cảm biến sinh học (biosensor) là hệ thống phân tích các tác nhân sinh học nhƣ

DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá – đo lƣờng các dấu hiệu

hóa – lý các tác nhân sinh học đó. Các cảm biến sinh học tỏ ra thuận lợi trong việc

2

đánh giá chất lƣợng nƣớc nhƣ kiểm tra trực tiếp nguồn nƣớc, nhạy cảm với chất độc

và phát hiện nhiều độc tố cùng một thời điểm, cảnh báo chất độc, không chỉ theo

dõi độc tính mà còn theo dõi tốc độ thay đổi thành phần-nồng độ chất độc, có thể

theo dõi từ xa, dễ dàng sử dụng...[9, 32, 66, 70, 73]. Trong đó, cảm biến sinh học

khai thác quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đang đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên

cứu và ứng dụng [32]. Pin nhiên liệu vi sinh vật là một dạng thiết bị cảm biến hoạt

động dựa trên hoạt tính điện hóa của vi sinh vật. Loại thiết bị này đƣợc nghiên cứu

tại nhiều quốc gia nhƣ Hàn Quốc, Hoa Kỳ, hay Châu Âu, chúng có ƣu điểm nhƣ có

khả năng chỉ dẫn BOD nƣớc thải, có thời gian phản ứng nhanh, dễ dàng sử dụng,

chi phí thấp [17, 25, 26, 29].

Tại Việt Nam hiện nay những nghiên cứu về pin nhiên liệu vi sinh vật cũng

nhƣ ứng dụng chúng làm cảm biến sinh học trong đánh giá chất lƣợng nƣớc thải còn

khá hạn chế [52]. Nhằm góp phần vào các nghiên cứu về pin nhiêu liệu vi sinh cũng

nhƣ phát triển một thiết bị cảm biến có khả năng đánh giá chất lƣợng nƣớc thải với

thời gian phân tích nhanh và khả năng sử dụng nhiều lần… chúng tôi tiến hành đề

tài “ Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell)

sử dụng làm cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải”.

3

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN

1.1 Ô NHIỄM NƢỚC TẠI VIỆT NAM

Ô nhiễm nƣớc xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau, tuy nhiên tại Việt

Nam hiện nay có bốn nguồn gây ô nhiễm nƣớc chính: nƣớc thải nông nghiệp, công

nghiệp, sinh hoạt và y tế. Theo Báo cáo môi trƣờng quốc gia 2012 của Việt Nam,

nƣớc thải sinh hoạt chiếm 30% tổng lƣợng nƣớc thải trực tiếp ra các sông hồ; kênh

rạch. Trong giai đoạn đẩy mạnh công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nƣớc, nhiều

ngành công nghiệp đƣợc mở rộng quy mô sản xuất, cũng nhƣ phạm vi phân bố. Tuy

nhiên mức đầu tƣ cho hệ thống xử lý nƣớc thải lại chƣa đáp ứng đƣợc nhƣ cầu này,

Số lƣợng nƣớc thải công nghiệp đƣợc xử lý là đang ở mức trung bình (50 – 60%),

nhƣng hơn 50% hệ thống xử lý đó vẫn chƣa hoạt động hiệu quả. Cũng theo báo cáo

của Sở Tài Nguyên Môi Trƣờng Hà Nội năm 2009, có tới 93% tổng lƣợng nƣớc thải

chƣa đƣợc xử lý xả thẳng vào hệ thống, lƣợng nƣớc còn lại chỉ đƣợc xử lý sơ bộ

trong các bể tự hoại, bể lắng trong tuyến thoát nƣớc. Bên cạnh đó, nƣớc thải nông

nghiệp cũng là vấn đề đáng quan tâm hiện nay. Nƣớc thải nông nghiệp thƣờng chứa

các chất hóa chất bảo vệ thực vật, hay thuốc trừ sâu gây hại cho sức khỏe con ngƣời

và hệ sinh thái nƣớc mặt [2, 4].

Bảng 1: Đặc trƣng thành phần nƣớc thải của một số ngành công nghiệp [2]

Ngành công nghiệp Chất ô nhiễm chính Chất ô nhiễn phụ

Chế biến đồ hộp, thủy sản, rau quả,

đông lạnh

BOD, COD, pH, SS Màu, tổng P, N

Chế biến nƣớc uống có cồn, bia,

rƣợu

BOD, pH, SS, N, P TDS, màu, độ đục

Chế biến thịt BOD, pH, SS, độ đục NH4+, P , màu

Sản xuất bột ngọt BOD, SS, pH, NH4+

Độ đục, NO3-, PO4

3-

Cơ khí COD, dầu mỡ, SS, CN-,

Cr, Ni

SS, Zn, Pb, Cd

4

Bảng 2: Tổng lƣợng nƣớc thải và lƣợng thải các chất ô nhiễm trong nƣớc thải

từ một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng [4]

Khu Vực

Lƣợng

nƣớc thải

(m3/ ngày)

Tổng lƣợng các chất ô nhiễm (Kg/ ngày)

TSS BOD5 COD Tổng N Tổng P

Bắc Ninh 38946 8568 5336 12424 2259 3116

Hà Nội 36577 8047 5011 11668 2122 2926

Hải Phòng 14026 3086 1922 4474 814 1122

Quảng Ninh 8050 1771 1103 2568 467 644

Hải Dƣơng 23806 5237 3261 7594 1381 1904

Hƣng Yên 12350 2717 1692 3940 716 988

Ô nhiễm nƣớc đƣợc xem là một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng, gây ra

thiệt hại lớn về kinh tế và phá hoại hệ sinh thái. Theo đánh giá của ngân hàng thế

giới, Việt Nam có thể chịu tổn thất do ô nhiễm môi trƣờng lên tới 5, 5 % GDP và

780 triệu USD trong lĩnh vực sức khỏe cộng đồng vì ô nhiễm môi trƣờng. Ô nhiễm

sông Thị Vải là một ví dụ điển hình: một đoạn sông dài khoảng 12 km (từ hợp lƣu

suối Cả-sông Thị Vải tới khu vực cảng Khú Mỹ, phía sau khu công nghiệp Mỹ

Xuân) hầu nhƣ không một loài tôm, cá, thủy sản nào có thể tồn tại và phát triển. Tại

khu vực này chỉ còn chứa các động-thực vật phù du. Ƣớc tính ban đầu diện tích

nông nghiệp bị thiệt hại là 1.438,5 ha, trong đó phần lớn là ao nuôi thủy sản và 29,5

ha là đất nông nghiệp. Một ví dụ khác, một nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động

sản xuất tại khu chế biến kim loại màu thuộc tỉnh Thái Nguyên chỉ ra rằng, hàm

lƣợng chì và arsen trong nƣớc thải sinh hoạt tại vùng này cao hơn 1,5 – 6 lần so với

vùng đối chứng. Qua xét nghiệm máu của phụ nữ trong độ tuổi sinh sản sống liên

tục ở vùng nghiên cứu 5 năm cho thấy hàm lƣợng chì và arsen trong máu của họ cao

hơn trong máu của ngƣời ở vùng đối chứng 3 – 80 lần [2, 4].

5

Từ các dẫn liệu trên có thể thấy việc xả nƣớc thải xử lý kém là một trong

những nguyên nhân chính dẫn đến ô nhiễm nƣớc nghiêm trọng. Vì vậy, một nhu

cầu thực tế hiển nhiên đƣợc đặt ra là cần có các phƣơng pháp hiệu quả để đánh giá

nhanh chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý.

1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ

Đánh giá chất lƣợng nƣớc cũng nhƣ mức độ ô nhiễm của nƣớc cần đựa vào

một số thống số cơ bản về thành phần hóa học và sinh học đối với từng loại nƣớc sử

dụng với các mục đích khác nhau và so sánh chúng với chỉ tiêu cho phép. Các thông

số cơ bản bao gồm: độ pH, màu sắc, độ đục, hàm lƣợng chất rắn, các chất lơ lửng

(huyền phù), các kim loại nặng, chỉ số COD (nhu cầu oxy hóa học-chemical oxygen

demand) và BOD (nhu cầu oxy sinh hóa-Biochemical oxygen demand)…

Bảng 3: Một số thông số ô nhiễm nƣớc thải trong công nghiệp theo tiêu chuẩn

Việt Nam QCVN40: 2011/BTNMT [3]

1 Thông số Đơn vị Giá trị C

A B

1 Nhiệt độ oC 40 40

2 Màu Pt/Co 50 150

3 pH - 6-9 5,5-9

4 BOD5 (20oC) mg/lít 30 50

5 COD mg/lít 75 150

6 Chất rắn lơ lửng mg/lít 50 100

7 Asen mg/lít 0,05 0,1

8 Thủy ngân mg/lít 0,005 0,01

9 Chì mg/lít 0,1 0,5

10 Cadimi mg/lít 0,05 0,1

11 Crom (VI) mg/lít 0,05 0,1

12 Crom (III) mg/lít 0,2 1

Hàm lƣợng chất rắn có trong nƣớc bao gồm: các chất vô cơ ở dạng muối hòa

tan hoặc không hòa tan đƣợc nhƣ đất đá, các chất hữu cơ nhƣ xác của vi sinh vật,

6

tảo, nấm, động vật nguyên sinh…Tổng chất rắn (TS) đƣợc xác định bằng trọng

lƣợng khô thành phần còn lại sau khi cho bay hơi 1 lít mẫu nƣớc rồi sấy khô ở

103oC, hay chất rắn huyền phù (SS) là trọng lƣợng khô của chất rắn sau khi cho 1 lít

mẫu nƣớc đi qua giấy lọc sợi thủy tinh rồi sấy ở 103 – 105oC tới khối lƣợng không

đổi [1, 3, 54].

Các kim loại nặng trong nƣớc hay các chất độc hữu cơ (nhƣ phenol, DDT,

thuốc diệt cỏ…) có thể đƣợc đánh giá bằng các phƣơng pháp so màu với thuốc thử,

sắc ký, hoặc chuẩn độ theo thể tích với một chất hóa học. Ví dụ, để xác định hàm

lƣợng phenol có thể sử dụng một trong hai phƣơng pháp sau: (1) Phƣơng pháp xác

định phenol bằng phƣơng pháp đo màu theo nguyên tắc là tách phenol ra khỏi nƣớc

và cho tác dụng với 2-6 dicloroquinon diclorimmid để tạo phức màu xanh của

indophenol, và qua cƣờng độ màu thu đƣợc ta biết đƣợc hàm lƣợng phenol (đo bƣớc

sóng 610 nm). (2) phƣơng pháp chuẩn độ thể tích theo phép đo iot bằng cách cho

phenol trong nƣớc tác dụng với brom tạo thành tribromophenol, khi thêm kali iodua

vào dung dịch, lƣợng brom phản ứng thừa với phenol sẽ đẩy iot ra khỏi muối

kaliiodua, sau đó ta tiến hành định lƣợng iot bằng natri thiosunfat và qua đó ta tính

đƣợc hàm lƣợng phenol. Một ví dụ khác là phƣơng pháp xác định hàm lƣợng asen

trong nƣớc thải bằng cách so màu trên quang sắc kế với bạc dietylthiocacbamat:

dùng hydro mới sinh để khử muối asen thành khí asin (AsH3); asin sau khi đi qua

một ống chứa bông thủy tinh hoặc giấy lọc tẩm chì axetat rồi đi vào ống hấp thụ có

chứa bạc dietylthiocacbamat hòa tan trong pirindin. Trong ống hấp phụ asen phản

ứng với muối bạc tạo thành một phức tan màu đỏ sử dụng để so màu, cƣờng độ màu

sẽ tỷ lệ với hàm lƣợng asen có trong nƣớc (đo ở bƣớc sóng 350 - 540 nm) [1, 3].

Chỉ số COD là lƣợng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất

hữu cơ có trong nƣớc thải thành CO2 và H2O. Để xác định chỉ số này ngƣời ta

thƣờng xử dụng chất oxy hóa mạnh trong môi trƣờng axit (thƣờng là bicromat-

K2Cr2O7). Lƣợng bicromat dƣ đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch muối Mohrp-

Fe(NH4)2(SO4)2 với chỉ thị là dung dịch Ferroin (chỉ thị sẽ chuyển từ màu xanh lam

sang màu đỏ nhạt) [1, 3, 54].

7

Chỉ số BOD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa các chất hữu cơ có trong

nƣớc bằng vi sinh vật (thƣờng là vi khuẩn) dị dƣỡng, hiếu khí. Quá trình oxy hóa

chất hữu cơ này đòi hỏi thời gian dài ngày, phụ thuộc vào bản chất của chất hữu cơ,

các chủng loại vi sinh vật, hay nhiệt độ và thành phần độc tính của nƣớc. Phƣơng

pháp thƣờng sử dụng hiện nay để đo chỉ số BOD của nƣớc là chỉ số BOD5: tức là

xác định lƣợng oxy cần thiết để oxy hóa chất hữu cơ trong 5 ngày tại nhiệt độ 20oC

trong bóng tối [1, 3, 54].

Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng nƣớc thải ở trên có ƣu điểm là: định

lƣợng chính xác nồng độ chất gây ô nhiễm, đã đƣợc áp dụng rộng rãi tại nhiều nƣớc

trong thời gian dài. Tuy nhiên chúng lại có những nhƣợc điểm nhƣ: không thể chi ra

nhiều tác nhân gây ô nhiễm cùng một lúc, thời gian phân tích khá dài, giá thành đắt,

quy trình phân tích đòi hỏi ngƣời có chuyên môn cao và máy móc-hóa chất đắt

tiền… Vậy nhằm hƣớng tới sự thuận tiện và hiệu quả (đặc biệt là về mặt thời gian)

trong việc đánh giá chất lƣợng nƣớc thải của ngƣời quản lý hay các công ty tƣ nhân,

việc đƣa ra đƣợc một phƣơng pháp đánh giá nhanh chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý,

với chi phí cạnh tranh và dễ sử dụng đang là một nhu cầu bức thiết.

1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU

XỬ LÝ

Một cảm biến sinh học (Biosensor) là một hệ thống phân tích sử dụng các tác

nhân sinh học nhƣ DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá – đo

lƣờng các dấu hiệu hóa – lý của các tác nhân sinh học đó. Các dạng cảm biến sinh

học hay đƣợc sử dụng hiện nay để đánh giá chất lƣợng nƣớc thải thƣờng thuộc hai

dạng: (i) cảm biến dựa trên hành vi của sinh vật, hoặc (ii) cảm biến sử dụng vi sinh

vật [8, 32, 65, 66].

1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật

Nghiên cứu hành vi của sinh vật cung cấp các hiểu biết liên quan đến sinh lý

và sinh thái của sinh vật và môi trƣờng của chúng. Các đặc tính hành vi này gồm

8

chuỗi của hành động có thể xác định. . Việc nghiên cứu các đặc tính này cần dựa

trên những hiểu biết về hệ thống thần kinh ngoại vi, và sự tích lũy - biểu hiện của

gen, các phản ứng sinh hóa, quá trình sinh lý cần thiết cho cơ thể sống, nhƣ việc ăn,

sinh sản, tránh xa động vật ăn thịt... Các đặc tính hành vi này cho phép các sinh vật

có thể điều chỉnh các nhân tố bên trong và bên ngoài cơ thể nhằm giúp cho chúng

có thể thích nghi với những biến đổi của môi trƣờng. Nhờ có các đặc tính hành vi

này và sự ổn định của chúng mà sinh vật có thể sống sót, thích nghi, và sinh sản với

môi trƣờng sống. Năm 1985 Rand đã công bố về hành vi phản ứng với độc tố của

sinh vật trong nƣớc, và sau 20 năm đã có nhiều nghiên cứu quan tâm về số hành vi

phản ứng của nhiều loài với độc tố, cũng nhƣ các cách thức chọn lựa xử lý số liệu

và đánh giá chúng. Năm 1986 chính phủ Hoa Kỳ đã chấp nhận hành vi tránh xa chất

độc là bằng chứng hợp pháp của tổn thƣơng sinh vật. Rất nhiều sinh vật đƣợc

nghiên cứu về các đặc điểm biến đổi hành vi nhằm ứng dụng để đánh giá chất lƣợng

nƣớc nhƣ: cua, bọ nƣớc, cá, sò… [8].

Bảng 4: Theo dõi sự thay đổi hành vi của cá liên kết với điều kiện stress

khác nhau

Loài Tác nhân stress Hành vi Tác giả

Cá hồi Đại Tây

Dƣơng Cu và Zn Tránh xa Sprague, 1964

Cá hồi đốm đen Thuốc diệt cỏ Khả năng bơi lội, hoạt

động ăn,

Little và cộng sự

1990

Cá thái dƣơng Cd, Cr, Zn Trạng thái kích động Ellgaard 1978

Cá vàng Cu Sự nhanh nhẹn, sự

thay đổi góc bơi

Kleerekoper và

cộng sự 1972

Cá thái dƣơng DDT Trạng thái kích động Ellgaard 1977

Cá hồi đốm đem Hỗn hợp kim loại

nặng Hành vi tránh xa Svecevicius 2001

9

Mô hình cá trong kiểm tra đặc tính hành vi độc tố (Bảng 4): Cá là một mô

hình lý tƣởng cho việc nghiên cứu các hành vi của động vật với các tác nhân stress

và các độc tố bởi vì: (i) cơ thể cá tiếp xúc trực tiếp với nƣớc của môi trƣờng có chứa

nhiều chất hóa học cần thử nghiệm, (ii) môi trƣờng sống của cá khá đa dạng, (iii) cá

dễ dàng nuôi; có khả năng sinh sản; và đƣợc nghiên cứu nhiều với các độc tố. Bất

cứ nghiên cứu nào hƣớng tới phát triển một mô hình cảm biến dựa trên phản ứng

hành vi của cá cần phải dựa trên những nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của loài

tƣơng ứng [8].

Mô hình Bọ nước (Daphnia) phát hiện độc tố trong nước: Bọ nƣớc đƣợc sử

dụng nhƣ một cảm biến sinh học hữu ích trong việc phát hiện độc tố trong nƣớc.

Chúng có kích thƣớc cơ thể nhỏ, vòng đời ngắn, dễ nuôi và có thể sinh sản trong

phòng thí nghiệm và phản ứng nhanh với sự thay đổi của thành phần hóa học trong

nƣớc. Bọ nƣớc khi đƣợc thử nghiệm độc tố sẽ có những thay đổi về đặc điểm hành

vi và sinh lý cơ thể. Các chỉ tiêu đánh giá bọ nƣớc trong việc đánh giá chất lƣợng

nƣớc gồm: tốc độ - chiều cao – góc – chuyển động bơi, vị trí phân bố [73].

1.3.2 Cảm biến sinh học vi sinh vật

Cảm biến sinh học sử dụng tập tính hành vi của sinh vật có một số nhƣợc

điểm nhƣ: thời gian đáp trả dài, nghiên cứu về tập tính sinh vật phức tạp đòi hỏi

ngƣời nghiên cứu phải có kiến thức chuyên môn sâu, bị ảnh hƣởng bởi yếu tố bên

ngoài (gây kết quả sai lệch)… Vì vậy, nhiều nghiên cứu gần đây đã tập trung sử

dụng vi sinh vật nhƣ một mô hình cảm biến sinh học. Các vi sinh vật cũng có phản

ứng sinh học tốt giống nhƣ động vật hay thực vật đôi với tác nhân stress. Ngoài ra

chúng còn có khả năng phát hiện nhiều chất hóa học hơn, có thể dễ dàng cải biến

vật chất di truyền, hoạt động với phổ nhiệt độ và pH rộng, thời gian phản ứng

nhanh… Một vài dạng cảm biến sinh học sử dụng vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và

phát triển nhƣ: các cảm biến dựa trên sự phát quang, sự phát huỳnh quang của vi

sinh vật, hoặc cảm biến dựa trên sự điện hóa của vi sinh vật…[32]

10

Cảm biến sinh học vi sinh vật quang học: là cảm biến dựa trên sự biến đổi

đặc tính quang học nhƣ sự hấp thụ tia cực tím, sự phát quang sinh-hóa, gây sự phản

xạ hoặc phát huỳnh quang bởi các phản ứng nội sinh của vi sinh vật (Bảng 5) [32].

Bảng 5: Tổng hợp nghiên cứu về cảm biến sinh học vi sinh vật quang học [32]

Chất ô nhiễm Vi khuẩn Dạng cảm biến

Độc tố của chlorophenol P. fluorescens 10586r pUCD607 Phát quang

Ni2+

và Co2+

Ralstonia eutropha AE2515 Phát quang

Arsenite E. coli DH5α (pPR-arsR-ABS,

biểu hiện gen egfp

Phát quang

Toluen P. fluorescens A506 (pTolLHB) Huỳnh quang

BOD P. putida Huỳnh quang

Sự phát quang sinh học có liên kết với ánh sáng phát ra từ tế bào vi sinh vật

và đóng vai trò quan trọng trong sự chỉ thị trực tiếp chất ô nhiễm. Gen phát quang

lux đã đƣợc phát hiện ở Vibrio fischeri và nghiên cứu ứng dụng rộng rãi. Có thể

thông qua sự biểu hiện của gen lux để đánh giá nồng độ của chất độc ta quan tâm,

bằng cách khai thác quá trình điều hòa của gen này; và qua đó có thể dễ dàng phân

tích số lƣợng nồng độ chất độc dựa vào cƣờng độ phát quang sinh học của sinh vật

chứa gen lux. Ngoài ra các gen có khả năng tạo protein huỳnh quang cũng đã đƣợc

ứng dụng trong việc thiết kế cảm biến sinh học vi sinh vật phát quang nhƣ: gen gfp

mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây [32].

Cảm biến sinh học vi sinh vật điện-hóa: Các cảm biến này hoạt động dựa

trên sự biến đổi của dòng điện (amperometric), điện thế (potentiometric) hay độ dẫn

điện (conductometric) trong mối tƣơng quan đến hoạt động trao đổi chất của vi sinh

vật [32].

Cảm biến sinh học vi sinh vật điện hóa dựa trên dòng điện (amperometric

microbial biosensor) hoạt động với hiệu điện thế cố định, và tiến hành phân tích

11

dòng điện phát sinh bởi quá trình vi sinh vật oxy hóa hoặc khử cơ chất xung quanh

bề mặt điện cực. Cảm biến này đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong việc đánh giá

nhu cầu oxy sinh hóa (BOD) trong nƣớc. Một số chủng vi sinh vật đã đƣợc nghiên

cứu sử dụng: Torulopsis candida, Trichosporon cutaneum, Pseudomonas putida,

Bacillus subtilis… Ngoài ra, cảm biến sinh học vi sinh vật dựa trên dòng điện phát

sinh còn đƣợc sử dụng để đánh giá các chất độc trong nƣớc, ví dụ nhƣ: Moraxella

sp và P. putida phát hiện chất hữu cơ có chứa gốc phosphate là độc tố thần kinh

[32].

Cảm biến sinh học vi sinh vật điện hóa dựa trên điện thế (potentiometric

microbial biosensor) có điện cực chọn lọc ion (pH, ammonium, chloride) hoặc điện

cực cảm biến khí (PCO2 và PNH3); đƣợc bao phủ bởi lớp màng vi sinh vật. Các vi

sinh vật này sử dụng chất cần phân tích và tạo ra sự thay đổi hiệu điện thế từ sự tích

lũy hoặc loại bỏ các ion. Nguyên lý cảm biến dựa trên việc đo sự chuyển đổi của

điện cực đang hoạt động so với điện cực đối chứng, qua đó xác định đƣợc mối

tƣơng quan với nồng độ chất cần phân tích. Ví dụ để phát hiện hợp chất hữu cơ có

chứa phosphate có thể sử dụng một số chủng vi khuẩn Flavobacteium sp. với dạng

điện cực pH, hay có thể hiện urea nhờ chủng Bacillus sp. với dạng điện cực chọn

lọc ion NH4+, hay có thể phát hiện trichloroethylene nhờ chủng P. aeruginosan

JI104 có dạng điện cực chọn lọc ion chloride [32].

Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là dạng cảm biến sinh học đã đƣợc nghiên

cứu nhƣ một cảm biến đo BOD trong một thời gian dài, từ khi Karube và cộng sự

công bố cảm biến BOD kiểu MFC đƣợc sử dụng sản xuất khí hydro bởi Clostridium

butyricum vào năm 1977 [32]. Cảm biến MFC trong việc đánh giá BOD ngày càng

đƣợc phát triển và tối ƣu nhằm mục đích dễ dàng sử dụng, phát hiện nhanh-trực tiếp

nồng độ BOD [17, 25, 26, 35, 36, 45]. Ngoài ra hệ thống MFC có thể sử dụng làm

cảm biến phát hiện độc tố, nhờ dựa vào sự ức chế cơ chế di chuyển electron hoặc

quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố có trong môi trƣờng.

Theo Mia và cộng sự khi thử nghiệm MFC với các chất độc nhƣ: Pb, Hg, PCB, có

thể dễ dàng nhận thấy sự sụt giảm dòng điện phát sinh trong MFC [29].

12

1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT

Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là hệ thống có khả năng phát sinh dòng điện

từ sự oxy hóa cơ chất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Nghiên cứu sớm nhất về MFC

đƣợc thực hiện bởi Potter vào năm 1911, khi tác giả đã thu đƣợc dòng điện phát

sinh trong MFC khi nuôi cấy Escherichia coli và Saccharomyces. Tuy nhiên, MFC

không gây đƣợc sự chú ý cho đến những năm 1980 khi có những phát hiện rằng mật

độ dòng điện và năng lƣợng đầu ra có thể đƣợc tăng lên cao bằng cách thêm vào

MFC chất truyền điện tử trung gian (electron mediator), là chất có thể mang điện

tích từ ngoài tế bào tới điện cực âm (anode). Phần lớn các vi sinh vật có các thành

phần màng lipid, peptidoglycans, lipopolysaccharides và không dẫn điện, có thể cản

trở việc di chuyển của electron tới anode [37, 38].

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC [38]

Ghi chú: Bacterium: vi khuẩn; Anode: cực âm; Cathode: cực dƣơng:

MED: chất truyền điện tử trung gian: e-: điện tử

Hiện nay, các nghiên cứu về hệ vi sinh vật nằm trong màng biofilm tại anode

của MFC cho thấy có hai phƣơng cơ chế vận chuyển điện tử: thông qua kết nối trực

tiếp giữa bề mặt điện cực với màng ngoài tế bào nhờ các cytochrome (vận chuyển e-

trên bề mặt tế bào hoặc nhờ nanowire) hoặc thông qua các chất truyền điện tử trung

gian (đƣợc bổ sung từ ngoài hoặc do vi khuẩn tự sinh ra). [38, 39].

13

Hình 2: (a) Thiết kế MFC sử dụng chổi than chì là điện cực anode nhƣ là một

bề mặt cho vi sinh vật phát triển và với điện cực cathode sử dụng vải carbon.

Tại đây sử dụng màng khếch tán polytetrafluoroethylene. (b) Biểu diễn

phƣơng thức truyền điện tử của trong màng biofilm: sản sinh nanowires, chất

truyền điện tử trung gian, và tiếp xúc qua bề mặt tế bào [39]

Gorby và đồng nghiệp đã công bố về phƣơng tiện truyền điện tử của hai loài

Geobacter sulfurreducens và Shewanella oneidensis và gọi chúng là“nanowires”.

Tiếp đến tác giả nghiên cứu đột biến thiếu hụt cytochrome trong hô hấp với giả

thuyết rằng những giới hạn từ sự vận chuyển electron của nanowires, những đột

biến (mtrC và omcA) đó hầu hết làm suy yếu khả năng sản sinh điện trong MFC

[10, 20]. Những quan sát về nanowires trong sự truyền điện tử của G.

sulfurreducens báo cáo bởi một tác giả khác là Reguera hoàn toàn giống với những

công bố của Gorby, nhƣng cấu trúc của nanowires sản sinh bởi G. sulfurreducens

xuất hiện ít sai khác hơn so với S. oneidensis. Nanowires của G. sulfurreducens

đƣợc coi là một dạng dây đơn, trong khi nanowires của S. oneidensis đƣợc cho là có

thể tạo thành một bó dây [61].

Ngoài khả năng sử dụng phƣơng thức vận chuyển điện tử thông qua

nanowires, một vài vi khuẩn còn có một khả năng khác là vận chuyển điện tử thông

qua bề mặt tế bào. Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng, tại bề mặt tế bào có các

14

phân tử protein nhỏ lồi ra có chức năng vận chuyển điện tử, tuy nhiên chúng không

phải là nanowires [38, 42].

Các chất truyền điện tử trung gian thƣờng đƣợc đƣa vào MFC với mục đích

nhằm tăng khả năng sản sinh dòng điện của chúng. Những nhiên cứu của Poster,

Bond và Lovley đã nhận thấy đối với E. coli khi đƣợc nuôi cấy thuần trong MFC

mà không bổ sung chất truyền điện tử trung gian sẽ không có khả năng phát sinh

dòng điện trong MFC. Một số chất đóng vai trò làm chất truyền điện tử trung gian

thƣờng đƣợc bổ xung vào MFC nhƣ là: đỏ trung tính, anthraquinone-2-6,

disulfonate [37, 38].

Rabaey và cộng sự đã chứng minh rằng các chất truyền điện tử trung gian có

thể đƣợc vi sinh vật trong MFC tự sản xuất, ví dụ nhƣ pycoanin và một vài thành

phần tƣơng tự sản xuất bởi Pseudomonas aeruginosa. Chúng có thể vận chuyển

electron tới điện cực và sản xuất dòng điện trong MFC. Việc sản xuất nồng độ cao

chất truyền điện tử trung gian bằng cách nuôi cấy hỗn hợp có P. aeruginosa là loài

chủ yếu, trong thiết kế MFC sử dụng ferricyanide ở cathode ( thay cho oxy), sản

xuất 3.1 tới 4.2 W/m2 trong MFC [38, 59].

Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC [38]

15

1.4.1 Các loại Thiết kế MFC

Cho đến nay, có khá nhiều các dạng thiết kế MFC đƣợc nghiên cứu và phát

triển. Mỗi dạng thiết kế có những ƣu nhƣợc điểm riêng và phù hợp với những mục

đích sử dụng nhất định. Các dạng thiết kế MFC cơ bản bao gồm:

Hệ thống MFC với cathode không khí: Một thiết kế đơn giản nhằm cải thiện

năng lƣợng sản xuất trong MFC với cathode tiếp xúc không khí (air cathode) đƣợc

phát triển bởi Liu và Logan (2004). Dạng buồng đơn này, với cathode tiếp xúc trực

tiếp với không khí tỏ ra thuận tiện cho nghiên cứu và sử dụng. Khoang phản ứng

gồm có tấm đơn 4 cm Acrylic hoặc Lexan (vật liệu có thể khử trùng) với thể tích

khoang là 28 ml, hai điện cực đƣợc đặt đối nhau ở cuối bề mặt với diện tích phản

ứng là 25 m2/ m

3. Trong thử nghiệm đầu tiên anode đƣợc làm từ giấy carbon Toray,

cathode là dạng vải carbon bao gồm 0.5 mg/ cm2 của chất xúc tác Pt (E – Tek,

USA) mặt bên của phản ứng. Trong hệ thống phát triển đầu tiên sử dụng màng

cation (CEM) của NafionTM

117 và điện trở đƣợc sử dụng gồm loại 500 hoặc 1000

Ω. Công suất của MFC sử dụng glucose trong thí nghiệm là 494 + 21 mW/ m2 khi

thiếu CEM, và 262 + 10 mW/ m2 với CEM, cao hơn đáng kể so với các thiết kế

khác. Tuy nhiên, một trở ngại lớn với MFC cathode không khí là sự tƣơng tác giữa

ba pha (khí, lỏng, rắn) của phản ứng oxygen với protons và electron trên bề mặt

cathode kém, làm cho đòng điện phát sinh trong MFC không ổn định [15, 17, 18,

37, 38].

Hệ thống MFC hai khoang với khoang cathode chứa nước và được sục oxy

hòa tan: Đây là dạng thiết kế MFC có thể coi là kinh điển, đƣợc sử dụng trong

nhiều nghiên cứu, với hai khoang riêng biệt và màng cation (CEM) đƣợc sử dụng để

ngăn cách. Dạng này có điểm đặc biệt là hệ thống gồm hai khoang ngăn cách bởi

CEM và điện cực cathode nằm trong nƣớc và đƣợc sục khí. Theo Oh và cộng sự

(2005), nồng độ của oxy hòa tan có thể ảnh hƣởng tới hệ thống, với năng lƣợng sẽ

giảm khi DO thấp. Ngoài ra, việc kết nối giữa hai khoang có thể hạn chế năng lƣợng

sản xuất đƣợc trong MFC, nguyên nhân là do sự thấm qua màng trao đổi proton của

16

oxy hòa tan và các hóa chất hòa tan bị thấm qua màng và sang khoang anode. Điện

trở trong của hệ thống MFC hai khoang khá lớn, nguyên nhân là do khoảng cách

giữa hai điện cực và phản ứng không hiệu quả của oxy hòa tan. Tuy nhiên, hệ thống

này có một số ƣu điểm đáng lƣu ý là khả năng hoạt động ổn định và sự thuận tiện,

đơn giản trong vận hành và chế tạo [15, 18, 26, 37, 38].

Hệ thống MFC hai khoang với dung dịch điện ly ở cathode (catholytes):

Dung dịch điện ly dạng chứa ferricyanide ở cathode, đã đƣợc Rabaey và cộng sự

(2006) đề xuất, có thể làm tăng năng lƣợng đầu ra của một MFC lên 4310 mW/ m2

với cơ chất là glucose. Việc sử dụng ferricyanide có ảnh hƣởng tới sự di chuyển của

điện tử tới điện cực tại cathode, và điện trở trong của hệ thống là thấp hơn so với

việc dùng ôxy hòa tan. Năng lƣợng đầu ra của hệ thống MFC có khoang cathode

chứa ferricyanide tăng lên tới 80% so với của hệ thống sử dụng nƣớc đƣợc sục oxy

[15, 37, 38].

Một chất khác là permanganate đã đƣợc thí nghiệm bởi You và cộng sự

(2006) nhƣ là chất nhận điện tử. Trong hệ thống này năng lƣợng đƣợc sản xuất là

116 mW/m2, cao hơn so với khi sử dụng ferricyanide (26 mW/m

2) hoặc oxy hòa tan

(10 mW/ m2). Điện trở trong của permanganate (51Ω) cũng thấp hơn so với

ferricyanide (73Ω). Một nhƣợc điểm lớn của hệ thống MFC sử dụng dung dịch điện

ly là: Các chất này có thể gây độc, hoặc nếu hoạt động trong thời gian dài thì bị khử

hết dẫn đến yêu cầu phải thay chúng thƣờng xuyên [72].

MFC dạng ống: Liu và cộng sự (2004) sử dụng MFC dạng ống bao gồm 8

thanh than chì và một cathode dạng ống ở trung tâm. Một vài dạng hệ thống sử

dụng oxy hòa tan ở trong cathode, hoặc có thể sử dụng ferricyanide. Jang và cộng

sự (2004) sử dụng hệ thống dạng ống đƣợc vận hành trên nền tảng dòng chảy liên

tục trong khoang anode và khoang cathode đƣợc nối trực tiếp có dạng thiết kế giống

hình trụ. Ƣu điểm của MFC dạng ống là tạo diện tích tiếp xúc bề mặt lớn giữa

anode và cathode, dòng điện phát sinh cao, lƣợng cơ chất đƣợc phân hủy hoàn toàn

nhờ áp dụng phƣơng pháp dùng chảy ngƣợc (lớn hơn 90% COD bị tiêu thụ). Một

17

điều bất lợi của hệ thống có thể là hiện tƣợng oxy từ cathode khuếch tán sang

khoang anode gây phải ứng không đặc hiệu [18, 37, 38, 60].

1.4.2 Vật liệu cấu tạo MFC

1.4.2.1 Vật liệu cho điện cực

Vật liệu sử dụng là điện cực trong MFC cần thỏa mãn yêu cầu sau: tính dẫn

điện cao, không bị ăn mòn, có diện tích tiếp xúc bề mặt cao, không bị tắc, không đắt

tiền, dễ dàng sử dụng, không gây độc cho vi sinh vật; trong đó tính dẫn điện là chỉ

tiêu quan trọng nhất. Tính dẫn điện có thể đƣợc đánh giá bằng cách đo điện trở của

vật chất trên khoảng cách. Ví dụ độ dẫn điện; của đồng là 0,1 Ω/ cm, của giấy

carbon là 0,8 Ω/ cm, của sợi than chì là 1,6 Ω/ cm, của vải than chì là 2,2 Ω/ cm.

Điện tử sản xuất bởi vi sinh vật cần đƣợc truyền từ điểm phát sinh trên bề mặt của

vật liệu điện cực tới điểm gom điện ( kết nối với dây), chỉ cần một vài ohms của

điện trở trong đƣợc thêm vào có thể ảnh hƣởng lớn tới công suất [37, 38].

Vải than chì, giấy carbon, xốp carbon (Hình 4): Việc sử dụng điện cực với

bản chất là carbon cho cực âm anode của MFC là phổ biến, vì những vật liệu này có

khả năng dẫn điện khá tốt, trơ với các phản ứng điện hóa và phù hợp với sự phát

triển của vi khuẩn. Giấy carbon rất cứng, giòn, dễ gãy; vải carbon và xốp carbon có

độ dẻo và diện tích bề mặt hoạt động lớn hơn giấy carbon [37, 38].

Hạt than chì (Hình 6A): Rabaey, Aelterman, Heilmann và Logan cũng đã

nghiên cứu sử dụng hạt than chì trong MFC, các hạt than chì có kích thƣớc khác

nhau thƣờng d = 1.5 – 5 mm với diện tích bề mặt đƣợc công bố vào khoảng 820 –

2700 m2/m

3. Hạt than chì có tính dẫn điện khoảng 0,5 - 1Ω/ hạt, và một trong những

yêu cầu để đảm bảo khả năng dẫn điện của anode chứa các hạt than chì là cần phải

có sự tiếp xúc giữa các hat trong khoang anode [37, 38, 60].

18

Hình 4: Vật liệu carbon sử dụng cho

điện cực anodes: (A) giấy carbon, (B)

vải các bon, (C) lƣới carbon [38]

Hình 5: Một vài vật liệu dùng làm điện

cực cho MFC (A) Thanh than chì (B;

C; D) Tấm than chì [38]

Thanh than chì, miếng than chì, xốp than chì (Hình 5): Thanh than chì đã

đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu MFC trƣớc đấy, chúng có tính dẫn điện cao

(0,2 Ω/ cm) và bề mặt rõ ràng. Tuy nhiên, trƣớc khi sử dụng chúng cần đƣợc mài

với cát để tăng diện tích bề mặt cho vi sinh vật sinh trƣởng. Than chì miếng cũng có

thể đƣợc sử dụng trong MFC, nó có đặc điểm khá giống than thanh than chì, và bởi

chúng là các miếng nên có diện tích bề mặt lớn, thuận lợi cho việc sử dụng phân

tích màng sinh học (biofilm) sinh điện. Tuy nhiên, các miếng than chì thƣờng không

rỗng và tạo dòng điện thấp hơn so với dạng cấu chúc dạng xốp. Chaudhuri và

Lovley (2003) đã phát hiện rằng khi tăng diện tích không gian bề mặt của điện cực

dạng thanh than chì hoặc xốp than chì thì sẽ làm tăng dòng điện phát sinh bởi MFC

chứa Rhodoferax ferrireducens. Tuy nhiên sự ảnh hƣởng này là do sự khác biệt diện

tích bề mặt, chứ không phải là do sự khác nhau trong vật liệu [34, 37, 38].

19

Hình 6: (A) Hạt than chì, (B; C) Chổi than chì (D) Sợ than chì [38]

Sợi than chì và chổi than chì (Hình 6C và 6D): Đặc điểm của các vật liệu

này là diện tích bề mặt lớn và độ xốp cao. Lõi của chổi có thể đƣợc làm từ các vật

liệu không bị ăn mòn nhƣ tianium. Đƣờng kính nhỏ của sợi than chì (khoảng 7.2

µm) cho phép tạo đƣợc diện tích bề mặt lớn, ví dụ với một cây chổi có đƣờng kính

5 cm và dài 7 cm có diện tích khoảng 1,06 m2. Sợi than chì có thể sử dụng trong

anode; tuy nhiên, làm sao để phân tán đƣợc tốt các sợi trong khoang là một vấn đề

còn tồn tại cần đƣợc giải quyết [37, 38].

1.4.2.2 Màng trao đổi ion

Màng trao đổi ion là cần thiết để phân tách hai khoang anode và cathode của

MFC, chúng có tác dụng chọn lọc sự di chuyển của proton giữa hai khoang, do đó

màng trao đổi ion có thể mà một nhân tố giới hạn năng lƣợng thu đƣợc từ MFC. Có

một số loại màng trao đổi ion chính đƣợc sử dụng trong các hệ thống MFC: màng

trao đổi cation (CEM), màng trao đổi anion (AEM), màng phân cực (PBM) [24, 38,

63, 74].

20

Màng trao đổi cation (Hình 7 A và C): Hầu hết màng trao đổi cation (CEM)

là màng Nafion. Màng này đã đƣợc phát triển từ việc sử dụng trong hệ thống pin

hydrogen, và nó đã đƣợc tối ƣu hóa nhằm tạo ra sự ổn định cho môi trƣờng dẫn điện

có nồng độ proton cao (pH thấp) và lƣợng nƣớc đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt. Tuy

nhiên, nồng độ proton này trở nên bão hòa trong MFC và màng có thể không đạt

đƣợc chức năng nhƣ đã đƣợc kỳ vọng. Màng Nafion là màng trao đổi proton, đƣợc

thiết kế cho sự di chuyển proton, nhƣng trong MFC nó cho phép cả sự di chuyển

của chất mang điện tích dƣơng nhƣ (Na+, K

+, NH4

+, Ca

2+, và Mg

2+ ) và sự hiện diện

của chúng cao hơn 105 lần so với proton hòa tan trong MFC [63]. Vậy sự canh tranh

di chuyển của các cation khác sẽ ảnh hƣởng tới hệ thống MFC. Khi các chất hòa tan

bị tiêu thụ, proton đƣợc sản xuất từ khoang anode và đƣợc tiêu thụ tại khoang

cathode. Nếu proton không thể di chuyển đúng tốc độ từ anode tới cathode, pH có

thể bị giảm tại anode và tăng tại cathode trong khi sự cân bằng vật chất đƣợc duy trì

bởi sự di chuyển của các cation khác. pH giảm tại anode ảnh hƣởng tới sự sinh

trƣởng của vi khuẩn và dòng điện phát sinh. Một dung dịch đệm tốt có thể bù trừ sự

thay đổi pH này để làm giảm ảnh hƣởng tới điện lƣợng sinh ra. Các tính toán về quá

trình khử oxy tại cathode chỉ ra rằng pH có thể ảnh hƣởng đến điện thế cathode [37,

38, , 51].

Màng trao đổi anion (AEM) (Hình 7B): Nếu ion H+

không di chuyển hiệu

quả qua CEM, sự cân bằng pH trong MFC sẽ bị ảnh hƣởng. Kim và cộng sự đã báo

cáo rằng có thể tăng hiệu quả di chuyển của proton bằng cách sử dụng hóa chất nhƣ

đệm pH, hay anion phosphate. Bên cạnh đó, có thể sử dụng màng trao đổi anion để

ngăn cách hai khoang MFC. Năng lƣợng sinh ra có thể lớn hơn khi sử dụng AEM.

Do sự có mặt của phosphate trong khoang anode, AEM cho phép toàn bộ anion

phosphate di chuyển qua và pH trong khoang anode có thể đƣợc duy trì tốt hơn. Tuy

nhiên, đối với AEM, việc duy trì pH trong khoang cathode sẽ gặp khó khăn và phụ

thuộc rất nhiều vào việc sử dụng đệm. Vì vậy, mật độ dòng điện cao trong hệ thống,

sự di chuyển mạnh của proton là cần thiết cho sự duy trì và cân bằng pH [38, 63].

Màng phân cực (BPM): Màng phân cực bao gồm màng anion và cation đƣợc

ghép với nhau. Sự tăng lên của hiệu điện thế là lớn hơn sự di chuyển proton qua

màng, kết quả là sự di chuyển anions (OH-) từ anode và cation (H

+) từ cathode là

đƣợc cân bằng. Ter Heijne và cộng sự (2006) đã phát triển một hệ thống MFC với

21

anode vận hành ở pH thấp (<2.5) nhƣng nếu sử dụng CEM sẽ không đảm bảo điều

kiện này. Bằng cách sử dụng màng phân cực, họ có khả năng duy trì pH thấp trong

khoang cathode và pH trung hòa trong khoang anode . Nhƣợc điểm duy nhất của

loại màng này là giá thành cao [21, 37, 63].

Hình 7: Các loại màng đƣợc sử dụng trong MFC; (A) Màng cation (CMI –

7000, Membranes International, Inc); (B) màng anion (AMI – 7001,

Membranes International, Inc); (C) Nafion 117 (Ion Power, Inc) [38]

Hình 8: Cơ chế hoạt động của các loại màng phân tách; (A) CEM sự di chuyển

của cation từ anode tới cathode: (B) AEM sự di chuyển của anion từ cathode

sang anode: (C) BPM phân tách nƣớc trong ion proton và hydroxyl trong

màng (D) màng khảm CMM sự di chuyển cation từ anode tới cathode hoặc/ và

anion từ cathode tới anode (PS = Power supply, C+ = Cations, A

- = Anions) [63]

22

1.4.3 Vật liệu tạo khung cho MFC

Vật liệu tạo khung cho MFC giúp tạo hình dáng và ngăn cách khoang phản

ứng anode và cathode của MFC với điều kiện môi trƣờng bên ngoài. Yêu cầu của

vật liệu tạo khung MFC là: không độc với hệ vi sinh vật, không bị phản ứng hay bị

ăn mòn với hóa chất thử nghiệm, có thể khử trùng đƣợc. Có rất nhiều vật liệu đã

đƣợc báo cáo sử dụng cho việc làm khung MFC, ví dụ nhƣ thủy tinh, polyacrylic,

polyplastic, polypropylen, plexiglass…[37, 38]

Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy

tinh [38]

Hình 10: MFC một khoang-khung

thủy tinh [38]

Vật liệu thủy tinh phục vụ cho làm khung MFC: Thủy tinh (bao gồm cả

plexiglass) có thể đáp ứng đƣợc những yêu cầu cơ bản của một vật liệu tạo khung

cho MFC. Đây là các vật liệu rất tốt để phục vụ cho việc nghiên cứu về hệ vi sinh

vật trong MFC, hay để thử nghiệm các nguồn cơ chất mới [38]. Tuy nhiên, vật liệu

này bộc lộ nhiều hạn chế khi cần chế tác, thay đổi cấu trúc.

Vật liệu polyacrylic: Đây cũng là một vật liệu phổ biến đƣợc sử dụng trong

nghiên cứu MFC. Do tính chất dẻo của polyacrylic, ta có thể dễ dàng chế tác và sửa

chữa vật liệu theo cấu trúc, thiết kế mong muốn. Hơn nữa, vật liệu này có giá thành

không đắt, dễ dàng sản xuất, và có thể khử trùng đƣợc [38].

23

Hình 11: MFC một khoang- khung

polyacrylic [38]

Hình 12: MFC hai khoang- khung

polyacrylic [38]

Hình 13: MFC dạng ống- khung

polypropylen [60]

Hình 14: MFC một khoang- khung

Plexiglas [38]

1.4.4 Ứng dụng của MFC

MFC trong sản xuất điện: MFC có khả năng chuyển hóa năng lƣợng hóa học

trong thành phần hóa học của sinh khối thành năng lƣợng điện tích với sự có mặt

của vi khuẩn, bởi các năng lƣợng hóa học bị oxy hóa đƣợc tạo thành dòng điện thay

cho phản ứng sinh nhiệt. Chaudhury và Lovley đã báo cáo rằng R. ferrireducens có

thể phát sinh dòng điện với sản lƣợng đạt 80%, sự chuyển hóa cao hơn khoảng 89%

đã đƣợc báo cáo bởi Rabaey và cộng sự 2003, hay đạt 97% với điện cực bọc bởi Pt

đen. Tuy nhiên dòng điện của MFCs sinh ra vẫn còn rất thấp, nguyên nhân là do

24

điện tích bị dự trữ trong thiết bị và sự phân bổ điện tích là không đều [15, 18, 37,

38].

MFC trong sản xuất hydro sinh học: MFC có thể đƣợc sử dụng để sản xuất

hydrogen thay cho điện. Dƣới điện kiện hoạt động bình thƣờng, proton đƣợc giải

thoát bởi các phản ứng khoang anode di chuyển tới khoang cathode kết hợp với oxy

tạo ra nƣớc. Nếu cung cấp thêm một lƣợng điện thế nhỏ ở cathode thì có thể thu

đƣợc hydro. MFC có thể sản xuất 8 – 9 mol H2/ mol glucose trong khi các quá trình

lên men chỉ sản xuất 4 mol H2/ mol glucose [38].

MFC trong xử lý nước thải: MFC đã đƣợc ứng dụng trong xử lý nƣớc thải từ

rất sớm vào năm 1991 bởi Habermann và Pommer. Năng lƣợng phát sinh của MFC

trong xử lý nƣớc thải có thể đƣợc tạo ra từ quá trình tiêu thụ cơ chất của vi sinh vật,

và các phân tử hữu cơ nhƣ acetate, propionate, butyrate có thể đƣợc phân hủy thành

CO2 và H2O. MFC dạng đơn và MFC thiếu màng đƣợc sử dụng cho xử lý nƣớc thải

có thể phân hủy đƣợc hơn 80% lƣợng chất hữu cơ [15, 37, 38, 49].

MFC sử dụng làm cảm biến sinh học: Một ứng dụng khác của MFC hiện nay

đang đƣợc quan tâm nghiên cứu là sử dụng làm cảm biến sinh học cho phân tích các

chất gây ô nhiễm và chỉ thị kiểm soát chúng. Việc phát sinh dòng điện có mối quan

hệ với nồng độ chất hữu cơ trong nƣớc nƣớc thải và điều này rất thuận lợi cho việc

thiết kế cảm biến đo BOD (BOD sensor). Nhờ vậy, ta có thể dùng hệ thống MFC

nhƣ một cảm biến chỉ thị trực tiếp nồng độ BOD trong nƣớc thải. Ngoài ra, hệ thống

MFC có thể sử dụng làm cảm biến phát hiện độc tố, dựa vào sự ức chế cơ chế di

chuyển electron hoặc quá tình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố

có trong môi trƣờng [13, 17, 23, 25, 26, 29, 32, 35, 36, 55].

1.5 HỆ VI SINH VẬT TRONG MFC

Nhƣ ta đã biết, MFC là hệ thống sử dụng vi sinh vật chuyển hóa năng lƣợng

hóa học từ các hợp chất hữu cơ thành dòng điện. Nhiều nghiên cứu về hệ vi sinh vật

trong anode của MFC nhận thấy rằng, có tới bốn trong năm lớp của Proteobacteria

25

có khả năng phát sinh dòng điện (Deltaproteobacteria, Alphaproteobacteria,

Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria); hay Bacteroidetes; Acidobacteria,

Firmicutes. Nấm men Pichia anomala và vi khuẩn lam Synechocytis sp. PCC 6803

cũng đã đƣợc phát hiện ra là có khả năng sản xuất dòng điện trong MFC. Một

nghiên cứu của Kim và công sự đã công bố cấu trúc hệ vi khuẩn hoạt động trong

MFC bằng phƣơng pháp phân tích thƣ viện nhân dòng gen 16s rRNA đã nhận thấy

rằng, Bacteriodetes chiếm số lƣợng lớn với 32,5 % trong tổng số trình tự nhân

dòng, tiếp đến là Betaproteobacteria là 23,9 %; Firmicutes 14,2 %;

Grammaproteobacteria 10,6 %; Alphaproteobacteria 6,9 %; Spirochaetes 5.9 %;

Acidobacteria 2,6 %; Deltaproteobacteria và Planctomycetes chiếm 0,3 %; và các

trình tự chƣa định danh đƣợc chiếm 1.3%. Một nghiên cứu khác của Choo và công

sự (2006) lại chỉ ra rằng lớp vi khuẩn chiếm ƣu thế tròng MFC đƣợc làm giàu với

nồng độ glucose và glutamate là Grammaproteobacteria (36,5%), mặt khác Logan

và Regan (2006) lại tìm thấy lớp Sigmaproteobacteria là chiếm ứu thế trong quần

xã vi sinh vật điện hóa trong MFC và chúng có trình tự tƣơng đồng gen 16s rRNA

lớn hơn 95% với loài Desulfuromonas acetoxidans. Geobacter sulfurreducens và

Shewanella oneidensis là các vi khuẩn điện hóa điển hình đƣợc tìm thấy trong nhiều

hệ thống MFC và tƣơng tác của chúng với điện cực trong MFC đã đƣợc nghiên cứu

kỹ (Bảng 6). Bên cạnh đó, trong một số hệ thống khác, các vi khuẩn thuộc chi

Pseudomonas đƣợc phát hiện và khả năng tƣơng tác của chúng với điện cực thông

qua chất truyền điện tử trung gian tự sinh đã đƣợc chứng minh Ngoài ra, rất nhiều

loài vi khuẩn thông qua nuôi cấy đơn chủng trong MFC đã đƣợc chứng minh là có

khả năng sinh ra dòng điện (Bảng 6) [16, 27, 39, 41].

26

Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC không sử dụng chất truyền

điện tử trung gian [39, 43, 50]

Năm phát hiện Vi khuẩn

1999 Shewanella putrefaciens IR-1

2001 Clostridium butyricum EG 3

2002 Desulfuromonas acetoxidans

Geobacter metallireducens

2003 Geobacter sulfurreducens

Rhodoferax ferrireducens

Aeromonas hydrophila

2004 Pseudomonas aeruginosa

Desulfobulbus propionicus

2005 Geopsychrobacter electrodiphilus

2006 Shewanella oneidensis DSP 10

S. oneidensis MR-1

Escherichia coli

2008 Rhodopseudomonas palustris DX-1

Ochrobactrum anthropi YZ-1

Desulfovibrio desulfuricans

Acidiphilium sp. 3.2Sup5

Klebsiella pneumoniae L17

Thermincola sp. JR

Pichia anomala

2009 Bacillus subtilis

2013 Tolumonas osonensis

Ảnh hưởng của vi sinh vật tới hoạt động của MFC: Nhƣ ta đã biết MFC hoạt

động dựa trên quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Do đó, sự phát triển của vi sinh

vật trong MFC, nguồn vi sinh vật sử dụng làm giàu, hay phƣơng thức làm giàu đóng

một vai trò quan trọng đến sự phát sinh dòng điện, điều kiện hoạt động, và năng

lƣợng thu đƣợc của MFC. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, những MFC đƣợc làm

giầu từ nguồn vi sinh vật hỗn hợp có thể cho dòng điện lớn hơn so với làm giàu đơn

27

chủng. Logan đã báo cáo rằng MFC đƣợc làm giàu từ quần xã có công suất lớn hơn

22% (576 mW/m2) so với MFC làm giàu từ chủng Geobacter sulfurreducens. Ngoài

ra, các quần xã vi sinh vật khác nhau có thể ảnh hƣởng tới điện trở trong của MFC.

Ví dụ, Ana và cộng sự (2011) đã công bố với MFC làm giầu từ quần xã khử lƣu

huỳnh có điện trở trong 2550 ohm, trong khi các quần xã methanol và quần xã hiếu

khí có điện trở trong lần lƣợt là 6400 ohm và 115000 ohm. Hơn nữa, công suất đầu

ra và điều kiện hoạt động của MFC còn bị giới hạn bởi tốc độ sinh trƣởng và mối

quan hệ của các chủng vi sinh vật trong quần xã. Một bằng chứng là trƣờng hợp

chủng vi khuẩn khuẩn Gram dƣơng Brevibacillus sp. PHT1 có thể chuyền điện tử

ngoại bào nhờ có hoạt động trao đổi chất của Pseudomonas sp [27, 39, 41, 57, 67].

1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG MFC

Phƣơng pháp phổ biến sử dụng nghiên cứu quần xã vi sinh vật là phƣơng

pháp phân lập-nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, việc phân loại và nghiên cứu đa

dạng vi sinh vật dựa trên nuôi cấy còn nhiều hạn chế, vì các vi sinh vật có kích

thƣớc nhỏ bé, dẫn đến sự khó khăn trong phân biệt hình thái của chúng; và vì số

lƣợng vi sinh vật nuôi cấy đƣợc là rất thấp. Theo một số nghiên cứu gần đây, chỉ có

khoảng 1% các chủng vi khuẩn là ta có thể phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp

nuôi cấy hiện có [7, 46].

Gần đây, các phƣơng pháp sinh học phân tử đã đƣợc áp dụng để phân tích

quần xã vi sinh vật nhƣ: RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), RADP

(phân đoạn DNA đa hình đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên), DGGE (Điện di gel biến

tính-denaturing gradient gel electrophoresis). DGGE là phƣơng pháp phân tách các

đoạn DNA có chiều dài tƣơng đồng nhau nhƣng khác nhau về trình tự sắp xếp, sự

phân tách này dựa trên sự giảm tốc độ di chuyển của các sợi DNA đôi có thành

phần khác nhau, bị biến tính trong gel polyacrylamide với nồng độ chất biến tính

tăng dần (chất biến tính là hỗn hơn urea và formamide), qua đó chúng sẽ dừng lại

tại các điểm khác nhau trên gel. Nhằm tăng độ đặc hiệu quá trình phân tách các

đoạn DNA có trình tự khác nhau, đầu cuối 5’ của đoạn DNA đƣợc thêm vào trình tự

giàu guanine và cytonine (kẹp GC) thông qua một mồi trong phản ứng PCR, thông

28

thƣờng các kẹp GC thƣờng có độ dài từ 30-50 nucleotide. DGGE đã đƣợc sử dụng

trong: phân tích quần xã vi sinh vật, chỉ dẫn sự thay đổi của quần thể vi sinh vật,

phát hiện các trình tự DNA không tƣơng đồng….[46-48, 64].

DGGE tỏ ra đặc biệt hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh trình tự gen

16s rRNA của vi khuẩn. Trình tự 16s rRNA đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân loại

vi khuẩn. Vùng 16s rRNA có 9 vùng biến động (ký hiệu từ V1-V9), đã đƣợc chứng

minh là có mức độ đa dạng trình tự cao giữa các vi khuẩn khác nhau và có thể sử

dụng cho phân loại các loài. Ví dụ, vùng V2 và V3 có kích thƣớc khoảng 200 bp có

khả năng phân biệt đƣợc 110 loại vi khuẩn khác nhau tới mức độ chi. Tuy nhiên,

các vùng này thƣờng ngắn và không thể chỉ sử dụng một vùng biến động mà có thể

phân biệt đƣợc tất cả các loại vi khuẩn [12, 47].

29

Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Nghiên cứu này đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học

- Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các máy móc, thiết bị

chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, Sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn:

- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ).

- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)

- Máy DGGE K-2401 (C.B.S Scientific, Mỹ)

- Bàn soi gel LMW-20 UVP (UK).

- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)

Hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: Pepton, các muối (NaCl, MgSO4,

(NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4…); nguyên tố vi lƣợng (H3BO3, CoCl2.6H2O...) có

xuất xứ Trung Quốc (Xilong), Agar (Việt Nam), Cao nấm men (Sigma, Hoa Kỳ).

Hóa chất sử dụng trong phƣơng pháp điện di gel biến tính DGGE:

Acrylamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl

ethylenediamine), APS (Ammonium persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ)

cung cấp.

Hoá chất sử dụng trong các thí nghiệm Sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử

dụng tách ADN (Glycogen 20 mg/ml, Ethanol 100 %, Ammonium acetate) , phản

ứng PCR (USB Taq PCR Master Mix 2x), điện di kiểm tra sản phẩm PCR

(HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x, Loading Dye 6x, GeneRuler 1kb ADN

Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup). Tất cả đều

đƣợc cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và Fermentas (Mỹ).

30

Vật liệu cấu tạo pin nhiên liệu vi sinh vật:

- Polyacrylic (Việt Nam)

- Vải than chì (Việt Nam)

- Thanh than chì (Việt Nam)

- Màng nafion 117 (Hoa Kỳ)

- Nối nhanh ϕ 4 mm (Trung Quốc)

- Ống nƣớc phi ϕ 4 mm (Đài Loan)

- Dây chuyền nƣớc (Trung quốc)

Đồng Hồ đo điện:

- Đồng hồ vạn năng Extech (Hoa Kỳ)

- Máy đo điện tự động KEITHLEY (Hoa Kỳ)

2.1.2 Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành chọn lựa các nguồn quần xã khác nhau phục vụ cho việc

làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa có khả năng tốt nhất cho việc phát triển cảm biến

sinh học trong MFC từ nguồn tự nhiên và nguồn đã bị ô nhiễm gồm:

- Nguồn bùn thải khu dân cư: phố Chùa Láng – quận Đống Đa - Hà Nội

- Mẫu đất tự nhiên (ĐT): gồm hỗn hợp các nguồn đất đƣợc lấy từ Fansipang –

Sapa – Lào Cai, Đất tại vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng và đầm Vân Long – Ninh Bình.

- Mẫu bùn tự nhiên (BT): gồm hỗn hợp của bùn đƣợc lấy từ Đầm vân Long –

Ninh Bình vàVƣờn quốc gia Xuân Thủy – Nam Định.

- Mẫu bùn hoạt tính (BH): Gồm bùn kỵ khí và hiếu khí (Nhà máy bia Hà Nội

– Hƣng Yên – Khu Công Nghiệp Phố Nối A – Hƣng Yên).

- Mẫu Nước Thải (NT): Bùn và nƣớc thải hỗn hợp (Làng giấy Phong Khê –

Bắc Ninh; Làng tái chế kim loại Đan Hội – Bắc Ninh; Cơ sở dệt nhuộn – Hồi Quan

– Bắc Ninh; Làng tái chế Ni lon – Văn Giang – Hƣng Yên).

31

- Mẫu hỗn hợp (HH): là hỗn hợp của mẫu đất tự nhiên, bùn tự nhiên, bùn hoạt

tính, nƣớc thải đƣợc trộn với nhau.

2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lựa chọn thiết kế tối ƣu cho MFC

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tổng hợp, đánh giá các ƣu nhƣợc điểm của

các dạng thiết kế MFC- và các vật liệu sử dụng cho MFC đã đƣợc công bố, qua đó

chúng tôi tiến hành lựa chọn dạng vật liệu-thiết kế phù hợp nhất cho việc thiết kế

MFC có khả năng làm cảm biến sinh học trong điều kiện Việt Nam.

2.2.2 Thiết kế, lắp đặt hệ thống MFC

Pin nhiên liệu vi sinh vật đƣợc thiết kế dựa trên thiết kế của Kim và cộng sự

[26]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm hai dạng thiết kế MFC

(dạng khoang hình hộp chữ nhật và khoang hình trụ) và ba thể tích khoang anode (5

ml; 7,5 ml; và 10 ml) .

Cụ thể, với MFC dạng thiết kế khoang hình chữ nhật (Hình 15) đƣợc cấu tạo

từ polyarylic gồm: khoang cathode có thể tích là 7,5 ml với kích thƣớc ngoài là 50 x

100 x 15 mm, và kích thƣớc khoang là 50 x 10 x 15mm; khoang anode có thể tích

khoang lần lƣợt là 5 ml, 7,5 ml, 10 ml với kích thƣớc ngoài là 50 x 100 x A (A =

10; 15; 20 mm), và kích thƣớc khoang trong bằng 50 mm x 10 mm x H (H = 10; 15

; 20 mm). MFC đƣợc chặn ngoài bằng hai tấm ốm có kích thƣớc 50 x 100 x 15 mm.

Khoảng cách giữa các tấm đƣợc ngăn cách bởi một lớp cao su dày 1 mm, hai

khoang anode cà cathode đƣơc ngăn cách bằng màng Nafion N117 (DuPont, Hoa

Kỳ), thiết bị đƣợc cố định bằng ốc và bu lông. Điện cực tại khoang anode và

cathode đƣợc cấu tạo bằng vải than chì có kích thƣớc 9 mm x 45 mm x 5 mm với

điện trở 0, 8 Ω/cm2 đƣợc nối với thanh gom điện bằng than trì có đƣờng kính 6 mm

với điện trở 0, 2 Ω/cm2, hai điện cực đƣợc nối với điện trở 10Ω thông qua dây nối

có đƣờng kính 1 mm.

32

MFC dạng thiết kế khoang hình trụ (Hình 16) đƣợc làm từ polyacrylic gồm:

khoang cathode có thể tích là 7,5 ml kích thƣớc 45,24 x 45, 24 x 15 mm, kích thƣớc

khoang đƣờng kính 25,24 mm độ cao 15 mm. Khoang anode có thể tích khoang lần

lƣợt là 5 ml, 7,5 ml, và 10 ml có kích thƣớc ngoài 45,24 x 45, 24 x A (A = 10; 15;

20 mm), kích thƣớc khoang đƣờng kính 25,24 mm và chiều cao H = 10; 15; 20 mm.

Mỗi khoang sẽ đƣợc ngăn bằng tấm chặn ngoài có kích thƣớc 45,24 x 45, 24 x 15

mm. Điện cực tại khoang anode và cathode đƣợc cấu tại bằng vải than chì có kích

thƣớc 25 mm x 5mm điện trở 0,8 Ω/ cm2, và đƣợc nối với thanh gom điện bằng than

chì có đƣờng kính 6 mm điện trở 0,2 Ω/ cm2, khoảng cách giữa các tấm đƣợc ngăn

cách bởi một lớp cao su dày 1 mm, hai khoang anode và cathode đƣơc ngăn cách

bằng màng Nafion N117 (DuPont, Hoa Kỳ), thiết bị đƣợc cố định bằng ốc và bu

lông, đầu thanh gom điện than chì đƣợc nối với dây dẫn (đƣờng kính 1 mm) bằng

ngàm cá sấu và điện trở mạch ngoài là 10 Ω.

Hình 15 : MFC khoang chữ nhật Hình 16 : MFC khoang trụ

2.2.3 Quy trình làm giầu vi sinh vật trong các MFC:

Phục vụ thí nghiệm lựa chọn thiết kế MFC tối ưu: Quần xã vi sinh vật thí

điểm đƣợc làm giàu từ mẫu nƣớc thải khu dân cƣ tại phố Chùa Láng - quận Đống

Đa - thủ đô Hà Nội. Quần xã đƣợc tiến hành làm giầu với dung dịch anode mô

phỏng nƣớc thải có nồng độ BOD = 50 ppm với tốc độ dòng 0,3 ml/phút. Song song

33

với quá trình làm giầu, chúng tôi tiến hành chạy MFC đối chứng hóa học (MFC

không đƣợc bổ sung vi khuẩn).

Phục vụ thí nghiệm lựa chọn nguồn vi sinh vật tối ứu: Sau khi lựa chọn đƣợc

thiết kế MFC tốt nhất cho việc phát triển cảm biến sinh học đánh giá chất lƣợng

nƣớc thải, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các MFC với thiết kế đó và hệ vi sinh vật

làm giàu từ các nguồn quần xã vi sinh vật khác nhau (Mục 2.1.2). Các MFC đƣợc

làm giàu với dung dịch anode mô phỏng nƣớc thải có nồng độ BOD 30 ppm với tốc

độ dòng 0,3 ml/ phút tại điều kiện nhiệt độ phòng. Ban đầu hai khoang anode và

cathode của các MFC bị ngăn bởi 1 lớp màng nilon (không có khả năng cho các ion

đi qua) trong thời gian 14 ngày, sau đó chúng tôi tiến hành đổi chúng bằng lớp

màng nafion117.

2.2.4 Vận Hành Hệ Thống MFC

Hệ thống MFC của chúng tôi đƣợc vận hành liên tục theo Hình 17: Với

khoang cathode chứa nƣớc bão hòa oxy đƣợc chảy tuần hoàn nhờ bơm (Boyu

FP2000, Trung Quốc) dẫn nƣớc từ bồn chứa có sử dụng sục khí (HEIBAO

aquarium HB-248A, Trung Quốc), nƣớc tại bồn đƣợc thay hàng ngày. Tại khoang

anode, dung dịch mô phỏng nƣớc thải theo Kim và cộng sự (2006) đƣợc sử dụng

với thành phần 1 lít dung dịch gồm: 0,56g (NH4)2SO4; 0,42g NaHCO3; 0,114 g

KH2PO4 3H2O; 0,068 g K2HPO4; 0,0247 MnCl2 cộng 10 ml vi lƣợng (1,1 g FeSO4

7H2O; 0,1 g MnCl2 4H2O; 0,17 g CoCl2 6H2O; 0,1 g ZnCl2; 0,1 g CaCl2 2H2O;

0,002 g CuCl2 2H2O; 0,001 g H3BO3; 0,001 g Na2MoO3; 1 g NaCl; 0,13 g NiCl2

6H2O ) và thêm dung dịch có chứa nồng độ BOD cẩn kiểm tra gồm glucose và

glutamat đƣợc tính toán nồng độ theo Ủy ban đo lƣờng tiêu chuẩn và sức khỏe cộng

đồng của Hoa Kỳ (1995), dung dịch đƣợc đựng trong bình Duran 2 lít và chảy vào

khoang anode thông qua dây chuyền dịch (Human Luzhou Huikang Development

Co., Ltd, Trung Quốc), và tốc độ dòng vào đƣợc điều chỉnh nhờ có van điều tiết

[26, 54].

Với các thí nghiệm làm giàu vi sinh vật anode và đánh giá hoạt động của các

MFC, các MFC đƣợc vận hành với dung dịch nƣớc thải mô phỏng có giá trị BOD là

30 ppm.

34

Với các thí nghiệm lựa chọn thiết kế ƣu việt hơn, các MFC đƣợc vận hành

với các dung dịch nƣớc thải mô phỏng có các giá trị BOD là 5 và 50 ppm, thay đổi

luân phiên.

Với các thử nghiệm khả năng đánh giá chất lƣợng nƣớc thải của các thiết bị,

các MFC đƣợc vận hành với các dung dịch nƣớc thải mô phỏng có các nồng độ

BOD khác nhau (0, 5, 15, 30 và 50 ppm).

Hình 17: Sơ đồ hoạt động hệ thống MFC

Hình 18: Hệ thống MFC vận hành trong phòng thí nghiệm

35

2.2.5 Đo đạc và xử lý số liệu

Hiệu điện thế của các MFC đƣợc đo bằng đồng hồ vạn năng EX MN 35

(Extech, Hoa Kỳ), với thời gian 30 phút/ lần-đo một ngày 8 tiếng hoặc bằng cách sử

dụng máy đo điện KEITHLEY (Hoa Kỳ) với thời gian đo 10 phút/lần, hiệu điện thế

của MFC đƣợc xử lý và vẽ đồ thị bằng phầm mền Microsoft Excel 2010. Dòng điện

của MFC sẽ đƣợc tính bằng công thức I = U/ R (Định luật ôm), trong đó: I là cƣờng

độ dòng điện (Ampe: A), U là điện áp ở hai đầu đoạn mạch (Vol: V), R là điện trở

của mạch (ohm).

2.2.6 Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống

Phân lập hệ vi sinh vật trên điện cực anode: Sau khi làm giàu vi sinh vật

trong MFC thành công, tiến hành cắt 5 x 1 x 5 mm điên cực anode cho vào 9 ml

nƣớc muối sinh lý và tiến hành vortex, sau đó dịch điện cực anode đƣợc tiến hành

pha loãng theo dày nồng độ giảm 10 lần đến 104 bằng nƣớc muối sinh lý, tiếp đó

tiến hành cấy trải dịch điện cực anode trên môi trƣờng C, LB, BG11, Hansen, PDA.

Các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc chọn lựa và làm thuần bằng phƣơng pháp cấy ria ba

pha trên môi trƣờng cùng loại. Mẫu vi sinh vật thu đƣợc sẽ đƣợc bảo quản trên ống

môi trƣờng thạch nghiêng tƣơng ứng với nhiệt độ 4oC và glycerol 15% tại nhiệt đô -

20oC.

Bảng 7: Môi trƣờng LB (phân lập các vi khuẩn dị dƣỡng) [62]

STT. Thành phần Hàm lƣợng

1 Nƣớc cất 1 L

2 Peptone 15 g

3 Cao nấm men 5 g

4 NaCl 5 g

5 Agar 18 g

pH 7 ± 0,5, khử trùng tại 121oC trong 20 phút.

36

Bảng 8: Môi trƣờng C [62]

(phân lập các vi khuẩn có khả năng khử sulfate)


1 Nƣớc cất 1 L

2 Sodium lactate 6 g

3 Na2SO4 4,5 g

4 NH4Cl 1 g

5 Cao nấm men 1 g

6 KH2PO4 0,5 g

7 Sodium citrate.2H2O 0,3 g

8 CaCl2.6H2O 0,06 g

9 MgSO4.7H2O 0,06 g

10 FeSO4.7H2O 0,004g

11 Agar 16 g

pH 7.5 ± 0.2, khử trùng tại 121oC trong 20 phút.

Nuôi trong điều kiện kỵ khí (Oxy tối thiểu)

Bảng 9: Môi trƣờng PDA (phân lập nấm sợi) [62]


1 Nƣớc cất 1 L

2 Khoai tây 200 g

3 Glucose 16 g

4 Agar 16 g

pH 7 ± 0.5, khử trùng tại 110oC trong 20 phút.

Bổ sung thêm ampicillin (10 mg/ 1L) ở nhiệt độ khoảng 60oC trong

Box cấy vô trùng

37

Bảng 10: Môi trƣờng Hansen (phân lập nấm men) [62]


1 Nƣớc cất 1 L

2 Glucose 50 g

3 KH2PO4 3 g

4 MgSO4.7H2O 3 g

5 Peptone 10 g

6 Agar 20 g

pH 7 ± 0,5, khử trùng tại 110 oC trong 20 phút.

Bổ sung thêm ampicillin (10 mg/ 1L) ở nhiệt độ khoảng 60oC trong

Box cấy vô trùng

Bảng 11: Môi trƣờng BG 11 (phân lập vi khuẩn lam và tảo) [62]


1 Nƣớc cất 1 L

2 NaNO3 1,5 g

3 MgSO4.7H2O 0,075 g

4 K2HPO4 0,04 g

5 CaCl2.2H2O 0,036 g

6 Na2CO3 0,02 g

7 Citric acid 6,0 mg

8 Ferric ammonium citrate 6,0 mg

9 Disodium EDTA 1,0 mg

10 Hỗn hợp vi lƣợng A5 1,0 mL

11 Agar 16 g

pH 7 ± 0,5, khử trùng tại 121oC trong 20 phút.

38

Bảng 12: Thành phần của dung dịch Trace metal mix A5


1 Nƣớc cất 1 L

2 H3BO3 2,86 g

3 MnCl2.4H2O 1,81 g

4 Na2MoO4.2H2O 0,39 g

5 ZnSO4.7H2O 0,222 g

6 CuSO4.5H2O 0,079 g

7 Co(NO3)2.6H2O 0,049 g

Quan sát hình thái vi khuẩn: Các chủng phân lập đƣợc tiến hành nhuộm

gram và đem soi dƣới kính hiển vi quang học (Zeiss - Đức), ở vật kính 100 x và

đƣợc chụp ảnh bằng máy ảnh Canon G10 (Nhật Bản) ở các độ phóng đại 8.5 x; 11.5

x; 14 x. Với quy trình: lấy một khuẩn lạc thuần của chủng vi khuẩn và khuẩn lạc

của Bacillus subtilis hoặc E. coli trộn với nhau và cố định hai vết bôi trên lam kính

sạch, sau đó tiến hành nhuộm mẫu với dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) trong

1 phút, tiếp ta rửa mẫu bằng nƣớc cất, mẫu đƣợc nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol

trong 1 phút. Vết bôi đƣợc rửa lại bằng ethanol 96% trong 30 giây, sau đó đƣợc rửa

lại bằng nƣớc cất. Mẫu đƣợc nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm bổ sung màu đỏ

Safranin (hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây. Cuối cùng, mẫu đƣợc rửa bằng nƣớc

cất, để khô và soi dƣới kính hiển vi quang học.

2.2.7 Phƣơng pháp DGGE

Quy trình tách chiết DNA [30]: Mẫu điện cực anode hoặc dịch vi khuẩn đƣợc

tách chiết DNA theo quy trình sau: Các ống Eppendorf có chứa 1 ml mẫu đƣợc ly

tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) ở 8000 rpm, 20oC trong 10 phút. Gạn bỏ dịch

nổi; phần lắng đƣợc mix đều với 0,5 mL nƣớc vô trùng MQ. Sau đó, các dung dịch

này đƣợc bổ sung 500 µL hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1)

và vortex khoảng 20 giây trƣớc khi ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) ở

14.000 rpm, 20°C trong 10 - 15 phút. Tiếp đến, thu dịch nổi và chuyển vào một ống

39

Eppendorf vô trùng khác. Các ống này tiếp tục đƣợc bổ sung lần lƣợt 1 µL

glycogen, 100 µL 7,5 M ammonium acetate và 750 µL ethanol 100% trƣớc khi ủ

qua đêm ở nhiệt độ -20 °C. Hỗn hợp này tiếp tục đƣợc ly tâm trên máy Eppendorf

5417R (Đức) với điều kiện 14.000 rpm, 30 phút, 4 °C thu DNA, DNA thu đƣợc

đƣợc rửa lại ba lần trong dung dịch ethanol 70%. Cuối cùng, DNA đƣợc để khô tự

nhiên qua đêm trƣớc khi pha loãng với 50 µL nƣớc PCR. Sản phẩm tách chiết DNA

đƣợc kiểm tra trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa

thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch

TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi

gel LMW-20 UVP (UK).

Bảng 13: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen16s rRNA

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình nhiệt

Taq PCR mix 12,5 µL

1. 95oC: 5 min

2. 95oC: 1 min

53oC: 45 s

72oC: 1 min

Lặp lại 30 chu kì.

3. 72oC: 7 min

P63F (10 µM) 1,5 µL

P1378R (10 µM) 1,5 µL

DNA khuôn 1,5 µL

Nƣớc PCR 8 µL

Tổng thể tích 25 µL

Quy trình khuếch đại đoạn gen 16s rRNA: DNA thu đƣợc từ điện cực anode

hoặc chủng nuôi cấy thuần sẽ đƣợc đƣa vào chạy PCR trên máy PCR 9700 (Applied

Biosystems, Mỹ) với mục đích khuếch đại gen 16s rRNA (1400 bp) bằng cặp mồi

p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′, mồi xuôi) và p1378R

(5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’, mồi ngƣợc) [19] với thành phần

phản ứng và chu trình nhƣ Bảng 13, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên máy điện di

40

BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc nhuộm HydraGreen Safe

ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-

thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi gel LMW-20 UVP (UK). Sau khi

nhân đoạn 16s rRNA của mẫu thành công, chúng tôi tiếp tục sử dụng sản phẩm

PCR khuếch đại gen 16s rRNA làm khuôn nhằm khuếch đại vùng V3 (200 bp) bằng

cặp mồi p338F-GC (với một kẹp GC đƣợc thêm vào) (5’

ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3’, mồi xuôi) và p518R

(5’ATTACCGCGGCTGCTGG 3’, mồi ngƣợc) [47] theo quy trình ở Bảng 14 để

phục vụ cho quá trình phân tích trên DGGE. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên

máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc nhuộm

HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch TAE 1x với hiệu

điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi gel LMW-20 UVP

(UK).

Bảng 14: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng V3 thuộc

gen16s rRNA

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình nhiệt

Taq PCR mix 12,5 μL 1. 95

oC: 5 min

2. 95oC: 30 s

53oC: 30 s

72oC: 45 s

Lặp lại 30 chu kì.

3. 72oC: 5 min

p338F (10 μM) 1,5 μL

P518R (10 μM) 1,5 μL

DNA khuôn 1,5 μL

Nƣớc PCR 8μL

Tổng thể tích 25 μL

41

Bảng 15: Thành phần của dung dịch biến tính 0% và 60%

Thành phần Dung dịch biến tính 0% Dung dịch biến tính 60%

Acrylamide 6 g 4,5 g

Bis-AA 0,162 g 0,122 g

50 x TAE 2,5 mL 1,9 mL

Urea - 25,2 g

Formamide - 24 mL

MQ water 100 mL 100 mL

Quy trình điện di DGGE: Quá trình điện di đƣợc tiến hành trên gel

polyacrylamide 6% với gradient biến tính Urea/ formamide từ 45% đến 60% (Bảng

15, 16). Ta tiến hành trộn 15 µl mỗi mẫu với 10 µl Loading Dye 6x và tra vào mỗi

giếng. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DGGEK – 2401 (C.B.S

Scientific - Mỹ), trong đệm TAE 1x, ở nhiệt độ 60oC, hiệu điện thế 38V, thời gian

16 giờ. Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch HydraGreen Safe

ADN Stain 1x trong 30 phút, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất trong 10 phút và quan sát

bằng máy soi LMW-20 UVP (UK).

Bảng 16: Thành phần của “Working solution”

Dung dịch stock Dung dịch biến

tính 45%

Dung dịch biến

tính 60%

Dung dịch biến

tính 0%

Dung dịch 60% 7,5 mL 10 mL 0 mL

Dung dịch 0% 2,5 mL - 5 mL

TEMED 8 µL 8 µL 5 µL

APS 10% 40 µL 40 L 20 L

42

Quy trình thôi gel: Những băng phân tách trên bản gel DGGE đƣợc cắt bằng

dao cắt gel vô trùng, sau đó đƣợc rửa lại bằng nƣớc MQ và bổ sung thêm 50 µl

nƣớc MQ, để qua đêm ở 4oC. Dịch thôi ADN đƣợc dùng làm khuôn để thực hiện

phản ứng PCR tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR cho DGGE Bảng 15 với cặp mồi 338F

và 518R. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit ExoSAP – IT (Affymetric) và

giải trình tự bởi FirstBase (Singapore).

Phân tích kết quả DGGE: Kết quả điện di DGGE sẽ đƣợc phân tích nhờ

phần mềm NTSYSpc2.0 dựa trên phân tích ma trận tƣơng đồng – ma trận khoảng

cách của mẫu từ số lƣợng băng thu đƣợc, sau đó tiến hành phân tích nhóm (cluster

analyses) để xác định tƣơng quan giữa các quần xã. Trình tự gen 16S rRNA của các

đơn chủng và trình tự của các băng thu đƣợc trên điện di DGGE đƣợc phân tích trên

phần mềm clustalx 2.0, và BioEdit Sequence Aligment Editor, sau đó đƣợc tiến

hành tìm kiếm so sánh trình tự tƣơng đồng trên công cụ BLAST của NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

43

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ MFC PHÙ HỢP

3.1.1 Lựa chọn vật liệu cho MFC

Chúng tôi tiến hành so sánh ƣu nhƣợc điểm của từng loại vật liệu phục vụ

cho thiết kế MFC đã đƣợc công bố trong những nghiên cứu trƣớc đây (Bảng 17; 18;

19). Qua đó, chúng tôi lựa chọn sử dụng vải than chì (0,8 Ω) làm điện cực, chúng

đƣợc nối với thanh gom điện làm bằng than chì đƣờng kính 0,6 cm (0,2 Ω) thông

qua keo epoxy (Thái Lan) có trộn với bột than chì. Tiếp theo, chúng tôi lựa chọn

màng CEM nafion 117 làm màng ngăn cách giữa hai khoang MFC, vì loại màng

này cho dòng điện phát sinh cao, tạo pH ổn định trong khoang anode. Cuối cùng,

qua so sánh, chúng tôi chọn vật liệu polyacrylic làm khung MFC, vì đây là vật liệu

có thể khử trùng và dễ dàng cải biến hình dạng.

Bảng 17: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các điện cực trong MFC

[37, 38, 51, 63]

STT Tên Vật liệu

(độ dẫn điện) Ƣu điểm Nhƣợc điểm

1 Giấy carbon

(0,4 Ω) Tính dẫn điện cao,

Giòn dễ gãy, không gian

điện cực nhỏ

2 Vải than chì

(2,2 Ω) Không gian điện cực lớn Tính dẫn điện thấp

3

Thanh than chì,

miếng than chì

(0,2 Ω)

Tính dẫn điện cao Không gian điện cực thấp

44

Bảng 18: Phân tích ƣu nhƣợc điểm vật liệu cấu tạo khung MFC [37, 38]

STT Tên Vật liệu Ƣu điểm Nhƣợc điểm

1 Vật liệu khung polyacrylic Có thể khử trùng đƣợc,

Đễ dàng khoan cắt

2 Vật liệu khung bằng thủy tinh Có thể khử trùng

Khó cải tiến, dễ vỡ,

khó đặt mua với số

lƣợng ít

Bảng 19: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các loại màng phân tách [37, 38]

STT Tên Vật liệu Ƣu điểm Nhƣợc điểm

1 Màng CEM nafion 117

(R=84+4 Ω; P=514 mW/m2)

Điện trở trong thấp, năng

lƣợng sản sinh cao Giá thành đắt

2

Màng AEM

(R=88+4 Ω: P=610 mW/m2)

Năng lƣợng phát sinh

lớn, điện trở trong thấp,

pH trong khoang

anode cao, nếu hoạt

động trong thời gian

dài gây ức chế vi

sinh vật

3 Màng Phân cực

Có khả năng duy trì pH

độc lập tại khoang anode

và cathode

Năng lƣợng sản sinh

thấp

3.1.2 Lựa chọn thiết kế MFC nhằm phát triển cảm biến sinh học

Sau khi lựa chọn đƣợc vật liệu để chế tạo MFC, chúng tôi tiếp tục nghiên

cứu các dạng thiết kế MFC đã đƣợc công bố trên thế giới và so sánh phân tích ƣu

nhƣợc điểm của chúng qua đó lựa chọn đƣợc dạng thiết kế tối ƣu nhất cho việc phát

triển cảm biến sinh học đánh giá chất lƣợng nƣớc thải (Bảng 20, 21). Nhƣ ta đã biết,

cảm biến sinh học (biosensor) trong đánh giá chất lƣợng nƣớc cần những yêu cầu

nhƣ: chỉ dẫn chính xác chất lƣợng nƣớc, kiểm tra trực tiếp chất lƣợng nƣớc, thời

gian phản ứng với sự thay đổi chất lƣợng nƣớc ngắn, giá thành rẻ… Tuy nhiên,

dòng điện đƣợc sinh ra bởi MFC chịu ảnh hƣởng bởi nhiều nhân tố nhƣ: hoạt động

của vi sinh vật, sự di chuyển-tốc độ electron từ tế bào đến điện cực, sự di chuyển

của proton từ khoang anode tới khoang cathode, điện trở trong của hệ thống, tốc độ

và lƣợng oxy phản ứng tại khoang cathode, oxy hòa tan trong khoang anode[26]…

45

Do đó, nhằm hạn chế các yếu tố ảnh hƣởng tới MFC, đã có rất nhiều dạng thiết kế

MFC đã đƣợc nghiên cứu phục vụ cho việc phát triển cảm biến sinh học và tối ƣu

độ hoạt động của chúng. . Ƣu nhƣợc điểm của các dạng thiết kế này đã đƣợc chúng

tôi phân tích ở Bảng 20.

Bảng 20: Phân tích ƣu nhƣợc điểm các loại thiết kế MFC [13, 14, 25, 37, 38]

STT Loại MFC Ƣu điểm Nhƣợc điểm

1

MFC một

khoang với

cathode không

khí

- Dòng điện phát sinh cao

- Điện trở trong thấp

- Khó thiết kế điện cực cathode

- Điện cực cathode có thể là trở ngại

cho việc tiếp xúc với oxy nếu không

đƣợc tƣới nƣớc hoặc dung dịch điện ly

- Oxy có thể thấm qua màng vào

khoang anode gây phản ứng không đặc

hiệu

2

MFC hai khoang

với cathode

chứa dung dịch

chất điện ly

- Dòng điện phát sinh

cao, ổn định

- Chất điện ly thƣờng là chất độc cần

đƣợc thay thƣờng xuyên

3

MFC hai khoang

với cathode

chứa nƣớc đƣợc

sục khí

- Dòng điện phát sinh

thấp, ổn định

- Thuận tiện trong chế

tạo và vận hành

- Điện trở trong cao



hiệu

4 MFC dạng ống

- Dòng điện phát sinh cao

- Cơ chất bị phân hủy

chiệt để

- Không bị tắc nếu dung

địch đầu vào vẩn đục



hiệu

- Điện cực cathode có thể là trở ngại

cho việc tiếp xúc với oxy nếu không

đƣợc tƣới nƣớc hoặc dung dịch điện ly

46

Bảng 21: Tổng hợp các nghiên cứu về dạng MFC biosensor

Dạng MFC Chất cho

điện tử

Nồng độ

cao nhất

có thể đo

Dòng điện

phát sinh

cao nhất

Thể tích

khoang

Thời gian

cảm biến Tài liệu

MFC hai

khoang (không

sử dụng chất

chuyền điện

tử)

Nƣớc thải 25 mg O2/l

BOD 1.1 mA 25 ml

30 phút–

10h

Kim và

cộng sự

(2003) [25]

MFC hai

khoang dạng C

Glucose

và

glutamate

200 mg

O2/l BOD 2.9 mA 5 ml 5 phút-10h

Kim và

cộng sự

(2006) [26]

MFC hai

khoang (không

chất chuyền

điện tử)

Glucose

và

glutamate

100 mg

O2/l BOD 6 mA 20 ml 60 phút

Chang và

cộng sự

(2004) [13]

MFC một

khoang Nƣớc thải

250 mg

O2/BOD 0.4 mA 12 ml

Lớn hơn

60 phút

Lorenzo và

cộng sự

(2009) [17]

MFC một

khoang Nƣớc thải

78 mg O2/l

BOD 0,27 mA 9 ml

30 phút-

10h

Peixoto và

cộng sự

(2011) [55]

Sau khi tiến hành nghiên cứu và so sánh ƣu-nhƣợc điểm của các dạng thiết

kế MFC tại Bảng 20 và 21, chúng tôi lựa chọn thiết kế MFC dựa trên mô hình của

Kim và cộng sự năm 2006 [26]. Đây là dạng thiết kế MFC có thể tích khoang anode

nhỏ nên sẽ cơ thời gian phản ứng với các nồng độ BOD khác nhau nhanh hơn. MFC

của chúng tôi đƣợc thiết kế là dạng MFC hai khoang với dạng hình hộp và hình trụ,

với ba thể tích khoang anode là: 5 ml; 7,5 ml; 10 ml. Hệ thống MFC vận hành với

khoang cathode sử dụng nƣớc bão hòa oxy chạy tuần hoàn (nƣớc đƣợc thay 1

47

ngày/lần), còn khoang anode không sử dụng chất truyền điện tử trung gian, và dịch

đầu vào anode chúng tôi không sử dụng nitơ để tạo điều kiện kỵ khí. Với những đặc

điểm trên, chúng tôi mong đợi MFC có thể tích khoang nhỏ sẽ cho tốc độ cảm ứng

với chất lƣợng nƣớc thải nhanh hơn. Việc không sử dụng dung dịch đầu vào anode

kỵ khí, không sử dụng chất truyền điện tử trung gian và sử dụng cathode chứa dung

dịch nƣớc đƣợc sục khí là nhằm tăng khả năng triển khai cho ứng dụng ngoài thực

địa. Ngoài ra, do hoạt động của MFC còn chịu nhiều ảnh hƣởng của cấu trúc

khoang, đƣờng đi của dòng dung dịch và tốc độ lƣu dịch trong khoang, chúng tôi

tiến hảnh thử nghiệm hai dạng thiết kế khoang hình trụ và hình hộp chữ nhật với thể

tích khoang anode biến đổi từ 5-7, 5-10 ml nhằm chọn ra thiết kế tốt nhất cho việc

thiết kế một cảm biến sinh học có độ nhạy cao và ổn định.

3.1.3 Thử nghiệm để chọn lựa thiết kế thiết kế ƣu việt hơn

3.1.3.1 Kết quả làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC

Để phục vụ cho việc lựa chọn thiết kế tối ƣu cho các MFC, chúng tôi tiến

hành làm giàu một quần xã vi sinh vật điện hóa thí điểm trong MFC từ nguồn bùn

thải khu dân cƣ (Hình 19).

Hình 19: Biểu đồ hiệu điện thế MFC trong quá trình làm giàu (BOD 50 ppm)

MFC 9 –HH là MFC có thiết kế khoang hình hộp chữ nhật

MFC 3 – HT là MFC có thiết kế khoang hình trụ

Đối chứng: là MFC hình hộp chữ nhật không được bổ sung vi sinh vật

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

mA

Ngày

MFC 9-HH

MFC 3-HT

Đối chứng

48

Kết quả ở hình Hình 19 cho thấy, dòng điện bắt đầu xuất hiện từ ngày thứ 3

(với MFC dạng thiết kế hình hộp chữ nhật là 0,005 mA và MFC khoang hình trụ là

0,002 mA), sau khi hệ thống MFC đƣợc làm giầu với quần xã vi sinh vật trong nƣớc

thải khu dân cƣ, dòng điện đạt đƣợc mức ổn định tại hiệu điện thế đạt khoảng 0,3

mA từ ngày 16 trở đi. Thêm vào đó đối với MFC đối chứng (không đƣợc làm giàu

với quần xã vi sinh vật) ta có thể nhận thấy không có dòng điện xuất hiện. Nhƣ vậy,

chúng tôi đã làm giàu đƣợc quần xã vi khuẩn điện hóa thí điểm trong các MFC với

các thiết kế thử nghiệm.

3.1.3.2 So sánh các MFC với dạng thiết kế khác nhau

Về độ ổn định của dòng điện sản sinh bởi hai dạng MFC: Sau khi làm giàu

hệ vi sinh vật điện hóa thí điểm trong MFC thành công, chúng tôi so sánh độ ổn

định dòng điện của các dạng thiết kế MFC với nhau. Có thể nhận thấy, dòng điện

sinh ra từ MFC khoang hình hộp chữ nhật là ổn định hơn so với dạng thiết kế MFC

khoang hình trụ (Hình 20 và 21). Nguyên nhân của việc này có thể là do khoảng

cách đƣờng dung dịch đầu vào và đầu ra của khoang anode trong dang thiết kế MFC

khoang hình trụ khá gần nhau (khoảng 2,5 cm) nên tốc độ lƣu dịch trong khoang

thấp và cơ chất không đƣợc phân bố đồng đều toàn bộ điện cực, còn đối với dạng

thiết kế MFC khoang hình hộp chữ nhật có khoảng cách hai đƣờng dung dịch đầu

vào và đầu ra xa hơn (khoảng 5 cm), do đó dung dịch sẽ đƣợc lƣu lại lâu hơn trong

khoang (cùng tốc độ dòng đối với khoang hình trụ) và khả năng phân hủy cơ chất

triệt để hơn.

49

Hình 20: Hiệu điện thế MFC khoang hình hộp chữ nhật sau quá trình làm giàu

(BOD 50 ppm)

MFC 3–HH–5: là MFC khoang hình hộp chữ nhật có thể tích 5 ml

MFC 6-HH-7.5: là MFC khoang hình hộp chữ nhật có thể tích 7.5 ml

MFC8-HH-10: là MFC khoang hình hộp chữ nhật có thể tích 10 ml

Hình 21: Hiệu điện thế MFCs khoang hình trụ sau quá trình làm giàu

(BOD 50 ppm)

MFC 3–HT–5: là MFC khoang hình trụ có thể tích 5 ml

MFC 6-HT-7.5: là MFC khoang hình trụ có thể tích 7.5 ml

MFC8-HT-10: là MFC khoang hình trụ có thể tích 10 ml

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

17

:00

10

:30

11

:30

14

:30

15

:30

16

:30

10

h30

11

h30

12

h30

13

h30

14

h30

15

h30

16

h30

1/13/2014 1/14/2014 1/15/2014

mA

MFC 3-HH-5

MFC 6-HH-7,5

MFC 8-HH-10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

h

11

h

12

h30

14

h30

15

h30

16

h30

10

h

11

h

12

h

15

h

15

h30

10

h30

11

h30

12

h30

14

h30

15

h30

16

h30

10

h

11

h

14

h

15

h

16

h

17

h

1/13/2014 1/14/2014 1/15/2014 1/16/2014

mA

MFC 3-HT-5

MFC 4-HT-7,5

MFC 9-HT-10

50

Về độ nhạy trong phản ứng của hai dạng MFC với sự thay đổi giá trị BOD

của dung dịch andoe: Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với hai nồng độ BOD = 5

ppm và BOD 50 ppm nhằm so sánh độ nhạy của các MFC với thiết kế khác nhau

(chứa quần xã vi sinh vật điện hóa thí điểm). Dựa vào Hình 22 và 23 có thể thấy

rằng, khi thay đổi nồng độ BOD từ 50 ppm xuống 5 ppm, dòng điện sinh ra với cả

hai dạng MFC có xu hƣớng giảm (0,35 - 0,3 mA xuống 0,1 – 0,05 mA), và phải mất

đến khoảng 2 giờ 30 phút thì dòng điện mới bắt đầu đạt mức ổn định. Ngƣợc lại,

Hình 24 và 25 cho thấy, khi thay đổi BOD từ 5 ppm lên 50 ppm, MFC dạng khoang

hình hộp có thể tích 5 ml và 7, 5 ml có sự tăng dòng điện ngay trong lần đo đầu tiên

(đo 10 phut/ lần trong thời gian thử BOD) và đạt mức ổn định ngay sau 30 phút; còn

đối với các MFC còn lại, phải mất từ 60 – 90 phút dòng điện mới có thể bắt đầu đạt

đƣợc mức ổn định với dòng điện tăng từ khoảng 0,05 đến 0,3 mA. Trong khi đó,

dòng điện sinh ra bởi MFC đối chứng (không thay đổi nồng độ BOD) là không đổi.

Khi so sánh phản ứng dòng điện của hai MFC dạng khoang hình hộp chữ nhật với

thể tích anode là 5 ml và 7,5 ml, có thể nhận thấy thời gian cảm ứng của chúng với

các nồng độ BOD là giống nhau, nhƣng MFC dạng khoang hình hộp chữ nhật với

thể tích anode 7,5 ml có khả năng phân biệt sự sai khác giữa giá trị BOD 50 ppm và

5 ppm tốt hợn so với MFC dạng khoang hình hộp chữ nhật có thể tích khoang 5 ml.

Vậy kết quả thu đƣợc cho thấy độ nhạy với sự thay đổi nồng độ BOD của

MFC dạng khoang anode hình hộp chữ nhật là cao hơn so với độ nhạy của MFC

dạng khoang anode hình trụ. Hơn nữa, MFC dạng khoang anode hình hộp chữ nhật

với thể tích khoang 5 ml và 7,5 ml có độ nhạy cao hơn so với MFC cùng dạng có

thể tích khoang anode 10 ml. Những kết quả này khá tƣơng đồng với kết quả của

Di Lorenzo thu đƣợc về ảnh hƣởng của thể tích khoang anode MFC tới độ nhạy của

phản ứng [17]. Tổng hợp các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn thiết kế dạng khoang

anode hình hộp chữ nhật với thể tích khoang 5 ml và 7,5 ml là thiết kế phù hợp nhất

cho mục đích sử dụng MFC để đánh giá chất lƣợng nƣớc thải. Trong các thí nghiệm

tiếp theo, chúng tôi sử dụng dạng thiết kế này.

51

Hình 22: MFC khoang hình hộp chữ nhất

thử nghiệm với BOD 50 ppm-5 ppm Hình 23: MFC khoang hình trụ thử

nghiệm với BOD 50 ppm-5 ppm

*Ghi chú: ĐC là ký hiệu MFC đối chứng, tại đó MFC không được thay đổi nồng độ BOD.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.59:0

0

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

17

:00

50 ppm 5 ppm

2/28/2014

mA

MFC khoang hình hộp chữ nhật thể tích

anode 5 ml

MFC 1-HH-5

MFC 2-HH-5

MFC 3-HH-5

ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

17

:00

50 ppm 5 ppm

2/28/2014

mA

MFC khoang hình trụ thể tích anode 5 ml

MFC 2-HT-5

MFC 3-HT-5

MFC 1-HT-5ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

17

:00

50 ppm 5 ppm

2/28/2014

mA

MFC khoang hình hộp chữ nhật thể tích anode 7,5 ml

MFC 4-HH-7,5

MFC 5-HH-7,5

MFC 6-HH-7,5ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:30

12

:00

13

:30

15

:00

16

:30

50 ppm 5 ppm

2/28/2014

mA

MFC khoang hình trụ thể tích anode 7,5 ml

MFC 5-HT-7,5

MFC 6-HT-7,5

MFC 4-HT-7,5ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:00

11

:00

12

:00

13

:30

14

:30

15

:30

16

:30

50ppm

5 ppm

2/26/2014

mA


anode 10 ml

MFC 8-HH-10

MFC 9-HH-10

MFC 7-HH-10ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:30

12

:00

13

:30

15

:00

16

:30

50 ppm 5 ppm

2/28/2014

mA

MFC khoang hình hộp chữ nhật thể tích anode 10 ml

MFC 7-HT-10

MFC 8-HT-10

MFC 9-HT-10ĐC

52

Hình 24: MFC khoang hình hộp chữ nhất

thử nghiệm với BOD 5 ppm-50 ppm

Hình 25: MFC khoang hình trụ

thử nghiệm với BOD 5 ppm-50 ppm

*Ghi chú: ĐC là ký hiệu MFC đối chứng, tại đó MFC không được thay đổi nồng độ BOD.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:00

11

:00

12

:30

13

:30

14

:30

15

:30

16

:30

5 ppm 50 ppm

3/1/2014

mA

MFC khoang hình hộp chữ nhật thể tích anode 5 ml

MFC 1-HH-5

MFC 2-HH-5

MFC 3-HH-5ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

5 ppm 50 ppm

2/27/2014

mA

MFC khoang hình trụ thể tích anode 5 ml

MFC 1-HT-5 ĐC

MFC 2-HT-5

MFC 3-HT-5

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

17

:00

5 ppm 50 ppm

2/27/2014

mA


anode 7,5 ml

MFC 4-HH-7,5

MFC 5-HH-7,5

MFC 6-HH-7,5ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

9:0

0

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

5 ppm 50 ppm

3/1/2014

mA

MFC khoang hình trụ thể tích anode 7.5

ml

MFC 4-HT-7,5ĐC

MFC 5-HT-7,5

MFC 6-HT-7,5

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

5 ppm 50 ppm

2/27/2014

mA


anode 10 ml

MFC 8-HH-10

MFC 9-HH-10

MFC 7-HH-10ĐC

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

10

:00

11

:00

12

:00

13

:00

14

:00

15

:00

16

:00

5 ppm 50 ppm

2/27/2014

mA

MFC khoang hình trụ thể tích anode 10

ml

MFC 9-HT-10ĐC

MFC 8-HT-10

MFC 7 -HT-10

53

3.2 LỰA CHỌN NGUỒN VI SINH VẬT PHÙ HỢP ĐỂ LÀM GIÀU HỆ VI

SINH VẬT ĐIỆN HÓA TRONG CÁC MFC

3.2.1 Dòng điện phát sinh bởi các MFC trong giai đoạn làm giàu hệ vi sinh vật

điện hóa

Sau khi thử nghiệm các dạng thiết kế khác nhau, chúng tôi tiến hành làm

giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong các MFC dạng khoang hình hộp chữ nhật có thể

tích anode là 5 ml (ký hiệu là TX) và 7,5 ml (ký hiệu BO) từ năm quần xã vi sinh

vật khác nhau (đất tự nhiên-ĐT, bùn tự nhiên-BT, bùn hoạt tính-BH, nƣớc thải-NT,

hỗn hợp-HH). Kết quả (Hình 26) cho thấy sau khi MFC đƣợc thay màng nilon bằng

màng nafion 117 (14 ngày đƣợc gây nhiễm vi sinh vật từ các quần xã), dòng điện

xuất hiện ngay lập tức và đạt giá trị từ 0,1 – 0,13 mA. Sau 8 ngày dòng điện của các

MFC đƣợc làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa từ nguồn hỗn hợp, nƣớc thải, bùn hoạt

tính và bùn tự nhiên đều đạt giá trị ổn định (dao động từ 0,35 mA đến 0,5 mA). Còn

đối với MFC đƣợc làm giàu từ nguồn đất tự nhiên, phải sau 19 ngày dòng điện mới

đạt giá trị dòng điện ổn định (0,5 – 0,6 mA).

54

Hình 26: Quá trình làm giàu MFC với nguồn quần xã khác nhau

55

3.2.2 Độ ổn định của dòng điện phát sinh trong MFC sau khi làm giàu thành

công hệ vi sinh vật điện hóa

Một trong những yêu cầu của cảm biến MFC đánh giá BOD của nƣớc thải là:

với mỗi nồng độ cơ chất nhất đinh, dòng điện sinh ra phải có tính ổn định. Vì vậy,

chúng tôi theo dõi và so sánh tính ổn đinh của dòng điện sinh ra bởi các MFC với

hệ vi sinh vật đƣợc làm giàu từ các nguồn khác nhau nêu trên. Khi so sánh dòng

điện phát sinh của các MFC (trong giai đoạn sau khi làm giàu thành công) tại hai

thời điểm cách nhau khoảng 20 ngày, có thể thấy rằng: MFC đƣợc làm giàu từ

nguồn đất tự nhiên và bùn hoạt tính có dòng điện phát sinh trong cả hai giai đoạn là

khá ổn định, và tại hai thời điểm theo dõi thì giá trị dòng điện của MFC làm giàu từ

nguồn đất tự nhiên là khá bằng nhau (0,45 -0,49 mA) (Hình 27). Ngƣợc lại, với các

MFC đƣợc làm giàu từ nguồn bùn tự nhiên, nƣớc thải, hỗn hợp, dòng điện phát sinh

sau 20 ngày theo dõi là không ổn định và có giá trị thấp hơn, dao động trong khoảng

0.2 mA.

Hơn nữa, khi so sánh dòng điện thu đƣợc sau khi làm giàu thành công hệ vi

vật điện hóa trong MFC từ các nguồn khác nhau, ta có thể nhận thấy MFC đƣợc làm

giàu từ nguồn đất tự nhiên có dòng điện phát sinh (0,45 – 0,49 mA) là cao hơn so

với các nguồn làm giàu từ bùn tự nhiên, nƣớc thải, bùn hoạt tính, và nguồn hỗn hợp

(dƣới 0,4 mA).

Các kết quả trên chứng tỏ các MFC đƣợc làm giàu từ nguồn quần xã vi sinh

vật khác nhau cũng ảnh hƣởng tới dòng điện phát sinh và độ ổn định của dòng điện

tại MFC. Theo Kim và cộng sự (2006), đối với các MFC mà không đƣợc bổ sung

chất truyền điện tử trung gian, quá trình làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC

đóng một vai trò quan trọng trong việc phát sinh dòng điện. Hơn nữa, nguồn quần

xã làm giàu có thể ảnh hƣởng tới cấu trúc hệ vi sinh vật trong MFC và qua đó chúng

sẽ có phản ứng khác nhau đối với sự thay đổi điều kiện môi trƣờng hoạt động của

MFC. Ana và cộng sự cũng nhận ra rằng, đối với các quần xã khác nhau đƣợc sử

dụng cho quá trình làm giàu hệ vi sinh điện hóa trong MFC sẽ tạo ra điện trở trong

khác nhau, và ảnh hƣởng tới dòng điện phát sinh trong MFC. Theo Logan thì cấu

56

trúc hệ vi sinh vật điện hóa và tốc độ sinh trƣởng của chúng trong MFC là một yếu

tố giới hạn hiệu điện thế phát sinh trong MFC [27, 39, 67].

Hình 27: So sánh dòng điện sau quá trình làm của MFC tại hai thời điểm có khoảng là

cách 20 ngày

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0:00

2:50

5:40

8:30

11:2

0

14:1

0

17:0

0

19:5

0

22:4

0

1:35

4:25

7:15

10:0

5

12:5

5

15:4

5

18:3

5

21:2

5

6/24/2014 7/22/2014

mA

Nguồn bùn tự nhiên

TXBT

BOBT

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0:00

3:00

6:00

9:00

12:0

015

:00

18:0

021

:00

0:05

3:05

6:05

9:05

12:0

515

:05

18:0

521

:05

6/24/2014 7/18/2014

mA

Nguồn đất tự nhiên

TXĐT

BOĐT

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0:00

2:50

5:40

8:30

11:5

0

14:4

0

17:3

0

20:2

0

23:1

0

2:05

4:55

7:45

10:3

5

13:2

5

16:1

5

19:0

5

21:5

5

6/28/2014 7/22/2014

mA

Nguồn nƣớc thải

TXNT

BONT

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0:00

3:00

6:00

9:00

12:0

015

:00

18:0

021

:00

0:05

3:05

6:05

9:05

12:0

515

:05

18:0

521

:05

6/24/2014 7/21/2014

mA

Nguồn bùn hoạt tính

TXBH

BOBH

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0:00

2:20

4:40

7:00

9:20

11:4

0

14:0

0

16:2

0

18:4

0

21:0

0

23:2

0

1:45

4:05

6:25

8:45

11:0

5

13:2

5

15:4

5

18:0

5

20:2

5

22:4

5

6/24/2014 7/22/2014

mA

Nguồn hỗn hợp

TXHH

BOHH

57

3.2.3 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật trong điện cực anode của MFC sau khi

làm giàu thành công

Nhằm hiểu rõ hơn về ảnh hƣởng của nguồn vi sinh vật ban đầu đến hệ vi sinh

vật hình thành trong các MFC, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật

trong điện cực anode của những MFC nêu trên. Sau khi phân lập mẫu điện cực

anode đƣợc cắt ra từ các MFC (sau quá trình làm giàu) trên các môi trƣờng (môi

trƣờng LB, C; Hansen; PDA, BG11), chúng tôi chỉ thu đƣợc các khuẩn lạc mọc trên

môi trƣờng LB. Điều này chứng tỏ hệ vi sinh vật trên điện cực anode trong MFC

của chúng tôi đa phần là vi khuẩn dị dƣỡng. Theo nhiều nghiên cứu khác, nhiều vi

khuẩn trong các MFC vận hành với các cơ chất hữu cơ là các vi khuẩn dị dƣỡng

[37]. Ngoài ra, số chủng phân lập đƣợc trong các MFC của chúng tôi là khác nhau

giữa các nguồn quần xã ban đầu, thậm chí ngay cả trong MFC đƣợc làm giàu cùng

nguồn quần xã ban đầu cũng có số chủng phân lập đƣợc và tỷ lệ có mặt của các

chủng là hoàn toàn khác nhau (Hình 29). Theo Kim và cộng sự 2011 khi nghiên cứu

về biến đổi quần xã trong MFC đã nhận thấy rằng, quần xã vi khuẩn giữa các MFC

là khác nhau nhƣng thời gian hoạt động của MFC càng dài thì các quần xã trong các

MFC lại càng giống nhau hơn [28].

Hình 28: Ảnh phân lập mẫu điện cực anode từ MFC đã đƣợc làm giàu thành

công

(A) Phân lập mẫu điện cực MFC BTTXH4 trên môi trƣờng LB

(B) Phân lập mẫu điện cực MFC BTTXH4 trên môi trƣờng Hansen

(C) Phân lập mẫu điện cực MFC BTTXH4 trên môi trƣờng PDA

A C

58

64.5%

0.8%

4.8%

0.8%

0.8%

25.8%

0.8% 0.8% 0.8%

HHTXT 2.1

HHTXT 2.2

HHTXT 2.3

HHTXT 2.4

HHTXT 2.5

HHTXT 2.6

HHTXT 2.7

HHTXT 2.8`

HHTXT 2.9

81.8%

7.3%

0.2% 4.0% 0.7%

0.2%

0.2%

4.5% 0.2%

0.2% 0.2%

0.2%

HHBOT4.1

HHBOT 4.2

HHBOT4.3

HHBOT 4.4

HHBOT4.5

HHBOT 4.6

HHBOT4.7

HHBOT 4.8

HHBOT4.9

HHBOT 4.10

HHBOT4.11

HHBOT 4.12

1.3%

25.5%

73.2%

ĐTTXH 1.1

ĐTTXH 1.2

ĐTTXH 1.3

0.11%

99.76%

0.13%

ĐTBOE 2.1

ĐTBOE 2.2

ĐTBOE 2.3

80.94%

16.44%

0.32% 0.32%

0.32% 0.32% 0.32% 0.00% 0.70% 0.32%

BTTXH 4.1

BTTXH 4.2

BTTXH 4.3

BTTXH 4.4

BTTXH 4.5

BTTXH 4.6

BTTXH 4.7

BTTXH 4.8

BTTXH 4.9

95%

5%

BTBOE 4.1

BTBOE 4.2

59

Hình 29: Tỷ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ điện cực anode tại các

MFC

HH: nguồn hỗn hợp, ĐT: đất tự nhiên, BT: bùn tự nhiên, BH: bùn hoạt tính, NT: nƣớc thải,

BO: MFC có khoang anode 7,5 ml, TX: MFC khoang anode 5 ml

100%

0%

BHTXB 2.1

70.9%

9.9%

0.2%

0.2%

0.2%

0.2% 0.2%

17.1%

0.7% 0.2%

0.2% BHBOBL 1.1

BHBOBL 1.2

BHBOBL 1.3

BHBOBL 1.4

BHBOBL 1.5

BHBOBL 1.6

BHBOBL 1.7

BHBOBL 1.8

BHBOBL 1.9

BHBOBL 1.10

BHBOBL 1.11

1.2% 0.6% 0.6% 1.2%

96.4%

NTTXB3.1

NTTXB3.2

NTTXB3.3

NTTXB3.4

NTTXB3.5

2.9%

36.0%

17.6%

39.5%

0.3%

0.3%

0.3% 0.3% 0.3% 1.6%

0.3%

0.3% 0.3% NTBOBL 4.1

NTBOBL 4.2

NTBOBL 4.3

NTBOBL 4.4

NTBOBL 4.5

NTBOBL 4.6

NTBOBL 4.7

NTBOBL 4.8

NTBOBL 4.9

NTBOBL 4.10

NTBOBL 4.11

NTBOBL 4.12

60

3.2.4 Kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phƣơng pháp DGGE

Dựa trên kết quả nuôi cấy, và căn cứ vào các công bố trƣớc đây, có thể thấy

giả thuyết thuyết phục nhất là: Vi sinh vật trong anode của các MFC chỉ bao gồm vi

khuẩn. Để so sánh các quần xã vi khuẩn đƣợc làm giàu từ nguồn khác nhau trong

các MFC, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số của vi khuẩn từ mẫu nguồn quần

xã làm giàu ban đầu và mẫu điện cực anode và sau đó phân tích sự biến đổi quần xã

của sau khi đƣợc làm giàu trong MFC bằng phƣơng pháp DGGE.

Hình 30: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR vùng V3 thuộc gen 16s rRNA

NT-nguồn nƣớc thải; BH- nguồn bùn hoạt tính; TX-MFC khoang hình hộp chữ nhật

5 ml; BO-MFC khoang hình hộp chữ nhật 7,5 ml

Khi so sánh mẫu quần xã vi khuẩn trƣớc khi làm giàu và sau khi làm giàu

thành công trong MFC tại Hình 31; 32 ta có thể nhận thấy có sự biến đổi quần xã

đƣợc làm giàu tại MFC. Điển hình nhất là tại hai quần xã làm giàu từ nguồn nƣớc

thải và nguồn hỗn hợp, có độ tƣơng đồng với mẫu quần xã trong MFC sau khi làm

giàu thành công là 0,64. Thêm vào đó, ta có thể nhận thấy nguồn bùn tự nhiên và

đất tự nhiên ban đầu là khá tƣơng đồng nhau (hệ số tƣơng đồng là 0,93) tuy nhiên

sau khi làm giàu trong MFC quần xã của hai nguồn đất tự nhiên và bùn hoạt tính chỉ

có hệ số tƣơng đồng khoảng 0,68. Ngoài ra, trừ hai dạng thiết kế MFC đƣợc làm

giàu từ nguồn quần xã hỗn hợp ra, quần xã của hai MFC với thiết kế khác nhau

đƣợc làm giàu từ cùng một quần xã ban đầu đều có hệ số tƣơng đồng nhỏ hơn 0,83.

Mặt khác, khi nhìn vào Hình 31 ta có thể thấy, một số băng DNA tại nguồn quần xã

ban đầu sau quá trình làm giàu trong MFC có thể bị mờ đi hoặc không xuất hiện

61

(không chiếm ƣu thế) tại mẫu DNA đƣợc khuếch đại từ điện cực. Và ngƣợc lại một

số băng DNA xuất hiện tại quần xã trong điện cực anode sau giai đoạn làm giàu

trong MFC lại không xuất hiện trong nguồn quần xã ban đầu. Những kết quả này

cho thấy, mỗi quần xã vi khuẩn anode ở trong các MFC đều có sự biến đổi lớn so

với quần xã nguồn để thích nghi với điều kiện trong khoang anode. Đây là một

minh chứng cho thấy điều kiện trong mỗi MFC đã giúp làm giàu các vi sinh vật

điện hóa thích nghi cao từ quần xã nguồn.

Sự thay đổi quần xã trong MFC tại các thời gian khác nhau cũng đƣợc nhận

thấy trong nghiên cứu của Kim và cộng sự, tại đây tác giả nhận thấy quần xã ban

đầu sử dụng cho MFC (bùn kỵ khí) và quần xã đƣợc làm giàu sau 97 ngày có mức

độ tƣơng đồng rất thấp (khoảng 0,1). Ngoài ra các MFC có thời gian làm giàu càng

lâu thì độ tƣơng đông quần xã giữa các MFC càng cao, nhƣ: mẫu phân tích lẫy sau

21 ngày làm giàu chỉ có độ tƣơng đồng khoảng 0,38; còn mẫu lấy sau 97 ngày làm

giàu có hệ số tƣơng đồng lớn hơn là 0,7 [28].

62

Hình 31: Kết quả phân tích gen 16S rRNA bằng DGGE của các mẫu quần xã

vi khuẩn trong các nguồn khác nhau và các mẫu quần xã vi khuẩn từ điện cực

anode của các MFC làm giàu từ các nguồn

1-nguồn nước thải; 2, 3 -MFC khoang 5 ml và 7,5 ml làm giàu từ nguồn nước thải

4-nguồn bùn hoạt tính; 5, 6-MFC khoang 5 ml và 7,5 ml làm giàu từ nguồn bùn hoạt tính

7- nguồn hỗn hợp; 8, 9-MFC khoang 5 ml và 7,5 ml làm giàu từ nguồn hỗn hợp

10-nguồn đất tự nhiên; 11, 12-MFC khoang 5 ml và 7,5 ml làm giàu từ nguồn đất tự nhiên

13-nguồn bùn tự nhiên; 14, 15-MFC khoang 5 ml và 7,5 ml làm giàu từ nguồn bùn tự

nhiên

63

Hình 32: Kết quả phân tích tƣơng quan của các quần xã vi khuẩn đƣợc nghiên

cứu dựa trên kêt quả DGGE (bằng cách sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0)

3.2.5 Kết quả phân tích trình tự các băng DNA thu đƣợc từ các quần xã trên

DGGE

Nhằm hiểu rõ hơn về thành phần vi khuẩn có trong quần xã của các MFC

cũng nhƣ quần xã nguồn trƣớc làm giàu, chúng tôi tiến hành thôi gel các băng DNA

(phụ lục 4.3) thu đƣợc từ gel điện di DGGE (Hình 32). Sau đó chúng tôi tiến hành

giải trình tự mẫu DNA thu đƣợc và sử dụng công cụ BLAST của NCBI để phân tích

các trình tự thu đƣợc.

64

Bảng 22: Bảng so sánh trình tự các băng DNA đƣợc thôi gel từ gel DGGE với

dữ liệu trình tự DNA trên NCBI

Băng DNA trên DGGE Tên chủng vi khuẩn Hệ số tƣơng đồng

TD 1 Pauludibacter propionicigenes 93 %

Parabacteroides chinchillae 91%

TD 4 Tolumonas auensis DSM 9187 100%

Aeromonas tecta 96%

Shewanella amazonensis 94%

TD 5 Psychromonas aquimarina 99%

Tolumonas auensis DSM 9187 98%

Aeromonas hydrophila 96%

Shewanella algae 95%

TD 8 Pseudomonas fluorescens Pfo-1 100%

Pseudomonas punonensis 100%

TD 9 Flavobacterium xusehanense 98%

Flavobacterium myungsuense 98%

TD 11 Geothrix fermentans 99%

TD 12 Tolumonas auensis 99%

Shewanella amazonensis 96%

TD 16 Aeromonas media 99 %

Desulfomicrobium baculatum 96 %

Desulfomicrobium hypogeium 96 %

TD 17 Cellulophaga tyrosinoxydans 99%

TD 18 Pseudomonas punonensis 97%

65

TD 19 Geobacter propionicus 99%

Geobacter luticola 98%

TD 21 Geobacter uraniireducens 100%

Geobacter toluenoxydans 100%

TD 23 Geothrix fermentans 99%

TD 24 Aeromonas hydrophila 99%

Aeromonas tecta 99%

Các băng DNA xuất hiện trong bảng gel điện di biến tính (Phụ lục 4.4) đều

có trình tự (Bảng 22) đa phần giống với trình tự DNA của các loài vi khuẩn điện

hóa đã đƣợc phát hiện trong các hệ thống MFC nói chung nhƣ Geobacter sp.;

Aeromonas sp.; Shewanella amazonensis; Pseudomonas sp.: Geothrix fermentans;

Paludibacter sp; Parabacteroides sp.; Tolumonas sp.; Flavobacterium sp.;

Clostridium sp.; Desulfomicrobium sp [11, 22, 28, 39, 43, 68].

Theo kết quả thu đƣợc đƣợc ở mục 3.2.2 về độ ổn định của các quần xã,

quần xã đất tự nhiên sau một thời gian dài hoạt động vẫn giữ đƣợc dòng điện phát

sinh ổn định và có giá trị cao (0,4-0,45 mA). Phân tích DGGE cho thấy: có một

băng đậm duy nhất (TD8) tại MFC làm giầu từ nguồn đất tự nhiên – với trình tự

tƣơng ứng với đoạn trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas -

có mặt ở hầu hết các mô hình băng của các nguồn nhƣng băng này hầu nhƣ bị mờ đi

ở các mô hình băng của các quần xã đƣợc làm giàu, trừ quần xã làm giàu từ nguồn

đất tự nhiên (Hình 31). Quan sát này, kết hợp với các kết quả phân tích quần xã vi

khuẩn bằng phƣơng pháp phân lập truyền thống, dẫn đến một giả thuyết rằng: Sự

hoạt động ổn định của MFC đƣợc làm giàu từ nguồn đất tự nhiên có thể liên quan

đến sự chiếm ƣu thế của loài Pseudomonas sp. (tƣơng ứng với băng TD 8 ở Hình

31). Pseudomonas nói chung là các vi khuẩn biến dƣỡng, có khả năng sống linh

hoạt tại các môi trƣờng khác nhau. Nhờ đó, chúng sẽ dễ dàng thích nghi với điều

kiện sống trong khoang anode hơn so với các chủng vi khuẩn khác [44]. Ngoài ra,

66

từ kết quả phân lập vi khuẩn từ các MFC khoang hình hộp 5 ml và 7,5 ml) với hệ vi

sinh vật đƣợc làm giàu tự nguồn đất tự nhiên, trong số ba chủng vi khuẩn phân lập

đƣợc, chủng chiếm ƣu thế là Pantoea agglomerans là một vi khuẩn điện hóa mạnh.

Hơn nữa, so sánh trình tự DNA khác thu đƣợc từ các băng DGGE của MFC làm

giàu từ nguồn đất tự nhiên đều thấy có độ tƣơng đồng cao với các chủng vi khuẩn

điện hóa nhƣ Geobacter sp.; Shewanella amazonensis …Vì vậy, giả thuyết mà chúng

tôi đƣa ra là: Các vi khuẩn điện hóa trong khoang anode của các MFC làm giàu từ

nguồn đất tự nhiên có tƣơng tác tốt với Pseudomonas sp. và vẫn cho phép loài này

chiếm ƣu thế, trong khi loài này có khả năng sử dụng cơ chất và thích nghi linh

hoạt; qua đó quần xã vi khuẩn sẽ ít bị biến động hơn, dẫn đến sự phát sinh dòng

điện ổn định hơn của các MFC này so với của các MFC làm giàu từ các nguồn khác

[58, 59]. Trong trƣờng hợp các quần xã làm giàu từ các nguồn khác, sự mất ƣu thế

của Pseudomonas sp. có lẽ liên quan đến tính bất ổn định của dòng điện sinh ra.

Tổng hợp các kết quả nghiên cứu nói trên, chúng tôi quyết định lựa chọn

nguồn đất tự nhiên là nguồn tối ƣu cho việc làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong

các MFC để sử dụng thử nghiệm đánh giá chất lƣợng nƣớc thải

3.3 BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM HỆ THỐNG MFC VỚI DUNG DỊCH MÔ

PHỎNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Sau khi nghiên cứu sự ảnh hƣởng của các thiết kế và nguồn làm giàu khác

nhau, chúng tôi bƣớc đầu tiến hành thử nghiệm MFC dạng thiết kế khoang hình hộp

chữ nhật thể tích 7,5 ml đƣợc làm giàu từ nguồn quần xã đất tự nhiên với dung dịch

mô phỏng nƣớc thải sau xử lý có các nồng độ BOD 0, 5, 15, 30, 50 ppm và thu

đƣợc kết quả tại Hình 33.

67

Hình 33: Biểu đồ dòng điện trung bình của MFC thử nghiệm với các nồng độ

BOD khác nhau trong dung dịch nƣớc thải mô phỏng ở anode

Từ kết quả ở Hình 33, có thể thấy hệ thống MFC của chúng tôi có phản ứng

tốt với các nồng độ BOD khác nhau. Dòng điện có quan hệ tuyến tính với nồng độ

BOD trong khoảng nồng độ BOD từ 0 ppm đến 30 ppm. Đối với nồng độ BOD từ

30 ppm trở lên (30 và 50 ppm), dòng điện đạt mức độ ổn định (“bão hòa”).

Khi so sánh với các hệ thống MFC biosensor khác (Bảng 21) có thể thấy

khoảng giá trị nồng độ BOD mà MFC của chúng tôi có thể phân biệt đƣợc (0 - 30

ppm) cao hơn so với dạng thiết kế MFC biosensor của Kim và cộng sự (2,6 - 25

ppm). Tuy nhiên, khoảng này thấp hơn so với một số hệ thống biosensor khác:

MFC của Peixoto đo đƣợc nồng BOD từ 17 - 78 ppm; MFC của Chang là 20 - 100

ppm và MFC của Kim có thể đo đƣợc nồng độ BOD từ 20 - 200 ppm [13, 17, 25,

26, 55]. Mặc dù vậy, khoảng đánh giá BOD của chúng tôi hoàn toàn phù hợp để sử

dụng đánh giá nhanh BOD của mẫu nƣớc thải bất kỳ: Với các mẫu nƣớc thải xử lý

kém có BOD vƣợt quá 30 ppm (ngƣỡng cho phép theo tiêu chuẩn A của QCVN40

BTNMT-2011) thì thiết bị sẽ cho tín hiệu đạt tới hoặc trên mức dòng điện “bão

hòa” (khoảng 0.4-0.5 mA tùy từng thiết bị [13, 17, 25, 26, 55].

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

BOD 0 BOD 5 BOD 15 BOD 30 BOD 50

mA

Giá trị BOD (ppm)

68

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã đạt đƣợc một số kết quả chính sau:

- Đã thiết kế và chế tạo thành công thiết bị MFC có khả năng vận hành với

nƣớc thải mô phỏng.

- Đã chọn ra đƣợc loại thiết kế là MFC khoang hình hộp chữ nhật 7,5 ml có

khả năng sinh ra dòng điện cảm ứng tốt với nồng độ BOD.

- Đã lựa chọn đƣợc đất tự nhiên là nguồn phù hợp nhất phục vụ cho việc làm

giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC để sử dụng làm cảm biến đánh giá chất

lƣợng nƣớc thải.

- Đã làm giàu thành công hệ vi sinh vật điện hóa, bao gồm những vi sinh vật

có khả năng sản sinh dòng điện mà không cần bổ sung chất nhận điện tử trung gian.

- Đã xác định đƣợc vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas chiếm ƣu thế trong quần

xã của các MFC sinh dòng điện ổn định nhất (làm giàu từ đất tự nhiên).

- Các MFC đƣợc phát triển có dòng điện phát sinh tƣơng quan tuyến tính với

nồng độ BOD của dung dịch nƣớc thải mô phỏng (ở anode) trong khoảng giá trị

BOD từ 0 – 30 ppm, trong điều kiện phòng thí nghiệm.

69

KIẾN NGHỊ

- Tối ƣu quy trình thử nghiệm và hệ thống MFC nhằm nâng cao đƣợc khả

năng đánh giá BOD của thiết bị.

- Tiến hành thử nghiệm hệ thống MFC với các yếu tố ảnh hƣởng tới dòng

điện phát sinh trong MFC, qua đó đƣa ra các khuyến cáo, thông số hiệu chỉnh nhằm

phản ánh đúng chất lƣợng nƣớc thải.

- Thử nghiệm thêm các giá trị cơ bản khác (pH, kim loại nặng, thuốc trừ

sâu…) của nƣớc thải xử lý kém với hệ thống MFC

- Nghiên cứu sâu hơn về tƣơng tác giữa các vi sinh vật trong khoang anode

thiết bị đƣợc làm giàu, tìm hiểu về hoạt tính điện hóa của quần xã vi sinh vật đó để

làm rõ vai trò của chúng trong quá trình truyền điện tử đến điện cực.

- Thử nghiệm thiết bị trong điều kiện thực tế.

70

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Tổng Cục Đo Lƣờng Chất Lƣợng Việt Nam. Bộ khoa học và công nghệ (1988).

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4566:1988 Về nước thải.

2. Trung tâm quan trắc môi trƣờng. Tổng cục môi trƣờng Việt Nam (2009). Báo

cáo môi trường quốc gia-Báo cáo môi trường khu công nghiệp Việt Nam.

3. Tổng Cục Đo Lƣờng Chất Lƣợng Việt Nam. Bộ khoa học và công nghệ (2011).

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP

QCVN 40:2011/BTNMT.

4. Trung tâm quan trắc môi trƣờng. Tổng cục môi trƣờng Việt Nam (2012). Báo

cáo môi trường nước mặt Việt Nam.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

5. Aelterman, P., và cộng sự (2008), “The anode potential regulates bacterial

activity in microbial fuel cells”. Applied Microbiology and Biotechnology.

78(3): pp. 409-418.

6. Afkar, E., và cộng sự (2005), “A novel Geobacteraceae-specific outer

membrane protein J (OmpJ) is essential for electron transport to Fe (III)

and Mn (IV) oxides in Geobacter sulfurreducens”. Bmc Microbiology. 5.

7. Amann, R.I., W. Ludwig, và K.H. Schleifer (1995), “Phylogenetic identification

and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”.

Microbiol Reviews. 59(1): pp. 143-69.

8. Andrew, S.K., D.S. James, và K.B. Sandra (2005), “Fish models in behavioral

toxicology”. Techniques in Aquatic Toxicology, Volume 2, CRC Press.

9. Bae, M.-J. và Y.-S. Park (2014), “Biological early warning system based on the

responses of aquatic organisms to disturbances: A review”. Science of The

Total Environment. 466–467(0):p p. 635-649.

10. Beveridge, T.J. (2004), “Composition, Reactivity and Regulation of

Extracellular Metal-Reducing Structures (Bacterial Nanowires) Produced

by Dissimilatory Metal - Reducing Bacteria”. pp. Medium: ED.

11. Bond, D.R. và D.R. Lovley (2005), “Evidence for involvement of an electron

shuttle in electricity generation by Geothrix fermentans”. Applied and

Environmental Microbiology. 71(4): p. 2186-2189.

12. Chakravorty, S., và cộng sự (2007), “A detailed analysis of 16S ribosomal RNA

gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria”. Journal

Microbiol Methods. 69(2): pp. 330-9.

71

13. Chang, I.S., và cộng sự (2004), “Continuous determination of biochemical

oxygen demand using microbial fuel cell type biosensor”. Biosensors &

Bioelectronics. 19(6): pp. 607-613.

14. Chang, I.S., và cộng sự (2006), “Electrochemically active bacteria (EAB) and

mediator-less microbial fuel cells”. Journal of Microbiology and

Biotechnology. 16(2): pp. 163-177.

15. Cheng, S., B.A. Dempsey, và B.E. Logan (2007), “Electricity generation from

synthetic acid-mine drainage (AMD) water using fuel cell technologies”.

Environmental Science & Technology. 41(23): pp. 8149-8153.

16. Choo, Y.F., Lee, J., Chang, I. S. và Kim, B. H., (2006), “Bacteria Communities

in microbial fuel cells enriched with high concentrations of glucose and

glutamate”. Journal of Microbiology and Biotechnology. 16(9): pp. 1481-

1484.

17. Di Lorenzo, M., và cộng sự (2009), “A single-chamber microbial fuel cell as a

biosensor for wastewaters”. Water Research. 43(13): pp. 3145-3154.

18. Du, Z., H. Li, và T. Gu (2007), “A state of the art review on microbial fuel

cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy”.

Biotechnology Advances. 25(5): pp. 464-482.

19. Fantroussi, E.S., và cộng sự (1999), “Effect of phenylurea herbicides on soil

microbial communities estimated by analysis of 16S rRNA gene

fingerprints and community-level physiological profiles”. Applied and

Environmental Microbiology. 65(3): pp. 982-8.

20. Gorby, Y.A., và cộng sự (2006), “Electrically conductive bacterial nanowires

produced by Shewanella oneidensis strain MR-1 and other

microorganisms”. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America. 103(30): pp. 11358-63.

21. Heijne ter, A., và cộng sự (2006), “A Bipolar Membrane Combined with Ferric

Iron Reduction as an Efficient Cathode System in Microbial Fuel Cells”.


22. Huang, J.S., và cộng sự (2014), “Performance evaluation and bacteria analysis

of AFB-MFC enriched with high-strength synthetic wastewater”. Water

Science Technol. 69(1): pp. 9-14.

23. Kang, K.H., và cộng sự (2003), “A microbial fuel cell with improved cathode

reaction as a low biochemical oxygen demand sensor”. Biotechnology

Letters. 25(16): pp. 1357-1361.

72

24. Kim, B.H., I.S. Chang, và G.M. Gadd (2007), “Challenges in microbial fuel cell

development and operation”. Applied Microbiology and Biotechnology.

76(3): pp. 485-494.

25. Kim, B.H., và cộng sự (2003), “Novel BOD (biological oxygen demand) sensor

using mediator-less microbial fuel cell”. Biotechnology Letters. 25(7): pp.

541-545.

26. Kim, B.H.C. và H. I. S. Moon (2006), “Microbial fuel cell-type biochemical

oxygen demand sensor”. Encylopedia of Sensors. X: pp. 1-12.

27. Kim, G.T., và cộng sự (2006), “Bacterial community structure,

compartmentalization and activity in a microbial fuel cell”. Applied and

Environmental Microbiology. 101(3): pp. 698-710.

28. Kim, J.R., và cộng sự (2011), “Spatiotemporal development of the bacterial

community in a tubular longitudinal microbial fuel cell”. Applied

Microbiology and Biotechnology. 90(3): pp. 1179-91.

29. Kim, M., và cộng sự (2007), “A novel biomonitoring system using microbial

fuel cells”. Journal of Environmental Monitoring. 9(12): pp. 1323-1328.

30. Kozdrój, J. và J.D. van Elsas (2000), “Application of polymerase chain

reaction-denaturing gradient gel electrophoresis for comparison of direct

and indirect extraction methods of soil DNA used for microbial

community fingerprinting”. Biology and Fertility of Soils. 31(5): pp. 372-

378.

31. Lee, S.W., B.Y. Jeon, và D.H. Park (2010), “Effect of bacterial cell size on

electricity generation in a single-compartmented microbial fuel cell”.

Biotechnol Letter. 32(4): pp. 483-7.

32. Lei, Y., W. Chen, và A. Mulchandani (2006), “Microbial biosensors”. Analytica

Chimica Acta. 568(1–2): pp. 200-210.

33. Liu, H., S.A. Cheng, và B.E. Logan (2005), “Power generation in fed-batch

microbial fuel cells as a function of ionic strength, temperature, and

reactor configuration”. Environmental Science & Technology. 39(14): pp.

5488-5493.

34. Liu, H., R. Ramnarayanan, và B.E. Logan (2004), “Production of electricity

during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell”.


35. Liu, J., G. Olsson, và B. Mattiasson (2004), “Short-term BOD (BODst) as a

parameter for on-line monitoring of biological treatment process: Part I. A

novel design of BOD biosensor for easy renewal of bio-receptor”.

Biosensors and Bioelectronics. 20(3): pp. 562-570.

36. Liu, J., G. Olsson, và B. Mattiasson (2004), “Short-term BOD (BODst) as a

parameter for on-line monitoring of biological treatment process: Part II:

73

Instrumentation of integrated flow injection analysis (FIA) system for

BODst estimation”. Biosensors and Bioelectronics. 20(3): pp. 571-578.

37. Logan, B.E. (2006), “Microbial fuel cells: methodology and technology”.

Environmental Science & Technology. 40: pp. 5181-5192.

38. Logan, B.E. (2008), Microbial Fuel Cells. Nature Publishing Group.

39. Logan, B.E. (2009), “Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells”.

Nature Reviews Microbiology. 7(5): pp. 375-381.

40. Logan, B.E., và cộng sự (2004), “ A state of the art review on microbial fuel

cells: Methodology and technology”. Environmental Science & Technology.

27(28): pp. 1456-1462.

41. Logan, B.E. và J.M. Regan (2006), “Electricity-producing bacterial

communities in microbial fuel cells”. Trends in Microbiology. 14(12): pp.

512-518.

42. Lower, S.K., M.F. Hochella, Jr., và T.J. Beveridge (2001), “Bacterial

recognition of mineral surfaces: nanoscale interactions between

Shewanella and alpha-FeOOH”. Science. 292(5520): pp. 1360-3.

43. Luo, J., và cộng sự (2013), “A new electrochemically active bacterium

phylogenetically related to Tolumonas osonensis and power performance

in MFCs”. Bioresource Technology. 139: pp. 141-8.

44. Madigan, M.T. (2012), Brock biology of microorganisms. San Francisco:

Benjamin Cummings.

45. Moon, H., và cộng sự (2004), “Improving the dynamic response of a mediator-

less microbial fuel cell as a biochemical oxygen demand (BOD) sensor”.

Biotechnology Letters. 26(22): pp. 1717-1721.

46. Muyzer, G. (1999), “DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural

ecosystems”. Current Opinion in Microbiology. 2(3): pp. 317-322.

47. Muyzer, G., E.C. de Waal, và A.G. Uitterlinden (1993), “Profiling of complex

microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis

of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA”.

Apply Environment Microbiology. 59(3): pp. 695-700.

48. Muyzer, G. và K. Smalla (1998), “Application of denaturing gradient gel

electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis

(TGGE) in microbial ecology”. Antonie Van Leeuwenhoek. 73(1): pp.

127-41.

49. Nimje, V.R., và cộng sự (2012), “A Single-Chamber Microbial Fuel Cell

without an Air Cathode”. International Journal Molecular Sciences.

13(3): pp. 3933-48.

74

50. Nimje, V.R., và cộng sự (2009), “Stable and high energy generation by a strain

of Bacillus subtilis in a microbial fuel cell”. Journal of Power Sources.

190(2): pp. 258-263.

51. Oh, S.E. và B.E. Logan (2006), “Proton exchange membrane and electrode

surface areas as factors that affect power generation in microbial fuel

cells”. Applied Microbiology and Biotechnology. 70(2): pp. 162-169.

52. Pant, D., và cộng sự (2010), “A review of the substrates used in microbial fuel

cells (MFCs) for sustainable energy production”. Bioresource Technology.

101(6): pp. 1533-1543.

53. Park, H.I., và cộng sự (2008), “Bacterial communities on electron-beam Pt-

deposited electrodes in a mediator-less microbial fuel cell”. Environmental

Science & Technology. 42(16): p. 6243-9.

54. Pawlowski, L. (1994), Standard methods for the examination of water and

wastewater, 18th edition. Science of The Total Environment, 1994.

55. Peixoto, L., và cộng sự (2011), “In situ microbial fuel cell-based biosensor for

organic carbon”. Bioelectrochemistry. 81(2): pp. 99-103.

56. Pham, C.A., và cộng sự (2003), “A novel electrochemically active and Fe(III)-

reducing bacterium phylogenetically related to Aeromonas hydrophila,

isolated from a microbial fuel cell”. FEMS Microbiol Lett. 223(1): pp.

129-34.

57. Pham, T.H., và cộng sự (2008), “Metabolites produced by Pseudomonas sp.

enable a Gram-positive bacterium to achieve extracellular electron

transfer”. Applied Microbiology and Biotechnology. 77(5): pp. 1119-1129.

58. Pham, T.H., và cộng sự (2008), “Use of Pseudomonas species producing

phenazine-based metabolites in the anodes of microbial fuel cells to

improve electricity generation”. Applied Microbiology and Biotechnology.

80(6): pp. 985-93.

59. Rabaey, K., và cộng sự (2005), “Microbial phenazine production enhances

electron transfer in biofuel cells”. Environmental Science & Technology.

39: pp. 3401-3408.

60. Rabaey, K., và cộng sự (2005), “Tubular microbial fuel cells for efficient

electricity generation”. Environmental Science & Technology, 2005.

39(20): pp. 8077-8082.

61. Reguera, G., và cộng sự (2005), “Extracellular electron transfer via microbial

nanowires”. Nature. 435(7045): pp. 1098-1101.

62. Ronald, M.A (2005), Contents, in Handbook of Media for Environmental

Microbiology, Second Edition. CRC Press.

75

63. Rozendal, R.A., và cộng sự (2008), “Effect of the type of ion exchange

membarane on performance, ion transport, and pH in biocatalyzed

electrolysis of wastewater”. Water Science & Technology. 57. 11: pp.

1757-1762.

64. Sofia Duarte, F.C.a.C.P., Gel Electrophoresis - Principles and Basics. ISBN:

978-953-51-0458-2, ed. S. Magdeldin. 2012, InTech.

65. Stein, N.E., H.V.M. Hamelers, và C.N.J. Buisman (2012), “The effect of

different control mechanisms on the sensitivity and recovery time of a

microbial fuel cell based biosensor”. Sensors and Actuators B: Chemical.

171–172(0): pp. 816-821.

66. Van der Schalie, W.H., và cộng sự (2001), “Using higher organisms in

biological early warning systems for real-time toxicity detection”.

Biosensors and Bioelectronics. 16(7–8): pp. 457-465.

67. Vázquez-Larios, A.L., và cộng sự (2011), “Effects of architectural changes and

inoculum type on internal resistance of a microbial fuel cell designed for

the treatment of leachates from the dark hydrogenogenic fermentation of

organic solid wastes”. International Journal of Hydrogen Energy. 36(10):

pp. 6199-6209.

68. White, H.K., và cộng sự (2009), “Quantitative population dynamics of

microbial communities in plankton-fed microbial fuel cells”. International

Journal of Hydrogen Energy. 3(6): pp. 635-46.

69. Xu, S. và H. Liu (2011), “New exoelectrogen Citrobacter sp. SX-1 isolated

from a microbial fuel cell”. Journal Apply Microbiology. 111(5): pp.

1108-15.

70. Yang, H. (2011), “Biological Early Warning System for Prawn Aquiculture”.

Procedia Environmental Sciences. 10, Part A(0): pp. 660-665.

71. Yi Zuo, S.C., và Bruce E. Logan (2008), “Ion exchange membrane cathodes for

scalable microbial fuel cells”. Environmental Science & Technology. 42:

pp. 6967-6972.

72. You, S.J., và cộng sự (2006), “Sustainable approach for leachate treatment:

Electricity generation in microbial fuel cell”. Journal of Environmental

Science and Health Part a-Toxic/Hazardous Substances & Environmental

Engineering. 41(12): pp. 2721-2734.

73. Zeng, Y., X.e. Fu, và Z. Ren (2012), “The Effects of Residual Chlorine on the

Behavioural Responses of Daphnia magna in the Early Warning of

Drinking Water Accidental Events”. Procedia Environmental Sciences.

13(0): p. 71-79.

76

74. Zhang, X., và cộng sự (2010), “Improved performance of single-chamber

microbial fuel cells through control of membrane deformation”.

Biosensors and Bioelectronics. 25(7): p. 1825-1828.

PHỤ LỤC

4.1 HÌNH ẢNH KHUẨN LẠC VÀ TẾ BÀO CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN

LẬP ĐƢỢC TỪ ĐIỆN CỰC ANODE CỦA CÁC MFC

Chủng vi khuẩn phân lập từ MFC hình hộp chữ nhật khoang 5 ml làm giàu từ

nguồn hỗn hợp trên môi trƣờng LB

Tên

chủng/

CFU

Ảnh khuẩn lạc Nhuộm với E.coli Nhuộm với Bacillus

subtilis

HHTX

T2.1/

80 x 104

HHTX

T2.2/

1 x 104

HHTX

T2.3/

6 x 104

HHTX

T2.4/

1 x 104

HHTX

T2.5.1*

(T2.5/

104)

HHTX

T2.5.2*

(T2.5/

104)

HHTX

T2.6.1*

(T2.6/

32 x 104)

HHTX

T2.6.2*

(T2.6/

32 x 104)

HHTX

T2.7/

1 x 104

HHTX

T2.8/

1 x 104

HHTX

T2.9/

1 x 104

Chủng vi khuẩn phân lập từ MFC khoang chữ nhật 7,5 ml làm giàu từ nguồn

hỗn hợp trên môi trƣờng LB

Tên chủng Ảnh khuẩn lạc Nhuộm với E.coli Nhuộm với Bacillus

subtilis

HHBO

T4.1/

346 x 104

HHBO

T4.2/

31 x 104

HHBO

T4.3/

1 x 104

HHBO

T4.4/

17 x 104

HHBO

T4.5/

3 x 104

HHBO

T4.6/

1 x 104

HHBO

T4.7/

1 x 104

HHBO

T4.8/

19 x 104

HHBO

T4.9/

1 x 104

HHBO

T4.10/

1 x 104

HHBO

T4.11/

1 x 104

HHBO

T4.12/

1 x 104

Chủng vi khuẩn phân lập từ MFC khoang hình hộp chữ nhật 5 ml làm giàu từ

nguồn đất tự nhiên trên môi trƣờng LB


subtilis

ĐTTX

H1.1.1*

(H1.1/

4 x 104)

ĐTTX

H1.1.2*

(H1.1/

4 x 104)

ĐTTX

H1.2/

80 x 104

ĐTTX

H1.3

230 x 104

Chủng vi khuẩn phân lập từ MFC khoang hình hộp chữ nhật 7,5 ml làm giàu

từ nguồn đất tự nhiên trên môi trƣờng LB


subtilis

ĐTBO

E2.1/

6 x 103

ĐTBO

E2.2/

52 x 104

ĐTBO

E2.3/

7 x 103

Chủng vi khuẩn phân lập từ MFC khoang chữ nhật 5 ml làm giàu từ nguồn

bùn tự nhiên trên môi trƣờng LB

Tên

chủng


subtilis

BTTX

H4.1/

256 x 104

BTTX

H4.2/

54 x 104

BTTX

H4.3/

1 x 104

BTTX

H4.4/

1 x 104

BTTX

H4.5/

1 x 104

BTTX

H4.6/

1 x 104

BTTX

H4.7/

1 x 104

BTTX

H4.8/

BTTX

H4.9/

2 x 103

BTTX

H4.10/

1 x 104


bùn tự nhiên trên môi trƣờng LB


subtilis

BTBO

E4.1/

273 x 104

BTBO

E4.2/

13 x 104


nƣớc thải trên môi trƣờng LB

Tên

chủng


subtilis

NTBO

BL4.1/

11 x 104

NTBO

BL 4.2/

137 x 104

NTBO

BL 4.3/

67 x 104

NTBO

BL 4.4/

150 x 104

NTBO

BL 4.5/

1 x 104

NTBO

BL 4.6/

1 x 104

NTBO

BL 4.7/

1 x 104

NTBO

BL 4.8/

1 x 104

NTBO

BL 4.9/

1 x 104

NTBO

BL 4.10/

6 x 104

NTBO

BL 4.11/

1 x 104

NTBO

BL 4.12/

1 x 104

NTBO

BL 4.13/

1 x 104


nƣớc thải trên môi trƣờng LB

Tên Ảnh khuẩn lạc Nhuộm với E.coli Nhuộm với Bacillus

chủng subtilis

NTTX

B3.1/

2 x 104

NTTX

B3.2.1*

(B3.2/

1 x 104)

NTTX

B3.2.2*

(B3.2/

1 x 104)

NTTX

B3.3/

1 x 104

NTTX

B3.4/

2 x 104

NTTX

B3.5/

156 x 104


bùn hoạt tính trên môi trƣờng LB


subtilis

BHBO

BL1.1/

286 x 104

BHBO

BL1.2/

40 x 104

BHBO

BL1.3/

1 x 104

BHBO

BL1.4/

1 x 104

BHBO

BL1.5/

1 x 104

BHBO

BL1.6/

1 x 104

BHBO

BL1.7/

1 x 104

BHBO

BL1.8/

69 x 104

BHBO

BL1.9/

1 x 104

BHBO

BL1.10/

1 x 104

BHBO

BL1.11/

1 x 104


bùn hoạt tính trên môi trƣờng LB

Tên

chủng


subtilis

BHTX

B2.1/

128 x 104

4.2 TRÌNH TỰ DNA CỦA CÁC ĐƠN CHỦNG

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng BHTX 2.1

GCTGAGAGCCGTACTACTTTTGCTGACGAGCGTCGGACGAGTGAGTAATGCCTGGTAGATTGCC

CAGACGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGC

AGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA

TGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAG

ACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGA

TGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAA

AGGTTGATGCCTAATACGTATCAACTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT

GCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCA

CGCAGGCGGTTGGATAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTAAAA

CTGTCCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG

ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA

GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGA

GGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGG

CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGTGGTTTA

ATTCGATGCAACGCGAAGAACC

GGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGGGAGAT

GTTGGGTTAAGTCCCGCACCGAGCGCACCCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAA

CTCAAGGGAGATTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCC

TTTACGGTCAGGGCTACCCATTTGCTACAATGGCCGGGACAAGAGGGCTCGGAGCTTCGCGATT

TGGAGCGAATCCCAAAAAAGCCCGCTTTATTCCGGGATTGGAATCTCGCAACTCGACTCCTTGG

AAGCGGGAATCCCTNGTTTACCGAAATCCAAAGTTGNGGGGAAACATCCCGGCCTTGGCNACC

ACGACAAAA

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng NTTX 3.4.1

TGGCTGACCTCTCTCGCGTGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCT

GATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAG

GGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAAC

GGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGA

CACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGAT

GCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAG

GTGCTGAGGTTAATAACCTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCAC

GCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACT

GGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT

CTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGC

GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGG

TTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTAC

GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT

TAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGA

TTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG

TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACT

CAAAGGAAACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT

TACGAGTAGGGTTCACACGTGCTACAATGGGCCAAACAAAGAAAAGCAACCTCCCGAAGGCAA

GCGGACCTCTAAAAGTGTTCGGATCCCGGATGGGAGTTCGCACTCCCCCCCCTGAATTCCGAAC

CCTTTAATCT

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng BHBO 1.1

GCGGGTACGTCGTACCAACGATAGCCAGCGATACGGGTGAGTAACACGTGGGCGACCTGCCTG

TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATCTATTTATACATATAAT

TAGATTGAAAGATGGTTCTGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGA

GGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA

CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG

TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGA

AGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC

CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCG

TAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTC

ATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAAT

GCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAG

GCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG

TGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG

GGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG

CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCTCTGACAATCCT

AGAGATAGGACTTTCCCCTTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCCAGCTC

GAGTCGTGGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCCGAAACGAGGGGCAACCCTTTGATCTTAGTTTGCG

AGCATTTAAGTTGGGGCACTCTAAGGGTGACTGCCCGGTGACAAAACCGGAAGGAAGGGTGGG

ATGGACGTCAAATCNACCTTGCCCCTTATTGACTTGGGGTTAACACCGTGCCTACAATGGGAGG

GTACAAAGGGGTTGCAAGACACCGCGGGGTTTGACCAAACCCCCTAAAAACCATTCTCCAATTC

CGGATTTTTAAGGGCGGGACTCCGCCCCACTAGAAAGCCGGAGATCCCTTTGATATCCCGGATA

AAGATGCGCGCCGGTAAAAATCC

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng NTBO 4.4

GACCTGGACGGCGTCTGCTGTATCAGTGGCGACGGGTGAGTAACACGTGAGCAATCTG

CCCTTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACCGGATACGAGCTGCGAAGGCAT

CTTCAGCAGCTGGAAAGAACTTCGGTCAAGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGG

TAACGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACT

GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC

TGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGACGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAA

GAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA

ATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGC

GTCTGCTGTGAAAACTGGAGGCTCAACCTCCAGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGC

GGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGA

TGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACA

GGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGGGGGTCCATTCCACGG

ATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACT

CAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGA

AGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTC

GTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

GAGCGCAACCTTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGGTGGGAACTCATTGGGATACTGGCCG

GGGTCAACTCGGAAGGAAGGGGGGGGATGACGTCCAAATCATCATTGCCCCTTAATGCCTTGG

GCTTTCAGCCATGGCTACAATTGGCCGGGTACAAAAGGGTTGCAAATCCCGTAAAGGTGGGAG

CGAAACCCCAAAAAAAGCCGGTCCCANGTTCCGGATTTGGAGGCTGAAACTCCGCCCTCTTGAA

AATCGGGAATCCCCTGGATATCCGAAATTACANAACCGTTCCGGNGAACATTCCCG

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng BTBO 4.1

GAGCNTGGACGTGTCTCGGTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGC

CTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG

AGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTA

ACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGA

GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG

ATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGA

AGGTGCTGAGGTTAATAACCTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG

CACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAA

ACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA

GATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAA

AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGG

AGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACG

GCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT

AATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGAT

TGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGT

TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTACCTTTTGTTGCCAGCGGGCCGGCCCGGGAAC

TCCAAAGAGAATTGCCAGTGTATAAACTGGAAGGAAGGGGGGGATGAAGGTCAAGTCATCATC

GCCCCTTACGAAGAAGGCTTACACAGGTGCTACAATGGGCGCATCAAAAGAGAAGCGACCTCC

CCGAAGACAAACGGGACCTTCAAAAAGGGGTTCGTAATCCCCGATGTGGAAGTTCGCAACTCC

CATTCCTTGAGA

Trình tự DNA gen 16s rRNA của chủng HHTX 4.1

CTGTACGTGACCATGTGCTCAGCGGCGGCGGGTGAGTCTACGTGCGCTGACTGCCTGTAAGAGT

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACACCTACCCCCGCATGGGGGAAGGTT

GAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA

TGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG

ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGA

CGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA

CAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG

CGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAA

ACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT

ATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAA

GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGT

GTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG

GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCCGTTGGAGCATGT

GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCAAAAAA

TAGGGTTTTCCCCTTCGGGGGGACAAAGTGACCAGTGGGTGAAGGTTGTCCTCCAGTCCGTGTC

CTTGAGATGTTTGGGTTTAAGTCCCCGCAACCAGGCGCAACCCTTTGATCTTAAGTTGGCCAGC

AATTCAATTTGGGCCACTCTAAAAATAACTTGCCCGGTGACAAAACCCGGAAGGAAAGGTGGG

GGATGAACGTCCAATCCATCCATGGCCCCTTTATGACCTTGGNGCTAACCACCGTGCCTACAAT

TGGAACGGGTCACAAAGGGCTTGCNAAGAACCCCGGNAGGTTTTAGCNCAATCCCNCTANAAN

ACCCGTTCCNCA

4.3 Vị trí các băng DNA và trình tự của chúng đƣợc thôi gel từ DGGE

Hình 34: Vị trí các băng DNA trên DGGE đƣợc thôi gel và đem giải trình tự

Trình tự băng DNA TD 1

GTGGGATGATCTCTCTTCGTTATGTCAATTTTACACGTATCGCACTTTATTCCCTT

ACCAAGAAGTTTACAATCCATAGAACCTTCTTCCTTCACGCGACTTGGCTGGTTCAGGC

TCTCGCCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCGTCCCGTAGGAGTCCCCCCGTGCCGC

CGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGCGGCG


GGCAACGATCTCTCGGAGTTATGTCAATTTTCACGTATGGCACTTTATTCCCTA

CCAAGAAGTTTTGATTTATAGAACCTTCTTCCTTTCGCGACTTGGCTGGTTCAGGCTCT

CGCCCATTGGCCAATATTCCTCACTGCTGCGTCCCGTAGGAGTCCCCCCGTGCCGCCGC

CCCGCCCGGGGCGGGCCCCCGGCGCGGCG


GTGGAACGATCTGTCGGACGTTATGTCAATTTGACAAGTATGACACATTATTCC

CATACCAAAAAGTTTTGATTTATAGAACCTTCTTCCTTTCGCGACTTGGCTGGTCAGGC

TCTCGTCCATTGACCAATATTCCACACTGCTGCGTCCCGTAGGAGTCCCCCCGTGCCGC

GGCCCCGCCCGGGGCGGGCCCCCGGCGCGGCG


TGGGATGGGTCTCTCTGTGGTACGTCAATGCTGATGAATATTAGTCATCAGCCC

TTCCTCCCCACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGG

CTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCC

CCCCGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


GGATGGAGTCTCTCTGCGGTACGTCAAGGATGATGGTATTAGCATCACCCCTTT

CCTCCTCACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCT

GCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCC

CCGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


TGGGATGGGGGCTATCTGTCGGTACGTCAAATTGCAGAGTATTAATCTACAAC

CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATG

GCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTC

CCCCCGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCG


GGCATGGAGCTTTCTAAGTACCCGCAACCCCGATTCACGATCGGGGGTTTTGTC

CCGTATAAAAGCAGTTTACGAACCATAGGTCCTTCATCCTGCACGCGGCATGGCTGGA

TCAAGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCTTACTGCTGCCTCCCGTACGAGTCCCCCCG

TGCCCCCCCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


TTGGATGAGCTCTCTAGTGATACCTACACTGAGTACGCGTACTCATCTTTATTC

CCCTGTAAAAGAAGTTTACAATCTATAAGACCTTCTTCCTTCACGCCACTTGGCTGGTT

CGCGCTCTCGCCCATTGCCCTGTATTCCTCTCTGCTGCCTCGCGTACGAGTCCA

CTCCCGCCCTGCCCCCGCCCGGGGCGGGCCCCCCCCGCGGCGAGGAGGCAGGACTCTA

TGGAGGCACGTGCGGAATATTGTTTGTGGGGAGAGCTACCAACAATCGGGGGGGAAA

AAGTCTTACGGATGGTAAAAACTTTTCCGGGGAATAAAAAGAGTAGCTATACTTCTGG

TCCGAAACAAGGATCGCTACTTCTCCGGGCCCAAAAAAAAAA


TGTGGACGGT CTCTCTGGGT TCCGTCAGTA ACAGGATTAT TTATCCTGCC

CCTTCGTCCT GATGAAGGGT TTTACAGCCC GAAGACCTTC ATCACCCACG

CGGCGTGGCT GCATCAGACT CTCCCCCATT GCGCAAAATT CCCCACTGCT

GCCTCCCGTA GGAGTCCCCC CGTGCCCCCG CCCCGCCCGG GGCGCGCCCC CGGCGA


CGATGGTCTCTCTGTGGGTACGTCATGCTGATGAATATTAGTCATCAGCCCTTC

CTCCCCACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTG

CATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCCC

CGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


GTGCAACGGATCTCTCTGAAGTTATGTCATTGGGACACGTATTACACTTTATTC

CCCCTCCCAGAAGTTTTGCTTTATCGCGCCGTCCTCCTTTCGCCACTTGGCTGGTTCAG

GCTCTCGTCCATTGGCCAATATTCCTCACTGCTGCGTCCCGTAGGAGTCCCCCCGTGCC

GCCGCCCCGCCCGGGGCGGGCCCCCGGCGCGGCG


GTGGATGGATCCTTTCGGTCGGTACGTCAACTCGACGAGTACTGCACTTTATTC

CCTTACCAAGAAGTTTACGATCCATAGAACCTTCTTCCTTCACGCCACTTGGCTGGTTC

AGGCTCTCGCCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCGTCCCGTACGAGTCCCCCCGTG

CCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGCGGCG


GTGGGACGGGGCTCTCTAGGTACGTCAATTGGCGGCTATTGGACCACCAACCG

TTCTTCCCTTCCGACAGAGGTTTACAACCCAAAAGCCTTCATCCCTCACACGGCGTTGC

TGGTTCAGGCTTTCTCCCATTGATCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCC

CCCGGGCCCCCGCCCGGCCGGGGGCGCGCCCCCGGGG


GGAACTGATCTATTCTCGGTACGGCATCGACCCCCGCAGGGGCCTTATTCTTCC

CGGGGAAAAGCAGTTTACAACCCGTAGGGCATTCTTCCTGCACGCGGCATGGCTGGTT

CAGGCTTCCGCCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCCCCGT

GCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


GGGGAACGGGGCTACTCTGTCGGTACGTCAGATTGTACAGTATTAATCTACAT

CCCTTCCTCCCAACTTATAGTGCTTTCCAATCCCAATACCTTTTTCACCCACTCGGCATG

GCTGGATTCTGCTTTCTTGCATTGTATAATATTCCGCACTGCTGCCTCCGATACCACTCC

CCCCCCGCCCCCGCCCCGGCCGGGGCCCGCCCCCGGCG


TGGGGACGGGGGCTCTCTACGGGTACGTCAGTATCTGCAGGGTATTAACCGCA

ATACACTTCTTTCCCCTTGACAGAGCTTTCCGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGG

CGTTGCTGCGTCAGGTTTTCCCCCATTGGGAAAAATTCCCCACGGCTGCCTCCCGAAG

AAGTCCCCCCGGGCCCCCGCCCCGCCGGGGGCGCGCCCCCGGGG


TGGGGACGGGCTCTCTGAGGTCCGTCAGATAGGTGGTATTAACACTTTTTCTTT

CTTCCCTTCTGACAGAGCTTTAAGACACATAAGGCTTTTTCACTCACGCGGCGTTGCTG

ATTCAGGCTTTTCCCATTGCGAAAAATTCCCCACTGCTGCTTCCAGTAGGAGTCCCCCC

GGGCCCCCCCCCGGCCGGGGCCCCGCCCCCGGGG


GGGAATGGGCTCTTTGAGGTACCGTCAGAAAGTGGTATTAACACCTTTTCATTT

CTTCCCTTCTGACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTG

CGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCCC

CGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCG


GGGGAATGACTACTCTTTGTTACGTCATATTCTTCACAAATAAAAGCAGTTTAC

AACCCGAAGGCCTTCATCCTGCACGCGGCGTTGCTCCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGG

AAGATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCCCCTGGCCCCTCCCCCACCCGGGGC

GCCCCCCCCGCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGAATATTTTAGTATCTTAAAGG

GGCAAAGCGTGGGTAAACCGGGCGGAGAAAGCTTCGGCTGCTAACGCTTTTAT

TGGGAAGAAAATGAGGTAACAAATGGAAGAGGGGGGGGAATATTCGACGTATTAAA


GGTCGGGCTTCTCTCAGGTACGTCAGTAACAGGATTATTAGTCCTGCCACCTTC

GTCCCTGACGACTGGGTTTTACAGTCCGAAGACCTTCATCACCCACGCGGCGTTGCTG

CGTCAGACTCTCGTCCATTGCGCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCCC

CGTGCCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGA


GGGGGATCGGGTCTTGGAGGTACGTCAAGAGCAGGAGGGTATTAGCATCACAT

CTTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTAAACCCGAAGGCCTTCTTCCACACGCGGCATGGC

TGCATCAGGGTTTCCCCCATTGGGCAATATTCCCCAATGGTGCCTCCCGTAAGAGTCCC

CCCGTGGCCCCGCCCCGCCCGGGGCGCGCCCCCGGCGGA

Documents

NNG MINH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN … (282).pdf · ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi trƢỜng ĐẠi hỌc khoa hỌc tỰ nhiÊn----- nng minh tuẤn