"NORMALIZACIÓN Y MEJORA DE QUESO SEMIDURO, TRADICIONAL Y CON REDUCIDO

CONTENIDO EN GRASA, DE LECHE DE CABRA"

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ÍNDICE 1 Introducción Maduración de quesos Lipasas y esterasa animales 2 Objetivos 3 Resultados y discusión 3.1 Pastas de cuajo 3.1.1. Procedimientos experimentales 3.1.2. Resultados de las experiencias con pastas de cuajo 3.2 Sistemas Modelo 3.2.1. Procedimientos experimentales 3.2.2. Resultados del estudio de los Sistemas Modelo 3.3. Quesos 3.3.1 Procedimientos experimentales 3.3.2.Estudio de quesos de cabra a escala piloto 3.3.3. Estudio de quesos semiduros de cabra artesanal e industrial 3.3.4.Estudio de quesos de cabra a escala industrial de maduración corta Consideraciones finales Bibliografía

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1. INTRODUCCIÓN La leche de cabra está adquiriendo cada día más importancia en España, sobre todo por la aceptación de los productos elaborados fundamentalmente queso, ya que prácticamente la totalidad de la producción de la leche de esta especie se destina a la elaboración de queso semiduro con un periodo de maduración corto. El queso es el producto que resulta de la coagulación (ácida, enzimática o mixta) de la leche cruda o pasterizada y que, en general, se somete posteriormente a maduración. Es un alimento de gran valor nutritivo, no sólo por el elevado contenido en proteína y grasa, sino también por ser una fuente importante de elementos minerales, principalmente calcio y fósforo (Renner, 1987). Las distintas variedades de queso son el resultado de la composición de la leche utilizada, sustancias añadidas, el conjunto de procesos físicos y mecánicos que inciden en la elaboración y los factores microbiológicos y bioquímicos del período de maduración. El objetivo más importante en la fabricación de cualquier tipo de queso es obtener un producto de calidad, tanto desde el punto de vista físico (textura), como desde un punto de vista organoléptico (aroma y sabor). MADURACIÓN DE LOS QUESOS En el queso se produce un acúmulo de sustancias responsables del sabor y aroma producidos por transformaciones metabólicas de los componentes mayoritarios de la leche, es decir, lactosa, triglicéridos y caseínas. A continuación se comenta la proteolisis y lipolisis como los procesos bioquímicos de mayor interés en relación con el tema del proyecto. La proteolisis es el proceso bioquímico de mayor importancia que tiene lugar durante la maduración de la mayoría de variedades de queso. Afecta de forma importante tanto al sabor como a la textura y modifica el pH, principalmente por la producción de grupos amonio en etapas finales de degradación. Los agentes responsables de la proteolisis durante la maduración del queso son: • El cuajo o sus sustitutos (quimosina, pepsina, cuajo vegetal y proteasas

microbianas). Todos los cuajos comerciales son proteasas ácidas que muestran especificidad sobre los enlaces peptídicos adyacentes a aminoácidos hidrofóbicos. Sólo alrededor del 6% de la quimosina añadida para la coagulación de la leche queda retenida en la cuajada y se mantiene activa en el queso durante las etapas iniciales de la maduración, el resto de la enzima se pierde en el suero durante el desuerado. La proporción de quimosina retenida aumenta marcadamente a medida que el pH disminuye. Cuando se encuentra en solución, varios enlaces de la αs1- y β-caseína son susceptibles a la hidrólisis por quimosina, aunque su actividad sobre esta última es menor.

• Las enzimas endógenas de la leche, principalmente la plasmina. Es una

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proteasa alcalina, procedente de la sangre, que se presenta en la leche asociada a las micelas de caseína. Aunque muestra especificidad por la hidrólisis de la β-caseína, dando lugar a sus productos de degradación γ-caseínas y proteosas peptonas, el pH de la mayoría de los quesos no es favorable para su actividad (Farkye y Fox, 1991).

• Enzimas de microorganismos presentes en la leche cruda o añadidas como cultivo iniciador. Las bacterias lácticas que forman parte de los cultivos iniciadores son microorganismos poco proteolíticos, aunque mediante la acción de sus proteinasas y peptidasas son capaces de hidrolizar totalmente las caseínas hasta aminoácidos (Visser, 1993). Otras enzimas proteolíticas son las procedentes de la microbiota secundaria adicionada a la leche y por último, las enzimas que proceden de bacterias que sobreviven a la pasterización de la leche, o llegan al queso por una posible contaminación durante la elaboración o la posterior maduración y/o conservación, tales como lactobacilos y micrococos.

Durante la proteolisis, los compuestos nitrogenados insolubles sufren cambios a formas solubles. En las primeras etapas, las caseínas son degradadas a péptidos de alto peso molecular y polipéptidos de tamaño no inferior a 1400 Da, debido principalmente a la acción proteolítica del cuajo o sus sustitutos y, en menor medida, a las proteinasas de los microorganismos que forman parte del cultivo iniciador y a las proteasas nativas de la leche. Posteriormente, estos péptidos y polipéptidos de alto peso molecular son hidrolizados hasta péptidos de bajo peso molecular y aminoácidos por la acción de las peptidasas de los microorganismos presentes en el queso (Crow et al., 1995; Farkye et al., 1995). La degradación proteica en el queso se determina de forma habitual por electroforesis o por distintos índices de maduración. Uno de los más utilizados es el contenido en nitrógeno soluble en agua o el nitrógeno soluble a pH 4.6 (nitrógeno no caseínico; NNC). En la fracción de nitógeno soluble, están incluidos el nitrógeno proteico precipitable en ácido tricloroacético al 12%, NNC (lactoalbúminas, lactoglobulinas, seroalbúminas, polipéptidos y oligopéptidos) y el soluble en dicho ácido tricloroacético (nitrógeno no proteico; NNP), que incluye péptidos de bajo peso molecular. La determinación de estas fracciones y sus relaciones con el contenido en nitrógeno total (NT) constituyen los índices normalmente empleados para determinar la evolución de la proteolisis durante la maduración de los quesos. La lipolisis es un fenómeno poco destacado en la mayoría de quesos, excepto en quesos azules (Roquefort, Stilton, Gorgonzola, Danablue y Cabrales), en algunas variedades españolas como Majorero e Idiazabal y en quesos italianos duros (Romano, Parmesano y Provolone) (Fox y Guinee, 1987). En otros quesos como Manchego, Cheddar, Edam y Gouda, la lipolisis ocurre de forma ligera. La hidrólisis enzimática de los triglicéridos (que constituyen más del 98 % de la grasa del queso) es la transformación bioquímica más importante que sufre la grasa durante la maduración del queso. El resultado es la producción de ácidos grasos libres y bajas concentraciones de monoglicéridos y diglicéridos. Los ácidos grasos libres y otros productos formados en etapas posteriores de degradación, como alcoholes, ésteres, aldehídos, cetonas y lactonas, son los componentes

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principales del aroma y sabor característico de cada queso. Los ácidos grasos libres presentes en los quesos provienen, por una parte, de la acción de las lipasas sobre los triglicéridos y, por otra, del metabolismo de los carbohidratos y aminoácidos por las bacterias. Los ácidos grasos liberados mediante el proceso lipolítico que contienen entre 4 y 12 átomos de carbono poseen aromas específicos (rancio, picante, a cabra, a coco) y su intensidad depende de la concentración y distribución entre las fases acuosa y grasa, el pH del medio, la presencia de ciertos cationes (Na+, Ca2+) y los productos de la degradación de proteínas (Gripon et al., 1991). El nivel de lipolisis de un queso puede ser considerado como un índice de maduración, determinándose mediante técnicas cromatográficas. La cromatografía de gases en columna capilar se utiliza de forma generalizada para determinar el contenido en triglicéridos, ácidos grasos de triglicéridos y ácidos grasos libres durante las distintas etapas en la maduración de un queso. Existen pocos estudios tecnológicos dirigidos específicamente a mejorar las condiciones de elaboración y maduración de los quesos semiduros de leche de cabra. Una de las alternativas es acelerar la maduración mediante el aumento de lipolisis y proteolisis, al ser estos procesos fundamentales en el desarrollo del sabor y aroma de quesos. Los quesos industrializados de este tipo, no madurados por mohos, presentan niveles de lipolisis bajos (Fuente De la et al.,1993), ya que la actividad lipolítica de las bacterias lácticas integrantes del cultivo iniciador es baja (Fox y Stepaniak, 1993). Las tradicionales fuentes de lipasas para mejorar el aroma de quesos han sido las pastas de cuajo procedentes de tejidos animales, especialmente glándulas pancreáticas y tejidos pregrásticos de rumiantes lactantes. Estas pastas contienen esterasas pregástricas y se utilizan de forma parcialmente purificada en la elaboración de quesos duros italianos italianos (Fox y Guinee, 1987). La literatura disponible sobre estas esterasas indica la alta especificidad sobre los ácidos grasos de cadena corta, esterificados en la grasa de leche en la posición sn-3 del triglicérido. La acción de estas esterasas puede dar lugar a la liberación de ácidos de cadena corta responsables del característico sabor picante, muy apreciado en determinados tipos de queso. Lipasas y esterasas animales Las lipasas y esterasas animales se obtienen generalmente de tejidos pancreáticos porcinos y tejidos pregástricos procedentes de cabritos, corderos y terneros (Birschbach, 1994). Tradicionalmente, las pastas de cuajo (de cabrito y de cordero, principalmente) se han utilizado para la producción de algunos quesos artesanales españoles, así como algunas variedades de quesos duros italianos. Las pastas de cuajo aportan además de las funciones de coagulación de la leche, el sistema lipolítico, esencialmente pregástrico, necesario para el desarrollo del gusto “picante”, típico de estos quesos. Dicho sabor picante aparece ligado principalmente a la

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liberación de ácidos grasos de cadena corta (Rampilli y Barzaghi, 1995). Las pastas de cuajo se preparan artesanalmente macerando los estómagos de los rumiantes lactantes, incluido su contenido (leche coagulada). La diferencia con los extractos de pasta de cuajo comerciales es que éstos se preparan a partir de estómagos previamente vaciados y lavados (Fox y Guinee, 1987). La composición enzimática de las pastas de cuajo consiste en:

- Enzimas coagulantes. Constituidas por proteasas ácidas (aspartato proteasas; EC 3.4.23), principalmente quimosina y pepsina. La composición enzimática varía mucho de unos cuajos a otros y depende fundamentalmente de la especie animal, de la modalidad de preparación y del sistema de conservación. - Enzimas lipolíticas. Es la fracción enzimática más compleja, debido a la presencia de sistemas enzimáticos múltiples, específicos para cada especie. Además, como se ha descrito anteriormente, la actividad lipolítica está influida por la especificidad de la enzima hacia el sustrato y depende de la naturaleza de este último, del tipo de triglicérido y del estado de emulsión en que se encuentra. Las enzimas lipolíticas presentes en las pastas de cuajo se secretan durante la lactancia en el epitelio glandular de la región pregástrica, definida como el área que está delimitada en la parte anterior por la región sublingual y en la parte posterior por la parte del esófago donde finaliza la faringe (Birschbach, 1992). Posteriormente, dichas enzimas son conducidas hasta el estómago con la leche ingerida durante la digestión, donde catalizarán la hidrólisis de los triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos para dar ácidos grasos y diglicéridos, monoglicéridos y glicerol, respectivamente. La enzima lipolítica presente en las pastas de cuajo mejor caracterizada es la que se conoce como esterasa pregástrica. Esta enzima muestra una gran especificidad por los ácidos grasos de cadena corta, especialmente butanoico (esterificado en leche de cabra mayoritariamente en posición sn-3). El óptimo de actividad de la misma se encuentra entre 32-40 ºC y pH entre 4.8-5.5 (Fox y Stepaniak, 1993). Aunque, parece probable que las preparaciones comerciales de la esterasa pregástrica contienen diversas enzimas lipolíticas con pesos moleculares y movilidades electroforéticas similares, pero con diferentes pH y temperatura óptimos (Fox y Guinee, 1987). La esterasa procedente de diferentes especies animales produce diferentes perfiles de sabor. En este sentido, la procedente de cabrito genera un sabor a mantequilla y ligeramente picante, la de ternero un sabor a pimienta ligeramente picante, mientras que la de cordero genera el sabor típico denominado “pecorino” (Birschbach, 1992). En general, el desarrollo del aroma típico al que dan lugar las pastas de cuajo en el queso está más relacionado con las proporciones relativas de los ácidos grasos liberados que con la cantidad de los mismos (Rampilli y Barzaghi, 1995). En la actualidad, algunos trabajos se están enfocando a la inmovilización de esterasas pregástricas para la producción de concentrados lácteos de sabor (García et al., 1995). Barzaghi y Rampilli (1996) analizaron las características enzimáticas de pastas de cuajo comerciales, y determinaron que la actividad coagulante de las mismas era uniforme, a diferencia de la actividad lipolítica que variaba en función del método utilizado para medir actividad y del sustrato empleado. Estos autores observaron

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que no existía relación entre la actividad lipolítica medida mediante potenciometría y el análisis cromatográfico del perfil de ácidos grasos libres liberados. El análisis indicaba que las pastas de cuajo liberaban mayoritariamente ácidos grasos de cadena corta. Recientemente se han purificado total o parcialmente lipasas pregástricas tanto de cordero (de Caro et al., 1995; Barton et al., 1996), como de cabrito (Lai et al., 1997; Lai et al., 1998) y se han estudiado las características hidrolíticas de esta última (Lai et al., 1997). La caracterización de estas lipasas indica que las enzimas son de diferente naturaleza, masa molecular y pH y temperatura óptimos (de Caro et al., 1995; Barton et al., 1996). El empleo de pastas de cuajo en la fabricación de quesos está justificado en el mejor sabor conseguido en los mismos respecto al obtenido con la utilización de lipasas pregástricas purificadas (Barzaghi y Rampilli, 1996), pero presenta, sin embargo, una serie de puntos críticos. Los principales inconvenientes son la complejidad y variabilidad de la composición de las pastas de cuajo (que depende sobre todo de la especie animal de la que procede, de la edad y alimentación del animal, del modo de obtención, del sistema de conservación, etc), su baja actividad coagulante, la imposibilidad de estandarizar la relación coagulante/lipasa, su limitada calidad microbiológica (preparación artesanal) y la presencia de restos de tejidos, que pueden representar una limitación en su uso. Es indispensable, por tanto, llevar a cabo un control analítico (microbiológico y enzimático) de estas pastas de cuajo, así como su higienización y caracterización, con el fin de extender la aplicación de las mismas. A la vista de los resultados positivos obtenidos en cuanto a las características sensoriales se refiere- en un queso de cabra estudiado en nuestro laboratorio, en el que se utilizó como coagulante pastas de cuajo con esterasas pregástricas obtenidas de forma artesanal (Fontecha et al., 1990), la adición de este tipo de pastas con un nivel de actividad lipolítica controlado podría ser una alternativa a considerar para mejorar el aroma y sabor de quesos. Para la mejora del aroma y sabor de este tipo de quesos, es necesario también potenciar la proteolisis que ocurre en los mismos. La selección de un cultivo iniciador con menor actividad acidificante y proteolítica y con alto potencial peptidásico, capaz de producir compuestos del aroma, es una alternativa quizás con mayores posibilidades que la incorporación de enzimas. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un cultivo iniciador específico, compuesto por lactococos, lactobacilos y leuconostocs para la producción industrializada de queso semiduro de cabra (Requena et al. 1992). De todo lo anterior puede deducirse el potencial interés de estudiar la posible mejora de un queso semiduro de leche de cabra, elaborado a partir de leche pasterizada, mediante el empleo de pastas de cuajo con esterasas y un cultivo iniciador específico, para llegar a un producto de características organolépticas mejoradas y reducir el período de maduración. Los resultados obtenidos pueden ser de utilidad para la elaboración de quesos de cabra semiduros, elaborados a partir de leche pasterizada y en los que interese

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acortar el período de maduración.

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2 OBJETIVOS El objetivo principal de este trabajo es la normalización y mejora del aroma y sabor de quesos semiduros, tradicional y con reducido contenido en grasa, de leche de cabra mediante el aumento controlado de la proteolisis y lipolisis durante la maduración. Este objetivo final se pretende llevar a cabo a través de los siguientes objetivos parciales: -Higienización y caracterización de pastas de cuajo artesanales, con alto contenido en esterasas pregástricas, de potencial utilización para el aumento moderado de la lipolisis. -Evaluación del uso de pastas de cuajo higienizadas en sistemas modelo. - Desarrollo de procedimientos de elaboración de quesos semiduros de leche de cabra, tradicional y con reducido contenido en grasa, que incluyan el empleo del cultivo iniciador desarrollado en nuestro laboratorio -bacterias lácticas de elevado potencial peptidásico y como cofermento microorganismos con baja actividad acidificante y alta actividad peptidásica-, con el fin de potenciar la proteolisis del queso y por otra parte de las pastas de cuajo caracterizadas, con el fin de potenciar la lipolisis. Los resultados obtenidos, independientemente de contribuir al conocimiento de los mecanismos enzimáticos que regulan la maduración de los quesos, podrían suministrar al subsector de quesos información sobre procedimientos de fabricación de estos productos -mejorados en el aroma y sabor por la aceleración en el desarrollo de estas características organolépticas- que respondan a requerimientos del consumidor y que podrían contribuir a una utilización mas efectiva de nuestra producción. Por otra parte, se producirían beneficios económicos importantes al reducirse el tiempo de inmovilización de capital con el acortamiento del período de maduración.

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3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN En esta parte se recogen los materiales y la metodología utilizados, así como los resultados obtenidos en los tres apartados que se han abordado en el estudio: pastas de cuajo, sistemas modelo y quesos. 3.1. PASTAS DE CUAJO 3.1.1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Proceso de higienizado y caracterización de las pastas de cuajo La complejidad y variabilidad de la composición de las pastas de cuajo, así como su limitada calidad microbiológica (preparación artesanal) pueden representar una limitación en su uso. Es indispensable, por tanto, llevar a cabo un control analítico (microbiológico y enzimático) de estas pastas de cuajo, así como su higienización, con el fin de extender la aplicación de las mismas en la elaboración de quesos. Las pastas de cuajo artesanales, se obtuvieron a partir de estómagos de cabritos lactantes que contenían leche coagulada y que fueron secados al sol durante dos meses o conservados en salmuera. Con objeto de conocer el efecto del sistema de conservación del estómago así como de la forma de extracción sobre las características de las pastas de cuajo, se compararon dos métodos diferentes en dos estómagos que se utilizaron para este ensayo. En el primero, el estómago en salmuera se cortó entero en trozos y se trituró en un mortero con 100-150 mL de agua milli-Q, posteriormente fue homogeneizado en Omni-mixer en baño de hielo durante 2 min. hasta la obtención de una pasta homogénea que se diluyó en agua destilada en la proporción 1:6. En el segundo, el estómago seco se vació y su contenido fue procesado de la misma forma que se hizo con el estómago en salmuera. Finalmente ambas fracciones fueron agitadas durante 16 h a 4ºC, centrifugadas a 14000 g durante 20 min. a 4ºC y posteriormente filtradas, en primer lugar mediante filtros Whatman 1 para eliminar los restos en suspensión y seguidamente a través de filtros Millipore de 0.45 µm de diámetro mediante filtración al vacío. En la fracción líquida obtenida se realizó recuento de microorganismos viables totales después de incubación a 30ºC durante 72 h y se determinó la concentración de proteína presente según el método de Lowry utilizando el sistema Bio-Rad y empleando albúmina sérica bovina como estándar (Lowry et al. , 1951). La fracción líquida obtenida de la pasta de cuajo fue utilizada directamente o liofilizada y en ambos casos conservada a -20ºC para su análisis posterior. Determinación de actividades enzimáticas de la pasta de cuajo Con objeto de conocer la aptitud tecnológica de la pasta de cuajo es preciso determinar la actividad proteolítica, esterásica, lipásica y sobre todo la actividad coagulante, para estimar la cantidad a utilizar en la elaboración.

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Medida de la actividad proteolítica La actividad proteolítica de la pasta de cuajo se determinó utilizando azocaseína como sustrato (Fontecha et al. 1996). La mezcla de reacción estaba formada por 0.5 mL de azocaseína (5 mg/mL) y 0.5 mL de extracto higienizado de pasta de cuajo y se incubó a 37ºC durante 2 h con agitación. La reacción se detuvo por adición de 0.5 mL de ácido tricloroacético al 10%. Posteriormente, se centrifugó a 10000 g durante 5 min a 4ºC y se determinaron en el sobrenadante los productos de hidrólisis de azocaseína mediante incremento de la absorbancia a 440 nm. Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias, definiéndose una unidad como el incremento de 0.001 unidades de absorbancia por min. La actividad proteolítica específica se expresó por mg de proteína en el extracto enzimático. Estudio de la actividad esterásica La actividad esterásica presente en la fracción higienizada procedente de las pastas de cuajo se determinó empleando como sustrato ß-naftil caprilato (Gobbeti et al., 1996). La mezcla de reacción estaba constituida por 20 µL de sustrato (5 mM en metanol), 80 µL de tampón Tris-HCl (20 mM a pH 7.5) y 100 µL de extracto higienizado de pasta de cuajo y se incubó durante 4 h a 37ºC. La reacción se detuvo por adición de 360 µl de Fast Garnet (Sigma) (5 mg/mL en 10% de SDS) y 375 µL de tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7.5. Tras una centrifugación a 10000 g durante 5 min a 4ºC, se midió la absorbancia del sobrenadante a 560 nm. Una unidad de actividad esterásica se definió como la cantidad de enzima que libera un µmol de ß-naftol a partir del sustrato por min y por mg de proteína. La concentración de ß-naftol se determinó a partir de una recta de calibrado. Estudio de la actividad lipásica El estudio de actividad lipásica se llevó a cabo en una emulsión con tributirina como sustrato y empleando como emulgente L-α-lecitina y caseinato sódico. La emulsión base se preparó mediante la adición de 200 mg de L-α-lecitina y 1.2 g de caseinato sódico a 200 mL de agua Milli-Q. La mezcla se agitó en un homogeneizador durante 2 min; posteriormente, se adicionaron diferentes concentraciones de tributirina que variaban en un rango entre 0 y 33 mM. La mezcla se volvió a homogeneizar durante períodos de 2-3 min hasta la formación de una emulsión estable. La mezcla de reacción estaba compuesta por 10 mL de emulsión y 250 µL de extracto higienizado de pasta de cuajo. La reacción se llevó a cabo en agitación continua a pH 6.4 y a 30 ºC durante 15 min. La actividad se monitorizó mediante la valoración del ácido butírico liberado por acción de las lipasas presentes en la pasta de cuajo. Para lo cual, se empleó una solución de NaOH valorada (10 mM), en un pH-Stat con regulación de temperatura. Como control, se registró la hidrólisis espontánea del sustrato en ausencia del enzima. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de ácido graso por min y por mg de proteína.

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Estudio de la actividad coagulante y aptitud tecnológica Para determinar la actividad coagulante de las pastas de cuajo se empleó un tromboelastógrafo, que mide la resistencia que presenta la leche durante la coagulación frente a un péndulo sumergido en ella. Los resultados obtenidos se representan en un gráfico (figura 1) que aporta las características de coagulación de la leche y que quedan definidas por los siguientes parámetros: • tr: corresponde al tiempo de coagulación y mide en mm la longitud de la parte

rectilínea del trazo hasta que la apertura de los brazos de la gráfica es de 1 mm. Considerando que la velocidad del papel se fija en 2 mm/min, es posible calcular el valor de tr en min. a partir de la distancia r en mm. Este parámetro se identifica con la fase primaria de la coagulación.

• Amax: corresponde a la distancia en mm entre los brazos de la curva alcanzada en un tiempo prefijado. Se identifica con la consistencia de la cuajada en ese punto.

• K20: es un parámetro definido arbitrariamente como la distancia medida entre el final del parámetro tr y el eje transversal de un trazo realizado en el punto en que la gráfica adquiere 20 mm de amplitud. Supone una expresión de la velocidad con que el coágulo adquiere una consistencia determinada y se relaciona con la velocidad de coagulación.

tr: tiempo de coagulación

K20: velocidad de formacióndel coágulo

20 mm

Amax: firmeza de la cuajada

Coagulación

Figura 1. Esquema de los parámetros de coagulación de la leche.

La aptitud tecnológica a la coagulación del higienizado de pasta de cuajo se llevó a cabo empleando una leche desnatada en polvo estéril de bajo tratamiento térmico. La leche reconstituida al 10 % con agua destilada se calentó a 30ºC durante 30 min. A 2 mL de leche se añadieron 400 µL del extracto de la pasta de cuajo líquido o de una disolución del extracto liofilizado, se agitó e inmediatamente después se colocó la mezcla en el tromboelastógrafo y se dejó

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coagular a 30ºC durante 40 min. Se definió la actividad coagulante específica como la inversa del tiempo que tarda la pasta de cuajo en coagular 1 mL de leche por mg de proteína. Determinación de la fuerza de cuajo Se determinó la fuerza de coagulación de la pasta de cuajo de cabrito empleando leche de vaca entera y desnatada pasterizada. Se calentaron 100 mL de leche a 35ºC y se añadieron 2 mL de una dilución acuosa 1:1 (v/v) del higienizado de la pasta de cuajo. En el momento de la aparición de los primeros flóculos de caseína se tomó el tiempo transcurrido en segundos (s) y se determinó la fuerza de cuajo (F) por la fórmula siguiente: F= 240000 / s en caso de cuajo líquido y F= 2400000 / s en caso de cuajo liofilizado. Rendimiento quesero Para determinar la influencia de la pasta de cuajo en el rendimiento quesero, se partió de leche de vaca entera y desnatada pasterizada mantenida a 30ºC en agitación suave. A 50 mL de leche se añadieron 2 mL de cloruro cálcico al 2%, y se dejó la mezcla en reposo durante 10 min. Pasado este tiempo, se añadieron 0.2 mL de pasta de cuajo y se dejó coagular durante 40 min en baño de agua a 31ºC. Posteriormente, se cortó la cuajada y se dejó reposar durante 30 min. A continuación, se centrifugó a 5000 g durante 10 min a 4ºC, determinándose el peso de la cuajada previa separación del suero por decantación. El rendimiento total se expresó como el porcentaje sobre el peso total de la leche de partida. 3.1.2. RESULTADOS DE LAS EXPERIENCIAS CON PASTAS DE CUAJO Efecto del proceso de extracción Con el objeto de recuperar mayor actividad enzimática y coagulante en las pastas de cuajo se trató de optimizar el procedimiento de extracción y preparación de las mismas. En cuanto a la actividad proteolítica, se pudo observar que la obtenida en la pasta de cuajo del estómago seccionado y recuperación de su interior es aproximadamente cinco veces superior que en la pasta de cuajo del estómago en salmuera cortado entero en trozos y triturado (1.25 frente a 0.25 Unidades de Actividad). Sin embargo, la actividad esterásica de esta última es ligeramente superior (32.9 frente a 27.6 nM ß-naftol/min/mg proteína), dado que se incluye la carga enzimática presente también en los tejidos del estómago. En cuanto a la actividad coagulante, se observó menor tiempo de coagulación en la pasta de cuajo completa (0.5 min frente a 2.5 min), así como los mayores valores de actividad coagulante específica y fuerza de cuajo, 5 veces superior. El rendimiento quesero teórico fue similar para ambas pastas. Dado que el objetivo de la utilización de estas pastas es incrementar la actividad

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esterásica, y aunque las diferencias no son acusadas, salvo en el tiempo de coagulación, se considera mas apropiado utilizar el estómago completo, previo a la higienización. Caracterización de pastas de cuajo Además de la determinación de las actividades enzimáticas citadas se estudió el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad esterásica y lipásica así como la especificidad de sustrato, para esta última. La actividad esterásica del extracto higienizado de la pasta de cuajo presentó un óptimo a pH 7.5. Las mayores actividades resultaron entre pH 7 y 7.5 y fuera de este intervalo la actividad se redujo hasta casi el 25 % de la máxima. A pH inferior a 5 y superior a 9 no se detectó actividad esterásica. Sin embargo, el extracto higienizado de la pasta de cuajo presentó actividad esterásica en un amplio rango de temperaturas. Entre 25ºC y 45ºC la actividad relativa fue superior al 50 % de la actividad máxima determinada a una temperatura óptima de 45ºC. En función de los resultados obtenidos de actividad esterásica a diferentes valores de pH y temperatura, se puede estimar que la adición de los extractos higienizados de la pasta de cuajo no contribuiría significativamente a la liberación de ácidos grasos libres (AGL) durante la maduración del queso, ya que al pH de maduración de los quesos (pH próximo a 5) la actividad esterásica es limitada y a la temperatura de maduración (12ºC) se redujo la actividad hasta un 25 %. Sin embargo, teniendo en cuenta que en el momento de adición de la pasta de cuajo, la leche se encuentra en unas condiciones de pH y temperatura más próximas al óptimo de actividad esterásica, la actividad de la pasta de cuajo se podría iniciar durante la fabricación del queso. Adicionalmente, a la temperatura de maduración del queso los triglicéridos se encuentran parcialmente cristalizados y esto hace que disminuya la acción de las enzimas lipolíticas. Sobre la actividad lipásica se observó que el máximo de actividad lipásica a pH 6.4 se alcanzó desde bajas concentraciones de tributirina, en concreto, a partir de 0.1 mM, donde se observó una actividad de 0.014 µmol de ácido butírico/min/mg de proteína. Estos resultados confirman la especificidad de las enzimas lipolíticas por ácido butírico y otros ácidos de cadena corta, contribuyendo así al desarrollo del aroma típico de estos quesos de cabra. El ácido butírico constituye aproximadamente el 7-8 % molar del total de ácidos grasos presentes en los constituyentes lipídicos y alrededor del 90 % de este ácido se encuentra en leche de cabra en la posición sn-3. En cuanto a la especificidad de sustrato, la actividad lipásica presente en el extracto higienizado de la pasta de cuajo presentó un comportamiento similar frente a la grasa de leche de las especies vaca, oveja y cabra, registrándose actividad en un amplio intervalo de temperaturas. Por ello, el estudio realizado tendría potencial aplicación a queso elaborado a partir de leche de las tres especies.

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3.2 SISTEMAS MODELO Una vez realizada la caracterización de la pasta de cuajo, se llevó a cabo el estudio de sistemas modelo de queso de leche de cabra, elaborados utilizando cuajo comercial y una mezcla de éste con la pasta de cuajo seleccionada. 3. 2.1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Elaboración de los sistemas modelo Se llevó a cabo en la planta piloto del Departamento de Ciencia y Tecnología de Productos Lácteos del Instituto del Frío (C.S.I.C.). Se prepararon cuatro sistemas modelo, dos a partir de leche entera de cabra (4,2% de grasa) y otros dos a partir de leche semidesnatada (2,5% de grasa), con 10 L de leche en cada elaboración. Con objeto de conocer específicamente la acción de la pasta de cuajo, los sistemas se pasterizaron a 70ºC durante 15 min y no se utilizaron cultivos iniciadores, empleando δ-gluco-lactona para hacer descender el pH. Para su elaboración se empleó cuajo comercial o mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial. La tabla 1 muestra los lotes de sistemas modelo elaborados.

Tabla 1. Lotes de sistemas modelo elaborados a partir de leche de cabra.

Lote Leche Cultivo iniciador Cuajo ECC Entera -- Comercial EPC/CC Entera -- Comercial+Pasta de cuajo DCC Semidesnatada -- Comercial DPC/CC Semidesnatada -- Comercial+Pasta de cuajo

La leche entera o semidesnatada, previamente pasterizada, se atemperó a 30ºC en la cuba utilizada de 15 litros de capacidad, con agitación. Se bajó el pH de la misma hasta 5.7 con una disolución de δ-gluco-lactona (1g/mL). A continuación se añadieron 10 mL de CaCl2 al 20%, 10 mL de azida de sodio (0,1g/mL), este última para impedir la proliferación de microorganismos. Se añadió después el cuajo (0.015 g/L) en el caso del sistema de referencia, cuajo comercial en polvo y en los de estudio de la pasta de cuajo, 6.3 mL de pasta de cuajo + 0.0077 g/L de cuajo comercial. Tanto en el caso del cuajo comercial como en la pasta de cuajo se determinó previamente la fuerza ( F=2400000 / s) y se tomó el tiempo en el momento de la aparición de los primeros coágulos. Se calcularon las cantidades a añadir para obtener la coagulación en unos cuarenta minutos. Posteriormente se cortó la cuajada para tener un tamaño de grano de 1 cm y se agitó a 37ºC durante 30 min. Los quesos moldeados (de un peso aproximado de 500g) después de salados en salmuera al 20% durante 4 h, se sometieron a maduración hasta 30 días, a 12ºC y 85% de humedad relativa (HR). Se realizan controles después de la fabricación y a los 15 y 30 días. Métodos de análisis de los sistemas modelo y quesos Análisis de composición global.- Se llevaron a cabo determinaciones analíticas de composición global (pH, sólidos totales, materia grasa, proteína total y cloruro

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sódico) a lo largo de la maduración, por procedimientos normalizados por la Federación Internacional de Lechería (FIL). Determinación de las fracciones nitrogenadas.- Para estimar el grado de proteolisis se determinaron los niveles de Nitrógeno no caseínico y Nitrógeno no proteico. Nitrógeno no caseínico (NNC).- Para la determinación del NNC se pesaron 40 g de queso y se homogeneizaron con 80 mL de agua destilada a 45ºC (Kuchroo y Fox, 1982). El homogeneizado se llevó a 200 mL añadiendo ácido acético al 20% en cantidad suficiente hasta alcanzar un pH 4.6. A continuación, se agitó 1 h a 40ºC y se reajustó el pH a 4.6, centrifugando posteriormente a 3000 g, 10 min para separar las caseínas precipitadas. El sobrenadante obtenido después de centrifugar se filtró con papel Whatman 40 y 10 mL de este filtrado se utilizaron para la determinación del NNC por el método Kjeldahl. Nitrógeno no proteico (NNP).-A 50 mL del filtrado obtenido de NNC, se le añadieron 120 mL de ácido tricloroacético al 20 % y se llevó hasta 200 mL con agua destilada. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 h y se filtró posteriormente a través de papel Whatman 40. Se utilizaron 20 mL de este filtrado para la determinación del NNP por el método Kjeldahl. Análisis de componentes volátiles.-El análisis de la fracción volátil se determinó por cromatografía de gases empleando el método de espacio de cabeza (Alonso et al. 1999). Se homogeneizaron 10 g de queso y se mezclaron con 80 µl de solución patrón que contenía 1.14 mg/ml del ester etílico del ácido propiónico en solución acuosa y 10 g de sulfato sódico anhidro para retener el agua.Se prepararon disoluciones patrón individualmente en solución acuosa y se almacenaron en viales sellados herméticamente a -20 ºC hasta el momento de su utilización. Se empleó un equipo de espacio de cabeza estático para el análisis de volátiles. Las muestras se mantuvieron a 80 ºC durante 60 min antes del análisis (para establecer un equilibrio termodinámico entre la muestra y la fase gaseosa). Las condiciones del equipo fueron las siguientes: 5 s para presurización, equilibrio y llenado y 2 min para inyección. Como gas portador se empleó helio a un flujo de 17.5 ml/min. Se empleó un equipo de cromatografía de gases acoplado a un detector selectivo de masas. Análisis de la composición en ácidos grasos libres (AGL).- Para estimar el grado de lipolisis se determinó la composición en AGL por cromatografía de gases, previa extracción de los lípidos del queso, siguiendo el procedimiento descrito por Juárez et al., (1992). La extracción de los lípidos del queso se realizó tomando 10 g de muestra que se mezclaron con 5 mL de agua destilada. Con una varilla se formó una papilla a la que se añadió una solución de ácido sulfúrico al 25% en metanol, en cantidad suficiente para reducir el pH de la papilla hasta 1.5 y facilitar la conversión de los ácidos presentes en forma de sales en ácidos libres. A continuación, se añadió 1

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mL de una disolución en éter etílico al 0.6% (p/v) de ácido nonanoico (C9) utilizado como patrón interno y 10 mL de éter etílico. La mezcla se homogeneizó durante 2 min en Omni-mixer, a una velocidad de 3500 rpm. El procedimiento se realizó en un baño de hielo para evitar en lo posible la evaporación del disolvente y la pérdida de ácidos grasos. El homogeneizado se centrifugó a 1000 g durante 5 min a 2ºC. La fase superior (etérea) se transfirió a un tubo de ensayo y se filtró a través de sulfato sódico anhidro (1g). Para la derivatización de la muestra, al extracto etéreo (3 mL) se le añadieron 0.2 mL de hidróxido de tetrametil amonio en metanol al 20% como catalizador. La mezcla se agitó durante 2 min y se dejó reposar durante 15 min. La capa superior, que contenía los ésteres metílicos de los ácidos grasos de los triglicéridos, se separó de la inferior, que contenía las sales de tetrametil amonio de los AGL. Esta capa inferior, donde se encuentran las sales de tetrametil amonio, se lavó tres veces con éter etílico y se neutralizó hasta pH 9 con una disolución de ácido clorhídrico en metanol utilizando azul de timol al 0.1% en metanol como indicador de cambio de pH y se inyectó en el cromatógrafo de gases. En el inyector las sales se pirolizan a esteres metílicos. Análisis de actividad enzimática en quesos. Para el estudio de la actividad enzimática residual presente en las muestras de queso se determinaron la actividad proteolítica, esterásica y lipásica. Las determinaciones se hicieron en los quesos a los diferentes tiempos de maduración. Obtención del extracto enzimático.-Para la obtención del extracto enzimático se tomaron 15 g de queso y se mezclaron con 30 ml de tampón Pipes (Sigma) 50 mM, pH 6.7, que contenía 0.86 M de NaCl y 0.1 M de CaCl2. La mezcla se homogeneizó en Omni-mixer durante 5 min. A continuación, se incubó en agitación a 30 ºC durante 4 h y se centrifugó a 12000 g durante 15 min a 4 ºC. Los sobrenadantes se filtraron en primer lugar a través de filtros Whatman 40 y posteriormente a través de filtros Millipore de 0.45 µm de tamaño de poro y se mantuvieron a -20 ºC hasta el momento del análisis. El contenido en proteína se determinó mediante el método de Lowry et al. (1951) utilizando el sistema para determinación de proteína de Bio-Rad. Ensayos enzimáticos.- Se llevó a cabo en los extractos enzimáticos de los sistemas modelo y quesos la determinación de la actividad proteolítica frente a azocaseína, la actividad esterásica frente a ß-naftil caprilato y la actividad lipásica frente a tributirina, mediante procedimientos similares a los descritos en el estudio de las pastas de cuajo. Para la determinación de la actividad proteolítica se partió de 0.5 ml de extracto enzimático del queso, para la esterásica de 100 µl y para la lipásica se partieron de 250 µl.

3.2.2. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LOS SISTEMAS MODELO Composición global.- Los contenidos en grasa de los sistemas modelo de leche entera al comienzo del período fueron 30.5% y los de leche desnatada del 21.5%

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para unos contenidos en sólidos totales (ST) del 57.2 y 46.9% respectivamente. Los niveles de proteína total en los cuatro sistemas presentaron unos valores comparables, con un valor medio del 17.8 %. En cuanto a niveles de proteolisis, aunque aumentaron ligeramente a lo largo del estudio, presentaron niveles bajos como corresponde a un queso fresco, elaborado sin cultivo iniciador. Los contenidos medios en nitrógeno soluble (referido a nitrógeno total), en los cuatro sistemas al final del período estuvieron en torno al 12%. El pH en los distintos sistemas modelo, al comienzo de la maduración fué de 6.2 a 6.0 y descendió muy ligeramente hasta los 30 días. Por tanto, los niveles tanto de las características de composición como de proteolisis fueron comparables a los que presenta un queso fresco. Actividades enzimáticas.- Con el fin de determinar el efecto de la pasta de cuajo utilizada, se analizaron los niveles de actividad esterásica, lipásica y proteolítica. En las actividades proteolítica y esterásica pudo comprobarse que los niveles al comienzo del período fueron más altos en los sistemas elaborados con pastas de cuajo. No obstante, los amplios intervalos de variación sobre todo en la actividad proteolítica, no permiten concluir que estos niveles sean significativamente superiores. Este resultado está de acuerdo con los similares índices de proteolisis observados (contenido en nitrógeno soluble). A lo largo del período en estudio se observaron descensos en las actividades que se pueden justificar ya que están referidas a mg de proteína presente en el extracto soluble, que aumenta a lo largo de la maduración. En el caso de la actividad lipolítica se observan valores superiores en los sistemas elaborados con pastas de cuajo durante la maduración. A partir de estos resultados se puede esperar que los sistemas elaborados con pasta de cuajo presenten un nivel de lipolisis más acusado, lo que se estimará mediante la determinación de ácidos grasos libres Compuestos volátiles.- La tabla 2 recoge los contenidos en compuestos volátiles. En todos los sistemas estudiados el contenido total en compuestos volátiles aumenta durante el período en estudio y aunque las cifras son superiores en los sistemas elaborados con leche entera a los 30 días, los niveles son bajos en todos los sistemas como corresponde a quesos en los que no se han utilizado cultivos microbianos y no hay diferencias sensibles por el tipo de cuajo utilizado. Los resultados obtenidos se pueden interpretar considerando que la proteolisis secundaria, responsable en gran medida de la aparición de compuestos volátiles, está mediatizada por la presencia de proteasas microbianas, ausentes de los sistemas estudiados.

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Contenido en ácidos grasos libres.- El contenido en AGL es el índice más interesante para estimar el grado de lipolisis. Como era de esperar, a la vista de los superiores niveles de actividad lipolítica en los sistemas elaborados con mezcla de pasta de cuajo, los niveles de AGL en éstos son mayores y sobre todo en aquellos con toda la grasa (tabla 3). Por otra parte, indicar que los contenidos en los sistemas son altos, sobre todo en los elaborados con leche entera y pasta de cuajo, si se comparan con los normalmente presentes en queso fresco. Tabla 3.- Contenido en ácidos grasos libres (mg/kg) de los sistemas modelo elaborados con cuajo comercial o mezcla con pasta de cuajo, a los 30 días de maduración

EPC/CC DPC/CC ECC DCC 30 días 30 días 30 días 30 días

C4 362 238 220 234 C6 81 137 189 176 C8 244 138 197 200 C10 802 452 581 631 C10:1 39 28 30 43 C12 407 263 306 300 C14 721 538 571 462 C14:1 106 34 42 22 C15 53 35 41 32 C16 1785 1535 1571 1244 C16:1 41 108 63 35 C17 47 45 39 20 C18 792 661 734 389 C18:1 1833 1318 1551 892 C18:2 182 168 94 112 Total 7496 5697 6228 4793

ECC: Sistema de leche entera de cabra con Cuajo Comercial

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EPC/CC: Sistema de leche entera de cabra con mezcla de pasta de Cuajo y cuajo comercial DCC: Sistema de leche semidesnatada con Cuajo Comercial DPC/CC: Sistema de leche semidesnatada con mezcla de Pasta de Cuajo y cuajo comercial De los resultados obtenidos se puede concluir que la adición de pasta de cuajo se puede considerar potencialmente positiva para incrementar los niveles de lipolisis de los quesos a ensayar en la etapa siguiente.

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3.3. QUESOS 3.3.1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Se llevaron a cabo una serie de elaboraciones de queso que se indican a continuación: � 10 Elaboraciones de quesos semiduros a escala piloto (agrupados en cinco

lotes por duplicado) para ensayar la acción de la pasta de cuajo en procesos utilizando leche entera y ligeramente desnatada, y un cultivo iniciador específico desarrollado en el Instituto del Frío para este tipo de queso (cultivo IFPL). Los cinco lotes se elaboraron con cuajo comercial, pasta de cuajo o mezcla de ambos.

� 3 Elaboraciones de queso semiduro: 2 a nivel Artesanal, con la pasta de cuajo seleccionada, pero en una de ellas a partir de leche pasterizada y utilizando el cultivo IFPL específico para leche de cabra (Requena et al., 1992) y la tercera a nivel Industrial con cuajo y cultivo comercial.

� 2 Elaboraciones a escala industrial empleando en ambas cultivo iniciador comercial y pasta de cuajo en una de ellas, con objeto de observar aisladamente el efecto de la misma.

Elaboración de los quesos de cabra a escala piloto.- Se llevaron a cabo dos elaboraciones idénticas para cada uno de los cinco lotes de queso, variando el contenido en grasa de la leche y el tipo de cuajo utilizado. En la tabla 4 se muestran la identificación de los lotes elaborados. Los lotes ECC se elaboraron con leche entera de cabra y se empleó cuajo comercial líquido BioStar de cordero, compuesto por 93.7 % de quimosina y 6.3% de pepsina, con una fuerza de cuajo F=1:150000. Para los lotes DCC se empleó leche de cabra de reducido contenido en grasa y el mismo cuajo comercial. Los lotes DPC/CC elaborados con leche de reducido contenido en grasa y mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial. Los lotes EPC/CCE elaborados con la misma mezcla de coagulantes y leche entera de cabra. Por último los lotes EPC que se elaboraron con leche entera de cabra y se coaguló únicamente con la pasta de cuajo de cabrito higienizada. En las 10 elaboraciones de quesos se empleó el cultivo iniciador IFPL, preparado en las condiciones que se describen más adelante. La leche de cabra empleada en la elaboración de los quesos tenía un contenido en grasa de 4.2%, se pasterizó a 76ºC durante 45 s. Parte de la leche se desnató y se mezcló en la cuba de fermentación con leche de cabra pasterizada entera hasta obtener leche con 3.2% de grasa, que se utilizó para la elaboración de los quesos con contenido en grasa reducido. Cada fabricación de quesos se realizó a partir de 30L de leche y se llevaron a cabo dos elaboraciones idénticas de cada lote, en cada uno de los cuales se realizaron controles a cuatro niveles de maduración, por lo que el número total de quesos fue de 40.

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Tabla 4.- Lotes de quesos de cabra elaborados a escala piloto

Lote Leche de cabra Cuajo Cultivo iniciador ECC1 Entera Comercial (BioStar) IFPL ECC2 Entera Comercial (BioStar) IFPL DCC1 Desnatada Comercial (BioStar) IFPL DCC2 Desnatada Comercial (BioStar) IFPL DPC/CC1 Desnatada Comercial+pasta de cuajo IFPL DPC/CC2 Desnatada Comercial+pasta de cuajo IFPL EPC/CC1 Entera Comercial+pasta de cuajo IFPL EPC/CC2 Entera Comercial+pasta de cuajo IFPL EPC1 Entera Pasta de cuajo higienizada IFPL EPC2 Entera Pasta de cuajo higienizada IFPL

ECC: Queso de leche entera de cabra con Cuajo Comercial DCC: Queso de leche semidesnatada con Cuajo Comercial DPC/CC: Queso de leche semidesnatada con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial EPC/CC: Queso de leche entera con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial EPC: Queso de leche entera de cabra con Pasta de Cuajo La leche de partida se calentó a 28º C en agitación y se adicionaron 12 mL de Cl2Ca al 54%, posteriormente tuvo lugar la adición del fermento, 300 mL de cultivo iniciador IFPL, dejándose actuar alrededor de 30-40 min. Una vez que se alcanzó un pH de 6.49, tuvo lugar la adición de cuajo. Para la elaboración de los lotes ECC, se adicionaron 3.3 mL de cuajo comercial (F=1:150000). Para los lotes DCC se adicionaron 2.03 mL del mismo cuajo comercial. En los lotes DPC/CC se adicionó una solución de cuajo preparada a partir de una mezcla de 1.28 mL de cuajo líquido comercial y 0.28 g de la pasta de cuajo de cabrito higienizada y liofilizada (F=1:). En el caso de los lotes EPC/CC la solución de mezcla de los cuajos fue de 1.64 mL de cuajo comercial y 0.21 g de pasta de cuajo. Por último los lotes EPC se prepararon añadiendo 0.98 g de pasta de cuajo de cabrito. En todos los lotes el punto de corte de la cuajada se alcanzó entre 30-35 min a una temperatura de 28º C. El corte de la cuajada se realizó hasta tamaño de avellana. La cuajada se colocó en moldes de plástico donde se comenzó el desuerado y prensado hasta que el pH fue aproximadamente de 5.5. El salado se llevó a cabo en salmuera (18 ºBme) durante 12 h. Los quesos elaborados para este estudio tenían un peso medio de 1 kg y se maduraron a 11-11.5ºC y 75-78% HR. Los análisis se realizaron a los 2, 15, 30 y 45 días de maduración.

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Elaboración de queso semiduro, artesanal e industrial.- Para llevar a cabo este estudio se realizaron 3 elaboraciones diferentes y se analizaron 3 quesos para cada uno de los cuatro tiempos de maduración que comprendió el estudio, por lo que el número total de quesos estudiados fue de 36. La tabla 5, resume los tres lotes elaborados: • Lote Industrial, elaborado a escala industrial con leche de cabra pasterizada,

utilizando cuajo comercial (F= 1:150000) y cultivo iniciador comercial de adición directa a cuba.

• Lote Artesanal, elaborado a partir de leche de cabra pasterizada. Se utilizó la pasta de cuajo de cabrito higienizada, y el cultivo iniciador IFPL específico para queso de cabra.

• Lote Artesanal, elaborado con leche cruda de cabra y la pasta de cuajo de cabrito higienizada.

Tabla 5. Lotes de queso semiduro de cabra elaborados

Lote Leche Cultivo iniciador Cuajo Industrial Pasterizada Comercial (Larbus) Comercial (Epasa) Artesanal Pasterizada IFPL Pasta de cuajo higienizada Artesanal Cruda -- Pasta de cuajo higienizada

Para la elaboración del lote Industrial se emplearon 6500 L de leche de cabra que se pasterizaron a 72-76ºC durante 20 s. Para la elaboración de los lotes Artesanales se emplearon 300 L de leche de cabra, que se pasterizaron a 72-76ºC durante 20 s en uno de los casos. La leche se pasó a la cuba de fermentación y cuando alcanzó 32ºC se adicionó CaCl2 (0.2 g/L) y en el caso del lote Artesanal de leche pasterizada el cultivo iniciador para obtener un inóculo equivalente a 107 u.f.c./mL, que se dejó actuar hasta que el pH de la leche descendió hasta 6.5. Posteriormente, se adicionó el cuajo necesario para que la coagulación tuviera lugar en aproximadamente 35 min, para el lote Industrial (cuajo comercial F=1:150000) y en 1 h y 15 min. en los lotes Artesanales (1ml de pasta de cuajo higienizada por litro de leche; F=1:10000). El corte de la cuajada se realizó hasta tamaño de grano de avellana. Una vez cortada la cuajada, la temperatura de la cuba se fue aumentando gradualmente hasta 36ºC a razón de 1ºC/3 min, al mismo tiempo que se agitaba para favorecer el desuerado y agregado del grano. Las cuajadas se moldearon en moldes de 3.5 kg y se prensaron en prensa hidráulica (lotes Artesanales) y en prensa neumática horizontal (lote Industrial) hasta que el pH fue de 5.3-5.2. El salado se llevó a cabo mediante inmersión en salmuera (20 ºBme) entre 10 y 13ºC durante 12 h para los quesos de los lotes Industrial y Artesanal de leche pasterizada. El salado de los quesos del lote Artesanal de leche cruda se realizó aplicando directamente sal en la superficie de los quesos durante 6 h por cada lado, siguiendo el procedimiento tradicional . Los quesos se maduraron a temperatura ambiente y a ≈85 % de HR. Se tomaron muestras a los 7, 15, 30 y 60 días de maduración. El peso medio de los quesos fue de 2.6 kg.

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Elaboración de los quesos de cabra a escala industrial.- Se elaboraron dos lotes de quesos a partir de leche entera y empleando como cultivo iniciador uno comercial compuesto de un 5% de microbiota mesófila y un 0.5% de microbiota termófila. En la tabla 6 se muestran las características de los lotes y la identificación de los mismos. Tabla 6. Lotes de quesos de cabra elaborados a escala industrial Lote Leche de cabra Cultivo iniciador Cuajo ECC Entera Comercial Comercial EPC/CC Entera Comercial Comercial + Pasta de cuajo

Para la elaboración del lote ECC se empleó leche entera pasterizada de cabra y cultivo iniciador comercial. Como coagulante se empleó cuajo comercial compuesto por 100% de quimosina. Por otra parte, para el lote EPC/CC se empleó leche entera pasterizada de cabra, cultivo iniciador comercial y como coagulante se empleó una mezcla de cuajo comercial y pasta de cuajo de cabrito. Para la elaboración de los quesos de cabra a escala industrial se partió de 4000 L de leche entera de cabra en el caso del lote ECC y de 1500 L en el caso del lote EPC/CC. La leche de cabra empleada en la elaboración de los quesos se pasterizó a 76ºC durante 45 s. La leche de partida tenía un contenido en grasa del 4.2%. La leche se calentó a 31.9º C en agitación, se adicionó Cl2Ca (0.2g/L) y posteriormente tuvo lugar la adición del fermento, dejándose actuar alrededor de 30-40 min. Una vez que se alcanzó un pH de 6.5, tuvo lugar la adición de cuajo. Para la elaboración del lote ECC se adicionaron 400 mL de cuajo comercial y en el lote EPC/CC se adicionó una solución de cuajo preparada a partir de una de mezcla de 80 mL del mismo cuajo comercial y 17 g de la pasta de cuajo higienizada y liofilizada. En los dos lotes el punto de corte de la cuajada se alcanzó entre 30-35 min. a una temperatura de 32º C. El corte de la cuajada se realizó hasta tamaño de avellana. La cuajada se colocó en moldes de plástico donde se comenzó el desuerado y prensado hasta que el pH fue aproximadamente de 5.5. El salado se llevó a cabo en salmuera (18 ºBme) durante 12 h. Los quesos elaborados para este estudio se maduraron a 11-11.5 ºC y 75-78% de HR y se analizaron dos quesos de cada lote por triplicado. Los análisis se realizaron a los 2, 15, 30 y 45 días de maduración. Preparación del cultivo iniciador IFPL.- Los microorganismos de la colección de cepas del Departamento de Ciencia y Tecnología de Productos Lácteos del Instituto del Frío (CSIC), que constituyen el cultivo iniciador IFPL, protegidos bajo patente (Requena et al. 1993), son los siguientes:

- Lactococcus lactis ssp. lactis IFPL 359 - Lactobacillus casei ssp. casei IFPL 731 - Lactobacillus plantarum IFPL 935 - Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum IFPL 709 - Leuconostoc paramesenteroides IFPL 705

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Las diferentes cepas crecidas en leche se combinaron y se inocularon conjuntamente al 1% en 500 mL de leche desnatada. Las proporciones de cada una de las cepas en el inóculo eran las siguientes: 80% de L. lactis ssp. lactis IFPL 359; 5% de L. casei ssp. casei IFPL 731; 5% de L. plantarum IFPL 935; 5% de L. mesenteroides ssp. dextranicum IFPL 709 y 5% de L. paramesenteroides IFPL 705. El cultivo se incubó a 22ºC durante 16 h y se mantuvo en refrigeración hasta su utilización. Análisis microbiológico.-Se realizaron recuentos de microorganismos viables totales, lactococos, lactobacilos y leuconostocs, por procedimientos normalizados por la FIL. Análisis sensorial.- Para la realización del análisis sensorial de los quesos, se siguieron las recomendaciones de la FIL mediante la selección de un amplio grupo de catadores compuesto por el personal del Instituto del Frío. Las muestras de queso se prepararon eliminando la corteza de los mismos y se cortaron cuñas de un tamaño de aproximadamente 1 cm de espesor. Todos los análisis se valoraron en una escala hedónica de 1 a 10. Los atributos analizados fueron: intensidad de aroma, intensidad de sabor, sabores básicos, presencia de otros sabores, textura y aceptabilidad general. También se valoró la posible presencia de determinadas características en cada atributo, así como la posible aparición de defectos en el sabor, aroma o apariencia de los quesos (sabores a rancio, etc.). 3. 3. 2. ESTUDIO DE QUESOS DE CABRA A ESCALA PILOTO A continuación se detallan los resultados del análisis microbiológico, fisicoquímico, y sensorial de los quesos de cabra elaborados a escala piloto. En esta experiencia se intenta determinar el efecto de la adición de la pasta de cuajo de cabrito higienizada (lote EPC) o mezclada con cuajo comercial (lotes EPC/CC y DPC/CC) frente a un queso producido con cuajo comercial (lotes ECC y DCC) empleando en todos los lotes el cultivo iniciador específico IFPL y variando el contenido en grasa de la leche (entera y ligeramente desnatada). Para realizar esta experiencia, como se ha indicado, se llevaron a cabo 10 elaboraciones formadas por 5 lotes de queso por duplicado. Análisis microbiológico.- Los recuentos de microorganismos viables totales descendieron lentamente a lo largo de la maduración, y resultaron ligeramente superiores al inicio de la misma en los lotes elaborados con pasta de cuajo y leche entera, aunque al final los resultados tendían a mantenerse entre 8.2 y 10 log u.f.c./g, sin observarse grandes diferencias entre los diferentes lotes de queso. Los lactococos constituyeron la microbiota predominante, tanto en los quesos elaborados con leche entera como en los de reducido contenido en grasa, y descendieron ligeramente a lo largo de la maduración. Los recuentos de lactobacilos y leuconostocs y la evolución de los mismos fue la esperada y similar a la obtenida en otros quesos que emplearon en su

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elaboración el mismo cultivo iniciador IFPL, tanto en quesos de cabra (Requena et al., 1992) como quesos de reducido contenido en grasa de cabra (Asensio et al., 1996) y de mezcla (Rodríguez et al., 1996). Composición físico-química de los quesos.- El valor de pH de la leche fue de alrededor de 6.6-6.7 en todas las elaboraciones. En general se observa una evolución de los valores de pH similar a la encontrada en otros quesos bajos en grasa (Bullens, 1994) y en quesos de leche entera de cabra (Fontecha et al., 1990; Requena et al., 1992). El contenido en ST de los quesos siguió la tendencia esperada a lo largo de la maduración, un aumento debido a la pérdida de humedad que sufren los mismos. Los contenidos medios en ST a los dos días fueron en los lotes de leche entera de 54,4% y de 51,8% en los de leche semidesnatada. A diferencia de lo que suele ocurrir en los quesos con una mayor reducción en el contenido en grasa frente a los quesos de leche entera (Rodríguez, 1998), la pérdida de humedad en los lotes con reducido contenido en grasa, son moderadas. El contenido en grasa de la leche de partida, fue de 4,2 % en la leche entera y de 3,2% en la semidesnatada. El contenido en grasa de los quesos estudiados al comienzo de la maduración fue de 28,0 y 25,5% en los quesos de leche entera y parcialmente desnatada, respectivamente, y aumentaron durante la maduración como consecuencia de la pérdida de humedad. Promediando los contenidos en grasa durante la maduración la reducción media entre los lotes enteros y parcialmente desnatados fue de un 13%. El contenido en proteína total de los quesos fue de 21,7 y 24,1% en los elaborados a partir de leche entera y semidesnatada, respectivamente, y aumentó como consecuencia de la pérdida de humedad durante la maduración. Evolución de las fracciones nitrogenadas.- Los dos índices de proteolisis estudiados NNC(%NT) y NNP(%NT) aumentaron a lo largo de la maduración de los quesos de todos los lotes. Desde el inicio de la maduración se observan valores superiores en el lote elaborado con leche entera de cabra y cuajo comercial, manteniéndose estas diferencias hasta el primer mes de maduración, y para los valores de NNC y NNP. Pero a partir de los 30 días de maduración se observan niveles superiores de proteolisis en los quesos elaborados con la pasta de cuajo y que emplearon leche entera para su elaboración, pero las diferencias no son significativas. Los valores de NNP referidos a NT son indicativos de la proteolisis secundaria efectuada por la actividad peptidásica de los microorganismos a partir del NNC. Estudios previos sobre la actividad proteolítica de las cepas del cultivo iniciador han demostrado que los lactobacilos (L. casei IFPL731 y L. plantarum IFPL935) tienen mayor actividad peptidásica que L. lactis IFPL359 (Requena et al., 1993; Fernández de Palencia et al., 1997). Los valores obtenidos de NNP evolucionaron de forma similar al NNC. La evolución de los recuentos de microorganismos viables totales y sobre todo los lactobacilos se ha indicado que fue similar en todos los lotes, por tanto el incremento de NNC es el factor limitante en el desarrollo de la proteolisis secundaria, es decir en la formación de NNP, al igual

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que se observa en otros quesos elaborados con el mismo cultivo iniciador (Requena et al., 1992) Actividad enzimática presente en los quesos.- Los resultados obtenidos para la actividad proteolítica muestran una mayor actividad en los lotes de leche entera al inicio de la maduración al igual que sucedió con los contenidos en NNC y NNP. Aunque a lo largo de la maduración se observa un descenso en la actividad proteolítica en todos los lotes y las diferencias entre lotes no sean significativas, se observan valores ligeramente superiores para los lotes elaborados con pasta de cuajo y leche entera, como sucedía con las fracciones nitrogenadas. En cuanto a la actividad esterásica específica también se observa un descenso de la misma en todos los lotes a lo largo de la maduración, aunque a todos los tiempos se observan valores de actividad superiores en el lote de quesos elaborado solamente con pasta de cuajo y leche entera Perfil de ácidos grasos libres.-. En la tabla 7 se muestran los valores medios de los ácidos grasos libres mayoritarios a lo largo de la maduración en los lotes de leche entera. Desde el inicio de la maduración se obtuvieron contenidos algo superiores en AGL en los lotes que emplearon en su elaboración la pasta de cuajo, 10.800-11.300 ppm a los 45 días y a ese período los niveles en el lote elaborado con cuajo comercial fueron de 9.700 ppm. En cuanto al perfil de los AGL por longitud de cadena, (corta, de C4 a C8; media, de C10 a C14 y larga de C16 a C18), se observa un nivel superior de ácidos de cadena corta (principales responsables del sabor picante de los quesos) en los quesos de los lotes que empleaban pasta de cuajo a partir de los 15 días de maduración. Las enzimas lipolíticas presentes en las pastas de cuajo se ha descrito que liberan preferentemente ácidos de cadena corta (Barzaghi y Rampilli, 1996).

Análisis de componentes volátiles.- Para la determinación de los mismos se identificaron 13 compuestos que se presentanen por grupos (tabla 8), 3 ácidos (acético, butanoico y hexanoico), 4 cetonas (2-propanona, 2-pentanona, 2,3-butanodiona y acetoína), 1 éster (etil éster del ácido acético), 1 aldehído (3-metil butanal) y 4 alcoholes (etanol, 2-metil-1-propanol, 2-pentanol y 3-metil-1-butanol). Las principales diferencias en los distintos lotes se encontraron desde un punto de vista cuantitativo.

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Se puede observar como a partir de los 30 días de maduración, la cantidad de compuestos volátiles en los quesos del lote elaborado únicamente con pasta de cuajo fue superior al determinado para el resto de los quesos. Además los compuestos volátiles originados como resultado de la lipolisis, representados por los ácidos grasos volátiles de cadena corta (ácidos acético, butanoico y hexanoico), fueron en general superiores en el lote de quesos que empleaba pasta de cuajo en su elaboración. Demostrando una vez más y como ocurría con la determinación de ácidos grasos libres, que la pasta de cuajo provoca, a los pocos días de maduración, el desarrollo controlado de compuestos responsables del sabor y aroma en estos quesos.

Análisis sensorial.- La evolución de la apariencia de los quesos es similar para todos los lotes a lo largo de la maduración. En cuanto a la intensidad de aroma se observan valores superiores en los quesos elaborados con pasta de cuajo desde los dos días de maduración y hasta el final de la misma. Este resultado es de extraordinaria importancia ya que muchos de los tipos de quesos de cabra que se comercializan en nuestro país tienen períodos cortos de maduración. Se observa además menor desarrollo de aroma en los quesos elaborados con leche desnatada. Por otra parte, de las valoraciones personales manifestadas como conclusiones del análisis sensorial, el aroma más aceptado fue el detectado en los quesos elaborados solo con pasta de cuajo y leche entera. Por último, en cuanto a la aceptabilidad general, no se observan diferencias al inicio de la maduración pero a los 15 días comienzan a destacar los lotes de queso elaborados con pasta de cuajo, ya sea mezclada con cuajo comercial o no, hasta el final de la misma. En resumen, se observaron puntuaciones medias superiores en cuanto a intensidad de aroma y sabor en los quesos elaborados solo con pasta de cuajo y leche entera, a lo largo de toda la maduración. Las puntuaciones para la

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aceptabilidad general a partir de 15 días de maduración fueron superiores para los lotes elaborados solo con pasta de cuajo o mezcla de pasta de cuajo/cuajo comercial y leche entera. 3.3.3. QUESOS SEMIDUROS DE CABRA ARTESANAL E INDUSTRIAL A continuación se detallan los resultados del análisis microbiológico, fisicoquímico, reológico y sensorial de los quesos de cabra elaborados tanto a nivel industrial como artesanal, donde se compara el efecto de la adición de la pasta de cuajo de cabrito higienizada (lotes Artesanales) y el empleo de un cultivo iniciador específico para este tipo de queso elaborado con leche pasterizada, frente a un queso producido industrialmente con cuajo y cultivo iniciador comerciales (lote Industrial).

Análisis microbiológico.- Los recuentos de microorganismos viables totales descendieron lentamente a lo largo de la maduración en todos los lotes de queso, siendo al inicio de la misma mayores los resultados para los quesos del lote Industrial con 9.17 log u.f.c./g, seguido de los Artesanales de leche pasterizada y leche cruda, con 8.89 log u.f.c./g y 8.48 log u.f.c./g, respectivamente. Al final del periodo de maduración, los recuentos de viables totales más bajos se detectaron en el lote artesanal de leche pasterizada, con valores de 5.95 log u.f.c./g. El descenso tan acusado de los recuentos de microorganismos totales en este lote al final de la maduración probablemente fue debido a una elevada pérdida de humedad de los quesos, como se describirá más adelante. La evolución de los recuentos de microorganismos totales fue similar a la obtenida por Fontecha et al. (1990) en el estudio de quesos de cabra Majorero artesanal y por Gómez et al. (1989) en queso de cabra Majorero industrial. Los lactococos constituyeron la microbiota mayoritaria, tanto en los quesos con cultivo iniciador como en el lote de leche cruda, y decrecieron a lo largo de la maduración en una unidad logarítmica en los quesos del lote Industrial y Artesanal de leche cruda y en más de dos unidades logarítmicas en los quesos del lote Artesanal de leche pasterizada. Los mayores niveles de lactobacilos se registraron en el lote Artesanal de leche pasterizada, ya que se adicionaron junto al cultivo iniciador. La procedencia de lactobacilos en el lote Industrial, por el contrario, podría estar asociada a contaminación de la leche procedente del ambiente y utensilios de quesería. Composición físico-química.-El pH de los quesos no registró modificaciones significativas durante la maduración en ninguno de los lotes estudiados, desde 4.7 a 5.0. La moderada proteolisis de los quesos (como se observará más adelante en el estudio de las fracciones nitrogenadas) explicaría que los valores de pH se mantuvieran bajos al final de la maduración.

El contenido en ST de los quesos de los tres lotes al inicio de la maduración varió entre 57-59%. Los quesos del lote Artesanal de leche cruda mostraron en este punto de maduración valores ligeramente inferiores, este resultado puede atribuirse fundamentalmente a que el prensado efectuado en estos quesos fue más ligero que para los otros dos lotes. Los valores de ST aumentaron a lo largo

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de toda la maduración para los tres lotes, aunque se registraron los mayores valores al final de la maduración en los quesos de los lotes Artesanales (del 72-80%). El contenido en proteína total (referido a ST) de los quesos estudiados fueron similares en los tres lotes, con valores medios del 39% en los lotes Industrial y Artesanal de leche pasterizada y del 37.5% en el lote Artesanal de leche cruda. Los valores observados son parecidos a los obtenidos en quesos de cabra por Fontecha et al. (1990), Martín-Hernández et al. (1992) y Requena et al. (1992). El contenido en materia grasa, referido a ST, de los tres lotes de quesos fue de 55%, 56% y 53% para los lotes Industrial y Artesanal de leche pasterizada y leche cruda respectivamente. Estos resultados coinciden con los observados por Fontecha et al. (1990) y Martín-Hernández et al. (1992) en queso Majorero y queso de oveja (Fontecha et al., 1994), y son algo superiores a los valores citados por Fernández-Salguero et al. (1981) para otros quesos de cabra. Fracciones nitrogenadas.- Los valores de NNC más elevados se encontraron en los quesos del lote Industrial y aumentaron a lo largo de la maduración, obteniéndose valores similares a los de otros quesos de cabra elaborados con cuajo animal comercial. Por el contrario, el contenido en NNC de los quesos de los lotes elaborados con pasta de cuajo higienizada fue inferior al de los quesos industriales y no aumentó significativamente durante la maduración. El reducido contenido en NNC de los quesos elaborados con la pasta de cuajo higienizada se debe como era de esperar a una menor actividad proteilítica de las pastas de cuajo en comparación con el cuajo comercial. Al igual que para el NNC, los valores más altos de NNP se encontraron en los quesos del lote Industrial, elaborado con cuajo comercial, más proteolítico. Análisis de componentes volátiles.- Se identificaron 28 compuestos volátiles entre los que se pueden diferenciar alcoholes (2-propanol, etanol, 2-metil-1-propanol, 2-pentanol, 3-metil-1-butanol y 2-heptanol); cetonas (2-propanona, 2-butanona, 3-hydroxi-2-butanona, 2-pentanona, 2,3 butanodiona, 2-heptanona y 2-nonanona); aldehídos (3-metil-butanal, hexanal, heptanal); ésteres (acetato de etilo, butanoato de etilo, hexanoato de etilo, 3-metil-butanoato de butilo y octanoato de etilo) y ácidos grasos volátiles (ácidos acético, propanoico, 2-metil-propanoico, butanoico, 3-metil-butanoico, pentanoico y hexanoico) (Tabla 9). La concentración (µg/100 g) de la mayoría de compuestos volátiles aumentó gradualmente durante la maduración de los quesos de los tres lotes, a excepción de 2,3-butanodiona (diacetilo), 3-metil-1-butanol y 3-hidroxi-2-butanona (acetoína), que descendieron desde el principio de la maduración en los lotes Industrial y Artesanal de leche cruda, pero que en el lote Artesanal de leche pasterizada en el que estos 3 compuestos presentaron los valores mas altos hasta los 30 días para después descender ligeramente. Las diferencias entre los compuestos volátiles de los diferentes lotes de quesos fueron principalmente cuantitativas, determinándose desde el principio de la maduración los mayores contenidos para los lotes Artesanales. El compuesto más abundante encontrado en los quesos de los tres lotes fue el

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etanol, el cual se origina principalmente a partir del acetaldehído. Los leuconostocs, y en algunas ocasiones los lactobacilos heterofermentativos facultativos, son capaces de metabolizar lactosa por vía heterofermentativa, dando lugar a la producción de cantidades significativas de etanol. El lote Artesanal de leche cruda fue el que presentó las mayores concentraciones de etanol, seguido del lote del de leche pasterizadal, que se correspondían ambos lotes con los mayores recuentos de leuconostocs. Los compuestos carbonílicos (cetonas y aldehídos) representan también una fracción importante en el perfil cromatográfico de la fracción volátil que contribuye al aroma de los quesos de cabra. Es de destacar en los tres lotes de quesos la presencia de 2-propanona, 2-pentanona y 2-nonanona. La 2-propanona es la cetona presente en mayor concentración en todos los quesos, generalmente se produce a partir del ácido butanoico por oxidación, aunque puede ser biosintetizada en la glándula mamaria y pasaría a la leche. Otras cetonas, tales como 2,3-butanodiona y 3-hidroxi 2-butanona (sabor a leche ácida), se detectaron también en altas concentraciones, sobre todo en los quesos del lote Artesanal de leche pàsterizada. Ambas cetonas derivan del metabolismo de la lactosa y del citrato y probablemente juegan un papel importante en el sabor de los quesos al principio de la maduración, ya que descienden a lo largo de la misma.

El contenido total en AGL volátiles de cadena corta fue superior para los lotes Artesanales que para el lote Industrial durante todas las etapas de maduración estudiadas. Al final del estudio, el total de AGL volátiles de los quesos del lote Industrial representaban sólo un 20% del total registrado en los lotes elaborados con la pasta de cuajo higienizada. Los mayores niveles de lipolisis en los quesos del lote Artesanal de leche cruda al principio de maduración, pueden estar

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asociados a la actividad de la lipasa nativa de la leche que se ha inactivado durante la pasterización en los otros dos lotes. El AGL presente en mayor proporción en los quesos de los tres lotes fue el ácido butanoico, el cual constituía al final de la maduración el 54% del total en el lote Industrial y hasta el 69% y 75% en los quesos de los lotes Artesanal de leche cruda y pasterizada, respectivamente. Todos los ácidos se encontraron en mayor cantidad en los quesos de los lotes Artesanales que en los quesos del lote Industrial, debido fundamentalmente al empleo de la pasta de cuajo cuyas enzimas favorecen la liberación de ácidos grasos de cadena corta.

Tabla 10. Contenido total de ácidos grasos libres volátiles en los quesos de cabra a lo largo de la maduración.

Ácidos grasos volátiles (µg/100 g) Lote 7 días 15 días 30 días 60 días Industrial 993 1568 2546 4835 Artesanal de leche past. 1757 5502 11250 22256 Artesanal de leche cruda 3921 5796 11079 22055

De todo lo anterior se puede concluir que la mayor concentración de compuestos volátiles determinada en los quesos del lote Artesanal de leche pasterizada puede atribuirse no sólo a la acción lipolítica iniciada por el empleo de la pasta de cuajo en la elaboración del queso, sino también por la presencia de L. casei ssp. casei IFPL731, añadido en el cultivo iniciador para la elaboración de estos quesos. La elevada actividad peptidásica de este microorganismo (Fernández de Palencia et al., 1997), la destacada presencia de enzimas relacionadas con el catabolismo de aminoácidos (Amárita et al., datos no publicados) y de una importante actividad esterásica, junto con los elevados recuentos de lactobacilos -detectados desde el principio de la maduración de estos quesos-, indicarían que la mayor formación de volátiles, incluidos AGL, en el lote Artesanal de leche pasterizada en comparación con el de leche cruda, estaría causada por la actividad de L. casei ssp. casei IFPL731. También Rodríguez et al. (1997), observaron un mayor contenido de volátiles en quesos elaborados con el mismo cultivo iniciador IFPL que el mismo tipo de queso elaborado con un cultivo comercial. La combinación de todos los compuestos detectados en el perfil cromatográfico originan las propiedades sensoriales típicas de este tipo de queso. El contenido en componentes volátiles desde las primeras etapas de maduración fue superior en los lotes Artesanales presentando ya a los 7 y 15 días, respectivamente, valores superiores que el Industrial a los 30 días de maduración. Se obtiene, por tanto, un desarrollo más rápido en la producción de volátiles por acción de la pasta de cuajo, que permitiría la comercialización del queso antes de un mes de maduración, en el caso del lote Artesanal de leche pasterizada. Análisis sensorial.- En cuanto a la intensidad de aroma y sabor, las puntuaciones fueron superiores en los lotes Artesanales en comparación con el lote Industrial y desde el principio de la maduración. Este resultado sólo puede atribuirse al mayor contenido en componentes volátiles de estos quesos, sobre

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todo AGL de cadena corta (Rampilli y Barzaghi, 1995), lo que se explica fundamentalmente por la acción de la pasta de cuajo añadida en el proceso de elaboración y probablemente también por una microbiota más variada que incluye microorganismos con actividad lipolítica. De los resultados obtenidos del análisis sensorial se puede concluir que los quesos de los lotes Artesanales se valoraron muy positivamente en cuanto a aceptabilidad general e intensidad de sabor y aroma, debido principalmente al desarrollo de sabor picante. La mayor intensidad de sabor desarrollada por estos quesos se correlaciona con la adición de las pastas de cuajo higienizadas en la elaboración de los quesos, lo cual dio lugar a la liberación de un mayor nivel de AGL volátiles y, por lo tanto, de mayor intensidad en sabor y aroma de los quesos. Las bajas puntuaciones en textura, que disminuyeron la aceptación de los quesos, estaría relacionada con la escasa proteolisis en los mismos, limitada por la baja actividad proteolítica de la pasta de cuajo. 3.3.4. QUESO DE CABRA A ESCALA INDUSTRIAL Análisis microbiológico.- Se llevó a cabo el análisis microbiológico de los dos lotes de quesos estudiados, lote elaborado con leche entera de cabra y cuajo comercial y lote elaborado con leche entera de cabra y mezcla de pasta de cuajo de cabrito y el mismo cuajo comercial empleado en la elaboración del lote anterior. Para ambos lotes se empleó un cultivo iniciador comercial, con objeto de estimar la posible acción aislada de la pasta de cuajo. Los recuentos de microorganismos viables totales fueron ligeramente superiores en los quesos del lote con cuajo comercial (aunque las diferencias fueron ligeras), mientras que se observaron recuentos de lactococos similares en ambos lotes. Composición global.- La evolución del pH de los quesos de ambos lotes fue la esperada aunque se encontraron valores ligeramente superiores en los quesos del lote con mezcla de pasta de cuajo, 5.7 y 5.8 durante la maduración frente al intervalo 5.3-5.5 observado en los quesos del lote con cuajo comercial. Esto se puede explicar porque los recuentos de microorganismos fueron inferiores en los primeros. El contenido en grasa de los dos lotes de quesos fue similar, alrededor del 50% (referido a ST), cifra comparable a la de los cinco lotes de quesos elaborados con leche entera de cabra descritos anteriormente. El porcentaje de proteína referido a ST de los dos lotes de quesos a los diferentes tiempos de maduración fue del 40%, valor también similar al obtenido para los quesos elaborados a nivel piloto. El porcentaje de ST evolucionó en ambos lotes entre el 58 y el 60% y el de sal, entre 1.6% y 2.2%. Fracciones nitrogenadas.- Tanto la proteolisis primaria como la secundaria al inicio de la maduración fue similar para ambos lotes de quesos, sin embargo a partir de los 30 días de maduración comienzan a observarse mayores niveles de proteolisis en los quesos que emplearon el cuajo comercial en su elaboración, a

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diferencia de aquellos que emplearon la mezcla cuajo comercial y pasta de cuajo. Como era de esperar la proteolisis es superior debido al empleo de cuajo comercial en polvo, que incluye en su composición un elevado porcentaje de quimosina. Actividades enzimáticas.- Los resultados obtenidos para la actividad proteolítica igualmente muestran valores superiores de actividad en el lote elaborado con cuajo comercial al inicio de la maduración. Dicho resultado de actividad proteolítica se relacionan con la presencia de enzimas proteolíticas solubles en la fracción de extracto de cuajo residual. Por otra parte, la actividad esterásica muestra valores ligeramente superiores de actividad en el lote elaborado con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial al inicio de la maduración y un aumento de la misma a partir de 30 días. Sin embargo, en los quesos del lote elaborado con cuajo comercial se observa un descenso de la actividad esterásica. Este resultado es de interés por la incidencia en los niveles de ácidos grasos libres de interés para el desarrollo del aroma. Composición en ácidos grasos libres.- Los resultados obtenidos en los niveles de ácidos grasos libres (Tabla11) permiten concluir que el grado de lipolisis es ligeramente superior en el lote elaborado con mezcla de pasta de cuajo, de acuerdo con los datos de las elaboraciones anteriores, a los 45 días 13.600 frente a 11.100 mg/kg .

Tabla 11. Composición de los ácidos grasos libres (mg/kg) en los quesos del lote elaborado con cuajo comercial (ECC) y el lote elaborado con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial (EPC/CC), a los 2, 15, 30 y 45 días de maduración.

Lote ECC Lote EPC/CC

Acido 2 días 30 días 45 días 2 días 30 días 45 días

C4 359 406 582 391 465 608

C6 266 536 414 305 437 571

C8 249 293 303 248 286 369

C10 788 876 892 746 958 1153

C12 312 311 363 288 366 461

C14 645 595 825 628 716 1005

C16 2196 1888 3035 2234 2187 3586

C18 884 710 1289 918 827 1488

C18:1 2197 1877 3210 2403 2249 4057

C18:2 207 129 208 172 215 345

Total 8103 7620 11122 8332 8706 13643

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Análisis sensorial.- Tanto la intensidad de aroma como de sabor se iguala a los 15 días de maduración, y la aceptabilidad general es también similar para ambos lotes de quesos. En cuanto al estudio de otras características sensoriales que hacían referencia a atributos relacionados con la textura, se observó la aparición de una textura ligeramente más dura, plástica, quebradiza y arenosa en los quesos del lote con pasta de cuajo, debido a la menor proteolisis observada en los quesos de dicho lote, que reflejó un menor ablandamiento de la masa del queso. Los catadores detectaron un retrogusto picante a los 15 días de maduración en estos quesos. A pesar de estos ligeros defectos de la textura del queso, la intensidad de aroma y sabor de dichos quesos fue considerada positivamente frente al lote con cuajo comercial. La aceptabilidad de estos lotes se vio ligeramente disminuida respecto a la observada en los quesos estudiados en el capítulo anterior porque el empleo del cultivo iniciador IFPL junto con la pasta de cuajo resulta ser un complemento adecuado para incrementar los niveles de proteolisis y el óptimo desarrollo de las características más deseables en este tipo de queso.

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CONSIDERACIONES FINALES Los resultados obtenidos permiten formular las siguientes consideraciones: • Se ha desarrollado un procedimiento de higienización de pastas de cuajo

artesanales que permite estandarizar su utilización en la elaboración industrializada de quesos. Este procedimiento disminuye ligeramente las actividades proteolíticas y lipolíticas de la pasta de cuajo, pero aumenta su aptitud tecnológica. No obstante, el rendimiento en queso y la fuerza de la pasta de cuajo higienizada sigue presentando valores inferiores a los cuajos comerciales.

La pasta de cuajo higienizada muestra actividad lipolítica similar frente a grasa de leche de vaca, oveja y cabra, presentando óptimos de actividad a valores de pH y temperatura más próximos a las condiciones de fabricación del queso que a las de maduración.

• Los resultados obtenidos en la utilización de pastas de cuajo en sistemas

modelo de queso dio lugar a un incremento en los niveles de lipolisis frente al empleo de cuajo comercial.

• La utilización de la pasta de cuajo higienizada y de un cultivo iniciador

específico en la elaboración de quesos de cabra -tradicional y con una ligera reducción en el contenido en grasa- incide fundamentalmente en el desarrollo de la lipolisis, que se refleja en un mayor contenido en ácidos grasos libres, mayoritariamente de cadena corta y compuestos volátiles que incrementan de forma apreciable el aroma y sabor de estos quesos por lo que el resultado práctico es una disminución del tiempo de maduración.

No obstante dada la menor actividad proteolítica de la pasta de cuajo se considera de mayor interés la utilización conjunta de una mezcla pasta de cuajo y cuajo comercial.

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ABREVIATURAS NNC: Nitrógeno no caseínico NNP: Nitrógeno no proteico NT: Nitrógeno total ST: Sólidos Totales AGL: Ácidos grasos libres IFPL: Instituto del Frío Productos Lácteos ECC: Sistema elaborado a partir de leche entera de cabra con Cuajo Comercial EPC: Sistem/Queso elaborado a partir de leche entera de cabra con Pasta de Cuajo DCC: Sistema/Queso elaborado a partir de leche semidesnatada de cabra con Cuajo Comercial DPC/CC: Queso de leche semidesnatada con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial EPC/CC: Queso de leche entera con mezcla de pasta de cuajo y cuajo comercial AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar su agradecimiento a la Fundación Alfonso Martín Escudero por la financiación del trabajo realizado. Asimismo, agradecen a la Quesería Rondeña las facilidades para la realización de los lotes de queso a nivel piloto e industrial y al Cabildo Insular de Fuerteventura por el suministro de estómagos de cabrito para la preparación de las pastas de cuajo.

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